BRPI0809796B1

BRPI0809796B1 - Métodos para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, e para produzir óleo

Info

Publication number: BRPI0809796B1
Application number: BRPI0809796-8A
Authority: BR
Inventors: Eyal Emmanuel; Gil Ronen; Noa Savir
Original assignee: Evogene Ltd
Priority date: 2007-04-09
Filing date: 2008-04-09
Publication date: 2021-09-08
Also published as: WO2008122980A2; CN101854798B; AU2008236316B2; WO2008122980A9; AU2008236316A1; US20130291223A1; US20160348125A1; BRPI0809796A2; CN101854798A; BRPI0809796A8; CA2683143C; MX2009010858A; US8513488B2; WO2008122980A3; MX341624B; US10036031B2; US20100154077A1; WO2008122980A8; ZA200907805B; EP2154946B1

Abstract

método de aumento do conteúdo de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção de frutos e/ou energia de uma planta, polinucleotídeo isolado, construção de ácidos nucleicos, polipeptídeo isolado e célula de planta, são fornecidos os métodos de aumento de conteúdo de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção de frutos e/ou energia de urna planta. os métodos são efetuados proliferando na planta um nível de expressão de um polipeptídeo contendo uma sequência de aminoácidos de no mínimo 90% homóloga à sequência selecionada a partir de um grupo que consiste dos nos id seq: 199, 166-198, 200-221, 229-307, 311-300, 351-353, 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048; também foi determinado que os polinucleotídeos, construções de ácido nucleico, polipeptídeos e plantas transgênicas expressam o mesmo que pode ser utilizado para aumentar o conteúdo de óleo, taxa de crescimento, biomassa, produção de frutos e/ou energia ou produção de óleo de uma planta.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em algumas de suas configurações, diz respeito a polipeptídeos, polinucleotídeos que codificam os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos de se produzir e utilizar os mesmos e, mais particularmente, mas não exclusivamente, a métodos de se aumentar o conteúdo de óleo, o rendimento de sementes, a taxa de crescimento, a biomassa e/ou o rendimento de uma planta.

[002] Óleos de sementes ou vegetais são a principal fonte de energia e nutrição na dieta humana e animal. Também são utilizados para a produção de produtos industriais, tais como tintas e lubrificantes. Além do mais, óleos vegetais representam fontes renováveis de hidrocarbonetos de cadeia longa, os quais podem ser utilizados como combustível. Uma vez que os combustíveis fósseis atualmente utilizados são fontes finitas e estão sendo exauridas gradualmente, culturas de biomassa de rápido crescimento podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou podem ser utilizadas como combustíveis alternativos ou para matérias-primas energéticas e podem reduzir a dependência de recursos de energia fóssil. Entretanto, o principal limitador para se aumentar o consumo de óleos vegetais como bio- combustível é o preço do óleo, o qual é, todavia, mais elevado do que combustível fóssil [http://www.eia. doe.gov/oiaf/analysispaper/biodiesel/; Http://www.njbiz.com/weekly article.asp?aID=19755147.6122555 .957931.7393254.4337383.561&aID2=73678]. Além do mais, a taxa de produção de óleo vegetal é limitada pela disponibilidade de terras para o plantio e água. Assim, aumentar-se o rendimento de óleo vegetal a partir da mesma área de cultivo pode superar, efetivamente, a carência de espaço de produção e pode diminuir os preços de óleo vegetal ao mesmo tempo.

[003] Estudos voltados a aumentar os rendimentos de óleo vegetal se focam na identificação de genes envolvidos no metabolismo óleo, bem como em genes capazes de aumentarem os rendimentos da planta e das sementes em plantas transgênicas.

[004] Os genes sabidamente envolvidos no aumento dos rendimentos de óleo vegetal incluem aqueles que participam na síntese ou sequestro de ácido graxo tais como desaturase [por ex., DELTA6, DELTAl2 ou acil-ACP (Ssi2; Fonte de Informações de Arabidopsis (TAIR; Http://World Wide Web (ponto) Arabidopsis (ponto) org/), TAIR No. AT2G43710)], OleosinA (TAIR No. AT3G01570) ou FAD3 (TAIR No. AT2G29980) e vários fatores de transcrição e ativadores, tais como Lec1 [TAIR No. AT1G21970, Lotan et al. 1998. Cell. 26; 93 (7): 1195-205], Lec2 [TAIR No. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579 (21): 4666-70], Fusa (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIR No. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278 (23): 21003-11] e Wril [TAIR No. AT3G54320, Cernac e Benning, 2004. Plant J. 40 (4): 575-85].

[005] Zabrouskov V., et al., 2002 (Physiol Plant. 116:172-185) demonstrou que a super-regulação de retículo endoplasmático (FAD3) e desaturases de ácido graxo plastidial (FAD7) na batata aumenta a fração de lipídios totais em clones transgênicos.

[006] Wang HW et al., 2007 (Plant J. 52:716-29. Epub 2007 Sep 18) descobriu que sementes de plantas transgênicas superexpressando os fatores de transcrição GmDof4 e GmDofll apresentam um conteúdo aumentado de ácidos graxos e lipídios totais.

[007] Vigeolas H, et al. [Plant Biotechnol J. 2007, 5(3):431-41] e o Pedido de Patente Americana No. 20060168684 revelam um conteúdo aumentado de óleo de semente na canola (Brassica napus L.) pela sobre-expressão de glicerol-3-fosfato desidrogenase de uma levedura sob o controle de um promotor especifico de sementes.

[008] Katavic V, et al., 2000 (Biochem Soc Trans. 28:935-7) descrevem o uso dos genes de Arabidopsis FAE1 e de levedura SLC1-1 para melhoras no ácido erúcico e no conteúdo de óleo na canola.

[009] O Pedido de Patente Americana No. 20080076179 revela um ácido nucléico isolado de musgo codificando uma proteína do metabolismo de lipídio (LMP) e plantas transgênicas expressando o mesmo com níveis aumentados de lipídios. O Pedido de Patente Americana No. 20060206961 revela um método de se aumentar o conteúdo de óleo em plantas (por ex., em sementes de plantas) mediante a expressão do polipeptídeo Ypr140w na planta.

[0010] O Pedido de Patente Americana No. 20060174373 revela um método de se aumentar o conteúdo de óleo em plantas mediante a expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína estimuladora da síntese (TEP) de triacilgliceróis (TAG) na planta.

[0011] Os Pedidos de Patente Americana Nos. 20070169219, 20070006345, 20070006346 e 20060195943, revelam plantas transgênicas com eficiência aumentada da utilização do nitrogênio, as quais podem ser utilizadas para conversão em combustível ou matérias-primas químicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0012] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionado um método de se aumentar o conteúdo de óleo, a taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou o vigor de uma planta, compreendendo introduzir - na planta - um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de amino ácido ao menos 90 % homóloga à sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 199, 166-198, 200-221, 229-307, 311330, 351-353, 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048 aumentando, desta forma, o conteúdo de óleo, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor da planta. De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionado um método de se produzir óleo, compreendendo: (a) fornecer a planta de acordo com o método da invenção, e (b) extrair o óleo da planta; produzindo, desta forma, o óleo.

[0013] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionado um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucléico ao menos 90 % idêntica às SEQ ID NOs: 34, 1-33, 35-52, 54-56, 64-165, 332-334, 336-342, 344-345, 347-349, 53, 57-63, 143-145, 331, 335, 343, 346, 369-522, 650-785, 10161046.

[0014] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionada um construto de ácido nucléico, compreendendo o polinucleotídeo isolado da invenção e um promotor para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucléico.

[0015] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionada um polipeptídeo isolado, compreendendo uma sequência de amino ácido ao menos 90 % homóloga às SEQ ID NO: 199, 166-198, 200-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363-364, 366368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0016] De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionada uma célula vegetal exogenamente expressando o polipeptídeo da invenção. De acordo com um aspecto de algumas configurações da presente invenção, é proporcionada uma célula vegetal exogenamente expressando o polinucleotídeo da invenção.

[0017] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo compreende a sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 34, 1-33, 35-52, 54-56, 64-165, 332-334, 336-342, 344-345, 347-349, 53, 57-63, 143-145, 331, 335, 343, 346, 369-522, 650-785, 1016-1046.

[0018] De acordo com algumas configurações da invenção, a sequência de amino ácidos selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 199, 166-198, 200-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363361, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0019] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 34, 1-33, 35-52, 54-56, 64-165, 332-334, 336-342, 344-345, 347-349, 53, 5763, 143-145, 331, 335, 343, 346, 369-522, 650-785, 10161046.

[0020] De acordo com algumas configurações da invenção, o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs: 199, 166-198, 200-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363-364, 366368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048. De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de semente.

[0021] De acordo com algumas configurações da invenção, o óleo compreende um óleo de porção vegetativa.

[0022] De acordo com algumas configurações da invenção, a célula vegetal forma uma parte de uma planta.

[0023] A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados aqui têm o mesmo significado compreendido normalmente por alguém medianamente douto na arte à qual diz respeito a invenção. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste de configurações da invenção, são descritos, abaixo, métodos exemplares e/ou materiais. Em caso de conflito, este será mediado pela especificação da patente, inclusive definições. Além do mais, os materiais, métodos, e exemplos são apenas ilustrativos e não têm a intenção de serem, necessariamente, limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] Algumas configurações da invenção estão descritas aqui, apenas por força de exemplo, com referência aos desenhos anexados. Agora, com referência específica aos desenhos em detalhe, ressaltasse que os detalhes mostrados se dão por força de exemplo e com os propósitos de discussão ilustrativa da invenção. Neste sentido, a descrição levada com os desenhos torna aparente, aos doutos na arte, como podem ser praticadas as configurações da invenção.

[0025] Nos desenhos: as figuras 1a-d são imagens digitais de folhas retratando o comprimento da folha (na Figura 1a, o comprimento da folha está representado pela seta), o comprimento laminar (na Figura 1b, o comprimento laminar está representado pela seta), a área laminar (na Figura 1c, a área laminar está representada pela elipse branca) e a largura laminar (na Figura 1d, a largura laminar está representada pela seta). A circularidade da lâmina foi calculada como sendo a largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[0026] As figuras 2a-b são imagens retratando o desenvolvimento da raiz de plantas cultivadas em placas de ágar transparente. Os diferentes ecótipos foram cultivados em placas de ágar transparentes por 17 dias e as placas foram fotografadas a cada 2 dias iniciando no dia 7. Uma imagem exemplar é mostrada na Figura 2a (obtida depois de 12 dias nas placas de ágar). O comprimento medido da raiz está representado pela seta vermelha (Figura 2b).

[0027] A figura 3 é uma imagem retratando a tintura por vapor de iodo dos lipídios isolados a partir das plantas transgênicas expressando os genes listados na Tabela 56, Exemplo 7 da seção de Exemplos que se segue. A seta indica as bandas de tri acil glicerol.

DESCRIÇÃO DE CONFIGURAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0028] A presente invenção, em algumas de suas configurações, diz respeito a polipeptídeos isolados e polinucleotídeos codificando os mesmos e, mais particularmente, porém não exclusivamente, a métodos de utilizar os mesmos para se aumentar o conteúdo de óleo, a taxa de crescimento, o rendimento, a biomassa e/ou o vigor de uma planta.

[0029] Antes que seja explicada ao menos uma configuração da invenção em detalhe, deve-se entender que a invenção não está necessariamente limitada - em sua aplicação - aos detalhes apresentados na seguinte descrição ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de ser praticada ou realizada em várias formas.

[0030] Ao reduzirem a presente invenção à prática, os presentes inventores identificaram novos polipeptídeos e polinucleotídeos que podem ser utilizados para aumentar o conteúdo de óleo, o rendimento de sementes, a taxa de crescimento, a biomassa, o rendimento e/ou o vigor de uma planta.

[0031] Assim, conforme mostrado na seção de Exemplos que segue, os presentes inventores empregaram uma abordagem de bio-informática, a qual compara o padrão de expressão de genes derivados da Arabidopsis em 79 tecidos ou estágios de desenvolvimento ao padrão dos oil hook genes (OHGs) que desempenham, sabidamente, um papel na embriogênese, no desenvolvimento da semente e na síntese e acúmulo de óleo, e forma identificados genes que exibiam uma correlação significativa (Tabela 1, Exemplo 1). Além do mais, utilizando uma microvarredura de oligonucleotídeos, os presentes inventores determinaram o perfil de expressão de genes identificados nos tecidos e estágios de desenvolvimento de vários ecótipos de Arabidopsis (Tabela 3; Exemplo 2) e correlacionaram o perfil de expressão com parâmetros selecionados de rendimento ou vigor relacionados (Tabelas 4, 5 e 6; Exemplo 2). Foram identificados genes apresentando uma correlação significativa entre perfil de expressão e os parâmetros de rendimento ou vigor dos ecótipos (Tabela 7; Exemplo 2). Destes, descobriu-se que vários genes modulam o rendimento de sementes (Tabela 8), o rendimento do óleo (Tabela 9), a taxa de crescimento (Tabela 10), a forma / tamanho / comprimento do órgão (Tabela 11), o índice de colheita (Tabela 12), o conteúdo de óleo por semente (Tabela 13), a matéria seca da planta (Tabela 14) e o número de sementes por silíqua (Tabela 15). Mediante o uso de ferramentas de bio-informática, foram identificados genes adicionais, os quais se previu aumentarem o conteúdo de óleo, rendimento de sementes, a taxa de crescimento, o rendimento e/ou a biomassa de uma planta (Tabela 2, Exemplo 1). Além do mais, também foram identificados polipeptídeos e polinucleotídeos codificando os mesmos, os quais são homólogos aos polipeptídeos preditos nas Tabelas 1 e 2 (Tabela 18, Exemplo 5). Mais adiante, conforme descrito nos Exemplos 3, 4 e 6 da seção de Exemplos que se segue, plantas transgênicas expressando os polinucleotídeos identificados apresentam um rendimento aumentado de sementes, de óleo, de matéria seca, de índice de colheita, de taxa de crescimento, de área de roseta, de percentual de óleo na semente e de peso de 1000 sementes (Tabelas 19-55; Exemplo 6). Além do mais, plantas transgênicas expressando os polinucleotídeos da invenção apresentaram um conteúdo aumentado de óleo em comparação às plantas de controle (Figura 3, Exemplo 7). No todo, estes resultados sugerem o uso dos novos polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção para se aumentar o conteúdo de óleo, rendimento (inclusive o rendimento de sementes), a taxa de crescimento, a biomassa, e/ou o vigor de uma planta.

[0032] Deve-se notar que, uma vez que o conteúdo de óleo é afetado pela produção de óleo intrínseca, ou pela massa / tamanho do tecido produtor de óleo por planta / por período de crescimento, é contemplado qualquer gene que afete estes processos mencionados acima, de acordo com os ensinamentos da presente invenção.

[0033] Assim, de acordo com um aspecto da invenção, é proporcionado um método de se aumentar o conteúdo de óleo, o rendimento, a taxa de crescimento, a biomassa e/ou o vigor de uma planta. O método é levado a efeito mediante a introdução, na planta, de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido - ao menos 90 % homóloga à sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOs:166-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0034] A frase "conteúdo de óleo"conforme utilizada aqui se refere à quantidade de lipídios no órgão de uma dada planta, quer sejam as sementes (conteúdo de óleo da semente) ou a porção vegetativa da planta (conteúdo de óleo vegetativo) e tipicamente expressada como um percentual de peso seco (10 % de umidade de sementes) ou de peso molhado (para a porção vegetativa).

[0035] Conforme mencionado, em uma configuração, o aumento do conteúdo de óleo da planta pode ser alcançado pelo aumento de tamanho/massa do(s) tecido(s) de uma planta, que compreende óleo por período de crescimento. Assim, o conteúdo aumentado de óleo de uma planta pode ser alcançado pelo aumento do rendimento, da taxa de crescimento, da biomassa e do vigor da planta.

[0036] Conforme utilizada aqui, a frase "rendimento da planta" se refere ao volume (conforme estabelecido por peso / tamanho) ou quantidade (número) de tecido (por ex., semente, designado "rendimento de sementes" e porção vegetativa) produzidos por planta ou por época de cultivo. Portanto, o rendimento aumentado poderia afetar o benefício econômico que se pode extrair da planta em certa área de cultivo e/ou época de cultivo. Conforme utilizada aqui, a frase "biomassa da planta" se refere à quantidade (medida em gramas de tecido seco ao ar) de um tecido produzido a partir da planta em uma estação de cultivo, o que também poderia determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por área de plantio.

[0037] Conforme utilizada aqui, a frase "vigor da planta" se refere à quantidade (medida por peso) de tecido produzido pela planta em um dado tempo. Portanto, o vigor aumentado poderia determinar ou afetar o rendimento da planta ou o rendimento por área de cultivo e/ou época de cultivo.

[0038] Conforme utilizada aqui, o termo "aumentar" se refere a um aumento de, ao menos cerca de 2 %, ao menos cerca de 3 %, ao menos cerca de 4 %, ao menos cerca de 5 %, ao menos cerca de 10 %, ao menos cerca de 15 %, ao menos cerca de 20 %, ao menos cerca de 30 %, ao menos cerca de 40 %, ao menos cerca de 50 %, ao menos cerca de 60 %, ao menos cerca de 70 %, ao menos cerca de 80 % no conteúdo de óleo da planta, no rendimento de sementes (rendimento de sementes por planta e/ou rendimento de sementes por área de cultivo), rendimento da planta, taxa de crescimento, biomassa, e/ou vigor em comparação com uma planta nativa [por ex., uma planta não modificada com as biomoléculas (polinucleotídeo ou polipeptídeos) da invenção, (por ex., uma planta não transformada da mesma espécie, a qual é cultivada sob as mesmas condições de crescimento). Conforme utilizada aqui, a frase "polinucleotídeo exógeno"se refere a uma sequência heterológica de ácido nucléico, a qual pode não ser expressa naturalmente dentro da planta, ou cuja sobreexpressão na planta seja almejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de uma forma estável ou transitória, de forma a se produzir uma molécula de ácido ribonucléico (RNA) e/ou uma molécula de polipeptídeo. Deve ser notado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucléico, a qual é idêntica - ou parcialmente homóloga - a uma sequência endógena de ácido nucléico da planta.

[0039] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de amino ácido ao menos cerca de 60 %, ao menos cerca de 65 %, ao menos cerca de 70 %, ao menos cerca de 75 %, ao menos cerca de 80 %, ao menos cerca de 81 %, ao menos cerca de 82 %, ao menos cerca de 83 %, ao menos cerca de 84 %, ao menos cerca de 85 %, ao menos cerca de 86 %, ao menos cerca de 87 %, ao menos cerca de 88 %, ao menos cerca de 89 %, ao menos cerca de 90 %, ao menos cerca de 91 %, ao menos cerca de 92 %, ao menos cerca de 93 %, ao menos cerca de 94 %, ao menos cerca de 95 %, ao menos cerca de 96 %, ao menos cerca de 97 %, ao menos cerca de 98 %, ao menos cerca de 99 % ou, digamos, mais de 100 % homóloga à sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs:166-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0040] A homologia (por ex., percentual de homologia) pode ser determinada mediante o uso de qualquer software de comparação de homologia inclusive, por exemplo, os softwares BLASTP ou TBLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (National Center of Biotechnology Information, NCBI), qual seja pelo uso de parâmetros de default, ao se iniciar a partir de uma sequência de polipeptídeo; ou o algoritmo tBLASTX (disponível via NCBI) qual seja pelo uso de parâmetros de default, o qual compara os produtos da translação conceitual de seis estruturas de uma sequência de nucleotídeo de referência (ambas cadeias) com uma base de dados de a sequência de proteína.

[0041] Sequências homólogas incluem tanto as sequências ortológicas como paralógicas. O termo "paralógico"diz respeito às duplicações de genes dentro do genoma de uma espécie levando a genes paralógicos. O termo "ortólogo"se refere à genes homólogos em diferentes organismos devido a uma relação ancestral.

[0042] Uma opção para se identificar ortólogos na espécie de planta monocotiledônea é realizar uma pesquisa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) recíproca. Isso pode ser feito mediante uma primeira BLAST envolvendo a pesquisa da sequência de interesse em comparação com qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados NCBI, publicamente disponível, que pode ser encontrada em: Http://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Se fossem procurados ortólogos no arroz, a sequência de interesse seria pesquisada em comparação com, por exemplo, os 28.469 clones de cDNA em comprimento total de Oryza Sativa Nipponbare disponível no NCBI. OS resultados da BLAST podem ser filtrados. As sequências de comprimento total - tanto dos resultados filtrados como dos resultados não filtrados - são pesquisadas de volta (segunda BLAST) em comparação com as sequências do organismo do qual a sequência de interesse é derivada. Os resultados da primeira e da segunda BLAST são comparados a seguir. Um ortólogo é identificado quando a sequência que resulta no escore mais alto (best hit) na primeira BLAST identifica, na segunda BLAST, a sequência de referência (a sequência de interesse original) como best hit. É encontrado um parálogo (homólogo de um gene no mesmo organismo) usando-se o mesmo racional. No caso de famílias de sequências longas, o programa ClustalW pode ser utilizado [Http://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido de uma árvore neighbor-joining (Http://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining), a qual ajuda a visualizar o aglomerado.

[0043] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs:166-221, 229-307, 311-330, 351- 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0044] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico que é ao menos cerca de 60 %, ao menos cerca de 65 %, ao menos cerca de 70 %, ao menos cerca de 75 %, ao menos cerca de 80 %, ao menos cerca de 81 %, ao menos cerca de 82 %, ao menos cerca de 83 %, ao menos cerca de 84 %, ao menos cerca de 85 %, ao menos cerca de 86 %, ao menos cerca de 87 %, ao menos cerca de 88 %, ao menos cerca de 89 %, ao menos cerca de 90 %, ao menos cerca de 91 %, ao menos cerca de 92 %, ao menos cerca de 93 %, ao menos cerca de 93 %, ao menos cerca de 94 %, ao menos cerca de 95 %, ao menos cerca de 96 %, ao menos cerca de 97 %, ao menos cerca de 98 %, ao menos cerca de 99 %, por ex., 100 % idêntica à sequência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs:1-52, 5456, 64-165, 332-334, 336-342, 344-345, 347-349, 53, 57-63, 143-145, 331, 335, 343, 346, 369-522, 650-785, 1016-1046.

[0045] A identidade (por ex., percentual de homologia) pode ser determinada usando-se qualquer software de comparação de homologia inclusive, por exemplo, o software BLASTN do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (National Center of Biotechnology Information, NCBI) qual seja usando parâmetros de default.

[0046] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é apresentado por SEQ ID NOs:1-52, 54-56, 64-165, 332-334, 336-342, 344-345, 347-349, 53, 57-63, 143-145, 331, 335, 343, 346, 369-522, 650-785, 1016-1046.

[0047] Conforme utilizado aqui,o termo "polinucleotídeo"se refere a uma sequência de ácido nucléico, de cadeia simples ou dupla, a qual é isolada e proporcionada na forma de uma Sequência de RNA, uma sequência de polinucleotídeo complementar (cDNA), uma sequência de polinucleotídeo genômica e/ou um composto de sequências de polinucleotídeo (por ex., uma combinação do acima).

[0048] Conforme utilizada aqui, a frase "sequência complementar de polinucleotídeo"se refere a uma sequência, a qual resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro usando uma transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Subsequentemente, tal sequência pode ser amplificada in vivo ou in vitro polimerase de DNA dependente de DNA.

[0049] Conforme utilizada aqui, a frase "sequência de polinucleotídeo genômica"se refere a uma sequência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, desta forma, representa uma porção contígua de um cromossomo.

[0050] Conforme utilizada aqui, a frase "composto de sequências de polinucleotídeo"se refere a uma sequência, a qual é, menos parcialmente, complementar e, ao menos parcialmente, genômica. Um composto de sequências pode incluir algumas sequências exonais requeridas para se codificar o polipeptídeo da presente invenção, bem como algumas sequências intrônicas que se interpõem ali. As sequências intrônicas podem vir de qualquer fonte, inclusive de outros genes e, tipicamente, incluirão sequências de sinal de união conservadas. Tais sequências intrônicas podem incluir, ainda, elementos reguladores da expressão ativa cis.

[0051] As sequências de ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos da presente invenção podem ser otimizadas para expressão. São dados exemplos não limitantes de sequências otimizadas de ácidos nucléicos otimizadas em SEQ ID NOs:1040, 1041, 1042, 1043, 1044, 1045 e 1046 a qual codifica polipeptídeos compreendendo as sequências de amino ácido apresentadas por SEQ ID NOs: 167, 169, 1047, 181, 185, 189 e 196, respectivamente. Exemplos de tais modificações de sequência incluem, porém não se limitam a, um conteúdo alterado de G/C para se abordar mais de perto o encontrado tipicamente na espécie vegetal de interesse, e a remoção dos códons encontrados atipicamente na espécie da planta - normalmente chamada de otimização de códons.

[0052] A frase "otimização de códons"se refere á seleção de nucleotídeos de DNA apropriados para utilização dentro de um gene estrutural ou fragmento dali que aborde o uso de códons dentro da planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucléico otimizados se referem a um gene no qual as sequências de nucleotídeo de um gene nativo - ou que ocorra naturalmente - foram modificadas de forma a se utilizarem códons preferidos estatisticamente - ou estatisticamente favorecidos - dentro da planta. As sequências de nucleotídeo são tipicamente examinadas em nível de DNA e a região de codificação é otimizada para expressão na espécie de planta determinada usando-se qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15: 677-681). Neste método, o desvio padrão do uso de códons, uma medida da tendência do uso de códons, pode ser calculado achando-se, primeiro, o desvio proporcional ao quadrado do uso de cada códon do gene nativo relativo aos dos genes de plantas altamente expressados, seguido por um cálculo do desvio médio ao quadrado. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, onde Xn se refere à frequência de uso de códon n em genes de planta altamente expressados, onde Yn se refere à frequência de uso de códon n no gene de interesse, e N se refere ao número total de códons no gene de interesse. Uma Tabela de uso de códon para genes altamente expressados de plantas dicotiledôneas está compilada usando-se os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17: 477- 498).

[0053] Um método de otimizar a sequência de ácido nucléico de acordo com o uso de códon preferido para um tipo de célula vegetal em particular, sem a realização de quaisquer cálculos estatísticos extras, é baseado no uso direto de tabelas de otimização de códons tais como as que são disponibilizadas on-line na Base de Dados de Uso de Códons (Codon Usage Database) através do banco de DNA do NIAS (Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas), no Japão (http://www.kazusa.or.jp/códon/). A Base de Dados de Uso de Códons contém tabelas de uso de códons para uma série de espécies diferentes, coma tabela de uso de cada códon havendo sido determinada estatisticamente com base nos dados presentes no Genbank.

[0054] Ao serem usadas as Tabelas acima para se determinar os códons mais preferidos - ou mais favorecidos - para cada amino ácido em uma espécie em particular (for exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeo de ocorrência natural, que codifique uma proteína de interesse, pode ser otimizada para códons em prol daquela espécie de planta em particular. Isto é feito substituindo-se os códons que podem ter uma baixa incidência estatística no genoma da espécie em particular por códons correspondentes que sejam estatisticamente mais favorecidos, no que diz respeito a um amino ácido. Entretanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser escolhidos para deletar locais de restrição existentes, para que se criem novos locais em junções potencialmente úteis (terminais 5' e 3' para acrescentar peptídeo de sinal ou cassetes de término, locais internos que podem ser utilizados para se cortar e unir segmentos de forma que seja produzida uma sequência de comprimento total a correta), ou para que se eliminem sequências de nucleotídeo que possam afetar, de forma negativa, a estabilidade ou expressão de mRNA.

[0055] As sequências codificadoras de nucleotídeo de ocorrência natural já podem conter, antes de qualquer modificação, um número de códons que correspondam a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie vegetal em particular. Portanto, a otimização de códons das sequências nativas de nucleotídeo pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência nativa de nucleotídeo, não são estatisticamente favorecidos em respeito a uma planta em particular, e a modificação destes códons de acordo com uma tabela de uso de códons de uma planta em particular para se produzir um derivado otimizado em códons. Uma sequência de nucleotídeo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para uso de códon na planta, desde que a proteína codificada pelas sequências modificadas de nucleotídeo seja produzida a um nível mais elevado do que a proteína codificada pelo gene nativo ou de ocorrência natural. A construção de genes sintéticos pela alteração do uso de códons é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente PCT 93/07278.

[0056] De acordo com algumas configurações da invenção, a expressão do polinucleotídeo da invenção resulta na regulação descendente da atividade ou nível de expressão do polipeptídeo endógeno correspondente (por ex., homólogo).

[0057] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno é utilizado para a co-supressão ou supressão de sentido de um polipeptídeo endógeno. Desta forma, introduzir-se o polinucleotídeo exógeno em células vegetais resulta na transcrição de uma molécula de RNA (na orientação do sentido em relação ao gene endógeno correspondente), a qual suprime a translação da molécula de RNA endógena correspondente, tal como descrita na Patente dos EUA No. 5,231,020 para Jorgensen, a qual está incorporada aqui, na íntegra, por referência. Para co- supressão, o polinucleotídeo exógeno não requer a sequência de ácido nucléico inteira do gene endógeno correspondente, e tampouco requer que a sequência introduzida seja exatamente idêntica ao gene endógeno. Entretanto, da mesma forma que na supressão anti-sentido, a eficiência supressiva é aumentada na medida em que se aumenta a especificidade da hibridização, por ex., assim como a sequência introduzida tem seu comprimento alongado, e/ou como a similaridade de sequência entre a sequência introduzida e o gene endógeno é aumentada. Para mais detalhes, veja o Pedido de Patente Americana No. 20050172364 o qual está incorporado aqui, na íntegra, por referência.

[0058] De acordo com algumas configurações da invenção, o polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácido nucléico não traduzíveis, por ex., uma sequência compreendendo um ou mais códons de parada prematura, ou mutações sem sentido, tais como descritas na Patente dos EUA. No. 5,583,021.

[0059] Desta forma, a invenção abrange os polinucleotídeos isolados descritos acima; seus fragmentos, suas demais sequências hibridizáveis, sequências homólogas pertinentes, sequências que codifiquem polipeptídeos similares com uso de códon diferente, sequências alteradas caracterizadas por mutações, tais como deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos, quer ocorram naturalmente ou sejam induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou de forma dirigida.

[0060] Conforme mencionado,os presentes inventores revelaram polipeptídeos não caracterizados anteriormente.

[0061] Assim, a invenção proporciona um polipeptídeo isolado tendo uma sequência de amino ácido ao menos cerca de 70 %, ao menos cerca de 75 %, ao menos cerca de 80 %, ao menos cerca de 81 %, ao menos cerca de 82 %, ao menos cerca de 83 %, ao menos cerca de 84 %, ao menos cerca de 85 %, ao menos cerca de 86 %, ao menos cerca de 87 %, ao menos cerca de 88 %, ao menos cerca de 89 %, ao menos cerca de 90 %, ao menos cerca de 91 %, ao menos cerca de 92 %, ao menos cerca de 93 %, ao menos cerca de 93 %, ao menos cerca de 94 %, ao menos cerca de 95 %, ao menos cerca de 96 %, ao menos cerca de 97 %, ao menos cerca de 98 %, ao menos cerca de 99 %, ou mais de, digamos, 100 % homóloga a uma sequência de amino ácido selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs:166-221, 229-307, 311-330, 351- 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 362, 365, 523-649, 786-920, 1047 e 1048.

[0062] De acordo com algumas configurações da invenção, é proporcionado um polipeptídeo exógeno selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NOs:166-221, 229-307, 311-330, 351-353, 355-361, 363-364, 366-368, 218, 222-228, 308-310, 350, 354, 362, 365, 523-699, 786920, 1047 e 1048.

[0063] A invenção também engloba fragmentos dos polipeptídeos descritos acima e polipeptídeos que tenham mutações, tais como deleções, inserções ou substituições de um ou mais amimo ácidos, quer ocorram naturalmente ou sejam induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou de forma dirigida.

[0064] O termo '"planta", conforme utilizado aqui, engloba plantas inteiras, ancestrais e a progênie das plantas ou de partes de planta, inclusive sementes, brotos, caule, raízes (inclusive tubérculos) e células vegetais, tecidos e órgãos. A planta pode estar em qualquer forma, inclusive culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido caloso, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micro-esporos. As plantas que são particularmente úteis nos métodos da invenção incluem todas aquelas que pertencem à superfamília Viridiplantae, em particular, plantas monocotiledâneas e dicotiledôneas, inclusive forragem ou legumes de forragem, plantas ornamentais, culturas alimentares, árvores ou arbustos selecionados a partir da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguieragymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arábica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetária, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altíssima, Heteropogon ccntoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolu e, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus RJiaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp. Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amarante, alcachofra, aspargo, brócolis, Couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve-manteiga, linho, couve crespa, lentilha, óleo de colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba sacarina, cana de açúcar, girassol, tomate, abóbora, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfalfa, algodão, semente de colza, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, gramínea perene, e uma forragicultura. Alga alternativa e outra não- Viridiplantae podem ser utilizadas para métodos da presente invenção.

[0065] De acordo com algumas configurações da invenção, a planta produtora de óleo pode ser safra de semente oleaginosa, soja, girassol, Brassica napus, Brassica Juncea, zea maize, algodão, oliva (Olea europaea), linho, Brassica nigra, Jatropha curcas, e Mamona (Ricinus communis).

[0066] Introduzir o polinucleotídeo exógeno da invenção na planta pode ser efetuado transformando uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguido da criação de plantas maduras das células transformadas e da cultivação da planta madura sob condições adequadas para retirar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[0067] De acordo com algumas configurações da invenção, a transformação é efetuada pela introdução de uma construção de ácido nucléico na célula vegetal que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas configurações da invenção e pelo menos um promotor capaz de direcionar a transcrição do polinucleotídeo exógeno na célula vegetal. Mais detalhes das abordagens da transformação adequada são fornecidos a seguir.

[0068] Conforme utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região do DNA que se situa a montante do sítio de iniciação transcricional de um gene que a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (por exemplo, que porção de uma planta) e/ou quando (por exemplo, em que fase ou condição na vida de um organismo) o gene é retirado.

[0069] Qualquer sequência de promotor apropriada pode ser utilizada pela construção de ácido nucléico da presente invenção. De acordo com algumas configurações da invenção, o promotor é um promotor constitutivo, um tecido-específico ou um promotor de desenvolvimento ou embrionário- específico.

[0070] Promotores adequados constitutivos incluem, por exemplo, promotor CaMV 35s (SEQ ID NO:921; Odeil et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor Arabidopsis At6669 (SEQ ID NO: 1015; ver PCT Publication No. W02004/104162; milho Ubi 1 (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); G0s2 (de Pater et al, Plant J Nov; 2(6): 837-44, 1992); Ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 5 25(5):837-43, 1994); Histona H3 do milho (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1); 107121, 1996) e Sintético Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Outros promotores constitutivos incluem aqueles nos Pat. dos EUA Pat. Nos. 5,659,026, 5,608,149; 5.608,144; 5,604,121; 5.569,597: 5.466,785; 5,399,680; 5,268,463; e 5,608,142.

[0071] Promotores tecido-específicos adequados incluem, mas não estão limitados a, promotores de semente preferida [por exemplo, de sementes de genes específicos (Simon, et al., Plant Mo1.Bio1.5.191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol.Bio1.14: 633, 1990), albumina da Castanha do Pará (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Genet. Gen. Mol. 208: 1522, 1986; Takaiwa, et al., FEBS da Letônia. 221: 43-47, 1987), Zein (Matzke et AL Plant Mol Biol, 143: 323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), Trigo SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 181, 1997), oleosina de girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873- 876, 1992)], promotores específicos de folhas [assim como descritos, por exemplo, por Yamamoto et al, Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778 1994; Gotor et al. Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et AL. Plant Mol. Biol. 23:11291138, 1993; e Matsuoka et al, Proc. Acad. Nac. Cien. USA 90:9586-9590, 1993], promotores específicos do endosperma (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), trigo a, b and g gliadinas (EMB03:1409-15, 1984), promoter de Cevada ltrl promoter, hordeína de cevada barley Bl, C, D (Theor Appl Gen 98: 1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750- 60, 1996), Cevada DOF (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998), Biz2 (EP99106056. 7), promotor Sintético (Vicente-Carbajosa et al. Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina de arroz NRP33, globulina de arroz Glb-1 (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina de arroz REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucose de arroz PP (Trans Res 6:157-68, 1997), família do gene do milho ESR (Plant J 12:235-46, 1997), sorgo gama-kafirin (PMB 32:102935, 1996)], promotores específicos de embrião [por exemplo, arroz OSH1 (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), olecsina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123:386, 1998)], e promoters específicos de flores [por exemplo, AtPRP4, sintase chalene chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-5 245; 1989), apetala-3].

[0072] A construção de ácido nucléico de algumas configurações da invenção pode incluir posteriormente um marcador seletivo apropriado e/ou uma origem de réplica. De acordo com algumas configurações da invenção, a construção de ácido nucléico utilizada é um vetor ponte, que pode propagar-se tanto em E. coli (onde a construção abrange um marcador seletivo apropriado e origem de réplica) e ser compatível com propagação em células. A construção de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmidio, um bacmídio, um fagomídio, cosmídio, fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[0073] A construção de ácido nucléico de algumas configurações da invenção pode ser utilizada para transformar células vegetais estavelmente ou transitoriamente. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado ao genoma vegetal, e, como tal, representa uma característica estável e hereditária. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é retirado pela célula transformada, mas não éintegrado ao genoma, e, como tal, representa uma característica transitória.

[0074] Existem vários métodos de introdução de genes exógenos em plantas de ambas as monocotiledôneas e dicotiledôneas. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[0075] Os métodos de princípio de causar integração estável de DNA exógeno no DNA genômico de plantas incluem duas abordagens principais: (i)Transferência de gene mediada pela Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell,J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, em Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Absorção direta de DNA: Paszkowski e outros., em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para absorção direta de DNA em protoplastas, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:10721074. Absorção de DNA introduzido por curtos choques elétricos de células vegetais: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 5 319:791-793. Injeção de DNA em células ou tecidos vegetais por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; através do uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:(1990) 79:213-217; fibras de vidro ou transformação de filamento (whisker) de carboneto de silício de cultivos de células, embriões ou tecidos de calo, Pat. dos EUA No.: 5,464,765 ou através da incubação direta de DNA com pólen em germinação, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, Londres, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715-719.

[0076] O sistema Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídeo que contêm segmentos de DNA definidos que integra no DNA genômico vegetal. Métodos de inoculação do tecido vegetal variam dependendo da espécie vegetal e o sistema de entrega Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é c procedimento de disco de folha que pode ser realizado com qualquer explante de tecido que forneça uma boa fonte para iniciação de diferenciação de planta completa. Ver, por exemplo, Horsch e outros em Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem suplementar emprega o sistema de entrega Agrobacterium na combinação com infiltração a vácuo. O sistema Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas transgênicas de dicotiledôneas.

[0077] Existem vários métodos de transferência direta de DNA em células vegetais. Na eletroporação, os protoplastas são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células usando micropipetas pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojécteis são fisicamente acelerados em células ou tecidos vegetais.

[0078] A Transformação estável de propagação de planta seguinte é exercida. O método mais comum de propagação de planta é através da semente. A Regeneração por propagação de semente, no entanto, tem a deficiência que devido a heterozigosidade, há uma falta de uniformidade na safra, já que sementes são produzidas por plantas de acordo com as variações genéticas dominadas pelas regras Mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com seus próprios traços específicos. Então, é preferível que a planta transformada seja produzida de forma que a planta regenerada tenha os traços e características idênticas a planta-mãe transgênica. Sendo assim, é preferível que a planta transformada seja regenerada por micropropagação que fornece uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[0079] A Micropropagação é um processo de cultivar novas plantas geradoras de um único fragmento de tecido que tenha sido retirado de uma planta-mãe selecionada ou cultivares. Esse processo permite a reprodução em massa de plantas com o tecido preferido retirando a proteína de fusão. As plantas geradoras que são produzidas são geneticamente idênticas a, e tem todas as características da, planta original. A micropropagação permite produção em massa de material vegetal de qualidade em um curto período de tempo e oferece uma multiplicação rápida de cultivares selecionados na preservação de características da planta original trangênica ou transformada. As vantagens de clonar plantas são a velocidade de multiplicação de plantas e a qualidade e uniformidade de plantas produzidas.

[0080] A micropropagação é um procedimento de várias etapas que requer alteração de meios de cultura ou condições de crescimento entre os estágios. Assim, o processo de micropropagação envolve quatro estágios básicos: Estágio um, cultura inicial de tecido; estágio dois, multiplicação da cultura de tecidos; estágio três, diferenciação e formação de planta; e estágio quatro, cultura de estufa e aclimatação (hardening). Durante o estágio um, cultura inicial de tecido, a cultura de tecido é estabelecida e certificada como livre de contaminantes. Durante o estágio 2, a cultura inicial de tecidos é multiplicada até que um número suficiente de amostras de tecidos seja produzido para corresponder aos objetivos de produção. Durante o estágio três, as amostras de tecidos cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em plântulas. No estágio quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para a aclimatação (hardening) onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente elevada para que possam ser cultivadas no ambiente natural.

[0081] De acordo com algumas configurações da invenção, as plantas trangênicas são geradas por transformação transitória de células folhas, células meristemáticas ou toda a planta.

[0082] A transformação transitória pode ser efetuada por qualquer dos métodos de transferência de DNA direta descritos acima ou por infecção viral utilizando vírus vegetais modificados.

[0083] Os vírus que tenham se mostrado úteis para a transformação de hospedeiros de plantas incluem CaMV, TMV e BV. A transformação de plantas utilizando vírus vegetais é descrita no Pat. dos EUA No.: 4,855,237 (BGV), EP-A 67,553 (TMV), Japanese Published Application No. 6314693 (TMV), EPA 194,809 (BV), EPA 278,667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, pp. 172-189 (1988). Partículas de pseudo-vírus para uso na retirada de DNA exógeno em vários hospedeiros, incluindo plantas, são descritos em WO 87/06261.

[0084] De acordo com algumas configurações da invenção, o vírus utilizado para transformações transitórias é avirulento e assim é incapaz de causar sintomas graves tais como taxa reduzida de crescimento, mosaico, manchas anulares, enrolamento da folha, amarelecimento, estrias, formação de inchação, formação de tumor e perfurações. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento de ocorrência natural ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação de vírus pode ser efetuada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas diretas de mutagênese como descritas, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) and Huet et al. (1994).

[0085] Cepas adequadas de vírus podem ser obtidas de fontes disponíveis como, por exemplo, a American Type culture Collection (ATCC) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos de planta infectada pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na arte tais como descritas, por exemplo, por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Resumidamente, tecidos de uma planta infectada que possivelmente contenham uma concentração elevada de um vírus adequado, preferivelmente folhas novas e pétalas de flores, são pulverizados em uma solução-tampão (por exemplo, solução-tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada por vírus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

[0086] A construção de vírus RNA de planta para a introdução e retirada de sequências não-virais de polinucleotídeo exógeno em plantas é demonstrada nas referências acima, assim como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al. Science (1986) 231:1294-1297; e Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

[0087] Quando o vírus é um vírus de DNA, modificações adequadas podem ser feitas ao próprio vírus. Por outro lado, o vírus pode ser primeiro clonado em um plasmídeo bacterial para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA exógeno. O vírus pode ser removido do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacterial de réplica pode ser ligado ao DNA viral, que é então replicado pela bactéria. A transcrição e a tradução desse DNA irá produzir a proteína capsidial que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, esse é geralmente clonado como um cDNA e inserido no plasmídeo. O plasmideo é então utilizado para fazer todas as contruções. O vírus de RNA é então produzido transcrevendo a sequência viral do plasmídeo e a tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) capsidial(s) que encapsida o RNA viral.

[0088] A construção de vírus vegetais de RNA para a introdução de sequências de polinucleotídeo exógeno tais como aquelas incluídas na construção da presente invenção é demonstrada nas referências acima assim como no Pat. dos EUA No.: 5,316,931.

[0089] Em uma configuração, um polinucleotídeo viral de planta é fornecido no qual a sequência codificante da proteína capsidial nativa foi apagada de um polinucleotídeo viral, uma sequência codificante de proteína capsidial de planta viral não-nativa e um promotor não-nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da sequência codificante da proteína capsidial não-nativa, capaz de expressão no hospedeiro vegetal, empacotamento do polinucleotídeo recombinante viral da planta, e garantia de uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo recombinanete viral da planta, foi inserido. Por outro lado, o gene da proteína capsidial pode ser inativado por inserção da sequência de polinucleotídeos não-nativos no interior, de forma que a proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral da planta pode conter um ou mais promotores subgenômicos adicionais não- nativos. Cada promotor subgenômico não-nativo é capaz de transcrever ou retirar genes adjacentes ou sequências de polinucleotídeos no hospedeiro vegetal e incapaz de recombinação entre eles e com promotores subgenômicos nativos. Sequências de polinucleotídeos não-nativas (exógenas) podem ser inseridas adjacentes ao promotor subgenômico nativo viral da planta ou ao nativo e aos promotores subgenômicos não-nativos virais da planta se mais de uma sequência de polinucleotídeo é incluída. As sequências de polinucleotídeos não-nativas são transcritas e expressadas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[0090] Em uma segunda configuração, um polinucleotídeo recombinante viral da planta é fornecido como na primeira configuração, exceto que a sequência codificadora nativa da proteína capsidial é localizada adjacente a um dos promotores subgenômicos não-nativos da proteína capsidial ao invés de uma sequência codificadora não-nativa da proteína capsidial.

[0091] Em uma terceira configuração, um polinucleotídeo recombinante viral da planta é fornecido no qual o gene nativo da proteína capsidial é adjacente aos promotores subgenômicos e um ou mais promotores não-nativos subgenômicos foram inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômico não-nativo inserido são capazes de transcrever ou retirar genes adjacentes em um hospedeiro vegetal e incapaz de fazer recombinação entre eles e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeos não-nativas podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos não-nativos de forma que as sequências sejam transcritas e expressadas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômico para produzir o produto desejado.

[0092] Em uma quarta configuração, um polinucleotídeo recombinante viral da planta é fornecido como na terceira configuração, exceto que a sequência codificadora nativa da proteína capsidial é substituída por uma sequência codificadora não-nativa da proteína capsidial.

[0093] Os vetores virais são encapsidados pela proteína capsidial codificada pelo polinucleotidio recombinante viral da planta para produzir um vírus vegetal recombinante. O polinucleotídeo recombinante viral da planta ou vírus vegetal recombinante é utilizado para infeccionar plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo recombinante virai da planta é capaz de fazer replicação no hospedeiro, dispersão sistêmica no hospedeiro, e transcrição ou expressão de gene(s) exógeno(s) (polinucleotídeos exógenos) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[0094] Técnicas para inoculação dos vírus para plantas podem ser encontrar em Foster e Taylor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, Nova Iorque 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado and Agrawa, eds. "Principies and Techniques in Plant Virology", Van NostrandReinhold, Nova Iorque.

[0095] Em adição ao que está acima, o polinucleotídeo da presente invenção pode também ser introduzido em um genoma do cloroplasto, permitindo assim a expressão do cloroplasto.

[0096] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeos exógenos ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Esta técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, células vegetais são tratadas quimicamente de forma que reduza o número de cloroplastos por célula para aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido via bombardeamento de partícula dentro das células com o intuito de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos selecionados tais que são integráveis nos genomas do cloroplasto via recombinação homóloga que é efetuada de imediato por enzimas inerentes ao cloroplasto. Com este fim, o polinucleotídeo exógeno inclui em adição a um gene de interesse, pelo menos um estiramento de polinucleotidio que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotidio exógeno inclui um marcador selecionável, que serve por procedimentos de seleção seqüencial para certificar que todos ou substancialmente todos das cópias dos genomas do cloroplasto seguindo tal seleção irá incluir o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes relacionados a essas técnicas são encontrados no .Pat. Dos EUA Nos. 4,945,050; e 5,693,507 que são incorporados aqui por referência. Um polipeptídio pode assim ser produzido pelo sistema de expressão de proteína do cloroplasto e tornar-se integrado na membrana interior do cloroplasto.

[0097] Visto que o aumento do teor de óleo, produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor em plantas pode envolver genes múltiplos agindo adicionamento ou em sinergia (ver, por exemplo, em Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a invenção também contempla expressar uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira para assim atingir um aumento superior de teor de óleo, produção, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor em plantas.

[0098] Expressar uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuado através da co-introdução de construção de ácido nucléico, cada um incluindo um polinucleotídeo exógeno, em uma única célula vegetal. A célula transformada pode então ser regenerada em uma planta madura utilizando métodos descritos acima.

[0099] Por outro lado, a expressão de uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada através da co-introdução em uma única célula vegetal uma construção de ácido nucléico incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos. Tal construção pode ser determinada com uma sequência única de promotor que pode transcrever um RNA mensageiro policistrônico incluindo todas as sequências diferentes de polinucleotídeos exógeno. Para possibilitar a co-tradução de diferentes polipeptídios codificados pelo RNA mensageiro policistrônico, as sequências de polinucleotídeo podem ser ligadas através de uma sequência de sítio interno de entrada de ribossomo (IRES)que facilita a tradução de sequências de polinucleotídeos posicionadas abaixo da sequência IRES. Neste caso, uma molécula transcrita de RNA policistrônico codificando os diferentes polipeptídios descritos acima será traduzida tanto da extremidade 5 nivelada quanto das duas sequências internas IRES da molécula de RNA policistrônica para assim produzir na célula todos os diferentes polipeptídios. Por outro lado, a construção pode incluir várias sequências de promotores, cada uma ligada a uma sequência diferente de polinucleotídeo exógeno.

[00100] A célula vegetal transformada com a construção, incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotídeos exógenos, pode ser regenerada em uma planta madura, utilizando os métodos descritos acima.

[00101] Por outro lado, a expressão uma pluralidade de polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada através da introdução de diferentes construções de ácido nucléico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos em uma pluralidade de plantas. As plantas regeneradas transformadas podem então serem cruzadas e a prole resultante selecionada para conteúdo superior de óleo, taxa de crescimento, biomassa, safra e/ou vigor utilizando técnicas convencionais de reprodução de planta.

[00102] Assim, a invenção inclui plantas expressando exogenicamente (como descrito acima) o(s) polinucleotídeo(s) e/ou polipeptídio(s) da invenção. Uma vez expressada dentro da célula vegetal ou da planta inteira, o nível de polipeptídio codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica tais como, ensaio de atividade, Western blot utilizando anticorpos capazes de ligar especificamente o polipeptídio, Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELISA), ensaios rádio-imunes (RIA), imunohistoquímica, imunofluorescência e seus semelhantes.

[00103] Métodos de determinação do nível na planta do RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análise Northern blot, reação em cadeia de transcrição reversa da polimerase (RT-PCR) ensaios (incluindo quantitativos, semi- quantitativos ou RT-PCR em tempo real) e hibridização in situ do RNA.

[00104] Os polinucleotídeos e polipeptidios descritos acima podem ser utilizados em amplo alcance de plantas econômicas, em uma maneira segura e de custo efetivo.

[00105] O efeito do transgene (o polinucleotídeo exógeno codificando o polipeptídio) no teor de óleo, produção da planta, produção da semente, biomassa, taxa de crescimento e/ou vigor pode ser determinado utilizando métodos conhecidos.

[00106] O teor de óleo de uma planta pode ser determinado pela extração do óleo da semente ou da porção vegetativa da planta. Resumidamente, lipídios (óleo) podem ser removidos da planta (por exemplo, semente) através da penetração do tecido vegetal na presença de solventes específicos (por exemplo, hexano ou éter de petróleo) e da extração do óleo em um extrator contínuo. Análise indireta de teor de óleo pode ser realizada utilizando vários métodos conhecidos, tais como Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), que mede a energia de ressonância absorvida por átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra [Ver, por exemplo, Conway TF. and Earle FR., 1963, Journal of. the American Oil Chemists' Society; Springer Berlin / Heidelberg, ISSN: 0003-021X (Impresso) 1558-9331 (Online)]; a Espectroscopia no Infravermelho Próximo (IVP), que utiliza a abosurção de energia próxima ao infravermelho (11002500 nm) pela amostra; e um método descrito em W0/2001/023884, que é baseado na extração de óleo de um solvente, evaporando o solvente em um fluxo de gás que forma partículas de óleo, e no direcionamento da luz para dentro do fluxo de gás e partículas de óleo que forma uma luz refletida detectável. Outros métodos de determinação de teor de óleo são descritos no Exemplo 7 da seção de Exemplos que segue.

[00107] O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento em parâmetros de crescimento, tais como área da folha, diâmetro da roseta, peso recente da planta e semelhantes por tempo.

[00108] A taxa de crescimento pode ser medida utilizando uma análise digital de crescimento de plantas. Por exemplo, imagens de plantas crescendo em estufas em bases de lote podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área da roseta é calculado utilizando a diferença de área da roseta entre dias de experimentos divididos pela diferença em dias entre amostras.

[00109] Medições da produção de semente podem ser feitas coletando as sementes totais de 8-16 plantas juntas, pesando-as utilizando balança analítica e dividindo o peso total pelo número de plantas. A semente por área crescente pode ser calculada da mesma maneira enquanto levando em conta a área de crescimento dada a uma única planta. A produção elevada da semente por área de crescimento pode ser atingida aumentando a safra de semente por planta, e/ou aumento o número de plantas capazes de crescerem em determinadas áreas.

[00110] A avaliação da produção de semente por planta pode ser feita medindo a quantia (peso ou tamanho) ou quantidade (i.e., número) ou sementes secas produzidas e colhidas de 8-16 plantas e divididas pelo número de plantas.

[00111] A avaliação da taxa de crescimento pode ser feita medindo-se a biomassa da planta produzida, área da roseta, tamanho da folha ou comprimento da raiz por tempo (pode ser medido em cm2por dia de área da folha).

[00112] Assim, a presente invenção é de alto valor agrícola para promover a produção de safras desejadas comercializadas (por exemplo, sementes).

[00113] Quaisquer plantas transgênicas descritas acima ou partes destas podem ser processadas para produzir um alimento, refeição, proteína ou Preparação de óleo, tais como animais ruminantes.

[00114] As plantas transgênicas descritas aqui, que exibem um teor de óleo elevado pode ser utilizado para produzir óleo vegetal (através da extração do óleo da planta).

[00115] O óleo vegetal (incluindo o óleo da semente e/ou o óleo de porção vegetativa) produzido de acordo com o método da invenção pode ser combinado com uma variedade de outros ingredientes. Os ingredientes específicos incluídos em um produto são determinados de acordo com o objetivo do uso. Produtos exemplares incluem alimentação animal, matéria prima para modificação química, plástico biodegradável, alimento misturado, óleo comestível, biogás, óleo de cozinha, lubrificante, biodiesel, lanche, cosméticos, e matéria prima de processo de fermentação. Produtos exemplares para serem incorporados aos óleos vegetais incluem de alimentação animal, alimentos humanos tais como lanches extrusados, pães, como agente aglutinador de alimento, bebidas esportivas, barras nutricionais, suplementos multi-vitaminicos, bebidas diet, e cereais.

[00116] Como utilizados aqui, o termo "aproximadamente" refere a? 10 %.

[00117] Os termos "abrange", "abrangendo", "inclui", "incluindo", "possuindo" e seus conjugados significam "incluindo, mas não limitado a".

[00118] O termo "consistindo" significa "incluindo e limitado a". O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, métodos ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alteram materialmente as características básicas e novas da composição reivindicada, método ou estrutura.

[00119] Como utilizado aqui, a foram simples "um/uma", "um/uma" e "o/a" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente fale de outra forma. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas disso.

[00120] Através desta aplicação, várias configurações desta invenção podem ser apresentadas um formato variado. Pode ser entendido que a descrição na no formato variado é meramente para conveniência e brevidade e deveria não ser construída como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Portanto, a descrição de uma variação deveria ser considerada especificamente divulgada todas as possíveis sub-variações assim como valores numéricos individuais dentro da variação. Por exemplo, a descrição de uma variação de 1 a 6 deveria ser considerada especificamente sub-variações divulgadas de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc.; assim como números individuais dentro daquela variação, por exemplo, 1,2,3,5 e 6. Isto se aplica independente da amplitude da variação.

[00121] Quando uma variação numérica está aqui indicada, significa incluir qualquer numeral citado (fracional e integral) dentro da variação indicada. As frases "variando/variação entre" o primeiro número indicado e um segundo número indicado e "variando/variação de" um primeiro número indicado "para" um segundo número indicado são utilizados indistintamente e destinam-se a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionados e integrais dentre eles.

[00122] Como utilizado aqui o termo "método"refere à maneira, meio, técnicas e procedimentos para realizar uma determinada tarefa incluindo, não são limitando a, aquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos ou conhecidos, ou prontamente desenvolvidos de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por práticos da técnica química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00123] Reconhecem-se certos recursos d invenção, que são, para clareza, descritas no contexto de configurações separadas, podem também ser fornecidas em combinação em uma configuração única. Inversamente, vários recursos da invenção, que são, para brevidade, descritos no contexto de uma configuração única, também pode ser fornecida separadamente ou em qualquer sub-combinação apropriada ou como apropriada em qualquer outra configuração descrita da invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias configurações não são considerados recursos essenciais daquelas configurações, a menos que as configurações sejam inoperantes sem aqueles elementos.

[00124] Várias configurações e aspectos da presente invenção como delineada acima e como reivindicado na seção de reivindicação abaixo encontra apoio experimental nos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

[00125] Referência é agora feita para os exemplos seguintes, que junto com as descrições acima ilustram algumas configurações da invenção em um costume sem limite.

[00126] Geralmente, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas molecular, bioquímica, microbiológica e de DNA recombinante. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes IIII Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et ai., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set fcrth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes IIII Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980) ; imunoensaios disponíveis são consideravelmente descritos na patente e literatura científica, ver, por exemplo, na Pat. Americana Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 e 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos dos quais são incorporados pela referência como se completamente demonstrado aqui. Outras referências gerais são fornecidas completamente neste documento. Os procedimentos aqui se acreditam serem bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Toda a informação contida aqui é incorporada pela referência.

EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DO GENE PREVISÃO DA FUNÇÃO DO GENE UTILIZANDO FERRAMENTAS DA BIOINFORMATICA

[00127] Polipeptídeos de codificação dos genes, adequado para o aumento do óleo da semente e quantidade de semente foram identificados por análise em profundidade de perfis de expressão de RNA, similaridades de sequência, anotações de genes, vias bioquímicas, DNA, ESTs, proteína e expressão de base de dados depositados na internet. Ferramentas da Bioinformática

[00128] Identificação de gene em silício - Para identificar novos genes que poderiam grandemente afetar a quantidade de óleo da semente, genes Arabidopsis, já encontrados a desempenhar papel fundamental na embriogênese, desenvolvimento da semente e síntese e acúmulo do óleo foram identificados na literatura ('os genes do gancho do óleo - GGOs). O número do GGos está de acordo com o website TAIR [Http://www.Arabidopsis.org/] e inclui toda a informação sobre os GGOs. Os GGOs incluem alelos tipo selvagem de Ssi2 (AT2G43710), OlesinA (AT3G01570), Lecl (AT1G21970), Lec2 (at1g28300), Fus3 (AT3G26790), FAD3 (AT2G29980), ABI3 (AT3G24650) e Nril (AT3G54320). A comparação de perfil de expressão de gene em 79 estágios de desenvolvimento diferentes da Arabidopsis foi feita sobre os genes GGOs e todos os outros genes impressos no Nottingham Arabidopsis Stock Centre[Centro de Estoque de Arabidopsis em Nottingham] [(NASC), Http://affymetrix.Arabidopsis.info/)] micro ensaios descrevendo a autonomia, desenvolvimento e vários experimentos de stress. A correlação foi determinada utilizando a análise de correlação estatística Pearson [Http://davidmlane.com/hiperstat/A34739.html].

[00129] Os critérios utilizados para cada um dos genes são descritos em detalhes na Tabela 1 abaixo e cobre uma variedade de racionalidades biológicas que utilizam várias abordagens de bioinformática. Os genes foram selecionados para causar alterações no tamanho da semente e/ou quantidade de óleo da semente baseado na sua correlação de expressão mais alta (dada como valores Pearson R entre 0,7 < R < 1) para um ou mais dos GGOs. A lista de genes identificados e sua correlação (valor R) para cada um dos GGos são fornecidos na Tabela 1, abaixo.Tabela 1

[00130] Genes adicionais que são previstos para afetar a síntese do óleo da Semente e que foram identificados utilizando ferramentas de bioinformática são fornecidos na Tabela 2, abaixo. Tabela 2

Exemplo 2 PRODUÇÃO DE TRANSCRIPTOMA DE ARABIDOPSIS E ALTA ANÁLISE DE CORRELAÇÃO DE RENDIMENTO USANDO MICRO ENSAIO DE OLIGONUCLEOTÍDEO DE GENOMA COMPLETO DE ARABIDOPSIS 44 K

[00131] A fim de produzir uma alta análise de correlação de rendimento, os presentes inventores utilizando um micro ensaio de oligonucleotídeo da Arabidopsis thaliana, produzida pela Agilent Technologies [Http://www.chem.agilent.com/Scripts/PDS.asp?1Page=50879]. O ensaio de oligonucleotídeo representa cerca de 40.000 A. thaliana e transcritos designados baseados nos dados da base de dados TIGR ATH1 v.5 e base de dados da Arabidopsis MPSS (Universidade de Delaware). A fim de definir as correlações entre os níveis de expressão de RNA e componentes do rendimento ou parâmetros de vigor relacionados, várias características da planta de 15 ecótipos diferentes de Arabidopsis foram analisadas. Entre elas, nove ecótipos englobando a variância observada foram selecionadas para a análise de expressão do RNA. A correlação entre os níveis de RNA e os parâmetros caracterizados foram analisados utilizando teste de correlação Pearson [Http://www.davidmlane.com/hiperstate/A34739.html]. Procedimentos Experimentais

[00132] Extração de RNA - Cinco tecidos de estágios de desenvolvimento diferente [raiz, folha, flor em antese, semente em 5 dias após a floração (DAF) e semente em 12 DAF], representando diferentes características da planta, foram amostradas e o RNA foi extraído utilizando Reagente TRIzol da Invitrogen [Http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageid=469]. Por conveniência, cada tipo de tecido de informação de expressão de micro ensaio recebeu um Conjunto de ID como resumido na Tabela 3 abaixo.Tabela 3 Conjuntos experimentais do Transcriptoma de Arabidopsis

[00133] Aproximadamente 30-50 mg de tecido foi tomado das amostras. Os tecidos pesados foram moídos com almofariz e pilão em nitrogênio líquido e resuspensos em 500 ?l do Reagente TRIzol. Para o homogeneizado lisado, 100 ?l de clorofórmio foi adicionado seguido pela precipitação utilizando isopropanol e duas lavagens com etanol 75%. O RNA foi eluído em 30 ?l de água livre de RNase. A amostras de RNA foram limpas utilizando o protocolo de limpeza minikit Qiagen's RNeasy como o protocolo do fabricante.

[00134] Componente do rendimento e avaliação dos parâmetros relacionados ao vigor - 8 ecótipos Arabidopsis em 5 blocos repetitivos (nomeados de A, B, C D e E), cada contendo 20 plantas por parcela cresceram em condições de controle de estufa 22?C, 20:20:20 (razão dos pesos) foi adicionado fertilizante N:P:K [nitrogênio (N), fósforo (P) e Potássio (K)]. Durante esse período os dados foram coletados, documentados e analisados. Os dados adicionais foram coletados através da fase de muda das plantas cultivadas em cultura de tecidos em placas de Agar transparente de crescimento vertical. Parâmetros de dados coletados são resumidos na Tabela 4, abaixo.Tabela 4 Parâmetros correlacionados da Arabidopsis (vetores)

[00135] Muitos dos parâmetros de escolha foram analisados por imagem digital.

[00136] Imagem digital - Um sistema de aquisição de imagem de laboratório, que consiste de uma câmera de reflexo digital (Canon EOS 300 D) acoplada com lentes de comprimento focal de 55 mm (Canon série EF-S), montada sobre um dispositivo de reprodução (Kaiser RS), que incluiu 4 unidades de luz (lâmpada elétrica de 4 x 15 watts) e localizada em uma sala escura, foi utilizada para captura de imagem de mudas serradas nas placas quadradas de ágar.

[00137] O processo de captura de imagem foi repetido a cada 2 dias iniciando no dia 7 até dia 14. A mesma câmera anexada com uma lente focal de comprimento 24 mm(Canon série EF), colocada em um monte de ferro, foi utilizada para capturar imagens de plantas maiores serradas em tubos brancos em estufa ambiental controlada (como visto na Figura 2b).

[00138] Os tubos brancos de forma quadrada com medidas de 36 x 26,2 cm e 7,5 cm de profundidade. Durante o processo de captura, os tubos foram colocados sob o monte de ferro, enquanto evita luz solar direta e sombras. Este processo foi repetido a cada 3-4 dias por até 30 dias.

[00139] Um sistema de análise de imagem foi utilizado, que consiste de um computador desktop pessoal (processador Intel P4 3.0 GHz) e um programa de domínio público - ImageJ 1.37 (Java baseado no programa de processamento da imagem que foi desenvolvido no Instituto Nacional Americano de Saúde e livremente disponível na internet no http://rsbweb.nih.gov/). As imagens foram capturadas na resolução 6 Mega Pixel (3072 x 2048 pixels) e armazenadas em baixa compressão no formato JPEG (Joint Photographic Experts Group standard). Em seguida, dados analisados foram salvos aos arquivos de texto e processados utilizando o software de análise estatística 311P (instituto SAS).

[00140] Análise da folha - utilizando dados de folhas de análise digital foi calculado, incluindo número de folha, área, perímetro, comprimento e largura. No dia 30, 3-4 plantas representativas foram escolhidas de cada parcela dos blocos A, B e C. As plantas foram dissecadas, cada folha foi separada e foi introduzida entre duas bandejas de vidro, uma foto de cada planta foi tomada e os vários parâmetros (tal como área total da folha, comprimento laminar, etc) foram calculados a partir das imagens (Figura 1 ad). A circularidade da lâmina foi calculada como largura laminar dividida pelo comprimento laminar.

[00141] Análise da raiz - Durante 17 dias, os diferentes ecótipos cresceram em placas de Agar transparente. As placas foram fotografadas a cada 2 dias iniciando no dia 7 na sala de fotografia e o desenvolvimento das raízes foi documentado (Figuras 2a-b).

[00142] A taxa de crescimento foi calculada de acordo com a seguinte formula I.

[00143] Fórmula I: Taxa da área de crescimento relativo = (? Área/?t) * (1/área tO) 6t é o dia da imagem atual analisada subtraída do dia inicial (t-t0).

[00144] Assim, a taxa da área de crescimento relativo está na unidade de 1/dia e taxa de crescimento está na unidade de 1/dia. Análise da taxa de crescimento vegetativo - A taxa de crescimento foi calculada dividindo a área adicionada (á área) pelo número de dias para cada intervalo (At). A análise foi finalizada com a aparência de plantas sobrepostas.

[00145] A taxa de crescimento foi calculada de acordo com a fórmula II.

[00146] Fórmula II: Taxa de crescimento = A área / At.

[00147] Para comparação entre ecótipos, a taxa calculada foi normalizada utilizando a etapa de desenvolvimento da planta como representado pelo número de plantas verdadeiras. Em casos onde as plantas com 8 folhas foram amostradas duas vezes (por exemplo, no dia 10 e dia 13), somente a amostra maior foi escolhida e adicionada para comparação Anova.

[00148] Sementes em análise de síliquas - No dia 70, 15-17 síliquas foram coletadas de cada parcela nos blocos D e E. As síliquas escolhidas eram de cor marrom, mas ainda intactas. As síliquas foram abertas na sala de fotografia e as sementes foram dispersas sobre uma bandeja de vidro, uma figura digital de alta resolução foi tomada de cada parcela. Utilizando as imagens, o número das sementes por síliqua foi determinado.

[00149] Peso médio das sementes - No final do experimento, todas as sementes das parcelas A-C foram coletadas. Um peso médio de 0,02 gramas foi medido de cada amostra, as sementes foram dispersas sobre uma bandeja de vidro e uma fotografia foi tirada. Utilizando a análise digital, o número de sementes em cada amostra foi calculado.

[00150] Porcentagem de óleo nas sementes - No final do experimento todas as sementes das parcelas A-C foram coletadas. As sementes Columbia de 3 parcelas foram trituradas e misturadas e então montadas na câmara de extração. 210 ml de n-hexano (cat. No. 080951 Biolab Ltd.) foram utilizados como o solvente. A extração foi realizada por 30 horas em. meio aquecido a 50°C. Uma vez finalizada a extração o n-hexano foi evaporado utilizando o evaporador a 35°C e condições de vácuo. O processo foi repetido duas vezes. A informação adquirida do extrator Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung dês Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) foi utilizado para criar uma curva de calibração para a Baixa Ressonância NMR. O conteúdo do óleo de todas as amostras de semente foi determinado utilizando Baixa Ressonância NMR (MARAN Instrumento Ultra-Oxford) e seu pacote de software MultiQuant.

[00151] Análise de comprimento da síliqua - No dia 50 da semeadura, 30 síliquas de diferentes plantas em cada parcela foram amostradas no bloco A. As síliquas escolhidas eram de cor verde-amarelo e foram coletadas das partes profundas de um tronco da planta em crescimento. Uma fotografia digital foi tirada para determinar o comprimento da síliqua.

[00152] Peso seco e rendimento da semente - No dia 80 da semeadura, as plantas dos blocos A-C foram coletadas e deixadas secar a 30°C em uma câmara de secagem. A biomassa e o peso da semente de cada parcela foram separados, medido e dividido pelo número de plantas. Peso seco = peso total da porção vegetativa acima do solo (excluindo as raízes) após a secagem a 30?C em câmara de secagem; rendimento da semente por planta = peso total da semente por planta (gr).

[00153] Rendimento do óleo - O rendimento do óleo foi calculado utilizando a Fórmula III. Fórmula III: Rendimento do óleo da semente = rendimento da semente por planta (gr)* % de óleo na semente

[00154] Índice de Colheita - 0 índice de colheita foi calculado utilizando a Fórmula IV. Fórmula IV: Índice de Colheita = Rendimento médio da semente por planta/Peso médio seco

Resultados Experimentais

[00155] Nove ecótipos diferentes de Arabidopsis cresceram e foram caracterizados por 18 parâmetros (nomeado como vetores). Os valores caracterizados são resumidos nas Tabelas 5 e 6 abaixo.Tabela 5 Ecótipos de Arabidopsis, parâmetros medidos

Tabela 6 Ecótipos de Arabidopsis, parâmetros adicionais medidos

[00156] Os genes selecionados, seus R (calculado utilizando a correlação Pearson), os parâmetros caracterizados utilizaram como eixo x para correlação e o tecido correlacionado com o transcriptoma são resumidos na Tabela 7, abaixo. Tabela 7 Genes de Arabidopsis selecionados e sua correlação com os componentes do rendimento entre diferentes conjuntos do transcriptoma

[00157] As seguintes Tabelas 8-15 apresentam os polinucleotídeos que são previstos baseados na análise de correlação do micro ensaio para aumentar no rendimento da semente na planta (Tabela 8), rendimento do óleo (Tabela 9), taxa de crescimento (Tabela 10), forma/tamanho/comprimento do órgão (Tabela 11), índice de colheita (Tabela 12), Conteúdo do óleo por semente (Tabela 13), matéria seca na planta (Tabela 14) e número de semente por síliqua (Tabela 15). Notou-se que os polinucleotídeos adicionais descritos na aplicação imediata podem ser utilizados para alterar as características acima nas plantas.Tabela 8 Polinucleotídeos que impactaram no rendimento de semente

Tabela 9 Polinucleotídeos que impactaram o rendimento do oleo

Tabela 10 Polinucleotídeos que impactaram na taxa de crescimento

Tabela 11 Polinucleotídeos que impactaram na forma/tamanho/comprimento do órgão

Tabela 11. forma/tamanho/comprimento do órgão inclui por exemplo, comprimento da folha, largura da folha, circularidade da folha, tamanho da semente, ou comprimento da raiz. Tabela 12 Polinucleotídeos que impactaram no índice da colheita

Tabela 13 Polinucleotídeos que impactaram no conteúdo por semente

Tabela 14 Polinucleotídeos que impactaram na matéria seca da planta

Tabela 15 Polinucleotídeos que impactaram no número de semente por síliqua

EXEMPLO 3 CLONAGEM DE GENE E CRIAÇÃO DOS VETORES BINÁRIOS RARA EXPRESSÃO DA PLANTA Estratégia de Clonagem

[00158] Os genes selecionados daqueles listados no Exemplo 1 e 2 acima foram clonados em vetores binários para a geração de plantas transgênicas. Para a clonagem, a estrutura de leitura de abertura (ELA) do comprimento total foi primeiro identificada. No caso do agrupamento ELA- EST e em alguns casos de sequências de RNAm foram analisados para identificar a estrutura de leitura da abertura total pela comparação dos resultados de algoritmos de translação para proteínas reconhecidas de outras espécies de plantas. Para clonar os cDNAs de comprimento total, Transcrição Reversa seguida de PCR (TR-PCR) foi realizada no RNA total extraído do Arabidopsissíliquas coletados 3 e 13 dias após a floração (3 e 13 DAF). O RNA foi extraído utilizando protocolo de extração de RNA com borato quente de acordo com WWW.eeob. iastate.edu/faculty/WendelVultramicroma.html . A produção de cDNA (utilizando hexamer aleatório e precursor poli dT) e amplificação PCR foi realizada utilizando protocolos padrão descritos em outro lugar (Sambrook J., E. F. Fritsch, e T. Maniatis.1989. Clonagem Molecular. Um Laboratório Manual., 2' Ed. Cold Spring Harbor laboratory Press, Nova Iorque) e são rotina para aqueles mortos na técnica.

[00159] Para clonar a região genômica de comprimento total de um gene, o DNA genômico foi extraído das folhas de Arabidopsis thallana tipo selvagem (TS) (Kit mini plant da DNeasy, Qiagen, Alemanha).

[00160] Todos os genes foram amplificados por PCR. Os produtos do PCR foram purificados utilizando kit de purificação de PCR Elute Mini (Qiagen) e foi realizado o seqüenciamento dos produtos de PCR amplificados, utilizando seqüenciador ABI 377 (Biosistemas Aplicados). Para facilitar a clonagem das sequências genómica do cDNA, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada a extremidade inicial de cada primer. A extensão do primer inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição são selecionados utilizando dois parâmetros: (a). O local não existe na sequência do cDNA; e (b). Os locais de restrição nos primers iniciais e finais são designados de modo que o cDNA digerido é inserido no sentido de formação do vetor binário utilizado para transformação.

[00161] Os produtos do PCR foram purificados (Kit de purificação PCR Mini Elute, Qiagen, Alemanha) e digeridos com os locais de restrição de acordo com os primers utilizados (Roche, Suiça). Os produtos digeridos do PCR foram primeiro subclonado em um vetor de alta cópia [(originado do vetor plasmideo KS pBlue-script http://www.stratagene.com/manuals/212205.pdf)] com o promotor 35S (SEQ ID NO:921), e o terminador NOS (SEQ ID NO:922) originado do vetor binário pBI 101.3 (Genbank Acesso No. U12640, BP 4417 a 4693), seguido por clonagem nos vetores binários pGI ou pMBArt (de acordo com a Tabela 16, abaixo). Os produtos digeridos do PCR e o vetor plasmídeo linearizado foram ligados utilizando e enzima DNA ligase T4 (Roche, Suíça). Os seguintes polinucleotídeos foram clonados à partir do RNA extraído dos tecidos descritos acima ou do DNA genômico utilizando primers como fornecido na Tabela 17, abaixo.Tabela 16 Genes clonados em diferentes vetores binaries

Tabela 16: São fornecidos os identificadores de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos identificados de modo informal (bioinf.), assim como os identificadores de sequência dos polinucleotídeos clonados. Nos dois casos, as sequências do polipetídeo traduzida de genes clonados foram diferentes dos polipeptídeos previsíveis identificados pela bioinformática (SEQ ID Nos: 176 e 178) e os novos identificadores de sequência foram fornecidos (isto é, SEQ ID NO: 1047 para o polipeptídeo traduzido do gene clonado SEQ ID NO: 1042 e SEQ ID NO: 1048 para o polipeptídeo traduzido do gene clonado SEQ ID NO:1024).Tabela 17 Polinucleotídeos clonados da biblioteca de cDNA, DNA genômico ou produzido sinteticamente e os primers utilizados para clonagem

Tabela 17.

[00162] Para otimizar a sequência de codificação (no projeto do silício), Tabelas de uso de códons calculados a partir do Transcriptoma da planta foram utilizadas (exemplo de tal Tabela pode ser encontrada na Base da dos de Uso de Códons disponível online no Http://www.kazusa.oujp/códon/). As sequências de codificação otimizadas foram designadas de modo que nenhuma alteração foi introduzida na sequência de aminoácido codificado (de polipeptídeos selecionados da Tabela 1, Exemplo 1) enquanto utilizam códons preferidos para a expressão em plantas dicotiledônas principalmente Arabidopsis, Canola e Soja; e plantas monocotiledôneas tal como o milho. Tais sequências otimizadas prometem melhores taxa e translação e, portanto níveis mais altos de expressão de proteína. Para as sequências otimizadas acompanhando locais únicos adicionais de enzimas de restrição foram adicionados SaII, XbaI, BamHI, SmaI na extremidade 5' e SacI na extremidade 3' (exceto um gene-BDL-1, no qual o local SmaI foi excluído). Os genes pelos quais as sequências sintéticas (artificiais) otimizadas pelo códon foram preparados são: BDL-1 (SEQ ID NO:1040), BDL-4 (SEQ ID NO:1041), BDL-11 (SEQ ID NO;1042), BDL-17 (SEQ ID NO:1043), BDL-20b (SEQ ID NO: 1044), BDL-24 (SEQ ID NO: 1045), BDL-30 (SEQ ID NO:1046). As sequências artificiais de polinucleotídeos otimizadas foram sintetizadas por um fornecedor comercial [GeneArt, GmbH, Http://www.geneart.com/)].

[00163] Geração de vetores binários compreende genes BDL e promotores funcionais de plantas por guiar a expressão do mesmo - O plasmídeo pPI foi construído pela inserção de uma sequência de sinal sintética poli -(A), originado do vetor plasmídeo básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; BP 4658-4811) no local de restrição Hindu do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Genbank Acesso No U12640). Em alguns casos o plasmídeo binário da coluna vertebral utilizado foi o pGI que é semelhante ao pPI mas o gene GUS foi substituído pelo gene GUS-Intron (Vancanneyt., G. et al MGG 220, 245-50, 1990). O pGi utilizado para clonar parte das sequências de polinucleotídeo, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al., Nature 313, 810-812 (28 de Fevereiro de 1985); SEQ ID NO: 921]. As sequências adicionais foram clonadas em pMBArt sob o controle do promotor 35S.

[00164] Algumas sequências de polinucleotídeos foram clonadas sob outro promotor preferencial como descrito abaixo. O promotor, nomeado Napin originário da Brassica napus que é caracterizada por uma semente de atividade promotora específica [Stuitje A. R. et al. Plant Biotechnology Journal 1(4): 301-309], foi amplificado por POR direto sobre o DNA genômico extraído do tecido da folha utilizado kit DNAeasy (Qiagen Cat. No 69104) utilizando os seguintes primers: Napin F Hind III (Enzima HindIII)- 5'- ATAAGCTTATTGATTCCTTTAAAGACTTATGTI (SEQ ID NO: 1013) Napin R Sal I (Enzima Sal 1)- 5'- TCGTCGACGGGTGIATGTTTTTAATCTTGTIT (SEQ ID NO: 1014).

[00165] Os seguintes genes foram clonados em sentido para baixo da sequência do promotor Napin: BDL-2, BDL-3, BDL-4, BDL-6, BDL-12, BDL-14, BDL-15, BDL-17, BDL-18, BDL-21, BDL-23, BDL-25, BDL-27, BDL-28, BDL29, BDL-32b, Wrinkel. Para proposto de controle, a enzima ?glicuronidase (GUS, SEQ ID NO: 1051) codificada pelo gene A uid (GUS- Intron, SEQ ID NO: 1049).

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE PLANTAS ARABIDOPSISTRANSGÊNICAS EXPRESSANDO OS GENES DO ÓLEO DA SEMENTE Materiais e Métodos

[00166] Transformação da planta foi realizada de acordo com (Clough SJ, Bent AF, 1998. Imersão floral: um método simplificado para a transformação mediada de Agrobacterium da Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6): 735-43, Desfeux C, Clough SJ, Bent AF.2000.

[00167] Os tecidos reprodutivos femininos são os alvos primários da transformação mediada do Agrobacterium pelo método de imersão floral da Arabidopsis. Plant Physiol. 123 (3): 895-904).

[00168] A Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas To) foram transformadas de acordo com o procedimento de imersão floral descrito por Clough SJ, Bent AF. (1998) Imersão floral: um método simplificado para a transformação mediada de Agrobacterium da Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6): 735-43, Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (20000 tecidos reprodutivos femininos são os alvos primários da transformação mediada do Agrobacterium pelo método de imersão floral da Arabidopsis. Plant Physiol. 123 (3): 895-904) com poucas modificações. Brevemente, Arabidopsis thaliana Columbia (Co10) Plantas To foram semeadas em recipientes de 250 ml preenchido com mistura de crescimento úmido peat-based. Os recipientes foram cobertos com folha de alumínio e uma cúpula de plástico, mantida a 4°C por 3-4dias, depois descoberta e incubado em câmara de crescimento a 18-24°C sob 16/18 horas de ciclos luz/escuro. As plantas To estavam prontas para a transformação de seis dias antes da antese.

[00169] Colônias únicas de Agrobacterium carregando os vetores binários abrigando os genes do óleo da semente foram cultivados em meio LB suplementado com canamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas em 28°C por 48 horas sob agitação vigorosa e centrifugado em 4000 rpm por 5 minutos. Os pellets compreendendo as células Agrobacterium foram resuspensas em um meio de transformação que contem metade da concentração (2,15 g/L) Murashige-Skoog (Duchefa); 0,044 ?M de benzilamina purina (Sigma); 112 ?g/L B5 Gambourg vitaminas (Sigma); sacarose 5%; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Especialistas, CT) em água duplamente destilada, em pH de 5,7.

[00170] A transformação de plantas To foi realizada pela inversão de cada planta em uma suspensão de Agrobacterium tal que c tecido da planta acima do solo foi submerso por 3-5 segundos. Cada planta To inoculada foi imediatamente colocada em bandeja de plástico, depois coberta com cúpula de plástico transparente para manter a umidade e manter em sala escura em temperatura por 8 horas para facilitar a infecção e transformação. Plantas To transgênicas cresceram em estufa por 3-5 semanas até síliquas ficarem marrom e seca, depois as sementes foram coletadas de plantas e mantidas em temperatura ambiente até semear.

[00171] Para a geração de plantas transgênicas T1 e T2 abrigando os genes, sementes coletadas das plantas transgênicas To foram esterilizadas na superfície por imersão em etanol 70% por 1 minuto, seguido por imersão em hipocloreto de sódio 5% e Triton 0,05% por 5 minutos. As sementes esterilizadas na superfície foram completamente lavadas em água destilada estéril e depois colocadas em placas de cultura contendo metade da concentração Murashige-Skoog (Duchefa); sacarose 2%; agra planta 0,8%; canamicina 50 mM; e carbenicilina 20 mM (Duchefa). As placas de cultura foram incubadas a 4°C por 48 horas e depois transferidas para uma sala de crescimento a 25°C por uma semana de incubação adicional. As plantas Arabidopsis T1 Vital foram transferidas para placas de cultura fresca por outra semana de incubação. Após a incubação as plantas T1 foram removidas das placas de cultura e plantadas em mistura de crescimento contido nos recipientes de 250 mL. As plantas transgênicas cresceram em estufa para maturação. As sementes colhidas das plantas Ti foram cultivadas e crescidas para maturação como as plantas T2 sob as mesmas condições como utilizado para cultura e crescimento das plantas T1.

EXEMPLO 5 IDENTIFICAÇÃO ADICIONAL DE SEQUÊNCIAS COM A MAIOR PROBABILIDADE PARA CONFERIR EFEITS FAVORÁVEIS SEMELHANTES NAS PLANTAS TRANSGÊNICAS

[00172] Os métodos para a procura e identificação de homólogos do rendimento da semente de polipeptídeo ou polinucleotídeo estaria bem dentro do domínio de uma pessoa qualificada na técnica. A procura e identificação dos genes homólogos envolvem a seleção da sequência de informação disponível, por exemplo, base de dados pública, que inclui, mas não se limita à Base de Dados de DNA do Japão (BDDJ), Genbank, e a Base de Dados da Sequência de Ácido Nucléico do Laboratório de Biologia Molecular da Europa (LEME) ou versões disso ou a Base da dados MIPS. Um número de diferentes algoritmos de busca foi desenvolvido, incluindo, mas não limitado a programas referidos como programas BLAST. Existem cinco implementações do BLAST, rês designados para sequência de nucleotídeo (BLASTIN, BLASTX, e TBLASTX) e dois designados para sequências de proteína (BLASTP e TBLASTN) (Coulson, Tendências na Biotecnologia: 7680, 1994; Birren et al., Análise do genoma, 1:543, 1997). Tais métodos envolvem alinhamento e comparação de sequências. O algoritmo BLAST calcula a porcentagem de identidade de sequência e desempenha uma análise estatística de similaridade entre as duas sequências. O software para desempenho da análise BLAST é publicamente disponível através do Centro Nacional para Informação em Biotecnologia. Outros software ou algoritmos são GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA. O GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para achar o alinhamento de duas sequências completas que maximizam o número de pares e minimiza o número de brechas.

[00173] Os genes homólogos podem pertencer a mesma família de gene. A análise de uma família de gene pode ser realizada utilizando análise similaridade de sequência. Para realizar esta análise um pode ser o programa padrão para múltiplos alinhamentos, por exemplo, Clustal W. Uma árvore de articulação vizinha das proteínas homólogas para os genes nesta invenção pode ser utilizada para fornecer um visão geral da estrutura e relacionamentos anteriores. A identidade de sequência pode ser calculada utilizando um programa de alinhamento como descrito acima. É esperado que outras plantas de genes semelhantes e aqueles genes fornecerão o mesmo fenótipo referido como os genes apresentados aqui. De maneira vantajosa, estes membros da família podem ser úteis nos métodos da invenção. Exemplo de outras plantas é incluído aqui, mas não são limitados a, cevada (Hordeum vulgare), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), milho (Zea mays), algodão (Gossypium),Oleo da semente de colza (Brassica napus), Arroz (Oryza sativa), cana de açúcar (Saccharum officinarum), Sorgo (Sorghum bicolor), Soja (Glycine max), Girassol (Helinathus annuus), Tomate (Lycopersicon esculentum), Trigo (Triticum aestivum).

[00174] As análises acima mencionadas para homologia de sequência são preferivelmente realizadas em uma sequência de comprimento total, mas pode ser baseado na comparação de certas regiões tal como os domínios conservados. A identificação de tais domínios, estaria também dentro do domínio da pessoa qualificada na técnica e envolveria, por exemplo, um formato legível de computador de ácidos nucléicos da presente invenção, o uso de programas de software de alinhamento e o uso de informação disponível publicamente sobre domínios de proteína, conservado motifs e caixas. Esta informação está disponível no PRODOM (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomq ry.html), PIR (http://pir.georgetown.edu/) ou base de dados Pfam (Http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam).

[00175] Os programas da análise da sequência designados para procura do motif podem ser utilizados para identificação dos fragmentos, regiões e domínios conservados como mencionado acima.

[00176] Os programas de computador preferidos incluem, mas não são limitados a, MEME, SIGNALSCAN, e GENESCAN.

[00177] Uma pessoa qualificada na técnica pode utilizar sequências homólogas fornecidas aqui para encontrar sequências semelhantes em outras espécies e outros organismos. Os homólogos de uma proteína englobam peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas que apresentam substituições de aminoácidos, deleções e/ou inserções relativas a uma proteína não modificada em questão e apresenta atividade biológica e funcional semelhante como a proteína não modificada que eles derivam. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos das proteínas podem ser substituídos por outros aminoácidos apresentando propriedades semelhantes (alterações de conservação, tal como hidrofobicidade, hidrofilicidade, antigenicidade semelhante, propensão de formar ou quebrar estruturas a-helicoidal ou estruturas de 3 folhas). As tabelas de substituição conservadora são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Creighton (1984) proteins. W. H. Freeman e Company). Os homólogos de um ácido nucléico englobam ácidos nucléicos apresentando substituições d nucleotídeo, deleções e/ou inserções relativas ao ácido nucléico não modificado em questão e apresentando atividade e função biológica e funcional semelhante como o ácido nucléico não modificado que eles derivam.

[00178] Genes identificados nos bancos de dados de sequência disponível pública quando compartilham alta sequência homóloga para os genes de Arabidopsis identificados aqui são resumidos na Tabela 18 abaixo. Aqueles genes são esperados em possuir funções semelhantes quando introduzido exogenamente nas plantas, como os genes identificados da Arabidopsis. Os genes homólogos são também fornecidos. Tabela 18 Polipeptídeos e polinucleotídeos que codificam o mesmo que compartilham alta sequência de homologia para polipeptídeos da Arabidopsis identificados da invenção.

EXEMPLO 6 DESEMPENHO DA PLANTA TRANSGÊNICA MELHORADA

[00179] Para analisar se as plantas transgênicas apresentam desempenho melhor, as plantas cresceram em recipientes com uma quantidade adequada de nutriente e água. As plantas foram analisadas para seu tamanho, taxa de crescimento, tempo para a inflorescência (floração), rendimento da semente, conteúdo de óleo d semente, peso de 1.000 sementes, matéria seca e índice de colheita (IC - rendimento da semente/matéria seca). O desempenho das plantas transgênicas foi comparado com as plantas controle crescidas em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas Mock expressam o gene relator uidA (GUS-Intron) sob o mesmo promotor foram utilizados como controle.

[00180] Os parâmetros foram medidos como descrito nos Exemplos 1 e 2.

[00181] Análise estatística - Para identificar genes que conferem melhora significante do desempenho da planta, os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados àquelas obtidas das plantas controle. A taxa de crescimento da planta, área da planta, tempo de peneirar, tempo de floração, peso de 1.000 sementes, rendimento da semente, rendimento do óleo, matéria seca, e dados da área do índice de colheita foram analisados por ANOVA de um único modo. Para identificar os genes superados e construções, os resultados da mistura dos eventos de transformação ou eventos independentes testados foram analisados. Para gene em comparação com a análise controle um teste t foi aplicado, utilizando significância de p < 0,05. O pacote de software estatístico JMP foi utilizado (Versão 5.2.1., SAS Institute Inc., Cary. NC, Estados Unidos).

Resultados experimentais

[00182] As sequências de polinucleotídeo da invenção foram analisadas para um número de traços desejados comercialmente.

[00183] As tabelas 19-24 representam a análise do rendimento da semente em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob uma regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A,B,) são significativamente diferente do controle.Tabela 19 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento da semente

Tabela 20.Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento da semente

Tabela 21 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento da semente

Tabela 22 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento da semente

Tabela 23 Genes mostrando desempenho melhorado da planta: rendimento da semente

Tabela 24 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento da semente

[00184] As Tabelas de 25-30 descrevem as análises do rendimento do óleo em plantas que super expresssam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A,B,) são significativamente diferente do controle. Tabela 25 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do óleo

Tabela 26 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do óleo

Tabela 27 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do óleo

Tabela 28 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do óleo

Tabela 28, *P = 0,07 Tabela 29 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do óleo

Tabela 30 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: rendimento do oleo

[00185] As Tabelas 31-32 representam as análises da matéria seca em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S). Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B,) são significativamente diferente do controle. Tabela 31 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: matéria seca

Tabela 32 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: matéria seca

[00186] As Tabelas 33-34 representam a análise do índice de colheita (IC) em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B,) são significativamente diferente do controle.Tabela 33 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: índice de colheita (IC)

Tabela 34 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: índice de colheita (IC)

[00187] As Tabelas 35-38 representam a análise do índice de colheita (IC) em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B,) são significativamente diferente do controle. Tabela 35 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Taxa de crescimento

Tabela 36 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Taxa de crescimento

Tabela 37 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Taxa de crescimento

Tabela 37, * P = 0,06 Tabela 38 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Taxa de crescimento

[00188] As Tabelas 39-42 representam a análise do índice de colheita (IC) em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B,) são significativamente diferente do controle. Tabela 39 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Área da Roseta

[00189] Tabela 39: Aumento da área Roseta significa melhor cobertura de óleo e reduzida perda de água do óleo. Diminuição na área Roseta significa que mais plantas poderiam ser colocadas por área aumentando o rendimento. Tabela 40 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Área Roseta

[00190] Tabela 40: Aumento da área Roseta significa melhor cobertura de óleo e reduzida perda de água do óleo. Diminuição na área Roseta significa que mais plantas poderiam ser colocadas por área aumentando o rendimento. Tabela 41 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Área Roseta

[00191] Tabela 41: Aumento da área Roseta significa melhor cobertura de óleo e reduzida perda de água do óleo. Diminuição na área Roseta significa que mais plantas poderiam ser colocadas por área aumentando o rendimento.Tabela 42 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: Área Roseta

[00192] Tabela 42: Aumento da área Roseta significa melhor cobertura de óleo e reduzida perda de água do óleo. Diminuição na área Roseta significa que mais plantas poderiam ser colocadas por área aumentando o rendimento.

[00193] As Tabelas 43-49 representam a análise do índice de colheita (IC) em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um promotor constitutivo (35S) ou específico de semente (napin). Cada Tabela representa um experimento independente, usando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B) são significativamente diferente do controle. Tabela 43 Genes mostrando desempenho de planta melhorado: % óleo em semente

Tabela 44 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

Tabela 45 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

Tabela 46 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

Tabela 47 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

Tabela 48 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

Tabela 49 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: % de óleo na semente

[00194] As Tabelas 50-55 representam a análise do índice de colheita (IC) em plantas que super expressam os polinucleotídeos da invenção sob a regulação de um constituinte (35S) ou promotor específico (napin) da semente. Cada Tabela representa um experimento independente, utilizando pelo menos 5 eventos independentes por gene. Os genes não conectados pela mesma letra como o controle (A, B,) são significativamente diferente do controle. Tabela 50 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

Tabela 51 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

Tabela 52 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

Tabela 53 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

Tabela 54 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

Tabela 55 Genes mostrando desempenho da planta melhorada: peso de 1.000 sementes

[00195] Levando em consideração os resultados obtidos utilizando estes ensaios, os seguintes genes BDL, quando introduzidos por via exógena nas plantas, induziram uma melhora significante na: Rendimento da semente: BDL1, BDL3, BDL8, BDL14, BDL27, BDL32B.

[00196] Rendimento do óleo: BDL1, BDL3, BDL8, BDL14, BDL29, BDL32B.

[00197] Índice de colheita: BDL17, BDL28.

[00198] Taxa de crescimento: BDL1, BDL14.

[00199] Área Roseada: BDL14, BDL18, BDL20a, BDL30.

[00200] % do óleo na semente: BDL20b, BDL19, BDL32b.

[00201] Peso de 1000 sementes: BDL2, BDL11, BDL20b, BDL30, BDL32b.

EXEMPLO 7 CONTEÚDO DE ÓLEO AUMENTADO NAS FOLHAS

[00202] Em geral, óleos são compostos principalmente de triacilgliceróis (TAG). Sementes de Arabidopsis e outras sementes oleaginosas contendo altas quantidades de TAG. Geralmente os TAGs estão sendo degradados em açúcares através do processo de germinação. Cermac e Benning (Plant journal 2004; 40, 575-585) na sua função utilizou um ensaio para quantificar a produção de TAG nas mudas cultivadas em sacarose. Elas utilizam este estágio de desenvolvimento já que normalmente a mudas não apresentam TAG em altos níveis. No seu estudo, eles demonstraram a importância de gene enrugado no controle da produção de óleo mostrando que as mudam transgênicas super expressam o cDNA enrugado e produzem altas quantidades de TAG.

Materiais e Métodos Experimentais

[00203] O presente inventor utilizou o ensaio do Cermac e Benning (Cermac e Benning (Plant journal 2004; 40, 575-585) com poucas alterações para qualificar o efeito dos transgenes aqui identificados para sua capacidade em aumentar o TAG nas mudas, semelhante ao gene enrugado.

[00204] Para a quantificação do triacilglicerol nas mudas transgênicas T2 cresceram sobre metade do meio MS (Murashige e Skoog, 1962 Plan Physiology 15, 473-497), pH 5.9, sacarose 2% e Agar 0.7%. As ementes foram esterilizadas por evaporação de 100 ml de branqueador (10%) e 4 ml de HC1 (37%) por 90 minutos em câmara plástica fechada de 5,5L de volume.

[00205] O glufosinato de amônio e a canamicina foram adicionados as concentrações finais de 20 ?g.m1-1para glufosinato de amônio e 50 ?g.m1-1 de canamicina. Após a esterilização, as sementes foram semeadas em placas de ágar. As pacas foram incubadas no escuro a 4°C antes de colocá-las na sala de crescimento. As condições na sala de crescimento foram de 24°C, período de luz de 12 horas e um período sem luz de 12 horas. As mudas cresceram por 10-11 dias.

[00206] As mudas com igual quantidade de 11 dias cresceram em tubos testes de polipropileno de 1.5 ml com uma vareta de vidro, e os lipídios foram extraídos em 50 ml de clorofórmio:metanol:ácido fórmico (10:10:1, v/v). Após a extração com 12.5 ml de KC1 1 M e H3PO4 0.2 M e separação das fases orgânicas e aquosa por centrifugação a 16.000 g por 5 minutos, os lipídios na fase inferior foram separados sobre uma placa de sílica TLC (Si 250 PA, J.T. Baker, Philipsburg, NJ) desenvolvido com 80:20:1, éter de petróleo:éter etílico:ácido acético. Os lipídios foram visualizados pela mancha com vapor de iodeto.

[00207] Como controles positivos os seguinte foram utilizados: Os triacilgliceróis naturalmente produzidos - extraído das sementes de Arabidopsis tipo selvagem (linha 5, Figura 3); e mudas transgênicas expressam cDNA ENRUGADO (SEQ ID No: 1050), que são conhecidos por produzir quantidades significantes de triacilgliceróis nas folhas (Cermac A e Benning C, The Plant Journal 2004, 40, 575-585). Como controle negativo as mudas transgênicas expressam o gene GUS-Intron (SEQ ID No:1049) foram utilizados.

Resultados Experimentais

[00208] A Figura 3 representa o vapor de iodeto na mancha de lipídios isolados de plantas transgênicas de eventos independentes (BDL9, ENRUGADO) ou pool de eventos (GUS-Intron) expressando os seguintes genes de acordo com a Tabela 56, abaixo. Um evento independente representa uma planta única estável transformada que resultou de integração ao acaso da construção transformada no genoma da Arabidopsis. Progenes de um evento abrigando a construção transformada foram utilizadas para a avaliação de genes separadamente como no caso do BDL9 e genes enrugados ou como pool de eventos no caso do GUS-Intron.Tabela 56

[00209] Como mostrado na Figura 3, as plantas transgênicas expressando o gene BDL9 (SEQ ID No: 1022) produziu um conteúdo de óleo significativamente maior quando comparado ao conteúdo de óleo produzido pelas plantas controle expressando o GUS-Intron (SEQ ID No: 1049). Além disso, a quantidade de óleo produzida pelas plantas transgênicas BDL9 (por exemplo, Figura 3, linha 2) é comparável com aquele produzido pelas sementes (Figura 3, linha 5) ou por plantas transgênicas expressando o gene enrugado conhecido (Figura 3, linha 6). Resumo

[00210] Os presentes inventores identificaram genes da Arabidopsis thaliana, que são importantes para embriogênese, desenvolvimento da semente e síntese do óleo e acúmulo. Estes genes, quando super expressos em plantas, podem efetivamente aumentar o conteúdo de óleo nas sementes ou folhas ou qualquer outra parte da planta. A expressão do tecido ou embriônico específico dos genes nas plantas podem resultar no aumento ótimo do conteúdo de óleo em qualquer tecido da planta. Assim, os transgenes podem ser expressos em certos estágios do embrião, desenvolvimento da semente ou para estágio de desenvolvimento de qualquer tecido alvo, definido como óleo de acúmulo no tecido. Este único perfil de expressão pode ser alcançado utilizando promotores específicos, tal como promotores de desenvolvimento, expressão da semente e promotores específicos da semente.

[00211] Os presentes inventores demonstraram melhora da síntese do óleo e acúmulo por aumento do tamanho da semente, que permite o óleo sintetizado ser acumulado em extensão maior, dentro de um grande volume.

[00212] Além disso, aumento do óleo pode ser alcançado pelo controle da embriogênese. O óleo é acumulado no embrião de semente desenvolvida. Alguns dos genes de desenvolvimento precoce de embriões são diretamente encarregados da regulação da síntese do óleo e armazenamento.

[00213] Os genes identificados da invenção podem melhorar o rendimento do óleo em geral, e mais especificamente a síntese do óleo, acúmulo do óleo e tamanho da semente. O rendimento do método de bioinformática aqui descrito é um conjunto de genes altamente previstos para melhorar o rendimento do óleo e da semente pela modificação da sua expressão. Apesar de cada gene ser previsto para apresentar seu próprio impacto, a modificação do modo de expressão de mais de um gene é esperado para fornecer um efeito aditivo ou sinergístico no desempenho do rendimento da semente/óleo da planta. Alterando a expressão de cada gene descrito aqui sozinho ou um conjunto de genes juntos aumenta o rendimento global do óleo, por isso espera-se diminuir o preço do óleo vegetal, assim como aumentar a produtividade.

[00214] Embora a invenção descrita em conjunto com as configurações específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes em relação àquelas qualificadas na técnica. Deste modo, pretende- se abranger tais alternativas, modificações e variações que são Inseridas no espírito e na abrangência das reivindicações anexadas.

[00215] Todas as publicações, patentes e aplicações de patente mencionadas nestas especificações são aqui incorporadas na sua íntegra pelas referências especificações, a mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou aplicação de patente foi especificamente e individualmente indicado para ser incorporada aqui pela referência. Além disso, citação ou identificação por qualquer referência nesta aplicação não deve ser construída como uma admissão que tal referência está disponível como técnica anterior para apresente invenção. Na medida em que os títulos da seção são utilizados, eles não devem ser construídos quando necessariamente limitante.

Conteúdo do CR-ROM

[00216] As seguintes listam o conteúdo do arquivo do CD-ROM que está anexado aqui e arquivado com a aplicação. A informação do arquivo é fornecida como: Nome do arquivo/tamanho em bytes/data de criação/sistema de operação/formato da máquina.

[00217] CD-ROM1 ( 1 arquivo de SEQUÊNCIA LISTADA): 1. "40043 st25.txt"/1,820,000 bytes/ 9 de Abril de 2008/ Microsoft Windows XP Professional /PC.

Claims

1. Método para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, caracterizadopelo fato de superexpressar na planta um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 194 ou 796, aumentando assim o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento da planta comparado a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de adicionalmente selecionar dita planta superexpressando dito polipeptídeo para teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento da planta aumentados comparado a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento

3. Método para produzir óleo, caracterizadopelo fato de compreender: (a) fornecer a planta como definida na reivindicação 1; e (b) extrair o óleo da planta; produzindo, desta forma, o óleo.

4. Método para aumentar o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, caracterizadopelo fato de superexpressar na planta um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida pela SEQ ID NO: 194, aumentando assim o teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, vigor e/ou rendimento da planta comparado a uma planta do tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada nas mesmas condições de crescimento.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a referida superexpressão é realizada introduzindo na planta um polinucleotídeo exógeno como apresentado pela SEQ ID NO: 29 ou 1036, que codifica o referido polipeptídeo como apresentado pela SEQ ID NO: 194, ou suas sequências degeneradas que codificam o referido polipeptídeo apresentado pela SEQ ID NO: 194.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo exógeno é apresentado pela SEQ ID NO: 1036 ou 29.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o óleo é um óleo de semente.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o óleo é de uma porção vegetativa da planta.

9. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de adicionalmente selecionar as referidas plantas que superexpressam o referido polipeptídeo para teor de óleo, taxa de crescimento, biomassa, rendimento e/ou vigor aumentados em comparação com uma planta de tipo selvagem da mesma espécie que é cultivada sob as mesmas condições de crescimento.

10. Método para produzir óleo, caracterizado pelo fato de: (a) fornecer a planta como definida na reivindicação 4; e (b) extrair o óleo da planta; produzindo assim o óleo.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo exógeno é apresentado pela SEQ ID NO: 1036.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o óleo é um óleo de semente.

13. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o óleo é de uma porção vegetativa da planta.