CN109161560A - 一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法 - Google Patents

一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法 Download PDF

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Abstract

一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，涉及一种转入了人血清白蛋白基因的柱花草的制备方法，以及从该转基因柱花草中表达的人血清白蛋白。目的是以基因重组人血清白蛋白在柱花草中的表达作为从人血清中提取分离血清白蛋白的替代方法，解决其来源有限且价格昂贵的问题。方法：一、以柱花草无菌苗真叶为外植体诱导形成愈伤组织；二、农杆菌菌液的活化与重悬；三、用农杆菌重悬液对胚性脆性愈伤组织进行转染；四、将转染后的愈伤组织转入共培养基上共培养；五、将愈伤组织移入筛选分化培养基中筛选培养，诱导抗性植物再生，鉴定为阳性的即为转基因柱花草。本发明用于获得可表达基因重组人血清白蛋白的转基因柱花草以及从中表达人血清白蛋白。

Description

一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法
技术邻域
本发明涉及转基因柱花草的制备，并用该转基因柱花草表达人血清白蛋白。
技术背景
人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血浆中主要的蛋白质，约占血浆总蛋白的60％，由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7～4.9之间。HSA的主要生理功能在于维持血液胶体渗透压；结合并运输内源性及外源性物质，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等；临床上用于烧伤和严重失血等引起的休克、急性缺血性脑卒中、肾病综合症、肝硬化、肺性脑病、糖尿病性肾病和皮肤溃烂，也可作为血浆增容剂。血浆白蛋白每下降2.5g/L，死亡危险性增加24％～56％；当血浆白蛋白水平<20g/L，患者死亡率几乎是100％。在制药领域，HSA广泛用作保护剂、稳定剂和赋形剂等。目前，HSA全球年市场需求量超过600吨。临床使用的HSA 主要通过人体血液提取，受人血来源不足和血源传染病的影响，供应相对紧张。因此，重组人血清白蛋白的生产作为一种获得大量无病原HSA的替代方法越来越受到重视。
由于临床上HSA的使用剂量为每日5～10g，现有微生物表达***的生产规模无法满足需要，转基因动物制备的基因重组HSA传播疾病的潜在风险。到目前为止，利用酵母和转基因水稻等制备的基因重组HSA主要用做培养基或者制剂辅料，仍然不能满足临床用药需求。
发明内容
本发明是针对现有原核或真核生物为生物反应器的表达量低、无生物活性或不安全等特点，为解决目前人血白蛋白来源有限及价格昂贵的问题，提供一种表达基因重组人血白蛋白的转基因柱花草的制备方法，并从中表达人血清白蛋白。
本发明用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：
一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，移至节律光照培养至形成真叶；
二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；
三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素 50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含AS 100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至 OD600达0.6～0.8，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃、180rpm浸泡2～5min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium) 的MS培养基清洗1次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；
七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；
八、将分化出的不定芽分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。
人血清白蛋白具有相对稳定的结构特性，相对于原核表达体系和酵母表达体系，采用转基因柱花草作为生物反应器能更好的进行转录翻译后的修饰，以保证基因重组人血清白蛋白能正确折叠形成具有生物活性的功能蛋白。
柱花草(Stylosanthes guianensias SW.)为豆科多年生草本植物，是优质的热带和亚热带牧草之一。柱花草耐热、耐低磷、耐干旱、抗虫害，耐瘠薄酸性土壤，耐践踏，不耐低温和浸渍，其根系发达，分枝多，丛生，茎匍匐或半匍匐。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，脂肪1.6～2.0％，纤维26.0～29.0％，无氮浸出物38.0～44.0％。单播的人工草地多为刈割，用于青饲或调制干草、干草粉。中国南方如广东、广西等地，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和绿肥作用。柱花草作为优质牧草之一，具有较高的营养价值，且产量较高，可作为良好的植物生物反应器生产外源蛋白。本发明采用农杆菌介导法将基因重组人血清白蛋白基因导入柱花草基因组中，经筛选鉴定后获得含基因重组人血清白蛋白基因的转基因柱花草植株。目的在于通过以转基因柱花草为生物反应器规模化生产基因重组人血清白蛋白，解决人血清白蛋白在微生物发酵反应器和转基因动物中生产产量较低、存在次级代谢产物和动物源性致病原等缺陷，最终增加人血清白蛋白的提取来源，降低生产成本等。
附图说明
图1.基因重组人血清白蛋白植物表达载体图谱。
图2.柱花草遗传转化过程。A.初生愈伤组织；B.脆性愈伤组织；C.转化后筛选培养的愈伤组织；D.抗性愈伤组织的增殖；E.抗性芽的分化；F.抗性芽的增殖；G.生根培养。
图3.转基因柱花草基因组DNA PCR检测结果。A.ALB特异性引物PCR产物； B.Hyg特异性引物PCR产物。M：DL2000DNA Marker；+：质粒pCAMBIA1300-35S-ALB PCR产物(阳性对照)；-：野生型柱花草基因组DNA PCR产物(空白对照)；泳道1-7：抗性再生植株基因组DNAPCR产物。
图4.转基因柱花草蛋白质检测结果。A.考马斯亮蓝染色结果；B.westernblotting 检测结果。M：Protein Marker；+：血源性人血清白蛋白(阳性对照)；-：野生型柱花草总蛋白(空白对照)；泳道1-3：抗性再生植株总蛋白。
图5.转基因植株基因组DNA PCR产物第1位至第300位核苷酸测序峰图。
图6.转基因植株基因组DNA PCR产物第301位至第600位核苷酸测序峰图。
图7.转基因植株基因组DNA PCR产物第601位至第900位核苷酸测序峰图。
图8.转基因植株基因组DNA PCR产物第601位至第1200位核苷酸测序峰图。
图9.转基因植株基因组DNA PCR产物第1201位至第1500位核苷酸测序峰图。
图10.转基因植株基因组DNA PCR产物第1501位至第1758位核苷酸测序峰图。
具体实施方式
一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，用于本发明的进一步说明，但不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：
一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒5～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，移至节律光照培养至形成真叶；
二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；
三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素 50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含AS 100μM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6～0.8，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡2～5min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠的MS培养基清洗1 次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；
七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；
八、将分化出的不定芽分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。
本实施方式步骤一中柱花草种子为柱花草选育和改良品种热研5号柱花草(Stybsanthes guianensis cv.Ryan No.5)。
本实施方式步骤四中YEP培养基成分为：10g/L蛋白胨、10g/L酵母浸膏、10 g/L氯化钠，pH值为7.0，固体培养基添加琼脂粉15g/L，常规高温高压灭菌。
本实施方式步骤四中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌即携带基因重组人血清白蛋白基因的pCAMBIA1300重组质粒pCAMBIA1300-35S-ALB(图1)转入根癌农杆菌菌株GV3101所筛选鉴定获得的阳性菌株。所述基因重组人血清白蛋白转基因工程菌转入了基因重组人血清白蛋白基因。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤三中愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三不同的是步骤五中共培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，乙酰丁香酮100μM。其他与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四不同的是步骤六中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，2mg/L酪蛋白水解物，25 mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。其他与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五不同的是步骤六中的培养条件为：温度24-26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。其他与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六不同的是步骤七中的不定芽分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，25mg/L潮霉素和300 mg/L头孢噻肟钠。其他与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七不同的是步骤八中的生根培养基为1/2MS基本培养基。其他与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八不同的是步骤八中炼苗的过程为：室温自然光照3～5d，开盖自然条件培养5～7d(加水保湿)，洗净根部培养基，移栽至土壤:沙:蛭石＝3:1:1的混合土壤中自然条件培养。其他与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十：本实施方式用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，按以下步骤进行：
一、选择籽粒饱满的柱花草种子去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v) 次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS 培养基中，26℃暗培养3d后，移至节律光照培养至形成真叶；
二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；
三、将培养15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5mL含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:100接种到100mL含AS 100μM/L的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液3500g离心10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡5min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠的MS培养基清洗1 次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；
七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；
八、将分化出的不定芽分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。
具体实施步骤中所用的培养基如下(YEP培养基pH为7.0，其余培养基pH均为5.8)：
本实施方式中基因重组人血清白蛋白转基因工程菌株中的穿梭质粒T-DNA部分含有潮霉素抗性基因，对潮霉素具有抗性，因此筛选培养和生根培养后可初步证明目的基因(基因重组人血清白蛋白基因)导入到受体植物中。但为了进一步排除假阳性植株的存在，需进一步鉴定，对抗性再生植株鉴定方法包括PCR检测及蛋白质印记检测。具体步骤如下：使用北京全式金生物技术有限公司的TransDirect Plant Tissue PCR Kit提取获得的抗性再生柱花草基因组DNA；以再生柱花草gDNA作为模板，分别用引物ALB-F/R和Hyg-F/R进行PCR扩增(同时设置阳性对照为含目的基因片段的转基因工程菌株质粒，空白对照为野生型柱花草基因组DNA)，反应体系如下：
PCR反应条件：
PCR反应条件：
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果(图3)显示的带型与阳性对照一致，说明相对应的转基因柱花草基因组DNA中已成功***基因重组人血清白蛋白的基因片段。
对基因检测为阳性的植株进行蛋白质提取，将叶片组织用液氮冷冻，每克组织加入3mL蛋白提取缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，10mM MgCl2，18％(w/v)蔗糖，40mMβ- 巯基乙醇，pH 8.0)，研钵中充分研磨后纱布过滤，离心得到的上清即为蛋白质粗提液，将样品于10％SDS-PAGE电泳后进行Western blotting检测(Rabbit anti-serum albumin，Bioss；Goat anti-rabbit IgG H&L(Alexa647)，abcam)，结果呈阳性的即为成功表达基因重组HSA的转基因柱花草植株。
序列表
<110> 海南大学
<120> 一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法
<130> 2018-07-02
<141> 2018-07-02
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1758
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
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gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agggaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200
tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260
ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320
cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgaccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gcttataa 1758
<210> 2
<211> 585
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cggggtaccg ccaccatgga tgcacacaag 30
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgcgtcgact tattattata agcctaa 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagatatga aaaagcctga actcacc 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctatttctt tgccctcgga cgagt 25

Claims (10)

1.一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于人血清白蛋白由转入了人血清白蛋白基因的转基因柱花草中表达；
2.表达人血清白蛋白的转基因柱花草的制备按以下步骤进行：
一、选择籽粒饱满的柱花草种子，去除褐色种皮后进行消毒处理，将去皮的种子于80℃热水预处理5min，75％的乙醇消毒1～2min，然后用无菌水漂洗一次，再用30％(v/v)次氯酸钠溶液消毒10～15min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，接种于1/2MS培养基中，26℃暗培养2～3d后，将萌发的种子移至节律光照培养至形成真叶；
二、剪取柱花草无菌苗的真叶，无菌条件将其切割为约0.5～0.8mm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基中，26℃暗培养；
三、将培养10～15d的外植体转入继代培养基，每两周继代一次，培养至形成胚性脆性的愈伤组织；
四、将基因重组人血清白蛋白转基因工程菌划线培养于含利福平50mg/L、卡那霉素50mg/L的YEP固体培养基上，在28℃培养2d，挑取单克隆加入到5ml含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L的YEP培养基中，在28℃，180rpm摇床培养24h后，按体积百分比1:50～1:100接种到100mL含乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)100μM的YEP培养基中，28℃、180rpm摇床培养至OD600达0.6～0.8，获得活化菌液；
五、取活化后的菌液3500g离心5～10min收集菌体，将菌体用愈伤组织诱导培养基重悬至OD600为0.5～0.6，将步骤三中培养的胚性愈伤组织分离为直径约0.5mm的小块，置于重悬菌液中，在恒温摇床上于28℃，180rpm浸泡5～10min，然后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干表面菌液，转入共培养基中，于26℃黑暗条件下共培养2～3d；
六、将共培养3d后的愈伤组织用含300mg/L头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium)的MS培养基清洗1次，用无菌滤纸吸干表面多余培养基后，转入愈伤组织诱导培养基中恢复培养1周，然后转入筛选分化培养基中光照节律培养，2周继代一次至愈伤组织形成胚状体；
七、将形成胚状体的抗性愈伤组织转移至不定芽分化培养基中，26℃光照节律条件下培养，2周继代一次至分化出不定芽；
八、将分化出的不定芽从愈伤组织上分离，转接至生根培养基中培养，待再生植株形成后炼苗、移栽，并对再生植株进行鉴定，获得阳性植株即为转基因柱花草。
3.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤二中的愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/LNAA。
4.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤三中的愈伤组织继代培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/LNAA。
5.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤五中共培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，1.0mg/L NAA，乙酰丁香酮100μM。
6.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤六中的筛选分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，2mg/L酪蛋白水解物，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。
7.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤六中的培养条件为：温度24～26℃，光周期为16小时光/8小时暗，光照强度1600Lx。
8.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤七中的不定芽分化培养基为MS基本培养基附加4.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，25mg/L潮霉素和300mg/L头孢噻肟钠。
9.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤八中的生根培养基为1/2MS基本培养基。
10.根据权利要求2所述的一种用柱花草表达的基因重组人血清白蛋白及表达方法，其特征在于步骤八中炼苗的过程为：室温自然光照3～5d，开盖自然条件培养5～7d，清洗根部培养基，移栽至土壤:沙:蛭石＝3:1:1的混合土壤中自然条件培养。
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