BRPI0709102A2 - antìgenos de grupo sanguìneo de diferentes tipos para aplicações diagnósticas e terapêuticas - Google Patents

Abstract

ANTìGENOS DE GRUPO SANGUìNEO DE DIFERENTES TIPOS PARA APLICAçõES DIAGNóSTICAS E TERAPêUTICAS. A presente invenção fornece composições e métodos para tratar ou prevenir tipagem sanguínea ou rejeição a enxerto mediada por anticorpo.

Description

"ANTÍGENOS DE GRUPO SANGÜÍNEO DE DIFERENTES TIPOS PARAAPLICAÇÕES DIAGNOSTICAS E TERAPÊUTICAS"

Campo da Invenção

A invenção se refere geralmente a composições e métodos para tratar ou prevenirrejeição a enxerto mediada por anticorpo e mais particularmente para composições incluindodeterminantes grupos sangüíneos, úteis para remoção de anticorpos de antígeno de grupoanti-sanguíneo.

Antecedentes da Invenção

A transplantação renal através das barreiras ABO foi constatada, já nos primeirosdias da transplantação, resulta em uma incidência elevada de transplantes que nuncafuncionou, e foi por esse motivo considerada como um pré-requisito em alotransplantaçãopara cumprir com as tradicionais regras de Landsteiner empregadas para transfusãosangüínea. As isoaglutininas anti-A/ B pré-formadas dos receptores são responsáveis pelarejeição hiperaguda de enxertos ABO incompatíveis. Esta rejeição hiperaguda é similar aaquela observada em pacientes aloimunizados com anticorpos HLA de doador reativo. Oprimeiro teste a cruzar a barreira ABO em transplantação foi iniciado no início de 1970enxertando rins cadavéricos do grupo sangüíneo A2 em receptores O.1 Em 1980, usandodoadores Ai e B, Alexandre realizou as primeiras séries de transplantações renais de doadorvivo (LD) de ABO incompatível e obteve a sobrevivência do enxerto, similar a aqueles decasos de ABO compatível. O protocolo imunossupresivo abrangia a plasmaferese pre-operatória para remover anticorpos anti-A/ B1 transfusão de plaquetas do doador,esplenectomia e terapia de indução com globulina anti-linfócito/timócito, injeção desubstâncias de grupo sangüíneo A ou B extraídas do estômago porcino e Ciclosporina,Azatioprina, prednisona. Uma vez que então, mais do que 500 casos de transplantaçõesrenais por LD de ABO incompatível tem sido relatada por todo o mundo, principalmente noJapão (pesquisado em 1), e a importância de reduzir os níveis de anticorpo de receptor anti-A/ B antes do enxerto para evitar a rejeição, tem sido bem documentado.2,3 A sobrevivênciado enxerto naquelas séries é boa (1 ano de sobrevivência do enxerto de cerca de 85% paradoadores A1 e B) mas ligeiramente inferior a aquele de enxertos de ABO compatíveis devidoa casos únicos com. greve rejeição mediada por anticorpo anti-A/ B.4,5 Dados recentes detransplantações renais de ABO incompatível empregando um anticorpo anti-CD20(Rituximabe) combinada com remoção de anticorpo foram mostradas ser ainda melhor comreferência a sobrevivência do enxerto.6,7

Em épocas de grave escassez de órgão, um uso aumentado de enxertos dedoadores de ABO incompatível permitirá mais transplantões de rim de LD a ser realizada.Além do que, a experiência conquistada neste campo será também aplicável no controlepós-tratamento e pré-tratamento de pacientes de HLA sensibilizado.8Sumário da Invenção

A invenção é com base em parte no método e composições melhoradas pararemoção de plasma em forma de anticorpos de antígenos de grupos sangüíneos e ummétodo de tipagem sangüínea.

Em um aspecto a invenção fornece uma composição contendo pelo menos doisantígenos de grupos sangüíneos de cada antígeno de grupo sangüíneo é expressado emdiferente tipo de cadeia de sacarídeo de núcleo. Preferivelmente a composição contém 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou mais antígenos de grupos sangüíneos Al B.

Em outro aspecto, a presença de anticorpos de grupo sangüíneo em uma forma deamostra de um indivíduo é determinada (por exemplo, tipagem sangüínea) por fornecer umacoleta de microcontas de subtipos diferentes, onde cada subtipo é revestido com umantígeno de grupo sangüíneo diferente e adicionado a amostra do indivíduo para a referidacoleta de microcontas. A amostra e as microcontas são incubadas durante tempo suficienteem anticorpos de grupo anti-sanguíneo na amostra para se ligar aos antígenos de grupossangüíneos nas microcontas para formar um complexo de anticorpo de microconta de gruposangüíneo. O complexo é incubado, por exemplo, contatado com pelo menos um ligandorotulado capaz de especificamente se ligar com os referidos anticorpos de grupo anti-sanguíneo ligados aos antígenos de grupos sangüíneos e a presença de ligando rotuladoligado aos anticorpos de grupo anti-sanguíneo é detectada para determinar a presença ouausência dos referidos anticorpos reativos. O ligando é, por exemplo, um anticorpo oufragmento deste. O anticorpo é um fragmento de anticorpo monovalente tal como fragmentoFab ou Fab'. Por exemplo, o fragmento Fab ou Fab' é um fragmento de anticorpo anti-Fc,um fragmento de anticorpo de cadeia leve anti-capa, um fragmento de anticorpo de cadeialeve anti-lambda, e um fragmento de anticorpo de cadeia única. O rótulo é, por exemplo, umrótulo fluorescente. O ligando rotulado é detectado pelos métodos conhecidos na técnica talcomo

citometria de fluxo ou luminex.

Os anticorpos reativos de grupo sangüíneo em uma amostra são removidoscompreendendo fornecer uma coleta de microcontas de diferentes subtipos, onde cadasubtipo é revestido com um diferente antígeno de grupo sangüíneo. A amostra é contatadacom a coleta de microcontas e incubada durante tempo suficiente em anticorpos de grupoanti-sanguíneo na amostra para se ligar aos antígenos de grupos sangüíneos. Asmicrocontas e a amostra são separadas, deste modo, removendo os anticorpos reativos degrupo sangüíneo da amostra.

Os antígenos de grupos sangüíneos incluem antígeno A, antígeno B e antígeno H.

Os tipos de cadeia de sacarídeo de núcleo incluem tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 4. Osantígenos de grupos sangüíneos são sacarídeos livres (referidos aqui como oligossacarídeoABO ou opcionalmente o antígeno de grupo sangüíneo são expressados em umpolípeptídeo de mucina. O polipeptídeo de mucina é parte de uma proteína de fusão deimunoglobina de mucina (referido aqui como proteína de fusão ABO ou polipeptídeos).

Opcionalmente, oligossacarídeo ABO ou proteínas de fusão ABO são ligadas, porexemplo, covalentemente ou não covalentemente a um suporte sólido tal como microcontas.As microcontas são, por exemplo, látex. Por microcontas de um diferente subtipo épretendido que as microcontas se diferenciem de uma das outras pelo tamanho, cor ouambos. A variação em diâmetro de cerca de 2 μιη a cerca de 15 pm. Preferivelmente1 amicroconta é de aproximadamente 5 pm em diâmetro. Mais preferivelmente, as microcontassão de aproximadamente 5 pm em diâmetro.

A amostra é, por exemplo, plasma, soro ou sangue total.

Em alguns aspectos, as composições são formuladas como uma absorção para aremoção de anticorpos de grupo sangüíneo de plasma ou sangue total. Da mesma formafornecida pela invenção é uma coleta de microcontas de subtipos diferentes, onde cadasubtipo é revestido com antígeno de grupo sangüíneo diferente. Por exemplo, a coletacontém como microcontas pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 40, 50 ou maissubtipos diferentes.

A menos que de outra forma definidos, todos os termos científicos e técnicosempregados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versadona técnica a qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ouequivalentes para aqueles descritos aqui podem ser empregados na prática ou testados napresente invenção, materiais e métodos adequados são descritos abaixo. Todas aspublicações, pedidos de patentes, patentes, e outras referências mencionadas aqui sãoincorporados por referência em sua totalidade. No caso de conflito, a presenteespecificação, incluindo definições, irá controlar. Além do que, os materiais, métodos, eexemplos são ilustrados somente e não pretendidos ser limitados.

Outros aspectos e vantagens da invenção serão evidentes na seguinte descriçãodetalhada, e nas reivindicações.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma representação esquemática dos vetores empregados paraproduzir as proteínas de fusão transportando os antígenos de grupos sangüíneos.

A figura 2 é uma fotografia mostrando a localização celular de PSGL-1/ mlgG2b, foideterminada por imunofluorescência indireta. A proteína PSGL-1/ mlgG2b foi detectadaempregando um Fc de anticorpo da IgG de anti-camundongo de cabra de isotiocianato defluoresceína conjugado (Sigma) diluída em 1:200 de tampão de bloqueio. Os núcleos dascélulas foram tingidos com 4, 6-diamidino2-fenilindol (DAPI).

A figura 3 é uma fotografia de um Western Blot mostrando determinantes grupossangüíneos A de cadeias de núcleo externo transportadas.

A figura 4 é uma representação esquemática do esquema de transfecção ABH paraproduzir peptídeos de fusão ABO em precursores de glicano diferentes.

Na figura 5 são gráficos mostrando a citometria de fluxo resultando de contas deintensidade de cores e 5 diferentes tamanhos, claramente mostrando que é possívelempregar contas de muitas combinações de tamanho e cores. Empregando as combinaçõesdas cores e tamanhos mostrados acima seria possível fabricar uma mistura de até 25diferentes contas, cada expressando um único antígeno de grupo sangüíneo.

A figura 6 é uma representação esquemática de estruturas de núcleo externo deantígeno de grupo sangüíneo.

A figura 7 é uma representação esquemática dos antígenos do grupo sangüíneoABH.

A figura 8 é uma representação gráfica de citometria de fluxo resultando identificaranticorpos de grupos anti-sanguíneo em soro.

A figura 9 é uma série de gráficos de dispersão mostrando IgG e IgM de anticorposde grupo sangüíneo A em soro de indivíduos A, B e O.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção é baseada em parte na descoberta que epítopos de grupo sangüíneopodem ser especificamente expressados em densidade elevada e por diferentes cadeias desacarídeos de núcleo (por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4) como quaisquersacarídeos livres ou em cadeias principais de proteína tipo mucina. Foi descoberto queempregando os antígenos de grupos sangüíneos transportado pelas diferentes cadeias desacarídeos de núcleo quando usado em combinação são mais eficientes na remoção deanticorpos de grupo anti-sanguíneo do sangue antes da transplantação. Adicionalmente, ascomposições da invenção são úteis diagnosticamente e prognosticamente para determinar apresença de anticorpos reativos de grupo sangüíneo em um indivíduo.

Em um aspecto a invenção fornece uma composição contendo pelo menos doisantígenos de grupos sangüíneos diferentes (isto é, oligossacarídeos) onde cada antígeno degrupo sangüíneo é expressado em uma diferente cadeia de sacarídeo de núcleo (isto é,precursores de glicina). Estes oligossacarídeos são referidos aqui como "oligossacarídeosABO". Os antígenos de grupos sangüíneos são sacarídeos livres. Alternativamente, oantígeno de grupo sangüíneo é expressado em um polipeptídeo de mucina. Por exemplo, oantígeno de grupo sangüíneo é expressado em uma proteínas de fusão de imunoglobulinade mucina (referidas aqui como "proteínas de fusão ABO"). As proteínas de fusão ABOtransportam um epítopo específico para um determinante grupo sangüíneo. Por exemplo, aproteína de fusão ABO transporta também o epítopo A1 epítopo B ou epítopo H.Alternativamente, a proteína de fusão ABO transporta dois epítopos para os antígenos degrupos sangüíneos. Por exemplo, a proteína de fusão ABO transporta ambos o epítopo A eB. Em muitos aspectos a proteína de fusão ABO transporta todos os três epítopos (isto é, A,B e H). As proteínas de fusão ABO da invenção expressa o epítopo A, B1 ou H nosdiferentes precursores de glicano, por exemplo, cadeias de precursores tipo 1, tipo 2 ou tipo 3.

Opcionalmente, os oligossacarídeos ABO ou as proteínas de fusão ABO sãoligados a um suporte sólido para permitir a separação de antígenos de grupos sangüíneosdo sangue.

Conseqüentemente, os oligossacarídeos ABO e a proteína de fusão ABO são úteisem eliminação de anticorpos ABO de grupo anti-sanguíneo de receptor de sangue ouplasma antes de, por exemplo, um órgão ABO incompatível, transplantação de medulaóssea ou a fim de fabricar doador universal de plasma. Os oligossacarídeos ABO ouproteína de fusão ABO absorvem 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 100% deanticorpos de grupo anti-sanguíneo ABO de receptor sangüíneo ou de plasma.

O oligossacarídeo ABO é mais eficiente em uma base molar de carboidrato emremoção ou ligação de anticorpos de grupo anti-sanguíneo quando comparado aoligossacarídeo de grupo sangüíneo expressado em uma única cadeia de sacarídeo denúcleo. O oligossacarídeo ABO liga 2, 4, 10, 20, 50, 80, 100 ou mais vezes númerosmaiores de anticorpos de grupo anti-sanguíneo quando comparado a uma quantidadeequivalente de sacarídeos livres expressados em uma única cadeia de sacarídeo de núcleo.

Similarmente, o peptídeo de fusão ABO é mais eficiente em uma base molar decarboidrato em remoção ou ligação de anticorpos de grupo anti-sanguíneo quandocomparado a sacarídeos livres de tipo selvagem AB determinantes. O peptídeo de fusãoABO liga 2, 4, 10, 20, 50, 80, 100 ou mais vezes números maiores de anticorpos de grupoanti-sanguíneo quando comparado a uma quantidade equivalente de sacarídeos livres detipo selvagem AB determinantes.

Os oligossacarídeos ABO e as proteínas de fusão ABO são também úteis em ummétodo de tipagem sangüínea. Os métodos da invenção são superiores a corrente demétodos de tipagem sangüínea quando permite a quantificação de anticorpos de gruposangüíneo de diferentes classes é subclasses. Em particular permite a detecção deanticorpos específicos tipo cadeia. Isto é clinicamente relevante quando o sistema imunepode responder especificamente aos antígenos sangüíneos nas diferentes cadeias denúcleo. Além do mais, os antígenos de grupos sangüíneos nas diferentes cadeias de núcleosão expressados em uma célula e tecido de modo específico. Deste modo, permitindo adetecção de anticorpos específicos de cadeia permitirá melhor adaptação do cruzamentodoador-receptor em aloenxertos de órgão ABO incompatível, que aumentará a rejeiçãohiperagudaAntígenos de grupo histo-sanguíneo ABH

Os antígenos ABH são encontrados em quase todas as células do corpo humano,mas sua função fisiológica, se existir, permanece uma questão não resolvida. Elas são denatureza de carboidrato e são construídas por diferentes glicosiltransferases, isto é, enzimasadicionando unidades de monossacarídeo em um modo seqüencial para o termino da nãoredução do crescimento da cadeia de oligossacarídeo. Os oligossacarídeos podem sertransportados por proteínas ou lipídeos, 9 ou podem ser encontrados livres nos fluídos docorpo (por exemplo, leite de peito).9

Os antígenos ABH são divididos em subgrupos, dependendo da cadeia desacarídeo de núcleo interno.9 Como um exemplo, ambos antígenos A, B e H sãoexpressados das cadeias tipo 1 (Gal/?1,3GlcNAc), tipo 2 (Gal01,4GlcNAc), tipo 3(Gal/?1,3Ga1 NAcct) e tipo 4 (Gal£1, 3GalNAc£). Os antígenos ABH de cadeia tipo 4 sãoapenas encontrados ligados ao lipídeo. Os antígenos H são produzidos pela adição de umafucose em uma ligação de σ1,2 para as diferentes cadeias de núcleo contendo umagalactose terminal. Ambos os antígenos AeoB são produzidos de subtipos de H por adiçãode uma N-acetilgalactosamina (A) ou uma galactose (B) em uma ligação de σ1,3 a galactoseterminal. As glicosiltransferases responsáveis pela biossíntese de antígenos AeB requerema presença de a1,2-fucose para adição de galactose e N-acetilgalactosamina terminal,respectivamente.

Duas α1,2-fucosiltransferases distintas estruturalmente permitem a biossíntese doantígeno H como inicialmente descrito por Oriol.10 Um é codificado pelo local H (FUT-I) e ooutro pelo local secretor (Se) (FUT-II). O produto de gene FUT-I é responsável pelaexpressão de antígeno H de eritócito e atua predominantemente nas cadeias de tipo 2, masativado para cadeias de tipo 1 sendo também mostrado. Em comparação, o produto de geneFUT-II é expressado por células acinares de glândulas salivares bem como células epiteliaisrevestindo os aparelhos pulmonares, reprodutivos e gastrointestinais, e atua principalmentenas cadeias de tipo 1 mas provavelmente, também, nas cadeiras de tipo 3 e 4.

Os produtos de gene responsáveis pela expressão de antígeno AeB têm mostradoter uma origem comum.1· As principais mutações para a substituição de quatro resíduos deaminoácido em produto de gene codificado A quando comparado ao B resulta em umamudança no nucleotídeo como açúcar doador de preferência de UDP-N-acetilgalactosaminapara UDP-galactose. O fenótipo O nomeado serologicamente necessita da expressão deambos os produtos de gene devido a uma mutação de mudança de estrutura no alelo Aoriginal, e em conseqüência não expressa determinantes A ou B.11 O grupo sangüíneo A foisubdividido em grupos serologicamente distintos, os subgrupos mais freqüentes sendo A1 eA2.12 Estes subtipos A são produzidos por dois diferentes σΙ,3-Ν-acetilgalactosaminiltransferases, um com uma preferência para antígenos H de tipo 3 e 4(A1) e o outro com uma preferência para antígenos H de tipo 1 e 2 (A2).

A importância da multivalência

As interações de proteína-carboidrato são geralmente caracterizados por uma baixaafinidade de ligação. Se bem que isto pode parecer irracional, fornecendo a base para umataxa de presença/ ausência resistente que é essencial sob condições fisiológicas quandopermite resistir, altamente mutável, as interações para ocorrer entre receptores de célula,anticorpos e outros carboidratos ligando as proteínas e seus Iigandos glicosilados. Asafinidades mais elevadas, quando necessárias, são efetuadas por natureza pelo uso demultivalência. A ligação de receptores diversos em uma entidade biológica a diversosligandos de carboidrato em outro, podem resultar em aumento de 10-10.000 vezes daafinidade. Os exemplos de interações polivalentes incluem a ligação de micróbios (toxinasbacterianas, viroses ou de bactérias) para a superfície da célula, ligação célula a célula, eligação de moléculas polivalentes, tais como anticorpos, a uma superfície de célula.13 Ainibição de interações polivalentes com inibidores monovalentes é usualmente ineficaz mesmo se a atividade de ligação do inibidor foi estruturalmente otimizada.Conseqüentemente, um número de diferentes moléculas (por exemplo, poliacrilamida,peptídeos, albumina de soro bovino, dendrimers e ciclodextrinas) tem sido empregado comocadeias principais para apresentações múltiplas de mono e oligossacarídeos tentando criarligação multivalente dos receptores correspondentes.13 Um método alternativo envolveassociação não covalente do ligando com os grupos cabeça em lipossomas, membranas ououtras superfícies.13 O sucesso destes glicoconjugatos variam, mas em geral a afinidade érealçada de 10 a 1000 vezes quando comparado as interações monovalentes. As atividadesmicromolares na maior parte, muitas vezes, caracterizando interações proteína-carboidratofisiológicas sendo concluída em poucos casos13 pela apresentação de ligando de otimização (isto é estrutura de ligando, grau de valência, estrutura de cadeia principal e distâncias deintra/inter ligandos), isto é caminho natural de apresentar o carboidrato, foi imitado em tantosdetalhes quanto possível.

Mucinas recombinante com substituição de glicano adaptado como eficienteabsorvente de anticorpos anti-carboidrato.

As proteínas tipo mucina são normalmente encontradas em superfícies de mucosae são caracterizadas por sua abundante substituição de O glicano (do segundo ao terceiroaminoácido). Até 50 % de seu peso molecular é devido a substituição de carboidrato. Porco-expressar vários glicosiltransferase cDNAs com a mucina Ig eles podem determinar asestruturas destes O glicanos tal que transporta diversos cópias de determinantescarboidratos significante biologicamente. Neste caminho, as mucinas transportamdeterminantes grupo sangüíneo A, sendo feito e mostrado para ligar grupo anti-sanguíneo Aabsoluto com alta eficácia1. De fato, a absorção com base em mucina de anticorpos degrupo anti-sanguíneo A formam mostradas ser de aproximadamente umas 100 vezes maiseficiente (quando calculado no número de determinantes grupo sangüíneo A) na ligação deanticorpos de anti-A do que trissacarídeo de grupo sangüíneo A ligado através de umespaçador diretamente às contas de agarose (é a disposição de Glucosorb®). Isto1 éexplicado pelo fato de que diversas cópias do determinante A é expressada com com oespaçamento ideal de ligação Ab em uma proteína de transporte tipo mucina1. Da mesmaforma, as mucinas recombinantes transportando o epítopo de carboidrato, Galai ,3Gal (a-Gal), tem sido mostrada ser muito eficiente na absorção de anticorpos anti-Gal; o tapumeprincipal de prevenção sucedida de xenotransplantação do homem cobaia15"17. Deste modo,as mucinas são sustentações muito eficientes para otimizar a apresentação de carboidratosbioativos.

A importância de subtipos de antígeno de grupo sangüíneo.

Como descrito acima, os determinantes grupos sangüíneos ABH podem sertransportados por diferentes cadeias de sacarídeo de núcleo. Estes têm uma distribuiçãoespecífica de célula e tecido no corpo humano, e a importância dos antígenos ABHindividuais como moléculas alvo para anticorpos de grupo anti-sanguíneo ABH não éconhecido. Similarmente, não é conhecido se o repertório de anticorpo de grupo anti-sanguíneo ABH é heterogêneo, isto é, se as subpopulações destes anticorpos podem sedistinguir entre os diferentes subtipos de antígenos ABH e atualmente requerem mais dacadeia de carboidrato do que trissacarídeo terminal para ligação. Alguns dados sugeremque é suficiente usar somente o trissacarídeo A ou B para a absorção de todos osanticorpos específicos para os antígenos de grupos sangüíneos A ou B, respectivamente,indicando que isto seria verdade também para detecção destes anticorpos19"20. Entretanto,os dados da presente invenção mostram que é possível obter detecção e absorção maiseficiente de anticorpo empregando diferentes subtipos (isto é, transportado por diferentescadeias de sacarídeo de núcleo) dos antígenos de grupos sangüíneos ABH.

Oligossacarídeos com adaptação de cadeias de sacarídeo de núcleo comoabsorventes eficientes de anticorpos de anti-carboidrato.

Seguindo a discussão acima, a mistura de proteínas de fusão tipo mucina ouoligossacarídeos transportando os ABH determinantes nas diferentes cadeias de sacarídeode núcleo (para obter heterogeneidade estrutural) absorverá um repertório mais amplo deanticorpos anti-N B. Empregando diferentes combinações de genes de glicosiltransferase, aproteína de fusão de mucina imunoglobulina pode ser planejada para transportar diversascópias de O glicanos ligados com cadeias de sacarídeo de núcleo interna ou externadefinida. Estes podem ser ainda alongados com os determinantes ABH. Deste modo, atecnologia recombinante pode ser empregada para fabricar estruturalmente diversasmucinas de grupo sangüíneo A ou B, que podem se empregadas para absorver umrepertório amplo de anticorpos anti-A ou B.

Oliqossacarídeos de Antíqeno de Grupo Sangüíneo

Em vários aspectos a invenção fornece oligossacarídeos de antígenos de grupossangüíneos. Os antígenos de grupos sangüíneos incluem (A, B1 e O (H). Os antígenos degrupos sangüíneos são específicos para todos os subtipos de grupo sangüíneo. Porsubtipos de grupo sangüíneo é pretendido que os antígenos de grupos sangüíneos sejamexpressados nos diferentes tipos de cadeia de sacarídeo de núcleo. Os tipos de cadeia desacarídeo incluem precursores de glicano tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 4.

Os exemplares de oligossacarídeos de antígeno de grupo sangüíneo incluem oseguinte:

Antígenos de grupos sangüíneos A nos tipos 1-4

Tipo A 1 GaINAcaI ,3(Fucal,2)Gal£1,3GlcNAc£1 -R

Tipo A 2 GaINAcaI ,3(Fucal,2)Gal£1,4GlcNAc£1-R

Tipo A 3 GaINAcaI ,3(Fuca1,2)Gal01,3GalNAcal-R

Tipo A 4 GaINAcaI ,3(Fuca1,2)Gal/?1,3GalNAc£1-R

Antígenos de grupos sangüíneos B nos tipos 1-4Tipo B 1 Galai ,3(Fuca1,2)Gal£1,3GlcNAc/?1 -R

Tipo B 2 Galai ,3(Fuca1,2)Gal01,4GlcNAc/?1 -R

Tipo B 3 Galai ,3(Fuca1,2)Galj21,3GalNAca1 -R

Tipo B 4 Galai ,3(Fuca1,2)Galjff 1,3GalNAc£1 -R

Onde R representa a mucina na qual o antígeno de grupo sangüíneo é transportadoem uma proteína de fusão, o ponto de ligação onde o oligossacarídeo é ligado a um suportesólido, ou nada onde o oligossacarídeo é um sacarídeo livre.

Polipeptídeos de Fusão

Em vários aspectos a invenção fornece as proteínas de fusão que incluem um

primeiro polipeptídeo contendo pelo menos uma porção de uma glicoproteína, por exemplo,um polipeptídeo de mucina operativamente ligado a um segundo polipeptídeo. Comoempregado aqui, uma "proteína de fusão" ou "proteína quimérica" incluem pelo menos umaporção de um polipeptídeo de mucina operativamente ligados a um polipeptídeo de nãomucina. Um "polipeptídeo de mucina" se refere a um polipeptídeo tendo um domínio demucina. O polipeptídeo de mucina tem um, dois, três, cinco, dez, vinte ou mais domínios demucinas. O polipeptídeo de mucina é qualquer glicoproteína caracterizada por umaseqüência de aminoácido substituído por glicanos O. Por exemplo, um polipeptídeo demucina tem muito segundo ou terceiro aminoácido sendo uma serina ou treonina. Opolipeptídeo de mucina é uma proteína segregada. Alternativamente, o polipeptídeo demucina é uma proteína de superfície da célula.

Os domínios de mucina são ricos em prolina, serina e treonina de aminoácidosonde os oligossacarídeos são ligados através de N-acetilgalactosamina aos aminoácidos dehidróxi (glicanos O). Um domínio de mucina compreende ou alternativamente consiste deum sítio de O ligado a glicosilação. Um domínio de mucina tem 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50, 100 oumais sítios de O ligado a glicosilação. Alternativamente, o domínio da mucina compreendeou alternativamente consiste de um sítio de N ligado a glicosilação. Um polipeptídeo demucina tem 50%, 60%, 80%, 90%, 95% ou 100% desta massa devido ao glicano. Umpolipeptídeo de mucina é qualquer polipeptídeo codificado por um gene MUC (isto é, MUC1,MUC2, MUC3, etc.). Alternativamente, um polipeptídeo de mucina é ligando de glicoproteínade P-selectina 1 (PSGL-1), CD34, CD43, CD45, CD96, GlyCAM-1, MAdCAM ou glicoforinasde glóbulos vermelhos. Preferivelmente, a mucina é PSGL-1. Considerando que um"polipeptídeo de não mucina" se refere a um polipeptídeo do qual pelo menos menor do que40% desta massa é devido a glicanos.

Dentro de uma proteína de fusão ABO da invenção, o polipeptídeo de mucina podecorresponder a todos ou uma porção de uma proteína de mucina. Em uma modalidade, umaproteína de fusão ABO compreende pelo menos uma porção de uma proteína de mucina."Pelo menos uma porção" é pretendido que o polipeptídeo de mucina conter pelo menos umdomínio de mucina (por exemplo, um sítio de O ligado a glicosilação). Em uma modalidade,a proteína de mucina compreende a porção extracelular do polipeptídeo. Por exemplo, opolipepídeo de mucina compreende a porção extracelular de PSGL-1.

O primeiro polipeptídeo é glicosilado por uma ou mais transferases de gruposangüíneo. O primeiro polipeptídeo é glicosilado por 2, 3, 5 ou mais transferases de gruposangüíneo. A glicosilação é seqüencial ou consecutiva. Alternativamente a glicosilação écoincidente ou aleatória, isto é, em ordem não particular. Por exemplo, o primeiropolipeptídeo é glicosilado por uma σ1,2 fucosiltransferase, tal como o gene H ou Secodificado por σ1,2 fucosiltransferases. Os exemplares de σ1,2 fucosiltransferases sãoFUT1 (Gen Bank Acc. Nos: Q10984; 010983; 010981; AT455028 e NM00148) e FUT2.(Gen Bank Acc. No: P19526; BAA11638; D82933 e A56098). Alternativamente, o primeiropolipeptídeo é glicosilado por 1,3 N-acetilgalactosaminiitransferase ou σ1,3galactosaminiltransferase. Em alguns aspectos, o primeiro polipeptídeo é glicosilado porambos uma σ1,2 fucosiltransferase e uma 1,3 N-acetilgalactosaminiltransferase ou uma σ1,3galactosaminiltransferase.

Dentro da proteína de fusão, o termo "operativamente ligado " é entendido paraindicar que o primeiro e o segundo polipeptídeos são quimicamente ligados (maistipicamente através de uma ligação covalente tal como uma ligação de peptídeo) de ummodo que permite O ligação a glicosilação do primeiro polipeptídeo. Quando empregadopara se referir a ácidos nucleícos codificando um polipeptídeo de fusão, o termooperativamente ligado significa que um ácido nucléico codificando o polipeptídeo de mucinae o polipeptídeo de não mucina são fundido em alinhamento um do outro. O polipeptídeo denão mucina pode ser ao N-terminal ou C-terminal do polipeptídeo de mucina.

Ainda em uma modalidade, a proteína de fusão ABO pode ser a um ou maisporções adicionais. Por exemplo, a proteína de fusão ABO pode adicionalmente ser ligado auma proteína de fusão GST em que as seqüências de proteína de fusão ABO são fundidasao C-terminal da seqüência de GST (isto é, glutationa S-transferase). Tais proteínas defusão podem facilitar a purificação da proteína de fusão ABO. Alternativamente, a proteínade fusão ABO pode adicionalmente ser ligada a um suporte sólido. Vários suportes sólidossão conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais composições podem facilitar aremoção de anticorpos de grupo anti-sanguíneo. Por exemplo, a proteína de fusão ABO éligada a uma partícula feita de, por exemplo, compostos de metal, sílica, látex, materialpolimérico; uma placa de micro-título; nitrocelulose , ou náilon ou uma combinação destes.As proteínas de fusão ABO ligadas a um suporte sólido são empregadas como umaabsorção para remover anticorpos de grupo anti-sanguíneo de uma amostra biológica, talcomo sangue ou plasma.

Em outra modalidade, a proteína de fusão inclui uma seqüência de sinal heterólogo(isto é, uma seqüência de polipeptídeo que não está presente em um polipeptídeocodificado por um ácido nucléico de mucina) neste N-terminal. Por exemplo, a seqüência desinal de mucina nativa pode ser removida e substituída com uma seqüência de sinal deoutra proteína. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeira demamífero), expressão e/ ou secreção de polipeptídeo pode ser aumentada através do usode uma seqüência de sinal heterólogo.

Uma proteína de fusão ou quimérica da invenção pode ser produzida portecnologias de DNA recombinante padrão. Por exemplo, codificação de fragmentos de DNApara as diferentes seqüências de polipeptídeo são ligados juntos em alinhamento de acordocom as tecnologias convencionais, por exemplo, por empregar terminal de extremidadeobtuda ou extremidade alternada para ligação, digestão de enzima de restrição parafornecer para terminal apropriada, inserindo em extremidades coesivas quando apropriada,tratamento de fosfatase alcalina para evitar união indesejável, e ligação enzimática. Emoutra moadalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionaisincluindo sintetizadores de DNA automatizado. Alternativamente, a amplificação de PCR defragmentos de gene pode ser transportada empregando apoio iniciador que da origem asprojeções complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podemsubsequencialmente ser recozido e reamplificado para gerar uma seqüência de genequimérico (veja, por exemplo, Ausubel e outros (eds.) CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Além do mais, muitos vetores deexpressão são comercialmente viáveis para codificar uma porção de fusão (por exemplo,uma região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina). Uma glicoproteína Iba codificandoo ácido nucléico pode ser clonado em um tal vetor de expressão tal que uma porção é ligadaem alinhamento à proteína de imunoglobulina.

Os polipeptídeos de fusão ABO podem existir como oligomeros, tal como dímeros,tímeros ou pentâmeros. Preferivelmente, polipeptídeo de fusão ABO é um dímero.

O primeiro polipeptídeo, e/ ou ácidos nucléicos codificando o primeiro polipeptídeo,pode ser construído empregando mucina codificando as seqüências são conhecidas natécnica. As fontes adequadas para polipeptídeos de mucina e ácidos nucléicos codificandoos polipeptídeos de mucina incluem GenBank Accession Nos. NP663625 e NM145650, CAD10625 e AJ417815, XP140694 e XM140694, XP006867 e XM006867 e NP00331777 eNM009151 respectivamente, e são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Em algumas modalidades, a porção de polipetídeo de mucina é fornecida como umpolipeptídeo de mucina variante tendo uma mutação na seqüência mucina ocorrendonaturalmente (tipo selvagem) que resulta em conteúdo de carboidrato aumentado (relativo aseqüência não mutado). Por exemplo, o polipeptídeo de mucina variante compreendido desítios de O ligação a glicosilação adicional comparado a mucina de tipo selvagem.Alternativamente, o polipeptídeo de mucina variante compreende mutações de seqüência deaminoácido que resulta em um número aumentado de resíduos de serina, treonina ouprolina quando comparado a um polipeptídeo de mucina de tipo selvagem. Este conteúdo de carboidrato aumentado pode ser avaliado por determinar a proteína para a relação decarboidrato da mucina pelos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Em algumas modalidades, a porção de polipeptídeo de mucina é fornecida comoum polipeptídeo de mucina variante tendo mutações na seqüência de mucina ocorrendonaturalmente (tipo selvagem) que resulta em uma seqüência de mucina mais resistente aproteólise (relativo a seqüência de não mutado).

Em algumas modalidades, o primeiro polipeptídeo inclui PSGL-1 de tamanhonatural. Alternativamente, o primeiro polipeptídeo compreende menos do que o polipeptídeode PSGL-1 de tamanho natural tal como a porção extracelular de PSGL-1. Por exemplo, oprimeiro polipeptídeo menor do que 400 aminoácidos em comprimento, por exemplo, menosdo que ou igual a 300, 250, 150, 100, 50, ou 25 aminoácidos em comprimento. Osexemplares de seqüências de polipeptídeo PSGL-1 e ácido nucléico incluem GenBankAccess No: XP006867; XM006867 ; XP140694 e XM140694.

O segundo polipeptídeo é preferivelmente solúvel. Em algumas modalidades, osegundo polipeptídeo inclui uma seqüência que facilita a associação do polipeptídeo defusão ABO com um segundo polipetídeo de mucina. Nas modalidades preferidas, o segundopolipeptídeo inclui pelo menos uma região de um polipeptídeo de imunoglobulina. "Pelomenos uma região" é pretendido para incluir qualquer porção de uma molécula deimunoglobulina, tal como a cadeia leve, cadeia pesada, região FC, região FAB, região Fv ouqualquer fragmento destes. Os polipeptídeos de fusão de imunoglobulina são conhecidos natécnica e são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.516.964;5.225.538; 5.428.130; 5.514.582; 5.714.147; e 5.455.165.

Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo deimunoglobulina de tamanho natural. Alternativamente, o segundo polipeptédeo compreendemenos do que polipeptídeo de imunoglobulina de tamanho natural, por exemplo, cadeiapesada, cadeia leve, Fab1 Fab2, Fv, ou Fc. Preferivelmente, o segundo polipeptídeo inclui acadeia pesada de um polipeptídeo de imunoglobulina. Mais preferivelmente, o segundopolipeptídeo inclui a região Fc de um polipeptídeo de imunoglobulina.

Em outro aspecto da invenção o segundo polipeptídeo tem menos função efetoraque a função efetora de uma região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina de tiposelvagem. A função efetora Fc inclui, por exemplo, ligação receptora Fc, fixação decomplemento e atividade de esvaziamento de célula T. (veja, por exemplo, Patente dosEstados Unidos No. 6.136.310). Os métodos de ensaio da atividade de esvaziamento dacélula T, função de efetora Fe, e uma estabilidade de anticorpo são conhecidos na técnica.Em uma modalidade o segundo polipeptídeo tem baixa ou não afinidade ao receptor Fe. Emuma modalidade alternativa, o segundo polipeptídeo tem baixa ou não afinidade a proteínaClq complementar.

Outro aspecto da invenção se refere a vetores, preferivelmente vetores deexpressão, contendo um ácido nucléico codificando polipeptídeos de mucina, ou derivados,fragmentos, análogos ou homólogos destes. Em vários aspectos o vetor contém um ácidonucléico codificando um polipeptídeo de mucina operavelmente ligado a um ácido nucléicocodificando um polipeptídeo de imunoglobulina, ou derivados, fragmentos análogos ouhomólogos destes. Adicionalmente, o vetor compreende um ácido nucléico codificando umatransferase de grupo sangüíneo tal como uma σ1,2 fucosiltransferase, uma σ1,3 N-acetilgalactosamininitransferase, uma σ1,3 galactosiltransferase ou qualquer combinaçãodestes. A transferase de grupo sangüíneo facilita a adição de grupos sangüíneosdeterminantes na cadeia principal de peptídeo da porção de mucina da proteína de fusãoABO. Como empregado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucléicocapaz de transportar outro ácido nucléico para o qual foi ligado. Um tipo de vetor é um"plasmídeo", o qual se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular nas quais ossegmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, noqual os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetoressão capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira nas quais são introduzidas(por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores de mamíferos dereplicação e epissômico). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamífero nãoepissômico) são integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução da célulahospedeira, e desse modo são replicadas junto com o genoma hospedeiro. Além do mais,certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais sãooperativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão". Emgeral, os vetores de expressão de utilidade em tecnologias de DNA recombinante sãomuitas vezes na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor"pode ser empregado alternadamente como o plasmídeo é a mais comumente formaempregada de vetor. Entretanto, a invenção é entendida para incluir outras tais formas devetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, viroses de adenoassociadas,adenoviroses e retroviroses defeituosa em replicação), que serve como funçõesequivalentes.

Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácidonucléico da invenção em uma forma adequada para a expressão do ácido nucléico em umacélula hospedeira, que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem umaou mais seqüências regulatórias, selecionadas na base das células hospedeiras para seremempregadas na expressão, que é operativamente ligada a seqüência de ácido nucléico paraser expressada. Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado"entende-se que significam uma seqüência de nucleotídeo de interesse é ligada à seqüência(s) regulatória em um modo que permite expressar a seqüência de nucleotídeo (porexemplo, em um sistema de translação/ transcrição in vitro ou em uma célula hospedeira naqual o vetor é introduzido na célula hospedeira).

O termo "seqüência regulatória" é entendido para incluir os promotores, realçador eoutros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Taisseqüências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel, GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990). As seqüências regulatórias incluem aquele que dirige a expressão constitutiva deuma seqüência de nucleotídeo de muitos tipos de célula hospedeira e aquele que dirige aexpressão da seqüência de nucleotídeo somente em certas células hospedeiras (porexemplo, seqüências regulatórias de tecido específico). Será apreciado por aquelesversados na técnica que o plano do vetor de expressão pode depender em tais fatores comoa escolha da célula hospedeira ser transformada, o nível de expressão da proteínadesejada, etc. Os vetores de expressão da invenção pode ser introduzidos nas célulashospedeiras para, desse modo, produzir proteínas ou peptídeos, incluindo peptídeos ouproteínas de fusão, codificadas por ácidos nucléicos como descrito aqui (por exemplo,polipeptídeos de fusão ABO, formas mutantes de polipeptídeos de fusão ABO, etc.).

Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem ser planejados paraexpressar os polipeptídeo da fusão ABO em células procarióticas ou eucarióticas. Porexemplo, os polipeptídeos de fusão ABO podem ser expressados em células bacterianascomo Escherichia coli, células de insetos (empregando os vetores de expressão debaculovírus) células de levedura ou células de mamíferos. As células hospedeira adequadassão discutidas ainda em Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS INENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Alternativamente o vetor deexpressão recombinante pode ser transcrito e trasladado in vitro, por exemplo, empregandoas seqüências regulatórias de promotor T7 e polimerase T7.

A expressão de proteínas em procariotes é na maior parte muitas vezes executadasin Escherichia coli com vetores contendo promotes constitutivos ou induzível dirigindo aexpressão de quaisquer proteínas de fusão e não fusão. Os vetores de fusão adicionam umnúmero de aminoácidos a uma proteína codificada dessa maneira, usualmente para osterminais amino da proteína recombinante. Tais vetores de fusão tipicamente servem a trêspropósitos: (i) para aumentar a expressão de proteína recombinante; (H) para aumentar asolubilidade da proteína recombinante; e (iii) para adicionar na purificação da proteínarecombinante por agir como um ligando na purificação da afinidade. Muitas vezes, emvetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítica é introduzido na junção daporção de fusão e a proteína recombinante para permitir a separação da proteínarecombinante da porção de fusão subseqüente a purificação da proteína de fusão. Taisenzimas, e suas seqüências de reconhecimento do cognato, incluem Fator Xa, trombina eenterocinase. Os vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharmacia Biotechlnc; Smith e Johnson, 1988. Gene 67:31-40, pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) epRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que se funde a glutationa S-transferase (GST),proteína de ligação de maltose E, ou proteína A, respectivamente, para o alvo da proteínarecombinante.

Os exemplos de vetores de expressão E. coil de não fusão induzível adequadosincluem pTrc (Amrann e outros, (1988) Gene 69:301-315) e pET Ild (Studier e outros, GENEEXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, SanDiego, Calif. (1990)60-89).

Uma estratégia para maximizar a expressão de proteína recombinante em E. coli épara expresser a proteína emu ma bactéria hospedeira com uma capacidade prejudicadapara proteoliticamente clivar a proteína recombinante, Veja, por exemplo, Gottesman, GENEEXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, SanDiego, Calif. (1990) 119-128. Outra estratégia é alterar seqüência de ácido nucléico para serinserida em um vetor de expressão de modo que os códons individuais para cadaaminoácido são aquele preferencialmente utilizado em E. coli (veja, por exemplo, Wada, eoutros, 1992. Nucl.. Acids Res. 20: 2111-2118). Tal alteração de seqüências de ácidonucléico da invenção pode ser executada por técnicas padrão de síntese de DNA.Em outra modalidade, o vetor de expressão de polipeptídeo de fusão ABO é umvetor de expressão de levedura. Os exemplos de vetores para expressão em leveduraSaccharomyces cerivisae incluem pYepSecl (Baldari, e outros, 1987. EMBO J. 6: 229-234),pMFa (Kurjan e Herskowitz1 1982. Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz e outros, 1987. Gene54: 113-123), pYES2 (Invitrogen Corporelação n, San Diego, Calif.), e picZ (InVitrogen Corp,San Diego, Calif.).

Alternativamente, o polipeptídeo de fusão ABO pode ser expressado em células deinseto empregando vetores de expressão de baculovírus. Os vetores de baculovírusdisponíveis para expressão de proteínas em células de inseto cultivadas (por exemplo,células SF9) inclue as séries pAc (Smith, e outros, 1983. Moi CeH Biol. 3: 2156-2165) e asséries pVL (Lucklow e Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

Contudo em outra modalidade, um ácido nucléico da invenção é expressado emcélulas de mamífero empregando um vetor de expressão de mamífero. Os exemplos devetores de expressão de mamífero incluem pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) epMT2PC (Kaufman1 e outros, 1987. EMBO J. 6: 187-195). Quando empregada em célulasde mamífero, as funções de controle do vetor de expressão são muitas vezes fornecida porelementos regulatórios virais. Por exemplo, comumente empregado os promotores sãoderivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, e vírus símio 40. Para outros sistemasde expressão adequados para ambas as células procariótica e eucariótico veja, porexemplo, Chapters 16 e 17 de Sambrook, e outros, MOLECULAR CLONING: ALABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

Outro aspecto da invenção se refere para células hospedeiras nas quais um vetorde expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e"célula hospedeira recombinante" são empregadas alternadamente aqui. É entendido quetais termos não se referem somente à célula de paciente particular, mas também para aprogênie ou progênie potential de uma tal célula. Porque certas modificações podemocorrer em gerações sucessivas devido a outras influências ambientais e mutações, talprogênie não pode, de fato, ser idêntica a célula origem, mas são ainda incluídas no escopedo termo como empregado aqui.

Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Porexemplo, os polipeptídeos de fusão Iba de glicoprteína podem ser expressados em célulasbacterianas tais como E. coif, células de insetos, células de mamífero ou de levedura (talcomo humanas, célula de ovário de hamster Chinês (CHO) ou células COS). Outras célulashospedeiras adequadas são conhecidas por aqueles versados na técnica.

O vetor de DNA pode ser introduzido nas células procarióticas ou eucarióticasatravés de técnicas de transfecção ou transformação convencionais. Como empregado aqui,os termos "transformação" e "transfecção" são entendidos para se referir a uma variedadede técnicas de arte reconhecida para introdução de ácido nucléico estranho (por exemplo,DNA) em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de cloreto de cálcio ou fosfato decálcio, transfecção por dextrana e DEAE1 lipofecção, ou electroporelação. Os métodosadequados para transformar ou transfectar células hospedeiras podem ser encontrados emSambrook1 e outros (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed„ ColdSpring Harbor Laboratory1 Cold Spring Harbor Laboratory Press1 Cold Spring Harbor1 N.Y.,1989), e outros manuais de laboratório.

Para transfecção estável de células de mamífero, é conhecido que, dependendo datécnica de transfecção e vetor de expressão empregados, apenas uma pequena fração decélulas pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionarestes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistênciaà antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene deinteresse. Os vários marcadores selecionáveis incluem aquele que confere resistência adrogas, tal como G418, higromicina e metotrexato. O ácido núcleico codificando ummarcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no mesmo vetorcomo que codificando polipeptídeos de fusão Ibo de glicoproteína ou pode ser introduzidoem um vetor separado. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucléicointroduzido podem ser identificadas por seleção de droga (por exemplo, células que têmincorporadas o gene de marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras célulasmorrerem).

A célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica oueucariótica em cultura, pode ser empregada para produzir (isto é, expressa) polipeptídeosde fusão ABO. Consequentemente, a invenção ainda fornece métodos para produzirpolipeptídeos de fusão ABO empregando as células hospedeiras da invenção. Em umamodalidade, o método compreende cultivar a célula hospedeira da invenção (na qual umvetor de expressão recombinante codificando os polipeptídeos de fusão ABO foi introduzido)em um meio adequado tal que os polipeptídeos de fusão ABO é produzido. Em outramodalidade, o método ainda compreende isolamento do polipeptídeo ABO do meio ou dacélula hospedeira.

Os polipeptídeos de fusão ABO podem ser isolados e purificados de acordo com ascondições convencionais, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatogradiapor afinidade, eletroforese ou tipos. Por exemplo, as proteínas de fusão de imunoglobulinapodem ser purificadas por passar uma solução através de uma coluna que contem proteínaG ou proteína A imobilizada que seletivamente se liga a porção Fc da proteína de fusão.Veja, por exemplo, Reis, K. J., e outros, J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); PCTApplication, Publicação No. W087/00329. O polipeptídeo de fusão pode ser eluído pelotratamento com um sal caotrópico ou por eluição com ácido acético aquoso (1 M).

Alternativamente, os polipeptídeos de fusão ABO de acordo com a invenção podemser quimicamente sintetizado empregando os métodos conhecidos na técnica. A síntesequímica de polipeptídeos é descrita em, por exemplo, uma variedade de métodos de síntesede proteína são comuns na técnica, incluindo síntese empregando um sintetizador depeptídeo. Veja, por exemplo, Peptide Chemistry, A Practical Textbook1 Bodasnsky, Ed.Springer-Verlag, 1988; Merrifield, Science 232: 241-247 (1986); Barany1 e outros, Intl. J.Peptide Protein Res. 30: 705-739 (1987); Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-989 (1988), eKaiser, e outros, Science 243: 187-198 (1989). Os polipeptídeos são purificados de modoque são substancilmente livre de precursores químicos ou outros químicos empregandotécnicas padrão de purificação de peptídeo. A linguagem "substancialmente livre deprecursores químicos ou outros químicos" incluindo preparações de peptídeo em que opeptídeo é separado de precursores químicos ou outros químicos que são involvidos nasíntese do peptídeo. Em uma modalidade, a linguagem "substancialemtne livre deprecursores químicos ou outros químicos" inclui preparações de peptídeo tendo menos doque cerca de 30% (por peso seco) de precursores químicos ou químicos de não peptídeo,mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de precursores químicos ou químicos denão peptídeo, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de precursosquímicos ou químicos de não peptídeo, e mais preferivelmente menos do que cerca de 5%de precursores químicos ou químicos de não peptídeo.

A síntese química de polipeptídeos facilita a incorporação de aminoácidosmodificados ou não natural, incluindo outras pequenas moléculas orgânicas ou D-aminoácido. A substituição de um ou mais L-aminoácidos em um peptídeo com asisoformas de D-aminoácido correspondente pode ser empregado para aumentar a resitênciade peptídeos a hidrólise enzimática, e para realçar uma ou mais propriedade dos peptídeosativos biologicamente, isto é, receptor de ligação, potência funcional ou duração da ação.Veja, por exemplo, Doherty, e outros, 1993. J. Med. Chem. 36:2585-2594; Kirby, e outros,1993. J. Med. Chem. 36:3802-3808; Morita, e outros, 1994. FEBS Lett. 353: 84-88; Wang, eoutros, 1993. Int. J. Peps. Protein Res. 42: 392-399; Fauchere e Thiunieau, 1992. Adv. DrugRes. 23: 127-159.

A introdução de reticulações covalentes em uma seqüência de peptídeo podeadaptavelmente e topograficamente forçar a cadeia principal de polipeptídeo. Esta estratéciapode ser empregada para desenvolver análogos de peptídeo dos polipeptídeos de fusãocom potência aumentada, selectividade e estabilidade. Porque a entropia de conformaçãodo peptídeo cíclico é menor do que a contraparte linear, adoção de uma conformaçãoespecífica pode ocorre com um aumento menor em entropia para um análogo cíclico do quepara um análogo acíclico, desse modo produzindo a energia livre para ligação maisfavorável. A macrociclização é muitas vezes efetuada para formar um ligação de amidoentre o peptídeo N- e C-terminal, entre uma cadeia de lados e o N- ou C-terminal [porexemplo, com K3Fe(CN)6 em pH 8,5] (Samson e outros, Endocrinology, 137: 5182-5185(1996)), ou entre duas cadeias de aminoácido. Veja, por exemplo, DeGrado, Adv ProteinChem, 39: 51-124 (1988). As pontes de dissulfeto são também introduzidas nas seqüênciaslineares para reduzir sua flexibilidade. Veja, por exemplo, Rose, e outros, Adv Protein Chem,37: 1-109 (1985); Mosberg e outros, Biochem Biophys Res Comnzun, 106: 505-512 (1982).Ainda mais, a substituição dos resíduos de cisteína com penicillamina (Pen, valina de 3-mercapto-(D)) tem sido empregado para aumentar a seletividade de algumas interaçõesrecpetor-opióide. Lipkowski e Carr, Peptides: Synthesis, Structures, and Applications, Gutte,ed., Academic Press pp. 287-320 (1995).

Composição e Kits

Também incluídas na invenção estão as composições contendo pelo menos doisantígenos de grupos sangüíneos (por exemplo, oligossacarídeos ABO) onde cada antígenode grupo sangüíneo é expressado em um diferente tipo de cadeira de sacarídeo de núcleo.O antígeno de grupo sangüíneo é um antígeno A, antígeno B ou um antígeno Η. O tipo decadeia de sacarídeo de núcleo é um tipo 1, um tipo 2, um tipo 3 ou um tipo 4. A composiçãocontém 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais diferentes antígenos de grupos sangüíneo.

Os exemplos de antígenos de grupos sangüíneos incluem aquele recitado acima.

Opcionalmente, os oligossacarídeos ABO ou as proteínas de fusão ABO sãoligadas à um suporte sólido. A ligação é covalente. Alternativamente, a ligação é nãocovalente.

O suporte sólido pode ser, por exemplo, uma conta, resina, membrana ou disco, ouqualquer suporte sólidos adequado para os métodos da invenção. Preferivelmente, osuporte sólido é uma conta, por exemplo, microconta. O tamanho da conta não é crítico.Tipicamente, a conta é de pelo menos 1 a 50pm em diâmetro com um tamanho de partículade 1 a 10pm m sendo preferido. Mais preferivelmente as contas têm um diâmetro de cercade 4-10μηη. Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 ou 50 u.m de diâmetro.

A conta pode ser fabricada de compostos de metal, sílica, látex, material polimérico,ou uma sílica, látex ou núcleos de polímeros revestido com um composto de metal ou metal.

O suporte sólido pode transportar grupos funcionais tais como grupos de amino,hidroxila, carboxila ou aldeído. O suporte pode ter ser carga positivamente, carganegativamente ou hidrofóbica. Os suportes revestidos funcionalizados para uso na presenteinvenção pode ser preparado por modificação do suporte. Por exemplo, os suportes nãorevestidos podem ser tratados com a polímero transportando um ou tais grupos funcionais,tal como poliuretano junto com um poliglicol para fornecer grupos de hidroxila ou umacelulose derivada para fornecer grupos de hidroxila, um polímero ou copolímero de ácidoacrílico ou ácido metacrílico para fornecer grupos de carboxila ou um polímeroaminoalquilado para fornecer grupos de amino. A Patente dos Estados Unidos No.4.654.267 descreve a introdução de muitos revestimentos de surperfície.

Preferivelmente cada diferentes oligossacarídeos ABO ou proteína de fusão ABO éuma microconta de um diferente subtipo. Por subtipo é pretendido que cada microconta édetectavelmente distinguível tal como sendo de diferentes tamanhos ou tendo rótulosdistinguíveis. Um tal uso de microcontas diferentemente dimensionadas ou rotulados pormicrocontas tal como fluoróforos permitindo a identificação e/ ou separação de diferentescontas por, por exemplo, citometria de fluxo.

A invenção ainda fornece kit para a separação de identificação de anticorposreativos de grupo sangüíneo de uma amostra de acordo com os métodos da invenção. O kitcontém uma coleta de microcontas de diferentes subtipos cada subtipo é revestido comdiferente oligossacarídeo ABO ou proteína de fusão ABO. Opcionalmente, o kit contém pelomenos ligando aberto capaz de especificamente ligar um anticorpo de antígeno de grupoanti-sanguíneo. Por exemplo, o ligando é um anticorpo ou fragmento destes. O anticorpo oufragmento destes é um anticorpo monoclonal. Alternativamente, o anticorpo ou fragmentodestes é um anticorpo policlonal. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo recombinante.

O anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como fragmentos Fab, Fab- e F(ab-)2. Por"especificamente ligar" ou "imunoreagir com" é pretendido que o anticorpo reaja com um oumais determinantes antigênicos do antígeno desejado e não reage (isto é, liga-se) com outropolipeptídeo ou se liga em muitas afinidades inferiores (Kd > 10"6) com outros polipeptídeos.

O anticorpo é um monovalente.

O rótulo é qualquer substância empregada para facilitar a identificação e/ ouquantificação de um alvo. Os rótulos são diretamente observados ou medidos ouindiretamente observados ou medidos. Os rótulos incluem, mas não estão limitados a,radiorrótulos que podem ser medido com dispositivos de radiação por contagem; pigmentos,tinturas ou outros cromógenos que podem ser visualmente observados ou medido com umespectrofotômetro; os rótulos de giro que podem ser medido com a analisador de rótulo degiro; e porções fluorescentes, onde o sinal emitido é gerado pela excitação de uma aduçãomolecular adequada e que pode ser visualizado por excitação por luz que é absorvida pelopigmento ou pode ser medido com fluorômetros padrão ou sistemas de imagem, porexemplo. O rótulo pode ser uma substância Iuminescente tal como a fósforo ou fluorogênio;uma substância bioluminescente; uma substância quimioluminescente, onde sinal emitido égerado por modificação química do composto do sinal; uma substância contendo metal; ouuma enzima, onde ocorre uma geração secundária de enzima dependente de sinal, tal comoa formação de um produto colorido de um substrato sem cor. O rótulo pode também aceitara forma de uma química ou bioquímica, ou uma partícula inerte, incluindo, mas não limitadoa ouro coloidal, micro-esferas, pontos quantum, ou cristais inorgânicos tais comonanocristais ou fósforos (veja, por exemplo, Beverloo, e outros, Anal. Biochem. 203, 326-34(1992)). O termo rótulo pode também se referir a um "marcador" ou hapteno que pode seligar seletivamente a uma molécula rotulada tal que a molécula rotulada, quando adicionadasubseqüentemente, é empregada para gerar um sinal detectável. For exemplo, um podeempregar biotina, iminobiotina ou destiobiotina como um marcador e então emprega umaavidina ou estreptavidina conjugada de rábano picante peroxidase (HRP) para se ligar aomarcador, e então usa um substrato cromogênico (por exemplo, tetrametilbenzidina) ou umsubstrato fluorogênico tal como Amplex Red ou Amplex Gold (Molecular Probes, Inc.) paradetectar a presença de HRP. Similarmente, o marcador pode ser um hapteno ou antígeno(por exemplo, digoxigenina), e um anticorpo rotuladdo enzimaticamente, fluorescentemente,ou radioativamente pode ser empregado para se ligar ao marcador. Os numerosos rótulossão conhecidos por aqueles versados na técnica e inclui, mas não está limitado a,partículas, tinturas fluorescentes, haptenos, enzimas e seus subtratos cromogênicos,fluorogênicos, e quimioluminescentes, e outros rótulos que são descritos em MolecularProbes Handbook Of Fluorescent Probes And Research Chemicals por Richard P.Haugland, 6th Ed., (1996), e subseqüente 7a edição e 8a edição atualizada, emitida em CDRom em novembro de 1999 e maio de 2001, respectivamente, os conteúdos os quais sãoincorporados por referência, e em outras fontes publicadas.

Uma fluoróforo é qualquer porção química que exibe uma absorção máxima acimade 280 nm, e quando covalentemente ligado a um reagente de rotulação retendopropriedades espectrais. Os fluoróforos incluem, sem limitação; um pireno (incluindoqualquer dos compostos derivados correspondentes descritos em Patente dos EstadosUnidos No. 5.132.432), um antraceno, um naftaleno, uma acridina, um estilbeno, um indolou benzindol, um oxazol ou benzoxazol, um tiazol ou benzotiazol, um 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NED), uma cianina (incluindo qualquer composto correspondente em Ser.U.S. Nos. 09/968.401 e 09/969.853), uma carbocianina (incluindo quaisquer compostoscorrepondentes em Ser. U.S. Nos. 09/557.275; 09/969.853 e 09/968.401; Patente dosEstados Unidos Nos. 4.981.977; 5.268.486; 5.569.587; 5.569.766; 5.486.616; 5.627.027;5.808,044; 5.877.310; 6.002.003; 6.004.536; 6.008.373; 6.043.025; 6.127.134; 6.130.094;6.133.445; e publicações WO 02/26891, WO 97/40104, WO 99/51702, WO 01/21624; EP 1065 250 Al), a carbostiril, uma porfirina , um salicilato , um antranilato, um azuleno, umperileno, uma piridina, uma quinolina, um borapoliazaindaceno (incluindo quais compostoscorrespondentes descritos em Patente dos Estados Unidos Nos. 4.774.339; 5.187.288;5.248.782; 5.274.113; e 5.433.896), um xanteno (incluindo quaisquer compostoscorrespondentes descritos em Patente dos Estados Unidos No. 6.162.931; 6.130.101;6.229.055; 6.339.392; 5.451.343 e Ser. U.S. No. 09/922,333), uma oxazina (incluindoquaisquer compostos correspondentes descritos em Patente dos Estados Unidos No.4.714.763) ou uma benzoxazina, uma carbazina (incluindo quaisquer compostoscorrespondentes descritos em Patente dos Estados Unidos No. 4.810.636), umafenalenona, uma cumarina (incluído quaisquer compostos correspondentes descritos emPatente dos Estados Unidos Nos. 5.696.157; 5.459.276; 5.501.980 e 5.830.912), umbenzofurano (incluindo quaisquer compostos correspondentes descritos em Patente dosEstados Unidos Nos. 4.603.209 e 4.849.362) e benzfenalenona (incluindo quaisquercompostos correspondentes descritos em Patente dos Estados Unidos No. 4.812.409) ederivados destes. Como empregado aqui, oxazinas incluem resorrufinas (incluindoquaisquer compostos correspondentes descritos em Patente No. 5.242.805),aminooxazinonas, diaminooxazinas, e seus análogos benzo substituídos.

Opcionalmente, os kits contêm um controle positivo ou negativo ou ambos,instrução para empregar o kit (por exemplo, escrita, fita, VCR, CD-ROM, etc.), meios decoleta de amostra. Os meios de coleta de amostra são bem conhecidoos por aquelesversados na técnica. Por exemplo, o meio de coleta de amostra é um tubo vacutainer CPT.

Os reagentes são embalados em recipientes separados, por exemplo,oligossacarídeo ABO ou proteína de fusão ABO (qualquer ligação a uma matriz sólida ouembaladas separadamente com reagentes para ligá-los a matriz), um reagente de controle(positivo e/ ou negativo), e ou um ligando rotulado.

Métodos de tratamento ou prevenção de rejeição a enxerto mediada por anticorpo

Além disso, incluídos na invenção estão os métodos para tratar ou prevenir arejeição a enxerto mediada por anticorpo (AMR), por exemplo, rejeição de transplante deórgão. Tais transplantes incluem, mas não estão limitados a rim, fígado, pele, pancrêas,cômea, ou coração. AMR é pretendido para incluir qualquer rejeição a enxerto mediada poranticorpo pelo receptor. O método inclui contatar uma amostra biológica de um indivíduocom o oligossacarídeo ABO ou peptídeo de fusão ABO da invenção. A amostra biológica épor exemplo, sangue, isto é, plasma ou sangue total. A amostra é conhecida para oususpeitada compreender um anticorpo, por exemplo, um anticorpo de grupo anti-sanguíneo.

Em alguns aspectos, a amostra biollógica é retirada do indivíduo antes de contatar aamostra com o oligossacarídeo ABO ou polipeptídeo de fusão ABO. A amostra biológica écontatada com o oligossacarídeo ABO ou peptídeo de fusão ABO sob condições parapermitem a formação de um oligossacarídeo ABO ou complexo de anticorpo de grupo anti-sanguíneo de peptídeo de fusão ABO. O oligossacarídeo ABO ou complexo de peptídeo defusão ABO, se presente é separado da amostra biológica para eliminar os anticorpos degrupo anti-sanguíneo e a amostra é reinfundida no subjeito.

AMR é também tratada ou previnida por administrar ao indivíduo um polipeptídeode fusão ABO da invenção.O indivíduo pode ser, por exemplo, qualquer mamífero, por exemplo, um humano,um primata, camundongo, rato, cachorro, gato, vaca, cavalo, porco. O tratamento éadministrado antes do indivíduo receber um transplante ABO incompatível.Alternativamente, o tratamento é administrado após um indivíduo receber um transplanteABO incompatível.

A mostra é contatada com o oligossacarídeo ABO ou a proteína de fusão ABO pormétodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, imunoabsorçãoextracorporeal ou plasmaferese.

Essencialmente, qualquer doença, que é etiologicamente ligada a uma reaçãomediada por anticorpo é considerada acessível para prevenção ou para o tratamento. AMRé tratada ou prevenida quando o rato sobrevive ao transplante de órgão é maiores do queum transplante de órgão não tratado pelo método da invenção. Por sobrevivência do rato dotransplante é pretendido o tempo antes do transplante ser rejeitado pelo receptor. Porexemplo, AMR é tratado ou prevenido quando o transplante sobrevive pelo menos 1, 2, 4 ou8 semanada após a transplantação. Preferivelmente, o transplante sobrevive 3, 6, 13 meses.Mais preferivelmente, o transplante sobrevive 2, 3, 5 ou mais anos.

Métodos de remoção de grupo anti-sanquíneo para uma amostra

Também incluída na invenção estão os métodos de remoção ou esvaziamento dosanticorpos de grupo anti-sanguíneo de uma amostra. A amostra é um fluído biológico talcomo sangue ou plasma. Alternativamente, a amostra é um tecido biológico, tal como tecidodo coração, tecido do fígado, pele, ou tecido do rim. O método inclui contatar uma amostracom o oligossacarídeo ABO ou peptídeo de fusão ABO da invenção. A amostra é contatadacom o peptídeo de fusão ABO sob condições para permitir a formação de umoligossacarídeo ABO ou complexo de anticorpo de grupo anti-sanguíneo de peptídeo defusão ABO. O complexo de peptídeo de anticorpo de fusão ABO, se presente é separado daamostra biológica para remover ou esvaziar os anticorpos do grupo anti-sanguíneo.

Este método é útil para produzir doador universal de plasma.

Métodos de Tipaqem Sangüínea

Também incluídos na invenção estão os métodos de tipagem sangüínea de umsujeito. Um indivíduo é tipado sangüíneo por contatar uma amostra, por exemplo, plasma ousangue total de um indivíduo com uma coleta de microcontas de diferentes subtipos. Cadasubtipo contém antígeno de grupo sangüíneo diferente. Os antígenos de grupos sangüíneossão expressados em diferentes tipo de cadeia de sacarídeo de núicleo. As microcontas eamostras são contatadas, por exemplo, incubadas, em uma quantidade suficiente de tempopara permitir os anticorpos de grupo anti-sanguíneo presentes na amostra para ligação, porexemplo, formar um complexo de anticorpo de antígeno de grupo sangüíneo, para osantígenos de grupo sangüíneo nas microcontas.Após a formação do complexo a amostra é opcionalmente lavada um ou maisvezes para remover componentes não ligados do plasma. Alternativamante os componentesnão ligados do plasma são separados das mirocontas por desempenhar uma etapa deseparação em que, as microcontas são removidas da amostra. A separação édesempenhada pelos métodos conhecidos na técnica tal como centrifugação. Asmicrocontas são ainda contatadas com reagentes de rotulação que especificamente seligam aos anticorpos de grupo anti-sanguíneo que é ligado a microconta. As microcontassão opcionalmente lavadas uma ou mais vezes para remover reagentes de rotulação nãoligados. A presença ou ausência de anticorpos de grupo anti-sanguíneo na amostra é entãodeterminada por detectar o regente de rotulação. A detecção é feita por métodos conhecidosna técnica tal como por citometria de fluxo ou luminex.

A invenção também fornece a detecção de múltiplos anticorpos de grupo anti-sanguíneo em uma amostra. Por múltiplos anticorpos de grupo anti-sanguíne é pretendidonão somente anticorpos específicos para cada dos grupos sangüíneos (isto é, ABH) masanticorpos específicos de antígenos de grupo sangüíneo de diferentes tipos de cadeia denúcleo de oligossacarídeo. Os múltiplos alvos são identificados por contatar a amostrabiológica com reagentes de detecção adicional seguidos por reagentes específicos derotulação adicional para a detecção adicional empregando o método descrito acima. Porexemplo, os subgrupos de microcontas são preparados com antígenos de grupossangüíneos distintos, por exemplo, antígenos de grupos sangüíneos que são distinguidospor tipo de cadeia de oligossacarídeo de núcleo. Os subgrupos de microconta são entãoadicionados à amostra biológica contido em uma relação controlada.

Em métodos anternativos, subgrupos de reagentes de rotulação são preparadoscom rótulos distintos, por exemplo, fluoróforos que são distinguidos por seua emissão deesprectos, por exemplo, um que emite no espectra verde e um que emite no espectravermelho. Os subgrupos de reagente de rotulação são então adicionados à amostrasbiológicas contenção detectar complexos de reagente alvo em uma relação controlada, porexemplo, duas partes um reagente de rotulação (por exemplo, emissão verde) e uma partede outro reagente de rotulação (por exemplo, emissão vermelha) por anticorpo de ligação dealvo. Neste caminho os complexos imuno-rotulados podem ser empregados para detectarum alvo. Se outro complexo imuno-rotulado foi adicionado a amostra o alvo original poderiaser distinguido do alvo detectado subsequencialmente.

Opionalmente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais antígenos de grupos sangüíneos sãodetectados em umas 20 amostras.

A amostra é definida para incluir qualquer material que pode conter um antígeno degrupo sangüíneo. Tipicamente, a amostra é sangue total, soros ou plasma.

Os métodos da invenção fornecem vantagens significantes sobre tecnologiasexistentes para tipagem sangüínea. Especificamente permite detectar os subtipos deantígeno de grupo sangüíneo. Além do mais, os métodos permitem a qualificação dosdiferentes subtipos de antígeno de grupo sangüíneo em uma amostra a ser determinada.

O reagente de detecção é um composto que é capaz de especificamente se ligaraos anticorpos de grupo sangüíneo ligados as microcontas. O regente de detecção éselecionado com base no alvo desejado. O reagente de detecção é, por exemplo, umpolipeptídeo tal como anticorpo de alvo específico ou fragmento deste. Como empregadoaqui, o termo "anticorpo" se refere a moléculas de imunoglobulina e porçõesimunologicamente ativa de moléculas de imunoglobulina (1g), isto é, moléculas que contémum sítio de ligação de antígeno que especificamente se liga a (imunoreage com) umantígeno. Tais anticorpos incluem, cadeia única, policlonal, monoclonal, quimérico,fragmentos de Fabl Fab- e F(ab )2 e uma biblioteca de expressão Fab. Por "especificamenteligado" ou "imunoreage com" é pretendido que o anticorpo reaja com um ou maisantigênicos determinantes do antígeno desejado e não reage (isto é, liga-se) com outrospolipeptídeos ou se liga a muitas afinidades inferiores (Kd > 10"6) com outros polipeptídeos.

Os anticorpos monoclonais são paticularmente vantajosos na pratica de métodosda presente invenção. Geralmente, os anticorpos monoclonais são mais sensíveis eespecíficos do que os anticorpos policlonais. Além do que, os anticorpos policlonais nãoparecidos, que dependem da longevidade do animal produzindo o anticorpo, o fornecimentodos anticorpos monoclonais é indifinido. Os anticorpos policlonais, entretanto, são úteisquando é necessário para usar anticorpos com múltiplos isotipos, como geralmente, namaior parte os anticorpos monoclonais são da subclasse IgGI.

Como empregados aqui, os termos "ligação imunológica," e "propriedade de ligaçãoimunológicas" se referem as interações não covalentes do tipo que ocorre entre umamolécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica. Aforça, ou afinidade das interações de ligação imunológicas pode ser expressada em termosde constante dissociação (Ka) da interação, na qual um Kd menor representa uma afinidademaior. As propriedades de ligação imunológicas de polipeptídeos selecionados sãoquantificadas empregando métodos bem conhecidos na técnica. Um tal método conferemedir as taxas de dissociação e formação de complexo de antígeno/ sítio de ligação deantígeno, onde aquelas taxas dependem das concentrações dos parceitos do complexo, aafinidade da interação, e parâmetros geométricos que igualmente influencia a taxa emambas as direções. Deste modo, ambos "na taxa constante" (Kon) e a "fora da taxaconstante" (Koff) podem ser determinados por calcular as concentrações e taxas atuais deassociação e dissociação. (Veja, Nature 361:186-87 (1993)). A relação de Koff/ Kon permitemo cancelamento de todos os parâmetros não relacionados a afinidade, e é igual para adissociação constante Kd. (Veja, geralmente, Davies e outros (1990) Annual Rev Biochem59:439-473).

A invenção sera ainda ilustradas nos seguintes exempos não limitados.

Exemplo 1: Construção de Vetores de Expressão

O vetor de expressão transportando ligando de glicoproteína de P-selectinal/camundongo IgG2b (PSGL30 lfmlgG2b) cDNA foi modificado para conter um sítio declivagem (EK) enterocinase. Este sítio pode ser empregado liberar a jusante da parte domouse IgG2b.

O gene do grupo sangüíneo A humano foi reação de cadeia de polimerase (PCR)amplificando-se o cDNA fabricado do RNA total isolado da linha de célula MKN-45, e o genede grupo sangüíneo B foi PCR amplificando-se o cDNA fabricado do RNA total isolado dalinha de célula HuTu80.

Os vetores de expressão empregados para gerar transfectantes estáveis sãobidirecionais, veja figuras esquemáticas. O vetor de expressão PSGL-1/mlgG2bb tem opromotor EFIa contra corrente de um poliligador, um doador de união e sítio receptor, e osinal adicional poli(A) bidirecional de SV40. Oposto a orientação para esta unidade detranscrição, empregando os sinais poli(A) da direção oposta, é uma segunda unidade detranscrição consistindo do promotor HSV TK seguidos pela seqüência de codificação paraacetiltransferase de puromicina (PAC). Similarmente, o vetor de expressão /?1,6G1cNAcT(enzima de 2 núcleos) contem o promotro EFIct e a seqüência de codificação para neomícinaresistente ao gene (Neo). O vetor de expressão FUT2 (gene Se) contém a mesma cadeiaprincipal do vetor, mas com o promotor CMV e a neomina resistência ao gene. Os vetoresde expressão GaINAcT (gene A) e o GaIT (gene B) contêm um promotor CMV e a blasictidinresistente ao gene (Bsd), o FUT1 (gene H) e o /?l,3GlcNAcT6 (enzima de 3 núcleos) contémum promotor CMV e a zeocina resistente ao gene, e o vetor de expressão GalT5 contém umpromotor CMV e gene de transferase fosforibosil de guanosina (GPT).

As seqüências de DNA dos vetores de expressão foram verificados por seqüênciasautomatizados.

Exemplo 2: Determinação de Expressão de PSGI_-1/JgG2g empregandoWESTERN BLOTTING e imunofluorescência indireta

A expressão de PSGL-1/mlgG2b em célula cultivada sobrenadante foi determinadaempregando SDS-PAGE e Western blotting. As amostras foram executados em 4-12% degéis gradiente (Invitrogen) em tampão MES (Invitrogen), e as proteínase separadas foramelectroforeticamente manchadas em membranas de nitrocelulose (Invitrogen). Em seguidatampado durante 1 hora em 3% de albumina de soro bovino (BSA) em solução salinatamponada com fosfato (PBS) com 0,2% de Tween 20, as membranas foram sondadadurante 1 hora em temperatura ambiente com um IgG anti-camundongo de cabra deperoxidase conjugada por anticorpo Fc (Sigma) diluído 1:4.000 em tampão de bloqueio. Asmembranas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,2% de Tween 20, e anticorposde ligação doram visualizados por quimioluminescência empregando o kit ECL (AmerhamBiosciences), de acordo com as intruções de fabricação.

A localização celular de PSGL-l/mlgG2b foi determinada por imunofluorescênciaindireta. As células CHO-K1 semeadas nas capas em placas de seis cavidades foramtransitoriamente transfectadas com o vetor de expressão PSGL-1/mlgG2b empregandoLipofectarnine 2000 (Invitrogen), de acordo com as intruções de fabricação. Quarenta deoito horas após a transfecção, as células foram lavadas com PBS e fixada em 30% deacetona/MeOH. Em seguida bloqueada durante 30 minutos em 1% de BSA em PBS1proteína de PSGL-1/mlgG2b foi detectada empregando um IgG anti-camundongo de cabrade FITC conjugado de anticorpo de Fc (Sigma) diluída 1:200 em tampão de bloqueio. Osnúcleos das células foram tingidos com 4,6-diamidino2-fenilindol (DAPI). As capas forammontadas em lâminas com Vectashield Mounting Médium ( Vector Laboratories). As Iaminasforam examinadas empregando um microscópio DMRXA (Leica Corp.), e digitalmenteimageado empregadno uma câmera Hamamatsu C4880-40 CCD (Hamamatsu PhotonicsNorden AB), a embalagem de software Openlab (Improvision), e o software AdobePhotoshop (veja figura).

Exemplo 3: Adaptação de células CHO-K1 para meio livre de soro

A linha de célula CHO-K1 (ATCC CCL-61) foi adaptada para meio livre de soro, Ex-cell 302 (MR Bioscience, Inc), de acordo com as instruções de fabricação.

Exemplo 4: Transfecção de DNA e seleção clonal

As células CHO-K1 adaptadas ao meio livre de soro foram semeadas em fracos de75 cm2 e foram transfectadas com vetor de expressão PSGL-1/mlgG2b empregandoLipofectamine 200 CD (Invitrogen), uma formação livre de origem animal, de acordo com asinstruções de fabricação. Quarenta de oito horas após transfecção, as células, foramincubadas em meio de seleção contendo puromicina (6/yg/mL). O meio de seleção foialterado todos os três dias. Após aproximadamente 2 semanas, as células mortas foramremovidas empregando Dead Cell Removal MicroBeads (Miltenyi Biotech), de acordo comas instruções de fabricação. As células vivas foram células clonadas únicas em placa de 96cavidades, e expandida no meio de seleção durante aproximadamente 2 semanas. Ascélulas cultivas sobrenadantes foram colhidas e a concentração de hPSGL-1/mlgG2b, foiavaliada por ensaio (ELISA) imunosorbente de enzima ligada, veja protocolo abaixo,empregando um IgG anti-camundongo de cabra de anticorpo Fc (Sigma). As célulasclonadas com expressão mais elevada de hPSGL-1/mIgG2b foram escolhido para expansão.

Exemplo 5: Quantificação de concentração PSGL-1/mlqG?h em sobrenadantesempresando ELISA

As células foram semeadas em frascos de 25 cm2 (-1 χ 106 células/mL). As célulascultivadas subrenadantes foram colhidas após 4 dias. A concentração de PSGL-1/mlgG2bproduzidas pelas células conadas foi avaliado pelo ensaio (ELISA) imunosorbente deenzima ligada. Placas de noventa e seis cavidades ELISA (Costar 3590, Corning) foramrevestidas durante 2 horas com um anticorpo Fc de anti- mlgG de cabra de afinidadepurificada (Sigma) em uma concentração de 10/vg/mL. As placas foram bloqueadas com 1%de BSA em PBS durante 2 horas. Os sobrenadantes contendo PSGL-1/mlgG2b foramconsecutivamente diluídas em tampão de bloqueio e incubadas durante 2 horas. Emseguida lavada, as placas foram incubadas durante 2 horas com um anticorpo Fc de IgGanti-camundongo de cabra de peroxidase conjugada (Sigma) diluída 1:4.000 em tampão debloqueio. O anticorpo de peroxidase conjugada foi visualizado com diidrocloreto de 3, 3', 5,5'-tetrametilbenzidina (Sigma). A reação foi parada com 2 M de H2SO4 e as placas foramlidas em 450 nm em um leitor de microplacas automatizado (Bio-Tek Instruments). Aconcentração de PSGL-1/mlgG2b foi estimada empregando como um padrão uma série dediluição de fragmentos Fc de mlgG purificada (Sigma). O clone da célula de procução maiselevada (~25/yg/mL) foi escolhido para também transfecções, cmo descrito abaixo.

Exemplo 6: Geração de PSGL-1/MIGG?g substituído por antíqenos de tipo 3 degrupo sangüíneo AJ B

A linha de célula estável CHO-K1 com a expressão PSGL-l/mlgG2b mais elevada foitransfectada com vetor de expressão FUT2 (gene Se), como descrito acima, e selecionadoem meio contendo G418 (400/yg/mL). O clone da célula com o número relativo mais elevadodos antígenos de tipo 3 do grupo sangüíneo H em PSGL-1/mlgG2b será transfectado comquaisquer vetores de expressão GaINAcT (gene A) ou GaIT (gene B), e selecionado emmeio contendo blasticidine, para gerar linhas de células que produzem os grupossangüíneos AeB, respectivamente, antigenos de tipo 3 em PSGL-l/mlgG2b (veja esquemade transfecção).

Exemplo 7: Geração de PSGL-I/MIGG?r substituído por antígenos de tipo 2 degrupo sangüíneo N B

A linha de célula estável CHO-K1 com a expressão PSGL-l/mlgG2b mais elevada foitransfectada com vetores de expressão βλ ,6GlcNAcTI (enzima de 2 núcleos) e FUTI (geneH), e selecionado em meio contendo G418 (400^/g/mL). O clone da célula com o númerorelativo mais elevado dos antígenos de tipo 2 do grupo sangüíneo H em PSGL-IAnIgG2bserá transfectado com quaisquer vetores de expressão σ1.3 GaINAcT (gene A) ou σ1.3 GaIT(gene B), e selecionado em meio contendo blasticidine, para gerar linhas de células queproduzem os grupos sangüíneos AeB, respectivamente, antigenos de tipo 2 em PSGL-l/mIgG2b (veja esquema de transfecção).

Exemplo 8: Geração de PSGL-l/MIGG?g substituído por antígenos de tipo 1 degrupo sangüíneo N BO clone da célula com o número relativo mais elevado dos antígenos de tipo 3 dogrupo sangüíneo H em PSGL-1/mlgG2b será transfectado com os vetores de expressãoβλ.3GlcNAcT (enzima de 3 núcleos) e GalT5, e selecionado em meio contendo zeocina. Oclone com número relativo mais elevado de antígenos de tipo 1 do grupo sangüíneo H emPSGL-1/mlgG2b será transfectado com quaiquer vetores de expressão σ1.3 GaINAcT (geneA) ou σ1.3 GaIT ( gene b), e selecionado em meio contendo blasticidine, para gerar linhasde células que produzem os grupos sangüíneos A e B, respectivamente, antigenos de tipo 1PSGL-l/mlgG2b (veja esquema de transfecção).

Exemplo 9: Purificação de HPSGL-I/EK/MIGG™

A célula cultivada sobrenadante será depurada das ruínas por centrifugação, epassada através de uma coluna contendo agarose de IgG anti-camundongo de cabra(molécula inteira) (Sigma). Após a lavagem com PBS1 a ligação de hPSGL-1/EK/mIgG2b seráeluída com 3M de NaSCN e dialisado com água destilada. Para remover o baixo pesomolecular contaminante, hPSGL-1/EK/mlgG2b pode ser ainda purificado por filtração em gelem uma columa HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR (Amersham Bioscience).

Aclopamento covalente para compactação de coluna e sefaroseAs mucinas purificados do grupo sangüíneo AeB será aclopada covalente paracontas de fluxo rápido de sefarose empregando química de bioconjugação padrão. Seguinteao aclopamento, a sefarose será embalada em recipiente plástico constituindo a colunaatual.

Eficácia de absorção e biocompatibilidade da coluna de protótipoOs títulos dos anticorpos de grupo anti-sanguíneo ABO antes de e após a absorçãode plasma do grupo sangüíneo O misturado será avaliado por técnicas bancando sanguepadrão inlcuindo teste de anti-globulina indereta e hemaglutinação. As proteínas de plasma,incluindo imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA), fatores/ fragmentos de complemento (C3, C3a,C3d, C4 e sC5b-9), complexos imune, e fatores de coagulação (produtos de degradação defibrina, FVIII, protrombina, fibrinogênio) deve ser todo medido por técnicas padrão. Asespecificidades absorvidas e eluidas, e anticorpos ABO nonaabsorvido será determinadopor ELISA empregando mucinas recombinantes transportando os antígenos do gruposangüíneo N B nas cadeias de sacarídeo de núcleo definido ou por uma camada fina combase em cromatografia resistente ao ensaio no qual glicolipídeos de grupo sangüíneo AeBdefinidos sstructuralmente e purificados.

Exemplo 10: Produção de contas de diferentes tamanhos e cores paradeterminação de títulos de anticorpo

As contas de diferentes tamanhos e cores foram produzidas de micromodo dePartikeltechnologie GmbH em Rostock, Alemanha e conjugado para antígenos de gruposangüíneo de diferentes tipos. As contas foram analisadas por citometria de fluxo emostravam uma boa resolução em ambos quanto a tamanho e cor (veja figura 5).Empregando este método é possível usar uma mistura com número grande de contasconjugada onde cada combinação de intensidade de tamanho e cor representa um antígenode grupo sanguínoe específico expressado em uma estrutura de núcleo específico.

Exemplo 11: Detecção de anticorpos de grupo sangüíneo

As amostras de soro são diluídas 1:10 em PBS com 0,5% de albumina humana emisturas com microconta látex (4,6 /vm; 18/vg por peso seco) transportando osoligossacarídeos de antígenos de grupo sangüíneo. O soro e as microcontas são incubadasem temperature ambiente durante 30 minutos e então lavadas com 0,5% de HAS/PBS. OIgG rotulado por PE e IgM anti-humano rotulado por FITC é adicionado as microcontaslavadas e analisadas por citometria de fluxo.Referências

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2) Kl Welsh, M van Dam, CG Koffman Transplant Proc 1987; 19:4565-4567 20

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18)L Rydberg, A Bengtsson, 0 Samuelsson, K Nilsson, ME Breimer Transpl Int

2005;

Outras ModalidadesEnquanto a invenção foi descrita em conjunção com a descrição detalhada deste,descrição antecedente é entendida para ilustrar e não limitar o escopo da invenção, quedefinida pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens,modificações estão no escopo das reivinidicações seguintes.Listagem de seqüência

<110> Holgersson1 JanLiuf JiningBjornstrom, LindaGrufman1 Per

<120> Antígenos de grupo sangüíneo de diferentes tipos para aplicaçõesterapêuticas e diagnósticas

<130> 23254-512

<140> 11/690,616<141> 2007-03-23

<150> 60/785,700<151> 2006-03-23

<160> 2

<170> Versão da patente 3.2

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<223> sítio clivagem de enzima sintética

<400> 1gacgatgacg ataag

<210> 2<211> 5<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> sítio clivagem de enzima sintética

<400> 2

Asp Asp Asp Asp Lys1 5

Claims (32)

1. Composição compreendendo pelo menos dois antígenos de grupo sangüíneo,CARACTERIZADA pelo fato de que cada antígeno de grupo sangüíneo é expressado emdiferentes tipos de cadeia de sacarídeo de núcleo.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque o referido antígeno de grupo sangüíneo é um antígeno A, um antígeno B ou um antíge-no H.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque os referidos antígenos do grupo sangüíneo estão ligados a um suporte sólido.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato deque o referido tipo de cadeia de sacarídeo de núcleo é um tipo 1, um tipo 2, um tipo 3 ou umtipo 4.

5. Absorvente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a composição deacordo com a reivindicação 3.

6. Método para determinar a presença de anticorpos reativos do grupo sangüíneono soro de um paciente, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreen-de:a) fornecer uma coleta de microcontas de subtipos diferentes, onde cada subti-po é revestido com diferente antígeno de grupo sangüíneo,b) adicionar o referido soro do referido paciente a referida coleta de microcontas;c) incubar o referido soro e microcontas durante tempo suficiente para anticor-pos do grupo anti-sanguíneo no referido soro se ligarem aos referidos antígenos de gruposangüíneo;d) incubar as referidas microcontas com pelo menos um ligando rotulado capazde especificamente ligar-se com os referidos anticorpos de grupos de anti-sanguíneo ligadosaos referidos antígenos do grupo sangüíneo; ee) detectar a presença de ligando rotulado ligado aos referidos anticorpos degrupo anti-sanguíneo para determinar a presença ou ausência dos referidos anticorpos reativos.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que oreferido antígeno do grupo sangüíneo é carregado por um tipo de cadeia de sacarídeo denúcleo diferente.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que areferida detecção é por citometria de fluxo ou luminex.

9. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que areferida coleta compreende 8 antígenos A/B de grupos sangüíneos diferentes.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queas microcontas são látex.

11. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queas microcontas de pelo menos um subtipo de antígeno de grupo sangüíneo diferem das mi-crocontas de pelo menos um outro subtipo de grupo sangüíneo por ter sido selecionado porter diferentes diâmetros ou diferentes cores.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queas microcontas de pelo menos um subtipo de grupo sangüíneo diferem das microcontas depelo menos um outro subtipo de grupo sangüíneo por ter sido rotulado com rótulos diferentes.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de queos rótulos são rótulos fluorescentes.

14. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queas microcontas são aproximadamente 5 pm em diâmetro.

15. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queas microcontas variam em diâmetro de cerca de 2 pm a cerca de 15 pm.

16. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queadicionalmente compreende a etapa de remover os referidos componentes de soro que nãoespecificamente se ligam com os referidos antígenos do grupo sangüíneo apresentados nasreferidas microcontas antes da etapa (d).

17. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de queadicionalmente compreende a etapa de remover ligando rotulado que não está ligado aosreferidos anticorpos do grupo anti-sanguíneo antes da etapa (e).

18. Método de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que oreferido ligando é um anticorpo ou fragmento deste.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de queo referido anticorpo é um fragmento de anticorpo monovalente.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de queo referido fragmento de anticorpo monovalente é um fragmento Fab ou Fab'.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de queo referido fragmento Fab ou Fab' é selecionado do grupo consistindo em um fragmento deanticorpo anti-Fe, um fragmento de anticorpo de cadeia leve anti-capa, um fragmento deanticorpo de cadeia leve anti-lambda, e um fragmento de anticorpo de cadeia única.

22. Composição de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato deque o referido tipo de cadeia é um precursor tipo 1, um tipo 2, ou um tipo 3.

23. Coleta de microcontas de diferentes subtipos, CARACTERIZADA pelo fato deque cada subtipo é revestido com antígeno de grupo sangüíneo diferente.

24. Coleta de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de que oreferido antígeno de grupo sangüíneo é carregado por um tipo de cadeia de sacarídeo denúcleo diferente.

25. Coleta de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADA pelo fato de queos referidos antígenos de grupo sangüíneo são expressados em uma mucina recombinante.

26. Coleta de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADA pelo fato de que areferida expressão de antígeno de grupo sangüíneo é multivalente.

27. Composição de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato deque o referido tipo de cadeia sacarídeo de núcleo é um precursor tipo 1, um tipo 2, um tipo 3ou um tipo 4.

28. Método para remover anticorpos reativos de grupo sangüíneo no soro, o referi-do método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) fornecer uma coleta de microcontas de diferentes subtipos, onde cada subtipo érevestido com um antígeno de grupo sangüíneo diferente,b) contatar o referido soro com a referida coleta de microcontas;c) incubar o referido soro e microcontas durante tempo suficiente para anticorposde grupo anti-sanguíneo no referido soro se ligarem aos referidos antígenos de grupo san-güíneo;d) separar as referidas microcontas do referido sorodesse modo removendo os referidos anticorpos reativos do referido soro.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de queo referido antígeno de grupo sangüíneo é expressado em diferente de tipos de cadeia desacarídeo de núcleo.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de queos referidos tipos de cadeia de sacarídeo de núcleo são tipo 1, tipo 2, tipo 3 ou tipo 4.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de queo antígeno de grupo sangüíneo é expressado em uma mucina recombinante.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de quea referida expressão de antígeno de grupo sangüíneo é multivalente.