JP2001502896A

JP2001502896A - イヌ糸状虫感染を検出する方法

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Publication number: JP2001502896A
Application number: JP10514859A
Authority: JP
Inventors: ロバートビー．グリーブ; グレンアール．フランク; ロイアール．モンデザイア; ジェームズピー．ポーター; ナンシーウィスネウスキー
Original assignee: ヘスカコーポレーション
Priority date: 1996-09-18
Filing date: 1997-09-18
Publication date: 2001-03-06
Also published as: WO1998012563A1; US20030170749A1; CA2266428A1; EP0934529A1; AU4353797A; US6391569B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、宿主動物の体液中の抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３抗体を検出するのにイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いることで、その動物のイヌ糸状虫感染を検出する方法を含む。さらにその動物の体液中のＤｉ３３たんぱく質を検出するためにイヌ糸状虫抗Ｄｉ３３たんぱく質を用いることで、宿主動物のイヌ糸状虫感染を検出する方法も含まれる。本発明はさらに、Ｄｉ３３たんぱく質又は抗Ｄｉ３３抗体のいずれかを含むイヌ糸状虫検出キットに関連するものであるが、このようなキットにはさらに、この抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間の免疫錯体を検出するための組成物が含まれる。また本発明は、Ｄｉ３３たんぱく質、このようなたんぱく質をコードしている核酸分子や、このような核酸分子を含む組換え分子及び組換え細胞、並びに抗Ｄｉ３３抗体をさらに含む。さらにこのようなたんぱく質、核酸分子及び抗体を作成するための方法も含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】イヌ糸状虫感染を検出する方法発明の分野本発明は動物、特にネコのイヌ糸状虫感染を検出するための新規な方法に関する。本発明はさらに、イヌ糸状虫感染を検出するための新規なキット、及びその検出用試薬を精製するための方法を含む。発明の背景寄生性の蠕虫であるイヌ糸状虫はイヌに感染してイヌ糸状虫を生むことが長らく知られている。イヌ糸状虫はさらにその他の動物、例えばネコ及びフェレットにも、このような動物は基本的にはこの感染にとって非適合性の宿主であるにも関わらず、感染することが最近明らかになった。つまり、イヌ糸状虫と適合動物との間の寄生関係がよく適合しており、蠕虫による負荷があまり大きくない限り臨床徴候がほとんどないのである。対照的に、非適合性の動物、例えばネコ及びフェレットのイヌ糸状虫との寄生関係にはあまり適合性がないために、その動物の疾患、さらにひいては死に至るのである。ネコなどの非適合動物における糸状虫感染は診断が難しいが、それは、様々な臨床徴候があるがその中には他の疾患に関連があるものがあるからである。糸状虫による疾患は急性であったり慢性であったりし、また呼吸困難、咳及び嘔吐、昏睡、及び／又は食欲低下を伴うことがある。このように、動物の糸状虫をはっきりと検出する方法が必要とされている。イヌ糸状虫の生命サイクルはそれが感染したあらゆる動物において複雑であり、またこの生物は、特に成虫に糸状虫が成熟するまでは検出が困難である。蠕虫による負荷が大変低い非適合性の宿主では検出は特に難しい。例えばネコは平均して二匹又は三匹の蠕虫しか宿していないために、イヌ糸状虫特異抗原又は抗体の検出が困難になっている。性的に成熟した成虫は交配後にミクロフィラリアを生むが、このミクロフィラリアは宿主の毛細血管床を移動して血管系を循環する。イヌにおいて感染を実証する方法の一つは、例えば、この血中のミクロフィラリアを検出する方法である。もう一つの方法は、血液中でイヌ糸状虫血中寄生中抗原を検出することであるが、これらの抗原は成虫のメスの蠕虫及びミクロフィラリアに関連するものである（例えばウェイル氏による１９８９年６月１３日発行の米国特許第４，８３９，２７５号を参照されたい）。しかしながら非適合性の宿主では、イヌ糸状虫に感染しても一匹の蠕虫しか成熟に至らないことが多くあり、このような場合には繁殖が起きる機会がないために卵及びミクロフィラリアは生まれない。加えて、この一匹の蠕虫はしばしばオスの蠕虫である。感染した動物が昆虫のいない環境に維持された場合、この寄生性物のライフサイクルが進行する可能性はない。しかしながら、感染した動物からメスの蚊が血液を吸うときにミクロフィラリアを取り込んだ場合、この蚊の体内でミクロフィラリアが幼虫に成長する。ミクロフィラリアは二つの幼虫段階（Ｌ１及びＬ２）を経て最終的には成熟した第三段階の幼虫（Ｌ３）へとなるが、この第三段階の幼虫が次に、蚊に噛まれた宿主動物に戻る可能性がある。従って、最初の感染の原因はこの第三段階にあるのである。感染後三日という早い時点でＬ３は四番目の幼虫（Ｌ４）段階に脱皮し、次に第五段階へ、又は未成熟の成虫へとなる。この未成熟の成虫は心臓及び肺動脈へと移動してそこで成熟及び繁殖を行い、血液中にミクロフィラリアを生じる。宿主における糸状虫感染の「神秘」は、ミクロフィラリアは全く検出できないのにその他の方法によれば成虫の糸状虫の存在が確認できるということとされている。糸状虫を検出するもう一つの方法は生薬の利用であり、例えばグリーブ氏らによる１９８７年４月１４日発行の米国特許第４，６５７，８５０号を参照されたい。しかしながらこれらの検定法は、特に非適合性の宿主における検出を行う際に望まれる感受性及び特異性に欠けるものである。ホン氏らは１９９５年のProc Heartworm Symposium,p.33でイヌ糸状虫抗原ＤｉＴ３３をコードしている遺伝子のクローン形成を報告している。ホン氏らによる１９９４年のAbstracts of Amer.Soc.Trop Med Hyg.Meeting,p191-192も参照されたい。ホン氏らはまた１９９５年の同書で、ＤｉＴ３３をマルトース結合たんぱく質に連結したものから成る組換え融合たんぱく質により、１１週でイヌのイヌ糸状虫感染を検出できたと報告しているが、ネコ又はフェレットなど、非適合性の宿主のイヌ糸状虫感染を検出するのにこのたんぱく質を用いたとは報告していない。以前、何人かの研究者が、関連するたんぱく質Onchocerca volvu lus Ｏｖ３３をO.volvulus又はイヌ糸状虫感染を検出するために利用することや、O.volvulusＯｖ３３をコードしている遺伝子のクローン形成を報告したことがある。例えば、Santiago Mejia et al,1994,Parasite Immunol 16,297-303;Ogunrinade et al,1993,J Clin Microbiol 31,1741-1745;Lucius et al.,1992,Trop Med Pa rasitol 43,139-145;Lucius et al,1988,J Exp Med 168,1199-1204;Lucius et a l,1988,J.Exp.Med 167,1505-1510を参照されたい。Ａｖ３３をコードした関連する遺伝子はAcanthocheilonema viteaeから分離されている。例えばWillenbucher et al,1993,Mol.Biochem.Parasitol.57,349-351を参照されたい。再び言うが、このたんぱく質が、蠕虫による負荷が低い動物において蠕虫が成虫へ成熟する前でも感染を検出できるかどうかを言及したものはない。イヌ糸状虫感染を検出する正確かつ簡単な方法が依然、求められている。特に求められるのは、幼虫が糸状虫成虫へ成熟する前のイヌ糸状虫感染を検出できるが、満期の感染に進まない初期感染、つまり、宿主の免疫反応により成虫への発達を妨げることができるような感染、は検出しないような方法である。発明の概要本発明は、幼虫が成熟した成虫の糸状虫に成熟する前のイヌ糸状虫感染を検出しながら、満期の感染に発展しない初期感染（即ち成熟した糸状虫への成長に至らない感染）は検出しない検出方法及びキットを含む。本発明は、非適合性の宿主のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）宿主から採取した体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在するＤｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間の免疫錯体形成を測定するステップであって、このような免疫錯体の存在は、宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、ステップとを含む方法を含む。本発明はさらに、宿主動物中のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）その動物から採取された体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在するＤｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間の免疫錯体形成であって、このような免疫錯体の存在は、その動物がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、免疫錯体形成とを含む方法を含む。本発明にはさらに、非適合性宿主のイヌ糸状虫感染を感染後１０週以内で検出する方法が含まれ、同方法は、宿主から採取された体液中に抗Ｄｉ３３抗体を検出するステップを含む。本発明はまた、非適合性の宿主のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）宿主から採取した体液を、分離された抗Ｄｉ抗体を含む製剤に、この抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在する抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間の免疫錯体形成を測定するステップであって、このような免疫錯体の存在は、宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、ステップとを含む方法を含む。本発明の一実施例は、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質と、このＤｉ３３たんぱく質と免疫鉗体を形成することのできる抗体を検出する組成物とを含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキットである。もう一つの実施例は、分離された抗Ｄｉ３３抗体と、抗Ｄｉ３３抗体及びイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質間の免疫錯体を検出する組成物とを含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキットである。本発明はさらに、Ｄｉ３３たんぱく質と、このようなたんぱく質をコードしている核酸分子と、このような核酸分子を含む組換え分子及び組換え細胞と、抗Ｄｉ３３抗体とを含む。Ｄｉ３３たんぱく質の例には、ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄ 及びＰＤｉ３３₂₁₇があるが、これらに限定されるものではない。Ｄｉ３３核酸分子の例には、ｎＤｉ３３₃₄₆、ｎＤｉ３３₇₅₀、ｎＤｉ３３₇₀₂、ｎＤｉ３３₇₀₈ 、及びｎＤｉ３３₆₅₁があるが、これらに限定されるものではない。さらにＤｉ３３核酸分子、Ｄｉ３３核酸分子含有組換え分子、Ｄｉ３３核酸分子含有組換え細胞、Ｄｉ３３たんぱく質及び抗Ｄｉ３３抗体を作成するための方法が含まれる。本発明のある実施例は、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を作成する方法であって、（ａ）イヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子で形質転換させたバクテリアを培養してイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質含有培養株を作成するステップと、（ｂ）この培養株からＤｉ３３たんぱく質を含む不溶性の物質を回収するステップと、この不溶性の物質からＤｉ３３たんぱく質を精製するステップとを含む方法である。さらに、イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質生成組換え細胞の培養株から得た不溶性物質を破砕して陽イオン交換クロマトグラフィを行うことでＤｉ３３たんぱく質を回収するステップを含む、イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を精製するための方法が含まれる。図面の簡単な説明図１は、本発明の糸状虫検出用試薬を用いて、イヌ糸状虫に感染したネコの抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体を検出しようとするＥＬＩＳＡの結果である。図２は、本発明の糸状虫検出用試薬を用いて、イヌ糸状虫に感染したネコの抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体を検出しようとするＥＬＩＳＡの結果である。図３は、本発明の糸状虫検出用試薬を用いて、イヌ糸状虫に感染したネコの抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出しようとするＥＬＩＳＡの結果である。図４は、本発明の糸状虫検出用試薬を用いて、イヌ糸状虫に感染したネコの抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出しようとするＥＬＩＳＡの結果である。発明の詳細な説明本発明は、イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を基にした検出（例えば診断的な、スクリーニング）法及びキットにより、イヌ糸状虫の幼虫がＬ４からＬ５に成熟する時点で、非適合性の宿主（即ち、イヌ糸状虫が寄生関係を確立しない、イヌ糸状虫感染に感受性のある動物）のイヌ糸状虫感染を、このような宿主における蠕虫による負荷が大変低いにもかかわらず検出することができるという驚くべき発見に関するものである。従って、本発明のイヌ糸状虫検出法及びキットは、非適合性の宿主において、イヌ糸状虫が成虫糸状虫に成熟する前にイヌ糸状虫を検出することができる。このように、産卵に関連する試薬の検出にのみ基づいた検定法とは異なり、本発明の方法及びキットは、成虫の糸状虫が性的に活発になる前にイヌ糸状虫感染を検出するものである。糸状虫は通常、感染後約６．５カ月で繁殖上活発になる。本発明のイヌ糸状虫検出法及びキットは、非適合性の宿主のイヌ糸状虫を、その宿主がイヌ糸状虫に感染してから（即ちその後）少なくとも約１０週で、場合によっては約８週という早い時期に検出することができる。イヌ糸状虫感染は、成虫の糸状虫を宿した非適合性の宿主においても検出できる。従って、イヌ糸状虫感染は、糸状虫の成虫寿命段階、例えばネコの場合では約２から３年の間に渡って、感染後約８から１０週のいかなる時点でも検出が可能である。このように、イヌ糸状虫は感染後約１２週、１６週、２０週、及び２４週（例えば約６カ月）の時点や、その中間の時点やもっと遅い段階でも検出が可能である。しかしながら、約４から約６週未満のイヌ糸状虫感染はＤｉ３３たんぱく質を用いては一般的には検出されない。本発明の検出方法及びキットは、これらが僅かに一匹の蠕虫を持つ（即ち維持している、ある一定期間持っている、感染している）非適合性宿主において感染を検出することができるという点で、特に有用である。さらに、本発明の検出方法及びキットは、一匹のオス蠕虫又は一匹のメス蠕虫に至る感染を検出することができる。もちろん、本発明によるイヌ糸状虫Ｄｉ３３を基にした方法及びキットはさらに、２、３、４又は５匹の蠕虫を含む、しかしこれらに限らず、蠕虫によるより大きな負荷も検出することができることは留意されたい。従って、本発明の方法及びキットは、あらゆる感染した非適合性の宿主におけるイヌ糸状虫感染を、自己消散する可能性の高いごく初期の段階の感染や、抗蠕虫薬の毎月の投与で治療することができ、従って満期の感染に発展しないようなごく初期段階の感染（成熟した糸状虫への成長に至らない感染）を除き、検出することができる。本発明の検出方法は感受性が大変高いだけでなく、イヌ糸状虫感染に対して特異的な方法である。本発明のもう一つの発見は、イヌ糸状虫感染により、抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３免疫グロブリンＥ抗体（抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体）の生成だけでなく、抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３抗体のその他のイソタイプ、例えば抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３免疫グロブリンＧ抗体（抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体）の生成が刺激されるということである。このように、本発明には、抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体の検出に基づくイヌ糸状虫検出方法及びキットと共に、抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体など、抗Ｄｉ３３抗体のその他のイソタイプの検出に基づく方法及びキットも含まれる。理論に縛られるわけではないが、抗Ｄｉ３３ＩｇＥに基づく方法及びキットは、抗Ｄｉ３３ＩｇＧに基づく方法及びキットに比べて特異性が高いと考えられ、一方、抗Ｄｉ３３ＩｇＧを基にした方法及びキットは、抗Ｄｉ３３ＩｇＥを基にした方法及びキットよりも感受性が高いと考えられる。本発明は、非適合性の宿主におけるイヌ糸状虫（即ち糸状虫感染）を、このような宿主から採取された体液中に存在する何らかの抗Ｄｉ３３抗体を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて検出することで、検出する方法を含む。本発明はまた、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出することで、イヌ糸状虫感染に感染可能なあらゆる動物においてイヌ糸状虫を検出するための方法を含む。もう一つの実施例は、イヌ糸状虫感染を検出するための抗Ｄｉ３３抗体の利用である。さらに本発明には、イヌ糸状虫感染をこのような方法に基づいて検出するためのキットと、イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を生成する組換え分子及び組換え細胞と、このようなたんぱく質を精製する方法とが含まれる。「ある（原語：a）」実体又は「ある（原語：an）」実体という術語は、一つ又はそれ以上のその実体を言うものであることに留意されたい。例えば、あるたんぱく質とは、一つ又はそれ以上のたんぱく質あるいは少なくとも一つのたんぱく質を言うものである。従って、「ある（原語：a）（又は「ある（原語：an）」、「一つ又はそれ以上の」及び「少なくとも一つの」という術語はここでは互換可能に用いられていることがある。さらに、「含む（原語：comprising）」、「含む（原語：including）」及び「有する（原語：having）という術語は互換可能に用いられていることがある。本発明によれば、分離された、又は生物学的に純粋なイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質はその天然ミリューから取り出されたたんぱく質である。従って、「分離された」及び「生物学的に純粋な」とは、必ずしもそのたんぱく質が精製された程度を反映するものではない。本発明による分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質はその天然源（即ちイヌ糸状虫）から得ても、組換えＤＮＡ技術を用いて作成しても、又は化学合成により作成してもよい。ここで用いられる場合の、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質（ここではＤｉ３３たんぱく質、又は約３３キロダルトン（ｋｄ）のイヌ糸状虫たんぱく質とも言及されている）は、全長たんぱく質でも、このようなたんぱく質のいかなる相同体でもよい。本発明による分離されたＤｉ３３たんぱく質は、相同体も含め、ここでは抗Ｄｉ３３抗体とも言及される抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３抗体と免疫錯体を形成するというＤｉ３３たんぱく質の能力により、簡単な方法で同定が可能である。抗Ｄｉ３３抗体については、ここでは他の箇所でより詳細に説明することとする。Ｄｉ３３相同体の例には、アミノ酸が削除された（例えばペプチドなど、このたんぱく質の切断形）り、挿入されたり、反転したり、置換及び／又は誘導されたり（例えばグリコシレーション、リン酸化、アセチル化、ミリストイレーション（原語：myristoylation）、プレニレーション、パルミトイレーション（原語：palmitoylation）、アミド化及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの付加により）した結果、その相同体が、抗Ｄｉ３３抗体と免疫錯体を形成することのできるエピトープを少なくとも一つ含むようになったＤｉ３３たんぱく質が含まれる。Ｄｉ３３たんぱく質の相同体は、自然的なアレル変異又は自然的な突然変異の結果によるものでもよい。本発明のＤｉ３３相同体はさらに、このたんぱく質への直接的改変を行うか、又は、このたんぱく質をコードしている遺伝子を、例えば伝統的な又は組換えＤＮＡ技術を用いてランダムな又は標的を定めた突然変異誘発を行って改変する方法を含め、しかしこれらに限らず、当業において公知の技術を用いて作成してもよい。本発明の見かけ上の全長Ｄｉ３３たんぱく質をコードしているｃＤＮＡのコドン鎖の核酸配列をここでは配列同定番号第２番で表す。配列同定番号第２番を有するコドン鎖と、相補の非コドン鎖（その核酸配列は当業者には容易に判断可能である）の両方を含む二本鎖の核酸分子を、ここではＤｉ３３核酸分子ｎＤｉ３３₇₅₀と呼ぶこととする。配列同定番号第２番を翻訳すると、核酸分子ｎＤｉ３３₇₅₀は、配列同定番号第３番で表される、ここではＰＤｉ３３₂₃₄と呼ばれる、約２３４アミノ酸から成る全長イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質をコードしていることが分かるが、ただしこのとき配列同定番号第２番の約ヌクレオチド２４から約ヌクレオチド２６の間に開始（スタート）コドン、そして配列同定番号第２番の約ヌクレオチド７２６から約ヌクレオチド７２８に終了（停止）コドンを有する開放読み取り枠を想定している。停止コドンを除く、ＰＤｉ３３₂₃₄をコードしているコドン領域は、ここでは配列同定番号第４番として表される核酸配列をコドン鎖に持つ核酸分子ｎＤｉ３３₇₀₂で表される。配列同定番号第４番は、約１７のアミノ酸のシグナルペプチドと、ここではＰＤｉ３３₂₁₇と表される、約２１７のアミノ酸から成る見かけ上の成熟たんぱく質とをコードしているように思われ、この見かけ上の成熟たんぱく質のアミノ酸配列をここでは配列同定番号第７番に表しておく。この見かけ上の成熟たんぱく質をコードしている核酸分子はｎＤｉ３３₆₅₁と言及されるが、この核酸分子のコドン鎖の核酸配列をここでは配列同定番号第６番に記載しておく。これらの核酸配列及びアミノ酸配列の知識があれば、当業者であれば、各核酸分子及びたんぱく質に改変を加えることで、例えば、可溶性の増したＤｉ３３たんぱく質を開発したり、及び／又はイヌ糸状虫Ｄｉ３３感染を検出することのできる切断形たんぱく質（例えばペプチド）を開発することができる。例えば、可溶性のより高いたんぱく質を生じることになるであろうＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄（これの作成については実施例で説明することとする）の改変方法としては、推定上のシグナル配列の削除及び／又はたんぱく質ヨードアセトアミド化があるが、これに限定されるものではない。本発明にはさらに、イヌ糸状虫感染を検出するためにＤｉ３３ミメトープを利用することが含まれる。本発明に基づくと、「ミメトープ」とは、抗Ｄｉ３３抗体に結合するＤｉ３３たんぱく質の能力を模倣することのできるあらゆる化合物を言う。ミメトープは、ペプチドを、分解しやすい傾向が低下するよう、しかし抗体結合活性は維持しているように改変したものでもよい。その他のミメトープの例には、炭水化物を基にした化合物、脂質を基にした化合物、核酸を基にした化合物、天然の有機化合物、合成により得られた有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体、又はこれらのフラグメントが含まれるが、これらに限定されることはない。ミメトープは例えば、合成化合物のライブラリをスクリーニングして抗Ｄｉ３３抗体に結合することのできる化合物を探すことで得てもよい。ミメトープはさらに、例えば合理的なドラッグデザインにより得てもよい。合理的なドラッグデザインの手法においては、本発明による化合物の三次元構造を例えば核磁気共鳴法（ＮＭＲ）又はＸ線クリスタログラフィにより分析することができる。次にこの三次元構造を用いて、例えばコンピュータ・モデリングを行うことにより、ミメトープとして可能性のある物質の構造を予測してもよい。こうして、予測されたミメトープの構造を、例えば化学合成、組換えＤＮＡ技術により、又は天然源からミメトープを分離することにより作成することができる。さらに本発明には、抗Ｄｉ３３抗体としても言及される、抗イヌ糸状虫Ｄｉ３３抗体が含まれる。このような抗体は本発明のＤｉ３３たんぱく質に選択的に結合することができるものである。ここで用いられる場合の「選択的に結合する」という術語は、このような抗体が、本発明のＤｉ３３たんぱく質に選択的に結合することができるが、その他のたんぱく質には概ね結合できないことを言う。結合は当業者に公知の様々な方法で測定することができるが、その中には免疫ブロット検定法、免疫沈降検定法、酵素免疫検定法（例えばＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定法、免疫蛍光抗体検定法及び免疫電子顕微鏡法が含まれる。例えばSambrook et al.,1989,Molecular Clonlng:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor La bs Pressを参照されたい。本発明の抗体は、多クローン抗体又は単クローン抗体のいずれでもよい。本発明の抗体には、抗体フラグメント、一本鎖の抗体を含む遺伝子操作された抗体や、抗体を得るために用いられるＤｉ３３たんぱく質又はＤｉ３３ミメトープのエピトープの少なくとも一つに選択的に結合することのできる抗体ミメトープなど、機能的等価物が含まれる。好ましくは、本発明の抗体が、本発明のＤｉ３３たんぱく質に対し、約１０³Ｍ^-1から約１０¹²Ｍ^-1の単一部位結合親和性を有しているとよい。本発明の抗体を作成するのに好適な方法には、動物に対し、抗体を生じるのに有効量のＤｉ３３たんぱく質又はそのミメトープを投与して、その抗体を回収する方法がある。規定の生成物又はミメトープに対して生じた抗体は、このような抗体が、診断的検定において干渉を起こしたり、治療用組成物中に用いた場合に副作用を生じたりしかねないその他の物質に対する抗体で大きく汚染されていないため、有利である。本発明のある一つの実施例は、非適合性の宿主におけるイヌ糸状虫感染を検出する方法であって、（ａ）このような宿主から採取した体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間に免疫鉗体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在するＤｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間の免疫錯体形成を測定するステップとを含む方法である。このようなＤｉ３３たんぱく質：抗Ｄｉ３３抗体（Ｄｉ３３：抗Ｄｉ３３）免疫錯体の存在は、宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染した（例えば、最近感染し、その後抗Ｄｉ３３抗体がまだ存在する時点で化学療法を受けた）ことの指標となるものである。ここで用いられる場合の非適合性宿主とは、糸状虫への感染可能性はあるがイヌ糸状虫が良好に適応した寄生関係を確立しないようなあらゆる動物を言う。非適合性宿主の例には、ネコ、フェレット、及びその他のイタチ科の仲間があるが、これらに限定されるものではない。ここで用いられる場合のネコとは、家ネコ、野生のネコ、及び動物園のネコを含め、あらゆるネコ科（即ちネコ科）の仲間を言う。ネコの例には、家ネコ、ライオン、トラ、ヒョウ、クロヒョウ（原語：panther）、クーガー、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チータ、及びサーバルが含まれるが、これらに限定されるものではない。イヌ糸状虫感染を検査するのに好適なネコは家ネコである。体液とは、動物から採取できる（即ち得られる）あらゆる流体を言い、その例には、血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液、リンパ液、鼻分泌液、及び糞が含まれるが、これらに限定されるものではない。分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤とは、少なくともＤｉ３３たんぱく質を含んだ組成物を言う。このような製剤にはさらに、例えばＤｉ３３たんぱく質が可溶化された緩衝液、及び／又は担体が含まれていてもよいが、必ずしもこれらが含まれている必要はない。適した緩衝液及び担体は当業者には公知である。適した緩衝液の例には、あるたんぱく質又は抗体が、例えばリン酸緩衝生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタンスルホン酸緩衝生理食塩水）、ＴＥＳ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝生理食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝液及びＴＡＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ−アセテート−ＥＤＴＡ）など、そのパートナーに選択的に結合すべくその中で働くことのできるあらゆる緩衝液が含まれるが、緩衝液の例はこれらに限られるものではない。担体の例には、ポリマー・マトリックス、トキソイド、及び、ウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンがあるがこれらに限定されるものではない。担体は、Ｄｉ３３たんぱく質が抗Ｄｉ３３抗体に選択的に結合する能力に大きく干渉しない態様であれば、Ｄｉ３３たんぱく質に混合されていても、Ｄｉ３３たんぱく質に結合して（即ち付着して）いてもよい。本発明の製剤には、さらに、Ｄｉ３３たんぱく質又は抗Ｄｉ３３抗体だけでなく、イヌ糸状虫感染を検出するのに有用な一つ又はそれ以上のイヌ糸状虫抗原又は抗体がさらに含まれていてもよい。このような抗原及び抗体の例には、イヌ糸状虫Ｐ２２Ｕ（グリーブ氏らによる１９９４年７月２１日公開のＰＣＴ公報ＷＯ９４／１５５９３号を参照されたい）、イヌ糸状虫Ｐ３９（同書ＷＯ９４／１５５９３号を参照されたい）、イヌ糸状虫Ｇｐ２９（トリップ氏らによる１９９５年９月１４日公開のＰＣＴ公報ＷＯ９５／２４１９８号を参照されたい）、イヌ糸状虫シスタチン（原語：cystatin）、イヌ糸状虫梯子型たんぱく質、イヌ糸状虫血中抗原（例えば上述の米国特許第４，８３９，２７５号を参照されたい、及びこれらの抗原に対する抗体が含まれるが、これらに限定されることはない。ここで用いられる場合の「接触させる」という術語は、この場合は体液を、分離されたＤｉ３３たんぱく質に配合又は混合することを言う。Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間の免疫錯体の形成とは、測定（即ち検出）の可能な安定した錯体を形成すべく、Ｄｉ３３たんぱく質が抗Ｄｉ３３抗体に選択的に結合することのできる能力を言う。ここで用いられる場合の抗Ｄｉ３３抗体に選択的に結合するという術語は、本発明のＤｉ３３たんぱく質が、その他の抗体にほぼ結合できない状態で抗Ｄｉ３３抗体に選択的に結合できるという能力を言う。Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間の結合は、免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で行われるが、このような条件（例えば適切な濃度、緩衝液、温度、反応時間）や、このような条件を最適化するための方法は当業者には公知であり、いくつかの例がここに開示されている。免疫錯体形成条件の例はさらに、上述のSambrook et al．による文献に開示されているが、このSambrook et al．による文献全体を参考文献としてここに編入しておく。ここで用いられる場合の「免疫錯体形成を測定する」という術語は、何らかの免疫錯体が形成されているかを判断すること、即ち免疫錯体の存在を検定することを言う。免疫錯体が形成されていれば、形成された免疫錯体の量を調べてもよいが、必ずしも調べなくともよい。「体液中の抗Ｄｉ３３抗体」という文言は、その動物が感染しているか、又は感染が大変初期か、あるいは抗Ｄｉ３３抗体の形成より前に消散したかに応じて、このような抗体が存在する又は存在していない可能性を言う。体液中のＤｉ３３と何らかの抗Ｄｉ３３抗体との間の免疫錯体形成又は選択的結合は当業において標準的な様々な方法（例えば上述のSambrook et al．による文献を参照されたい）を用いて測定（即ち検出、判定）が可能であり、このような方法の例をここで開示しておく。本発明によると、Ｄｉ３３たんぱく質は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ抗体を含め、体液中のあらゆる抗Ｄｉ３３抗体と免疫錯体を形成することができる。検出をするために好適な抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ抗体があるが、ＩｇＧ及びＩｇＥ抗体がより好ましい。抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出しようとするある実施例では、採取された体液を予処理して、アルブミンなど、体液中に存在するその他のイソタイプの免疫グロブリン及び／又はその他のたんぱく質の少なくともいくつかを除去しておく。このような除去法には、体液を例えばたんぱく質Ｇなどの物質に接触させてＩｇＧ抗体を除去したり、及び／又は、体液を例えばコンカナバリンＡに暴露することで身体のその他の成分からＩｇＥ抗体を親和性精製する方法が含まれるが、これらに限定されるものではない。免疫錯体は、以下の方法を含む、しかしそのうちの一つ又はそれ以上の利用に限らず、様々な方法で測定が可能である。即ち、酵素結合免疫検定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫検定法、ラテラル・フロー（原語：lateral flow）検定法、凝集反応検定法、微粒子を基にした検定法（例えば磁気粒子や、ラテックス・ビード又はポリスチレン・ビードなどの樹脂ポリマなど、微粒子を用いたもの）、免疫沈降検定法、及び免疫ブロット検定法（例えばウェスタン・ブロット法）である。このような検定法は当業者には公知である。検定法を用いれば、それらがどのように用いられるかに応じ、定性的結果又は定量的結果を出すことが可能である。凝集法、微粒子分離法及び免疫沈降法など、いくつかの検定法は、検出可能なマーカを必要とせずに（例えば肉眼や、濃度計又は分光光電光度計などの機械により）視覚的に観察することができる。その他の検定法では、検出可能なマーカを、検出しようとする抗体に選択的に結合するＤｉ３３たんぱく質又は組成物に（以下に詳述する）結合させると、免疫錯体形成を測定するのに役立つ。検出可能なマーカをＤｉ３３たんぱく質又はこの組成物のいずれかに結合させる際には、Ｄｉ３３たんぱく質又は組成物が、検出しようとする抗体に結合する能力を遮断しないような態様で結合させる。検出可能なマーカの例には、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、色素産生標識（例えば比色標識）、及びリガンド（例えばビオチン、アビジン、ストレプタビジン、及び関連する化合物など）が含まれるが、これらに限られるものではない。ある一つの実施例では、免疫錯体は、Ｄｉ３３たんぱく質に接触させた体液（即ち体液をＤｉ３３たんぱく質に接触させた結果のもの）を、以下の抗体イソタイプのうちの一つに選択的に結合する組成物に接触させることで測定される。即ち、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体又はＩｇＡ抗体のうちの一つである。このような組成物の例には、抗イソタイプ抗体である第二抗体（例えば抗ネコ免疫グロブリン抗体など、Ｄｉ３３に結合した宿主抗体の定常領域に選択的に結合する抗体）、抗体結合バクテリア表面たんぱく質（例えばたんぱく質Ａ又はたんぱく質Ｇ）、抗体結合細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、又はマクロファージ）、抗体結合真核細胞表面たんぱく質（例えばＦｃレセプタ）、及び抗体結合補体系たんぱく質などがあるが、これらに限定されることはない。好適な組成物には、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、Ｆｃ_γレセプタ分子、Ｆｃ_εレセプタ分子、Ｆｃμレセプタ分子、及びＦｃ_αレセプタ分子がある。ここで用いられる場合のＦｃレセプタ分子には、完全なＦｃレセプタだけではなく、抗体のＨ鎖定常領域に選択的に結合することのできるあらゆるそのサブユニット又は部分が含まれる。例えば、Ｆｃ_εレセプタ分子は完全なＦｃεレセプタ（細胞に結びついていても、細胞から分離されていてもよい）でも、又は、ＩｇＥ抗体のＨ鎖定常領域に選択的に結合することができれば、Ｆｃεレセプタα鎖又はＦｃεレセプタα鎖のいかなる部分でもよい。Ｄｉ３３たんぱく質に結合した、体液から得られた抗体の量は、第二抗体又はその他の結合化合物による一つ又はそれ以上の層及び／又は種類を利用して決定できることは、本発明の範囲内である。例えば、標識を付けていない第二抗体を、体液から得た抗Ｄｉ３３抗体に結合させておき、次にこの標識のない第二抗体を、標識の付いた第三抗体に結合させてもよい。ある実施例では、免疫錯体を溶液中で形成させ、かつ測定することができる。別の実施例では、抗Ｄｉ３３抗体に結合させるのに用いるＤｉ３３たんぱく質又は組成物のいずれかを基質上に固定（例えば被膜するなど）してもよい。固定技術は当業者には公知である。Ｄｉ３３たんぱく質又は一組成物をその上に固定するのに適した基質材料の例には、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース、ＰＶＤＦ（フッ化ビニリデン樹脂）及び磁気樹脂など、合成樹脂、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、及び微粒子材料があるが、これらに限定されるものではない。適した基質には、ウェル（例えばマイクロタイタ皿のウェル）、プレート、ディップスティック、ビード、ラテラル・フロー装置、膜、フィルタ、チューブ、シャーレ、セルロイド型マトリックス、磁気粒子、及びその他の微粒子があるが、これらに限らない。ある一つの実施例としては、微粒子などの基質に検出可能なマーカが含まれていてもよい。イヌ糸状虫感染を検出するのに好適な方法は免疫吸着検定法である。ある一つの実施例では、Ｄｉ３３たんぱく質をマイクロタイタ皿のウェル又はディップスティックなどの基質上に固定する。動物から採取した体液をこの基質に付着させ、免疫錯体が形成されるのに充分な条件下でインキュベートする。余分な体液があればこれを取り除き、Ｄｉ３３たんぱく質に結合した抗Ｄｉ３３抗体に選択的に結合できる組成物を、検出可能なマーカ（好ましくは酵素標識、比色標識、蛍光標識、放射性同位元素、又はビオチン又はアビジン系のリガンド）に結合させたものをこの基質に加えてインキュベートし、この組成物と免疫錯体との間で錯体を形成させる。余分な組成物を取り除き、必要に応じて現像主薬を加え、基質を検出装置にかけて分析する。あるいは選択に応じ、上述したような抗体結合組成物を基質上に固定し、体液をこの基質と共にインキュベートして免疫錯体を形成させる。こうしてマーカを結合させたＤｉ３３たんぱく質をこの免疫錯体に付着させると、免疫錯体の検出を行うことができる。イヌ糸状虫感染を検出するためのもう一つの好適な方法はラテラル・フロー検定法であるが、この方法の例がいくつか、プロノボスト氏らの１９９５年６月１３日発行の米国特許第５，４２４，１９３号、イムリッチ氏らの１９９５年５月１６日発行の米国特許第５，４１５，９９４号、ミラー氏らの１９９４年１２月２２日公開のＷＯ９４／２９６９６号、及びポーラク氏らによる１９９４年１月２０日公開のＷＯ９４／０１７７５号に開示されており、これらの特許公報をそれぞれ、全文を参考文献としてここに編入しておく。ある一つの実施例では、体液試料を、以下の成分を含んだラテラル・フロー装置に配する。即ち（ａ）流路を規定する支持構造、（ｂ）Ｄｉ３３たんぱく質に結合させたビードを含む標識試薬、この標識試薬は支持構造内の標識域に含浸させてある、（ｃ）抗体結合組成物を含む捕獲試薬、である。捕獲試薬は、標識試薬が標識域から捕獲域に流れられるよう、標識域に流体的に接続する捕獲域内の標識試薬下流に配置される。支持構造は、ビードが標識域から捕獲域に流れるのを妨げない物質を含む。このような物質の例には、ニトロセルロース及びＰＶＤＦがあるが、これらに限定されるものではない。支持構造は横方向の流路を規定するが、この流路は標識域及び捕獲域という、複数域に分割される。この装置には、さらに、流路に沿って配置される試料受容域が含まれていてもよいが、この試料受容域は好ましくは標識試薬の上流に配置されているとよい。支持構造内の流路は、好ましくは流路の終点にある、捕獲域下流の支持構造部分を、標識域及び捕獲域から余分な液体を吸収することのできる吸収剤に接触させることで作り出される。この実施例では、体液は、支持構造の一部を含む試料受容域に施される。標識域が試料受容域から試料を受け取ると、この試料は前記の流路により下流に向けられる。標識域は、抗Ｄｉ３３抗体に結合する標識試薬を含む。好適な標識試薬は、ラテックスのビードなどの樹脂製ビードの基質に直接又はリンカを介して結合させたＤｉ３３たんぱく質である。基質にはまた、検出可能なマーカ、好ましくは比色マーカが含まれる。典型的には、標識試薬を乾燥又は凍結乾燥により支持構造に含浸させる。試料構造はまた、標識域の下流に捕獲域を含む。捕獲域が標識域から標識試薬を受け取ると、この試薬は流路により下流に向けられる。捕獲域は上述したように、免疫錯体を含有する標識試薬（即ち標識試薬のＤｉ３３たんぱく質部分と錯体形成させた抗Ｄｉ３３）を捕獲域内に固定する捕獲試薬、この場合は抗体結合組成物を含有する。捕獲試薬は好ましくは乾燥又は凍結乾燥により支持構造に固定されているとよい。標識試薬は捕獲域内で蓄積するが、この蓄積を視覚的に又は光学的検出装置により評価する。別の実施例では、イヌ糸状虫感染を検出するために用いるラテラル・フロー装置には、（ａ）流路を規定する支持構造、（ｂ）上述したように抗体結合組成物を含んだ標識試薬、ただしこの標識試薬は支持構造内の標識域に含浸される、及び（ｃ）Ｄｉ３３たんぱく質を含む捕獲試薬、ただしこの捕獲試薬は、標識試薬が標識域から捕獲域に流れられるよう、標識域に流体的に接続する捕獲域内の標識試薬下流に配置される、が含まれる。この装置は好ましくは、流路に沿って配置される、好ましくは標識試薬の上流に配置される試料受容域をさらに含むとよい。この装置はまた、流路の終点に配置された吸収剤をさらに含むことが好ましい。本発明のもう一つの実施例は宿主動物においてイヌ糸状虫を検出する方法である。当該方法は、（ａ）その動物から採取された体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在するＤｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間の免疫錯体形成を測定するステップとを含む。このようなＤｉ３３たんぱく質：抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体の免疫錯体の存在は、その動物がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである。ここで用いられる場合の宿主動物とは、イヌ糸状虫感染の可能性のある、従って適合性又は非適合性の宿主（即ちそれぞれ、イヌ糸状虫が寄生関係を確立する又は確立しない動物）の両方を含むあらゆる動物を言う。宿主動物の例には、ネコ、イヌ、フェレットや、その他のイタチ科の仲間、アシカやその他のひれあし目の海洋ほ乳類、及びヒト並びにその他の霊長類を含め、しかしこれらに限らず、イヌ糸状虫に感染する可能性のあるあらゆる動物が含まれる。イヌという術語は、家イヌ、野生のイヌ、キツネ、オオカミ、ジャッカル、及びコヨーテを含む、しかしこれらに限らずあらゆるイヌ科の仲間を言うことに留意されたい。上述したように、ネコはいかなるネコ科の仲間でもよい。検査をするのに好適な動物には家ネコ、家イヌ、及びフェレットがある。免疫錯体の形成及び測定法は上述した通りであるが、抗体結合組成物はＩｇＥＨ鎖定常領域に結合するような組成物、例えば、しかしこれらに限らず、抗ＩｇＥ抗体及びＦｃ_εレセプタ分子、例えばＩｇＥＨ鎖定常領域に結合する完全なＦｃ_εレセプタ、Ｆｃ_εレセプタα鎖、又はＦｃ_εレセプタα鎖の一部分など、に限定される。抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体は上述したような試験管内技術により検出可能であるだけでなく、抗Ｄｉ３３抗体はさらに、例えば皮膚検査などの生体内技術によっても検出が可能である。ＩｇＥ抗体を検出するための生体内法は当業者には公知であるが、このような方法の例はフランク氏らによる１９９６年４月１８日公開のＰＣＴ特許公報ＷＯ９６／１１２７１号にも開示されており、この公報をその全文のまま、ここに参考文献として編入しておく。本発明のさらに別の実施例は、非適合性の宿主中のイヌ糸状虫を検出する方法であるが、当該方法は、（ａ）宿主から採取した体液を、分離された抗Ｄｉ３３抗体を含む製剤に、前記抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）体液中に存在するこの抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間の免疫錯体形成を測定するステップとを含む。このような免疫錯体の存在は、宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである。本発明による抗Ｄｉ３３抗体を、同抗体を生じさせる方法と共にここで開示する。免疫錯体を形成させる方法、及び、免疫錯体形成を測定する方法は、ここの他の場所で開示されたものと同様であるが、例外として、この場合に分離された抗体を用いて検出しようとするのは天然Ｄｉ３３たんぱく質である。当業者であれば、この実施例を実施する際には、開示された方法に調節を行うことができる。本発明はさらに、開示された検出方法の各々に基づいてイヌ糸状虫感染を検出するためのキットを含む。ある一つの実施例は、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質と、このＤｉ３３たんぱく質と免疫錯体を形成することのできる抗体を検出する組成物とを含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキットである。もう一つの実施例は、分離された抗Ｄｉ３３抗体と、抗Ｄｉ３３抗体及びイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質の間の免疫錯体を検出する組成物とを含むキットである。両方の実施例について、このような組成物の例をここで開示するが、このような組成物はＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体を検出することができるものである。好適なキットには、Ｄｉ３３たんぱく質又は抗Ｄｉ３３抗体がそれぞれ基質に固定されたものがある。キットにはさらに、イヌ糸状虫感染の一つ又はそれ以上の診断試薬が含まれていてもよく、この診断試薬の一方は分離されたＤｉ３３たんぱく質又は分離された抗Ｄｉ３３抗体であり、他方はここで開示するような、さらなる分離されたイヌ糸状虫抗原及び／又は抗体である。さらに、抗体結合組成物が基質に固定されたキットも好ましい。特に好適なのは、免疫吸着検定法又はラテラル・フロー検定法の形式で用いられるキットである。本発明はまた、本発明のＤｉ３３たんぱく質を作成する方法をも含む。本発明のＤｉ３３たんぱく質はイヌ糸状虫から分離されても、組換えにより作成されても、又は化学合成されてもよい。Ｄｉ３３たんぱく質を作成するためのある好適な方法は組換えＤｉ３３たんぱく質生成である。本発明の一実施例はＤｉ３３たんぱく質を作成する方法であり、当該方法は（ａ）Ｄｉ３３たんぱく質を発現する組換え細胞を培養してこのたんぱく質を生成させるステップと、（ｂ）このたんぱく質を回収するステップとを含む。このように、本発明は、本発明のＤｉ３３たんぱく質をコードしている分離されたＤｉ３３核酸分子と、このようなＤｉ３３核酸分子を含んだ組換え分子及び組換え細胞とを含む。分離されたＤｉ３３核酸分子とは、その天然ミリューから取り出された核酸分子を言う。従って、「分離された」及び「生物学的に純粋な」とは、必ずしも、その核酸分子が精製された程度を反映するものではない。本発明による分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子はその天然源から（即ちイヌ糸状虫から）得られても、組換えＤＮＡ技術を用いて作成されても、又は化学合成により作成されてもよい。分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子は、本発明のＤｉ３３たんぱく質をコードしているあらゆる分子である。Ｄｉ３３核酸分子の例には、ｎＤｉ３３₃₄₆、ｎＤｉ３３₇₅₀、ｎＤｉ３３₇₀₂、ｎＤｉ３３₇₀₈、及びｎＤｉ３３₆₅₁があるが、これらに限定されるものではなく、その作成法は実施例で開示する。本発明の一実施例には組換えベクタが含まれるが、この組換えベクタは、この核酸分子を宿主の細胞内に送達することのできるベクタに挿入された、本発明による分離された核酸分子を少なくとも一つ含むものである。このようなベクタは異種の核酸配列を含んでいるが、この異種の核酸配列は、天然では本発明の核酸分子に隣接して見られるものではないと共に、好ましくはその核酸分子の由来となった種以外の種を由来とするものであるとよい。ベクタはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、原核性でも真核性でもよいが、典型的にはウィルス又はプラスミドである。本発明のＤｉ３３核酸分子のクローン形成、配列決定、及び／又は操作には組換えベクタを用いることができる。ここでは組換え分子と呼ばれる、ある種類の組換えベクタは、発現ベクタに有効に（原語：operatively）連結させた本発明による核酸分子を含む。この「有効に（原語：operatively）連結させたという文言は、ある核酸分子を、宿主の細胞内に形質転換させたときにその細胞が発現可能であるような態様で発現ベクタへ挿入することを言う。ここで用いられる場合の発現ベクタは、宿主の細胞を形質転換させて特定の核酸分子を発現させることのできるＤＮＡ又はＲＮＡベクタである。好ましくは、この発現ベクタがさらに、宿主の細胞内で複製が行えるものであるとよい。発現ベクタは原核性又は真核性のいずれでもよいが、典型的にはウィルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクタには、バクテリア、真菌、寄生生物、昆虫、その他の動物、及び植物の細胞を含め、本発明の組換え細胞内で機能する（即ち遺伝子発現を命令する）あらゆるベクタが含まれる。本発明において好適な発現ベクタは、バクテリア、酵母、蠕虫又はその他の寄生虫、昆虫及びほ乳類の細胞内、より好ましくはバクテリア内で遺伝子発現を命令できるものである。具体的には、本発明の発現ベクタは、転写調節配列、翻訳調節配列、複製開始点、及びその他の調節配列など、組換え細胞と適合性があると共に本発明の核酸分子の発現を制御する調節配列を含む。具体的には、本発明の組換え分子には転写調節配列が含まれる。転写調節配列とは、転写の開始、延長、及び終了を制御する配列である。特に重要な転写調節配列は、プロモータ、エンハンサ、オペレータ、及びリプレッサ配列など、転写の開始を調節するものである。適した転写調節配列には、本発明の組換え細胞のうちの少なくとも一つで機能することのできるあらゆる転写調節配列が含まれる。様々なこのような転写調節配列が当業者には公知である。好適な転写調節配列には、バクテリア、酵母、蠕虫又はその他の寄生虫、昆虫及びほ乳類の細胞内で機能するものが含まれる。より好適な転写調節配列には、例えばtac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージラムダ（例えばラムダＰ_L及びラムダＰ_R並びに、このようなプロモータを含む融合株）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７lac、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、及び抗生物質耐性遺伝子転写調節配列などの、しかしこれらに限らず、バクテリア内で働くものが含まれる。本発明による組換えベクタ内に含めるのに適した及び好適な核酸分子をここに開示する。組換えベクタ、特に組換え分子に含めるのに好適な核酸分子には、ｎＤｉ３３₃₄₆、ｎＤｉ３３₇₅₀、ｎＤｉ３３₇₀₂、ｎＤｉ３３₇₀₈、及びｎＤｉ３３₆₅₁ がある。本発明にとって特に好適な組換え分子には、ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇ ₀₈ 及びｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁があるが、その作成法は実施例の章で述べることとする。本発明の組換え分子は、さらに（ａ）発現された本発明の寄生蠕虫たんぱく質を、このたんぱく質を生成する細胞が分泌できるようにする分泌シグナル（即ちシグナル部分の核酸分子）を含んでいる、及び／又は（ｂ）本発明の核酸分子を融合たんぱく質として発現させることにつながる融合配列を含んでいてもよい。適したシグナル部分の例には、本発明のあるたんぱく質の分泌を命令することのできるあらゆるシグナル部分が含まれる。本発明に用いるのに適した融合部分には、あるたんぱく質の安定性を高めることのできる、及び／又は、（例えば親和性クロマトグラフィによる）Ｄｉ３３たんぱく質の精製に役立てることのできる部分が含まれるが、これに限定されるものではない。適した融合部分は所望の機能（例えば安定性を増加させる、及び又は、あるたんぱく質の精製を容易にする）を有するいかなる大きさの一ドメインでもよい。融合部分はそのたんぱく質のＤｉ３３ドメインのアミノ及び／又はカルボキシル端に接合させてよく、またあるＤｉ３３たんぱく質を簡単に回収できるよう、切断しやすいものにしてもよい。融合たんぱく質は好ましくは、あるドメインのカルボキシル及び／又はアミノ端のいずれかに付着させた融合部分を含むあるたんぱく質をコードしている融合核酸分子で形質転換させた組換え細胞を培養することにより、作成するとよい。好適な融合部分には、金属結合ドメイン（例えばポリ−ヒスチジン部分）、免疫グロブリン結合ドメイン（例えばたんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃレセプタ又は補体系たんぱく質抗体結合ドメイン）、糖結合ドメイン（例えばマルトース結合ドメイン）、及び／又は「標識」ドメイン（例えばβガラクトシダーゼの少なくとも一部分、連鎖球菌標識ペプチドや、例えば単クローン抗体など、そのドメインに結合する化合物を用いて精製可能なその他のドメイン）が含まれる。より好適な融合部分は金属結合ドメインである。本発明において特に好適な融合たんぱく質の例にはＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄があるが、その生成法をここに開示する。本発明のもう別の実施例には、本発明による一つ又はそれ以上の組換え分子で形質転換させた宿主細胞を含む組換え細胞がある。ある細胞内への核酸分子の形質転換は、核酸分子を細胞内に挿入することができればいかなる方法でも達成が可能である。形質転換技術には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合があるが、これらに限定されるものではない。形質転換させた本発明の核酸分子は染色体外のままでも、又は、形質転換された（即ち組換え）細胞の染色体内の一つ又はそれ以上の部位にそれらの発現能力が維持されるような態様で組み込まれてもよい。ある細胞を形質転換させるのに好適な核酸分子には、ここで開示したようなＤｉ３３核酸分子が含まれる。ある細胞を形質転換させるのに特に好適な核酸分子にはｎＤｉ３３₃₄₆、ｎＤｉ３３₇₅₀、ｎＤｉ３３₇₀₂、ｎＤｉ３３₇₀₈、及びｎＤｉ３３₆₅₁がある。形質転換するのに適した宿主細胞には、本発明の核酸分子により形質転換することが可能なあらゆる細胞が含まれる。宿主の細胞は未形質転換の細胞でも、又は既に少なくとも一つの核酸分子で形質転換された細胞でもよい。本発明の宿主細胞は本発明の少なくとも一つのたんぱく質を生成することができればいかなる細胞でもよく、バクテリア、真菌（酵母を含む）、寄生生物（蠕虫、原虫及び外部寄生虫を含む）、その他の昆虫、その他の動物及び植物の細胞がこれに含まれる。好適な宿主細胞には、バクテリア細胞があるが、サルモネラ菌、エシェリキア菌、及びバチルス菌がより好ましく、大腸菌が特に好ましい。組換え細胞は、宿主細胞を、転写調節配列を含んだ発現ベクタに有効に連結された本発明のＤｉ３３核酸分子を含む組換え分子で形質転換させることで作成されると好ましい。有効に連結されたという文言は、ある核酸分子を、宿主細胞内に形質転換されたときにその分子が発現可能であるような態様で発現ベクタ内に挿入することを言う。特に好適な組換え分子にはｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈及びｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁がある。特に好適な組換え細胞には、大腸菌：ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇ ₀₈ 及び大腸菌：ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁が含まれる。これらの組換え細胞の作成法の詳細をここに開示しておく。組換えＤＮＡ技術を用いれば、例えば宿主内におけるその核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、その結果得られる写しが翻訳される効率、及び翻訳後の改変の効率などを操作することにより、形質転換させた核酸分子の発現を向上させることができる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術には、核酸分子を高コピー数のプラスミドに有効に連結すること、この核酸分子を一つ又はそれ以上の宿主細胞染色体に組み込むこと、ベクタの安定性配列をプラスミドに加えること、転写調節シグナル（例えばプロモータ、オペレータ、エンハンサ）の置換又は改変、翻訳調節シグナル（例えばリボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）の置換又は改変、宿主細胞のコドン利用に対応する本発明の核酸分子の改変、写しを不安定にする配列の削除、及び、発酵の間、組換え酵素生成から組換え細胞の成長を一時的に切り離す調節シグナルの利用があるが、これらに限られることはない。本発明による発現された組換えたんぱく質の活性は、このようなたんぱく質をコードしている核酸分子をフラグメント化する、改変する、又は誘導することにより、向上するかも知れない。本発明の分離されたＤｉ３３たんぱく質は、ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄及びＰＤｉ３３₂₁₇を含め、しかしこれらに限らず、様々な方法で作成が可能であるが、その中には天然たんぱく質の生成及び回収、組換えたんぱく質の生成及び回収、及びこのたんぱく質の化学合成がある。ある実施例では、本発明の分離されたたんぱく質は、そのたんぱく質を発現可能な細胞を、そのたんぱく質を生成するのに効果的な条件下で培養し、同たんぱく質を回収することで作成される。培養するのに適した細胞は本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件には、たんぱく質生成が可能な効果的な培地、バイオリアクタ、温度、ｐＨ及び酸素条件が含まれるが、これらに限定されるものではない。効果的な培地とは、細胞が培養されると、本発明のＤｉ３３たんぱく質が生成されるようなあらゆる培地を言う。このような培地は典型的には、同化可能な炭素、窒素及びリン酸塩の源を有する水性培地や、適した塩、鉱物、金属及びその他の栄養素、例えばビタミンを含むものである。本発明の細胞は通常の発酵バイオリアクタ、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイタ皿、及びペトリ皿内で培養してよい。培養は組換え細胞にとって適切な温度、ｐＨ、及び酸素含有量で行ってよい。このような培養条件は当業者の知見の範囲にある。適した条件の例は実施例の章に含まれている。生成に用いたベクタ及び宿主系に応じ、その結果得られる本発明のたんぱく質は組換え細胞内に留められても、発酵培地に分泌されても、大腸菌のペリプラスム間隙などの二つの細胞膜間の間隙に分泌されても、又は細胞の外表面又はウィルス膜上に留められてもよい。「たんぱく質を回収する」という文言や同様の文言は、たんぱく質を含有する発酵培地全体を採取することを言い、必ずしも分離又は精製するためのさらなるステップを意味するものではない。本発明のたんぱく質は、例えば、しかしこれらに限らず、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、濾過、電気泳動法、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、コンカナバリンＡクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング及び吸収率較差法など、様々な標準的たんぱく質精製技術を用いて精製することができる。本発明のたんぱく質は好ましくは「概ね純粋な」形で取り出されるとよい。ここで用いられる場合の「概ね純粋な」とは、検出試薬としてそのたんぱく質を効果的に用いることのできる純度を言う。本発明のある一つの実施例はＤｉ３３たんぱく質を精製するための方法であり、同方法は（ａ）イヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子で形質転換させたバクテリアを培養してイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質含有培養株を作成するステップと、（ｂ）Ｄｉ３３たんぱく質を含む不溶性の物質（光屈折小体であると考えられる）をこの培養株から回収するステップと、（ｃ）この不溶性の物質からＤｉ３３たんぱく質を精製するステップとを含む。精製ステップは好ましくは、（ａ）不溶性の物質を破砕してＤｉ３３たんぱく質を含む溶液を形成するステップと、（ｂ）この溶液に陽イオン交換クロマトグラフィを行うステップと、（ｃ）Ｄｉ３３たんぱく質を回収するステップとを含むとよい。このような方法を用いると、少なくとも約８０％純粋な、そして好ましくは約９０％純粋なたんぱく質が得られる。この回収されたたんぱく質にさらに疎水性相互作用クロマトグラフィを行ってからこのたんぱく質を回収すると、その結果得られるたんぱく質は少なくとも約９５％純粋、そして好ましくは少なくとも約９９％純粋となる。本発明はさらに、これらの方法に基づいて精製されたたんぱく質を含むものである。これらの方法の詳細は実施例で述べることとする。これらの方法に基づいて精製するのに好適なたんぱく質はＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄である。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄は、例えば８Ｍの尿素又は１５０ｍＭのソルビトールを除く大半の溶液中で大変低い可溶性を有する。従って、精製プロトコルの開発は大変難しく、結果得られたプロトコルも明白なものではなかった。尿素は疎水性環境にある成分ではないために、疎水性相互作用クロマトグラフィを達成できたことは特に驚くべきことであった。以下の実施例は実例を挙げることを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとしては意図されてはいない。実施例実施例１本実施例は、本発明のｎＤｉ３３核酸分子のクローン形成及び配列決定を説くものである。本実施例には、当業者に公知と考えられる数多くの分子生物学、微生物学、免疫学、生化学、及び検定技術が含まれていることに留意されたい。このような技術の開示は、例えば上述したSambrook et al.の文献及び関連する文献に見ることができる。 Onchocerca volvulusＯｖ３３（例えばLucius et al.1988,J.Exp.Med.168,119 9-1204を参照されたい）及びAcanthocheilonema viteaeＡｖ３３（例えば Willenbucher et al,1993,Mol.Biochem Parasitol.57，349-351を参照されたい）のコドン領域の核酸配列を比較することで設計されたプライマを用いて成虫のオス及びメスのイヌ糸状虫Ｄｉ３３のｃＤＮＡライブラリをＰＣＲ増幅することで、イヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子を分離した。設計されたプライマは、核酸配列５‘ＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＩＧＴＩＧＴＩＧＡＴＡＡＴＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＣ３’（ここでは配列同定番号第８番と呼ぶ）を有するＤｉ３３−Ｓと、核酸配列５‘ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＩＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴ３’（ここでは配列同定番号第９番と呼ぶ）を有するＤｉ３３−Ａであった。この約４０５塩基対のＰＣＲ生成物に対し、核酸配列分析を行った。分析の結果、ここではｎＤｉ３３₃₄₆ と呼ばれるこのＰＣＲ生成物は大きさが約３４６塩基対であり、ここでは配列同定番号第１番と呼ばれる核酸配列を有するコドン鎖を有することが示された。核酸分子ｎＤｉ３３₃₄₆に³²Ｐ混合−ヘキサマーの標識をし、これを用いて緊縮交雑条件によりイヌ糸状虫の成虫メスｃＤＮＡライブラリを（例えば上述した Sambrook et al.の文献に開示されたように）プローブした。１４の陽性プラークをＰＣＲ分析して全長コドン領域を見かけ上含むものを判別した。見かけ上全長コドン領域を含有する核酸分子の核酸配列決定の結果、配列同定番号第２番を得た。配列同定番号第２番のコドン鎖及びその相補鎖（当業者であればその配列は容易に判定される）を有する核酸分子をここではｎＤｉ３３₇₅₀と表す。配列同定番号第２番はＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号Ｕ３１４５０番を有する。配列同定番号第２番の翻訳の結果、核酸分子ｎＤｉ３３₇₅₀は、配列同定番号第３番で表される、ここではＰＤｉ３３₂₃₄と呼ばれる、約２３４のアミノ酸から成る全長イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質をコードしていることが分かるが、このとき、開放読み取り枠の開始（スタート）コドンは配列同定番号第２番の約ヌクレオチド２４から約ヌクレオチド２６にあり、終了（停止）コドンは配列同定番号第２番の約ヌクレオチド７２６から約ヌクレオチド７２８にあるものと想定している。ＰＤｉ３３₂₃₄をコードしている、停止コドンを除くコドン領域は、ここでは配列同定番号第４番で核酸配列が表されるコドン鎖を有する核酸分子ｎＤｉ３３₇₀₂により表される。配列同定番号第４番は約１７のアミノ酸から成るシグナルペプチドと、ここではＰＤｉ３３₂₁₇で表される、約２１７のアミノ酸から成る見かけ上の成熟たんぱく質とをコードしていると思われるが、この見かけ上の成熟たんぱく質のアミノ酸配列をここでは配列同定番号第７番で表す。この見かけ上の成熟たんぱく質をコードしている核酸分子をｎＤｉ３３₆₅₁と呼ぶこととするが、そのコドン鎖の核酸配列をここでは配列同定番号第６番で表す。推定されたアミノ酸配列、配列同定番号第３番は、分子量が約２６．４キロダルトン、そして推定ｐＩが約８．５５のたんぱく質であることを示す。配列同定番号第３番は、O.volvulusＯｖ３３のアミノ酸配列に対して約８２％同一であると共にA．viteaeＡｖ３３のアミノ酸配列に対して約７５％同一である。配列同定番号第４番はO.volvulusＯｖ３３のコドン領域の核酸配列に対して約８１％同一であると共にA．viteaeＡｖ３３のコドン領域の核酸配列に対して約７８％同一である。実施例２本実施例は本発明による組換え分子及び組換え細胞の作成を開示するものである。ラムダファージ転写調節配列と、ポリ−ヒスチジン部分をコードする融合配列とに有効に連結させたイヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子を含有する組換え分子ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈を以下の方法で作成した。ここではｎＤｉ３３₇₀₈と表される、配列同定番号第１番の約２４から約７３１までのヌクレオチドを含有する約７０８のヌクレオチドＤＮＡフラグメント（そのコドン鎖の核酸配列はここでは配列同定番号第５番と表される）を、実施例１で述べたように作成された核酸分子ｎＤｉ３３₇₅₀から、プライマＤｉ３３-sen５‘ＧＡＡＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＧ３’（ここでは配列同定番号第１０番と表す、太字はBamHＩ部位）と、プライマＤｉ３３-ant５‘ＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧ３’（ここでは配列同定番号第１１番と表す、太字はEcoRＩ部位）とを用いてＰＣＲ増幅した。組換え分子ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈は、ｎＤｉ３３₇₀₈を含有するＰＣＲ生成物をBamHI及びEcoRI制限エンドヌクレアーゼで分解し、その結果生じたフラグメントをゲル精製し、これを、BamHI及びEcoRIで切断された発現ベクタλＰＲcro ／Ｔ２ori／ＲＳＥＴ−Ｂ中に定方向的にサブクローン形成し、ゲル精製することで作成された。発現ベクタλＰＲcro／Ｔ２ori／ＲＳＥＴ−Ｂは以下のヌクレオチド部分を含む。アンピリシン耐性遺伝子及び大腸菌の複製を含むｐＵＣ１９から得た約１９９０塩基対のPvuIIからAatIIフラグメント；（ｃＩ^tsをコードしている遺伝子、プロモータＰ_R、及びcroたんぱく質の２２個のアミノ酸をコードしている配列を含む）ラムダ転写調節領域を含むｐＲＫ２４８clts（メリーランド州、ロックビル、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション社から入手可能）から得た約１０００塩基対のPvuIIからBgIIIまでのフラグメント；Ｔ７プロモータを含むｐＧＥＭＥＸ−１（ウィスコンシン州、マジソン、プロメガ社から入手可能）から得た約６０塩基対のBgillからXbalまでのフラグメント；Ｔ７− Ｓ１０翻訳エンハンサ、His6融合、１４アミノ酸Ｓ１０リーダ融合、及びエンテロキナーゼ切断部位並びに複数のクローニング部位をコードした配列を含むｐＲＳＥＴ−Ｂ（カリフオルニア州、サンディエゴ、インビトロゲン社から入手可能）から得た約１６６塩基対のXbalからEcoRIまでのフラグメント；及び、三つの読み取り枠すべてのＴ₁翻訳終了暗号を含む合成翻訳及び転写終了シグナルと、B acillus thurengiensis結晶たんぱく質から得たＲＮＡ安定化配列と、_trpAオペロンから得たＴ２rho−独立転写終了暗号とを含んだ約２１０塩基対のEcoRIから AatlIまでのフラグメント。組換え分子ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈を、上述したSambrook et al.が開示したような標準的枝術を用いて大腸菌内に形質転換させて組換え細胞Ecoli：ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈を形成させた。実施例３本実施例は、本発明のＤｉ３３たんぱく質の原核細胞内での生成と抗Ｄｉ３３抗体の生成とを開示するものである。実施例２で説明したように作成した組換え細胞Ecoli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀ ₈ を、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び１％のグルコースを含有する濃縮されたバクテリア成長培地を容れた振盪フラスコ内で約３２℃で培養した。細胞が約０．６のＯＤ₆₀₀に達した時点で、温度を素早く４２℃まで調節し、細胞培養を約２時間続行することでイヌ糸状虫ｎＤｉ３３₇₀₈の発現を誘導した。たんぱく質生成を、組換え細胞の溶解産物のＳＤＳＰＡＧＥ、続いて標準的技術を用いた免疫ブロット分析法により観察した。組換え細胞Ecoli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈は、ここでＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄と表される融合たんぱく質を生成し、この融合たんぱく質は約３５キロダルトンの見かけ上の分子量で移動した。組換え細胞Ecoli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈の溶解産物の免疫ブロット分析の結果、この約３５キロダルトンのたんぱく質は、組換えＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃ ₄ 融合たんぱく質の融合部分に向けられたＴ７標識単クローン抗体（ウィスコンシン州、マジソン、ノバゲン社から入手可能）に結合することができることが示された。ニッケル・キレーション・クロマトグラフィ及びｐＨ勾配により、大腸菌たんぱく質からＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄ヒスチジン融合たんぱく質を分離した。たんぱく質の精製を、ＳＤＳＰＡＧＥ、続いてカラム溶出液留分のクーマシー・ブルー染色により観察した。Ecoli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈の溶解産物、カラム溶出液、及びカラムのボイド容量の免疫ブロット分析の結果、ニッケルカラムクロマトグラフィを用いて分離されたこのＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄の３５キロダルトンのたんぱく質はＴ７標識単クローン抗体に選択的に結合可能であることが示された。キレーション・クロマトグラフィで精製されたＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄でウサギを４回、免疫処置した。このウサギから採取された抗血清を抗ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄抗血清で表した。実施例４本実施例では、原核細胞から組換えＤｉ３３たんぱく質を生成させることを述べる。実施例２で説明したように作成した組換え細胞Ecoli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅ ₁ を実施例３で説明したのと同じような方法で培養した。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂ ₃₄ たんぱく質を含有する、見かけ上光屈折小体である不溶性の物質を以下のようにして得た。細胞ペレットを標準的技術（例えば遠心分離）を用いて培養株から得た。このペレットを緩衝液Ａ（５０ミリモル（ｍＭ）のリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨは５．７５）中に再懸濁させて、もとの細胞ペーストのグラム（ｇ）重量の１０倍のミリリットル（ｍｌ）最終液量にして均質な懸濁液を得た。懸濁液中の細胞を、リゾチーム処理（最終濃度は１ｍｌ容量当り約０．２ミリグラム（ｍｇ）のリゾチーム）して音波破砕するか、又はマイクロ流動化（例えば動的フレンチプレスを用いるなどして）することにより、破砕した。その結果得られた溶解産物を遠心分離により（例えばソーバル（原語：Sorval）３Ｂ遠心分離器、ＧＳＡロータ、で２０Ｋ×ｇ、２５℃で３０分間など、清澄させた。その結果得られたペレットは不溶性の物質を含んでいた。この不溶性の物質を含んだペレットを以下のように洗剤を含有する溶液中で二回、洗浄した。ペレットを緩衝液Ｂ（５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨは５．７５、に１％のトリトンＸ−１００及び１％のデオキシコール酸塩を加えたもの）中で緩衝液Ａで用いた容量に等しい容量で再懸濁させた。均質な懸濁液を得るまで混合した後、この懸濁液を上述したように遠心分離してペレットを回収した。５Ｍの尿素でペレットを分画抽出して洗剤を除くと、汚染物質は可溶化したがＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄は可溶化しなかった。この混合液を遠心分離してペレットを回収した。不溶性の物質は以下のような溶液を含んでいた。回収されたペレットを緩衝液Ｄ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨは５．７５）中で緩衝液Ａに用いたのと等しい容量で再懸濁させた。ジチオスレイトールを最終濃度１０ｍＭまで加えた。均質な懸濁液になるまで混合した後、懸濁液を遠心分離して清澄させた。緩衝液Ｄで抽出した上澄み液（即ちＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質を含有する溶液）を採取してそのｐＨをｐＨ５．７５±０．２５に、必要に応じてリン酸又は水酸化ナトリウムを用いて調節した。陽イオン交換クロマトグラフィにより、このＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質含有溶液からＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質を回収、又は精製した。ある実施例ではこの溶液を、緩衝液Ｄで予め平衡させたＳＰセファロースカラムに施した。このカラムを、（ａ）緩衝液Ｄ、（ｂ）緩衝液Ｄから１５％緩衝液Ｅ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのリン酸塩、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨは５．７５）までの勾配、及び（ｃ）１５％緩衝液Ｅ／Ｄ（即ち１５％の緩衝液Ｅ／８５％の緩衝液Ｄ）で順に洗浄した。５０％の緩衝液Ｅ／ＤでこのカラムからＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃ ₄ たんぱく質を溶出させた。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄含有溶出液を限外濾過により濃縮し、１００％の緩衝液Ｄに調節した。あるいは選択に応じ、この溶出液を１５０ｍＭのソルビトールに調節し、限外濾過により濃縮し、多段階の５０％希釈段階により、緩衝液Ｇ（５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５０Ｍのソルビトール）にゆっくりと緩衝液交換した。いずれの方法でも、回収されたＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質は少なくとも約８０％の純度であった。即ち、およそ１グラムのＤｉ３３たんぱく質が、約１０リットルの培養培地から得られたことになる。この標本は少なくとも診断試薬として用いるには充分純粋である。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄をさらに精製するために、ＳＰセファロースカラムから回収したＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄に疎水性相互作用クロマトグラフィを行った。ＳＰセファロースカラムからのこのＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄溶出液を限外濾過により濃縮して緩衝液Ｆ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．７５ＭのＮＨ₄ＳＯ₄、ｐＨは５．７５）に緩衝液交換するか、又は緩衝液Ｆｘ（８Ｍの尿素、５０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ＭのＮＨ₄ＳＯ₄、ｐＨは５．７５）でゆっくりと希釈（１：１）した後、緩衝液Ｆで予め平衡させたブチルセファロースカラムに施した。試料を施した後、このカラムを（ａ）緩衝液Ｆ、（ｂ）１５％緩衝液Ｄへの逆勾配、及び（ｃ）１５％の緩衝液Ｄ／Ｆで順に洗浄した。５０％の緩衝液Ｄ／ＦでこのカラムからＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質を溶出させた。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄含有溶出液を限外濾過により濃縮し、緩衝液Ｄへ緩衝液交換した。回収されたＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄たんぱく質は少なくとも約９５％純粋であり、ゲル分析では９９％を越える純度があるように見られた。ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄の可溶性が、例えば８Ｍの尿素又は１５０ｍＭのソルビトールを除く大半の溶液中で大変低いことに注目されたい。従って、精製プロトコルの開発は大変難しく、また結果として得られたプロトコルも明白なものではない。尿素は疎水性環境にある成分ではないため、疎水性相互作用クロマトグラフィを行えることは、特に驚くべきことであった。実施例５本実施例は、本発明によるもう一つの組換え分子、組換え細胞及び組換えたんぱく質の作成法を説くものである。ラムダファージ転写調節配列に有効に連結させたイヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子を含有する組換え分子ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁を以下の方法で作成した。ここではｎＤｉ３３₆₅₁と表される、配列同定番号第１番の約７５から約７２５までのヌクレオチドを含有する約６５１のヌクレオチドＤＮＡフラグメント（そのコドン鎖の核酸配列はここでは配列同定番号第６番と表される）を、実施例１で述べたように作成された核酸分子ｎＤｉ３３₇₅₀から、適切な発現ベクタ内にクローン形成するのに適切な制限エンドヌクレアーゼ部位を含んだ適切なプライマを用いてＰＣＲ増幅する。適切な制限エンドヌクレアーゼでこのｎＤｉ３３６５１を含有するＰＣＲ生成物を分解し、その結果得られたフラグメントをゲル精製し、このフラグメントを、ｎＤｉ３３₆₅₁が転写調節配列に有効に連結されるよう、λＰＲcro／Ｔ２ori／ＲＳＥＴ−Ｂにあるものと同様なラムダ転写調節配列を含む、適切に制限された発現ベクタ内に定方向的にサブクローン形成することで、組換え分子ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁を作成する。上述のSambrook et al.が開示した標準的な技術を用い、組換え分子ｐλＰＲ −ｎＤｉ３３₆₅₁を大腸菌内に形質転換させ、組換え細胞E.coli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁を形成させる。組換え細胞E.coli:ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁を実施例３で述べたように発現させ、また実施例４に述べたものなどの方法を用いて精製することで、ここでＰＤｉ３３₂₁₇と呼ぶ見かけ上成熟したイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を生成させることができる。実施例６本実施例は、Ｄｉ３３が感染後８週という早期にネコの糸状虫感染を検出することができることを説明するものである。ＥＬＩＳＡを以下のように行った。マイクロタイタ皿のウェルに、ＣＢＣ緩衝液（５０ｍＭの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨは９．６）１ｍｌ当り約１００μ ｌの１００ｎｇのＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄を各ウェルで一晩、約４℃でインキュベートすることで、実施例４で説明したように作成したＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄ で被膜した。ウェル内に残った溶液を廃棄し、このウェルを、０．０５％のT een−２０、ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）と一緒の１０ｍＭのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。約１００μｌの１：５０に希釈されたネコ血清試料（ＰＢＳＴで希釈されたもの）を各ウェルに加えた。各血清試料を二対又は三対のウェルに施した。陽性及び陰性対照試料もこの検定の比較対照を設けるために施した。Ｄｉ３３で被膜したウェル中でこれら試料を３０分間、室温でインキュベートした後、ウェル内に残った溶液を廃棄した。ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ネコ抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体のＤｉ３３への結合を検出するために、約１００μ ｌの１：５０００に希釈されたヤギ抗ネコＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）：ＨＲＰ（即ち西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ネコＩｇＧＨ鎖及びＬ鎖；メリーランド州、ガイザーズバーグ、カークガード＆ペリー・ラブズ社（ＫＰＬ）から入手可能、カタログ番号１４−２０−２６番）（ＰＢＳＴで希釈されたもの）を各ウェルに加え、３０分間室温でインキュベートした。ウェル内に残った溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。約２００μｌのＴＭＢ（３，３‘５’５ ‘テトラメチルベンジジン）ミクロウェル・ペルオキシダーゼ・基質システム（ＫＰＬ社から入手可能；カタログ番号５０−７６−０４番）を各ウェルに加えて５分間、室温でインキュベートした。約５０μｌの２．５Ｎ硫酸を各ウェルに加えた。自動ＥＬＩＳＡ読み取り器により４５０ｎｍ（Ａ［４５０ｎｍ］）で吸収度を調べた。一番目の研究では、１１匹のネコのそれぞれに４０匹のイヌ糸状虫の第三段階幼虫（Ｌ３）を０日目に感染させた。感染後２７、５５、８３、１１１、１３９及び１６７日目に各ネコから血清を採取した。実施例３及び４で説明したように作成された組換えイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、採取された血清中で抗Ｄｉ３３抗体を検出できるかを、ＥＬＩＳＡで測定した。ネコを部検して各ネコの心臓にいる成虫の数を調べた。１１匹のネコから採取した血清を経時的に評価したＥＬＩＳＡの結果を表１及び図１に示す。表１ではさらに、部検で各ネコの心臓に見つかった蠕虫の数を示す。表１．イヌ糸状虫Ｌ３に感染したネコ二番目の研究では、１２匹のネコのそれぞれに１００匹のイヌ糸状虫の第三段階幼虫（Ｌ３）を０日目に感染させた。感染より６日前と、感染後１、２９、５７、９３、１０２、１１７、及び１４５日目に各ネコから血清を採取した。実施例３及び４で説明したように作成された組換えイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、採取された血清中で抗Ｄｉ３３抗体を検出できるかを、ＥＬＩＳＡで測定した。ネコを部検して各ネコの心臓にいる成虫の数を調べた。１２匹のネコから採取した血清を経時的に評価したＥＬＩＳＡの結果を表２及び図２に示す。表２ではさらに、部検で各ネコの心臓に見つかった蠕虫の数を示す。表２．イヌ糸状虫Ｌ３に感染したネコこれらの研究の結果は、抗Ｄｉ３３ＩｇＧ抗体が、感染後８週という早い時期に、そして１０から１２週では高濃度で、イヌ糸状虫ネコから検出可能であることを示すものである。この結果はさらに、抗Ｄｉ３３抗体は、イヌ糸状虫が成虫へと成長している段階の動物や、成虫の糸状虫を宿している動物でも検出可能であることを示している。実施例７本実施例は、一匹のオス又はメスの蠕虫に感染したネコにおいて糸状虫感染を検出するＰＤｉ３３の能力を実証するものである。一番目の研究では、１０匹のネコのそれぞれを蚊に噛ませてイヌ糸状虫を感染させた。感染前０日目、そして感染後約２、４及び６カ月目にネコのそれぞれから血清を採取した。実施例３及び４で説明したように作成された組換えイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、採取された血清中で抗Ｄｉ３３抗体を検出できるかを、実施例６で述べたようにＥＬＩＳＡで測定した。この研究では、吸収度は１ｍｌ単位の吸収度単位（ＡｂＵ／ｍｌ）で出した。ＡｂＵ／ｍｌは、標準曲線に対して表にしたデータ点の二次多項式回帰分析によるＡ［４５０ｎｍ］から得られている。この場合、カットオフ値は約４ＡｂＵ／ｍｌと約６ＡｂＵ／ｍｌとの間である。ネコを部検して各ネコの心臓にいる成虫の数を調べた。１０匹のネコから採取した血清を経時的に評価したＥＬＩＳＡの結果を表３に示すが、この表ではさらに、部検で各ネコの心臓に見つかった蠕虫の数も示す。表３．蚊の吸血により糸状虫に感染したネコ二番目の研究では、その寿命の何らかの段階でイヌ糸状虫に自然に感染したことのある８匹のネコのそれぞれから血清を採取した。実施例３及び４で説明したように作成された組換えイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、採取された血清中で抗Ｄｉ３３抗体を検出できるかを、実施例６で述べたようにＥＬＩＳＡで測定し、吸収度は１ｍｌ単位の吸収度単位（ＡｂＵ／ｍｌ）で出した。ネコを部検して各ネコの心臓にいる成虫の数を調べた。８匹のネコから採取した血清を評価したＥＬＩＳＡの結果を表４に示すが、この表ではさらに、各ネコの心臓に見つかった蠕虫の数も示す。表４．自然感染したネコこれらの結果は、Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、自然感染した又は蚊にかまれて感染したネコのイヌ糸状虫感染を検出できるだけでなく、イヌ糸状虫感染の結果一匹の蠕虫のみが成熟するようなネコの感染も検出できることを示すものである。さらに、メスの蠕虫の感染しか検出できない血中抗原検査（例えば上述した米国特許第４，８３９，２７５号を参照されたい）とは違って、このＤｉ３３を基にした検定では一匹のオスの蠕虫を検出することが可能である。実施例８本実施例は、糸状虫感染を認識する上でのＤｉ３３の特異性を実証するものである。具体的には、Ｄｉ３３は、それぞれネコの胃腸管に感染する寄生生物であるTaenia taeniaeformis、Toxocara cati及びAncylostoma tubaeformeと交差反応しない。 T taeniaeformis、T cati及びA tubaeformeに感染した５匹のネコのそれぞれから、感染前０日及び感染後約３、４、７及び１０週目に血清を採取した。実施例３及び４で説明したように作成された組換えイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を用いて、T taeniaeformis、T cati及び／又はA tubaeformeの感染を検出できるかを、実施例６で述べたようにＥＬＩＳＡで測定し、吸収度をＡｂＵ／ｍｌで出した。これら５匹のネコから採取した血清を経時的に評価したＥＬＩＳＡの結果を表５に示す。その結果は、組換えＤｉ３３たんぱく質が、ネコがT.taeniaefor mis、T cati及びA tubaeformeに感染したときに生する抗体とは交差反応しないことを実証するものである。表５．その他の胃腸管寄生虫に感染したネコ実施例９本実施例は、イヌ糸状虫感染が、ネコ及びイヌの抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体の生成を刺激することを実証するものである。本実施例はさらに、ＰＤｉ３３により、抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出することによりネコ及びイヌの糸状虫感染を検出することが可能であることも示す。ＥＬＩＳＡを以下のように行った。イムロンＩＩプレート（ヴァージニア州、チャンティリー、ダイナテック社から入手可能）のマイクロタイタ皿ウェルに、一晩かけて４℃で１ウェル当り約１μｇの実施例４で説明したように作成したＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄か、又は１ウェル当り約１μｇのＨＷＡｇのいずれかの被膜を施したが、このＨＷＡｇとは、ＰＢＳ中に均質にした成虫の糸状虫の、成長した上澄み液である糸状虫抗原のプレパラートである。この被膜形成は、ウェルに対し、１ｍｌのＣＢＣ緩衝液（５０ｍＭの炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨは９．６）当り約１００μｌの１０μｇＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄か、又は１ｍｌのＣＢＣ緩衝液当り約１００μｌの１０μｇＨＷＡｇを加えることで行った。ウェル内に残った溶液を廃棄し、ＰＢＳＴでウェルを４回洗浄した。約１００μｌの１：１０に希釈したネコ又はイヌ血清（０．２５％のＢＳＡと共にＰＢＳＴ中に希釈）を各ウェルに加えた。各血清試料を二対のウェルに施した。陽性及び陰性対照試料もこの検定の比較対照を設けるために施した。Ｄｉ３３又はＨＷＡｇで被膜したウェル中でこれら試料を１時間、室温でインキュベートした後、ウェル内に残った溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ネコ又はイヌＩｇＥ抗体のＤｉ３３又はＨＷＡｇへの結合を検出するために、０．２５％のＢＳＡと共にＰＢＳＴ中に希釈した、約１００μｌの１：４０００に希釈されたビオチニル化Ｆｃ_εレセプタアルファ鎖（例えばレーダー氏らによる、１９９０年１０月９日に発行された米国特許第４，９６２，０３５号を参照されたい）を各ウェルに加え（１ウェル当り約１ｎｇのたんぱく質）、１時間、室温でインキュベートした。ウェル内に残った溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。０．２５％のＢＳＡと共にＰＢＳＴ中に１：４０００に希釈したストレプタビジン−ペルオキシダーゼ錯体溶液（ＫＰＬ社から入手可能；カタログ番号１４−３０−００番）を約１００μｌ、各ウェルに加えて（１ウェル当り約０．１２５μ ｇ）室温で１時間インキュベートした。ウェル内に残った溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ基質（ＫＰＬ社から入手可能、カタログ番号０−７６−０４番）を１０分間加え、停止溶液（ＫＰＬ社から入手可能）を加えた。自動ＥＬＩＳＡ読み取り器により４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を調べた。以下の血清を抗Ｄｉ３３抗体又は抗ＨＷＡｇＩｇＥ抗体の存在についてＥＬＩＳＡで調べた。糸状虫感染前９０日のネコＡＸＨ３から採取した血清（出血前ネコＡＸＨ３血清）及び糸状虫感染後１６８日のネコから採取した血清（ＨＷネコＡＸＨ３血清）；糸状虫感染前９０日のネコＭＧＣ２から採取した血清（出血前ネコＭＧＣ２血清）及び糸状虫感染後１６８日のネコから採取した血清（ＨＷネコＭＧＣ２血清）：及び少なくとも２００日間糸状虫に感染した６匹のイヌからプールされた血清（ＨＷイヌ・プール）。図３は、糸状虫感染後に採取された血清のみが検出可能なレベルの抗Ｄｉ３３又は抗ＨＷＡｇＩｇＥ抗体を有していたことを示すものである。このような抗体はイヌ糸状虫に感染したイヌだけでなくネコにも見られた。さらにこのＤｉ３３プレパラートはＩｇＥ抗体を検出する上でＨＷＡｇプレパラートよりも感受性が高いように思われる。検出されている抗体がＩｇＥ抗体（例えばＩｇＧ又はＩｇＡ抗体ではなくて）であったことをさらに実証するために、（ａ）糸状虫に感染したネコからプールした血清、（ｂ）糸状虫に感染したイヌからプールした血清、又は（ｃ）糸状虫に感染したネコＭＧＣ２から得た血清の当量の血清試料を、ＥＬＩＳＡ前４時間５６℃に加熱するか、又はＥＬＩＳＡ前に加熱せずにおいたが、このとき実験のＥＬＩＳＡプレートは上述したようにＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄で予め被膜した。(ＩｇＥとそのレセプタとの間の結合は非耐熱性である、即ちＦｃ_εレセプタは熱処理されたＩｇＥに結合しないことに留意されたい)図４はこの結合反応の非耐熱性を示しており、Ｄｉ３３を用いれば、抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体を検出することにより動物のイヌ糸状虫感染を検出することができることをここでも実証している。配列表以下の配列表を３７ＣＦＲ§１．８２１に則り提出する。コンピュータで読み取り可能な形式の写しもここに提出する。出願人は、３７ＣＦＲ§１．８２１（ｆ）に則り、ここに提出された本書類と配列同定番号第１番から配列同定番号第１１番までのコンピュータ読み取り可能な写しとが同じ内容であることを申請するものである。（配列表）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/569 Ａ 33/569 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モンデザイアロイアール. アメリカ合衆国 80301 コロラド州ボルダー、パインハーストコート 5343 (72)発明者ポータージェームズピー. アメリカ合衆国 80526 コロラド州フォートコリンズ、サウスオーバーヒルドライブ 5016 (72)発明者ウィスネウスキーナンシーアメリカ合衆国 80526 コロラド州フォートコリンズ、ビーバークリークドライブ 4219

Claims

【特許請求の範囲】１．非適合性宿主内のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）前記宿主から採取された体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）前記体液中に存在する前記Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３抗体との間の免疫錯体形成を測定するステップであって、前記免疫錯体の存在は、前記宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、ステップとを含む方法。２．前記方法が、前記イヌ糸状虫が成虫糸状虫へ成熟する前の前記宿主中のイヌ糸状虫を検出する、請求項１に記載の方法。３．前記方法が、前記宿主がイヌ糸状虫に感染してから少なくとも約１０週以内に前記宿主中のイヌ糸状虫を検出する、請求項１に記載の方法。４．前記方法が、成虫糸状虫を宿している非適合性宿主のイヌ糸状虫感染を検出する、請求項１に記載の方法。５．前記方法が、一匹の成虫糸状虫の成熟に至るイヌ糸状虫感染を検出する、請求項１に記載の方法。６．前記方法が、一匹の成虫オス糸状虫の成熟に至るイヌ糸状虫感染を検出する、請求項１に記載の方法。７．前記方法が、一匹の成虫メス糸状虫の成熟に至るイヌ糸状虫感染を検出する、請求項１に記載の方法。８．前記免疫鉗体中の前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ抗体のうちのいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。９．前記免疫錯体中の前記抗体がＩｇＥ抗体である、請求項１に記載の方法。１０．前記宿主がネコ及びフェレットのうちのいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。１１．前記ネコが家ネコである、請求項１０に記載の方法。１２．前記免疫錯体が、前記Ｄｉ３３たんぱく質に接触させた体液を、ＩｇＧ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、及びＩｇＡ抗体のうちのいずれかから選択されるある一つの抗体に選択的に結合する組成物に接触させることで測定される、請求項１に記載の方法。１３．前記組成物が、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、Ｆｃ_γレセプタ分子、Ｆｃ_εレセプタ分子、Ｆｃ_μレセプタ分子、及びＦｃ_αレセプタ分子のいずれかから選択される、請求項１２に記載の方法。１４．前記組成物が検出可能なマーカに結合される、請求項１２に記載の方法。１５．前記検出可能なマーカが酵素標識、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、色素産生標識、及びリガンドのいずれかから選択される、請求項１４に記載の方法。１６．前記組成物が基質上に固定される、請求項１２に記載の方法。１７．前記基質が、合成樹脂、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、及び微粒子材料のうちのいずれかから選択される材料を含む、請求項１６に記載の方法。１８．前記基質が、ウェル、プレート、ディップスティック、ビード、ラテラル・フロー装置、膜、フィルタ、試験管、皿、セルロイド型のマトリックス、及び磁気粒子のうちのいずれかから選択される、請求項１６に記載の方法。１９．前記Ｄｉ３３たんぱく質が基質上に固定される、請求項１に記載の方法。２０．前記基質が、合成樹脂、ガラス、ゲル、セルロイド、紙及び微粒子材料のうちのいずれかから選択される材料を含む、請求項１９に記載の方法。２１．前記基質が、ウェル、プレート、ディップスティック、ビード、ラテラル・フロー装置、膜、フィルタ、試験管、皿、セルロイド型のマトリックス、及び磁気粒子のうちのいずれかから選択される、請求項１９に記載の方法。２２．前記基質が検出可能なマーカをさらに含む、請求項１９に記載の方法。２３．前記基質が検出可能なマーカに結合される、請求項１９に記載の方法。２４．前記免疫錯体が溶液中で形成する、請求項１に記載の方法。２５．前記測定するステップが、酵素結合免疫検定法、放射免疫検定法、蛍光免疫検定法、ラテラル・フロー検定法、凝集反応検定法、微粒子を基にした検定法、免疫沈降検定法、及び免疫ブロット検定法のうちのいずれかから選択される検定法を含む、請求項１に記載の方法。２６．前記Ｄｉ３３たんぱく質が検出可能なマーカに結合される、請求項１に記載の方法。２７．前記体液が、血液、血清、血漿、尿、涙液、唾液、リンバ液、鼻分泌液、及び糞のうちのいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。２８．前記製剤が担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。２９．前記製剤が前記Ｄｉ３３たんぱく質以外のイヌ糸状虫抗原をさらに含む、請求項１に記載の方法。３０．前記製剤が、イヌ糸状虫抗原に対して生じた抗体をさらに含む、請求項１に記載の方法。３１．前記イヌ糸状虫抗原が血中寄生虫抗原を含む、請求項１に記載の方法。３２．宿主動物のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）前記動物から採取された体液を、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を含む製剤に、Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）前記体液中に存在する前記Ｄｉ３３たんぱく質と抗Ｄｉ３３ＩｇＥ抗体との間の免疫錯体形成を測定するステップであって、前記免疫錯体の存在は、前記動物がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、ステップとを含む方法。３３．前記動物がネコ、イヌ及びフェレットのうちのいずれかから選択される、請求項３２に記載の方法。３４．前記方法が、前記動物がイヌ糸状虫に感染してから少なくとも約１０週以内に前記動物のイヌ糸状虫を検出する、請求項３２に記載の方法。３５．前記方法が、一匹の成虫糸状虫の成熟に至るイヌ糸状虫感染を検出する、請求項３２に記載の方法。３６．前記成虫糸状虫がオスである、請求項３５に記載の方法。３７．前記成虫糸状虫がメスである、請求項３５に記載の方法。３８．非適合性宿主のイヌ糸状虫感染を感染後１０週以内で検出する方法であって、前記宿主から採取された体液中で抗Ｄｉ３３抗体を検出するステップを含む、方法。３９．前記方法が、一匹の成虫糸状虫の成熟に至るイヌ糸状虫感染を検出する、請求項３８に記載の方法。４０．前記成虫糸状虫がオスである、請求項３９に記載の方法。４１．前記成虫糸状虫がメスである、請求項３９に記載の方法。４２．分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質と、前記Ｄｉ３３たんぱく質と免疫錯体を形成することのできる抗体を検出する組成物とを含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。４３．前記抗体がＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、及びＩｇＡ抗体のうちのいずれかから選択される、請求項４２に記載のキット。４４．前記Ｄｉ３３たんぱく質を上に固定することのできる基質をさらに含む、請求項４２に記載のキット。４５．前記Ｄｉ３３たんぱく質が基質上に固定される、請求項４２に記載のキット。４６．前記組成物を上に固定することのできる基質をさらに含む、請求項４２に記載のキット。４７．前記組成物が基質上に固定される、請求項４２に記載のキット。４８．前記組成物が、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体、Ｆｃ_γレセプタ分子、Ｆｃ_εレセプタ分子、Ｆｃ_μレセプタ分子、及びＦｃ_αレセプタ分子のうちのいずれかから選択される、請求項４２に記載のキット。４９．（ａ）流路を規定する支持構造と、（ｂ）前記Ｄｉ３３たんぱく質に結合されたビードを含む標識試薬であって、該支持構造の標識域内に含浸される、標識試薬と、（ｃ）前記組成物を含む捕獲試薬であって、前記標識試薬が前記標識域から捕獲域に流れられるような態様で、前記標識域に流体的に接続する、前記標識試薬の下流にある前記捕獲域内に配置される、捕獲試薬とを含む装置をさらに含む、請求項４２に記載のキット。５０．前記装置が、前記流路に沿って配置される試料受容域をさらに含む、請求項４９に記載のキット。５１．前記試料受容域が前記標識試薬の上流に配置される、請求項５０に記載のキット。５２．前記装置が、前記流路の末端に配置された吸収剤をさらに含む、請求項４９に記載のキット。５３．前記支持構造が、前記ビードが前記標識域から前記捕獲域に流れることを妨げない物質を含む、請求項４９に記載のキット。５４．前記ビードがラテックス・ビードを含む、請求項４９に記載のキット。５５．前記ビードが検出可能なマーカを含む、請求項４９に記載のキット。５６．前記Ｄｉ３３たんぱく質が検出可能なマーカに結合される、請求項４９に記載のキット。５７．（ａ）流路を規定する支持構造と、（ｂ）前記組成物を含む標識試薬であって、該支持構造の標識域内に含浸される、標識試薬と、（ｃ）前記Ｄｉ３３たんぱく質を含む捕獲試薬であって、前記標識試薬が前記標識域から前記捕獲域に流れられるような態様で、前記標識域に流体的に接続する、前記標識試薬の下流にある前記捕獲域内に配置される、捕獲試薬とを含む装置をさらに含む、請求項４２に記載のキット。５８．前記装置が、前記流路に沿って配置される試料受容域をさらに含む、請求項５７に記載のキット。５９．前記試料受容域が前記標識試薬の上流に配置される、請求項５８に記載のキット。６０．前記キットが前記Ｄｉ３３たんぱく質以外のイヌ糸状虫抗原をさらに含む、請求項４２に記載のキット。６１．分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を作成する方法であって、（ａ）イヌ糸状虫Ｄｉ３３核酸分子で形質転換させたバクテリアを培養してイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質含有培養株を作成するステップと、（ｂ）前記培養株から前記Ｄｉ３３たんぱく質を含む不溶性の物質を回収するステップと、（ｃ）前記不溶性の物質から前記Ｄｉ３３たんぱく質を精製するステップとを含む方法。６２．前記精製するステップが、（ａ）ステップ（ｂ）の不溶性の物質を破砕してＤｉ３３たんぱく質を含む溶液を形成させるステップと、（ｂ）前記溶液に陽イオン交換クロマトグラフィを行うステップと、（ｃ）前記Ｄｉ３３たんぱく質を回収するステップとを含む、請求項６１に記載の方法。６３．前記精製するステップが、（ａ）ステップ（ｂ）の不溶性の物質を破砕してＤｉ３３たんぱく質を含む溶液を形成させるステップと、（ｂ）前記溶液に陽イオン交換クロマトグラフィを行ってＤｉ３３たんぱく質含有留分を得るステップと、（ｃ）前記留分に疎水性相互作用クロマトグラフィを行うステップと、（ｄ）前記Ｄｉ３３たんぱく質を回収するステップとを含む、請求項６１に記載の方法。６４．請求項６１の方法により作成された、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質。６５．イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を生成する組換え細胞の培養株から得た破砕された不溶性の物質の陽イオン交換クロマトグラフィからＤｉ３３たんぱく質を回収するステップを含む、イヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を精製するための方法。６６．請求項６５の方法により作成された、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質。６７．ＰＨＩＳ−ＰＤｉ３３₂₃₄及びＰＤｉ３３₂₁₇のうちのいずれかから選択されるたんぱく質。６８．ｎＤｉ３３₃₄₆、ｎＤｉ３３₇₅₀、ｎＤｉ３３₇₀₂、ｎＤｉ３３₇₀₈、及びｎＤｉ３３₆₅₁のうちのいずれかから選択される核酸分子。６９．請求項６８の核酸分子を含む組換え分子。７０．請求項６９の組換え分子であって、ｐλＰＲ−ｎＤｉ３３₇₀₈及びｐλ ＰＲ−ｎＤｉ３３₆₅₁のうちのいずれかから選択される、組換え分子。７１．請求項６８の核酸分子を含む組換え細胞。７２．請求項６８の核酸分子を含む組換え細胞を培養するステップと、前記たんぱく質を回収するステップとを含む、分離されたイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質を作成するための方法。７３．非適合性宿主内のイヌ糸状虫を検出する方法であって、（ａ）前記宿主から採取された体液を、分離された抗Ｄｉ３３抗体を含む製剤に、前記抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間に免疫錯体が形成されるのに充分な条件下で接触させるステップと、（ｂ）前記体液中の前記抗Ｄｉ３３抗体とイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質との間の免疫錯体形成を測定するステップであって、前記免疫錯体の存在は、前記宿主がイヌ糸状虫に感染している又は最近感染したことの指標となるものである、ステップとを含む方法。７４．分離された抗Ｄｉ３３抗体と、前記抗Ｄｉ３３抗体及びイヌ糸状虫Ｄｉ３３たんぱく質の間の免疫錯体を検出するための組成物とを含む、イヌ糸状虫感染を検出するためのキット。