BRPI0708017A2 - produto medicamentoso, processo para a sua produção e kit que compreende um frasco para proporcionar esse produto medicamentoso - Google Patents
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Abstract
PRODUTO MEDICAMENTOSO, PROCESSO PARA A SUA PRODUçãO E KIT QUE COMPREENDE UM FRASCO PARA PROPORCIONAR ESSE PRODUTO MEDICAMENTOSO. Expõe-se um produto medicamentoso que compreende uma combinação de colagenase I e colagenase II altamente purificados a partir de Colostridium histolyticum. O produto medicamentoso inclui colagenase 1 e colagenase II em uma proporção de cerca de 1 para 1, com uma pureza maior do que pelo menos 95%. A invenção expõe ainda processos de fermentação e purificação aperfeiçoados para o preparo do dito produto medicamentoso.
Description
PRODUTO MEDICAMENTOSO, PROCESSO PARA A SÜA PRODUÇÃO EKIT QUE COMPREENDE UM FRASCO PARA PROPORCIONAR ESSEPRODUTO MEDICAMENTOSO
Pedidos Relacionados
Este pedido reivindica o benefício do pe-dido provisório U.;S. No. 60/763.470 depositado em 30 dejaneiro de 2006 e pedido provisório U.S. No.60/784.135, depositado em 20 de março de 2006. A tota-lidade dos ensinamentos dos pedidos anteriormente cita-dos ficam incorporados neste contexto por referência.
Antecedentes da Invenção
O colagênio é o constituinte estruturalprincipal dos organismos mamíferos e constitui uma am-pla parte do teor de proteínas total da pele e de ou-tras partes do corpo animal. Em seres humanos, ele éparticularmente importante no processa de cura de feri-mentos e no processo de envelhecimento natural. Váriostraumas da pele, tais como queimaduras, cirurgia, in-fecção e acidentes são freqüentemente caracterizadospelo acúmulo errático de tecido fibroso rico em colagê-nio e tendo conteúdo proteoglicânico aumentado. Adi-cionalmente à substituição do tecido normal que foi da-nificado ou destruído, depósitos excessivos e desfigu-ráveis de tecido novo formam-se por vezes durante oprocesso de cura. A deposição excessiva de colagêniotem sido atribuída a uma perturbação no equilíbrio en-tre a síntese de colagênio e a degradação de colagênio.Niimerosas enfermidades e condições estãoassociadas com a deposição excessiva de colagênio e oacúmulo errático de tecido fibroso rico em colagênio.
Essas enfermidades e condições são chamadas coletiva-mente neste contexto de "enfermidades mediadas por co-lagênio". A colagenase tem sido usada para tratar umavariedade de enfermidades mediadas por colagênio. Acolagenase é uma enzima que tem a capacidade específicade digerir colagênio.
A colagenase para o uso em terapia podeser obtida a partir de uma variedade de fontes, inclu-indo mamíferos (por exemplo, seres humanos), crustáceos(por exemplo, caranguejo, camarão), fungos, e bactérias(por exemplo, a partir da fermentação de Clostridium,Streptomyces, Pseudomonas, ou Vibrio). A colagenasetambém tem sido manejada geneticamente. Uma fonte co-mum de colagenase bruta é proveniente de um processo defermentação bacteriana, especificamente a fermentaçãode C. histolyticum (C .his). A colagenase bruta obtidaa partir de C. his pode ser purificada utilizando-sequalquer uma de um número de técnicas cromatográficas.
Um inconveniente do processo de fermenta-ção a partir de C. his é que ele produz relações inde-finidas das várias colagenases, tais como colagenase Ie colagenase II, freqüentemente usadas nas composiçõesterapêuticas para tratar condições mediadas por colagê-nio. Além disso, a cultura tem requerido historicamen-te o uso de produtos de carne. Esta cultura de carnefoi originalmente derivada da variedade H4 de Clostri-dium histolyticum, Dr. I. Mandl1S laboratory na Colum-bia University em 1956, e depositada com a ATCC. Fras-cos liofilizados foram preparados com a cultura de car-ne cozinhada e chamados de grupo de células principaisABC Clostridium histolyticum.
Várias proporções de colagenase I para co-lagenase II em um preparado de colagenase terapêuticotêm efeitos biológicos diferentes. Conseqüentemente,seria desejável um preparado de colagenase terapêuticoem que a relação de colagenase I para colagenase II nopreparado pudesse ser determinada e controlada de ma-neira fácil e eficiente, para se obter atividade de en-zima e efeito terapêutico superior e sistemático.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona uma compo-sição de colagenase que compreende uma combinação decolagenase I e colagenase II altamente purificadas.Preferentemente, a colagenase I e colagenase II encon-tram-se presentes numa relação, em massa, de cerca de a1 para 1. Quando usada como uma composição farmacêuti-ca para o tratamento de enfermidades mediadas por cola-gênio, a composição da invenção proporciona efeito te-rapêutico aperfeiçoado e sistemático, ao mesmo tempo emque diminui o potencial para efeitos colaterais.
A invenção proporciona ainda métodos parapreparar uma composição de colagenase da invenção, com-posições farmacêuticas que compreendem uma composiçãoda invenção e métodos para tratar pacientes que padecemde lima enfermidade mediada por colagênio utilizando-selima composição de colagenase da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos
Os objetivos, aspectos e vantagens prece-dentes e outros da invenção serão evidentes a partir dadescrição mais específica seguinte de concretizaçõespreferidas da invenção, conforme ilustradas nos dese-nhos anexos em que caracteres de referência iguais sereferem às mesmas partes através das diferentes vistas.
Os desenhos não estão necessariamente em escala, sendoque em vez disso se dá ênfase à ilustração dos princí-pios da invenção.
A Figura 1 ilustra curvas de crescimento(OD contra tempo) de C. histolyticum em fermentações de5L DCFT24a,b.
A Figura 2 ilustra curvas de crescimentolíquido (0D líquido contra tempo) de C. histolyticum emfermentações de 5L DCFT24a,b.
A Figura 3 é um gel de 8% Tris-glicina SDSPAGE proveniente da segunda fermentação:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular
Faixa 2: Colagenase I - 0,27pg
Faixa 3: Colagenase II - 0,29pg
Faixa 4: 20h (6,12μ1 de amostra) - Ponto de colheita
Faixa 5: 19h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 6: 17h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 7: 16h (6,12μ1 de amostra)Faixa 8: 15h (6,12μl de amostra)
Faixa 9: 14h (6,12μl de amostra)
Faixa 10: 13h (6,12μl de amostra)
Faixa 11: 11,6h - 19h (6,12μl de amostra)
Faixa 12: 10,5h (6,12μl de amostra);
A Figura 4 é um gel de 8% Tris-glicina SDSPAGE proveniente da primeira fermentação:
<table>table see original document page 6</column></row><table> A Figura 5 é um gel semi-quantitativo de SDS PAGE para a segunda fermentação, amostra de ponto de colheita :
Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular
Faixa 2: 0,87 μl de amostra (1/7 diluição de amostrade fermentação)
Faixa 3: 1,22 μl de amostra (1/5 diluição de amostrade fermentação)Faixa 4: 1,53μ1 de amostra (1/4 diluição de amostrade fermentação)
Faixa 5: 2,04μ1 de amostra (1/3 diluição de amostrade fermentação)
Faixa 6: 0, 27μg colagenase IFaixa 7 : 0, 18μg colagenase IFaixa 8: 0, 135μg colagenase IFaixa 9 : 0, 29μg colagenase IIFaixa 10 : 0, 193μg colagenase IIFaixa 11: 0, 145μg colagenase II;
A Figura 6 representa a estratégia de fermen-tação usada para DCFT26a e DCFT26b;
A Figura 7 ilustra curvas de crescimento (ODcontra tempo) de C. histolyticum em fermentações de 5LDCFT26a,b;
A Figura 8 ilustra curvas de crescimento lí-quido (0D líquido contra tempo) de C. histolyticum em 5Lfermentações de DCFT26a,b;
A Figura 9 é um gel SDS PAGE para DCFT26a:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular
Faixa 2: Colagenase I - 0,67pg
Faixa 3: Colagenase II - 0,72pg
Faixa 4: 2Oh (6,12μ1 de amostra) - Ponto de colheita
Faixa 5: 19h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 6: 18h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 7: 17h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 8: 16h (6,12μ1 de amostra)
Faixa 9: 14h (6,12μ1 de amostra)Faixa 10: 13h (6,12μ1 de amostra) Faixa 11: Ilh (6,12μ1 de amostra); A Figura 10 é iam gel SDS PAGE para DCFT26b: Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular Faixa 2 : 20h (6,12μ1 de amostra) - Ponto de colheita Faixa 3 : 19h (6,12μ1 de amostra) Faixa 4 : 18h (6,12μ1 de amostra) Faixa 5 : 17h (6,12μ1 de amostra) Faixa 6 : 16h (6,12μL de amostra) Faixa 7: 15h (6,12μ1 de amostra) Faixa 8 : 14h (6,12μ1 de amostra) Faixa 9 : Ilh (6,12μ1 de amostra) Faixa 11: Colagenase I 0,67μg Faixa 12 : Colagenase II - 0;72μg;
A Figura 11 é um gel semi-quantitativo SDS PAGE para DCFT26a, ponto de colheita amostra: Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular Faixa 2 : 0í27μg colagenase I Faixa 3 : 0/18μg colagenase I Faixa 4 : 0í135μg colagenase I Faixa 5 : 0,29μg colagenase II Faixa 6 : 0,193μg colagenase II Faixa 7 : 0,145μg colagenase II Faixa 8: 0,87μ1 de amostra (1/7 diluição de araos- tra de fermentação) Faixa 9: 1,22μ1 de amostra (1/5 diluição de amos- tra de fermentação)Faixa 10: 1,53μ1 de amostra (1/4 diluição de amostrade fermentação)
Faixa 11: 2,04μ1 de amostra (1/3 diluição de amostrade fermentação);
A Figura 12 é um gel Semi-quantitativo SDSPAGE para DCFT26b, ponto de colheita de amostra:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0,27pg colagenase IFaixa 3: 0,18pg colagenase IFaixa 4: 0,135pg colagenase IFaixa 5: 0,29pg colagenase IIFaixa 6: 0,193pg colagenase IIFaixa 7: 0,145pg colagenase IIFaixa 8: 2,04μ1 de amostra (1/3 diluição de amostrade fermentação)Faixa 9: 1,53μ1 de amostra (1/4 diluição de amostrade fermentação)
Faixa 10: 1,22μ1 de amostra (1/5 diluição de amos-tra de fermentação)
Faixa 11: 0,87μ1 de amostra (1/7 diluição de amos-tra de fermentação);
A Figura 13 é um gel SDS PAGE para amostrasde precipitado de sulfato de amônio pós-dialisado (100g/le 150 g/l), DCFT26a, ponto de colheita amostra:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0,67μg de colagenase I e 0,72μg de colage-nase IIFaixa 3 : 0,27 u.g de colagenase I e 0,29pg de colage-nase
Faixa 4 : 6,12 u.l de amostra sobrenadante a partir de SC11 Faixa 5 : amostra após diálise - 100g/l AS (Puro)
Faixa 6 : amostra após diálise - 100g/l AS (1/5)
Faixa 7: amostra após diálise - 100g/l AS (1/10)
Faixa 8: amostra após diálise - 150g/l AS (puro)
Faixa 9: amostra após diálise - 150g/l AS (1/5)
Faixa 10: amostra após diálise - 150g/l AS (1/10)
A Figura 14 é um gel SDS PAGE para amostrasprecipitadas de sulfato de amônio pós-dialisado (200g/l e250 g/l), DCFT26a, ponto de colheita:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular
Faixa 2: 0,67 u.g colagenase I e 0,72pg colagenase II
Faixa 3: 0,27 u.g colagenase I e 0,29pg colagenase II
Faixa 4: 6,12 μl de amostra sobrenadante a partir deSC11
Faixa 5: amostra após diálise - 200g/l AS (liquida)
Faixa 6: amostra após diálise - 200g/l AS (1/5)
Faixa 7: amostra após diálise - 200g/l AS (1/10)
Faixa 8: amostra após diálise - 250g/l AS (Líquida)
Faixa 9: amostra após diálise - 250g/l AS (1/5)
Faixa 10: amostra após diálise - 250g/l AS (1/10);
A Figura 15 é um gel SDS PAGE para amostrasprecipitadas de sulfato de amônio após diálises (300g/l e400 g/l), DCFT26a, ponto de colheita:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0,67pg colagenase I e 0,72pg colagenase IIFaixa 3: 0,27pg colagenase I e 0,29pg colagenase IIFaixa 4: 6,12μ1 de amostra sobrenadante a partir deSCll
Faixa 5: amostra após diálise - 300g/l AS (amostralíquida)
Faixa 6: amostra após diálise - 300g/l AS (1/5 diluição)
Faixa 7: amostra após diálise - 300g/l AS (1/10 diluição)
Faixa 8: amostra após diálise - 400g/l AS (Líquida)Faixa 9: amostra após diálise - 4000g/l AS (1/5 diluição)
Faixa 10: amostra após diálise - 400g/l AS (1/10 diluição);
A Figura 16 ilustra a Curvas de crescimento(OD contra tempo e OD líquido contra tempo) de C. histoly-ticum em fermentação de PBFT57;
A Figura 17 é um gel semi-quantitativo de SDSPAGE, ponto de colheita de amostra:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0,27pg colagenase IFaixa 3: 0,18pg colagenase IFaixa 4: 0,135pg colagenase IFaixa 5: 0,29pg colagenase II
Faixa 6: 0f193pg colagenase IIFaixa 7: 0,145pg colagenase IIFaixa 8: 2,04μ1 de amostra (1/3 diluição de amostrade colheita de fermentação)
Faixa 9: 1,53μ1 de amostra (1/4 diluição de amostrade colheita de fermentação)
Faixa 10: 1,22μ1 de amostra (1/5 diluição de amos-tra de colheita de fermentação)
Faixa 11: 0,87μ1 de amostra (1/7 diluição de amos-tra de colheita de fermentação);
A Figura 18a é um gel de SDS PAGE quantitati-vo para amostra de 500ml após diálise a partir da fermen-tação PBFT57, ponto de colheita amostra. 400g/l de sulfatoamônio adicionado: Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2 : 0,272μg colagenase I e 0,286μg colagenase IIFaixa 3 : 0,18^g colagenase I e 0,190μg colagenase IIFaixa 4 : 0,136μg colagenase I e 0,142μg colagenase IIFaixa 5: 0,109μg colagenase I e 0,114μg colagenase IIFaixa 6 : amostra após diálise - 400g/l AS (1/15 diluição) Faixa 7: amostra após diálise - 400g/l AS (1/20 diluição) Faixa 8 : amostra após diálise - 400g/l AS (1/25 diluição)Faixa 9: amostra após diálise - 4 00g/l AS (1/3 0 diluição)Faixa 10: amostra após diálise - 400g/l AS (1/35 diluição)Faixa 11: Marcador de Alto Peso Molecular;A Figura 18b é uma SDS PAGE dos sobrenadantesdepois de centrifugação das amostras precipitadas de sul-fato de amônio:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0í27μg Col I e 0,29 μg Col IIFaixa 3: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (400g/l adição lenta)Faixa 4: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (400g/l adição rápida)Faixa 5: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (440g/l adição lenta)Faixa 6: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (480g/l adição lenta)Faixa 7: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (520g/l adição lenta)Faixa 8: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (400g/l, pH 6)Faixa 9: Sobrenadante (puro) de amostra pós precipi-tada de sulfato de amônio (400g/l, oxigenada);
A Figura 19 é um gel de SDS PAGE semi-quantitativo ilustrando amostras diluídas a partir do pon-to de colheita sobrenadante e da amostra precipitada porsulfato de amonio após diálise (com 400g/l - adição rápida):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: Amostra de fermentação - colheita (puro)Faixa 3: Amostra de fermentação - colheita (l/l di-luição)Faixa 4: Amostra de fermentação - colheita (1/2 di-luição)
Faixa 5: Amostra de fermentação - colheita (1/3 di-luição)
Faixa 6: Amostra de fermentação - colheita (1/4 di-luição)
Faixa 7: Amostra após diálise - colheita (1/17,54diluição) corresponde à faixa 1
Faixa 8: Amostra após diálise - colheita (1/35,08diluição) corresponde à faixa 2
Faixa 9: Amostra após diálise - colheita (1/52,62diluição) corresponde à faixa 3
Faixa 10: Amostra após diálise - colheita (1/70,16diluição) corresponde à faixa 4
Faixa 11: Amostra após diálise - colheita (1/87,70diluição) corresponde à faixa 5;
A Figura 20 é um gel semi-quantitativo SDSPAGE para PBFT57 que ilustra amostras diluídas a partir doponto de colheita sobrenadante e da amostra precipitadapor sulfato de amônio após diálise (com 520g/l):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: Amostra de fermentação - colheita (puro)Faixa 3: Amostra de fermentação - colheita (l/l di-luição)
Faixa 4: Amostra de fermentação - colheita (1/2 di-luição)
Faixa 5: Amostra de fermentação - colheita (1/3 di-luição)Faixa 6: Amostra de fermentação - colheita (1/4 di-luição)
Faixa 7: Amostra após diálise - colheita (1/15,63)corresponde à faixa 1
Faixa 8: Amostra após diálise - colheita (1/31,26)corresponde à faixa 2
Faixa 9: Amostra após diálise - colheita (1/46,89)corresponde à faixa 3
Faixa 10: Amostra após diálise - colheita (1/62,52)corresponde à faixa 4
Faixa 11: Amostra após diálise - colheita (1/78,15)corresponde à faixa 5;
A Figura 21 ilustra curvas de crescimento (ODlíquido contra tempo) de C. histolyticum variedades 004 e013 em fermentações de PBFT58c,d;
A Figura 22 é um gel SDS PAGE para PBFT58c(Variedade 004):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: Colagenase I - l,00pgFaixa 3: Colagenase I - 0,67μgFaixa 4: Colagenase II - l,08pgFaixa 5: Colagenase II - 0,72pgFaixa 6: 16,25h (6,12μ1 de amostra)Faixa 7: 17h (6,12μ1 de amostra)Faixa 8: 18h (6,12μ1 de amostra)Faixa 9: 19h (6,12μ1 de amostra)Faixa 10: 20,5h (6,12μ1 de amostra);A Figura 23 é um gel SDS PAGE para PBFT58d(Variedade 013):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso Molecular Faixa 2 : Colagenase I 1,00μgFaixa 3 : Colagenase I 0,67μgFaixa 4 : Colagenase II - 1,08μgFaixa 5 : Colagenase II - 0,72μgFaixa 6 : 16,25h (6,12μ1 de amostra)Faixa 7: 17h (6,12μ1 de amostra)Faixa 8 : 18h (6,12μ1 de amostra)Faixa 9: 19h (6,12μ1 de amostra)Faixa 10 : 20,5h (6,12μ1 de amostra).
A Figura 24 é um gel semi-quantitativo SDSPAGE PBFT58C (variedade 004), ponto de colheita de amostra:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2 : 0,27μg colagenase I e 0,29μg colagenase IIFaixa 3 : 0,18μg colagenase I e 0,19μg colagenase IIFaixa 4 : II 0,135μg colagenase I e 0,145μg colagenaseFaixa 5 : II 0,108μg colagenase I e 0,116μg colagenaseFaixa 6 : 6,12μ1 de amostra Faixa 7: 3,06μ1 de amostra Faixa 8: 2,04μ1 de amostra Faixa 9: 1,53μ1 de amostra Faixa 10: 1,22μ1 de amostra.A Figura 25 é um gel semi-quantitativo SDSPAGE para PBFT58d (variedade 013), ponto de colheita deamostra:
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2 : 0,27pg colagenase I e 0f29μg colagenase IIFaixa 3 : 0,18pg colagenase I e 0,19μg colagenase IIFaixa 4 : 0,135pg colagenase I e 0,145μg colagenase II Faixa 5: 0.108pg colagenase I e 0,116μg colagenase II Faixa 6 : 6,12μ1 de amostra Faixa 7 : 3,06μ1 de amostra Faixa 8: 2,04μ1 de amostra Faixa 9: 1,53μ1 de amostra Faixa 10 : 1,22μ1 de amostra;
A Figura 26 é um gel SDS PAGE para amostra deponto de colheita após diálise (520g/l sulfato de amônio)de fermentação de PBFT58C (variedade 004):
<table>table see original document page 17</column></row><table>Faixa 7: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/5 diluição)
Faixa 8: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/10 diluição)
Faixa 9: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/15 diluição)
Faixa 10: amostra de ponto de colheita após diálise- (1/20 diluição);
A Figura 27 é um gel de SDS PAGE para amostrade ponto de colheita após diálise (4 00g/l sulfato de amô-nio) de fermentação de PBFT58d (variedade 013):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 0,27pg colagenase I e 0,29pg colagenase IIFaixa 3: 0,18pg colagenase I e 0,19μg colagenase IIFaixa 4: 0,135pg colagenase I e 0,145pg colagenase IIFaixa 5: 0,108pg colagenase I e 0f116pg colagenase IIFaixa 6: amostra de ponto de colheita após diálise -Puro
Faixa 7: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/5 diluição)
Faixa 8: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/10 diluição)
Faixa 9: amostra de ponto de colheita após diálise -(1/15 diluição)
Faixa 10: amostra de ponto de colheita após diálise- (1/20 diluição);A Figura 28 ilustra um fluxograma do procedi-mento experimental usado para peneiramento das peptonasvegetais alternativas.
A Figura 29 ilustra uma estratégia de alimen-tação por lote para fermentações de DCFT27a,b.
A Figura 3 0 ilustra curvas de crescimento (ODlíquido contra tempo) de C. histolyticum em 5L DCFT27a eDCFT27b fermentações de alimentação por lote.
A Figura 31 ilustra curvas de crescimento (ODlíquido contra tempo) de C. histolyticum in 5L PBFT59a,b,cfermentações de alimentação por lote.
A Figura 32 ilustra uma curva de crescimento(OD líquido contra tempo) de C. histolyticum em 5L DCFT27dfermentação de alimentação por lote.
A Figura 33a é um gel de SDS PAGE paraDCFT27d (Fitona suplementado com aminoácidos):
Faixa 1: Marcador de Alto Peso MolecularFaixa 2: 18h (6,12μ1 de amostra)Faixa 3: 17h (6,12μ1 de amostra)Faixa 4: 15h (6#12μ1 de amostra)Faixa 5: 14h (6,12μ1 de amostra)Faixa 6: 13h (6,12μ1 de amostra)Faixa 7: 11,3h (6,12μ1 de amostra)Faixa 8: 0,27 μg Colagenase I e 0/29μg Colagenase II.
A Figura 33b representa um diagrama esquemá-tico do procedimento de inoculação.A Figura 33c representa um fluxograma de umprocesso de inoculação de lote de alimentação de aproxima-damente 200 1.
A Figura 34 mostra um cromatograma depois decromatografia de hidroxiapatita.
A Figura 35 mostra um cromatograma depois deuma permuta de ânions de TMAE de fractogel.
A Figura 36 é uma análise de 8% Tris-GlicinaSDS-PAGE de material Pre HAf Após HA e Após TMAE a partirdo processo de escala 5L:
<table>table see original document page 20</column></row><table>
A Figura 37 mostra um cromatograma depois deuma permuta de ânions de TMAE de fractogel.
A Figura 38 é uma análise de 8% Tris-GlicinaSDS-PAGE de Sepharose Q IEX cromatográfica de material a-pós TMAE material executada na presença de leupeptina:
<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>
A Figura 39 é uma análise 8% Tris-GlicinaSDS-PAGE de cromatografia de Q Sepharose IEX após corridade material de TMAE na presença de leupeptina. Gel 2-Peak 2 (ABCI):
<table>table see original document page 21</column></row><table>
A Figura 40 mostra um cromatograma depois depermuta de ânions de Q Sepharose HP com gradiente mo- difiçado.
A Figura 41 mostra um cromatograma depois deuma cromatografia de permeação Superdex 75 Gel de ABCII.
A Figura 42 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 12% de Superdex 75 GPC de ABC II concentrado realiza-da na presença de arginina:<table>table see original document page 22</column></row><table>
A Figura 43 mostra um cromatograma depois deuma cromatografia por Superdex 75 Gel Permeation de ABCI.
A Figura 44 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de Superdex 75 GPC de ABC I concentrado reali-zada na presença de arginina:
Faixa Amostra Volume de carga, μl
1 Marcador Mark 12 10
2 Colagenase referência ABC I lμg 15
3 Colagenase referência ABC II lμg 15
4 Carga de GPC u.g 15
5 Fração D4 15
6 Fração D3 15
7 Fração D2 15
8 Fração Dl 15
9 Fração El 15<table>table see original document page 23</column></row><table>
A Figura 45 representa um fluxograma de umprocesso de manufatura proposto.
A Figura 46 representa um fluxograma do pro-cedimento de fermentação para o processo 3.
A Figura 47 representa um fluxograma do pro-cedimento de purificação para o processo 3.
A Figura 48 é um SDS-PAGE (reduzido) Coomasiecolorido para os Intermediários AUXI e AUXII:
Faixa
1. Marcador de Alto Peso Molecular
2. 0,132mg/ml Referência ABC-I
3. 0,0265mg/ml Referência ABC-I
4. 0f132mg/ml Intermediário AUX-I
5. 0;0265mg/ml Intermediário AUX-I
6. 0,132mg/ml Referência ABC-II
7. 0,0265mg/ml Referência ABC-II
8. 0,132mg/ml Intermediário AUX-II
9. 0,0265mg/ml Intermediário AUX-II.
A Figura 49 é um SDS-PAGE (reduzido) Coomasiecolorido para Substância Medicamentosa:
Faixa
1. Marcador de Alto Peso Moleculars
2. 0,132mg/ml Mixed BTC Referência
3. 0.0265mg/ml Mixed BTC Referência
4. 0,132mg/ml Substância medicamentosa5. 0,0265mg/ml Substância medicamentosa;
A Figura 50 é Substância medicamentosa colo-rida por SDS-PAGE Prata (reduzido):
<table>table see original document page 24</column></row><table>
A Figura 51 ilustra uma comparação de C. histolyticum desenvolvido em Proteose Peptona #3 em uma fer-mentação por lote com o processo de fermentação existenteutilizando-se peptona Fitona durante cultivo de alimenta-ção em lote;
GCFTOSb PP3 Isstefi GCFT03d Phytone fsd-foatch
A Figura 52 é uma análise de SDS-PAGE do produto de colagenase no ponto de colheita (2Oh) de uma fermentação por lote de 5L Proteose Peptona #3 (GCFT03b) (8Tris-Glicina):
<table>table see original document page 24</column></row><table>8 0,87 μΐ de amostra (1/7 diluição de amos-tra de fermentação)
9 1,22 μΐ de amostra (1/5 diluição de amos-tra de fermentação)
10 1,53 μΐ de amostra (1/4 diluição de amos-tra de fermentação)
11 2,04 μΐ de amostra (1/3 diluição de amos-tra de fermentação)
Estimativas
AUXI - 176 mg/l
AUXII - 190 mg/l
A Figura 53 é uma análise de SDS-PAGE do pro-duto de colagenase no ponto de colheita (20h) de uma fer-mentação de alimentação por lote 5L Fitona (GCFT03d) (8%Tris-Glicina):
Faixa Amostra
1 Marcador de Alto Peso Molecular
2 0,21 μg AUXI
3 0,18 AUXI
4 0,135 μg AUXI
5 0,29 μ9 AUXII
6 0,193 μg AUXII
7 0,145 μg AUXII
8 0,87 μΐ de amostra (1/7 diluição de amos- tra de fermentação)
9 1,22 μΐ de amostra (1/5 diluição de amos-tra de fermentação)
10 1,53 μΐ de amostra (1/4 diluição de amos-tra de fermentação)
11 2,04 μl de amostra (1/3 diluição de amostra de fermentação)
Estimativas
AUXI - 88 mg/l
AUXII - 142 mg/l
A Figura 54 ilustra três fermentações deClostridium histolyticum desenvolvido em 50g/l PP3, de-monstrando um perfil de crescimento capaz de ser reprodu-Zido: QCFTOSb | -e-GGFTIMe GCFTOSd |
A Figura 55 é uma análise de SDS-PAGE mos-trando o decorrer do tempo para GCFT05d (fermentação emlote com Proteose Peptona #3) , 8% Tris Glicina gel, colo-rido coloidal):
Faixa Amostra
1 Marcador de Alto Peso Molecular
2 Referência, AUXI e AUXII
3 3 horas
4 4 horas
5 5 horas
6 6 horas
7 7 horas
8 8 horas
9 9 horas
10 10 horas
11 11 horas
A Figura 56 é uma análise de SDS-PAGE mos-trando o decorrer do tempo de GCFT05d (fermentação por lo-te com Proteose Peptona #3), (8% Tris Glicina gel, clora-ção prata):
<table>table see original document page 27</column></row><table>
A Figura 57 é uma análise de SDS-PAGE quemostra o decorrer de tempo de DCFT24b (fermentação de ali-mentação por lote utilizando-se Fitona peptona), (8% TrisGlicina gel, coloração coloidal):
<table>table see original document page 27</column></row><table>10 13 horas
11 11,6 horas
12 10,5 horas
A Figura 58 ilustrates uma comparação de cur-vas de crescimento a partir de fermentações de C. histoly-ticum utilizando-se diferentes lotes de PP3:
<formula>formula see original document page 28</formula>
A Figura 59 ilustra uma comparação me pequenaescala de três lotes de PP3 e avaliação de 100g/l PP3:
<formula>formula see original document page 28</formula>
A Figura 60 ilustra os perfis de crescimentode duas fermentação de 5L utilizando-se PP3 a 100g/l:
<formula>formula see original document page 28</formula>
A Figura 61 é uma análise de SDS-PAGE do de-correr do tempo de fermentação de PBFT70c, 100g/l PP3 (lo-te # 5354796) (8% Tris-Glicina):
Faixa Amostra
1 Marcador de Alto Peso Molecular
2 Referência, 0,4 μg AUXI e AUXII
3 3,1 horas
4 4,4 horas
5 5,5 horas
6 6,6 horas
7 8,0 horas
8 9,1 horas<table>table see original document page 29</column></row><table>
A Figura 62 é uma análise de SDS-PAGE no de-correr do tempo de PBFT70d, fermentação de 100g/l PP3 (lo-te # 5325635) (8% Tris-Glicina):
<table>table see original document page 29</column></row><table>
A Figura 63 representa uma análise de densi-tometria de SDS-PAGE para comparar o crescimento de célu-las para formação de produto a partir da fermentaçãode 5 1de PBFT70c:
- - -o - - Freoursor —♦—Aux 1 —♦— Amk 2 —o— OD.
A Figura 64 ilustra uma comparação do proces-so de 100g/l PP3 a 5 1 e escala 200 1:
P8FT70C —*- P8FT7Gd -Φ- 200L scafe-up fermenlation
A Figura 65 é uma análise de SDS-PAGE do de-correr do tempo da fermentação de 200 1 (8% Tris-Glicina):Faixa Amostra
1 Marcador de Alto Peso Molecular
2 Referência mista de AUXI e AUXII (l,2μg)
3 4 horas
4 6 horas
5 8 horas
6 9,4 horas
7 12 horas
8 14 horas
A Figura 66 representa uma análise de densi-tometria de SDS-PAGE para comparer o crescimento de célu-las para formação de produto a partir da fermentação de 2001:
·'<> ■ -Precursor —*—Mix 1! —*—Ajux 2 —o—OD.
A Figura 67 é uma análise de SDS-PAGE do de-correr do tempo da fermentação de 200 1 (4-12% Bis-Tris):
Faixa Amostra
A Figura 68 mostra uma curva padrão para aquantificação densitométrica de concentração de colagenase.A Figura 69 representa uma ilustração esque-mática da fermentação e colheita de Clostridium histolyticum.
As Figuras 70 (a) e (b) são cromatogramas re-sultantes da cromatografia de interação hidrofóbica utili-zando-se fenil sefarose FF (baixo sub) : (a) é o cromato-grama em escala plena e (b) é um cromatograma expandidoque mostra a coleta de fração.
A Figura 71 é uma análise de 4-12% Bis-TrisSDS-PAGE em amostras de processo da etapa Mustang Q à eta-pa TFFl. O gel é colorido com azul coloidal e sobrecarre-gado (2,5pg total de proteína/faixa) para mostrar as ban-das de contaminação:
Faixa Amostra Volume de carga, μl
1 Marcador de peso molecular Mark 12 12
2 Filtrado Após Mustang Q 15
3 Pré HIC Bolsa 1 15
4 Pré HIC Bolsa 2 15
5 HIC atravessa Bolsa 1 15
6 HIC atravessa Bolsa 1 15
7 HIC Pico 1 (0,3M AS lavagem) 15
8 Conjunto após HIC (pico 2) 15
9 Pré TFF (conjunto após HIC + ret. 2 dias) 15
10 Após TFF 15
11 Pré Q-AEX (após TFF + ret.durante a noite) 15
A Figura 72 é um cromatograma de permuta deions (Q Sepharose HP) do material após HIC depois deconcentração e diafiltragem em IOmM Tris, 200μΜ leupepti-na pH 8.
A Figura 73 é uma análise de frações de BisTris SDS-PAGE 4-12% a partir do pico 1 (AUXII) eluxdas du-rante a permuta iônica de coluna (Figura 5). Gel 1: O gelé colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 32</column></row><table>
A Figura 74 é uma análise de frações de BisTris SDS-PAGE 4-12% a partir do pico 1 (AUXII) eluídas du-rante a permuta iônica de coluna (Figura 5). Gel 2: 0 gelé colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 32</column></row><table><formula>formula see original document page 33</formula>
A Figura 75 é uma análise de frações de BisTris SDS-PAGE 4-12% a partir do pico 2 (AUXI) eluídas du-rante a permuta iônica de coluna (Figura 5). Gel 3: O gelé colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 33</column></row><table>
A Figura 76 é uma análise de frações de BisTris SDS-PAGE 4-12% a partir do pico 2 (AUXI) eluídas du-rante a permuta iônica de coluna (Figura 5). Gel 4: O gelé colorido com azul coloidal:
Faixa Amostra Volume de carga, μl
1 Marcador de Peso Molecular Mark 12 10<table>table see original document page 34</column></row><table>
A Figura 77 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de amostras em processo a partir da etapa depermuta de ânions até ao produto final. 0 gel é coloridocom azul coloidal. Gel 1: lpg/carga de faixa:
<table>table see original document page 34</column></row><table>
A Figura 78 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de amostras em processo a partir da etapa depermuta de ânions até ao produto final. 0 gel é coloridocom azul coloidal. Gel 2: lpg/carga de faixa:
<table>table see original document page 35</column></row><table>
A Figura 79 representa uma SDS-PAGE com TrisGlicina 8% (NB Ref AS/1640/020):
<table>table see original document page 35</column></row><table>
A Figura 80 representa um SDS-PAGE com TrisGlicina 8%:
1. Marcadores de Alto Peso Molecular2. 1 μg Referência AUX-I
3. 1 μg Referência AUX-II
4. 1 μg Após IEX AUX-I Dia 5
5. 1 μg Após IEX AUX-I Dia 12
6. 1 μg Após IEX AUX-II Dia 5
7. 1 μg Após IEX AUX-II Dia 12
A Figura 81 representa um gel SDS-PAGE:
1. Marcadores de Alto Peso Molecular
2. 1 μg Referência AUX-I
3. 1 μg Referência AUX-II
4. 1 μg Intermediário AUX-I Dia 5
5. 1 μg Intermediário AUX-I Dia 12
6. 1 μg Intermediário AUX-II Dia 5
7. 1 μg Intermediário AUX-II Dia 12.
A Figura 82 representa uma análise de croraa-tografia analítica.
A Figura 83 mostra a determinação de concen-tração de proteínas por UV.
A Figura 84 é uma análise de 4-12% Bis-TrisSDS-PAGE de amostras em processo a partir da execução dedemonstraação de 2OL tomada no ponto de manufatura e arma-zenada a -20°C. O gel é colorido com azul coloidal. Carga de Ipg:
Faixa Amostra
Volume de carga, μl
1 Marcador de Peso Molecular Mark 12 15
2 Filtrado Após Mustang Q 15
3 Pré HIC Bolsa 1 15
4 Pré HIC Bolsa 2 15<table>table see original document page 37</column></row><table>
A Figura 85 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE4-12% de amostras em processo a partir da execução de de-monstração de 2OL depois de 22 horas sob temperatura ambi-ente. 0 gel é colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 37</column></row><table>A Figura 86 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de amostras em processo a partir da execução dedemonstração de 2OL depois de 22 horas a 37°C. 0 gel écolorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 38</column></row><table>
A Figura 87 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de amostras em processo a partir da execução dedemonstração de 2OL depois de 94 horas sob temperatura am-biente . O gel é colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>
A Figura 88 é uma análise de Bis-Tris SDS-PAGE 4-12% de amostras em processo a partir da execução dedemonstração de 2OL depois de 94 horas a 37 °C. O gel écolorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 39</column></row><table>
A Figura 89 é uma análise de Tris-GlicinaSDS-PAGE 8% de frações após IEX AUX I e após IEX AUX IIselecionadas. As frações foram selecionadas a partir dacorrida de demonstração de 2OL que foram enriquecidas paraa proteína de contaminação requerida. 0 gel é coloridocom azul coloidal:<table>table see original document page 40</column></row><table>
A Figura 90 é uma análise de Tris-GlicinaSDS-PAGE 8% de frações após IEX AUX I e após IEX AUX IIselecionadas. As frações foram selecionadas a partir dematerial purificado gerado a partir da fermentação de 20LPP3 e enriquecido para a proteína de contaminação ~90kDa.
O gel é colorido com azul coloidal:
<table>table see original document page 40</column></row><table>Descrição Detalhada da Invenção
A invenção proporciona uma nova substânciamedicamentosa de colagenase que compreende uma misturade colagenase I e colagenase II altamente purificada emuma relação em massa de cerca de 1 para 1. Descobriu-se que uma composição que compreende uma mistura decolagenase I e colagenase II em uma relação em massaartificial de 1 para 1 proporciona atividade enzimáticaaltamente reproduzível e ótima e transmite efeito tera-pêutico superior ao mesmo tempo em que diminui o poten-cial para efeitos colaterais. Deve ficar entendido queos termos "substância medicamentosa", "produto medica-mentoso" ou "composição de colagenase" podem ser usadosde forma permutável.
De acordo com uma concretização, a presen-te invenção a presente invenção proporciona uma subs-tância medicamentosa que consiste de colagenase I e co-lagenase II que tem a seqüência de colagenase I e cola-genase II de Clostridium histolyticum, respectivamente,tendo uma relação em massa de cerca de 1 para 1 com umapureza de pelo menos 95%, em área, e preferentemente,uma pureza de pelo menos 98%, em área.
Em outra concretização, a presente inven-ção proporciona uma substância medicamentosa, em que asubstância medicamentosa é dotada de pelo menos uma es-pecificação selecionada a partir da tabela A seguinte:Tabela A
<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>
De acordo com um aspecto, a invenção pro-porciona um processo para a produção de uma substânciamedicamentosa que consiste de colagenase I e colagenaseII que tem a seqüência de colagenase I e colagenase IIde Clostridium histolyticum, respectivamente, tendo umarelação em massa de cerca de 1 para 1 com uma pureza depelo menos 95%, em área, que compreende as etapas de:
a) promover a fermentação de Clostridium histolyticum;
b) colher o produto bruto que compreende colage-nase I e colagenase II;c) purificar a colagenase I e colagenase II apartir da colheita bruta por meio de filtrageme cromatografia de coluna; e
d) combinar a colagenase I e colagenase II puri-ficada a partir da etapa (c) sob uma relaçãode cerca de 1 para 1.
Em uma concretização preferida, a etapa defermentação é conduzida na presença de um derivado por-cino, uma peptona fitogênea ou um meio de peptona vege-tal. Com maior preferência, o meio derivado porcino épeptona de proteose #3.
De acordo com uma concretização, a inven-ção proporciona um procedimento de fermentação que com-preende as etapas de:
a) inocular o meio em vim primeiro estágio comClostridium histolyticume submeter a mistura a agitação;
b) incubar a mistura proveniente da etapa (a)para obter uma alíquota;
c) Inocular o meio em um segundo estágio com alí-quotas resultantes da etapa (b) e submeter amistura a agitação;
d) Incubar as misturas provenientes da etapa (c);
e) Inocular o meio em um terceiro estágio com alí-quotas resultantes da etapa (d) e submeter aagitação;
f) incubar misturas provenientes da etapa (e);
g) inocular o meio em um quarto estágio com umaalíquota resultante da etapa (f) e submeter aagitação;
h) incubar misturas provenientes da etapa (g); e
i) colher a cultura resultante da etapa (h) pormeio de filtragem.
De acordo com uma concretização preferida,procedimento de fermentação compreende as etapas de:
a) Inocular 3 χ 25ml de meio de PP3 (peptona deproteose) com 3 χ 250 μΐ de WCB (25 ml de cul-turas em frascos de agitação 3 χ 125 ml, conti-dos dentro de um vaso de gás Anaeróbio) a umatemperatura de ponto fixo de 37°C, e submeter amistura a agitação de 125 rpm;
b) incubar a mistura proveniente da etapa (a) du-rante 12 horas;
c) inocular 4 χ 200 ml de meio PP3 com alíquotas 4χ 5 ml a partir de 1 das culturas de 25 ml an-teriores (200 ml culturas em 4 frascos de agi-tação de 500 ml, contidos dentro de um vaso degás Anaeróbio) a uma temperatura fixada de3 7°C, e submeter a mistura a agitação de 125 rpm;
d) incubar as misturas provenientes da etapa (c)durante 12 horas;
e) inocular 14,4 1 do meio PP3 com 3 culturas χ200 mi (15 1 de cultura em fermentadòr de 20 1)a uma temperatura fixa de 37°C e pH fixado de7,00, e agitação da mistura a 125 rpm;f) incubar as misturas provenientes da etapa (e)durante 12 horas;
g) inocular 192 1 do meio PP3 com 8 l dos 15 l decultura (200 1 cultura em fermentador de 270 l)a uma temperatura fixada de 37°C e pH fixado de7,00, e submeter a mistura a agitação a 125 rpm;
h) incubar as misturas provenientes da etapa (g)durante 14 horas; e
i) colher 200 l de cultura por filtragem (profun-didade seguida por 0,2 μm) por meio de Millipo-re Millistak 4 m2 e filtro 0,2 μm (2 χ MilliporeExpress XL 10 filtros) sob uma velocidade defluxo de 200 l/hora.
De acordo com uma concretização, a inven-ção proporciona um procedimento de purificação que com-preende as etapas de:
a) filtrar a colheita bruta através de um filtrode cápsula permutadora aniônica Mustang Q;
b) adicionar sulfato de amônio; preferentementepara uma concentração final de IM;
c) filtrar a colheita bruta; preferentemente atra-vés de um filtro de 0,45 μπι filtro;
d) submeter o filtrado através de uma coluna HIC;
preferentemente um fenil sefarose 6FF (baixasub);
e) adicionar leupeptina ao filtrado; preferente-mente para uma concentração final de 0,2 mMpara eluição de produto após HIC;
f) remover o sulfato de amônio e manter a leupep-tina para vinculação correta da colagenase I ecolagenase II com troca de amortecedor porTFF; preferentemente com troca de amortecedorpor TFF;
g) filtragem da mistura da etapa (f) ; preferente-mente através de um filtro de 0,45 μπί;
h) separação da colagenase I e colagenase II uti-lizando-se Q-Sepharose HP;
i) preparação da concentração de TFF e formulaçãopara colagenase I e colagenase II separadamen-te; em que TFF é uma filtragem de fluxo tan-gencial utilizando-se membranas de filtro decelulose regenerada ou PES ou RC-polieter sul fona de 10 e/ou 3 OK MWCO (corte depeso molecular). Proporciona meios para rete-rem e concentrarem proteína e selecionada epermutar a proteína de uma solução de amorte-cedor para outra; e
j) filtragem através de um sistema de filtra-gem de 0,2 μπί.
A substância medicamentosa da presente in-venção inclui colagenase I e colagenase II. Uma fontepreferida de colagenase bruta é a partir de um processode fermentação bacteriano, especificamente a fermenta-ção de C. histolyticum (C. his). Em uma concretizaçãoda invenção, descreve-se um processo de fermentação. Acolagenase bruta obtida a partir de C. his pode ser pu-rificada por uma variedade de métodos conhecidos daque-les versados na técnica, incluindo cromatografia de a-finidade de ligante, cromatografia de afinidade de he-parina, precipitação de sulfato de amônio cromatografiade hidroxilapatita, cromatografia por exclusão de di-mensão, cromatografia por permuta iônica, e cromatogra-fia por quelação de metal. A colagenase bruta e parci-almente purificada encontra-se disponível comercialmen-te a partir de muitas fontes, incluindo a Advance Bio-factures Corp., Lynbrook, New York.
Tanto a colagenase I quanto a colagenaseII são metaloproteases e requerem zinco estreitamentevinculado e cálcio soltamente vinculado para a sua ati-vidade (Eddie L. Angleton e Η. E. Van Wart, Biochemis-try 1988, 27, 7406 - 7412) . As duas colagenases sãodotadas de ampla especificidade no sentido de todos ostipos de colagênio (Steinbrink, D; Bond, M e Van Wart,H; (1985), JBC1 260 p2771-2776). A Colagenase I ande aColagenase II digerem colagênio por hidrólise da regiãotriplo-helicoidal de colagênio sob condições fisiológi-cas (Steinbrink, D; Bond, M e Van Wart, H; (1985), JBC1260 p2771-2776). Mesmo que cada colagenase exiba espe-cificidade diferente (por exemplo, cada uma tenha umaseqüência amino preferida diferente para clivagem), emconjunto, elas têm atividade sinérgica no sentido docolagênio [Mandl, I., (1964), Biochemistry, 3: p.1737-1741; Vos-Scheperkeuter, GH, (1997), Cell Transplanta-tion, 6: ρ.403-412] . A colagenase II tem uma atividademais elevada no sentido de todas as espécies de subs-tratos de peptídeos sintéticos do que a colagenase I,tal como reportado para a colagenase da classe II eclasse I nas literaturas. [Bond, M.D. (1984), Biochem-istry, 23: p.3085-3091. Hesse, F, (1995), Transplanta-tion Proceedings, 27: ρ.3287-3289].
Exemplos de enfermidades mediadas por co-lagênio que podem ser tratadas pelas composições e mé-todos da invenção incluem, sendo que não se fica limi-tado às mesmas: enfermidade de Dupuytren; enfermidadede Peyronie; ombro congelado (capsulite adesiva), que-lóides; cicatrizes hipertróficas; cicatrizes afundadas,tais como aquelas resultantes de acne inflamatória; a-derências pós-cirúrgicas; acne vulgar; lipomas, e con-dições deformantes, tais como enrugamento, formação decelulite e fibrose neoplástica. As patentes U.S. Nos.6.086.872 e 5.589.171 incorporadas neste contexto porreferência expõem o uso de preparados de colagenase notratamento de enfermidade de Dupuytren. A patente U.S.No. 6.022.539 incorporada neste contexto por referênciaexpõe o uso de preparados de colagenase no tratamentode enfermidade de Peyronie.
Adicionalmente ao seu uso no tratamento deenfermidades mediadas por colagênio, a composição dainvenção também é de utilidade para a dissociação detecido em células individuais e aglomerados de células,da mesma forma que é de utilidade em uma ampla varieda-de de aplicações de laboratório, diagnóstico e terapêu-ticas. Estas aplicações envolvem o isolamento de mui-tos tipos de células para vários usos, incluindo célu-las endoteliais microvasculares para semeadura de en-xerto sintético de pequeno diâmetro, hepatócitos paraterapia de genes, dispositivos para auxiliar o fígadono peneiramento de toxicologia de drogas e extracorpó-reas, condrócitos para regeneração de cartilagem, e i-Ihas de Langerhans para o tratamento de diabetes melli-tus dependente de insulina. 0 tratamento por enzimastrabalha no sentido de fragmentar proteínas de matrizextracelular e as proteínas que mantêm contacto de cé-lula com célula. Uma vez que o colagênio é o componen-te proteínico principal da ultra-estrutura de tecido, acolagenase enzimática tem sido freqüentemente usada pa-ra se conseguir a desintegração de tecido desejada. Deuma maneira geral, a composição da presente invenção éde utilidade para qualquer aplicação onde são desejadasa remoção de células ou a modificação da matriz extra-celular.
As composições de colagenase da invençãotambém podem ser preparadas pela mistura seja de um nu-mero específico de unidades de atividade ou massas es-pecíficas das enzimas preferentemente purificadas. Aatividade da colagenase pode ser medida pela capacidadeda enzima em hidrolisar seja o peptídeo sintético ousubstrato de colagênio. Aqueles versados na técnicareconhecerão que ensaios de enzimas diferentes daquelesexpostos neste contexto poderão ser também usados paradefinir e preparar composições de enzimas funcionalmen-te equivalentes.
Outro aspecto da presente invenção é a o-timização capaz de ser reproduzida da relação de 1 parade colagenase I para colagenase II na composição dainvenção. A capacidade de reprodução da relação de co-lagenase I para colagenase II constituiu-se anterior-mente em um desafio por causa de diversos fatores.
Primeiro, a fermentação comercial do Clostridium geral-mente resulta em uma relação de 1 para 2 de colagenaseI e colagenase II. Segundo, é conhecido que os proce-dimentos de purificação alteram a sua relação de formasignificativa, resultando em relações incompatíveis deproduto purificado. A proporção de massa fixa otimiza-da da composição da presente invenção eleva ao máximo aatividade sinérgica proporcionada pelas duas colagena-ses diferentes, resultando em benefício terapêutico su-perior.
A invenção também proporciona formulaçõesfarmacêuticas das composições da invenção. As formula-ções farmacêuticas da presente invenção compreendem umaquantidade terapeuticamente efetiva de uma composiçãode colagenase da presente invenção formulada em conjun-to com um ou mais carreadores ou excipientes farmaceu-ticamente aceitáveis.
Da maneira que é usado neste contexto, otermo "carreador ou excipiente farmaceuticamente acei-tável" significa um material de encapsulamento, diluen-te, enchimento sólido, semi-sólido ou líquido inerte,não tóxico, ou formulação auxiliar de qualquer tipo.Alguns exemplos de materiais que podem servir como car-readores farmaceuticamente aceitáveis são açúcares,tais como lactose, glicose e sacarina; amidos tais comoamido de milho e amido de batata; celulose e seus deri-vados, tais como carboximetilcelulose de sódio, etilcelulose e acetato de celulose; tragacanto pulverizado;malte; gelatina; talco; glicóis tais como propilenoglicol; ésteres tais como etil oleato e etil laurato;agar-agar; agentes de amortecimento, tais como hidróxi-do de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico;água isenta de substância pirógená; salino isotônico;solução de Ringer; álcool etíIico, e soluções amortece-doras de fosfato, bem como outros lubrificantes compa-tíveis não-tóxicos, tais como sulfato laurílico de só-dio, bem como agentes de coloração, agentes de despren-dimento, agentes de revestimento, agentes aromatizan-tes, preservativos e antioxidantes também podem estarpresentes na composição, de acordo com o critério doformulador.
As composições farmacêuticas desta inven-ção podem ser administradas de forma parenteral, deforma tópica, ou por meio de um reservatório implanta-do. Da maneira que é usado neste contexto, o termo pa-renteral inclui técnicas de injeção subcutânea, intra-cutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular,intra-arterial, intra-sinovial, intrasternal, intrate-cal, intralesional e intracraniana ou infusão. Em umaconcretização preferida, a composição é injetada no te-cido de desfiguração. No caso de enfermidades de Pe-yronie ou Duputyren ou capsulite adesiva, a composiçãoé injetada no cordão ou placa. O termo "administraçãolocal" é definido neste contexto de forma a abrangeressa injeção direta.
Além disso, resultados particularmentebons podem ser obtidos por imobilização no local da in-jeção depois da administração. Por exemplo, o local deadministração pode ser imobilizado durante 4 ou maishoras.
Preparados injetáveis, por exemplo, sus-pensões aquosas oú oleaginosas injetáveis estéreis, po-dem ser formuladas de acordo com a técnica conhecidautilizando-se agentes de dispersão ou umedecimento eagentes de suspensão adequados. 0 preparado injetávelestéril também pode ser uma solução, suspensão ou emul-são injetável estéril, em um diluente ou solvente não-tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como umasolução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos ou sol-ventes aceitáveis que podem ser empregados encontram-sea água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotônicade cloreto de sódio. Adicionalmente, óleos fixos, es-téreis, são convencionalmente empregados como um sol-vente ou meio de suspensão. Para este propósito, pode-rá ser empregado qualquer óleo fixo leve, incluindo mo-no- ou diglicerídeos sintéticos. Adicionalmente, áci-dos graxos, tais como ácido oléico, são usados na pre-paração de injetáveis.
As formulações injetáveis podem ser este-rilizadas, por exemplo, por filtragem através de vimfiltro de retenção de bactérias, ou por incorporação deagentes de esterilização na forma de composições sóli-das estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas emágua estéril ou outro meio injetável estéril antes douso. As soluções estéreis também podem ser liofiliza-das para uso posterior.
Formas de dosagem para administração tópi-ca ou transdérmica de um composto desta invenção inclu-em ungüentos, pomadas, cremes loções géis, pós, solu-ções, sprays, inalantes ou emplastros. O componenteativo é misturado sob condições estéreis com um carrea-dor farmaceuticamente aceitável e quaisquer preservati-vos ou amortecedores que possam ser requeridos.
Os ungüentos, pastas, cremes e géis podemconter, adicionalmente ao composto ativo desta inven-ção, excipientes tais como gorduras de origem animal evegetal, óleos, ceras, parafinas, amido, tragacanto,derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones,bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco, ouas suas misturas.
Os pós e sprays podem conter, adicional-mente aos compostos desta invenção, excipientes taiscomo lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de alu-mínio, silicatos de alumínio, silicatos de cálcio e póde poliamida, ou misturas destas substâncias. Os s-prays podem conter adicionalmente propelentes usuais,tais como clorofluoroidrocarbonetos.
Os emplastros transdérmicos têm a vantagemadicional de proporcionar distribuição controlada de umcomposto ao corpo. Essas formas de dosagem podem serpreparadas pela dissolução ou distribuição do compostono meio apropriado. Agentes intensificadores de absor-ção também podem ser usados para aumentar o fluxo docomposto através da pele. A velocidade pode ser con-trolada seja pela provisão de uma membrana de controlede velocidade ou pela dispersão do composto em uma ma-triz de polímero ou gel.
Em uma concretização preferida, a substân-cia medicamentosa da invenção é uma composição injetá-vel liofilizada formulada com lactose. Em uma concre-tização, cada miligrama de colagenase injetável é for-mulado com 1,9 mg de lactose. Em outra concretização,cada miligrama de colagenase de injeção preferentementetem aproximadamente 2800 unidades SRC e 51000 unidadesmedidas com um ensaio de potência utilizando-se umsubstrato sintético, pzGPGGPA.
Em outra concretização preferida, a compo-sição de colagenase da invenção é uma composição inje-tável liofilizada formulada com Sacarina, Tris sob umnível de pH de cerca de 8,0. Com maior preferência,1,0 mg da substância medicamentosa da invenção é formu-Iada em 60 mM de Sacarina, 10 mM de Tris, sob um pH decerca de 8,0 (isto eqüivale a 20,5 mg/ml de sacarina e1,21 mg/ml de Tris no amortecedor de formulação). E-xemplos de algumas das formulações incluem, sendo quenão se fica limitado às mesmas: para 0,58 mg da dose desubstância medicamentosa, 18,5 mg de sacarina e 1,1 mgde Tris são adicionados em cada frasco, onde a meta deum volume de enchimento de frasco é 0,9 ml; e para a0,58 mg da dose de substância medicamentosa, 12,0 mg desacarina (multi-compêndio) e 0,7 mg de Tris (multi-compêndio).
De acordo com a invenção, são proporciona-dos métodos para o tratamento de enfermidades mediadaspor colagênio que compreendem a etapa de administrar aum paciente com necessidade do mesmo uma quantidade te-rapeuticamente efetiva de uma composição da invenção,ou uma quantidade terapeuticamente efetiva de uma for-mulação farmacêutica da invenção. Por uma "quantidadeterapeuticamente efetiva" de um composto da invençãoentende-se uma quantidade do composto que confere vimefeito terapêutico no paciente tratado, sob uma relaçãobenefício/risco razoável aplicável a qualquer tratamen-to médico.
O efeito terapêutico pode ser objetivo (ouseja, capaz de ser medido por algum teste ou marcador)ou subjetivo (ou seja, o paciente dá uma indicação deum efeito ou está sentido o mesmo). Doses efetivastambém serão variáveis na dependência da via de admi-nistração, bem como da possibilidade de co-utilizaçãocom outros agentes. Será compreendido, entretanto, quea utilização diária total das composições da presenteinvenção será decidida pelo médico atendente dentro doescopo de um critério médico adequado. O nível de doseterapeuticamente efetiva específico para qualquer paci-ente particular dependerá de uma variedade de fatores,incluindo o distúrbio que está sendo tratado e a gravi-dade da enfermidade; da atividade do composto específi-co empregado; da idade, peso corpóreo, saúde geral, se-xo e dieta do paciente; do tempo de administração, viade administração, e velocidade de excreção do compostoespecífico empregado; a duração do tratamento; drogasusadas em combinação ou simultaneamente com o compostoespecífico empregado; bem como fatores assemelhados am-plamente conhecidos nas técnicas medicinais.
A substância medicamentosa para colagenaseinjetável consiste de duas colagenases microbianas, c-hamadas de Colagenase AUX I e Colagenase ABC I e Cola-genase AUX II e Colagenase ABC II. Deve ser entendidoque os termos "Colagenase I", "ABC I", "AUX I", "cola-genase AUX I", e "colagenase ABC I" significam o mesmoe podem ser usadas permutavelmente. De uma forma asse-melhada, os termos "Colagenase II", "ABC II", "AUX II","colagenase AUX II", e "colagenase ABC II" referem-se àmesma enzima e também podem ser usados permutavelmente.Estas colagenases são segregadas por células bacteria-nas. Elas são isoladas e purificadas a partir de so-brenadante de cultura de Clostridium histolyticum pormétodos cromatográficos. As duas colagenases são pro-teases especiais e compartilham do mesmo número EC (E.C3.4.24.3).
A colagenase AUX I tem uma única cadeia depolipeptídio que consiste de aproximadamente 1000 ami-noácidos com um peso molecular de 115 kDa. A colagena-se AUX II também tem uma única cadeia de polipeptídioque consiste de cerca de 1000 aminoácidos com um pesomolecular de 110 kDa.
Mesmo que a literatura indique que existemhomologias de seqüência nas regiões de colagenase AUX Ie AUX II, os dois polipeptídios não parecem ser imuno-logicamente reativos cruzados como indicado pela análi-se de borrão ocíduo.
A substância medicamentosa (concentrado decolagenase) tem uma relação de massa de aproximadamente1 para 1 para colagenase AUX I e AUX II. 0 concentradode colagenase é dotado de um coeficiente de extinção de 1,528.
Todas as referências citadas neste contex-to, sejam elas impressas, eletrônicas meios de armaze-namento capazes de serem lidos por computador ou outraforma, ficam expressamente incorporados por referênciana sua totalidade, incluindo, mas não ficando a eleslimitados, resumos, artigos, jornais, publicações, tex-tos, tratados, sites da web internet, bases de dados,patentes, e publicações de patentes.Exemplos
As composições e processos da presente in-venção serão mais bem compreendidos em conexão com osexemplos seguintes, os quais têm intenção meramente i-lustrativa e não de limitação do escopo da invenção.Varias alterações e modificações das concretizações ex-postas serão evidentes para aqueles versados na técnicae essas alterações e modificações incluindo, sem limi-tação, aquelas relacionadas aos processos, formulaçõese/ou métodos da invenção poderão ser realizadas sem es-capar do espírito da invenção e do escopo das reivindi-cações anexas.
PROCESSO 2:
Processo de Fermentação
Este trabalho foi estabelecido para desen-volver um processo de fermentação que visa a distribuirum rendimento visado de 250mg/l de colagenases ABC I eII total a partir do processo em escala de fermentaçãode 5 1 em um meio de crescimento de componente isentode animal. Várias fontes de nitrogênio alternativaspotenciais foram peneiradas para ver se elas tinhamqualquer efeito na expressão de colagenase sobre e aci-ma do componente de fitone atualmente usado no meio decrescimento. Um experimento comparando produtividadesa partir de duas variedades de C. histolyticum, 004 e013, foi para determinar quais as diferenças entre asduas variedades com relação à cinética de crescimento,produtividade de colagenase e produção de proteases decontaminação desenvolvidas em um meio derivado de ani-mal. Esta comparação salientou diferenças significati-vas entre o crescimento da variedade C. histolyticum emmeio derivado de animal, em oposição ao meio de cresci-mento isento de animal.
Resultados anteriores descreveram que con-centrações aumentadas de fitone e extrato de fermentomostraram suportar concentrações de biomassa maiores e,portanto níveis mais altos de expressão de colagenasetotal. Em uma tentativa de aumentar mais as concentra-ções de biomassa e produtividade de colagenase total domeio de fermentação de lote otimizado, projetou-se umaestratégia de fermentação de lote alimentado. Realiza-ram-se duas fermentações de 5 1, uma com uma alta con-centração de meio na fase de lote seguida por uma fasede alimentação de baixa concentração, a segunda com umabaixa concentração de meio na fase de lote seguida comuma fase de alimentação de alta concentração. As duasfermentações produziram altas concentrações de biomas-sa, entretanto a fase de lote de alta concentração mos-trou níveis de expressão de colagenase relativamentebaixos. A fermentação de lote de baixa concentraçãomostrou níveis muito elevados de expressão de colagena-se (-280 mg/l); entretanto, esta cultura também produ-ziu quantidades significativas da protease de contami-nação, clostripain.
Muito embora a fermentação de lote de bai-xa concentração proporcionasse resultados muito bonscom relação à expressão das colagenases, a solução dealimentação de extrato de fermento e fitone altamenteconcentrado foi muito difícil de preparar. Realizaram-se duas fermentações adicionais, a primeira foi uma re-petição da fermentação de lote de alimentação eficazanterior, a segunda tinha uma composição de meio de fa-se de lote de concentração levemente mais alta com umasolução de alimentação concentrada mais baixa. As duasfermentações conseguiram concentrações de biomassa si-milares e mostraram o mesmo perfil de expressão da co-lagenase e clostripain. A quantidade de colagenaseproduzida foi novamente avaliada em aproximadamente 280mg/l nas duas fermentações. Entretanto, estas fermen-tações produziram quantidades significativas da clos-tripain protease de contaminação.
Uma seleção de fontes de nitrogênio alter-nativas foi avaliada quanto à sua capacidade de substi-tuir o peptona fitone usado na estratégia de fermenta-ção de lote de alimentação. 0 C. histolyticum cresceuextremamente bem nas peptonas vegetais alcançando den-sidades ópticas (600nm) de 4 a 5 unidades. Entretanto,análise SDS-PAGE destas fermentações não mostrou ex-pressão seja de colagenase ou de clostripaina. Devidoao crescimento de células luxuriante observado nestaspeptonas pensou-se que a concentração de fonte de ni-trogênio foi excessivamente alta resultando em uma ini-bição da expressão de protease. Realizou-se portantoum segundo conjunto de fermentações utilizando-se aspeptonas alternativas a 50 g/l em uma estratégia de lo-te. Quando as fermentações foram analisadas por SDS-PAGE não se observou novamente qualquer expressão decolagenase ou clostripaina. Uma fermentação de lote dealimentação utilizando-se peptona de fitone foi suple-mentada com três aminoácidos, glutamina, triptofan easparagina. Estes aminoácidos foram identificados comopresentes em quantidades menores no meio não-animal. Operfil de crescimento da fermentação foi muito seme-lhante àquele da fermentação de lote de alimentação semsuplementação de aminoácidos. A análise de SDS-PAGEmostrou um rendimento assemelhado de colagenase, mas umnível levemente menor de clostripaina. O ensaio declostripaina mostrou atividade reduzida no amino suple-mentado quando comparado à fermentação de lote de ali-mentação de controle. A redução na atividade de clos-tripaina embora ainda significativa não foi tão grandequanto a diferença entre meio animal e não-animal.
A avaliação da etapa de recuperação prin-cipal das colagenases utilizando-se precipitação desulfato de amônio foi realizada em filtrados de 0,2jamdos sobrenadantes de fermentação bruta. 0 objetivo foiajudar a aumentar o rendimento de colagenase e ideal-mente diminuir a quantidade de clostripaina que foi e-fetuada através do processo. Inicialmente avaliaram-seconcentrações de sulfato de amônio de 100 - 400g/l.Sulfato de amônio a 400g/l resultou em recuperação sig-nificativa de colagenase. Um outro estudo foi realiza-do com uma faixa mais elevada de sulfato de amônio (400- 520g/l). Adicionalmente, também se investigaram oefeito da diminuição do pH para 6,0 e a oxigenação domeio antes da precipitação. Não foi observada qualquerdiferença seja na quantidade das colagenases ou clos-tripaina recuperados a partir do sobrenadante sob qual-quer destas condições. A pelota gerada a partir de400g/l sulfato de amônio foi a mais fácil de voltar acolocar em suspensão.
O estudo para comparar as duas variedadesde C. histolyticum (004 e 013) mostrou que a produtivi-dade das colagenases a partir dos meios derivados deanimal foi mais baixa do que aquela dos meios derivadosde não-animal ótimos. A análise de SDS-PAGE, sustenta-da por um ensaio enzimático para atividade de clostri-paina, salientou que houve quantidades significativa-mente mais baixas de clostripaina no material produzidoa partir de meios derivados de animal do que dos meiosnão-animais. Isto ressaltou o fato de que a matéria-prima produzida a partir dos meios de fermentação deri-vados de não-animal foi um material de matéria-primasignificativamente diferente da fermentação que utilizameios derivados de animais com relação â produção deproteases de contaminação.
1° Conjunto de fermentações de lote alimentado - DCFT24
Os resultados provenientes do trabalho de desenvolvi-mento de processo mostraram que o uso de um meio enri-quecido (100g/l peptona fitone e 50g/l de extrato defermento) resultou na expressão de quantidades mais e-levadas de colagenases comparadas ao meio original(50g/l peptona fitone e 8,5g/l de extrato de fermento).Além disso, pareceu inicialmente que ele reduziu asquantidades de clostripaina produzidas.
Realizaram-se então duas fermentações de 5 1. Em pri-meiro lugar, a estratégia consistiu de uma fase de lotelongo/fase de lote alimentado curto, enquanto a segundaconsistiu de uma fase de lote Curto/fase de lote ali-mentado longo. Nas duas estratégias ao final da fer-mentação (depois de 2Oh) as concentrações de peptonafitone e de extrato de fermento foram de 100g/l e de50g/l, respectivamente, como no caso das fermentaçõesde lotes. As Tabelas 1 e 2 detalham as receitas demeios e as estratégias usadas.
Tabela 1 - Receita de meios e estratégia de lote ali-mentado<table>table see original document page 65</column></row><table>
Tabela 2 Receita de meios e estratégia de lote alimentado<table>table see original document page 66</column></row><table>
A Figura 1 mostra as curvas de crescimento(OD60Onm versus tempo) a partir das duas fermentações,enquanto que a Figura 2 mostra as curvas de crescimentoliquido OD60Onm versus tempo). Observou-se que as célu-Ias provenientes da primeira fermentação cresceram mui-to rápidas e alcançaram o seu OD máximo depois de apro-ximadamente 10 horas. Isto ocorreu devido ao fato deque os meios na fase de lote eram muito ricos. Durantea fase de lote-alimentado, as células não apresentaramcrescimento. Os valores OD diminuíram um pouco, o quepoderia ser, em parte, atribuído ao fato de que as cé-lulas foram tingidas e ao efeito de diluição da alimen-tação no fermentador.
Para a segunda fermentação, a fase de lotealimentado foi iniciada depois de 6 horas. Neste pon-to, o valor de OD poderia ser baixo, como sugerido pelacurva de crescimento na Figura 1. As células continua-ram a crescer lentamente até aproximadamente 18 horas.
Observou-se que as curvas de crescimentolíquido na Figura 2 sugeriram que as densidades de cé-lulas na fermentação DCFT24b, foram mais altas do quena fermentação DCFT24a. 0 OD600nm do meio antes da ino-culação foi de, aproximadamente, 1,7, enquanto que emDCFT24b foi de, aproximadamente, 0,4. Estas diferençassão devido ao fato de quando os fermentos são submeti-dos a autoclave, é formado um precipitado. Para aDCFT24a, formaram-se quantidades mais elevadas em com-paração com a DCFT24b.
Géis SDS PAGE:
Realizou-se a análise de SDS PAGE (8% Tris - géis deGlicina) das amostras de sobrenadantes para cada umadas duas fermentações. Os géis estão expostos nas Fi-guras 3 e 4. Um gel SDS PAGE semi-quantitativo tambémfoi produzido para a amostra do ponto de colheita dasegunda fermentação.
A análise de gel SDS PAGE na Figura 4 in-dicou que foram expressadas pequeníssimas quantidadesda colagenase. Isto poderia ser devido ao fato de queas células cresceram muito rapidamente durante a fasede lote e como um resultado a concentração de célulasmáxima foi alcançada depois de, aproximadamente, 10 ho-ras. Em contraste, observou-se nível muito alto de ex-pressão de colagenase na segunda fermentação, provavel-mente devido ao fato de que as células cresceram maislentamente durante a fase de lote curto e continuou acrescer durante a fase de lote-alimentado. Deste modo,a invenção refere-se a um método de fermentação aper-feiçoado para C.his, em que o crescimento celular élento e controlado durante a fase de lote curto e con-tinuando a crescer durante a fase de lote-alimentado.
O crescimento lento é definido como significando que avelocidade de crescimento durante a fase de lote curtonão resulta em uma concentração celular máxima antes dafase de lote-alimentado, tal como dentro de cerca de 10horas do início do processo de fermentação. Em umaconcretização preferida, a velocidade de crescimento éaproximadamente aquela que resultou do segundo ciclo dafermentação descrito neste contexto.
Produtividades de colagenase estimadas apartir do gel SDS PAGE semi-quantitativo no ponto decolheita do segundo ciclo de fermentação (Figura 5) ,foram de 132mg/l para colagenase ABC I e de 158 mg/lpara colagenase ABC II. Comparando-se estes valorescom aqueles obtidos anteriormente, existe um aumentode, aproximadamente, 3 vezes mais em níveis de expres-são usando-se uma estratégia lote-alimentado.
A etapa seguinte consistiu em desempenharum conjunto adicional de fermentações de lotes-alimentados usando-se estratégias e meios de lotes-alimentados levemente modificados. 0 objetivo foi o deaperfeiçoar a condição de escalação e a robustez doprocesso de fermentação.
A receita dos meios para essa fermentaçãofoi a mesma que exposta anteriormente, com a exceção deque a fitona peptona e o extrato de fermento na fase delote foram esterilizados por filtro em vez de seremsubmetidos na autoclave. Isto foi realizado com a fi-nalidade de evitar o tratamento em autoclave do extratode fermento e fitona peptona, que conseguem alterar,potencialmente, suas composições por calor e desnatura-ção das proteínas nos meios. Para a fermentaçãoDCFT26b, a quantidade de extrato de fermento e de fito-na peptona alimentaram. Isto foi realizado de forma quea concentração de extrato de fermento e peptona na ali-mentação foi menor do que aquela em DCFT26a e destaforma mais fácil de preparar e de esterilizar por fil-tro. Para ambas as fermentações, a estratégia seguidafoi a mesma, uma fase de lote em 6h seguida por uma fa-se de lote-alimentado em 14h. As Tabelas 3 e 4 apre-sentam as receitas dos meios, enquanto que a Figura 6 éa estratégia usada para as duas fermentações.
Tabela 3 Receita de meios e estratégia de lotes-alimentados para DCFT26a.
<table>table see original document page 70</column></row><table>Tabela 4 Receita de meios e estratégias de lotes-alimentados para DCFT26b
<table>table see original document page 71</column></row><table>A Figura 7 mostra as curvas de crescimento(OD60Onm versus tempo) a partir das duas fermentações,considerando-se que a Figura 8 mostra as curvas decrescimento líquido (OD600nm versus tempo, líquido) .
As curvas de crescimento para DCFT26a eDCFT26b foram muito semelhantes àquelas de DCFT24b i-lustradas na Figura 2. As células cresceram lentamen-tee durante a fase de batelada alimentada e alcançaramum OD600nm líquido final de aproximadamente 3,5.
Géis SDS PAGE de amostras de fermentação:
A análise SDS PAGE (8% tri-géis glicina)da amostra do sobrenadante foi realizada para cada umadas duas fermentações (Figura 9 e Figura 10) . Alémdisto, afim de se ter uma melhor estimativa da quanti-dade da colagenase, realizou-se uma análise SDS PAGEsemi-quantitativa para a amostra no ponto de colheitado DCFT26a (Figura 11) e DCFT26b (Figura 12).
Nas duas fermentações, os níveis de cola-genase foram similares àqueles em DCFT24b (Figura 3) .O gel SDS PAGE semi-quantitativo mostra que se obtive-ram níveis muito semelhantes a DCFT24b (entre 280 mg/laté 300 mg/l de colagenase total) foram obtidos para asduas, DCFT26a e DCFT26b. O ponto de colheita do ciclode fermentação de DCFT26a (Figura 11) foi de -142 mg/lpara colagenase I e ~132 mg/l para colagenase II. Oponto de colheita do ciclo de fermentação do DCFT26b(Figura 12) foi de ~147 mg/l para colagenase I e de-158 mg/l para colagenase II. Os níveis de clostripai-na, assim como no caso de DCFT24b, ainda foram altos.
Estudo da etapa de precipitação do sulfato de amônio:
Os resultados a partir destas fermentaçõesindicaram que, muito embora os níveis de colagenasefossem altos utilizando-se a estratégia de lote-alimentado, os níveis de clostripaina ainda foram, tam-bém, significativamente altos. Por este motivo, um es-tudo de pequena escala experimental foi estabelecidopara investigar o efeito da concentração do sulfato deamônio nas quantidades de clostripaina e colagenase re-cuperadas na pílula precipitada a partir do sobrenadan-te de fermentação filtrado.
A fim de se avaliar a eficiência na etapade precipitação do sulfato de amônio, colheram-se 6 a-mostras de 100ml de sobrenadante a partir da fermenta-ção DCFT26a. Estas amostras foram precipitadas com 6concentrações diferentes de sulfato de amônio como de-talhado na tabela a seguir. As pílulas foram re-suspensas em 3,3 ml de WFI e dialisadas contra 100mM deK2HPO4 (pH 6,7) .
Tabela 5 Concentrações de sulfato de amônio que foramutilizadas para precipitar 100ml de amostrasde sobrenadante a partir de DCFT26a.
<table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table>
As amostras pós-dialisadas foram então analisadas poruma análise por análise SDS PAGE.
A Figura 13: amostra de ponto de colheita pós-diálisadaprecipitada com 15% e 22,5%.
A Figura 14: amostra de ponto de colheita pós-dialisadaprecipitado com 30% e 37,5%.
A Figura 15: amostra de ponto de colheita pós-dialisadaprecipitado com 45% e 60%.
Os géis mostram que no caso onde o sulfatode amônio utilizado estava entre 15% a 45% de satura-ção, os níveis de colagenase nas amostras pós-dialisadas foram muito baixos. A recuperação nestescasos pareceu ser menor do que 5%.
No caso onde se utilizou 60% de saturaçãode sulfato de amônio (400 g/l) os níveis de colagenasena amostra pós-dializada foram muito altos (Figura 15).Por comparação da intensidade das bandas (amostra ver-sus referências), pode estimar-se que, aproximadamente,70 mg/l para cada uma das colagenases estavam presentesnas amostras pós-dialisadas. Isto sugere uma recupera-ção de cerca de 50 a 60%, uma vez que de acordo com ogel semi-quantitativo para a DCFT26a (Figura 11) , hou-ve, aproximadamente, 130 mg/l de cada uma das colagena-ses na amostra no ponto de colheita.
Deste modo, a invenção refere-se ao uso dereceitas de meios (naturalmente, as quantidades aquiexpostas são aproximadas) expostas anteriormente emDCFT26b e o uso de sulfato de amônio para precipitarcolagenase, em que cerca de 400 g/litro de sulfato deamônio é adicionado ao meio que contém colagenase.
3° conjunto de fermentações de lotes-alimentados
Neste caso, o objetivo principal foi ava-liar a capacidade de reprodução da estratégia de lotealimentado. Realizou-se uma fermentação de Iote-alimentado a qual foi uma fermentação replicada deDCFT26L·. Além disto, o sulfato de amônio/etapas deprecipitação foram investigados com maiores detalhes,comparados ao estudo em pequena escala anterior. Maisespecificamente, o objetivo foi examinar o efeito devárias concentrações de sulfato de amônio, a partir de60% (400g/l) até 80% (530g/l) na recuperação de colage-nases e clostripaina nas amostras pós-precipitadas /di-alisadas. Além disto, dois métodos de tratamento dasamostras de sobrenadantes colhidas também foram avalia-dos; isto é, mediante modificação do pH e oxigenando-seos meios.Curva de crescimento:
Os meios e a estratégia de lote-alimentadousada foram, exatamente, os mesmos como para DCFT26b.A Figura 16 mostra a curva de crescimento (OD60Onm versustempo) e a curva de crescimento líquido (OD600nm líquidoversus tempo) a partir da fermentação. A curva decrescimento foi bastante similar àquela de DCFT26b, in-dicando a boa reprodutibilidade do processo.
A análise SDS PAGE (8% de géis Tris - Gli-cina) das amostras de sobrenadantes obtidas durante to-da a fermentação indicou que os níveis de colagenases ede clostripaina foram muito similares àqueles deDCFT26b (o gel SDS PAGE não mostrado). Uma análise degel SDS PAGE semi-quantitativa (8% tri-glicina) foi e-xaminada para a amostra no ponto de colheita (Figura17). O gel sugere que há mais do que 120 mg/l de cadauma das colagenases presentes, similares aos níveis ob-servados para DCFT26b.
Precipitação por sulfato de amônio de amostras de fer-mentação colhidas:
Afim de se avaliar a eficiência da etapade precipitação de sulfato de amônio, foram colhidas 7amostras de sobrenadante de 500 ml. Estas foram preci-pitadas usando-se os seis métodos seguintes.
Em todos os casos, as pílulas foram re-suspensas em 16,5 ml de WFI e dialisadas contra 100mMde K2HPO4 (pH 6,7), com exceção do método 4, onde aspílulas foram re-suspensas em 16,5 ml de uma solução deIOOmM de K2HPO4 (pH 6) e dialisadas contra o mesmo tam-pão. Os géis SDS PAGE foram, então, examinados, afimde se avaliar a quantidade de colagenases nas amostraspós-dialisadas e avaliar a recuperação das etapas deprecipitação/diálise.
Os métodos para diálise/precipitação seguidos foram osseguintes:
1 Precipitação com 400g/l de sulfato de amônio adicio-nado todo de uma vez só na amostra de sobrenadante.Dialise contra uma solução de IOOmM de K2HPO4, pH6,7.
2 Precipitação com 4 00g/l de sulfato de amônio adicio-nado lentamente (em torno de 3 0 minutos) dentro daamostra de sobrenadante. Diálise contra uma solu-ção de IOOmM de K2HPO4, pH 6,7.
3 Precipitação com 400g/l de sulfato de amônio adicio-nado lentamente (em torno de 30 minutos) dentro daamostra de sobrenadante, a qual foi pré-oxigenada.Isto foi feito por oxigenação, durante aproximada-mente 10 minutos, de 5OOml de cultura de célulascolhidas a partir do aparelho de fermentação. Acultura foi então esterilizada por filtro. A pílu-la formada após a precipitação por sulfato de amô-nio, foi dialisada contra uma solução de IOOmM deK2HPO4 de pH 6,7.
4 Precipitação com 4 00g/l de sulfato de amônio adicio-nado lentamente (em torno de 30 minutos) dentro daamostra de sobrenadante, do qual o pH foi modifica-do para pH 6,0 pela adição de HCl 5N. A pílulaformada em seguida foi dialisada contra uma soluçãode 100 mM de K2HPO4 de pH 6,0.
5 Precipitação com 400g/l de sulfato de amônio, adi-cionado lentamente (em torno de 30 minutos) , dentroda amostra de sobrenadante. A diálise foi feitacontra uma solução de 100 mM de K2HPO4, pH 6,7.
6 Precipitação com 480g/l de sulfato de amônio adicio-nado todo ele de uma vez só na amostra de sobrena-dantes. Diálise contra uma solução de 100 mM deK2HPO4, pH 6,7.
7 Precipitação com 520g/l de sulfato de amônio, adi-cionado lentamente (em torno de 30 minutos) , dentroda amostra de sobrenadante. A diálise foi feitacontra uma solução de 100 mM de K2HPO4, pH 6,7.
O sulfato de amônio não se dissolve com-pletamente quando adicionado nas amostras em 480 g/l e520g/l de sobrenadantes; no entanto, o mesmo dissolveu-se completamente quando adicionado a 400g/l e 440g/l.
Os resultados a partir de SDS PAGE indica-ram que os diferentes níveis de sulfato de amônio usa-dos para a etapa de precipitação (400g/l, 440g/l,480g/l, 520g/l) ou os métodos usados (oxigenação, alte-ração de pH) não pareceram ter um efeito óbvio nasquantidades de colagenases presentes nas amostras pós-dialisadas. Em todos os casos, a concentração de cadalima das colagenases nas amostras pós-dilalisadas foivariável entre 50mg/l e 60mg/l. A Figura 18a mostra umgel SDS PAGE representativo, tal como aquele da amostrapós-dialisada precipitada com 400g/l de sulfato de amô-nio. Uma vez que todos os géis foram muito semelhantesos outros géis SDS PAGE não foram apresentados nesterelatório.
Levando-se em consideração as concentra-ções de colagenases estimadas na amostra de ponto decolheita (Figura 17) e nas amostras pós-diálisadas, arecuperação da colagenase após as etapas de precipita-ção / diálise foi de, aproximadamente, 50%. Afim deinvestigar se o valor de 50% de recuperação foi preci-so, uma vez que o erro na estimativa da concentração decolagenase por gel SDS é de uma maneira geral elevado,realizaram-se os seguintes géis de SDS PAGE.
• Um ensaio de gel SDS PAGE de todas os sobrenadan-tes após a centrifugação de amostras precipitadasde sulfato de amônio (Figura 18a). O objetivo foiavaliar se qualquer quantidade de colagenase éperdido dentro do sobrenadante.
• Um ensaio de gel SDS PAGE no qual amostras de so-brenadantes no ponto de colheita e amostras preci-pitadas de sulfato de amônio pós-diálise (400g/l)foram, apropriadamente, diluídas para conter quan-tidades iguais de colagenases e carregado no mesmogel (Figura 19).
• Um ensaio de gel SDS PAGE no qual amostras de so-brenadantes no ponto de colheita e amostras desulfato de amônio (520g/l) pós-diálise foram, a-propriadamente, diluídas para conter quantidadesiguais de colagenases e carregado no mesmogel(Figura 20).
Neste caso pode-se verificar, a partir da Figura 18b,que as quantidades de colagenases presentes nos sobre-nadantes após a centrifugação das amostras de precipi-tado de sulfato de amônio foram muito baixas. Na Figu-ra 19 e na Figura 20 que as quantidades de colagenasesapós as etapas de precipitação/ diálises apareceram sermuito similares tais quais no sobrenadante da amostrade colheita. Por esse motivo, semelhantemente, o valorde recuperação que foi descrito por comparação dos en-saios semi-quantitativos de géis SDS PAGE das amostrasde sobrenadantes/pós-diálises foi, atualmente, alto.
Experiências de fermentação Benchmarking com derivadosanimais TSB/Proteose:
Realizaram-se fermentações das variedadesde C. histolyticum 013 e 004 nos meios que continhamderivados de animais. O objetivo foi o de comparar avariedade 013 em relação à variedade 004 e avaliar oefeito dos componentes de animais nas células de cres-cimento, expressão de colagenase e nos níveis de agen-tes de contaminação.
C. histolyticum 013:
As variedades liofilisadas foram re-constituídas no PBS e nas placas e em placas de ágar deTBS/Proteose (30g/l TSB, 10g/l peptona proteose, 12g/lde ágar). As placas foram incubadas em uma jarra anae-róbica na presença de um gás anaeróbico acondicionado.Colônias individuais foram colhidas e usadas para ino-cular meios de 5ml TSB/proteose. Após 15 horas de in-cubação a 3 7°C, o OD600nm da cultura foi de aproximada-mente 1,0 unidade. Misturaram-se então 5 ml das cultu-ras com 1 ml de estéril e depositados sob temperaturasabaixo de -70°C.
Fermentações PBFT58
Curvas de crescimento:
Realizaram-se duas fermentações de lotesde 5 1, PBFT 58c (variedade 004) e PBFT58d (variedade013). A Tabela 6 expõe a receita dos meios deTSB/proteose usados. A Figura 21 mostra as curvas decrescimento obtidas (OD60Onm líquido versus tempo).
Tabela 6 Receita de meios para TSB/Proteose
<table>table see original document page 81</column></row><table>Observou-se a partir da Figura 21 que avariedade 013 cresceu para um OD mais alto do que a va-riedade 004. Nos dois casos, entretanto, o OD600nm finalfoi mais alto do que 2,5, indicando que os meios deri-vados de animais suportaram um bom crescimento para asduas variedades.
Observou-se ainda que a variedade 013 con-tinuou a crescer lentamente até ao ponto de colheita(2 0 horas), ao passo que a variedade 004 cresceu até umOD60Onm líquido de aproximadamente 2,7 e então parou decrescer. Comparado às fermentações de lote alimentadoapresentadas anteriormente, utilizando os meios deriva-dos de não-animais, o OD final obtido mediante utiliza-ção dos meios de TSB/proteose derivados de animais foimais baixo.
Análise SDS PAGE:
Os géis SDS PAGE (8% géis Tri-Glicina) deamostras de sobrenadantes coletadas através das fermen-tações são expostos nas Figuras 22 e 23.
Não foi observada qualquer clostripainanos sobrenadantes de fermentação, especialmente no casoda variedade 013. Isto constituiu-se numa descobertamuito importante uma vez conseguiria explicar o fato deque o agente iniciador pode não ter tido resultados outeve resultados reduzidos durante a purificação das co-lagenases. Em contraste, problemas significativos coma degradação das colagenases foram anteriormente expe-rimentado durante o processo de purificação. Isto po-deria ser parcialmente atribuído à presença de clostri-paina na fermentação.
A fim de obter-se uma melhor estimativa daquantidade de colagenases presentes nas fermentações,realizou-se um ensaio de gel SDS PAGE semi-quantitativopara as amostras do ponto de colheita (Figura 24 e Fi-gura 25). Os géis sugerem que foi produzida quantidademais baixa de colagenases nas fermentações de lotes comos meios TSB/Proteose (PBFT58c) comparados à fermenta-ção de lote-alimentado com os meios vegetais (PBFT57).Isto poderia ser atribuído ao fato que densidades maisaltas de células foram obtidas no último caso (OD600nm ~4 para OD600nm ~ 2,7) . A Tabela 7 resume os resultados apartir dos ensaios de géis semi-quantitativos.
Tabela 7. Resultados a partir de géis SDS PAGE semi-quantitativos para PBFT57 e PBFT58c,d
<table>table see original document page 83</column></row><table>
Precipitação por sulfato de amônio de amostras colhidasa partir da fermentação:
Para cada fermentação, 2 amostras de 5OOmldo ponto de colheita foram precipitadas cora 4 00g/l(60%) e 520g/l (80%) de sulfato de amônio. As pílulasforam re-suspensas em 16,5ml de WFI e submetidas a diá-lise contra tuna solução de IOOmM de (pH 6,7). Reali-zou-se então a análise de SDS PAGE (géis de Tri-Glicinaa 8%) de amostras pós-dialisadas (Figura 26 e Figura27) .
Os resultados a partir destes géis indica-ram que os níveis de clostripaina, mesmo nas amostraspós-dialisadas muito concentradas (faixas 6 e 7 das Fi-guras 26 e 27) foram extremamente baixos. Isto estámais evidenciado no caso de variedade 013 comparada àvariedade 004.
Desta forma, a invenção refere-se às com-posições de colagenase que estão isentas de clostripai-na, tais como aquelas produzidas pelos processos defermentação descritos neste contexto.Medição da atividade da clostripaina:
A fim de investigar adicionalmente a fun-ção da clostripaina, estabeleceu-se um ensaio enzimáti-co foi estabelecido para medir a atividade da clostri-paina das amostras pós-dialisadas. Usou-se o métodoexposto em seguida:
Ensaio enzimático de clostripaina:
clostripaina
BAEE + H2O -► N-a-Benzoíla-L-Arginina + Etanol
BAEE = Ester etílico do aminoácido N-a-Benzoíla-L-Arginina
Condições:
T = 25°C, pH = 7,6, A25Snm, Curso da luz = 1 cmMétodo: Determinação da taxa espectrofotométrica conti-nua.
Definição única: Uma unidade hidrolisará 1,0 /xmol deBAEE por minuto no pH 7,6 a 25°C, na presença de 2,5 mMDTT.
Análise de amostras pós-dialisadas quanto a atividadede clostripaina:
Usou-se o ensaio de atividade de clostri-paina para analisar as amostras pós-dialisadas a partirdas fermentações com o TSB/Proteose (PBFT58) e a fer-mentação de lote alimentado baseada em vegetais(PBFT57). A Tabela 8 resume os resultados.
Os resultados demonstram que a atividadede clostripaina estava muito baixa no caso das fermen-tações de TSB/Proteose. Em contraste, a atividade declostripaina no caso dos lotes-alimentados PBFT58 foimuito alta.
Tabela 8 Atividade enzimática das amostras pós-dialisadas<table>table see original document page 86</column></row><table>
* Atividade de Clostripaina determinada emamostras pós-precipitadas/dialisadas
Investigação de peptonas alternativas
Experiências de peneiração em balões de vidro com agi-tador :
Neste trabalho, várias peptonas de vege-tais foram usadas como alternativas para a peptona fi-tona. O objetivo foi avaliar seus efeitos nos níveisde extração de colagenases e clostripaina. Todas aspeptonas testadas são derivadas de fontes vegetais esão comercializadas pela Sigma.
O procedimento experimental usado estádescrito na Figura 28. As receitas dos meios estão de-talhadas na Tabela 9, ao passo que uma lista de pepto-nas usadas estão expostas na Tabela 10. Um balão devidro de agitação de controle também foi conduzido,contendo peptona fitona. Em todos os casos, 50g/l deextrato de fermento e 100g/l de cada peptona foram usa-dos em um esforço para imitar as concentrações destescomponentes no ponto de colheita da fermentação de Io-te-alimentado desenvolvida (vide Tabela 4) .
Tabela 9 Composição dos meios usados na experiênciado balão de vidro com agitação. Todos os meios foramesterilizados por filtro.
<table>table see original document page 87</column></row><table>
Os balões de vidro com agitação foram in-cubados durante 18 horas. As culturas foram analisadasquanto a OD60Onme contagens de células viáveis. As cul-turas foram filtradas e os sobrenadantes analisados porSDS PAGE. Os resultados provenientes das medições deOD60Onm e contagens de células viáveis estão resumidasna Tabela 10.
A maior parte das peptonas de vegetais re-sultaram em valores de OD líquido mais altos comparadosà fitona peptona. Entretanto, os valores de OD não re-lacionaram as contagens de células viáveis. Isto pode-ria ser parcialmente atribuído à variabilidade do méto-do de contagem de células viáveis ou devido ao fato deque as células já tinham começado a fase de Iise antesdo ponto de colheita pré-selecionado (18 horas).
Interessantemente, a análise de gel SDSPAGE indicou que não houve expressão de colagenase (gelnao ilustrado) em todos os balões de vidro, incluindo odo controle (fitona peptona). Uma possível razão paraisto poderia ser o fato de que as concentrações da fi-tona peptona e do extrato de fermento usados foram mui-to altas e como um resultado, eles reprimiram a expres-são de colagenase.
Tabela 10 Resultados provenientes da Ia experiênciade peneiramento
<table>table see original document page 88</column></row><table><table>table see original document page 89</column></row><table>
Fermentações de lote-alimentado usando peptonas alter-nativas - DCFT27a,b:
Com base na informação a partir das expe-riências anteriores do balão de vidro com agitação, on-de não se observou de extração de colagenase, decidiu-se avaliar as peptonas alternativas usando-se a estra-tégia de lote-alimentado desenvolvido.
Realizaram-se duas fermentações de lote-alimentado, DCFT27a (extrato vegetal 2) e DCFT27b (hi-drolisado de vegetal 2). Nas duas fermentações, utili-zou-se a estratégia de lote-alimentado que tinha sidodesenvolvida para os meios que continham fitona pepto-na. A Tabela 11 descreve as receitas de meios, ao pas-so que a Figura 29 mostra a estratégia usada.
Tabela 11 Receita de meios para fermentações de lote-alimentado DCFT27a e DCFT27b<table>table see original document page 90</column></row><table>
Curvas de crescimento:
As curvas de crescimento (OD60Onm líquido versus tempo)para DCeFT27a e DCFT27b foram representadas na Figura30. Nas duas fermentações, as células obtiveram umcrescimento OD600nm ligeiramente elevado, comparadas aosmeios que continham fitonas peptonas (fermentaçãoPBFT57, Figura 16). Isto estava de acordo com as con-tagens de células viáveis (aproximadamente 2 χ IO9CFU/ml para DCFT27a,b comparadas a 1,5 χ IO9 CFU/ml pa-ra PBFT57).
Géis de SDS PAGE
Da mesma forma que nas experiências de a-gitação do balão de vidro, a análise de SDS PAGE indi-cou que não houve expressão de colagenase nas duasDCFT27a DCFT27b (géis não mostrados).
Isto poderia ser atribuído ao fato de queos meios, que consistem de altas quantidades de pepto-na, suportam a expressão de colagenases quando é usadaa fitona peptona, mas é demasiado rica quando é usadauma peptona alternativa e assim reprime a expressão dequalquer metabólito, incluindo a colagenase e a clos-tripaína. Parece que as células experimentam condiçõesde crescimento luxurioso nos meios que contêm as pepto-nas alternativas e não precisam de produzir quaisquerproteases.
Fermentações de lotes usando-se peptonas alternativas -PBFT59a,b,C:
Os resultados a partir das fermentações delotes-alimentados DCFT27a e DCFT27b, levaram à tarefaadicional de investigar três peptonas alternativas adi-cionais, usando-se, entretanto, concentrações mais bai-xas do que aquelas usadas anteriormente.
Conduziram-se três fermentações de lotesde 5 1, PBFT59a (triptona vegetal), PBFT59b (extratovegetal) e PBFT59c (extrato vegetal no.l). As fermen-tações foram colhidas depois de 18 horas.
Todas as petponas foram usadas nas concen-trações de 50g/l num esforço de simular a concentraçãoda peptona de proteose em meios animais (Proteose /Peptona) e a concentração de fitona peptona, que foiusada anteriormente. A receita dos meios está ilustra-da na Tabela 12.
Tabela 12 Receita de meios e estratégia de fermenta-ção para as fermentações de 5 1 PBFT59a,b,c
<table>table see original document page 92</column></row><table>
Curvas de crescimento:
As curvas de crescimento obtidas a partirdas fermentações PBFT59a,b,c estão representadas na Fi-gura 31. Em todos os casos as células obtiveram umcrescimento OD600nm mais baixo (entre 1,8 e 2,8) em com-paração com as fermentações de lote-alimentado DCFT27.Isto também estava de acordo com as contagens de célu-las viáveis (entre 0,7 χ 109 CFU/ml a 1,2 χ 109 CFU/mlpara as fermentações PBFT59a,b,c comparadas a 2 χ 109CFU/ml para DCFT27a,b) . Nos meios que continham trip-tonas, as células demonstraram a velocidade de cresci-mento lento mais lenta e conseguiram a densidade da cé-lula mais baixa depois de 18 horas.
Géis SDS PAGE:
Da mesma forma que para a experiência do balão de vidrocom agitador e as fermentações de lote alimentado DCFT27a,b não se verificouqualquer expressão de colagenase nos géis SDS PAGE (géis não ilustrados).
Estes resultados mostram que as peptonas alternativas, muitoembora elas suportem o crescimento de células, elas não permitem a expressão decolagenases. Tal como sugerido anteriormente, isto poderia ser devido ao fato deque estas peptonas são muito ricas em nutrientes, por exemplo, aminoácidos li-vres, pequenos peptídeos.
4° conjunto de fermentações de lote alimentadoDCFT27d
Uma vez que os resultados provenientes das experiências u-sando as peptonas vegetais alternativas não tiveram êxito, o objetivo seguinte des-te trabalho foi investigar a possibilidade de diminuir os níveis de clostripaina nafermentação de lote alimentado desenvolvida utilizando-se os meios de peptonafitona. Tal como descrito anteriormente, a clostripaina foi provavelmente a cau-sadora da degradação de colagenases durante o processoo de purificação.
Realizou-se uma fermentação de lote alimentado utilizando-seos meios de peptona fitona padrão suplementados com três aminoácidos, isto é,glutamina, triptofan e asparagina. Esta fermentação foi realizada quando as con-centrações destes aminoácidos particulares foram mais baixas na peptona fitonacomparadas com os meios de SB/Proteose de animal, com base na composição deaminoácido destes componentes, proporcionada pelos fabricantes.
O objetivo neste caso foi investigar se a condição destes amo-noácidos poderia reduzir qualquer limitação de nutriente que possa ser um fator decontribuição para a expressão de clostripaina. A receita de meios está ilustrada naTabela 13. A estratégia de fermentação usada foi a estratégia de batelada alimen-tada padrão usada para as fermentações DCFT26 e PBFT57 (vide a Figura 6).Tabela 13 Receita de meios para fermentação de lotealimentado DCFT27d<table>table see original document page 95</column></row><table>
Curva de crescimento:
A curva de crescimento obtida a partir da fermentaçãoDCFT27d está ilustrada na Figura 32. O perfil de crescimento obtido foi muitosemelhante àquele obtido para a fermentação de lote alimentado padrão na ausên-cia de aminoácidos (DCFT26b e PBFT57) ilustrados anteriormente.
Gel SDS PAGE:
A Figura 33a mostra o gel SDS PAGE das amostras sobrena-dantes coletadas durante a fermentação. O nível de colagenases é semelhante à-quele observado para a fermentação de lote alimentado padrão (vide A Figura 10para gel SDS PAGE proveniente de DCFT26b). Muito embora a clostripaina ain-da esteja presente na fermentação, parece que o seu nível foi mais baixo do queaquele em DCFT26b.
A fim de investigar isto melhor, a atividade da clostripaina daamostra de ponto de colheita pós-dialisada foi estimada utilizando-se o ensaio deatividade de clostripaina. Além disso, estimou-se igualmente a atividade de clos-tripaina da amostra de ponto de colheita pós-dialisada tomada a partir do lote deliofilização de 21. Uma vez que este lote particular foi purificado sem mostrardegradação de colagenase significtiva, o conhecimento desta atividade de clostri-paina seria elucidativa. A Tabela 14 resume as atividades enzimáticas das amos-tras pós-dialisadas. Ela também inclui as atividades enzimáticas para a fermenta-ção de lote alimentado padrão PBFT57 e a peptona TSB/Proteose de animal apre-sentada na Tabela 8, para propósitos comparativos.
Tabela 14 Atividades enzimáticas de amostras pós-dialisadas<table>table see original document page 97</column></row><table>
Os resultados provenientes de DCFT27d in-dicam que a adição dos aminoácidos reduz a atividade declostripaina produzida pela variedade. A relação declostripaina para colagenase é aproximadamente quatrovezes mais baixa na fermentação suplementada por amino-ácidos em comparação com a fermentação de controle delote alimentado. A relação de clostripaina para cola-genase na fermentação derivada de animal foi dez vezesmais baixa do que a fermentação de lote alimentado su-plementada por aminoácido. É possível que a redução deatividade de clostripaina possa resultar em reduçãosignificativa na degradação de colagenases durante apurificação.Realizou-se uma série de fermentações de 51 para avaliar diversas estratégias de lote alimentado.As estratégias foram avaliadas com base no seu rendi-mento de colagenase, quantidade de contaminantes e con-dição de escalagem. Com base nestes resultados identi-ficou- se uma estratégia de lote alimentado óptimo queresultou em uma produtividade total de colagenases deaproximadamente 280 mg/l. A estratégia de fermentaçãofoi modificada ao aumentar-se ligeiramente a concentra-ção de meios de batelada e reduzindo-se e concentraçãode meios de batelada alimentada para aperfeiçoar a suacondição de escalagem. Esta mudança na estratégia defermentação não teve efeito na produtividade ou níveisde contaminantes.
0 segundo objetivo foi o de otimizar a e-tapa de recuperação principal das colagenases. A oti-mização desta etapa envolveu aperfeiçoamento no rendi-mento da etapa de processoo ou uma redução na quantida-de de contaminantes recuperados ou um aumento na condi-ção de escalagem. Avaliou-se uma faixa de concentra-ções de sulfato de amônio de 100 até 520 g/l. O efeitodo abaixamento do pH para 6,0 e oxigenação dos meiostambém foram avaliados. Todas as concentrações de sul-fato de amônio abaixo de 4 00g/l mostraram recuperaçõesde colagenase muito baixas. Não foi observada qualquerdiferença quanto à recuperação de colagenase ou declostripaina em qualquer uma das concentrações de sul-fato de amônio entre 400 e 520 g/l. A pelota proveni-ente da precipitaação de 400 g/l foi a mais fácil detornar a suspender e esta concentração portanto defini-da como o nível ótimo.
Uma experiência de marcação de referênciafoi realizada a fim de determiner e comparar o cresci-mento e produção de colagenases e clostripaina em vimmeio derivado de animal com variedades de C. histolyti-cum 013 e 004. A receita de meios derivados de animalfoi obtida a partir dos meios de fermentação de Proces-soo 1 utilizando-se TSB e protease peptona. Esta expe-riência também permitiu uma comparação da variedade 004desenvolvida em meios de animal e não-animal. Os re-sultados provenientes da análise SDS-PAGE mostraram quequantidades muito mais baixas de clostripaina a partirde C. histolyticum desenvolveram-se nos meios derivadosde animal. Estes resultados foram confirmados utili-zando-se um ensaio enzimático para atividade de clos-tripaina. 0 ensaio demonstrou uma redução significati-va na atividade de clostripaina em fermentações utili-zando-se os meios derivados de animais. Quando se com-pararam as duas variedades a 004 mostrou uma atividadede clostripaina mais alta do que a 013.
Avaliaram-se seleções de fontes de nitro-gênio alternativas quanto à sua capacidade de substitu-irem a peptona fitona na estratégia de fermentação porlote alimentado. Estas peptonas foram Vegetal ExtractNo.2 (Sigma, 49869) e Vegetal Hydrolysate No. 2 (Sigma,07436). A C. histolyticum cresceu extremamente bem naspeptonas vegetais, alcançando densidades ópticas(600nm) de 4 a 5 unidades. Análise SDS-PAGE destasfermentações não mostrou expressão de colagenase nem declostripaina. Devido ao crescimento luxuriante de cé-lulas observado nestas peptonas, pensou-se que a con-centração de fonte de nitrogêno complexo foi demasiada-mente alta, resultando em uma inibição de expressão deprotease. Um segundo conjunto fermentações foi portan-to realizado utilizando-se as peptonas alternativas sob50 g/l em uma estratégia de lote. Utilizaram-se Vege-tal Tryptone (Sigma, 16922), Vegetal Extract (Sigma,05138) e Vegetal Extract No. 1 (Sigma, 04316) comopeptonas alternativas para estas experiências. Quandoas fermentações foram analisadas por SDS-PAGE não seobservou expressão de colagenase ou de clostripaina. Afermentação de lote alimentado utilizando-se peptonafitona foi suplementada com três aminoácidos, glutami-na, triptofan e asparagina. Estes aminoácidos foramidentificados como estando presentes em quantidadesmais baixas nos meios não-animais. 0 perfil de cresci-mento da fermentação foi muito semelhante àquele dafermentação de lote alimentado sem suplementação de a-minoácido. A análise por SDS-PAGE mostrou um rendimen-to assemelhado de colagenase, porém um nível de clos-tripaina levemente mais baixo. 0 ensaio de clostripai-na mostrou atividade reduzida no amino suplementadoquando comparado à fermentação de lote alimentado decontrole. A redução na atividade de clostripaina embo-ra ainda significativa não foi tão grande quanto a di-ferença entre meios de animais e não animais.Materiais e Métodos:
Meios de inóculo para fermentações utilizando-se meiosvegetais
Durante todo este trabalho de desenvolvi-mento utilizam-se as seguintes receitas para os meiosde inóculo.
Meios de Inóculo - Vegetais
<table>table see original document page 101</column></row><table>
Os meios foram esterilizados por filtro
Procedimento de inoculação
Um frasco proveniente do banco de célulasinterno foi descongelado e usaram-se 0,025 ml para ino-cular ate 5 ml dos meios de inóculo em um 30 ml univer-sal. A cultura de 5 ml foi incubada a 37°C em um vasoanaeróbio na presença de geradores de gás anaeróbio.Depois de aproximadamente 13 até 15 horas de incubação,utilizaram-se 4 ml da cultura para inocular 200ml dosmeios de inõculo em um balão de vidro de 500 ml. Comoanteriormente, o balão de vidro foi colocado em um vasoanaeróbio na presença de geradores de gás anaeróbio.Depois de aproximadamente 13 até 15 horas de incubaçãoa 37°C e 75rpm, todo o conteúdo do balão de vidro foiusado para inocular o fermentador.
O pH e a temperature dos fermentadores fo-ram controlados a 7,0 e 37°C, respectivamente. A velo-cidade do fluxo de nitrogênio foi ajustada a 1 li-tro/min (~ 0, 2wm) e a velocidade do agitador foi de100 rpm. O fermentador foi submetido a amostragem aintervalos de tempo regulares para medições OD60Onm econtagens de células viáveis. As amostras foram fil-tradas através de um filtro de 0,22pm. Os filtradosforam armazenados a -2O0C e foram congelados a -20°Cdurante a análise SDS-PAGE. A Figura 33b ilustra umdiagrama esqumático do procedimento de inoculação.
Uma receita preferida para a fermentaçãode lote alimentado encontra-se expósa em seguida.
<table>table see original document page 102</column></row><table><formula>formula see original document page 103</formula>
É igualmente desejável alimentar ainda maiso processoo de fermentação sem prejudicar a qualidadeou o rendimento dos produtos de colagenase. Desta for-ma, a invenção refere-se ainda a um processoo de lotealimentado de aproximadamente 200 litros tal como des-crito no fluxograma da Figura 33c.
Método de contagem de células viáveis
Amostras coletadas a partir dos balões devidro com agitadores foram diluídas por um fator de 10"4 até 107 e chapeadas em placas de ágar TB. As placasforam incubadas a 37°C durante aproximadamente 48 horasem um Vaso Genbox. Utilizou-se um Pacote Gerador deGás Anaeróbio a fim de criar condições anaeróbias den-tro do Vaso. 0 número de colônias foi então contado.
Precipitação de Sulfato de Amônio:
Materiais: Centrífuga Sorvall EvolutionProdutos químicos: Sulfato de Amônio, classee GPR (BDH)
Amostras de sobrenadante (100 ml até 500ml) foram filtradas através de um filtro de 0,22pm. Nadependência da experiência adicionaram-se várias quan-tidades de sulfato de amônio (a partir de 15% até 80%de saturação). A solução foi misturada lentamente emum agitador magnético durante aproximadamente 15 minu-tos, até todo o sulfato de amônio ter sido dissolvido.Ela foi então mantida sem misturar durante -3,5 horas a+2-8 C. Em seguida à etapa de retenção, formou-se umaquantidade significativa de precipitado. A solução foientão centrifugada a 7.200 χ g durante 20 minutos a40C. 0 sobrenadante foi decantado e a pelota armazena-da a -20°C.
DiáliseMateriais: IOkDa MWCO SnakeSkin Diálise Tubing (68100,Pierce)
Agitasdor Magnético
Produtos químicos: Potassium Dihydrogen OrthophosphateAnalaR (BDH)
Água para Injeção (WFI)
As pelotas obtidas a partir de uma amostrade 100 ml de sulfato de amônio foram re-suspensas em3,3 ml de WFI. A pelota reconstituída foi transferidapara uma tubulação de diálise IOkDa MWCO SnakeSkin pré-umedecida e dialisada contra IOOmM de K2HPO4 (pH 6,7)durante -12 até 16 horas a 2-8°C. A WFI foi então tro-cada e a diálise prosseguiu durante 2 até 4 horas. 0material dialisado foi recuperado e o volume determina-do. A amostra pós-dialisada foi armazenada a -20°C.
Análise SDS-PAGE (géis de Tris-Glicina a 8%)
Materiais: Xcell SureLock Mini-Cell
Produtos químicos:
SDS-PAGE Standards de Akto Peso Molecular (161-0303,Bio Rad)
Géis de Tris-Glicina a 8% Novex, l,5mm, 10 well(EC6OI8BOX, Invitrogen)
Géis de Tris-Glicina a 8% Novex, l,5mm, 15 well(EC60185BOX, Invitrogen)
Novex Tris-Glicina SDS Tampão Ativo (IOx) (LC2675, In-vitrogen)
Novex Tris-Glicina SDS Tampão Amostra (2x) (LC2676, In-vitrogen)Agente Redutor de Amostra NuPAGE (IOx) (NP0009, Invi-trogen)
Kit de Coloração Collodial Blue (LC6025, Invitrogen)
Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetra-acético Analar R (BDH)
As amostras foram preparadas para redução de SDS-PAGEpela adição de 10μΙL de amostra a ΙΟμΙ de tampão de amostra (2x), 2,5μ1 de agenteredutor (IOx) e 2μL de O,IM EDTA (para conseguir concentração final de 10mM). O marcador de alto peso molecular (HMW) foi preparado pela adição de 10μL de estoque concentrado a 80μL de agente redutor (10x)5 310μL WFI e 400μLtampão de amostra (2x). O padrão HMW diluído foi então aquecido a 95°C du-rante 5 minutos antes de formação de alíquota e armazenamento a -20°C para ouso nos géis subseqüentes. Amostras (15μL) contendo colagenases foram passa-das diretamente (isto é, sem tratamento térmico prévio) em géis de Tris-Glicina a8% utilizando-se tampão ativo de Tris-Glicina a 130V durante ~1 hora e 50 minu-tos. Depois de eletroforese, os géis foram coloridos com reagente de coloração deazul colloidal conforme instruções do fabricante.
Processoo de Purificação
Sumário de método para processoo de purificação de 5 1:
Etapa 1. Precipitação de sulfato de amônio de meios decultura sobrenadantes (proteína secretada).Reconstituição e diálise em fosfato de potás-sio 0, 1M fosfato de potássio, arginina 0,1MpH 6,7.
Etapa 2. Cromatografia de Hidroxiapatita (na presençade 200μΜ leupeptinaa)
Eluição com 0-100% gradiente de 0,264 M fos-fato de potássio pH 6,7 sobre 4 CV.Picos de eluição póserior de 2 grupamentosforam A280 > A26O, carga direta em TMAE
Etapa 3. Permuta iônica de Fractogel TMAE (na presençade 200μΜ leupeptinaa)
Remoção de ácido nucléico (também pode serusado vim filtro Pall Mustang Q)Coleta e agrupamento de fluxo passante solto.
Etapa 4. Diálise em 10 mM Tris pH 8,0
Etapa 5. Permuta iônica de Q Sepharose HP (na presençade 200μΜ leupeptinaa)
Separa AUXI em relação a AUXIIEluição com 0-40% gradiente de IOmM Tris, 3mMCaCl2, 36OmM NaCl pH 8,0 sobre 20 CV2 picos coletados: Pico 1 = AUXII
Pico 2 = AUXIArginina adicionada a OfIM para frações quecontêm AUXI e AUXII
Etapa 6. Agrupamentos de AUXI e AUXII concentradas porcélula sob agitação pressurizada
Etapa 7. Filtração de Gel Superdex 75Remoção de clostripaina e gelatinase a partirde AUXI e AUXII
AUXI e AUXII fluem individualmente em colunasseparadas.
Amostras carregadas a 5% CV
Tampão: IOmM Tris, 3mM CaCl2, 150mM NaCl,0,IM Arginina pH8
0 AUXI e AUXII são reunidos e concentradosindividualmente, diafiltrados em água e entãoreunidos para formarem o produto medicamento-so final.
Detalhes de coluna:
Tabela 15. Especificações de Coluna para processoo de 5 1
<table>table see original document page 108</column></row><table>
Tamponamento de Coluna
• Colunas foram tamponadas conforme instruções dofabricante onde foi possível.• Coluna TMAE - não foram encontrados problemas.
• Q Sepharose e Superdex 75 - encontradas dificulda-des no tamponamento para corrigir a pressão devidoà dimensão da coluna. Entretanto7 as colunas pu-deram ser operadas sob a pressão recomendada.
• HA - acondicionado como uma pasta fluida a 50% erun at IOml/min.
Rendimentos / recuperações a partir do processoo de 51:
Tabela 16: Purificação a partir de precipitado de ASpara Q-Sepharose IEX
Rendimentos da etapa de cromatografia emnegrito
<table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table>
Tabela 17: Purificação a partir de Q-Sepharose IEXpara pós-Superdex 75 GPC.
<table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table>
Os rendimentos a partir de um processoo de 5 litros sãoaproximadamente 60-75mg cada de ABCI e ABCIIPara o escalonamento, na dependência da fermentação,poderão ser esperados rendimentos de 250-3OOmg para 20Ie 2500-300Omg para 200 litros.
Etapas de Cromatografia Individual de processoo de es-cala de 5 1:
Cromatografia de Hidroxiapatita
<table>table see original document page 111</column></row><table>
A Figura 34 mostra um cromatograma depoisde hidroxiapatita com uma carga de 1,0 mg/l média, emque ocorre uma perda considerável de resolução e degra-dação de objetivo.Troca aniônica de Fractogel TMAE
Dimensão de coluna: 58ml em XK26/20 (IOcm altura deleito)
Tampão A: IOmM Fosfato de Potássio, 0, 2M
NaCl, 200μΜ leupeptinaa, pH 6,7Tampão B: IOmM Fosfato de Potássio, 2M Na-l, pH 6,7
Amostra: ~650ml @ 0,5mg/ml (em Fosfato de potás-sio pH6.7, direto a partir da coluna deHA) carregada a ~5,5mg/ml médiaTaxa de fluxo: 8,8 ml/min
Eluição: (100% B para eluir ácido nucléico)
A Figura 35 ilustra um cromatograma depoisde troca aniônica de Fractogel TMAE. A fração soltaagrupou-se proporcionar ~650ml a 0,5mg/ml. Dialisadaem IOmM Tris sob pH 8.
A Figura 36 mostra um gel SDS-PAGE de ma-terial Pré HA, Pós HA e Pós TMAE proveniente do proces-soo de proporção de 5 1. 0 gel é colorido com azul co-loidal.
Troca aniônica de Q Sepharose HP com gradiente de elui-ção original
Dimensão de coluna: IOOml em XK50/20 (5,Ocm altura deleito)
Tampão A: IOmM Trisf 3mM CaCl2, 200μΜ leupeptina,pH 8,0Tampão Β: IOmM Tris, 3mM CaCl2, 36OmM NaCl, 200μΜ leu-peptina, ρΗ 8,0
Amostra: ~650ml a 0,5mg/ml (in IOmM Tris, pH 8,0 +200μΜ leupeptina) carregada a ~3,0 mg/mlmédia
Taxa de fluxo: 18,0 ml/min
Eluição: 0-40% B sobre 20 CV
A Figura 37 ilustra um cromatograma depoisde troca aniônica de Q Sepharose HP com gradiente deeluição original. Arginina é adicionada a 0,1M a fra-ções que contêm ABCI e ABCII. A fração de Pico 1 (AB-CII) agrupou-se para proporcionar ~220ml a 0,55mg/mlque foi concentrado por células agitadas para propor-cionar ~45ml a 2,8 mg/ml. As frações de Pico 2 (ABCI,excluindo projeção de gelatinase) agruparam-se paraproporcionarem ~190ml a 0,45 mg/ml, que foi concentradopor células agitadas para proporcionar ~42ml a 2 mg/ml.
A Figura 38 mostra um gel SDS-PAGE de cro-matografia de Q Sepharose IEX de material pós TMAE exe-cutada na presença de leupeptina para Pico 1 (ABCII) .0 gel é colorido com azul coloidal.
A Figura 39 mostra a SDS-PAGE gel de Q Se-pharose IEX cromatografia de pós TMAE material executa-da na presença de leupeptina para o Pico 2 (ABCI) . 0gel é colorido com azul coloidal.
Troca aniônica de Q Sepharose HP com gradiente modifi-cado
Teste de pequena proporção de adição deNaCl ao Tampão A e utilizando-se um gradiente mais im-pregnado/mais rápido. A amostra foi proveniente de umprocessoo de 1/3 5 1, pós TMAE, previamente congelado(-20°C) .
Dimensão de coluna: 1ml
Tampão A: 10mM Tris, 3OmM NaCl, 3mM CaCl2, 200μΜleupeptina, pH 8,0
Tampão B: 10mM Tris, 3mM CaCl2, 36OmM NaCl, 200μΜleupeptina, pH 8,0
Amostra: 3mg pós TMAEf pós diálise em 10mM Tris,3OmM NaCl, 200μΜ leupeptina, pH 8,0.Carregado a 3 mg/ml média
Gradiente: 0-25% B sobre 2CV, 25% B para 2CV, 25-40% B sobre 7,5CV
A Figura 40 ilustra um cromatograma depoisde troca aniônica de Q Sepharose HP com gradiente deeluição modificado. Observou-se boa separação de ABCIe ABCII. A segunda parte do gradiente pode ser propor-cionada mais íngreme para aguçar o pico de ABCI. O a-perfeiçoamento do pico também pode ser proporcionadoutilizando-se 5ml CV carregado a 3 e lOmg/ml em média.
Cromatografia por Permeação de Gel Superdex 75 de ABCII(Pico 1 a partir de IEX)
Dimensão de coluna: 880ml em XK50/60 (54cm altura deleito)
Tampão: 10mM Tris, 3mM CaCl2, 150mM NaCl,0,IM arginina, pH 8,0
Amostra: ~44ml (5% CV) a 2,5mg/ml (em IOmMTris, 3mM CaCl2, ~60mM NaCl, O, IMarginina, pH 8,0)
Taxa de fluxo: 8,8 ml/min
A Figura 41 ilustra um cromatograma depoisde cromatografia por permeação de gel superdex 75 deABCII (Pico 1 a partir de IEX) . Pico agrupado paraproporcionar ~60ml ABC II a l,2mg/ml.
A Figura 42 mostra um gel SDS-PAGE de cro-matograf ia por permeação de gel superdex 75 de ABC IIconcentrado, executado na presença de arginina. O gelé colorido com azul coloidal.
Cromatografia por Permeação de Gel Superdex 75 de ABCI(Pico 2 a partir de IEX):
Dimensão de coluna: 88Oml in XK50/60 (54cm altura deleito)
Tampão: IOmM Tris, 3mM CaCl2, 15OmM NaCli0,IM arginina, pH 8,0
Amostra: ~42ml (5% CV) a 2, Omg/ml (em IOmMTrisf 3mM CaCl2, ~60mM NaCl, 0,1Marginina, pH 8,0)
Taxa de fluxo: 8,8 ml/min
A Figura 43 ilustra um cromatograma depoisde cromatograf ia por permeação de gel superdex 75 deABCI (Pico 2 a partir de IEX). Pico agrupado para pro-porcionar ~60ml ABC I a 1,1 mg/ml.
A Figura 44 mostra um gel SDS-PAGE de cro-matograf ia por permeação de gel superdex 75 de ABC Iconcentrado, executado na presença de arginina. 0 gelé colorido com azul coloidal.
Dimensionamento de coluna aumentadaTabela 18
<table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table>
* Tipo de coluna e altura de leito resultante a ser a-inda otimizada. Voliimes médios são aumentos lineares apartir da escala de 5 1.
A Figura 44b ilustra um fluxograma de pro-cessoo de purificação de 5 1.Ainda em outras concretizações da inven-ção, as etapas de diálise do processoo de purificaçãodescrito anteriormente podem ser substituídas com ope-rações de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) utilizan-do-se diálise e as células agitadas serão substituídaspor TFF, filtração de fluxo tangencial. A etapa TMAEdiscutida anteriormente é opcional.
A invenção inclui os produtos de colagena-se que são produzidos pelos (ou que podem ser produzi-dos pelos) processoos de purificação expostos retro.Tais produtos de colagenase possuem graus de alta pure-za excepcionais e atividade enzimática retida. Por e-xemplo, as composições são isentas de clostripaina (porexemplo, possuem níveis insignificantes ou não detectá-veis de clostripaina).
Otimização do Processoo de Manufatura;
Com a finalidade de suportar estudos clí-nicos e proporcionar um processoo em escala comercial,completou-se a otimização do processoo de manufaturadesenvolvido anteriormente. As alterações de processooencontram-se descritas sucintamente adiante e estão sa-lientadas na Tabela 19.Tabela 19: Sumário das Alterações de Processoo entreBTC (Processoo 1) e Suprimentos Auxiliares (Processoos2 e 3)
<table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table>Otimização de Fermentação
Realizou-se a remoção dos materiais brutosderivados de bovinos a partir do banco de células ori-ginais e o processoo de fermentação. A variedade 004de Clostridium histolyticum foi propagada para o usocomo o banco de células mestras baseadas na viabilidadede passagem requerida para aumentar. As especificaçõese os resultados analíticos para o banco de células mes-tras encontram-se expostos na Tabela 20. A fim de au-mentar-se a biomassa e a produção de colagenase, desen-volveu-se a estratégia de fermentação de lote alimenta-do utilizando-se materiais brutos isentos de animal nomeio de crescimento, em uma proporção de fermentação de20 litros. Observou-se que o aumento de fermentaçãoadicional para 200 litros requereu o uso de um compo-nente de meios derivados porcinos (isto é, ProteosePeptona #3, infra) para assegurar o crescimento de cé-lulas compatível, a expressão de colagenase, e um per-fil de impureza aperfeiçoado. Realizaram-se alteraçõessubseqüentes para poder aumentar-se o rendimento e apureza de colagenase sobre o processoo a jusante. Es-tas alterações incluem a adição de novas estratégias deseparação e filtragem, bem como o aumento do equipamen-to de produção para poder suportar a proporção de fer-mentação de lote de 200 litros. A Figura 45 ilustra umfluxograma da fermentação para o processoo 3.Tabela 20: Especificações Analíticas e Resultados deTestes para Banco de Células Mestras
<table>table see original document page 124</column></row><table>Recuperação Primária e Otimização de Purificação
Desenvolvimento adicional para otimizar arecuperação primária e processoo de purificação a ju-sante está sendo empreendida. Substituição da precipi-tação de sulfato de amônio com cromatografia de sub co-luna de fluxo rápido de fenil sefarose para captar ascolagenases foi implementada para aperfeiçoar os rendi-mentos, eliminar o uso de sulfato de amônio de bulk am-monium sulfate e para aperfeiçoar o processoamento as-séptico.
Com relação à purificação, implementou-seo filtro Pall Mustang Q para liberação de DNA residuale impurezas para aumentar o rendimento e simplificar asérie de processoos de produção e requisitos de valida-ção. Os parâmetros de operação de Quaternary Amine Se-pharose High Performance (Q HP) foram otimizados parase eliminar a etapa de Cromatografia de Permeação deGel (GPC). Adicionalmente às alterações de processoocitadas anteriormente, a formulação de substância medi-camentosa foi modificada de maneira a incluir 10 mMTris, 60 mM Sacarina, pH 8,0, aperfeiçoando tanto a so-lubilidade do produto substância medicamentosa quanto aestabilidade do produto medicamentoso.
0 processoo de otimização ocorreu em doisestágios. 0 processoo inicial (Processo 2) utiliza ummeio isento de animal para todos os estágios de bancode células e fermentação, com a fermentação de lote a-limentado executada na proporção de 20 litros. 0 pro-cesso a jusante foi adaptado a partir do Processo 1 pa-ra incluir filtragem Mustang Q para remoção de DNA re-sidual e Superdex 75 GPC para liberação de contaminan-tes de células hospedeiras adicionais. Leupeptina tam-bém foi adicionada aos sistemas tampão de cromatografiapara impedir degradação proteolítica. 0 material doProcesso 2 foi ligado analiticamente com o material doProcesso 1 (Tabela 2IA), e foi testado em um estudopré-clínico lado a lado salientado neste contexto. Omaterial do Processo 2 foi proposto para o uso no está-gio anterior do programa clínico da Fase 3. As especi-ficações para os intermediaries do Processo 2 e a subs-tância medicamentosa estão detalhadas nas Tabelas 22 e23, respectivamente. Processo, formulação e desenvol-vimento de liofilização ulteriores proporcionaram umprocesso de manufatura otimizado (Processo 3) . Estasalterações incluem a adição de novas estratégias de se-paração e filtragem, bem como aumentar o equipamento deprodução para suportar a escala de fermentação de lotede 200 litros conforme salientado na Tabela 19. A Fi-gura 46 ilustra um fluxograma da purificação para oProcesso 3.
Declaração de dose: 0 ensaio de potência in vitro ini-cial foi um ensaio de colagenase bovina e não diferen-ciou a colagenase dos tipos I e II. Este ensaio foiutilizado para o material usado somente em estudos clí-nicos, DUPYl01 e DUPY 202, de rótulo aberto, com a dosede 0,58 mg resultando tipicamente em uma potência de10.000 Unidades. A análise do material do Processo 1utilizando os ensaios de potência in vitro serparadosatuais para colagenase do tipo I e colagensase do tipoII tipicamente resulta em 1.700 até 3.500 Unidades/dose(0,58 mg dose) para a colagenase do tipo I e 43.000 até69.000 Unidades/dose (0,58 mg dose) para a colagenasedo tipo II. A análise do material do Processo 2 queutilize os ensaios de potência in vitro atuais confir-mou que valores de potência relativa similares compara-dos ao material do Processo 1 são tipicamente consegui-dos .
Demonstração de comparabilidade analítica entre o Pro-cesso Ieo Processo 2: A fim de corroborar as altera-ções entre o Processo Ieo Processo 2, dados de compa-rabilidade foram apresentados na forma de teste de li-beração e caracterização analítica. Estes dados estãoexpostos na Tabela 21.
Comparação dos intermediários, descritoscomo AUX-I e AUX-II, e substância medicamentosa a par-tir do processo anterior (Processo 1; Referência) comum processo da invenção (Processo 2). Esta comparaçãoanalítica mostra que o material manufaturado a partirdo Processo 2 é comparável àquele preparado com o Pro-cesso 1 (Tabela 21). Em particular, a identidade, po-tência e pureza entre estes materiais são comparáveis.
0 nível de pureza dos intermediários doProcesso 2 está ilustrado na Figura 47, vim gel coloridoSDS-PAGE Coomasie reduzido. 0 gel mostra uma únicabanda para cada intermediário, corri nenhumas outras ban-das menores evidentes. AUX-I tem uma MW aparente de115 kDa e compara-se com a referência (ABC I), enquantoAUX-II tem uma MW aparente de 110 kDa e compara-se coma referência (ABC II). A Figura 48 mostra um gel colo-rido por SDS-PAGE Coomasie reduzido, mostrando substân-cia medicamentosa. Como acontece com os intermediá-rios, a substância medicamentosa manufaturada pelo Pro-cesso 2 compar-se com a referência (Processo 1) . Umgel SDS-PAGE com coloração de prata está ilustrado naFigura 49 substanciando ainda o nível de alta pureza dasubstância medicamentosa do Processo 2. Em resumo, oteste de liberação e caracterização analítica para osintermediários (AUX-I e AUX-II) e substância medicamen-tosa manufaturada utilizando-se o Processo 2 demonstramclaramente a comparabilidade com os materiais do Pro-cesso 1 (Referência). Adicionalmente, realizou-se tes-te de liberação adicional no material do Processo 2 eestá listado na Tabela 21B. Concluindo, a comparaçãoanalítica direta entre os materiais do Processo 1 e doProcesso 2 (Tabela 21) , e o intermediário adicional eteste de liberação (Tabela 22) indica que o material doProcesso 2 é adequado para o uso em estudos humanos.As Tabelas 23 e 24 proporcionam a listagem ainda dasespecificações analíticas resultantes do processo demanufatura do Processo 2.
Tabela 21: Comparabilidade analítica entre intermediá-rios e substância medicamentosa (Processo 1) e Auxilium(Processo 2).
<table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table>
* Processo 1 especificações preliminaries não incluídasneste caso
**Substância medicamentosa não disponível para estestestes, suprimentos limitados à mão
***seqüência N-terminal completada para AUX-I (idênticoà referência), mas requerido maior desenvolvimento paraAUX-II uma vez que N-término parece estar bloqueado.
Tabela 22: Resultados analíticos para intermediários deProcesso 2 e substância medicamentosa
<table>table see original document page 132</column></row><table>
*0 resultado está no LOQ do método de DNA residual an-terior
Tabela 23: Especificações Analíticas para Intermediá-rios AUX-I e AUX-II de Processo 2<table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table>
*Testes requeridos para liberação provisória de inter-mediários para manufatura ulterior
Tabela 24: Especificações Analíticas para Substânciamedicamentosa do Processo 2
<table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table>
Testes requeridos para liberação provisória deSubstância Medicamentosa para manufatura ulterior
EXPERIMENTAL DETALHADO PARA PROCESSO 3:PROCESSO DE FERMENTAÇÃO 3:
O processo de fermentação utilizando-sePeptona fitona empregado durante o Processo 2 mostrouuma variabilidade significativa durante os suprimentospara desenvolvimento de DSP e manufatura de GMP.
Durante trabalho anterior uma ProteosePeptona derivada de animal tinha mostrado suportar ocrescimento de C. histolyticum muito bem. A cultura deProteose Peptona derivada de animal produziu significa-tivamente menos clostripaina do que aquela observadadurante o Processo 2 e expressou AUXI e AUXII sob umarelação de 1:1. Como um resultado uma peptona derivadade animal aceitável reguladora, Proteose Peptona #3proveniente de Becton Dickinson (PP3), foi avaliada emfermentadores de 5 1. A comparação inicial com o pro-cesso baseado em fitona existente (Processo 2) mostrouque o uso de PP3 em 50g/l gerou uma alta concentraçãode biomassa com uma taxa de rápido crescimento exponen-cial. A fermentação resultou em um rendimento de pro-duto mais elevado de >350mg/l total de colagenase, opo-sed aos ~230mg/l provenientes do Processo 2 (por análi-se SDS-PAGE semi quantitativa). Outras fermentaçõesutilizando-se PP3 demonstraram que significativamentemenos clostripaina foi produzida utilizando-se o meiode fermentação derivado de animal. As primeiras trêsfermentações (utilizando-se um lote de PP3) demonstra-ram perfis de crescimento muito compatíveis. Quando oproduto foi analisado por SDS-PAGE o rendimento e pure-za da colagenase mostraram ser bastante reproduzíveisentre as três fermentações.
Para fornecer o DSP com material para de-senvolvimento de processo conduziram-se várias fermen-tações utilizando-se PP3. Para este material de supri-mento utilizaeam-se três lotes de PP3 diferentes. Ob-servou -se que quando dois destes lotes foram usados osperfis de crescimento dos cultivos não foram coerentescom as fermentações de PP3 anteriores e demonstraramvariabilidade no perfil de crescimento entre as fermen-tações. Uma investigação em pequena escala mostrou quevariabilidade de lote para lote nas PP3 causaram estavariação. 0 estudo em pequena escala também demonstrouque um aumento na concentração de PP3 para 100g/l iriaimpedir esta variação.
Realizaram-se duas fermentações de 5 1 com100g/l de PP3 utilizando-se dois lotes da peptona, umque resultou no perfil de crescimento típico e um quenão o fez (tal como demonstrado durante a experiênciaem escala reduzida). A experiência mostrou que o au-mento na concentração assegurou que as duas fermenta-ções com diferentes lotes de PP3 fossem capazes de serreproduzidas. Os perfis de crescimento foram altamentesemelhantes e o produto foi extraído sob rendimento epureza assmelehados.
0 processo de fermentação otimizado utili-zando 100g/l PP3 foi finalmente escalado para 200 1. 0perfil de crescimento de 200 1 foi muito semelhante à-quele observado na escala de 5 1. A análise SDS-PAGEdo filtrado de fermentação mostrou um alto rendimento apartir da fermentação de 200 1, ~320mg/l total de cola-genase (por análise de densitometria quantitativa). Apureza do produto de colagenase (pós fermentação) foisemelhante na proporção tanto de 5 1 quanto de 200 1.Processaram-se 20 1 do filtrado da fermentação de 200 1pelo grupo DSP para representar um aumento parcial parao processo a jusante (infra).
O processo de fermentação de Proteose Pep-tona #3 (Processo 3) gerou colagenase com um rendimentomais alto e com menos clostripaina do que o processo defitona existente. Em lOOg/1, a PP3 mostrou proporcio-nar cultivos de C. histolyticum com uma curva de cres-cimento capaz de ser reproduzida, apesar de utilizarvários lotes de PP3. Tanto o rendimento quanto a pure-za da colagenase também mostraram ser reproduziveisquando se utilizam vários lotes de PP3.
Avaliação de Peptona de Proteose #3 como um materialbruto para a produção de colagenase a partir de Clos-tridivaa histolyticum.
Devido à variabilidade observada nas fer-mentações utilizando-se peptona fitona como uma fontede nitrogênio complexa, avaliou-se a adequabilidade daProteose Peptona #3 (Becton Dickinson, 21223 0) (PP3) emfermentações de 5 1. Utilizou-se uma estratégia de Io-te simples com 50g/l de PP3. A composição media exatapode ser encontrada na seção de materiais e métodos.
A Figura 51 compara a curva de crescimentode fermentação de 50g/l PP3 (uma concentração mais bai-xa do que a concentração de fitona no Processo 2) com afermentação de lote alimentado de fitona. O cultivo dePP3 demonstra uma velocidade de crescimento específicomuito rápido durante o crescimento exponencial antes deingressar na fase estacionária aproximadamente 8 horasdepois da inoculação. A fermentação de PP3 alcançouuma densidade óptica máxima (600 nm) de 4,7 unidades.A cultura foi deixada durante um período de mais 12 ho-ras na fase estacionária para monitorar a forma-ção/degradação de produto.
A Figura 52 mostra a análise SDS-PAGE se-mi-quantitativa da concentração dos produtos de colage-nase a partir do ponto de 20 horas do cultivo de PP3.A Figura 53 mostra a mesma the same análise para o pro-cesso de lote alimentado de fitona. Pode ser observadoque a fermentação de PP3 gera mais produto do que oprocesso baseado em fitona (um aumento de 23 0 mg/l até360mg/l total de colagenase, com base na análise semi-quantitativa nas Figuras 52 e 53) . A cultura de PP3também extraiu AUXI e AUXII em uma relação de 1:1, en-quanto o Processo 2 produziu as duas proteínas numaproporção de 1:1,6.
Reprodutibilidade de fermentação de lote de ProteosePeptona #3.
A reprodutibilidade do processo de lote dePP3 foi ainda examinada utilizando-se o lote # 5354796de Proteose Peptona #3. Todas as três corridas ilus-tradas na Figura 54 demonstram perfis de crescimentocoerente com uma densidade óptica máxima (600nm) de a-proximadamente 4,5 obtida depois de 8 horas.
Análise de SDS-PAGE semi-quantitativa dospontos de colheita da fermentação mostraram que o ren-dimento do total de colagenase era de ~ 350 - 400mg/l.
Investigação na variação entre lotes de Proteose Pepto-na #3.
Trabalho inicial com PP3 tinha demonstradoum processo altamente robusto com um rendimento de pro-duto mais alto e níveis mais baixos da clostripaina deprotease. Quando se empregaram novos lotes de PP3 ob-servou-se que a robustez do processo diminuiu signifi-cativamente com perfil de crescimentos altamente variá-vel. Conduziu-se uma experiência em balão de vidro comagitador para comparar diretamente os três lotes de PP3deste modo usados (lotes 5354796, 5325635 e 5332398).A experiência replicou o processo de inóculo de doisestágios a partir do processo de 5 1, mas substituiu afase de fermentação final com outra cultura de 200 ml.Sabendo-se que este terceiro estágio foi da maior im-portância, como uma variação foi apenas observada noestágio de fermentação final do processo nas experiên-cias anteriores. As densidades (600nm) das culturasforam medidas em cada estágio de transferência e asculturas foram usadas para inocular o estágio seguinte.Prepararam-se meios utilizando-se os três lotes de PP3em 50g/l. Um dos dois lotes que resultou nas concen-trações de biomassa mais baixas de C. histolyticum du-rante as experiências de 5 1 (partida # 53323 98) tambémfoi preparado em 100g/l.
A Figura 59 mostra os resultados a partirda esperiência em pequena escala. Pode ser observadoque as partidas 5325635 e 5332398 mostraram densidadesópticas reduzidas (600nm) no terceiro estágio de apro-ximadamente 2,5 unidades, estas foram consideradas comosendo lotes de PP3 "pobres". A partida 5354796 maintémuma densidade óptica (600nm) de 5 unidades no terceiroestágio de cultivo, isto foi considerado como sendo umlote de PP3 "bom". Sob um aspecto interessante, quandoa concentração de um lote de PP3 (5332398) "pobre" foiaumentada para 100g/l a mesma densidade óptica (600nm)foi conseguida no segundo e terceiro estágio do culti-vo. Estes dados confirmam a teoria de que os desviosno perfil de crescimentos são causados pela variação naquantidade de um nutriente de limitação entre os lotesde PP3. Não foi possível identificar este nutrientepor meio de teste analítico dos lotes de PP3.
Avaliação de Peptona de Proteose #3 em 100g/l na fer-mentação de 5 1
Os resultados do estudo em pequena escalademonstraram que o aumento da concentração de PP3 de 50para 100g/l removeu o problema de variabilidade de lotepara lote. Esta alteração de processo foi testada naproporção de 5 1 utilizando-se a lote de PP3 "bom" e"pobre" (partida 5354796 e 5325635, respectivamente)conforme determinado durante a investigação em pequenaescala na variabilidade de PP3. A Figura 60 mostra theperfil de crescimento das duas fermentações. As duasculturas mostram taxas de crescimento específico iden-ticas durante a fase exponencial. A fermentação entramna fase estacionária e alcançam densidades ópticas má-ximas muito semelhantes (600nm) de aproximadamente 6,5unidades. Estes dados demonstram que o aumento da con-centração de PP3 alivia o problema de variabilidade delote to lote da PP3. Em decorrência da concentração debiomassa mais alta conseguida e fase exponencial maislonga na fermentação, o ponto de colheita foi prolonga-do para 12 horas.
As Figuras 61 e 62 mostram análise de SDS-PAGE das duas fermentações utilizando 100g/l PP3. Osgéis demonstraram expressão de colagenase coerente nasduas fermentações. As amostras provenientes das duasfermentações parecem conter níveis de contaminante si-milares descritos na Figura 56, muito embora PBFT70dpareça conter ligeiramente mais da banda de 40kDa(clostripaina). É possível que estas pequenas diferen-ças sejam devidas às diferenças de coloração ou de car-ga. Novamente, a quantidade de clostripaina produzidautilizando-se o processo de PP3 é significativamentemais baixa do que no processo de Fitona. A banda deprecursor parece persistir mais tempo no decorrer dotempo da fermentação. Foi recomendado que futuras fer-mentações a 100g/l deveriam ser prolongadas para umacolheita de 14 horas.
A presença da banda de precursor ressaltaa importância da definição do ponto de colheita e dasua qualificação durante a validação do processo.
A Figura 63 mostra dados a partir da aná-lise de densitometria do gel na Figura 61. 0 gráficocompara a formação de produto e precursor (área de picode densitometria) ao crescimento de células (OD6OO). Aformação de produto parece ser coerente com o cresci-mento de células e a velocidade de produção diminuiquando o cultivo entra na fase estacionária. A bandade précursor diminui na intensidade quando o crescimen-to exponencial termina, mas ainda está presente no pon-to de colheita da fermentação.
Elevação da £ermentação de 100g/l de Peptona Proteose#3 para 200 1.
Em seguida ao aumento na concentração dePP3 to 100g/l o processo foi aumentado para 200 1. Pa-ra gerar a quantidade de inóculo requerida para o vasode 200 1, introduziu-se um terceiro estágio de inóculoutilizando-se um fermentador de volume operacional de151. Utilizaram-se 3 culturas de 200 ml para inocularo fermentador de 5 1 e em seguida a 12 horas de crêsci-mento, 8 1 dos 15 1 foram inoculados no vaso de 200 1.A Figura 64 compara a curva de crescimento da fermenta-ção de 200 1 às duas fermentações de 5 1 utilizando-se100g/l de PP3. Conforme recomendado, o perfil de cres-cimento foi prolongado para 14 horas para assegurar quea banda de precursor tivesse desaparecido completamenteantes de o processamento começar. 0 perfil de cresci-mento da fermentação de 200 1 é muito semelhante à fer-mentação na proporção de 5 1, demonstrando êxito na e-levação do cultivo.
A Figura 65 mostra análise de SDS-PAGE nodecorrer da fermentação de 200 1. 0 gel mostra a for-mação de produto no decorrer da fermentação. 0 materi-al no ponto de colheita de 14 horas não contém precur-sor detectável e níveis de contaminantes muito baixos.O produto gerado a partir da fermentação de 200 1 pare-ce ser muito semelhante àquele produzido a partir doprocesso de 5 1, indicando que o número de geração au-mentado do processo de 200 1 não teve um efeito preju-dicial. A Figura 66 exibe dados provenientes da análi-se de densitometria do gel na Figura 64. O gráficocompara a formação de produto e precursor (área de picode densitometria) ao crescimento de células (OD6OO). Aformação de produto parece ser coerente com o cresci-mento de células e a velocidade de produção diminuiquando o cultivo entra na fase estacionária. A bandade precursor diminui de intensidade quando o crescimen-to exponencial termina. A banda de precursor diminuide intensidade mais rapidamente na fermentação de 200 1do que no cultivo de 5 1, PBFT70c (Figura 63). A Figu-ra 67 mostra a análise de SDS-PAGE utilizando-se um 4-12% Bis-Tris gel no decorrer da fermentação de 200 1.Os pesos moleculares aproximados dos contaminantes de-tectados estão anotados no gel.
O processo de colheita (clarificação porfiltração) desenvolvido para o Processo 2 foi avaliadodurante a fermentação de elevação de 200 1. A culturade células foi clarificada com êxito utilizando-se oprocesso existente sem bloqueio na série de filtros. Oprocesso de colheita encontra-se descrito na seção ma-teriais e métodos. Processaram-se 20 1 de filtradoproveniente da fermentação de 200 1 por DSP para de-monstrar vima elevação parcial do Processo 3 a jusante(infra) .Quantificação do rendimento de produto por análise dedensitometria
Foi requerido um método mais exato e quan-tificável para se determinar a concentração de produtodurante a etapa de processo a montante, do que a análi-se SDS-PAGE semi-quantitativa (Figuras 62 e 63) . 0filtrado de fermentação tinha uma grande quantidade depigmento e peptídios provenientes do meio de crescimen-to que tornam as técnicas de quantificação de proteínaspadrão, tais como UV e o ensaio de Bradford inutilizá-veis. A análise semi-quantitativa realizada anterior-mente foi modificada e atualizada pela realização deanálise densitométrica dos géis coloridos por Coomassi-e. O método envolveu carregar uma faixa de quantidades(0,2 - 1,2/xg / faixa) de material referência AUXI e AU-XII misturado e diluições da amostra a ser quantificadaem um gel de Tris Glicina. A imagem digitalizada foientão analisada a area de pico estimada para os padrõese as amostras. Uma curva padrão foi então construída(total de colagenase) e usada para quantificar a quan-tidade de colagenase total nas diluições de amostra. AFigura 68 mostra um example da curva padrão de colage-nase e realça a linearidade do método de quantificaçãodentro da gama antecipada das amostras. Os géis deTris Glicina não reduziram completamente AUXI e AUXII,portanto quantificou-se o total de colagenase em vez detentar quantificar separadamente as duas proteínas.
A quantidade de colagenase foi analisadapara PBFT70cf PBFT70d e as fermentações elevadas de 2 001. A quantidade foi encontrada como sendo -280 - 350mg/l total de colagenase para todas as três fermenta-ções .
Materiais e métodos
Preparação de meios:
Preparação de meios 1 1
Os fosfatos para a preparação de inóculo(Tabela 25) foram submetidos a autoclave em uma garrafade 1 1 a 121°C durante 20 minutos. Os meios de carga(Tabela 26) foram inicialmente aquecidos em um micron-das a 60°C para dissolver plenamente os componentes an-tes de submetê-los a autoclave em uma garrafa de 1 1 a121°C durante 20 minutos. 0 PSA 1 (Tabela 27) foi fil-trado através de um filtro 0,2 μπι Sartopore 2 150cm2 emuma garrafa estéril de 250 ml. Os fosfatos 300ml sub-metidos a autoclave, meios de carga 600ml submetidos aautoclave e PSA 1 filtrado estéril 100 ml foram agrupa-dos antes de formação de alíquota em balões de vidro de3Oml universais gama irradiados com (8x5ml) e 500ml Er-lenmeyer (4x200ml).
Tabela 25: Composição de fosfato para preparação de i-nóculo
<table>table see original document page 147</column></row><table>Tabela 26: Composição de meio de carga para preparaçãode inoculo
<table>table see original document page 148</column></row><table>
* Receita de meios incluem PP3 em 50 e lOOg/L.Tabela 27:PSA 1 Composição Magnésio/Glicose para a pre-paração de inóculo.
<table>table see original document page 148</column></row><table>
Preparação de meios de 51
A solução de fosfato para a escala de 5 1(Tabela 29) foi submetida a autoclave em uma garrafa delia 121°C durante 20 minutos. 0 meio de carga (Tabe-la 30) foi adicionado diretamente ao vaso de 5 1 e sub-metido a autoclave a 121°C durante 20 minutos. O PSA 1(Tabela 31) foi filtrado através de um filtro 0,2 μπιSartopore 2 150cm2 em uma garrafa estéril de 500ml. Asolução de fosfato 25Oml e PSA 1 2OOml foi bombeada se-paradamente no vaso de 5 1 vessel na conclusão da su-jeição a autoclave e refrigeração do vaso.
Tabela 29: Composição de fosfato para fermentação 5 1
<table>table see original document page 149</column></row><table>
* Receita de meio inclui PP3 em 50 e 100g/l.
Tabela 31: Composição de PSA 1 Magnésio/Glicose para1 de fermentação
<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table>
Preparação de meios de 15 1
A solução de fosfato (Tabela 33) foi fil-trada através de um filtro 0,2μm Sartopore 2 300cm2 emuma garrafa estéril de 2 1. O meio de carga (Tabela34) foi adicionado diretamente ao vessel de 20 1 antesda esterilização a Steam-In-Place (SIP) do vaso. A PSA1 (Tabela 35) foi filtrada através de um filtro 0,2μmSartopore 2 3OOcm2 em uma garrafa estéril de 1 1. Osfosfatos 75Oml e PSA 1 600ml foram bombeados separada-mente no vaso de 20 1 quando da conclusão de SIP e res-friamento do vaso.
Tabela 33: Composição de fosfato para fermentação 15 1
<table>table see original document page 150</column></row><table>
Tabela 34: Composição de meio de carga para fermentaçãode 15 L<table>table see original document page 151</column></row><table>
Tabela 35: Composição de PSA 1 Magnésio/Glicose para fermentação de 15 1 <table>table see original document page 151</column></row><table>
Preparação de meios de 200 1
A solução de fosfato (Tabela 37) foi fil-trada através de um filtro de 0,2 μπι Sartopore 2 300cm2em uma bolsa Gammasart Biosystem SAIO de 10 1. Os mei-os de carga (Tabela 38) foram adicionados diretamenteao vaso de 200 1 antes da esterilização SIP do vaso. Asolução PSA 1 (Tabela 39) foi filtrada através de umfiltro de 0,2μπι 3OOcm2 em uma bolsa Gammasart BiosystemSAIO de 10 1. Os fosfatos, 10 1 e PSA 1, 8 1, forambombeados separadamente para dentro do vaso de 200 1 naconclusão da SIP e resfriamento do vaso.
Tabela 37: Composição de fosfato para fermentação de200 1
<table>table see original document page 152</column></row><table>
Tabela 38: Composição de meio de carga para fermenta-ção de 200 1
<table>table see original document page 152</column></row><table><table>table see original document page 153</column></row><table>Fermentação
A Figura 69 ilustra vistas gerais dos flu-xos de processo para os processos de fermentação de fi-tona e PP3 na escala de 5 e 200 1.Fermentação de escala de 5 1.
Um frasco da WCB (2005#1019D) foi descon-gelado e usaram-se alíquotas de 50μ1 para binocular8x5ml de meios de inóculo em universais de 30ml gama-irradiados. As culturas de 5ml foram incubadas a 37°Cem um vaso anaeróbio na presença de 3 balas de gás ana-eróbio. Depois de aproximadamente 12 horas de incuba-ção (OD6OO 3,0-4,0) selecionaram-se 2 culturas de 5ml eusaram-se para inocular 2x2OOml de meios de inóculo embalões de vidro Erlenmeyer de 500ml. Os dois balões devidro foram então colocados os dois em um vaso anaeró-bio com 3 balas de gás e foram em seguida incubados a37°C em uma incubadeira com agitação (70 rpm) durante12 horas. Depois de 12 horas de incubação (OD6OO 6,0-7,0) cada inóculo de 200ml foi usado para inocular umvaso de 5 1.
O volume operacional dos vasos de 5/7 1 FTApplikon vessels foi de 5 1, dos quais 4% (v/v) foi i-nóculo proveniente do estágio de 200 ml stage. A velo-cidade de agitação foi ajustada para 100 rpm. 0 pH,d02 e temperatura foram controlados a 7,00 unidades, 0%de saturação e 37°Concretizações, respectivamente. OpH foi controlado com adições de seja HCl (5M) ou NaOH(5M) . A concentração de d02 foi mantida em 0% por as-persão contínua de nitrogênio, com uma taxa de fluxo de1 l/min. Coletaram-se amostras durante a fermentação efiltraram-se através de filtros de 0,2μm antes de ar-mazenamento a -2 0°C para propósitos analíticos. Asfermentações começaram a entrar na fase estacionária aum OD6OO de 6,0-7,0. Depois de 12 horas o fermentadorfoi resfriado para 10-20°C antes de se começar a recu-peração de colheita.
Fermentação de escala de 200 1
Um frasco da WCB (2005#1019D) foi descon-gelado e usaram-se alíquotas de 50μ1 para inocular 8meios de inoculo de 5ml em universais de 3Oml gama-irradiados. As culturas de 5ml foram incubadas a 37°Cem um vaso anaeróbio na presença de 3 balas de gás ana-eróbio. Depois de aproximadamente 12 horas de incuba-ção (OD600 3,0-4,0) selecionaram-se 4 culturas de 5ml eusaram-se para inocular 4x200ml de meios de inóculo embalões de vidro Erlenmeyer de 500ml. Dois balões devidro foram então colocados os dois em um vaso anaeró-bio com 3 balas de gás e foram deixados para incubar a37°C em uma incubadeira com agitação (70 rpm) durante12 horas. Depois de 12 horas de incubação (OD6OO 6,0-7,0) três dos quatro balões de vidro foram agrupadosentre si e usados para inocular o vaso de 20 1.O volume operacional dos vasos de 20 1 foide 15 1, dos quais 4% (v/v) foi inóculo proveniente doestágio de 200 ml stage. A velocidade de agitação foiajustada para 100 rpm. 0 pH, d02 e temperatura foramajustados para 7,00 unidades, 0% de saturação e 37°C,respectivamente. 0 pH foi controlado com adições deseja HCl (5M) ou NaOH (5M) . A concentração de d02 foimantida em 0% por aspersão superior contínua de nitro-gênio, com uma taxa de fluxo de 20 l/min.
Depois de 12 horas de crescimento no vasode 20 1 (ODôOO 6,0-7,0), usaram-se 8 1 de cultura parainocular o vaso de 200 1. As condições de operação fo-ram idênticas à escala de 20 1. A densidade óptica fi-nal (600 nm) na colheita foi de 6,0-7,0. Depois de 14horas o fermentador foi resfriado para 10-20°C antesde se começar a recuperação de colheita.
Colheita
Colheita de 5 1
As culturas 5 1 foram bombeadas com umataxa de fluxo de 5 l/h através de um filtro de profun-didade Millistak+ 10" Opticap (Millipore, KC0HC10FF1)e um filtro 0,2μπι Sartopore 2 300cm2 em bio-recipientesde 250 ml estéreis. 0 material processado foi ou arma-zenado a -20°C ou armazenado a 40C durante a noite an-tes de processamento por DSP.Colheita de 200 1
A colheita de 200 1 foi realizada utili-zando-se uma série de colheitas por filtragem. A cul-tura foi bombeada com uma velocidade de fluxo de 200l/h através de um filtro de profundidade descartávelMilistak+ (MC0HC10FS1) , com uma área de filtração de4xlm2 seguido por dois filtros de 0,2μτη Express OpticapXL 10, 2x0,49m2 (Millipore, KHGES1OTTl). 0 tempo deprocesso para a clarificação primária foi de 1 hora.Um adicional de 10 min foi deixado no final da colheitapara recuperar o produto residual retido nos filtros.O sobrenadante clarificado foi coletado em um StedimPalletank de 2 00 1 com a altura de filtrado registrada.Fizeram-se passar 20 1 de filtrado através de uma colu-na de DNA de alta afinidade Mustang Q com uma velocida-de de fluxo de ~6 l/min e coletou-se em dois sacos ste-dim de 20 1 estéreis, antes do armazenamento a 40C du-rante a noite.
Análise
Medições de densidade óptica
O espectrofotômetro foi zerado utilizando-se PBS sob comprimento de onda de 600 nm. Diluíram-seamostras fermentação por fatores de 10, 20 ou 100 (nadependência da densidade das células) utilizando-sePBS.
Transferiu-se 1 ml de cada amostra diluídapara uma cuveta de Iml; o topo foi vedado e ela foi in-vertida 5 vezes antes de se registrarem as leituras dedensidade óptica em triplicata sob um comprimento deonda de 600nm.Géis de Tris-Glicina
Filtraram-se amostras de fermentação atra-vés de filtros de 0,2μm antes de se preparar as mesmaspara análise de SDS-PAGE. Adicionaram-se 10μL de amos-tra filtrada a 10μL de tampão de amostra (2x)f 2,5μ1 deagente de redução (10x) e 2μ1 de 0,1M EDTA (para seconseguir uma concentração final de 10mM). O marcadorde alto peso molecular (HMW) foi preparado por adiçãode 10μL de estoque concentrado a 80μ1 de agente de re- dução (10x), 310μL WFI e 400μL tampão de amostra (2x) .O padrão de HMW diluído foi então aquecido a 95 °C du-rante 5 minutos antes de formação de alíquota e arma-zenamento a -20°C para o uso nos géis subseqüentes.Carregaram-se 15μ1 de amostra de fermentação e ΙΟμΙ demarcador HMW em um gel de Tris-Glicina a 8% utilizando-se tampão de operação pré-refrigerado (4°C) Tris-Glicina a 130V, 400mA e 100W durante ~1 hora e 50 minu-tos. Depois de eletroforese, os géis foram mergulhadosem 100 ml de reagente de coloração azul coloidal (55mlWFI, 2Oml metanol, 5ml marcador A, 2Oml marcador B) edeixados para colorir durante 5 h em um agitador orbi-tal a 60 rpm. Géis foram descoloridos com 200 ml deWFI. O gel foi deixado em WFI durante 15-20 h até oexcesso de coloração ser removido, depois do que o gelfoi submetido a varredura e submetido a secagem de a-cordo com as instruções do fabricante.
Géis Bis-TrisAs amostras de fermentação foram prepara-das para análise de SDS-PAGE pela adição de ΙΟμΙ de a-mostra filtrada 0,2μπι a 4μ1 de tampão de amostra (4x) ,1,5μ1 de agente redutor (IOx) e 1,7μ1 de 0,1M EDTA (pa-ra conseguir uma concentração final de IOmM). Carrega-ram-se 15μ1 de amostra fermentação e ΙΟμΙ de marcadorMark 12 em um gel a 4-12% Bis-Tris e operaram-se usan-do-se tampão de operação de MES a 2OOVf 4 OOmA e 100Wdurante -4 0 mins. Depois de eletroforese, os géis fo-ram mergulhados em uma solução de fixação 10Oml (4OmldH20, 5Oml metanol, IOml ácido acético) durante 10 mi-nutos antes de substituir com uma solução de coloração95ml (55 ml dH20, 2Oml metanol, 2Oml corante A) durantemais 10 minutos. Adicionaram-se 5ml de corante B à so-lução de coloração e deixaram-se os géis para coloraçãodurante 5 h em um agitador orbital a 60 rpm antes dedescolorir com 2OOml de WFI. O gel foi deixado no WFIdurante 15-20 h até o excesso de corante ser removido,depois do que o gel foi submetido a varredura e secadode acordo com as instruções do fabricante.
PURIFICAÇÃO PROCESSO 3:
A primeira escala de 20 1 experimentada deum processo recém desenvolvido (Processo 3) para a pu-rificação de colagenases a partir do Clostridium his-tolyticum, que foi modificado a partir do Processo 2realizado para GMP na escala de 20 1. Alterações deprocesso significativas foram introduzidas no desenvol-vimento do Processo 3 a fim de tornar a purificaçãomais robusta e mais amena para aumento e subseqüentevalidação do processo. Um fator significativo em faci-litar esta alteração de processo foi na escolha do com-ponente de fermentação. 0 Processo 2 tinha sido basea-do no requisito de manter um meio de fermentação basea-do em, enquanto para o processo 3 utilizou-se peptonade proteose No. 3. 0 processo executado é dividido nasetapas chave da purificação de jusante e das colagena-ses AUXI e AUXII. Estas incluem o tratamento do fil-trado de fermentação utilizando-se uma cápsula de Mus-tang Q, cromatografia de interação hidrofóbica, etapa 1de filtração de fluxo tangencial (assinalada por TFFl),cromatografia de troca aniônica e etapa 2 de filtraçãode fluxo tangencial (assinalada por TFF2) . AUXI e AU-XII copurificam-se nas etapas iniciais da purificação esão apenas separadas durante durante a etapa de croma-tografia de troca aniônica (realizada utilizando-semeios de Q-Sepharose HP meios). AUXI e AUXII são entãoprocessadas separadamente e formuladas. Os intermediá-rios são então misturados em uma relação 1:1 (baseadano teor de proteína determinado por UV) e filtrados pa-ra formarem a substância medicamentosa. No desenvolvi-mento do processo 3, as etapas chave associadas com oprocesso 2 foram removidas. Notavelmente, a etapa deprocipitação de sulfato de amônio, duas etapas de cro-matografia (cromatografia de hidroxiapaptita e permea-ção de gel) e todas as etapas de conservação a -2O0Cforam eliminadas. O uso de etapas não escaláveis taiscomo células agitadas e diálise também foram removidase substituídas com diltragem de fluxo tangencial (TFF).0 problema de instabilidade de produto, que foi eviden-te no processo 2 (e eliminou o uso de TFF), não foi e-vidente na execução da escala de 20 1 do processo 3.Entretanto, o perfil de contaminante associado com oprocesso 3 foi diferente para o processo 2 em que clos-tripaina e gelatinase foram os componentes principais.Mais notavelmente, um contaminante 4OkDa, 55kDa e doiscontaminantes 9OkDa (um de copurificação com AUXI e ooutro com AUXII) foram detectados por SDS-PAGE. Comoum resultado destes novos contaminantes, alguns dos en-saios de QC (tais como RPHPLC e SEC-HPLC) foram delimi-tados vima vez que eles não decompuseram todas as impu-rezas do processo 3. A incapacidade de utilizar ensai-os QC estabelecidos determinação de pureza em processo,resultou na necessidade de definir um método para esta-belecer que forma de material a coluna de QSepharoseera adequada para maior purificação. Isto foi necessá-rio uma vez que os contaminantes não foram claramentedesagregados dos produtos AUXI e AUXII na coluna QSe-pharose coluna e foi necessário, portanto, coletar ma-terial eluído em frações distintas, que poderiam seranalisadas retrospectivamente. A análise foi executadapor SDS-PAGE e a decisão de agrupamento para estar pre-sente no 20 1 h foi baseada na experiência da intensi-dade de coloração relativa de impureza para o produtoutilizando-se uma carga de Ipg padronizada.
A análise densitometria retrospective deSDS-PAGE possibilitou que os critérios de agrupamentofossem descritos com base na pureza percentual relativade produto. Análise de densitometria adicional utili-zando -se material a partir do da corrida de demonstra-ção de 2 00 1 possibilitou que um método padronizadofosse estabelecido, bem como uma aproximação de varia-ção de ensaio. Isto conduziu a um procedimento acorda-do para o agrupamento de frações em processo ser imple-mentado na primeira campanha de GMP.
Adicionalmente à descrição de processo,trabalho preliminar descrevendo uma estabilidade detampão e estudo de estabilidade de amostra em processoestá apresentado junto com a caracterização inicial dealgumas das impurezas associadas com o Processo 3.
O Processo 3 diferiu do processo 2 em trêsáreas principais. Primeiramente, as etapas de precipi-tação de sulfato de amônio e cromatografia de hidroxia-patita foram removidas; em segundo lugar, a etapa decromatografia de permeação de gel (GPC) foi eliminada eem terceiro lugar, todas as etapas de troca de tampãoforam executadas por filtragem de fluxo tangencial. Aetapa de precipitação foi substituída pelo uso de cro-matografia interação hidrofóbica (HIC) sob recomendaçãodo cliente. O desenvolvimento desta etapa resultou naimplementação bem sucedida de HIC para (i) captura deproduto (servindo assim como uma etapa de concentração)e (ii) alguma remoção de contaminante de proteína epigmento. A etapa HIC também mostrou subseqüentementereduzir os níveis de dsDNA. Como um resultado do pro-grama de desenvolvimento de processo, a introdução deHIC e inclusão de uma etapa de Mustang Q removeu a ne-cessidade da etapa de precipitação de sulfato de amônioe a etapa de cromatografia de hidroxiapatita. 0 efeitoglobal foi simplificar a captura frontal de produto eremover uma etapa de de conservação potencial associadacom o Processo 2. Este último ponto teve significadopelo fato de que anteriormente a fermentação podia seravaliada antes da purificação a jusante, uma vez que aspellets resultantes da etapa de precipitação podiam sermantidas a -200C antes do processamento.
Em seguida à etapa HIC, o produto foi al-terado por tampão utilizando-se filtração de fluxo tan-gencial (TFF). Isto foi realizado utilizando-se mem-branas de corte de peso molecular de 3 OkDa (MWCO) esubstituindo-se o procedimento de diálise usado para oProcesso 2. A contaminação de agregado, que quandopresente foi detectada como derivada de AUXII, pareceuser removida durante a etapa de cromatografia de trocaaniônica (IEX) . Como um resultado, a etapa GPC foi e-liminada uma vez que os dois intermediários AUXI e AU-XII estavam dentro da especificação para agregados emseguida a IEX. Finalmente, a concentração final e for-mulação dos intermediários AUXI e AUXII foi executadautilizando-se TFF em vez do método anterior de utiliza-cão de células agitadas.
No geral, o Processo 3 representou um pro-cesso mais simples que foi mais receptivo a aumento evalidação do que o Processo 2. Além disso, a reduçãono custom de consumíveis foi evidente, pela eliminaçãoda necessidade de hidroxiapaptita e meios de permeaçãode gel e pelo número de etapas reduzido requerendo Ieu-peptina. Uma visão geral do esquema de purificação pa-ra o Processo 3 está exposta na Figura 46.
Demonstração de não-GMP executada na escala de 20 1
Realizou-se o Processo 3 na escala de 20 1nos laboratórios de desenvolvimento de processo a fimde demonstrar se material de qualidade adequada poderiaser gerado utilizando-se este processo modificado naescala de 20 1. Um requisito chave para processamentofoi a capacidade de limitar a atividade de protease po-tencial pela reali zaçao de etapas geladas sempre quepossível e pela inclusão da leupeptina inibidora deprotease de cisteína nos estágios chave do procedimen-to. Um filtrado de fermentação de 20 1 pleno foi pro-cessado uma vez que o material de alimentação foi gera-do a partir de PP3 de fermentação de 200 1. Detalhesda fermentação e subseqüente colheita e filtragem estãodocumentados em vim relatório separado.
Tratamento de Mustang Q de filtrado de fermentação
Em seguida à filtragem 0,2μπ\, aproximada-mente 22 1 de sobrenadante de fermentação foram carre-gados em uma cápsula de cromatografia Mustang Q tal co-mo descrita anteriormente. Uma certa contaminação depigmento visível (verde/castanho) pareceu ser removidapela cápsula Mustang Q durante a filtragem dos primei-ros 10 1, uma vez que o conteúdo do saco Stedim dosprimeiros 10 1 pareceu visivelmente menos pigmentado doque os segundos. A capacidade da Cápsula Mustang Q re-mover dsDNA foi monitorada através desta etapa por aná-lise verde de pico de amostras pré e pós Mustang Q (Ta-bela 41). No processo, a análise indicou que diferentedos dados anteriores gerados na pequena escala, a remo-ção de ácido nucléico a granel não foi evidente na eta-pa Mustang Q. A robustez e aplicação desta etapa, por-tanto, requerem maior investigação.
Tabela 41
<table>table see original document page 164</column></row><table>
Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC)
0 uso da HIC serviu a três funções na pu-rificação. Primeira, o produto foi reduzido em volumeuma vez que foram identificadas condições em que cola-genases aglutinaram-se à\ resina. Segunda, algum con-taminante de pigmeno e proteína foi removido neste es-tágio, e terceira, a análise verde de pico a partirdesta corrida indicou redução de dsDNA. A etapa da HICfoi executada utilizando-se sobrenadante processado di-retamente a partir da fermentação (depois de tratamentode Mustang Q) e, como vim resultado, uma etapa de reten-ção, (evidente no Processo 2 na forma da pílula de sul-fato de amônio) não se encontrava mais presente para oProcesso 3.
A fim de proporcionar condições para cola-genases se ligarem à coluna HIC, produto (20 1) prove-niente da etapa Mustang Q foi diluído com uma soluçãode 3M-sulfato de amônio para uma concentração final deIM. Depois de filtragem, o produto foi carregado nacoluna e eluido utilizando-se uma eluição isocrática de2-etapas.
A concentração de proteína de material decarga HIC foi difícil de determiner com exatidão e foiavaliada de duas maneiras. Primeira, realizou-se umensaio Bradford no material antes da adição de sulfatode amônio. Isto foi realizado com material não diluídoa fim de padronizar a contribuição a partir do pigmentopresente nos meios de fermentação, que se sabia inter-ferir com o ensaio. Segunda, a estimativa foi baseadano volume dos meios de fermentação carregados por ml deresina de coluna. A carga de coluna foi avaliada comosendo 5,9 mg da proteína/ml de resina total por ensaiode Bradford ou, alternativamente, ~13ml de meios defermentação por ml de resina. Uma estimativa da quan-tidade total de proteína visada eluída a partir da co-luna foi determinada como 3,4 g utilizando-se UV (videTabela 42) . Supondo-se que a proteína total presentena carga HIC foi de 9g (ensaio Bradford), isto equacio-nou uma recuperação de 38%. Este valor, entretanto,foi apenas considerado como uma medida relativa, devidoà inexatidão do ensaio para as amostras que continhamcomponentes de meios de fermentação.
Um método alternativo para avaliar a con-centração da carga HIC foi determinado utilizando-seensitometria, muito embora fosse reconhecido que estaavaliação proporcionaria um teor de colagenase em vezde estimativa da proteína total (que poderia variar en-tre fermentações). Utilizando-se esta abordagem, o to-tal de colagenases foi estimado como 360mg/l com umaproporção aproximada de AUXI para AUXII estimada como40:60. Utilizando-se estes dados, o total de colagena-se esperado na carga de HIC seria 7,2g proporcionandoum rendimento de etapa de 47%.
O cromatograma resultante da etapa HIC es- tá ilustrado na Figura 70. 0 pigmento visível foi apa-rente no fluxo direto, bem como ligado à coluna. De-pois de lavagem da coluna com tampão de equilíbrio pararemover a contaminação de fluxo direto, o pico 1 foieluído utilizando-se uma solução de sulfato de amôniode concentração intermediária (0,3M).
Este pico foi mostrado como contendo con-taminantes de proteína muito embora alguma AUXII tambémfosso eluída neste estágio (Figura 71). Esta perda deproduto era esperada e tinha sido observada anterior-mente. A fim de reduzir ao mínimo a quantidade de pro-duto perdido, sem comprometer a pureza, o volume de e-luição para remoção do pico 1 foi ajustado em 5 volumesde coluna. 0 Pico 2, contendo a maior parte do produ-to, foi então eluído utilizando-se tampão sem nenhumsulfato de amônio. 0 Pico 2 foi coletado como um únicoagrupamento com o método de cromatografia programado deforma que a coleta começou depois de 3/4 de um volumede coluna de tampão de eluição ter sido aplicado à co-luna. A coleta foi então terminada depois de um totalde 4 volumes de coluna terem sido coletados. A fim dese reduzir ao mínimo proteólise potencial no produtoneste estágio do processo, leupeptina foi adicionada aoeluado pós HIC e o material mantido a 2-8°C. O tempode contenção total para o eluado pós HIC teve uma dura-ção de 2 dias.
Filtragem de fluxo tangencial 1 (TFFl)
TFF utilizando membranas de 3OkDa foi in-troduzido em seguida à HIC a fim de reduzir o volume deproduto (5-vezes) e para permutar o tampão em condiçõesadequadas para vinculação à coluna de troca aniônica.De particular importância foi a redução suficiente emsulfato de amônio de forma tal que a condutividade daamostra de carga de IEX foi <l,8mS. O tampão de dia-filtragem foi congelado e leupeptina adicionada antesdo uso para reduzir a possibilidade de proteólise. Ne-nhuma perda em proteína foi estimada no decorrer destaetapa (recuperação de >100%) muito embora isto possarefletir a imprecisão na estimativa de concentração deproteína neste estágio do processo devido à presença depigmento no material pré TFFl. Aproximadamente 97,5%da proteína total (3325mg) foi recuperada na retençãocom um adicional de 204,8 mg recuperados na primeiraenxaguadura de membrana (infra). Filtragem da proteínatotal a partir do retentado e enxaguadura combinadosfoi realizado no final da etapa TFF antes de conservaro material durante a noite a 2-8°C. A análise de SDS-PAGE não indicou quaisquer diferenças significativasantes e depois da etapa TFF (Figura 71).
Cromatografia de Q-Sepharose
A coluna Q-Sepharose foi carregada sob umacapacidade máxima de 5mg de proteína total por ml deresina. Como um resultado, nem todo o material dispo-nível a partir da etapa TFF foi utilizado nesta etapa(vide Tabela 421). A coluna de Q-Sepharose transformouas colagenases AUXI e AUXII como esperado (Figura 72).0 início daeluição de AUXII começou aproximadamente a13,6% B (onde o tampão A = IOmM Tris, 0,2mM leupeptinapH 8 e tampão B = Tampão A + 36OmM NaCl) o que igualoua condutividade pós coluna de 5,7mS. Frações (IOOml)foram coletadas através da eluição de AUXII até o valorde absorvência cair para 25% da altura de pico(550mAU). Um pequeno pico foi eluído em aproximadamen-te 8mS (20,3% B) em seguida à eluição de AUXII. Análi-se no processo deste pico a partir das experiências empequena escala indicou ser este material agregado deri-vado de AUXII. 0 início da eluição de AUXI foi em a-proximadamente 27% B (o que foi equivalente a 10,4mS).Como anteriormente, frações de IOOml foram coletadasaté a absorvência cair para o valor de 25% requerido(19OmAU).
Cada fração AUXI e AUXII coletada foi ana-lisada por SDS-PAGE e submetida a densitometria (Figu-ras 73-76) . A densitometria foi realizada retrospecti-vamente, de forma que a decisão no agrupamento de fra-ções foi baseada na experiência dos níveis de contami-nantes visíveis por coloração de azul coloidal. Naconsulta com Auxilium, as frações 6-12 foram agrupadaspara o produto AUXII e as frações 19-26 agrupadas paraAUXI. Os rendimentos de etapa e concentrações de pro-teínas presentes no material agrupado a partir da cor-rida de Q-Sepharose estão incluídos na Tabela 42.
Análise SDS-PAGE dos produtos pós IEX AUXIe AUXII a partir da demonstração de 20 1 (Figura 77 e78) mostrou poucos contaminantes visíveis por SDSPAGE.Além disso, os contaminantes detectados foram de acordocom as experiências em pequena escala anteriores, muitoembora fossem observadas diferenças na resolução doscontaminantes, que pareceram ser mais definidos (sto é,picos ou projeções separados) no modelo em pequena es-cala. Estes contaminantes foram também diferentes da-queles identificados para o Processo 2 em que clostri-paina e gelatinase constituíram-se nos components prin-cipais. Como um resultado, os protocolos de QC que fo-ram desenvolvidos para o Processo 2 não foram otimiza-dos para a detecção dos novos contaminantes associadoscom o Processo 3.
Densitometria retrospective do materialagrupado avaliou a pureza em 95,1% para AUXI e 99,4%para AUXII. Atualmente, entretanto a especificação depureza de >97% é especificada por RP-HPLC e na especi-ficação do produto final foi estabelecida utilizando-sedensitometria.
Concentração e mudança de tampão de AUXI e AUXII
Os produtos de AUXI e AUXII separados apartir da coluna de Q Sepharose foram processados sepa-radamente por TFF utilizando-se uma membrana de3 0kDa.Esta etapa foi requerida para; (i) remover/reduzir Ieu-peptina no produto final, (ii) formular os intermediá-rios no tampão correto (IOmM Tris, 6OmM sacarina pH 8)e (iii) para conseguir a concentração de proteína visa-da requerida de 0,9-1,lmg/ml. A total de 799mg (~683mlat 1,17mg/ml) de AUXII e 860mg (796ml a l,08mg/ml) deAUXI foi concentrada para uma concentração visada del,75mg/ml. Esta concentração teórica foi baseada naredução calculada no volume requerido supondo-se nenhu-ma perda de produto durante a etapa de concentração.Diafiltragem foi então realizada no tampão de formula-ção requerida, as membranes lavadas com volume mínimodo sistema TFF (~250ml) e a quantidade plena combinadacom o concentrado para conseguir a concentração visadarequerida de 0,9-1,lmg/ml. Um total de 819,5mg AUXII(a 1,03mg/ml) e 797, Omg de AUXI (a l,09mg/ml) foramdisponibilizados depois da filtragem. Nos dois casos,a maior parte do produto foi recuperada na retenção efoi estimada como sendo 95,4% (762mg) para AUXII e83,1% (715mg) para AUXI. 0 material adicional propor-cionado pela enxaguadura de membranas foi estimado comosendo 153mg e 89,6mg para AUXII e AUXI, respectivamen-te.
Mistura de intermediários a substância medicamentosa
Aproximadamente 200mg de cada intermediá-rio foram combinados para proporcionarem 4OOmg da subs-tância medicamentosa. Esta foi então filtrada e apro-ximadamente 26 mg proporcionados para teste de QC. Osresultados de QC intermediários AUXI, AUXII e a subs-tância medicamentosa encontram-se expostos na Tabela43. Todos os testes na substância medicamentosa e in-termediário AUXII passaram pela especificação requeri-da. 0 teste para potência do intermediário AUXI, en-tretanto, não estava dentro da faixa especificada, mui-to embora tivesse passado por todos os outros testes.Com a exceção do resultado de potência de AUXI, estesdata indicaram que o Processo 3 foi capaz de gerar ma-terial de acordo com a especificação requerida quandopurificado na escala de 20 1.
Da mesma forma que com o material de testede QC, o material proveniente da corrida de demonstra-ção de 20 1 foi utilizado para validação do método naKBI BioPharma, Inc. A pedido do cliente, 2OOmg desubstância medicamentosa foram transportados em geloseco para a KBI para validação de métodos de substânciamedicamentosa e produto medicamentoso. 0 último testefoi realizado depois de liofilisação da substância me-dicamentosa na KBI. Além disso, 25mg de cada interme-diário foram fornecidos à KBI para validação de métodosanalíticos.
Os rendimentos da etapa individual para acorrida de demonstração de 20 1 estão expostos na Tabe-la 42. Uma extrapolação doa dados em que todo o mate-rial disponível tinha sido carregado na coluna de Q-Sepharose indicou que a quantidade total máxima desubstância medicamentosa disponível a partir deste pro-cesso executado foi de l,6g (su"pondo-se nenhuma perdade material através de retenções) . Isto eqüivale a umrendimento de processo total aproximado de 17,8%, combase na estimativa inicial de 9g (utilizando-se o en-saio de Bradford) para a quantidade de proteína totaldisponível para carregar na coluna de HIC. Com a limi-tação na carga para a coluna de Q-Sepharose, uma quan-tidade máxima de l,4g de substância medicamentosa foidisponibilizada a partir da corrida atual, se todo ointermediário tiver sido misturado para formar a subs-tância medicamentosa.<table>table see original document page 173</column></row><table>
* calculado com base no fator de diluição depois de a-dição de sulfato de amônio.
Tabela 43
<table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table>
Estudo de estabilidade da amostra
Durante a corrida de demosntração de 2 0 1,coletaram-se amostras nos pontos de processo chave.Como a corrida de demonstração foi realizada como umprocesso contínuo (sem etapas de retenção) fez-se umatentativa para avaliar a estabilidade do material em-processodurante os tempos de retenção antecipados paraos lotes de GMP. A duração de corrida esperada paraGMP foi reconhecida devido ao requisito para obtençãode dados de liberação de equipamento entre as etapas deprocesso. 0 material em processo foi mantido a 2-80Cdurante aproximadamente a duração esperada para a manu-fatura de GMP. Além disso, amostras foram retidas du-rante um período de tempo prolongado representando duasvezes aquele esperado para a campanha de GMP. A des-crição das amostras colhidas, juntamente com os respec-tivos tempos de retenção estão expostos na Tabela 44.Os tempos de processamento para a corrida de demonstra-ção de 2 0 lestão representados na Tabela 45. Todas asamostras foram submetidas a QC para análise de SDS-PAGE, RP-HPLC, SEC-HPLC e UV análise (Figuras 79-83).No global, os resultados não mostraram de-terioração detectável no produto durante o primeiroponto de retenção com relação a pureza (tal como deter-minado por RP-HPLC), degradação (tal como detectado por8% Tris-Glycine SDS-PAGE) e agregação (conforme deter-minado por SECHPLC). Alguns dos ensaios, entretanto,foram reconhecidos como sendo limitativos, uma vez queos components de baixa massa molecular não seria, de-tectados por 8% SDS-PAGE e o ensaio de RPHPLC não tinhasido desenvolvido para detectar os contaminantes de40kDa, 55kDa e 90kDa associados com o Processo 3. Al-guns ensaios foram também menos relevantes para amos-tras brutas, tais como o uso de UV e SEC-HPLC nas amos-tras de fermentação. Apesar destas limitações, a únicaalteração detectada no perfil do produto foi identifi-cada para o Segundo ponto de retenção (dia 12) para aamostra em processo AUXII colhida a partir da coluna Q-Sepharose. Esta mostrou um aumento no nível de agrega-dos entre o dia 5 e o dia 12, muito embora este aumentofosse de somente 0 a 0,62%.
Um segundo estudo de estabilidade foi rea-lizado nas retenções em-processo que foram coletadas noponto de manufatura durante a corrida de demonstraçãode 20 l e armazenadas a -20°C. Neste estudo, amostrasforam descongeladas e incubadas sob temperatura ambien-te e a 37°C e monitoradas por análise SDS-PAGE 4-12%para permitir que a faixa de massa molecular de conta-minantes fosse avaliada (Figuras 84-88). Estes dadosdemonstraram que as amostras antes da troca aniônica deQ-Sepharose eram vulneráveis à degradação. Em seguidaà separação das colagenases AUXI e AUXII (pela colunade Q-Sepharose), as amostras pareceram ser relativamen-te estáveis e aparesentaram-se comparáveis às amostrasde tempo zero por SDS-PAGE.
Tomados em conjunto, os dois estudos indi-caram que fazendo-se com que a temperatura seja mantidaentre 2-8°C, é de se esperar que o material em-processonão se deteriore durante o processamento nos tempos deespera investigados. Isto proporciona um nível de con-fiança de que o uso de leupeptina e controle de tempe-rature são suficientes para restringir níveis de degra-dação do produto durante o processamento nas duraçõesantecipadas em GMP.
Tabela 44
<table>table see original document page 178</column></row><table>Tabela 45
<table>table see original document page 179</column></row><table>
Amostras de tampão ilustradas na Tabela 46foram reservadas a partir da demonstração de 20 1 etestadas novamente depois de armazenamento a 2-8°C. OpH, condutividade, temperatura e aparência dos tampõesforam observados na ocasião da conclusão e depois de12-13 dias de armazenamento. Os resultados deste estu-do estão expostos na tabela 47. Observaram-se pequenasdiferenças nos valores para pH e condutividade, mas is-to pode ser devido às diferenças na temperatura entreos tampões originais e os retentores testados. Em par-ticular, os tampões HIC mostraram a mais ampla variaçãona condutividade e temperatura. Como um resultado, fu-turos estudos na estabilidade de tampão deverão incluirespecificação de uma faixa de temperaturas aceitas pararegistrar todos os parâmetros. Em todos os casos, osretentores de tampão foram de aparência limpa no tempozero e depois do tempo de retenção requerido.
Tabela 46
<table>table see original document page 180</column></row><table>
Tabela 47
<table>table see original document page 180</column></row><table><table>table see original document page 181</column></row><table>
Identificação de contaminante por seqüência N-terminal
Três impurezas principais foram detectadaspara o Processo 3 por análise SDS-PAGE. Estas parece-ram ser co-eluídas com as colagenases AUXI e AUXII eforam apenas transformadas por fracionamento dos picoseluidos a partir da coluna de Q-Sepharose. Os contami-nantes foram designados pela sua massa molecular apa-rente em SDS-PAGE como contaminantes 4OkDa, 55kDa e90kDa. Frações com níveis elevados de um contaminanteparticular foram submetidas a seqüênciamento N-terminaldepois de excisão da banda a partir de SDS-PAGE.A análise de seqüência foi bem sucedidapara both the 55kDa e 4OkDa contaminant isolated fromthe 2OL corrida de demonstração. The N-terminus de the55kDa contaminant band associated with AUXI (Faixas 1-5; a Figura 89) was shown to match a region de the ColG sequence para colagenase AUXI whereas the 4OkDa con-taminant band from AUXII (Faixas 6-10; a Figura 89) wasidentical to a region de the Col H sequence para cola-genase AUXII. A previous attempt was made to sequencethe 9OkDa band associated with both the AUXI e AUXIIproducts (a Figura 90) . Sequencing de the 90kDa con-taminant associated with the AUXI product was bemsucedida in that identidade was correlated with the N-terminus de the AUXI sequence. Em contraste, não foipossível obter uma seqüência completa para o contami-nante 90kDa associado com AUXII, o que sugeriu que osdois contaminantes de 90kDa eram produtos sdiferentes.
Os contaminantes principais associados como Processo 3 pareceram ser produtos relacionados e fo-ram ou identificados como produtos clivados N-terminalmente de AUXI (55kDa) e AUXII (40kDa) ou umproduto clivado Concretizações-terminalmente de AUXI(90kDa). Como estes contaminantes eram diferentes da-queles identificados no Processo 2, os ensaios de QCutilizados para a especificação dos intermediários esubstância medicamentosa não decompuseram os novos con-taminantes que o desenvolvimento de ensaio tinha origi-nado em torno do Processo 2. Em particular, os ensaiosde pureza padrão (RP-HPLC) não puderam ser usados paradetectar níveis dos contaminantes 4OkDa e 55kDa.
Análise de Densitometria
Curso de demonstração de 20 l
Os contaminantes 40kDa, 55kDa e 90kDa as-sociados com o Processo 3 foram identificados e deter-minados por SDS-PAGE. Estes contaminantes foram clara-mente detectados em frações eluídas a partir da colunade Q-Sepharose e pareceram eluir nas bordas dianteira etraseira do perfil de pico (vide as Figuras 72-76). Adecisão para quais frações foram incluídas ou excluídaspara maior purificação foi baseada na experiência daintensidade relativa de coloração para contaminantes eproduto nos géis com coloração de azul coloidal. A fimde tornar esta avaliação menos subjetiva, utilizou-sedensitometria para determinar critérios de agrupamentoespecíficos para frações em seguida à etapa de Q-Sepharose. Usou-se a densitometria de preferência aoatual ensaio de QC para pureza (RP-HPLC) uma vez queeste ensaio poderia nao converter os novos contaminan-tes associados com o Processo 3.
Dados de densitometria provenientes de frações pós Qporvenientes do curso de demonstração de 20 l
Os valores de densitonetria provenientesde 2 anpalises separadas das frações pós-IEX foram me-diados e estão ilustrados na tabela 48. As frações 1-12e os últimos 25% (cauda) de pico 1 contêm AUXII e asproteínas de contaminação associadas de 40, 75 e 90kDa.As frações 13-27 e os últimos 25% (cauda) de pico 2contêm AUXI e os contaminantes associados de 55 e90kDa. Os agrupamentos das frações selecionadas basea-dos em SDS-PAGE sem análise densitométrica, são realça-dos.
Tabela 48
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Documentos resumo de densitometria a partir de fraçõespós Q provenientes da corrida de demonstração de 2001
Sumário da Análise de Densitometria
Frações pós IEX provenientes da série téc-nica de 2001 foram analisados diversas vezes para es-tabelecer um critério de agrupamento que possa ser do-cumentado no IEX BMR para a campanha de GMP. Este cri-tério de agrupamento é baseado na suposição de que (i)a qualidade de material gerado a partir da série técni-ca é apropriado para o material de GMP e (ii) a aproxi-mação do método de densitometria é aceitável. Se o ob-jetivo é gerar material de qualidade superior na campa-nha de GMP, a especificação para critérios de agrupa-mento precisará de ser revisado.
Especificação para agrupamento a partir do IEX
No total, as amostras provenientes da sé-rie técnica de 200 1 foram analisadas 6 vezes (2 opera-dores e 3 repetições de cada gel) e os dados médios a-prèsentados na Tabela 49. As frações que foram agrupa-das para a série técnica estão realçadas em vermelho.A partir desta análise, podem ser estabelecidos os se-guintes critérios de agrupamento:
(i) Qualquer frações de pureza maior do que ou igual a88,5% pode ser agrupada.
(ii) Qualquer fração com uma única impureza maior doque ou igual a 10%, não pode ser agrupada.
(iii) Frações a serem agrupadas devem ser provenientesde frações consecutivas.
(iv) A pureza teórica calculada do agrupamento deveráser:
Maior do que ou igual a 93% da pureza teórica para AUXIMaior do que ou igual a 96% da pureza teórica para AU-XII
Èste último ponto foi baseado nas estima-teivas a partir da série técnica de 200 1, em que aproteína total nas frações disponíveis foi avaliada(muito embora uma limitação fosse a de que nem todas asfrações estavam presentes para análise de UV para aAUXI) . Os dados provenientes desta análise estão ex-postos na Tabela 50.
**N0TA: partindo-se destes critérios, a fração 7 para opico AUXII será desta feita excluída.Variação de ensaio
A partir dos dados das frações pós IEXprovenientes da série técnica de 200 1, avaliou-se o•seguinte nível de exatidão:
(i) para o produto (AUXI e AUXII) a % CV foi calculadacomo 2,1% (AUXI) e 2,3% (AUXII) . Conseqüentemente, aespecificação de pureza de 88,6% para agrupamento pode-ria estar na faixa de 86,3-90,9%.
(ii) para as impurezas, a % CV é muito maior e a faixafoi estimada como 18,5%-33,7% na dependência da impure-za. Consequentemente, a especificação de pureza da ex-clusão de frações com uma única impureza não maior doque 10% poderá ser para frações com uma faixa de impu-rezas efetiva de 6,63 - 13,37 %. Portanto, o valor pa-ra a pureza do produto (e não as impurezas) é o valormais confiável para especificação de agrupamento.Pureza estimada de material final por densitometria
A análise densitométrica do material final(DS e intermediários) para a série técnica de 200 1também foi determinada por densitometria e é como sesegue:
AUXI = 96,0% (3,1% de contaminante 9OkDa)
AUXII = 98,7% (1,2% de contaminante 90kDa)
DS = 97,6% (2,1% de contaminante 90kDa)(Nota: Esta é a faixa determinada para uma única SDS-PAGE analisada 3 vezes por 3 operadores diferentes.)
Padronização do método
No decorrer da repetição da análise, o mé-todo de densitometria foi padronizado para minimizarerro entre operadores e variação entre géis e será do-cumentado em um SOP. Mais notavelmente:(i) A carga padrão da proteína total emcada faixa do gel será ^g.
(ii) Um máximo de 16 frações serão selecionadaspara análise a partir de cada um dos picos de pro-duto (AUXI e AUXII). Isto limitará o número degéis para análise densitométrica para 4.
(iii) As 16 frações selecionadas começarão na últimafração para serem coletadas coletadas para cadapico e operam para diante consecutivamente. Isto épara assegurar a precisão em que o valor calculadopara a pureza média (uma vez que todas as fraçõesa serem agrupadas têm probabilidade de ser incluí-das) .
Tabela 49: Quantidades relativas médias de produto eimpurezas nas frações pós IEX a partir da série técnicade 200 1, como determinado por análise densitométrica.As frações agrupadas estão ressaltadas em vermelho.
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Tabela 50: Quantidades relativas teóricas de produto eimpurezas nos agrupamentos de pós IEX a partir da sérietécnica de 200 1, conforme determinado Por análise den-sitométrica. As frações agrupadas estão salientadas emvermelho. A pureza de produto média teórica é calcula-da como 92,3% e 95,8% para os intermediários AUXI e AU-XII, respectivamente.
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Critérios de Agrupamento de GMP para Frações Pós Q-Sepharose
Detalhe a ser especificado na BMR permutadora iônicail
A. Os critérios de agrupamento seguintes devem ser es-pecificados para frações provenientes dos picos de AUXIe AUXII que foram analisados por densitometria:
(i) Um máximo de 16 frações sera selecionado pararanálise a partir de um dos picos de produto (AUXIe AUXII). Isto limitará o número de géis para a-nálise densitométrica para 4.
(ii) Qualquer fração de pureza maior do que ou i-gual a 90,00% (reportado para 2 casas decimais) podeser agrupada.
(iii) Qualquer fração com uma única impurexa mai-or do que ou igual a 9,00% (para 2 dp) não pode ser a-grupada.
(iv) Frações a serem agrupadas devem serprovenientes de frações consecutivas.
B. Os seguintes critérios de agrupamento devem ser es-pecificados para frações a partir do pico de AUXII quefoi analisado por SEC-HPLC:
(i) O número máximo de amostras a seremsubmetidas para SEC-HPLC é 10 e devem ser provenientesda última fração coletada para este pico e frações con-secutivas para diante.
(ii) Qualquer fração com mais do que ouigual a 2,00% (para 2dp) o agregado não pode ser agrupado.
Detalhes a serem registrados somente para informação
A. A pureza teórica estimada do agrupamento deve sercalculada somente para informação e espera-se que seja:
Maior do que ou igual a 93,00% da purezateórica para AUXI
Maior do que ou igual a 97,00% da purezateorica para AUXII
Β. A quantidade mínima de proteína em cada agrupamentodeverá ser anotada para estabelecer se critérios paraexclusão de frações com menos do que 0,5g puderem serusados no futuro.
C. Frações para o pico AUXI serão apresentadas a RP-HPLC, mas serão analisadas retrospectivamente e somentepara informação. Estes dados NÃO serão consideradoscomo parte dos critérios de agrupamento.
Impacto esperado no agrupamento
O seguinte foi calculado a partir do conjunto de dadosmédios apresentados na Tabela 51 para refletir o efeitono rendimento e seleção de fração seguindo s novos cri-térios de agrupamento:
Tabela 51
<table>table see original document page 192</column></row><table><table>table see original document page 193</column></row><table>
Tabela 52: Quantidades relativas médias de produto eimpurezas nas frações pós IEX a partir da série técnicade 200 1, conforme determinado por análise densitomé-trica
<table>table see original document page 193</column></row><table><table>table see original document page 194</column></row><table>Tabela 53: Quantidades relativas teóricas de produto eimpurezas nos agrupamentos pós IEX a partir da sérietécnica de 200 1, conforme determinadas por análisedensitométrica. As frações agrupadas estão salientadasem vermelho. A pureza de produto média teórica é cal-culada como 92,3% e 95,8% para os intermediários AUXI eAUXII, respectivamente.
<table>table see original document page 195</column></row><table>Uma comparação de 2 conjuntos de dados(isto é as mesmas amostras em-processo correm em dife-rentes géis por diferentes operadores) permitiu os se-guintes critérios de agrupamento retrospectivos a seremanotados para estabelecimento de dados médios, muitoembora uma fração adicional (fração 27 proveniente deAUXI) fossem incluídos a partir daqueles atualmente a-grupados na corrida de 20 l:
• AUXI
Agrupa todas as frações com uma pureza de ≥87%, mas quenão têm uma impureza individual de ≥10%.
• AUXII
Agrupa todas as frações com uma pureza de ≥94%, mas quenão têm uma impureza individual de ≥4%.
Os dados QC provenientes da análise do ma-terial final proveniente da demonstração de 20 l mos-trou que o intermediário AUXII foi 99,4% puro, o inter-mediário AUXI foi 99,1% puro e a substância medicamen-tosa foi 99,9% colagenase por RP-HPLC. Portanto, espe-ra-se que os critérios especificados para o processo deagrupamento resultem em material que passa as especifi-cações de liberação para o material final.
Corrida de demonstração de 200 l
Os critérios estabelecidos para a corridade demonstração de 20 l mencionada anteriormente foramdiferentes daqueles implementados para a série técnicade 200 l. Neste caso, o agrupamento foi especificadopara os dois produtos AUXI e AUXII como fraçãos com umapureza de >86.5%, mas que não tiveram uma única impure-za contaminante de >10%. Amostras de AUXII com um ní-vel de impureza >2% detectado por SEC-HPLC também foramexcluídas. Os intermediários AUXI/AUXII e substânciamedicamentosa resultantes foram também analisados pordensitometria, utilizando-se um método padronizado, emostraram ter a seguinte pureza estimada baseada na a-nálise de um único gel 3 vezes (3 operadores diferen-tes) : AUXI = 96,0% (3,1% de contaminante 90kDa); AUXII= 98,7% (1,2% de contaminante 9OkDa) ; DS = 97,6% (2,1%de contaminante 9OkDa).
Além disso, a pureza determinada por QCdos the intermediários e substância medicamentosa mos-trou passar na especificação pelo ensaio de RP-HPLC(AUXI = 98,2%; AUXII = 98,1%; substância medicamentosa= 99,4%). Conseqüentemente, os critérios de agrupamen-to seguidos para a série técnica de 2 00 1 foi bem suce-dida na distribuição de produto de pureza adequada combase nos métodos analíticos disponíveis atuais.
Materiais e Métodos
Cromatografia Mustang Q (corrida na escala de 20 1)Eguipmento:
Cápsula de Cromatografia Mustang Q, 6Oml (CL3MSTGQP1,Pall)
Conductividade e Medidor de pH 433 0 (Jenway)Produtos químicos:
Cloreto de sódio (classe USP, Merck)
Solução de hidróxido de sódio (volumétrico 4M) (AnalaR,BDH)
Tris (hidroximetil) metilamina (classe USP, Merck)
Sulfato de amônio (Extra Puro, Merck)
Água Hyclone para Injeção - Água de Qualidade (WFI-QW)
Uma cápsula de cromatografia Mustang Q devolume de leito de 60 ml foi sanitizada com IM NaOH auma taxa de fluxo de 30ml/min durante 30minutos. Acápsula foi então precondicionada durante o mesmo tempoe taxa de fluxo utilizando-se IM NaCl. A cápsula foiequilibrada com 2 1 de tampão Mustang Q Equilibration(10mM Trisi IM sulfato de amônio, pH 8), a uma taxa defluxo de 6Oml/min. 0 fluxo de saída foi checado paraassegurar o pH que foi <8. Sobrenadante (22 1) proveni-ente da fermentação PP3 de 200 1 (que tinha sido fil-trado por 0,2μm) foi carregado na cápsula sob uma taxade fluxo de 540ml/min (duração de aproximadamente 40min.). A taxa de fluxo operacional máxima recomendadapara a cápsula foi de 600ml/min. O material filtradofoi armazenado em 2 bolsas Stedim de 10 1 a 2-8°C du-rante a noite.
Cromatografia de interação hidrofóbica (corrida na es-cala de 20 l)
Equipmento:
AKTA Pilot instalado com Unicorn V 5.Olsoftware (GEHealthcare)
Coluna Vantage S130 (area seccional 125 cm2, Millipore)
Medidor de condutividade e pH 4330 (Jenway)
Cápsula de filtro Sartopore 2 0,8 + 0,45μπι (Sartorius)Unidade de Refrigeração médica MP150 (Electrolux)Produtos químicos:
Phenyl Sepharose 6 FF Iow sub (GE Healthcare)Solução de hidróxido de sódio (volumétrica 4M) (AnalaR,BDH)
Cloreto de sódio (classe USP, Merck)Tris(hidroximetil)metilamino (classe USP, Merck)Sulfato de amônio (Extra Puro, Merck)Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)Água Hyclone para Injeção - Quality Water (WFI -QW)Septo de coluna HIC
24 O Oml de Fenil Sefarose 6 FF Low Sub(Partida # 312089) pasta fluida foi assentada durante 3horas e o etanol removido e substituído com 1800ml WFI.Os meios foram submetidos a refluxo (50%), assentados elavados uma vez com WFI e duas vezes com 1800ml 2OOmMNaCl, com assentamento durante a noite entre as lava-gens. Os meios foram refluídos com 1800ml 200mM NaCl,vazados na coluna e deizados assenter durante Ih. 0adaptador foi abaixado para -Icm acima do leito de re-sina (remoção de todas as bolhas de ar) e os meios a-densados em 2 OOmM de NaCl a uma taxa de fluxo de4OOml/min (192cm/hr) durante IOmins. Esta taxa de a-densado foi utilizada como equivalente à taxa de fluxode operação máxima para o sistema K-prime disponível emGMP. O adaptador foi abaixado até ao topo do leito e acoluna adensada a 192cm/hr durante 10 mins antes de a-parafusar o adaptador no topo da resina e adensada a192cm/hr durante outro período de IOmins, durante oqual nenhuma compressão da resina foi observada. Oteste de septo foi realizado utilizando-se o método AK-TA Pilot: HIC 1500ml Pack Teste. Para isto, a colunafoi equilibrada com 1 volume de coluna (CV) de 2OOmMNaCl em WFI e testada ao adensamento com 15ml (1% CV)de IM NaCl em WFI a uma taxa de fluxo de 313ml/min(150cm/hr) . A coluna foi lavada com 2CV WFI e armaze-nada com 2CV IOmM NaOH. A coluna adensada tinha umaassimetria de 1,2, uma contagem de placas de 2659 pla-cas/metro, uma CV de 1525ml e altura de leito de12,2cm.
Coluna de sanitisação e equilíbrio
A coluna de Fenil Sefarose 6 FF (baixosub) foi sanitisada com 0,5M NaOH durante 60 minutos,lavada com 2 volumes de coluna (CV) WFI e equilibradacom 5CV IOmM Tris, pH 8 (HIC Tampão B) seguida por 5CV10mM Tris, 1,0M sulfato de amônio, pH 8 (HIC Tampão A).Preparação da carga de HIC
13,48kg (11,05 1) de 3,OM sulfato de amô-nio, IOmM Tris, pH 8 foi adicionado a 22,Ikg de filtra-do de fermentação depois do tratamento Mustang Q (sec-ção 3,1). 0 filtrado foi misturado durante durante 5minutos antes da filtragem através de uma cápsula defiltragem de 0,05m2 (0, 8+0, 45μπι) . O material filtrado(indicado como material de carga de HIC) foi armazenadoem gelo (aproximadamente 30 minutos duração) até serusado.Corrida de coluna HIC
A corrida de HIC foi realizada sob uma ve-locidade de fluxo linear constante de 150cm/horas uti-lizando-se tampões gelados mantidos a 2-8°C. Carrega-ram-se 30 1 de material de alimentação (equivalente a20 1 de filtrado pós-Mustang Q) nos 1525ml de Fenil Se-farose 6 FF (baixo sub) coluna previamente equilibradacom 2CV IOmM Tris, 1,0M sulfato de amônio, pH 8 (HICTampão A). 0 material não ligado foi removido por Ia-vagem da coluna com 10CV HIC Tampão A. A coluna foientão lavada com 5CV IOmM Trisf 0,3M sulfato de amônio,pH 8 (HIC Tampão A2) e as proteínas ligadas eluídas com10CV IOmM Tris, pH 8 (HIC Tampão Β). O primeiro 0,67CV (1 1) do tampão de eluição foi descartado e foi co-letado um agrupamento pós-HIC de 4CV. Leupeptina foiadicionada (126,4ml) ao agrupamento pós-HIC (6191.3g)para uma concentração final de 200μΜ a partir de umasolução de estoque de leupeptina IOmM, IOmM Tris, pH 8.
A solução misturada (6,3kg) foi armazenada a 2-8°C du-rante 2 dias antes de processamento ulterior por fil-tragem de fluxo tangencial.
Etapa 1 de Filtragem por Fluxo Tangencial (TFF1 corridade escala de 20 ln)
Equipmento:
ProFlux M12 TFF system (Millipore)
Condutividade e medidor de pH 4330 (Jenways)Cápsula de filtro Sartopore 2 0,8+0,45μπι (Sartorius)Pellicon 2 membranas "Mini" Filter 0,lm2 30kDa MWCO PES(Millipore).
Unidade de refrigeração Médica MP150 (Electrolux)Materiais/Produtos químicos:
Solução de hidroxido de sódio (4M volumétrics) (AnalaR,BDH)
Tris(hidroximetil)metilamina (classe USP, Merck)Leupeptina (MP Biomedicals, Inc)
Água Hyclone para Injection Quality Water (WFI-QW)
Elevação do Sistema
O sistema ProFlux M12 TFF foi ajustado deacordo com as instruções do fabricante com duas membra-nas Pellicon 2 "Mini" Filter 3OkDa MWCO PES, sanitisadocom 0, 5M NaOH durante 60 minutos e armazenado em 0,1MNaOH até o uso. 0 sistema foi drenado e lavado com 141 WFI e a permeabilidade a água normal (NWP) medida co-mo 23 l/m2/hr/psi a 250C sob uma pressão de transmem-brana (TMP) de 15psig (pressure de entrada de 2Opsig epressure de saída de 10 psig). 0 sistema foi lavadocom 0,5 1 IOmM Tris, pH 8 (tampão de diafiltragem) eequilibrado com 1 1 do mesmo tampão durante 10 minutos.
A condutividade e pH do permeado foi determinado e che-cado novamente no tampão de diafiltragem para assegurarque as membranas fossem equilibradas antes do uso.
Concentração e diafiltragem
As etapas de concentração e diafiltragemforam realizadas com tampão de diafiltragem congelado(IOmM Tris, pH 8) contendo 200μΜ de leupeptina. 0 sis-tema de TFF foi lavado com 1 1 tampão gelado imediata-mente antes do uso. Bombearam-se 2 1 de material pós-HIC (6,3 1 volume total) dentro do reservatório do sis-tema de TFF e recirculou-se durante 10 minutos sem con-tra-pressão para condicionar a membrana. O sensor denível no reservatório foi ajustado para 1,2 1 e o mate-rial pós-HIC concentrado sob uma TMP de 15psig (pressãode entrada de 2Opsig e pressão de saída de IOpsig) atétodo o material ter entrado no sistema. O permeado foicoletado e armazenado a 2-8°C para análise de para. Atubulação de entrada foi conectada ao tampão de tampãode diafiltragem e a diafiltragem do material foi reali-zada a TMP de 15psig (pressão de entrada de 2Opsig epressão de saída de IOpsig) para aproximadamente 8,5volumes de transbordo (TOV), mantendo o volume de mate-rial no reservatório em 1,2 1. A condutividade e pH dopermeado foi determinada depois de 5, 7 e 8,5 TOV echecada contra o tampão de diafiltragem. 0 retentadofoi drenado do sistema e armazenado a 2-8°C. Bombea-ram-se 250ml de tampão de diafiltragem para o reserva-tório, recircularam-se em torno do sistema durante 10minutos withoutsem contrapressão para enxaguar o siste-ma, drenou-se, repetiu-se a enxaguadura e as duas enxa-guaduras foram armazenadas separadamente a 2-8°C. Aconcentração de proteína do retentado eleva-se onde de-terminado (por UV) e a primeira enxaguadura (peso de204,8g) adicionada ao retentado (peso de 1231,4g). Es-te material pós-TFFl material (l,4kg) foi então filtra-do através de uma cápsula de filtro de Sartopore 20,8 + 0.45μm e armazenado a 2-8°C durante a noite atéprocessamento ulterior por cromatografia de troca iôni-ca de Q Sepharose.
Cromatografia de troca Iônica (corrida em escala 20 1)Equipamento:
ÀKTA Pilot instalado com Unicorn 5.01 software (GE He-althcare)
Condutividade e pH Meter 4330 (Jenway)
Coluna Vantage S90 (area seccional 62cm2, Millipore)
Medicai Refrigeration Unit MP150 (Electrolux)
Produtos químicos:
Solução de hidróxido de sódio (volumétrico 4M) (AnalaR,BDH)
Cloreto de sódio (classe USPi Merck)
Tris(hidroximetil)methylamine (USP grade, Merck)
Calcium chloride 2-hidratoe (classe USP, Merck)
Leupeptina (MP Biomedicals, Inc.)
Q Sepharose HP (GE Healthcare)
Hyclone Water para Injeção - Quality Water (WFI-QW)
Guarnecimento de Coluna e preparação
Uma coluna Vantage S90 foi guarnecida UTI-lizando-se um sistema de cromatografia AKTA Pilot commeios HP de Q Sepharose em WFI para proporcionar umacoluna guarnecida com a 10cm altura de leito, portantoum volume de coluna (CV) de 620ml. O guarnecimento foirealizado de acordo com as instruções do fabricante,mas com o limite de pressão da coluna Vantage imposto(0,3MPa) que se equiparou a taxa de fluxo de guarneci-mento de 210cm/hr e limite de pressão de 0,28MPa. De-pois do guarnecimento, a coluna foi equilibrada com 2CVde 0, 2M NaCl e teste de guarnecimento com 1% CV (6,2ml)IM NaCl a uma taxa de fluxo de lOOcm/hr (103ml/min). Acoluna guarnecida tinha uma assimetria de 1,6 e a platecount de 12605 placas/metro, que estava dentro da espe-cificação para os meios (assimetria entre 0,8 e 1,8,com uma contagem de placa >10.000). A coluna foi arma-zenada em IOmM NaOH até ser necessária.
Antes do uso, a coluna de Q Sepharose foilavada com 1,5 volumes de coluna (CV) de WFI para remo-ver o tampão de armazenamento, sanitisada com 0.5M NaOHdurante 6Omins a 4 0cm/hr antes da lavagem novamente com1, 5CV WFI. A coluna foi então carregada e equilibradade acordo com as instruções do fabricante com 2CV IOmMTris, 3mM cloreto e calcium, pH 8 followed by 2CV IOmMTris, 3mM CaCl2, 360mM NaCl, pH 8 e finally 5CV IOmMTris, 3mM CaCl2, pH 8.Coluna run
Imediatamente antesda amostra ser carre-gada na+ coluna, the coluna was reequilibrated withchilled IOmM Tris, 3mM CaCl2, 200μΜ leupeptina pH 8(IEX Tampão A). 1216ml de chilled pós TFF 1 material ata concentration de 2.55mg/ml (determined by UV) was Io-aded onto the coluna at a taxa de fluxo de lOOcm/hr(103ml/min). This equated to a coluna Ioad de 5mg totalprotein per ml de meios. Following loading de the prod-uct, the coluna was washed with 3 coluna volumes (CV)de IEX Tampão A e the protein eluted with IOmM Tris,3mM CaCl2, 360mM NaCli 200μΜ leupeptina, pH 8 (IEX Tam-pão B) with a gradient de 0-40% eluição tampão (A toΒ), over 2OCV at a taxa de fluxo de 70.2ml/min(68cm/hr). Eluição was monitored at 280nm e 260nm e10Oml fraçãos collected across the two product picoscontaining AUX II e AUX I. Fração collection wasstarted from the breakthrough de the pico e continueduntil 25% de the pico height on the trailing edge. Atotal de 12 fraçãos were collected across the AUX IIpico e 15 fraçãos across the AUX I pico. The Q Sepha-rose HP cromatografia was carried out at a standard Ia-boratory temperature de 18-23°C, muito embora the tam-pões usados were pre-chilled. Fraçãos were armazenadoat 2-8°C until a result was obtida a partir de the SDS-PAGE análise. Fraçãos 6 to 12 (pico 1) were pooled asAUX II colagenase with the volume determined as 683g(after sampling) e the concentration by UV análisemeasured as 1.17mg/ml. Fraçãos 19 to 26 (pico 2) werepooled as AUX I colagenase with the volume determinedas 796g (after sampling) e the concentration by UVmeasured as 1.08mg/ml.
Tangential Flow Filtragem etapa 2 (TFF2 2OL proporção run)
Equipment:
ProFlux M12 TFF system (Millipore)Condutividade e pH meter 4330 (Jenways)
Pellicon 2 "Mini" Filter 0.Im2 30kDa MWCO PES membrane(Millipore)
90mm Filter Unit (IL) 0.2μπι PES membrane (Nalgene)Medicai Refrigeration Unit ΜΡ150 (Electrolux)Materiais/Produtos químicos:
Solução de hidróxido de sódio (volumétrico 4M) (AnalaR,BDH)
Tris(hidroximetil)methylamine (USP grade, Merck)Sucrose (BP grade, Merck)Leupeptina (MP Biomedicals, Inc.)Hyclone Water para Injection - Quality Water (WFI-QW)Frensius Kabi Water para Injection (WFI)
Montagem do sistema
O sistema ProFlux M12 TFF foi esquematiza-do de acordo às instruções de manufaturas com dois "Mi-ni" filtros Pellicon 2 3OKDa de membranas MWCO PES, sa-nitisado com 0,5M de NaOH por 60 minutos e depositadoem 0,IM NaOH até o uso. 0 sistema foi drenado e lavadocom água sob pressão com 14L de água WFI e a permeabi-lidade de água normal (PAN) medido como 19,5L/m2/hr/psipelo o uso da membrana por AUXI e como 14, 5L/m2/hr/psiem 250C para o uso da membrana por AUXII em 250C em umapressão trans-membrana (PTM) de 15psig (pressão inicialde 2Opsig e pressão de saida de 10 psig). 0 sistema foilavado com água sob pressão com 0,5L de uma soluçãoIOmM Tris, 6OmM da sacarose, pH 8 (tampão da formula-ção) e equilibrada com IL do mesmo tampão por 10 minu-tos. O penetrar da condutividade e o pH for am determi-nados e testado contra o tampão da formulação.
Concentração e formulação
As etapas de concentração e diafiltragemforam executadas separadamente em cada um dos pós po-ços IEX de AUXI e AUXII. Todas as etapas foram executa-das usando congelamento do tampão da formulação (IOmMTrisf 6OmM sucrose, pH 8) mantidos em 2-8°C. 0 sistemaTFF foi lavado sob pressão com IL de tampão congeladoapenas antes do uso. 0 poço pós-IEX (683g de peso deAUXII and 796g de peso de AUXI) foi bombeado dentro desistema de reservatório TFF e recirculado em 10% da ve-locidade da bomba por 10 minutos sem contra-pressão pa-ra condicionar a membrana. O nível de sensor no reser-vatório foi agrupado para aproximadamente 4OOmL e o po-ço de AUXI e AUXII concentrado em um TMP de 15psig(pressão inicial de 2Opsig e pressão de saída deIOpsig) até o volume no reservatório ter sido reduzidoem aproximadamente 360-390mL (Isto assumiu um sistemaseguro em 10OmL). A redução do volume alvo foi baseadocompletando uma concentração teoria de l,75mg/mL para oproduto assumindo a não perda na proteína durante a o-peração de concentração. O penetra foi coletado e depo-sitado em 2-8°C para análise. Para a operação de dia-filtragem, o tubo inicial foi conectado para um tampãoda formulação em um TMP de 15psig (pressão inicial de2Opsig e pressão de saída de IOpsig). Aproximadamente12 voltas de volumne (TOV) foram executados para AUXIIe 8,5 TOVs para AUXIf mantendo o volume de material emum reservatório de -40OmL. A condutividade e pH do per-meate foi determinada após 12 TOV para AUXII e após 6,7, e 8.5 TOVs para AUXI e testados contra o tampão daformulação. 0 retentate foi drenado a partir do sistemae depositado em 2-8°C.
25OmL do tampão da formulação foi usado para lavar pro-dutos de residues das membranas por recirculado em vol-ta do sistema por 10 minutos (sem contrapressão) . De-pois de drenar a solução de enxague, foi executada umasegunda lavagem e ambos os enxagues 1 e 2 foram deposi-tados em 2 -8°C. Após a determinação do conteúdo da pro-teína do retentate e enxagues, a primeiro enxague foiacrescido ao retentate, misturado e um UV da concentra-ção da proteína agitada foi determinada. Para AUXII,122g do Segundo enxague também foi adicionado ao reten-tate com mais um enxague para dar uma concentração teó-rica AUXII de 1,Img/mL. Para AUXI, 94g do Segundo enxa-gue foi adicionado ao material para dar uma concentra-ção teórica AUXI de l,lmg/mL. Ambos os materiais AUXI eAUXII foram filtrados através de uma unidade de filtroIL Nalgene 0.2μπι filter em IL na classe II e a proteínapós-filtrada determinada. Os intermediaries do AUXI eAUXII foram depositados em 2-8°C.
Determinação da concentração da proteína
Absorbância
Equipmento:
Espectrofotômetro DU800 (Beckman)Nos processos, as amostras foram analisa-das por espectrofotometria de UV, executando um escande UV das amostras entre 220 and 330nm. 0 tampão apro-priado foi usado como um ensaio em branco e um escan dotampão do ensaio em branco executado antes do escanea-mento das amostras. Quando necessário, as amostras fo-ram diluídas com o mesmo tampão para assegurar a A280 <1,0 AU. As concentrações das proteínas (mg/mL) foramdeterminadas de acordo à lei de Lambert-Beer, c =A/b.ε, onde A le a absorbância (A280 - A330) , b é ocomprimento da trajetória (l,0cm) e ε é o coeficientede extinção da proteína. Foram usados coeficiente deextinção de 1,48mg-Icm-ImL para AUXI, 1,576mg-Icm-ImLpara AUXII and 1,428mg-Icm-ImL para uma mistura AU-XI/AUXII.
Ensaio Bradford
Materiais:
BSA Liofilisada (hidratado para l,4mg/mL)Produtos Químicos:
Ensaio de reagente corante concentrado da proteína(500-0006, Bio-Rad)
Uma curva modelo BSA foi preparada peladiluição da BSA com água, para saber as concentrações.
O ensaio Bio-Rad do reagent corante da proteína foipreparado pela diluição de uma parte comcentrada comquatro partes de água. Amostras testes foram preparadaspela diluição com água. 50μL das amostras testes tantoconcentrada tanto diluída foi adicionada à uma cubeta eadicionados 2,5mL de reagente diluído. As amostras fo-ram preparadas em duplicata. As amostras foram incuba-das por 10 minutos antes de ler o OD. A curva modelo deOD595nm vs. cocentração de proteína foi obtida calcu-lando os OD595nm das soluões de BSA já conhecidas. Asamostras testes foram então ensaiadas e as concentra-ções das proteínas determinadas a partir do ensaio dacurva padrão da proteína. As amostras após as etapasMustang Q foram sempre analisadas sem diluição afim depadronizar a contribuição a partir de um pigmento. Nes-te caso, 50/uL de um material não-diluído após Mustang Qfoi utilizado no ensaio.
Análise de um ensaio SDS-PAGE:
Equipmento:
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System (Invi-trogen)
Electrophoresis Power Supply EPS 601, (Amersham Pharma-cia Biotech)
Rocky shaker platform, (Scientific Laboratory Supplies)
Reagentes:
Modelo de alto peso molecular para um ensaio SDS-PAGE(161-0303, Bio Rad)
Markl2 Unstained Standard (LC5677, Invitrogen)
Novex 8% Tris-Glycine gels, l,5mm, 10 well (EC6OI8BOX,Invitrogen)
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gels, l,0mm, 12 well(NP0322BQX, Invitrogen)Novex Tris-Glicina SDS Tampão de corrida (IOx) (LC2675,Invitrogen)
NuPAGE MES SDS Tampão de corrida (20x) (NP0002, Invi-trogen)
Novex Tris-Glicina SDS Amostra de tampão (2x) (LC2676,Invitrogen)
NuPAGE LDS Amostra de tampão (4x) (NP0007, Invitrogen)NuPAGE Amostra de reagent redutor (IOx) (NP0009, Invi-trogen)
Kit de corante azul coloidal(LC6025, Invitrogen)
Sal Etilenodiaminotetra-acetato disódico AnalaR R (BDH)Géis de tris-Glicina
Amostras foram preparadas pela redução daSDS-PAGE pela adição 12μ1 de amostra para 20μ1 do tam-pão da amostra (2x) , 4μ1 de agente redutor (IOx) and4μ1 de 0,IM da solução de EDTA (para concluir a concen-tração final de IOmM). 0 alto peso molecular (HMW) mar-cador foi preparado pela adição de ΙΟμΙ do cocentradoem estoque para 80μ1 do agente redutor (IOx), 310μ1 deWFI and 400μ1 da amotra tampão (2x) . 0 modelo diluídode alto peso molecular foi então aquecido em 95oC por 5minutos antes de aliquotar e depositar em -2OoC parauso de géis subsequentes. Amostras (20μ1 de volume li-do) contend colagenáses foram corridas diretamente (is-Tris-Glicina usando tampão de corrida Tris-Glycine em13OV por ~2 horas. Após a eletroforese, os géis foramcorados com o reagente corante azul coloidal como feitonas instruções.
Géis de Bis-Tris
Amostras foram preparadas por redução do ensaio de SDS-PAGE pela adição de 16,5μ1 de amostra para 7.5μ1 detampão da amostra (4x), 3μ1 de agente redutor (IOx) e3μ1 da solução de EDTA 0.IM (para concluir a concentra-ção final de IOmM). O marcador MARK 12 leu em ordem(10μ1). Amostras (15μ1 de volume lido) contendo cola-genáses foram corridas diretamente (isto é, sem préviotratamento térmico) em géis Bis-Tris 4-12% usando tantopara o tampão de corrida MES em 2 OOV durante~4Ominutos. Após a eletroforése, os géis foram coradosou com o reagente corante azul coloidal como descritopelas instruções manufaturadas ou corantes prateadosusando o procedimento padrão (GE Healthcare).Análisedensitométrica das frações pós-IEX
Equ ipamento:
Sistema de Eletroforése Xcell SureLock Mini-Cell (Invi-trogen)
Electrophoresis Power Supply EPS 601, (Amersham Pharma-cia Biotech)
Rocky shaker platform, (Scientific Laboratory Supplies)Flatbed scanner (Hewlett Packard)
Materiais e Reagentes:
NuPAGE Novex 4-12% Géis de Bis-Tris, l.Omm, 12 well(NP0322BQX, Invitrogen)NuPAGE MES SDS Tampão de corrida (20x) (NP0002, Invi-trogen)
NuPAGE LDS Tampão de amostra (4x) (NP0007, Invitrogen)NuPAGE Agente redutor de amostras (IOx) (NP0009, Invi-trogen)
Markl2 Padrão sem mancha (LC5677, Invitrogen)Kit de corante azul coloidal (LC6025, Invitrogen)Sal Etilenodiaminotetra-acetato disódico (EDTA-Na2) (A-nalaR, BDH)
Água purificada
Reducing SDS-PAGE
As amostras pós-IEX foram corridas em géisBis-Tris 4-12% usando tampão de corrida MES at1μg/faixa lida. As amostras foram preparadas pela adi-ção de 2 0/xL de material diluído pós-IEX para 8μL> Tampãoda amostra (4x) , 3μL> Agente redutor (IOx) e 3,4μL dasolução de EDTA 0.1M. 15μ1, de cada amostra foi lidadentro diretamente da fonte após agitação (isto é, semtratamento prévio de aquecimento) e corrida em 2OOV du-2 0 rante 4 0 minutos. Após a eletroforése, os géis foramcorados com o reagente corante azul coloidal de acordocom as instruções manufaturadas mas com duração de umcorante fixado para reduzir a variação do corante (10minutos fixado, 5 horas corando, 15-20 horas descorandocom água purificada).
Escaneamento e densitometria dos Géis
Os géis foram colocados entre 2 lâminas deacetato assegurando a remoção de todas as bolhas de ar,escaneado em um scanner de fundo achatado na resoluçãode 600dpi e a imagem cortada,redimensionado e a colora-ção corrigida com o programa HP image zone. A imagemfoi convertida para uma iamgem TIFF grayscale 8-bit co-mum programa Alpha EaseFC e as bandas das proteínas fo-ram analisadas usando um programa de documentação degel quantidade única (BioRad). Após a substituição dofundo, a intensidade das areas dos picos das bandas se-lecionadas foram convertidas a uns valores de porcenta-gem relativa do produto (AUXI ou AUXII) e as impurezasem cada faixa.
Estabilidade de Tampão
Eguipamento:
Peristaltic Pump (Watson Marlow)
125ml PETG biotainers (Cellon)
Watson Marlow Tubing para bomba peristáltica
Condutividade e pH Meter 433 0 (Jenway)
Sartopore 2 300 (0,45/0,2jum) capsule de filtro (Sarto-rius)
Tampões para a corrida de demonstração de20 1 foram filtrados depois de preparação através d eu-ma cápsula de filtro de 0,45/0,2μπι em bolsas Stedim de10 ou 20 1 para armazenamento sob de 2-8°C antes de se-rem usados.
Quando a maior parte do tampão foi diltra-do, aproximadamente 75 mis do tampão remanescente foramcoletados em bio-recipientes 125ml PETG pré-rotulados earmazenado a 2-8°C. O pH, condutividade, temperature edata de preparação de tampão foram recuperados do arma-zenamento frio e novamente testados quanto a pH, condu-tividade, e aparência. A temperatura do tampão na oca-sião do teste também foi registrada.
Preparação de amostras para análise de seqüência N-terminal
Equ ipmento:
Electrophoresis Power Supply EPS 601, (Amersham Phar-macia Biotech)
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System, (Invi-trogen)
Rocky shaker platform, (Scientific Laboratory Supplies)Produtos químicos:
Novex 8% Tris-Glycine Gel, 1.5mm, 10 well, (Invitrogen)High Molecular Weight Marker, (BioRad)
NuPAGE Amostra Reducing Agent (IOx), (Invitrogen)Novex Tris-Glycine SDS Running Tampão (IOx), (Invitrogen)
Novex Tris-Glycine SDS Amostra Tampão (2x), (Invitrogen)
Kit de Colloidal Blue Staining , (Invitrogen)Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetra-acético (ED-TA) (AnalaR, BDH)
Metanol, AnalaR (BDH)
Ácido acético, AnalaR (BDH)
Água para injeção (WFI)
Água Purificada
Amostras para seqüência N-terminal forampreparadas e separadas em géis de Tris-Glicine 8% comosalientado anteriormente. Amostras identificadas comoenriquecidas para o contaminante 4OkDa (fração 2 a par-tir de pico de pós IEX AUXII, CTL2006#0610H;) e conta-minante 55kDa (fração 16 proveniente do pico pós IEXAUXI, CTL2 006#0611H) foram carregadas cada uma em 5faixas do gel para proporcionar material suficiente PA-ra sequenciação (Figura 89). Frações pós IEX proveni-entes de uma fermentação 20 l anterior (20 l PP3), queforam enriquecidas para os contaminantes 90kDa associa-dos com AUXI (fração B7 R2, CTL2006#0581P) e AUXII(fração Dl, CTL2006#0582P) foram também carregados emdiversas faixas (Figura 90). Depois de electroforese,os géis foram coloridos com reagente de coloração deasul colloidal de acordo com as instruções do fabrican-te e as bandas contaminantes cortadas e submetidas aAlta Bioscience (Birmingham University, UK) para se-qüenciamento N-terminal. O contaminante associado aAUXI 90kDa (CTL2006#0612H) proveniente da corrida dedemonstração de 20 1 também foi submetido a sequencia-mento, mas não se obtiveram nenhuns dados.
SUMÁRIO DO PROCESSO DE MANUFATURA 3
Fermentação
O processo de fermentação de lote alimen-tado de fitona (Processo 2) para produção de colagenasea partir de Clostridium histolyticum tinha mostrado seraltamente variável devido à variabilidade de lote paralote na Peptona fitona. Por esta razão Peptona de Pro-teose #3 (ΡΡ3) foi avaliada em fermentações de 5 l. Aavaliação demonstrou que quando se usa vim lote especi-fico de PP3 a 50g/l o processo de fermentação foi ro-busto e suscetível de ser reproduzido. Entretanto,quando outros lotes de PP3 foram empregados a 50g/l ob-servaram-se grandes variações nos perfis de crescimen-tos das cultivações. A concentração de biomassa máximaque os vários lotes de PP3 suportarão foi avaliada emuma avaliação de pequena escala. Estes lotes foramconsiderados "bons" ou "pobres" com base na sua capaci-dade de suportarem concentrações de biomassa altas oubaixas de C. histolyticum, respectivamente. Quando Du-as fermentações foram executadas emu ma proporção de 51 com lotes de PP3 "pobres" e "bons" sob 100g/l os doisdemonstraram perfis de crescimentos e rendimentos deprodutos. Esta experiência mostrou que o aumento daconcentração de PP3 a 100g/l aliviou o problema associ-ado à variação de lote para lote na peptona.
Uma fermentação de aumento foi realizadaem 200 1. A fermentação usou a concentração otimizadade PP3 (100g/l). A fermentação foi bem sucedida e re-plicou tanto o perfil de crescimento quanto o rendimen-to/qualidade de produto observado na escala de 5 l.atedboth the perfil de crescimento e product yield/qualityobserved at 5 l proporção. The processo de colheita
(clarificação por filtragem) desenvolvido para o Pro-cesso 2 foi evaliado durante a fermentação de alimentode 200 l. A cultura de células foi clarificada com ê-xito utilizando-se o processo existente sem bloqueio dotrem de filtragem.
A quantificação de concentração de colage-nase em amostras de fermentação bruta foi aperfeiçoadautilizando-se análise densitométrica de géis de TrisGl icina coloridos por Coomassie. Uma curva padrão deAUXI e AUXII misturadas foi carregada com diluições deamostras de fermentação. A relação entre concentraçãode colagenase e área de picode densitometria mostrouser linear dentro da faixa de diluições de amostra.Sal de ácido concentrações de colagenase nas amostrasforam então extrapoladas utilizando-se sua área de picoe a curva padrão. Este método avaliou o rendimento decolagenase como sendo 280 - 350mg/l a partir do proces-so PP3 100g/l sob escala de 5 e 200 1.
0 processo de fermentação de PP3 otimizadogerou uma concentração de biomassa mais alta (OD6OO 7unidades) e aumentou o rendimento do produto (280 -35Omg/1 de colagenase total, por densitometria quanti-tativa) quando comparado ao processo de lote alimentadode Fitona. 0 filtrado de fermentação continha signifi-cativamente menos clostripaina do que o processo de Fi-tona. A relação de AUXI:AUXII foi mais próxima de 1comparada com aquela observada durante a avaliação doProcesso 2. Em resumo, o processo PP3 aumentou o ren-dimento de produto, pureza (pós-fermentação) e reprodu-tibilidade da fermentação.
PurificaçãoO Processo 3 foi desenvolvido em um quadrode tempo acelerado a fim de aperfeiçoar os processosanteriormente desenvolvidos na Cobra (Processo 2) e re-alizado na proporção de 20 1 na GMP. Os aperfeiçoamen-tos principais realizados no processo foram feitos afim de simplificar o procedimento de purificação, faci-litar a robustez bem como tornar o processo mais aces-sível ao aumento para 200 1. Estes aperfeiçoamentostambém foram considerados elementos chave para ajudarna validação do processo.
0 Processo 3 foi realizado utilizando-sematerial proveniente de uma fermentação 200 1 a partir-de Clostridium histolyticum em que uma fermentação de2 0 1 plena foi purificada. 0 material foi processadodiretamente a partir da fermentação e nenhuma etapa deretenção foi implementada. Em seguida à filtragem, oproduto foi levado a passar através de um filtro Mus-tang Q uma vez que experiências em pequena escala de-monstraram redução de dsDNA (tal como detectado por a-nálise de pico verde) utilizando-se este procedimento.Análise de amostras em-processo a partir da corrida dedemonstraação de 20 1, entretanto, mostraram nenhumaredução no dsDNA sugerindo que a robustez e aplicaçãodesta etapa requeria maior investigação. Uma compara-ção dos parâmetros usados para a execução de 20 1 e ex-periências de pequena proporção anteriores demonstrarama remoção de dsDNA quando a cápsula superdimensionadapor um fator de 1000 (baseado nas capacidades de liga-ção da cápsula 15-25mg DNA/ml descrita pelo fabrican-te) . Em comparação, a cápsula usada na execução de 201 foi superdimensionada por um fator de aproximadamente177-296. Material proveniente da Cápsula Mustang Q foimantida durante a noite a 2-8°C. Um estudo de estabi-lidade fora de linha em material de amostra tomado nes-te estágio no processo indicou que a manutenção de umabaixa temperatura foi a chave para a estabilidade doproduto neste ponto no processo, uma vez que amostrasincubadas sob temperatura ambiente e 370C foram susce-tíveis a degradação conforme indicado por análise deSDS-PAGE.
Produto proveniente da Cápsula Mustang Qfoi preparedado para cromatografia de interação hidro-fóbica (HIC) pela adição e mistura de uma solução desulfato de amônio (3M) para conseguir uma concentraçãofinal de IM. Isto proporcionou condições adequadas pa-ra ligação de colagenase aos meios de Fenil Sefarose FF(baixo sub). Uma proporção de contaminantes de protei-na e pigmento foram então eluxdos a partir da colunaHIC utilizando-se uma etapa de eluição de sulfato deamônio 0.3M seguida por eluição de produto de colágena-se com uma solução que não continha sulfato de amônio.Os critérios para a coleta do pico do produto foram ES-tabelecidos como um volume fixo de coluna de 4 volumes(muito embora este fosse depois estendido para colunade 5 volumes para ζ corrida de demonstração de aumentode 200 1) . Leupeptina foi então adicionada imediata-mente em seguida à eluição e o material mantido Duranteum período de 2 dias a 2- 8°C. 0 rendimento a partirdesta etapa foi difícil de determinar com exatidão de-vido à natureza complexa do material de suprimento. 0rendimento da etapa de processo foi estimada como (i)3 8% baseada no ensaio Bradford da carga e UV do materi-al eluído ou (ii) 47% baseado no teor de colagenase nacarga estimada por densitometria e UV do material eluí-do. Alternativamente, 0,17 g da proteína total foi e-luído a partir da coluna HIC para o equivalente de cada1 1 filtrado de fermentação aplicada.
O agrupamento pós - HIC foi preparado paraa purificação de Q-Sepharose purificação por concentra-ção (5- vezes) e troca de tampão utilizando-se filtra-gem de fluxo tangencial (TFFl) utilizando-se 2 χ 0,lm2membranas 3OkDa. Nenhuma perda foi detectada nesta e-tapa e o aumento reportado ne proteína recuperada poderefletir a imprecisão de UV neste ponto do processo. Aimprecisão podia ser atribuída à contaminação de pig-mento ou ao uso do coeficiente de extinção para colage-nases, o que será menos preciso para material mais cedona purificação quando um complexo de proteínas tem Pro-babilidade de estar presente. A etapa TFF foi comple-tada por xima etapa de filtragem de produto antes demanter o material a 2-80C durante a noite.
Da mesma forma que com o Processo 2, a co-luna de Q-Sepharose foi uma etapa de purificação chaveno Processo 3 e resultou na separação das colagenasesAUXI e AUXII. Os contaminantes associados com o pro-cesso 3, entretanto, foram diferentes daqueles no pro-cesso 2 e pareceram co-purificar estreitamente com osprodutos AUXI e AUXII. Entretanto, foi possível remo-ver os contaminantes dos produtos por fracionamento dospicos de produto uma vez que os contaminantes parecerameluir nos picos de bordas dianteira ou traseira ou nasduas. Os contaminantes foram assinalados por sua massamolecular relativa no SDS-PAGE redutor aqueles associa-dos com o produto AUXII (o primeiro pico eluído a par-tir da coluna de Q-Sepharose) foram identificados como
(i) 40kDa (associados com a borda dianteira do pico) e
(ii) 75kDa e 90kDa (associados com a borda traseira dopico). Seqüenciamento de aminoácido N-terminal indicouque a 4OkDa foi relacionada a AUXII, uma vez que a se-qüência casou a identidade com uma região da seqüênciaCol H. Em comparação, nenhuma identidade poderia serconfirmada para o contaminante 90kDa devido a problemasde sinal baixo. Os contaminantes associados com o pro-duto AUXI (o Segundo pico eluído a partir da coluna deQ-Sepharose) foram (i) 55kDa (associado com a borda di-anteira do pico) e (ii) 9OkDa (associado com a bordatraseira do pico). Seqüenciamento N-terminal mostrouque os dois contaminantes 55kDa e 9OkDa a ser identifi-cados como relacionados a AUXI onde o contaminante55kDa mostrou identidade de seqüência com uma regiãomediana na seqüência Col Gea 9OkDa mostrou coincidên-cia N-terminal identical para AUXI. Conseqüentemente,as impurezas principais identificadas neste estágio noprocesso foram todas relacionadas a produto e seja i-dentificadas como produtos de clivagem interna de AUXI(55kDa) e AUXII (4OkDa) ou um produto de AUXI (9OkDa),clivado C-terminalmente
Em seguida à coluna de Q-Sepharose, umaetapa de processoo chave foi na decisão quanto a quaisfrações deveriam seguir adiante para maior purificação.Para a corrida de demonstração de 20 1 estes critériosforam baseados nas intensidades de coloração relativade contaminantes para produto quando analisadas porSDS-PAGE a 4-12% e coloridas com corante Colloidal Blu-e. A decisão foi subjetiva e baseada na experiênciacoletiva do grupo de desenvolvimento do processoo, bemcomo nas solicitações do cliente. A fim de se estabe-lecer critérios definidos que descrevessem o procedi-mento de partilhamento, realizou-se densitometria emSDS-PAGE. A partir desta, o partilhamento foi descritocomo incluindo frações que eram >87% puras (com nenhumaimpureza individual >10%) para AUXI e >94% pura (comnenhuma impureza individual ^4%) para AUXII. Isto re-sultou em um rendimento de etapa baseado em estimativapor UV de 27,7% e 25,8% para AUXI e AUXII, respectiva-mente. Refinamento adicional e padronização do métodode densitometria foi conseguido a partir de dados ad-quiridos a partir da demonstração de escala de 200 1executada que resultou na definição dos critérios modi-ficados para a corrida de GMP subseqüente.Frações contendo produto AUXI ou AUXII apartir da coluna de Q-Sepharose coluna foram formuladasseparadamente por TFF (assinalado como TFF2) utilizan-do-se membraneal χ 0,lm2 30kDa para cada colagenase. Otampão de formulação de IOmM Tris, 6OmM sacarina pH 8,tinha sido estabelecido por KBI BioPharma Inc. 0 pro-duto foi filtrado em seguida à etapa TFF2 e os rendi-mentos de etapa globais para TFF e filtragem estimadoscomo 97,5% para AUXI e 92,2% para AUXII. Neste estágioas amostras foram referidas como intermediários e foramretidas a 2-80C para análise QC e antes da mistura dasubstância medicamentosa. Um estudo de estabilidaderetrospectiva indicou que os intermediários foram está-veis durante um período de pelo menos 5 dias a 2-80Cconforme determinado por análise de SDS-PAGE, UV, RP-HPLC e SEC-HPLC. A única deterioração detectada nosintermediários foi identificada no intermediário AUXIIdepois de uma retenção de 12 dias em que os níveis deagregado aumentaram de 0 para 0,62%.
Os intermediários AUXI e AUXII foram mis-turados em igual proporção (tal como determinado porUV) para gerar a substância medicamentosa antes de rea-lizar a filtragem de produto final. Somente 400mg desubstância medicamentosa foram preparados, dos quais2OOmg foram embarcados para a KBI BioPharma Inc. juntocom 25mg de cada intermediário. 0 rendimento do pro-cesso global foi estinado para a corrida de demonstra-ção de 20 1, em que todo o material disponível proveni-ente do material de alimentação de fermentação de 20 1tinha sido processado e supondo-se que todo o materialtenha sido misturado às substância medicamentosa. Istodeu um rendimento previsto de l,6g de substância medi-camentosa para a purificação na escala de 20 l. Istofoi equivalente a uma recuperação de processo de 17,8%com base na suposição de que a estimativa inicial de 9g(utilizando-se o ensaio de Bradford) para a quantidadede proteína total disponível para carregar a coluna HICfoi exata. Alternativamente, se a proteína disponíveltotal foi relacionada com o teor de colagenasena cargade HIC (tal como estimada por densitometria) o rendi-mento do processo global foi calculado como sendo 22%.
Adicionalmente à execução do processo, re-alizaram-se alguns estudos preliminares nos retidos daamostra e tampão obtidos a partir do processo para Ava-liar a estabilidade. Estes dados indicaram que para oproduto, baixa temperatura foi um fator chave no con-trole da degradação e amostras coletadas antecipadamen-te na purificação (antes da coluna de Q-Sepharose) fo-ram mais suscetíveis a proteólise. Entretanto, um es-tudo de retenção de produto mostrou que a combinação deleupeptina e controle de temperatura (2-8°C) foi bemsucedida em manter a qualidade do produto no decorrerdos cursos antecipados para o processo de GMP.
As Tabelas 54 e 55 detalham as especifica-ções analíticas dos intermediários AUX-I e AUX-II etambém para Substância medicamentosa para o Processo 3.Tabela 54: Especificações Analíticas para intermediá-rios AUX-I e AUX-II de Processo 3
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♦Testes requeridos para liberação provisória de inter-mediários para ulterior manufatura
Tabela 55: Especificações Analíticas para SubstânciaMedicamentosa de Processo 3
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*Testes required para liberação provisória de Substân-cia medicamentosa para manufatura ulterior.
A patente e literatura científica referidaneste contexto estabelecem o conhecimento que se encon-tra disponível para aqueles versados na técnica. Todasas patentes dos Estados Unidos e pedidos de patentesdos Estados Unidos publicados ou não publicados citadosneste contexto são incorporados por referência. Todasas patentes e pedidos de patente estrangeiros publica-dos citados neste contexto ficam incorporados por re-ferência. Todas as outras referências, publicadas, do-cumentos, manuscritos e literatura científica citadaneste contexto ficam incorporadas por referência.
Embora esta invenção fosse particularmenteilustrada e descrita com referência a concretizaçõespreferidas da mesma, será compreendido por aqueles ver-sados na técnica que várias alterações na forma e deta-lhes podem ser realizadas sem com isso se escaper doescopo da invenção abrangido pelas reivindicações ane-xas .
Claims (47)
1. Produto medicamentoso, caracterizadopor consistir de colagenase I e colagenase II que tem aseqüência de colagenase I e colagenase II de Clostridi-um histolyticum, respectivamente, tendo uma relação, emmassa, de cerca de 1 para 1 com uma pureza de pelo me-nos 95%, por área.
2. Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por o produto medicamen-toso ter uma atividade de ensaio de SRC para colagenaseI de cerca de 13.000 até cerca de 23.000 fSRC unida-des/mg, e uma atividade de ensaio GPA para colagenaseII de cerca de 200.000 até cerca de 380.000 fGPA unida-des/mg, quando o produto medicamentoso está em IOmM a-mortecedor Tris buffer e 60mM sacarina, sob um pH decerca de 8.
3. Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 1, caracterizado por o produto medicamen-toso conter menos do que cerca de 2%, por área, de pro-teina agregada.
4. Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 3, caracterizado por o produto medicamen-toso conter menos do que cerca de 1%, por área, declostripaina.
5. Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 4, caracterizado por o produto medicamen-toso conter menos do que cerca de 1%, por área, de ge-latinase.
6. - Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 5, caracterizado por o produto medicamen-toso conter menos do que cerca de 1% ug/mg (p/p) deleupeptina.
7. - Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 6, caracterizado por ter uma biocarga me-nor do que 1 cfu/ml, e em que o produto medicamentoso éesterilizado.
8. - Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 7, caracterizado por conter menos do queEU/ml de endotoxina.
9. - Produto medicamentoso, de acordo com areivindicação 7, caracterizado por conter menos do queEU/mg de endotoxina.
10. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por a colagenase I e-11 ter uma pureza de pelo menos cerca de 97%, por área.
11. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por compreender aindaum excipiente farmaceuticamente aceitável.
12. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por o produto medica-mentoso ser um pó liofilizado estéril que é armazenadoa uma temperatura de cerca de 5°C.
13. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 11, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma composição injetável liofilizada formu-lada com sacarina, Tris e com um nivel de pH de cercade 8,0.
14. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 13, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável Iio-filizada que compreende cerca de 0,9 mg do dito produ-to medicamentoso, cerca de 18,5 mg de sacarina e cercade 1,.1 mg de Tris, e em que o objetivo de um volume depreenchimento de frasco é cerca de 0,9 ml.
15. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 13, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável Iio-filizada que compreende cerca de 0,58 mg do dito pro-duto medicamentoso, cerca de 12,0 mg de sacarina e cer-ca de 0,7 mg de Tris.
16. - Kit, caracterizado por compreenderum frasco para proporcionar o produto medicamentosoconforme descrito na reivindicação 11 e instruções queexplicam como distribuir o dito produto medicamentosocom o dito dispositivo.
17. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado por o produto medica-mentoso ser usado para tratar um paciente que padece deuma enfermidade mediada por colagênio.
18. - Produto medicamentoso que consiste decolagenase I e colagenase II que tem a seqüência de co-lagenase I e colagenase II de Clostridium histolyticum,respectivamente, tendo uma relação, em massa, de cercade 1 para 1 com uma pureza de pelo menos 95%, por área,caracterizado por a preparação do produto medicamentosocompreender as etapas de:a) fermentar Clostridium histolyticum;b) colher uma fermentação bruta que compreendecolagenase I e colagenase II;c) purificar colagenase I e colagenase II a par-tir da colheita bruta por meio de filtragem ecromatografia de coluna; ed) combinar a colagenase I e colagenase II puri-ficada a partir da etapa (c) sob uma proporçãode cerca de 1 para 1.
19. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por o produto medica-mentoso ter uma atividade de ensaio de SRC para colage-nase I de cerca de 13.000 até cerca de 23.000 unida-des/mg de fSRC, e uma atividade de ensaio de GPA paracolagenase II de cerca de 200,000 até cerca de 380.000unidades/mg de fGPA.
20. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por a pureza ser pelomenos 97%, por área.
21. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por a pureza ser pelomenos 98%, por área.
22. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por as preparações dogrupo de células serem conduzidas na presença de pepto-na de fitona ou peptona vegetal.
23. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por a etapa de fer-mentação compreender as etapas de:a) inocular o meio em um primeiro estágio comClostridium histolyticum e submeter a mistura aagitação;b) incubar a mistura proveniente da etapa (a)para obter uma alíquota;c) inocular o meio em um segundo estágio com alí-quotas resultantes da etapa (b) e submeter amistura a agitação;d) incubar as misturas provenientes da etapa (c);e) inocular o meio em um terceiro estágio com a-líquotas resultantes da etapa (d) e submeter aagitação;f) incubar misturas provenientes da etapa (e);g) inocular o meio em um quarto estágio com umaalíquota resultante da etapa (f) e submeter aagitação;h) incubar misturas provenientes da etapa (g); ei) colher a cultura resultante da etapa (h) pormeio de filtragem.
24. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por a etapa de puri-ficação compreender as etapas de:a) filtragem da colheita bruta através deuma coluna Mustang Q;b) adicionar sulfato de amônio;c) filtrar a colheita btuta;d) submeter o filtrado através de uma co-luna HIC;e) adicionar leupeptina ao filtrado;f) remover o sulfato de amônio e manter aleupeptina para vinculação correta de colagenase I ecolagenase II com permute de amortecedor por TFF;g) filtrar a mistura da etapa (f);h) separar colagenase I e colagenase IIutilizando-se Q-Sepharose HP;i) preparar concentração de TFF e formula-ção para colagenase I e colagenase II separadamente; ej) filtrar através de um sistema de fil-tragem de 0,2 μm.
25. Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por o produto medica-mentoso ser armazenado a uma temperatura de cerca de -70°C.
26. Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por compreender aindaum excipiente farmaceuticamente aceitável.
27. Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por o produto medica-mentoso ser um pó liofilizado estéril e ser armazenadoa uma temperatura de cerca de 5°C.
28. Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 26, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma composição injetável liofilizada formu-lada com Sacarina, Tris e com um nível de pH de cercade 8,0.
29. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 28, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável Iio-filizada que compreende cerca de 0,9 mg do dito produ-to medicamentoso, cerca de 18,5 mg de sacarina e cercade 1,1 mg de Tris, e em que o objetivo de um volume depreenchimento de frasco é cerca de 0,9 ml.
30. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 28, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável Iio-filizada que compreende cerca de 0,58 mg do dito pro-duto medicamentoso, cerca de 12,0 mg de sacarina e cer-ca de 0,7 mg de Tris.
31. - Kit, caracterizado por que compreen-de um frasco para proporcionar produto medicamentosoconforme definido na reivindicação 26, e instruções queexplicam como distribuir o dito produto medicamentosocom o dito dispositivo.
32. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 18, caracterizado por o produto medica-mentoso ser usado para tratar um paciente que padece deuma enfermidade mediada por colagênio.
33. - Processo para produzir um produto me-dicamentoso conforme descrito na reivindicação 1,caracterizado por compreender as etapas de:a) promover a fermentação de Clostridium his-tolyticum;b) colher a fermentação bruta que compreende co-lagenase I e colagenase II;c) purificar a colagenase I e colagenase II apartir da colheita bruta por meio de filtrageme cromatografia de coluna; ed) combinar a colagenase I e colagenase II puri-ficadas a partir da etapa (c) sob uma relaçãode cerca de 1 para 1.
34. - Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por o produto medicamentoso serdotado de uma atividade de ensaio de SRC para colagena-se I de cerca de 13.000 até cerca de 23.000 unidades/mgde fSRC, e uma atividade de ensaio de GPA para colage-nase II de cerca de 200.000 até cerca de 380.000 unida-des/mg de fGPA.
35. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 33, caracterizado por o produto medica-mentoso ser dotado de uma pureza de pelo menos 97%, porárea.
36. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 33, caracterizado por o produto medica-mentoso ser dotado de uma pureza de pelo menos 98%, porárea.
37. - Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por as preparações do grupo decélulas serem conduzidas na presença de peptona de fi—tona ou peptona vegetal.
38. Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por a etapa de fermentação com-preender as etapas de:a) inocular o meio em um primeiro estágio comClostridium histolyticum e submeter a misturaa agitação;b) incubar a mistura proveniente da etapa (a) pa-ra se obter uma alíquota;c) inocular o meio em um segundo estágio com alí-quotas resultantes da etapa (b) e submeter amistura a agitação;d) incubar as misturas provenientes da etapa (c);e) inocular o meio em um terceiro estágio com a-líquotas resultantes da etapa (d) e submetera agitação;f) incubar misturas provenientes da etapa (e);g) inocular o meio em um quarto estágio com umaalíquota resultante da etapa (f) e submeter aagitação;h) incubar misturas provenientes da etapa (g); ei) colher a cultura resultante da etapa (h) pormeio de filtragem.
39. Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por a etapa de purificação com-preender as etapas de:a) filtrar a colheita bruta através de uma colunaMustang Q;b) adicionar sulfato de amônio;c) filtrar a colheita bruta;d) fazer passar o filtrado através de uma colunade HIC;e) adicionar leupeptina ao filtrado;f) remover o sulfato de amônio e manter a leupep-tina para vinculação correta de colagenase I ecolagenase II com permute de amortecedor porT FF;g) filtrar a mistura da etapa (f);h) separar colagenase I e colagenase II utilizan-do-se Q-Sepharose HP;i) preparar concentração de TFF e formulação paracolagenase I e colagenase II separadamente; ej) filtrar através de um sistema de filtragem de-0,2 μm.
40. - Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por o produto medicamentoso serarmazenado a uma temperatura de cerca de -70°C.
41. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 33, caracterizado por compreender aindaum excipiente farmaceuticamente aceitável.
42. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 33, caracterizado por o produto medica-mentoso ser um pó liofilizado estéril e ser armazenadoa uma temperatura de cerca de 5°C.
43. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 33, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma composição injetável liofilizada formu-lada com Sacarina, Tris e com um nível de pH de cercade 8,0.
44. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 43, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável lio-filizada que compreende cerca de 0,9 mg do dito produ-to medicamentoso, cerca de 18,5 mg de sacarina e cercade 1,1 mg de Tris, e em que o objetivo de um volume depreenchimento de frasco é cerca de 0,9 ml.
45. - Produto medicamentoso, de acordo coma reivindicação 43, caracterizado por o produto medica-mentoso ser uma formulação de composição injetável lio-filizada que compreende cerca de 0,58 mg do dito pro-dut o medicamentoso, cerca de 12,0 mg de sacarina e cer-ca de 0,7 mg de Tris.
46. - Kit, caracterizado por que compreen-de um frasco para proporcionar produto medicamentosoconforme definido na reivindicação 41, e instruções queexplicam como distribuir o dito produto medicamentosocom o dito dispositivo.
47. - Processo, de acordo com a reivindica-ção 33, caracterizado por o produto medicamentoso serusado para tratar um paciente que padece de uma enfer-midade mediada por colagênio.
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