KR101723168B1 - 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 보툴리눔 독소를 생산할 수 있는 클로스트리디움 속 균주들의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 배지 조성물은 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 식물 유래 펩톤, 돼지 유래 펩톤 및 미네랄 성분이 포함된 배지를 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양에 이용할 경우, 기존배지와 식물 유래 펩톤만 포함된 배지보다 높은 균주 성장률을 보였고, 상기 배지를 이용하면 안전하게 균주를 배양하여 고농도의 보툴리눔 독소를 제조할 수 있다.

Description

보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물{Medium Composition for Preparing Botulinum Toxin}
본 발명은 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 보툴리눔 독소를 생산할 수 있는 클로스트리디움 속 균주들의 배양용 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 배지 조성물은 가든피 가수분해물(Garden Pea hydrolysate), 목화씨 가수분해물(Cotton seed hydrolysate) 및 밀글루텐 가수분해물(Wheat Gluten hydrolysate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤(Porcine peptone)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
신경독성을 지닌 독소를 분비하는 다양한 클로스트리디움 속 균주들이 1890 년대부터 지금까지 발견되었으며, 지난 70년간 이들 균주들이 분비하는 독소에 대한 특성 규명이 이루어져 왔다(Schant, E. J. et al ., Microbiol . Rev ., 56:80, 1992).
상기 클로스트리디움 속 균주들에서 유래한 신경독성을 지닌 독소, 즉 보툴리눔 독소(botulinum toxin)는 그 혈청학적 특징에 따라 A 내지 G형의 7가지 형으로 구분된다. 각 독소는 약 150kDa 정도의 독소 단백질을 가지고 있는데, 자연적으로는 여러 비독성 단백질들과 결합되어 있는 복합체로 이루어져 있다. 중간(Medium) 복합체(300kDa)는 독소 단백질과 비독성-비헤마글루티닌 단백질로 이루어져 있고, 큰(Large; 450kDa) 복합체 및 거대(Large-Large; 900kDa) 복합체는 중간 복합체가 헤마글루티닌과 결합되어 있는 형태를 띠고 있다(Sugiyama, H., Microbiol. Rev ., 44:419, 1980). 이러한 비독성 비헤마글루티닌 단백질들은 장내에서 낮은 pH와 각종 단백질 가수분해 효소로부터 독소를 보호하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 독소는 세포 내에서 분자량이 약 150kDa인 하나의 폴리펩티드로 합성된 후, 세포내 단백질 분해 효소의 작용이나 트립신과 같은 인위적인 효소처리에 의하여 N말단으로부터 1/3 되는 위치에서 절단되어 2개의 단위체인 경쇄(L: light chain)(분자량: 50 kDa) 및 중쇄(H: heavy chain)(분자량: 100kDa)로 나누어진다. 이렇게 나누어진 독소는 단일 폴리펩티드일 때에 비해 그 독성이 크게 증가한다. 두 단위체는 이황화결합으로 서로 연결되어 있으며, 각각은 서로 다른 기능을 갖는다. 중쇄는 표적(target)이 되는 세포의 수용체(receptor)와 결합하고(Park. M.K. et al ., FEMS Microbiol . Lett ., 72:243, 1990), 낮은 pH(pH4)에서 생체막과 반응하여 채널(channel)을 형성하는 기능을 가지며(Mantecucco, C. et al ., TIBS ., 18:324, 1993), 경쇄는 약리활성을 가지고 있어 세제(detergent)를 사용하여 세포에 투과성을 부여하거나, 전기천공(electroporation) 등으로 세포 내 투입되었을 때 신경전달물질의 분비를 방해한다(Poulain, B. et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA., 85:4090, 1988).
상기 독소는 신경근육종말(neuromuscular junction)의 콜린성 전시냅스 (cholinergic presynapse)에서 아세틸콜린의 엑소시토시스(exocytosis)를 저해하여 전신 무력증을 일으킨다. 극미량의 독소를 처리해도 독성이 나타나는 것으로 보아 이 독소는 어떤 효소 활성을 가질 것으로 생각되어져 왔다(Simpson, L. L. et al ., Ann. Rev . Pharmaeol . Toxicol ., 26:427, 1986).
최근에 밝혀진 바에 의하면, 독소는 메탈로펩티다제 활성(metallopeptidase activity)을 갖고 있으며 그 기질은 엑소시토시스 장치 복합체(exocytosis machinary complex)를 이루는 단위 단백질들인 시냅토브레빈(Synaptobrevin), 신택신(Syntaxin), 25kDa의 시냅토좀 연계 단백질(Synaptosomal associated protein of 25kDa)(SNAP25) 등이다. 각 형의 독소는 이 세 가지 단백질들 중 하나를 기질로 삼고 있는데, B, D, F 및 G형은 시냅토브레빈을, A와 E형은 SNAP25를, C형은 신택신을 특정 부위에서 절단하는 것으로 알려져 있다(Binz, T. et al ., J. Biol . Chem., 265:9153, 1994).
특히, 보툴리눔 독소 A형은 pH 4.0~6.8의 묽은 수용액에 용해성인 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서 안정화 비-독소 단백질이 신경독소로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점진적으로 손실되는데, 특히 pH 및 온도가 상승함에 따라 독성이 감소하는 것으로 알려져 있다.
상기 보툴리눔 독소는 소량으로 인체에 치명적이고 대량생산이 용이하므로 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트(Yersinia pestis), 천연두(smallpox virus)와 더불어 4대 생물테러 무기로 사용될 수 있는 독소이다. 그러나, 상기 보툴리눔 독소 중 A형 독소의 경우에는 전신적으로는 인체에 영향을 미치지 않는 용량 이하로 주사하면 상기 주사 부위의 국소 근육을 마비시킬 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 이러한 특성을 이용하여 주름살 제거제, 경직성 편마비 및 뇌성마비의 치료제 등으로 광범위하게 사용할 수 있으므로, 수요가 급증하고 있으며 수요에 맞추어 보툴리눔 독소의 생산방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
현재 대표적으로 상용화되어 있는 제품은 미국 알러간(Allergan)사의 BOTOX®(보툴리눔 독소 A형 정제된 신경독소 복합체)로, 각각의 BOTOX®의 100 유닛 바이알은 약 5ng의 정제된 보툴리눔 독소 A형 복합체, 0.5㎎ 인간 혈청 알부민, 및 0.9㎎ 염화 나트륨으로 구성되고 진공-건조 형태로 제공되며, 보존제 없이(0.9% 염화 나트륨 주입) 멸균 생리식염수를 이용하여 복원시킨다. 다른 상용화된 제품은 영국 Ipsen사의 Dysport®(보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중에 락토오스 및 인간 혈청 알부민을 가지는 클로스트리디움 보툴리눔 A형 독소 헤마글루티닌 복합체, 사용 전에 0.9% 염화 나트륨을 이용하여 복원됨) 및 Solstice Neurosciences사의 MyoBloc®(보툴리눔 독소 B형, 인간 혈청 알부민, 숙신산 나트륨, 및 염화 나트륨을 포함하는 약 pH 5.6 주사 용액) 등이 있다.
대한민국 등록특허 제10-1339349호에 개시되어 있는 보툴리눔 독소의 제조방법과 일반적으로 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지는 동물성 성분들이 함유되어 있다. 따라서, 전염성해면상뇌증 유발인자로 알려진 동물 유래의 변형프리온(abnormal prion)이 오염으로 인해 상기 동물성 성분들에 포함되어 있으면 보툴리눔 독소 제조과정에 문제가 된다.
전염성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE)은 치명적인 신경의 퇴행성 질환을 일으키는 일종의 퇴행성 신경 질환으로, BSE(Bovine Spongiform Encephalopathy, 소해면상뇌증(광우병)), 스크래피(Scrapie), 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease, CJD), 게르스트만-스트라우슬러-샤인커 신드롬(Gerstmann-Straussler-Scheinker Syndrome), 쿠루(Kuru), 전염성 밍크뇌증(Transmissible Mink Encephalopathy), 사슴의 만성소모성질병(Chronic Wasting Disease), 고양이 해면상뇌증(Feline Spongiform Encephalopathy) 등 사람 및 동물에서 발병되며, 소해면상뇌증의 경우 종간 장벽(species barrier)을 넘어 사람에게도 발병되는 것으로 보고되고 있다.
전염성해면상뇌증의 원인체는 면역원성이 없고, 긴 잠복기를 갖는 특징이 있다. 소해면상뇌증, 즉 광우병에 감염된 소의 뇌의 사후 분석으로부터 신경세포의 파괴와 비정상 단백질 섬유의 침적으로 인하여 뇌에 스펀지(해면상) 형태의 특이한 패턴의 공포(空胞)가 형성되었음을 확인할 수 있다.
전염성해면상뇌증의 원인으로 여겨지는 병원체는 변형프리온(abnormal prion)이라 불리는 감염 단백질이다. 핵산을 필요로 하는 일반 바이러스의 경우와 달리, 변형프리온은 핵산을 포함하지 않고 단백질로만 이루어진 감염 입자이다. 전염성해면상뇌증은 정상프리온(PrPc)에 감염성 인자인 변형프리온(PrPsc)이 결합하게 되면 병원성프리온으로 전환되어 이러한 병원성프리온이 뇌에 축적되는 것으로 알려져 있다(Prusiner SB, Alzheimer Dis Assoc Disord ., 3:52-78, 1989).
크로이츠펠트-야콥병은 사람 전염성해면상뇌증(전염성해면양뇌증, Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE)의 드문 신경퇴행성 질환으로, 전염성 물질은 프리온 단백질의 비정상적인 이형체임이 분명하다. 크로이츠펠트-야콥병이 있는 개체는 명백히 완전한 건강 상태로부터 6개월 이내에 무동성무언증(akinetic mutism)으로 악화될 수 있다. 그러므로 동물 유래 산물을 사용하여 얻어지는 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 경우, 크로이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성이 존재한다. 따라서, 동물 유래 성분을 사용하여 생산한 원액을 이용하여 의약품을 제조할 경우, 환자가 다양한 병원체 또는 감염성 물질을 받아들이게 되는 위험성이 존재한다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 상기와 같은 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험을 예방하기 위하여 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양 시 전염성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE) 감염 우려가 없는 식물 유래 펩톤을 포함하고, 미네랄 및 TSE 감염 우려가 없는 돼지 유래 펩톤(예: TSE-Certificated Porcine peptone)이 첨가된 배지를 이용할 경우 기존배지에서 발생할 수 있는 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성을 배제시키고, 기존배지와 식물성 펩톤만 첨가된 배지보다 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장률을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 전염성해면상뇌증(Transmissible Spongiform Encephalopathy: TSE) 감염 우려가 없는 식물성 펩톤과 TSE 감염 우려가 없는 돼지 유래 펩톤이 함유된 배지 조성물 및 상기 배지 조성물에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하여 보툴리눔 독소의 생산량을 개선시키는 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤을 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물 유래 펩톤, 돼지 유래 펩톤 및 미네랄 성분이 포함된 배지를 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양에 이용할 경우, 기존배지와 식물 유래 펩톤만 포함된 배지보다 높은 균주 성장률을 보였고, 상기 배지를 이용하면 안전하게 균주를 배양하여 고농도의 보툴리눔 독소를 제조할 수 있다.
도 1은 식물성 펩톤이 포함된 배지(APF 배지)에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 여부를 나타낸 것이다.
도 2는 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민이 포함된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지를 멸균처리한 경우 침전물의 형성 여부를 나타낸 것이다.
도 4는 식물성 펩톤과 미네랄을 포함하는 배지를 멸균처리한 경우 침전물의 형성 여부를 나타낸 것이다.
도 5는 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지에 비타민, 아미노산 및 포도당과 L-글루타민이 배제된 배지성분이 추가로 첨가된 배지에서 배양된 균주의 성장 여부를 나타낸 것이다.
도 6은 식물성 펩톤의 종류에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지에서의 균주의 성장 여부를 나타낸 것이다.
도 7은 미네랄 스크리닝(mineral screening)에 대한 FFD의 contour plots와 response optimization을 나타낸 것으로, (A) high setting에 대한 contour plot, (B) middle setting에 대한 contour plot, (C) low setting에 대한 contour plot 및 (D) maximum OD에 대한 response optimization을 나타낸 것이다.
도 8은 미네랄 스크리닝(mineral screening)에 대한 FFD의 contour plots와 response optimization을 나타낸 것으로, (A) high setting에 대한 contour plot, (B) middle setting에 대한 contour plot, (C) low setting에 대한 contour plot 및 (D) maximum OD에 대한 response optimization을 나타낸 것이다.
도 9는 식물성 펩톤 스크리닝(Plant peptone screeing)에 대한 contour plots와 response optimization을 나타낸 것으로, (A) middle setting에 대한 contour plot, (B) low setting에 대한 contour plot 및 (C) maximum OD에 대한 response optimization을 나타낸 것이다.
도 10은 최종 선별된 APF 배지에서 자란 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장곡선(growth curve) 및 독소(toxin) 농도 변화를 나타낸 것이다.
도 11은 돼지 유래 펩톤인 Primatone P37 또는 Bacto proteose peptone No.3 스크리닝에 대한 (A) response surface plot 및 (B) response optimization을 나타낸 것이다.
도 12는 기존배지, 식물성 펩톤이 첨가된 배지(APF 배지), 또는 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 첨가된 최종 배지(APF + porcine)에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 시간 별 OD값으로 비교한 것을 그래프로 나타낸 것이다.
APF 배지(Animal Protein Free medium) 조성으로도 기존배지 대비 향상된 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장률(생장률)을 보였으나, 균주의 성장률을 더욱 향상시키면서 여전히 TSE 등의 감염우려가 없는 배지 성분의 첨가를 고려하였다. 따라서, TSE 감염사례가 보고된 바 없는 돼지 유래 펩톤(예: TSE-Certificated porcine peptone)을 APF 배지에 첨가하여 균주의 성장을 살펴본 결과, 기존배지와 식물 유래 펩톤만 포함된 배지보다 높은 균주 성장률을 보였고, 상기 배지를 이용하면 TSE-프리(TSE-free)한 조건에서 안전하게 균주를 배양하여 고농도의 보툴리눔 독소를 제조할 수 있을 것이다.
TSE는 사람, 염소, 양, 밍크, 사슴 등 여러 동물에서 발병하는 것으로 보고된 바 있으나, 돼지의 TSE 발병사례는 아직까지 보고된 바 없다(Jahns H et al ., Vet Rec., 159(5):137-142, 2006; Kofler M et al., Schwweiz Arch Tierheild, 148(7):341-342, 344-348, 2006). 따라서, 본 발명은 돼지 유래 펩톤을 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물에 포함시킴으로써, 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 제조하는 과정에서 크로이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성을 배제하고, 기존배지와 식물성 펩톤만 첨가된 배지보다 균주의 성장율이 향상된 배지 조성물을 제조하고자 하였다.
본 발명에서 기존배지란 동물 유래 성분인 카세인 가수분해물(Casein hydrolysate), 효모추출물(Yeast extract) 및 티오글리콜산염 배지(Thioglycollate medium)가 포함된 배지를 의미한다. 또한, APF 배지(Animal Protein Free medium)란 동물 유래 단백질을 포함하지 않는 배지를 의미하며 "식물성 펩톤, 미네랄 및 포도당 등을 포함하는 배지"를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 TSE-프리(TSE(Transmissible Spongiform Encephalopathy)-free)한 조건에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 제조하기 위하여 TSE-프리한 식물성 펩톤이 포함된 APF 배지를 제조하고, 이를 기존배지(동물성 성분 포함)와 비교하였다. 그 결과, 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하기 위한 최적의 배지 조성은 식물성 펩톤과 KH2PO4, K2HPO4 및 Na2HPO4로 군에서 선택된 하나 이상의 미네랄을 포함시키고, 여기에 탄소원(예: 포도당)을 첨가한 경우이며, 이 경우 최적의 균주 성장을 확인할 수 있었다. 결국, 표 13에 나타난 바와 같이, 최종 선별된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물에 포함된 식물성 펩톤의 최적 함량은 Hy-Pea™ 7404 5g/L, UltraPep™ Cotton 10g/L 및 HyPep™ 4601N 5g/L이었으며, 미네랄의 최적 함량은 K2HPO4 5.5g/L, Na2HPO4 3g/L인 것으로 확정하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 최종 선별된 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 APF 배지에서 자란 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 패턴(growth pattern) 및 독소(toxin) 농도 측정을 수행하였다. 그 결과, 표 12 및 도 10에 나타난 바와 같이, 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양 12시간 이후부터 OD값이 증가하기 시작하여 배양 24시간이 경과된 시점에서 OD540nm가 3.5465, OD600nm가 3.0695를 나타내었다. 또한, 그 후 OD값이 점점 감소하여 48시간이 경과된 시점에서는 OD540nm가 0.792, OD600nm가 0.7224를 나타내었다. 클로스트리디움 보툴리눔 독소의 상등액 내 독소 농도는 배양 5시간 이후부터 증가하여 최종 31.41㎍/ml 값을 나타내었고, 균주를 파쇄하여 측정한 경우 배양 5시간 이후부터 독소가 생성되기 시작하여 계속하여 독소량이 증가하다가 28시간 이후부터는 비슷한 양의 독소 농도가 측정되어 최종 38.39㎍/ml 값을 나타내었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 포함된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주 성장을 확인하고자 하였다. 그 결과, 표 14에 나타난 바와 같이, 돼지 유래의 펩톤 성분이 추가로 첨가된 배지에서 균주를 배양한 경우 식물성 펩톤만 첨가된 배지보다 높은 OD값을 나타내었다. 특히 가장 높은 균주 성장률을 보이는 배지는 Primatone P37과 Bacto proteose peptone No.3을 각각 10g/L 첨가한 경우로 OD540nm가 4.951을 나타내었다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 패턴을 확인하고자 하였다. 그 결과, 표 15에 나타난 바와 같이, 균주 배양 20시간 경과 시점에서는 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 균주 성장은 왕성하여 기존배지보다 약 11배, 식물성 펩톤이 첨가된 배지보다 약 2.2배 높은 OD값을 나타내었고, 균주 배양 29시간 경과 시점에서의 최대 OD값은 기존배지 및 식물성 펩톤이 첨가된 배지보다 2배 이상 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 균주 성장률이 세 종류의 배지 중 가장 높게 나타났다.
결국, 표 16에 나타난 바와 같이, 최종 선별된 TSE-프리(TSE(Transmissible Spongiform Encephalopathy)-free)한 돼지 유래 펩톤이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물에 포함된 식물성 펩톤의 최적 함량은 Hy-Pea™ 7404 5g/L, UltraPep™ Cotton 10g/L 및 HyPep™ 4601N 5g/L이었으며, 미네랄의 최적 함량은 K2HPO4 5.5g/L, Na2HPO4 3g/L이었으며, 포도당의 함량은 10g/L이었고, 돼지 유래 펩톤의 함량은 13g/L Primatone P37, 13g/L Bacto proteose peptone No.3인 것으로 확정하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤을 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
여기서, 식물성 펩톤은 가든피(Garden Pea), 목화씨(Cotton seed) 또는 밀글루텐(Wheat Gluten)에서 추출된 펩톤을 의미하며, 바람직하게는 상업적으로 구매가능한 Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, HyPep™ 4601N일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 돼지 유래 펩톤은 돼지 유래 조직(tissue)에서 추출된 성분이며, 바람직하게는 500Da 이하 펩티드를 약 54.91∼60.69 중량% 함유하는 돼지 유래 펩톤 또는 500Da 이하 펩티드를 약 38.48∼42.53 중량% 함유하는 돼지 유래 펩톤일 수 있고, 더욱 바람직하게는 상업적으로 구매가능한 Primatone P37 또는 Bacto proteose peptone No.3일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "식물성 펩톤" 또는 "식물성 가수분해물"은 식물로부터 얻은 단백질의 분해 산물을 의미한다. 예를 들어 가든피 펩톤(가든피 가수분해물)은 가든피(Garden Pea)로부터 수득한 총단백질을 분해하여 얻은 산물을 의미한다. 또한, "돼지 유래 펩톤" 또는 "돼지 유래 가수분해물"은 돼지 유래 조직의 단백질 분해 산물을 의미한다.
상기 식물성 단백질 또는 돼지 유래 조직의 단백질 분해는 바람직하게는 부분적 분해(partial digest)에 의해 행해진다. 상기 단백질의 분해는 바람직하게는 산처리, 염기처리, 효소처리, 고압처리, 열처리 또는 물리적 처리에 의한 분해를 통해 행해지며, 더욱 바람직하게는 돼지 유래 펩톤은 효소처리된 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 물리적 처리는 예컨대 그라인딩(grinding)이다.
본 발명에서의 식물성 펩톤 또는 돼지 유래 펩톤은 단백질의 부분적 분해 산물로서, 단분자인 아미노산 뿐만 아니라, 수개 내지 수십개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드와 온전한 단백질 분자가 모두 포함되어 있는 혼합물 형태이다.
본 발명에 있어서, 상기 식물성 펩톤의 함량은 0.1∼10w/v%(1∼100g/L)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.2∼5w/v%(2∼50g/L)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.5∼2w/v%(5∼20g/L)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물을 모두 포함하는 경우, 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물의 함량비는 중량기준으로 1:0.24∼43.62:0.01∼50.57인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 1:0.68∼14.46:0.09∼9.87일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:1.6∼2.4:0.6∼1.4일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 유래 펩톤의 함량은 0.2∼10w/v%(2∼100g/L)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.4∼5w/v%(4∼50g/L)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1∼2w/v%(10∼20g/L)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 유래 펩톤은 500Da 이하 펩티드를 약 54.91∼60.69 중량% 함유하는 가수분해물 및/또는 500Da 이하 펩티드를 약 38.48∼42.53 중량% 함유하는 가수분해물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 돼지 유래 펩톤이 500Da 이하 펩티드를 약 54.91∼60.69 중량% 함유하는 가수분해물 및 500Da 이하 펩티드를 약 38.48∼42.53 중량% 함유하는 가수분해물을 모두 포함하는 경우, 돼지 유래 펩톤의 함량 범위는 중량기준으로 하기 수학식 1을 이용하여 계산하는 방법을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있고, 500Da 이하 펩티드를 약 54.91∼60.69 중량% 함유하는 가수분해물 및 500Da 이하 펩티드를 약 38.48∼42.53 중량% 함유하는 가수분해물의 함량비는 중량기준으로 바람직하게는 1:0.8∼1.2일 수 있다.
[수학식 1]
B≥-0.625*A+12.5, B≤-1.019*A+53
A: 500Da 이하 펩티드를 약 54.91∼60.69 중량% 함유하는 가수분해물 함량(0∼5.2w/v%(0∼52g/L));
B: 500Da 이하 펩티드를 약 38.48∼42.53 중량% 함유하는 가수분해물 함량(0∼5.3w/v%(0∼53g/L))
본 발명에 있어서, 상기 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물은 탄소원과 K2HPO4(Dipotassium phosphate), Na2HPO4(Disodium phosphate) 및 KH2PO4(Monopotassium phosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 미네랄을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
여기서, 상기 탄소원은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린, 전분 등), 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 미네랄의 함량은 0.05∼3.5w/v%(0.5∼35g/L)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 0.1∼1.75w/v%(1∼17.5g/L)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.25∼0.7w/v%(2.5∼7g/L)일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 식물성 펩톤 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양
1-1: 배양에 사용한 기존배지의 조성
본 발명에서 사용된 시약 및 배지 성분들은 시그마사(Sigma, 미국), 케리사(Kerry Inc, 미국), BD사(BD Biosciences, 미국), Gibco사(Gibco Life Technologies, 미국) 및 퀘스트사(Quest, 미국)로부터 구입하여 사용하였다.
보툴리눔 독소의 생산을 위한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 종 배양 및 본 배양에 이용된 배지는 2% 카세인 가수분해물(Casein hydrolysate)[20g/L], 1% 효모추출물(Yeast extract)[10g/L], 1% 글루코오스(Glucose)[10g/L] 및 0.5% 티오글리콜산염 배지(Thioglycollate medium)[5g/L]의 조성을 가지는 기존배지를 사용하였다. 상기 기존배지 1L 중 티오글리콜산염 배지 5g은 2.52g 카세인 소화효소분해물(enzymatic digest of casein), 0.84g 효모추출물(Yeast extract), 0.925g 덱스트로오스(Dextrose), 0.085g 티오글리콜산 나트륨(Sodium thioglycollate), 0.42g 염화 나트륨(NaCl), 0.085g L-시스테인(L-Cystein), 0.00014g 레사주린(Resazurin) 및 0.125g 세균성 한천(Bacteriological agar)으로 구성된 것이다.
1-2: 배양에 사용한 APF 배지의 조성
클로스트리디움 보툴리눔 배양용 기존배지(original media)에서 카세인 가수분해물(Casein hydrolysate), 효모추출물(Yeast extract) 및 티오글리콜산염 배지(Thioglycollate medium)가 제거된 배지(음성대조군, negative control), 상기 음성대조군 조성에 식물성 펩톤 후보군 4종(Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, HyPep™ 4601N)이 첨가된 APF 배지(Animal Protein Free medium)를 제조하였다(표 1).
하기 표 1은 기존배지 대비 식물성 펩톤이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 APF 배지의 성분을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00001
1-3 : 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 종 배양(seed culture)
실시예 1-1 및 1-2의 배지 조성을 가진 10mL의 멸균된 배지가 들어있는 배양 튜브( culture tube)에 20μL의 클로스트리디움 보툴리눔(질병관리본부 관리번호: 4-029-CBB-IS-001)을 접종하여 35℃에서 혐기적 조건으로 22~30시간 동안 1차 종 배양(정치 배양)을 하였다. 1차 종 배양에서 균주의 성장이 확인되면 같은 배지 조성을 가진 800mL의 멸균된 배지가 들어있는 1L 배양 보틀(culture bottle)에 8mL의 1차 종 배양액을 접종하여 35℃에서 혐기적 조건으로 8~15시간 동안 2차 종 배양(정치 배양)을 하였다.
1-4 : 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 본 배양
클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하여 보툴리눔 독소를 생산하기 위해 본 배양을 실시하였으며, 실시예 1-1 및 1-2의 조성으로 배지 9.3L를 조제하고, 10L 배양기에 넣은 후, 배지 멸균을 수행하였다. 혐기적 조건은 질소를 공급하여 만들었으며, 온도는 35℃, 교반속도는 50rpm으로 설정하여 성장환경을 유지시켰다.
실시예 1-3에서 2차 종 배양을 완료한 1L 배양 보틀(culture bottle)을 10L 배양기의 접종 포트와 연결된 접종선을 통하여 10L 배양기에 접종하였다. 10L 배양기에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주는 35℃, 50rpm 조건으로 배양하였으며, 배양이 진행되는 동안 배양설정조건으로 유지되는지 확인하고 기록하였다. 100시간 이상 배양되었을 때 본 배양을 종료하였다.
클로스트리디움 보툴리눔 배양용 기존배지(original media)에서 카세인 가수분해물(Casein hydrolysate), 효모추출물(Yeast extract) 및 티오글리콜산염배지(Thioglycollate medium)가 제거된 배지(음성대조군, negative control) 대비 식물성 펩톤 후보군 4종(Hy-Pea™ 7404, UltraPep™ Cotton, HyPep™ 7504, HyPep™ 4601N)이 첨가된 APF 배지(Animal Protein Free medium)에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 유무를 비교하였다(표 1).
그 결과, 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이, 음성대조군 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주는 자라지 않았고, 기존배지는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 접종 후 24시간 후에 자랐으며, 식물성 펩톤을 첨가한 배지는 균주 접종 후 30시간이 지난 후 자라기 시작한 것으로 확인되었다.
실시예 2: 식물성 펩톤, 미네랄, 아미노산 및 비타민이 첨가된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양
실시예 1에서 4종의 식물성 펩톤을 첨가한 배지에서 자란 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장이 기존배지에서 배양할 때보다 느렸기 때문에 이에 대한 해결책을 하기와 같이 마련하였다.
1) 혐기성 상태를 만들어 주는 역할을 하는 티오글리콜산염(Thioglycollate)에 의한 영향을 확인하고자 기존배지에 티오글리콜산염을 제거하여 성장속도 차이를 확인하였다.
2) 질소원(Nitrogen source) 부족에 의한 성장속도 저하일 가능성이 있어 펩톤 농도를 2배로 증가시켜 배양하였다.
3) 기존 식물성 펩톤을 포함하는 배지에 미네랄 성분, 아미노산, 비타민을 첨가한 배지와 알러간(Allergan)사의 특허(US 8,012,716)에 나와있는 APF 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 유무를 비교하였다(표 2).
하기 표 2는 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00002
그 결과, 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 기존배지에서 티오글리콜산염을 제거하여 균주를 배양한 경우 기존배지보다 자라는 속도가 느렸고, 이는 티오글리콜산염 성분이 성장 속도에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 펩톤의 농도를 2배 증가한 경우는 자라지 않았으며, 펩톤을 포함하는 배지에 미네랄 성분, 아미노산 및 비타민을 첨가한 경우는 기존배지와 비슷한 속도로 자랐으나 배지 멸균 후 침전물이 생김을 확인하였고, 알러간사의 APF 배지는 기존배지와 비슷한 속도로 성장하는 것을 확인하였다.
실시예 3: 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민이 포함된 배지의 멸균처리에 따른 침전물 생성
실시예 2에서 APF 배지 후보군(표 2: 2∼4 APF 배지) 중 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민을 포함하는 배지에서 기존배지와 비슷한 성장속도로 클로스트리디움 보툴리눔 균주가 자라나는 것을 확인하였으나, 배지의 멸균처리 후 침전물이 생기는 현상이 나타나 그에 대한 원인을 파악하고자 하였다(표 3).
하기 표 3은 멸균처리에 이용된 식물성 펩톤과 미네랄, 아미노산 및 비타민이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00003
그 결과, 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 식물성 펩톤이 포함된 배지에 미네랄을 첨가한 경우에서만 멸균처리 후 침전물이 형성되었기 때문에 침전물 형성의 주원인은 미네랄임을 확인하였다. 이는 배지 멸균시 고온·고압의 조건에서 미네랄 성분간의 상호작용으로부터 유래한 것으로 보았다.
실시예 4: 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 배지의 멸균처리에 따른 침전물 생성
실시예 3에서 확인된 배지의 멸균처리에 따른 침전물 형성에 관여하는 미네랄 성분을 확인하고자 다양한 조합으로 서로 다른 미네랄 성분을 배지에 첨가한 다음, 멸균처리를 하였다(표 4).
하기 표 4는 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분 및 상기 배지의 멸균처리에 따른 결과를 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00004
그 결과, 표 4 및 도 4에 나타난 바와 같이, 식물성 펩톤과 미네랄을 포함하는 배지 중 MgSO4 ·H2O와 K2HPO4를 함께 멸균한 경우와 MgSO4 ·H2O와 Na2HPO4를 함께 멸균한 경우 침전물이 생김을 확인하였다.
실시예 5: APF 배지의 침전물이 생기지 않는 조건에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양
실시예 4의 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 APF 배지에 비타민과 아미노산을 추가로 첨가할 경우 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양이 가능한지 확인하고자 하였다. 또한, 이와 별도로 식물성 펩톤과 미네랄을 배제하고 비타민, 아미노산 및/또는 "BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine"(Cat No. 670002, BD bioscience)(효모추출물을 기반으로 제작된 포도당과 L-글루타민이 배제된 배지성분)을 포함한 경우 균주의 배양이 가능한지도 확인하였다(표 5).
하기 표 5는 식물성 펩톤과 미네랄이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지에 비타민, 아미노산 및 효모추출물을 기반으로 제작된 포도당과 L-글루타민이 배제된 배지성분이 추가로 첨가된 배지의 성분 및 상기 배지에서 배양된 균주의 성장속도를 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00005
그 결과, 표 5 및 도 5에 나타난 바와 같이, 식물성 펩톤과 KH2PO4, K2HPO4 및Na2HPO4로 구성된 미네랄을 조합으로 하나 이상 포함시키고, 여기에 비타민과 아미노산을 배지에 첨가한 경우만이 클로스트리디움 보툴리눔 균주 접종 후 24시간 만에 균주가 성장하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 식물성 펩톤과 미네랄을 배제하고 비타민, 아미노산 및 효모추출물을 기반으로 제작된 포도당과 L-글루타민이 배제된 배지성분을 포함한 경우 균주 접종 후 48시간 만에 균주가 성장하는 것을 확인하였다. 결국, 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하기 위한 가장 적합한 배지 조성은 식물성 펩톤과 KH2PO4, K2HPO4, Na2HPO4, 아미노산 및 비타민을 첨가한 것이다.
실시예 6: 배지에 포함된 식물성 펩톤 종류에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양
실시예 5의 APF 배지에 식물성 펩톤의 종류를 서로 다른 조합으로 첨가할 경우 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양이 가능한지 확인하고자 하였다.
하기 표 6은 식물성 펩톤의 종류에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분 및 상기 배지에서의 균주의 성장 여부를 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00006
그 결과, 표 6 및 도 6에 나타난 바와 같이, 4종의 식물성 펩톤 중 1종 또는 2종만을 배지에 첨가하는 것만으로도 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양이 가능한 것으로 확인되었다.
따라서, 실시예 5 및 6의 결과를 종합해보면, 배지에 식물성 펩톤은 1종 이상 포함시켜야 하며, 식물성 펩톤을 "BD Recharge™ without Glucose and L-Glutamine"(Cat No. 670002, BD bioscience)(효모추출물을 기반으로 제작된 포도당과 L-글루타민이 배제된 배지성분)으로 대체할 수 없음을 알 수 있었다.
실시예 7: 배지에 포함된 미네랄 3종 중 2종 선별 실험
실시예 1∼7에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용으로 이용된 APF 배지 조성은 포도당(glucose), 염화 나트륨(NaCl), 식물성 펩톤 4종, 미네랄 성분 3종, 아미노산, 비타민으로 확정하였고, 이 중 성장에 큰 영향을 미치지 않는 배지 성분은 제거하여 배지 종류를 감소시키고자 하였다. 따라서, 아미노산과 비타민은 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장에 큰 영향을 미치지 않을 것이라는 판단 하에 배지 성분에서 제거하였다. 또한, 미네랄 3종 중 2종을 선별하기 위해 표 7과 같은 배지 조성으로 균주를 배양하여 균주 접종 후 24시간 및 48시간이 지난 시점에서 OD(540nm, 600nm)를 측정하여 그 값을 비교하였다.
하기 표 7은 1차 미네랄 선별에 따른 배지의 조성 및 상기 배지를 이용한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00007
그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 균주 접종 후 24시간 기준으로는 기존배지는 OD(540nm)가 0.942를 나타내었고, APF 배지 중 K2HPO4와 Na2HPO4를 포함한 경우 OD(540nm)가 4.964로 가장 높은 값을 나타내었다. 또한, 균주 접종 후 48시간 기준으로는 KH2PO4와 Na2HPO4를 첨가한 경우 가장 높은 OD값을 나타내어 균주 성장이 왕성한 것으로 확인되었다.
한편, 도 7에 나타난 바와 같이, 주효과가 큰 K2HPO4와 Na2HPO4에 대하여 contour plot을 작성하였다. 그 결과, K2HPO4와 Na2HPO4가 함께 증가할수록 OD값이 증가하는 경향을 보였다. 또한, 클로스트리디움 보툴리눔 균주가 최대 성장을 보이는 조건은 KH2PO4 = 0g/L, K2HPO4 = 5.5g/L, Na2HPO4 = 5g/L로 미네랄이 배지에 첨가될 때인 것으로 나타났다.
한편, 보다 정확한 미네랄 첨가에 따른 균주 배양의 결과 확인을 위해서 반응 표면법으로 2차 실험을 진행하였다. 배지 조성이 음수의 값을 가질 수 없으므로 CCF(Central composite faced) 디자인으로 설계하여 실험을 표 8과 같은 배지 조성으로 균주를 배양하여 실험을 수행한 후, 앞서 수행한 FFD 결과와 합쳐 통계분석을 수행하였다.
하기 표 8은 2차 미네랄 선별에 따른 배지의 조성 및 상기 배지를 이용한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00008
Contour plots을 그려 비교한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, KH2PO4가 적을수록 OD 값이 증가하였고, 최적 조건을 비교하면 곡률효과로 인하여 FFD의 결과와 차이를 보였으며, K2HPO4의 값은 같으나 Na2HPO4 값이 5g/L에서 3.1313g/L로 바뀌었다. 따라서, 통계분석에 따른 배지의 최적의 미네랄 조건은 K2HPO4 5.5g/L, Na2HPO4 3g/L로 확정하였다.
실시예 8: 배지에 포함된 식물성 펩톤 선별 실험
표 9 및 표 10에 나타난 바와 같이, 혼합물 설계에 따라 식물성 펩톤을 조합하여 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 확인하였다.
하기 표 9는 1차 식물성 펩톤 선별에 따른 배지의 조성 및 상기 배지를 이용한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00009
하기 표 10은 2차 식물성 펩톤 선별에 따른 배지의 조성 및 상기 배지를 이용한 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00010
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, Contour plots을 그려 분석한 결과 성분 C에 해당하는 HyPep™ 7504가 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장에 가장 영향을 미치지 못하는 것으로 판단되어 배지 성분에서 제외시켰다. 결국, 배지에 포함되는 최종 선별된 식물성 펩톤의 조성은 Hy-Pea™ 7404 5g/L, UltraPep™ Cotton 10g/L 및 HyPep™ 4601N 5g/L로 결정하였다.
실시예 9: 배지에 NaCl 첨가 유무에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양
실시예 1∼8에서 사용된 배지 조성 중 NaCl의 농도는 0.5g/L로 소량 첨가되었다. NaCl의 농도에 따른 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 살펴보고자 배지의 NaCl 첨가량을 0∼1g/L로 조절한 다음, 상기 균주를 배양하였다.
하기 표 11은 NaCl이 첨가된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분 및 상기 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00011
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, NaCl 첨가 유무에 따른 성장의 차이가 없었다. 따라서, NaCl을 최종 APF 배지 성분에서 제거하였다.
실시예 10: 최종 선별된 APF 배지에서 자란 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 패턴 및 독소 농도 측정
실시예 1∼9에 근거하여 조성된 최종 선별된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지(10g/L 포도당, 5g/L Hy-Pea™ 7404, 10g/L UltraPep™ Cotton, 5g/L HyPep™ 4601N, 5.5g/L K2HPO4, 3g/L Na2HPO4)에 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 접종한 다음, 균주의 성장 패턴과 독소 농도를 측정하였다.
하기 표 12는 최종 선별된 APF 배지에서 자란 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 시간별 OD값 및 독소(toxin) 농도를 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00012
그 결과, 표 12 및 도 10에 나타난 바와 같이, 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양 12시간 이후부터 OD값이 증가하기 시작하여 배양 24시간이 경과된 시점에서 OD540nm가 3.5465, OD600nm가 3.0695를 나타내었다. 또한, 그 후 OD값이 점점 감소하여 48시간이 경과된 시점에서는 OD540nm가 0.792, OD600nm가 0.7224를 나타내었다. 클로스트리디움 보툴리눔 독소의 상등액 내 독소 농도는 배양 5시간 이후부터 증가하여 최종 31.41㎍/ml 값을 나타내었고, 균주를 파쇄하여 측정한 경우 배양 5시간 이후부터 독소가 생성되기 시작하여 계속하여 독소량이 증가하다가 28시간 이후부터는 비슷한 양의 독소 농도가 측정되어 최종 38.39㎍/ml 값을 나타내었다.
결국, 실시예 1∼10의 결과로 최종 선별된 APF 배지(Animal Protein Free medium) 조성은 하기 표 13에 나타난 바와 같다.
Figure 112015041368530-pat00013
실시예 11: 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 포함된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주 성장
실시예 1~10을 통해 확립된 APF 배지 조성으로도 기존 배지 대비 향상된 균주의 성장률을 보였으나, 균주의 성장률을 더욱 향상시키면서 여전히 TSE 등의 감염우려가 없는 배지 성분의 첨가를 고려하였고, 그 결과, TSE 감염사례가 보고된 바 없는 돼지 유래 펩톤을 APF 배지에 첨가하여 균주의 성장을 살펴보고자 하였다.
실시예 1∼10에서 확립된 APF 배지에 2종의 TSE 감염 우려가 없는 돼지 유래 펩톤을 1종 또는 2종 첨가하였다. 즉, 돼지 유래 펩톤인 Primatone P37 및/또는 Bacto proteose peptone No.3이 첨가된 식물성 펩톤을 함유하는 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 24시간, 48시간 배양하는 가운데 OD(540nm, 600nm)값을 측정하여 균주의 성장을 살펴보았다(표 14). 또한, 상기 결과는 통계 프로그램을 이용하여 통계분석을 실시하여 균주 배양 24시간 경과시 최대의 성장을 보이는 배지 조성을 선별하였다.
하기 표 14는 식물성 펩톤, 미네랄 및 돼지 유래 펩톤이 포함된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지의 성분을 나타낸 것이다.
Figure 112015041368530-pat00014
그 결과, 표 14에 나타난 바와 같이, 돼지 유래의 펩톤 성분이 추가로 첨가된 배지에서 균주를 배양한 경우 식물성 펩톤만 첨가된 배지보다 높은 OD값을 나타내었다. 특히 가장 높은 균주의 성장률을 보이는 배지는 Primatone P37과 Bacto proteose peptone No.3을 각각 10g/L 첨가한 경우로 OD540nm 4.951을 나타내었다.
한편, 균주 성장을 최대로 할 수 있는 조건을 얻기 위하여 반응표면법으로 실험을 확장하였고, 반응표면법 결과를 가지고 통계 프로그램을 이용하여 통계분석을 실시하였고, 도 11 (A)에 나타난 바와 같이, Response contour plot을 그려본 결과 실험 범위 내에서 균주 성장을 최대로 할 수 있는 조건을 확인하였다. 또한, 균주 성장을 최대로 할 수 있는 조건을 구한 결과, 도 11 (B)에 나타난 바와 같이, Primatone P37을 13.131g/L, Bacto proteose peptone No.3을 12.727g/L 추가할 때 OD540nm\가 4.8718로 나타나 최대 성장 조건임을 확인하였다. 배지 조성의 편리를 위하여 추가 동물 배지 조성을 모두 13g/L로 통일하여 이후 실험을 진행하였다.
실시예 12: 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장 패턴
실시예 1∼11에 따른 방법으로 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하여 균주의 성장 패턴을 살펴보았다(표 15 참조).
하기 표 15는 기존배지, 식물성 펩톤이 첨가된 배지(APF 배지), 또는 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤이 첨가된 최종 배지(APF + 돼지 펩톤)에서의 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 성장을 시간 별 OD값으로 비교한 것이다.
Figure 112015041368530-pat00015
그 결과, 표 15 및 도 12에 나타난 바와 같이, 균주 배양 20시간 경과 시점에서는 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 균주 성장은 왕성하여 기존배지보다 약 11배, 식물성 펩톤이 첨가된 배지보다 약 2.2배 높은 OD값을 나타내었고, 균주 배양 29시간 경과 시점에서의 최대 OD값은 기존배지 및 식물성 펩톤이 첨가된 배지보다 2배 이상 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 식물성 펩톤과 돼지 유래 펩톤이 첨가된 배지에서의 균주 성장률이 세 종류의 배지 중 가장 높게 나타났다.
결국, 실시예 11∼12의 결과로 최종 선별된 APF 배지(Animal Protein Free medium)에 돼지 유래 펩톤이 첨가된 조성은 하기 표 16에 나타난 바와 같다.
Figure 112015041368530-pat00016
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. i) 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물을 포함하는 식물성 펩톤과;
    ii) 돼지 유래 펩톤을 함유하고,
    상기 가든피 가수분해물, 목화씨 가수분해물 및 밀글루텐 가수분해물의 함량비는 중량기준으로 1:0.24~43.62:0.01~50.57인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물성 펩톤의 함량은 0.1∼10w/v%인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 돼지 유래 펩톤의 함량은 0.2∼10w/v%인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 돼지 유래 펩톤은 500Da 이하 펩티드를 54.91∼60.69 중량% 함유하는 가수분해물 또는 500Da 이하 펩티드를 38.48∼42.53 중량% 함유하는 가수분해물인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 식물성 펩톤 및 돼지 유래 펩톤은 효소처리된 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 탄소원과 K2HPO4(Dipotassium phosphate), Na2HPO4(Disodium phosphate) 및 KH2PO4(Monopotassium phosphate)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 미네랄을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미네랄의 함량은 0.05∼3.5w/v%인 것을 특징으로 하는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 배양용 배지 조성물.
  10. 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법:
    (a) 제1항, 제2항, 제4항, 제5항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 보툴리눔 독소를 회수하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 배양은 혐기 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 독소는 보툴리눔 독소 A, B, C, D, E, F 및 G로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
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