BR112014001439B1

BR112014001439B1 - uso de um extrato proteolítico obtido de bromelaína para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença do tecido conjuntivo

Info

Publication number: BR112014001439B1
Application number: BR112014001439-6A
Authority: BR
Inventors: Lior Rosenberg; Guy Rubin; Eilon Asculai
Original assignee: Mediwound Ltd.
Priority date: 2011-07-20
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2021-05-25
Also published as: KR20140079757A; AU2012285378A1; JP6049714B2; EP2734216A1; AU2012285378B2; JP2014520881A; MX2014000748A; ES2690568T3; US10293033B2; WO2013011514A1; RU2014106299A; ZA201400946B; DK2734216T3; HUE039689T2; RU2625726C2; PT2734216T; CA2842291C; US20170049865A1; EP2734216A4; CN103687607A

Abstract

USO DE UM EXTRATO PROTEOLÍTICO DE BROMELAÍNA PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA PARA O TRATAMENTO DE UMA DOENÇA DO TECIDO CONJUNTIVO. A presente invenção refere-se a um extrato proteolítico obtido de bromelaína para o tratamento de doenças de tecido conjuntivo. Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um extrato proteolítico obtido de bromelaína para o tratamento de doenças tais como doença de Du- puytren e doença de Peyronie.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um extrato proteolítico obtido de bro- melaína para o tratamento de doenças de tecido conjuntivo. Em particular, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um extrato proteolítico obtido de bromélia para o tratamento de doenças tais como doença de Dupuytren e doença de Peyronie.

Antecedentes da Invenção

[002] Colágeno é o principal componente do tecido conjuntivo e é principalmente encontrado em tecidos fibrosos como tendão, ligamento e pele. Numerosas doenças e condições são associadas com excesso de deposição de colágeno, as mais comuns são doença de Dupuytren e doença de Peyronie.

[003] Doença de Dupuytren (DD) é um distúrbio de tecido conjuntivo de produção e deposição anormal de colágeno na mão que é comumente caracterizada por contratura de juntas metacarpofalangeais (MCPJs) e juntas interfalangeais pro- ximais (PIPJs) no nos dedos de anel e pequeno. Proliferação e diferenciação de fi- broblastos em miofibroblastos com excesso de deposição de colágeno no nível da fascia palmar causa formação de cordão fibrótico e nódulo na palma e/ou dedos. Os cordões fibróticos ou nódulos podem ser de espessuras variáveis, de 1 milímetro em diâmetro para os cordões fibróticos a aproximadamente 10 milímetros em diâmetro para os nódulos fibróticos. Na medida em que a doença progride, cordões começam a contrair, causando deformidades - flexão de dedo (contraturas de flexão) que in-terferem e diminuem função de mão.

[004] A predominância de DD aumenta com idade e machos são mais frequentemente afetados. Suscetibilidade genética, fumo, álcool, diabetes mellitus, epi- lepsia e trabalho manual repetitivo são pensados serem fatores de risco comum para DD. A severidade e progresso de DD podem ser classificados pelo grau afetado de flexão - contratura de dedo.

[005] Fasciectomia cirúrgica é correntemente o tratamento mais amplamente disponível para DD que provê resultados positivos, embora temporários para maioria dos pacientes. Entretanto, fasciectomia cirúrgica usualmente envolve complicações cirúrgicas comuns (por exemplo, infecção, hematoma, perda de tecido) assim como específicas complicações como dano de nervo digital, perda de dedos, perda de retalho de pele, problemas de cura de ferimento e rigidez pós-operação. Em adição, fasciectomia envolve uma longa recuperação e não oferece uma cura definitiva na medida em que DD tem uma taxa de recorrência extremamente alta. Procedimentos minimamente invasivos usando agulhas ou lâminas finas foram tentados; tais procedimentos embora causem menos complicações, aumentam a taxa de recorrência. Intervenções não-cirúrgicas também foram desenvolvidas e incluem radioterapia, ultra-som, injeção de vitamina A, vitamina E, esteróides e interferon-Y.

[006] Estudos in vitro demonstraram a habilidade de colagenase para diminuir o módulo de tensão e a força necessária para ruptura de tecido de cordão de Dupuytren, indicando que colagenase pode ser efetiva em fasciotomia enzimática. Estudos clínicos recentemente demonstraram que tratamento com colagenase de Clostridium histolyticum liberou contraturas de DD e aperfeiçoou a faixa de movimento em juntas afetadas. Um acompanhamento de 8 anos de injeção de colagenase em pacientes com DD mostrou que a contratura MCPJ foi menos severa seguindo a recorrência da doença, quando comparada à contratura inicial antes de aplicação de tratamento de colagenase. Também foi mostrado que colágeno Tipo-III, que é usualmente ausente de fascia palmar de adulto normal, é abundante no tecido de pacientes com DD.

[007] Doença de Peyronie é um distúrbio de tecido conjuntivo envolvendo o crescimento de placas fibrosas ricas em colágeno no tecido macio do pênis afetando até 10% de homens. Especificamente, as placas fibrosas são formadas na túnica albugínea, a bainha espessa de tecido circundando a corpora cavernosa, causa cur-vatura anormal que é frequentemente associada com dor.

[008] Cirurgia é a única abordagem para tratamento de doença de Peyronie que parece ter previsível eficácia de repetição. Cirurgia é usualmente somente indicada em casos de longo termo onde a doença é estabilizada e a deformidade evita intercurso e/ou causa dor extrema. Entretanto, complicações podem ser desenvolver a partir de cirurgia, incluindo uma diminuição permanente do pênis.

[009] Abordagens não-cirúrgicas para tratamento de doença de Peyronie também são disponíveis, embora elas sejam todas grandemente ineficazes. Tentativas para dissolver as placas através de injeções intra-lesões diretas foram tentadas. Das metodologias de injeção, aquelas envolvendo colagenase clostridial parecem exibir a eficácia mais consistente, embora ainda bem limitada em efeito e duração. Em adição, terapia de radiação e tecnologia de laser foram tentadas.

[010] As patentes U.S. 5 589 171 e 6 086 872 e patente U.S. re-expedida No. RE39941 mostram processos de tratamento de um indivíduo sofrendo de doença de Dupuytren cujos processos compreendem aplicação de colagenase a uma palmar fascia afetada fibrosa.

[011] A patente U.S. 6 022 539 mostra processos de tratamento de um indivíduo sofrendo de doença de Peyronie cujos processos compreendem injeção de colagenase em uma placa de Peyronie fibrosa no pênis do indivíduo.

[012] A patente U.S. 6 353 028 mostra medicamento tópico que compreende agentes bloqueadores de canal de cálcio e agentes carreadores facilitando liberação transdérmica do bloqueador de canal de cálcio para o tratamento de distúrbios de tecido conjuntivo: doença de Peyronie, doença de Dupuytren e fibrose Ledderhose.

[013] A publicação de pedido de patente U.S. No. 2008/0206228 mostra um medicamento contendo ácido hialurônico ou seus derivados em associação com co- lagenase para o tratamento de vários tipos de ferimentos, queimaduras, lesões cutâneas de pressão, úlceras vasculares, e úlceras de pé diabético assim como para o tratamento de cicatrizes quelóides e hipertróficas. Tratamento de doença de Dupuytren é explicitamente mostrado.

[014] A publicação de pedido de patente Internacional No. WO 2004/037183 mostra processos e composições para tratamento de condições envolvendo fibrose, entre as quais doença de Peyronie e doença de Dupuytren são mostradas. As composições compreendem um inibidor de fosfodiesterase (PDE)-4, um inibidor de PDE- 5 ou um composto que eleva cGMP, para listar alguns.

[015] Uso de inibidores de ciclo de célula, incluindo agentes anti-microtúbulo, antimetabólitos, agentes alquilantes, alcalóides vinca, inibidores de PDE, matriz me- taloprotetinase incluindo colagenases, para tratamento de uma contratura tal como contratura de Dupuytren ou contratura de Peyronie é mostrado em publicação de pedido de patente internacional WO 2005/074913.

[016] Em nenhum lugar na técnica anterior é mostrado ou sugerido que enzimasproteolíticas de fontes de plantas são úteis para tratamento de distúrbios de tecido conjuntivo envolvendo excesso de deposição de colágeno.

[017] Extratos derivados do caule da planta abacaxi (Ananás comosus) foram verificados removerem seletivamente tecido desvitalizado. Tais extratos, também chamados bromelaína, contêm várias enzimas proteolíticas e hidrolíticas.

[018] A publicação de pedido de patente internacional WO 2006/054309 para o requerente da presente invenção mostra um composição de debridamento obtida de bromelaína compreendendo maioria das enzimas proteolíticas presentes em bromelaína, as enzimas proteolíticas tendo um peso molecular média de 23 kDa. WO 2006/054309 ainda mostra usos de dita composição de debridamento para de- bridamento de tecidos não-viáveis.

[019] Permanece uma necessidade não-satisfeita de aperfeiçoados processosnão-invasivos para tratamento de doenças de tecido conjuntivo envolvendo excesso de deposição de colágeno.

Resumo da Invenção

[020] A presente invenção provê um extrato proteolítico obtido de bromelaína para o tratamento de doenças de tecido conjuntivo. Particularmente, a presente invenção provê um extrato proteolítico obtido de bromelaína para o tratamento de doenças de tecido conjuntivo que são associadas com excesso de deposição de colá- geno, incluindo doença de Dupuytren e doença de Peyronie.

[021] Foi agora verificado pela primeira vez que um extrato proteolítico obtido de bromelaína compreendendo uma ou mais das cisteína proteases presentes em bromelaína, por exemplo, bromelaína ou ananaína de tronco, é capaz de degradarcolágeno nativo, não-desnaturado. Inesperadamente, injeção do extrato proteolí- tico em um cordão de Dupuytren resultou em ruptura do cordão enquanto mantendo o tecido conjuntivo saudável normal intacto.

[022] A presente invenção ainda mostra que a eficácia do extrato proteolítico para romper ou dissolver cordões de Dupuytren é similar a ou mesmo maior que aquela de colagenase. Entretanto, enquanto colagenase pode causar dano para ligamentos ou tendões não-adoentados devido sua afinidade para vários tipos de co- lágeno, o extrato proteolítico da presente invenção mostra especificidade para os cordões adoentados. Assim, o extrato proteolítico da presente invenção provê uma medicação aperfeiçoada e segura para doenças de tecido conjuntivo que envolvem excesso de deposição de colágeno, particularmente para o tratamento de doença de Dupuytren e doença de Peyronie.

[023] Devido ao fato de que altas concentrações do extrato proteolítico podem ser preparadas em volumes pequenos, tais pequenos volumes podem ser injetados nos cordões ou placas fibrosas adoentadas, assim evitando extravazamento e dano para tecidos circundantes, simplificando o procedimento clínico e portando aumentando aquiescência de paciente.

[024] De acordo com um aspecto, a presente invenção provê um processo de tratamento de uma doença do tecido conjuntivo compreendendo administração a um sujeito em necessidade de tal tratamento de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um extrato proteolítico obtido de bromelaína e um carreador farmaceuticamente aceitável, onde o extrato proteolítico compreende pelo menos uma cisteína protease selecionada do grupo consistindo em bromelaína e ananaína de tronco, e onde a doença do tecido conjuntivoé associada com excesso de deposição de colágeno.

[025] De acordo com adicionais realizações, a doença do tecido conjuntivo é selecionada do grupo consistindo em doença de Dupuytren, doença de Peyronie, ombro congelado, e doença de Ledderhose. De acordo com certa realização, a doença do tecido conjuntivo é doença de Dupuytren. De acordo com outra realização, a doença do tecido conjuntivo é doença de Peyronie.

[026] De acordo com uma realização, o extrato proteolítico compreende bromelaína e ananaína de tronco. De acordo com outra realização, o extrato proteo- lítico ainda compreende um precursor de cisteína protease. De acordo com ainda uma realização, o extrato proteolítico ainda compreende um fragmento de cisteína protease. De acordo com uma realização exemplar, o extrato proteolítico compreendebromelaína de tronco, ananaína, e um precursor de cisteína protease.

[027] De acordo ainda com realizações, a composição farmacêutica ainda compreende um agente selecionado do grupo consistindo em um agente anestésico, agente anti-bacteriano, e agente antiinflamatório.

[028] Ainda de acordo com realizações, o agente anestésico é selecionado do grupo consistindo em ametocaína (tetracaína), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaina, benzocaina, mepivocaína, cocaína, e suas combinações. cada possibilidade é uma realização separada da invenção.

[029] De acordo com adicionais realizações, o agente anti-bacteriano é selecionado do grupo consistindo em cloridrato de amanfadina, sulfato de amanfadina, amicacina, sulfato de amicacina, amoglicosídeos, amoxicilina, ampicilina, ansamici- nas, bacitracina, beta-lactams, candicidina, capreomicina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefradina, cefaloglicina, quilonfenicóis, clorexidina, closexidina, gliconato, cloridrato de clorexidina, cloroxina, clorquiraldol, clortetraciclina, cloridrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, cloridrato de clindamicina, clotrimazol, cloxacilina, demeclociclina, diclosxacilina, diiodo hidroxiquina, doxiciclina, etambutol, cloridrato de etambutol, eritromicina, esto- lato de eritromicina, estearato de ermicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, giseofulvina, haloprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, iodo cloridroxiquina, canamicina, sulfato de canamicina, lincomicina, lineomicina, cloridrato de lineomicina, macrolidos, meclociclina, metaciclina, cloridra- to de metaciclina, metenina, hipuratode metenamina, mandelato de metenamina, meticilina, metonidazol, miconazol, cloridrato de miconazol, minociclina, cloridrato de minociclina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netimicina, sulfato de netilmicina, nitrofurazona, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, or- cefalosporinas, oxacilina, oxiteaclina, cloridrato de oxitetraciclina, paracloro meta xilenol, paromomicina, sulfato de paromomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, cloridrato de pentamidina, feneticilina, polimixinas, quinolonas, sulfato de streptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaftato, triclosam, trifampim, rifamici- na, rolitetraciclina, sais de prata, spectinomicina, spiramicina, struptomicina, sulfo- namida, tetraciclinas, tetraciclina, tobramicina, sulfato de tobramicina, triclocarbono, triclosam, trimetoprim - sulfametoxazol, tilosina, vancomicina, e irotricina. Cada possibilidadeé uma realização separada da invenção.

[030] De acordo com ainda realizações, o agente antiinflamatório é selecio- nado do grupo consistindo em agentes antiinflamatórios não-esteroidais e agentes antiinflamatórios esteroidais.

[031] Ainda de acordo com realizações, a composição farmacêutica ainda compreende um componente selecionado do grupo consistindo em um agente esta- bilizante, um antioxidante, um conservante, um agente tamponante, um agente que- lante, e um agente de tonicidade.

[032] Ainda de acordo com realizações, a composição farmacêutica é formulada em uma forma selecionada do grupo consistindo em uma formulação sólida, uma formulação semi-sólida, uma formulação líquida e uma formulação de espuma. De acordo com certa realização, a formulação sólida é um pó. De acordo com uma outra realização, a formulação líquida é uma solução injetável de um pH de cerca de 6 a cerca de 7.

[033] De acordo com uma realização exemplar, a composição farmacêutica é administrada por injeção no tecido fibroso adoentado. A composição farmacêutica pode ser injetada como uma dose simples ou em alíquotas em duas ou mais localizações no tecido fibroso adoentado.

[034] De acordo com outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um extrato proteolítico para uso no tratamento de uma doença do tecido conjuntivo, onde o extrato proteolítico compreende pelo menos uma cisteína protease selecionada do grupo consistindo em bromelaína e ananaína de tronco, e onde a doença do tecido conjuntivo está associada com ex-cesso de deposição de colágeno.

[035] Estas e outras realizações da presente invenção serão melhor entendidas em relação às figuras, descrição, exemplos, e reivindicações que se seguem.

Breve Descrição dos Desenhos

[036] A Fig. 1 é um gráfico mostrando a atividade colagenolítica de duas bateladas do extrato proteolítico. Crescentes concentrações dos extratos proteolíticos (designados MD2 H-05-27 e MD5 H-10-46) foram incubadas por 20 minutos na presença de colágeno tipo IV marcado fluorescentemente. No fim da incubação a fluorescência foi medida. Resultados são apresentados em unidades relativas de fluorescência (RFU).

[037] A Fig. 2 é um gráfico mostrando a atividade colagenolítica do extrato proteolítico sobre colágeno tipo I e tipo IV. O extrato proteolítico foi incubado na presença de colágeno tipo I ou colágeno tipo IV marcado fluorescentemente para vários períodos de tempo. No fim da incubação fluorescência foi medida. Os resultados são apresentados em unidade de fluorescência relativa (RFU).

[038] A Fig. 3 é um gráfico mostrando a atividade colagenolítica do extrato proteolítico como comparada àquela de colagenase. Colagenase de Clostridium his- toliticum foi incubada com colágeno tipo IV marcado fluorescentemente ou gelatina marcada fluorescentemente e fluorescência foi medida no fim de 20 minutos de incubação. O extrato proteolítico foi incubado com colágeno tipo IV marcado fluorescentemente por 20 minutos e a seguir a fluorescência foi medida.

[039] A Fig. 4 é um gráfico mostrando a atividade gelatinase do extrato pro- teolítico. Crescentes concentrações de duas bateladas do extrato proteolítico (designadas J-01-19 e J-14-45) foram incubadas por 20 minutos na presença de gelatina marcada fluorescentemente e a seguir fluorescência foi medida.

[040] Figs. 5A-C são fotografias mostrando excisão - remoção cirúrgica do cordão de Dupuytren a partir de um paciente. A Fig. 6A é uma fotografia mostrando a contratura anormal de dedo de anel em um paciente com doença de Dupuytren. A Figura 4B é uma fotografia mostrando a remoção cirúrgica do cordão patológico. A Fig. 4C é uma fotografia mostrando o cordão após remoção do leito palmar.

[041] A Fig. 6 é uma fotografia mostrando a dissecção do cordão de Dupuytren em dois.

[042] A Fig. 7 é uma fotografia mostrando a ancoragem do cordão.

[043] A Fig. 8 é uma fotografia mostrando a etapa de injeção de uma solução no cordão de Dupuytren.

[044] A Fig. 9 é uma fotografia mostrando a máquina de estiramento de tração.

[045] As Figs. 10A-B são fotografias mostrando o cordão antes e após aplicação de força de tração. A Fig. 10A mostra o cordão antes de aplicação de força de tração. A Fig. 10B mostra o cordão após aplicação de força de tração e antes de ruptura de cordão.

[046] A Fig. 11 mostra o efeito de solução salina sobre elongação de cordão de Dupuytren como uma função de aplicação de resistência à tração. Cordão de Dupuytrren foi injetado com solução salina e incubado em solução salina por 24 horas. A seguir, o cordão foi submetido a tensão de tração, e elongação e ruptura de cordão foram avaliadas.

[047] A Fig. 12 mostra o efeito do extrato proteolítico sobre elongação de cordão de Dupuytren como uma função de aplicação de resistência de tração. Cordão de Dupuytren foi injetado com o extrato proteolítico e incubado na presença do extrato proteolítico por 24 horas. A seguir, o cordão foi submetido a tensão de tração, e elongação e ruptura de cordão foram avaliadas.

[048] A Fig. 13 mostra o efeito de uma única injeção do extrato proteolítico sobre elongação de cordão de Dupuytren como uma função de aplicação de resistência à tração. Cordões de Dupuytren foram injetados com o extrato proteolítico e incubados em solução salina por 24 horas. A seguir, os cordões foram submetidos a tensão de tração, e elongação e ruptura de cordão foram avaliadas.

Descrição Detalhada da Invenção

[049] A presente invenção provê processos de tratamento de doenças de tecido conjuntivo envolvendo excesso de deposição de colágeno compreendendo administração a um sujeito em necessidade de tal tratamento de um extrato proteolítico obtido de bromelaína.

[050] Uma composição de debridamento obtida de bromelaína (também chamada Debrase) foi primeiro mostrada em WO 2006/054309 para o requerente da presente invenção, o conteúdo da qual é aqui incorporado por referência como se aqui inteiramente mostrado. A composição de debridamento mostrada em WO 2006/054309 compreende cisteína proteases tais como bromelaína e ananaína de tronco. WO 2006/054309 ainda mostra que a composição de debridamento debridou pele queimada, isto é, tecido desvitalizado, mais eficientemente que bromelaína. Entretanto, a composição de debridamento foi verificada ser inativa em debridamento de pele ou derme saudável ou vital (ver, por exemplo, Singer et al., 2010, J. Burn Care Res. 31:304-309). A composição de debridamento por isso foi mostrada ser ativa contra tecidos desvitalizados, não contra tecidos viáveis.

[051] Inesperadamente, a presente invenção mostra que um extrato proteolí- tico obtido de bromelaína exerceu atividade colagenolítica in vitro e foi capaz de dissolver os cordões fibróticos palmares obtidos de sujeitos sofrendo de doença de Dupuytren. Na medida em que o extrato proteolítico da presente invenção não degrada tecido conjuntivo saudável, a presente invenção assim provê medicamento enzimáti- co seguro e eficiente para dissolução de tecido fibroso rico em colágeno, especificamente em sujeitos sofrendo de doença de Dupuytren ou doença de Peyronie.

[052] Os termos “extrato proteolítico obtido de bromelaína” e “extrato proteo- lítico” são usados intercambiavelmente por todo o relatório descritivo e reivindicações e referem-se a uma preparação enzimática parcialmente purificada a partir de bromelaína.

[053] O termo “bromelaína” refere-se a qualquer uma de um número de preparações pulverizadas de bromelaína presentemente comercialmente disponíveis. Exemplos de fabricantes de bromelaína incluem, mas não são limitados a Sigma e Challenge Bioproducts Co. Ltd., Taiwan. Bromelaína é preparada a partir do caule de uma planta de abacaxi. Um procedimento típico para obter bromelaína é como se segue: o suco do tronco de planta de abacaxi é primeiro ajustado para um pH de cerca de 3 ou 4 com ácido fosfórico, e hidreto de sódio ou sulfidreto de sódio é adicionado para proteger contra oxidação de sulfidrila. O material inerte é precipitado em acetona cerca de 30% e, após filtração, o fluido clarificado é precipitado com acetona 70%. Este precipitado é coletado por centrifugação e tanto redissolvido em água contendo hidreto de sódio ou sulfidreto de sódio que foi acidulado com ácido fosfórico e reprecipitado, ou secado diretamente em um forno a vácuo. Se o material reprecipitado, acetona 70% é utilizada. O material secado a partir de qualquer processoé apropriado como um material de partida para obtenção de composição de debridamento da presente invenção.

[054] O extrato proteolítico da presente invenção pode compreender uma ou mais das cisteína proteases presentes em bromelaína. De acordo com uma realização exemplar, o extrato proteolítico (também chamado Debrase ou Nexobrid) compreende as cisteína proteases de tronco bromelaína (EC 3.4.22.32) e ananaína (EEC 3.4.22.31). O extrato proteolítico ainda pode compreender um ou mais dos precursores de cisteína protease de bromelaína como, por exemplo, precursor de ananaína (EC 3.4.22.31), precursor de bromelaína de fruto (EC 3.4.22.33), e precursor de bromelaína de tronco (EC 3.4.22.31). O extrato proteolítico ainda pode compreender fragmentos de cisteína protease (ver, por exemplo, WO 2006/054309), uma lectina semelhante a jacalina (ver, por exemplo, Raval et al., Glycobiology, 2004, 14(12): 1247-1263), e/ou inibidores de bromelaína.

[055] O extrato proteolítico pode ser preparado através de um processo compreendendo as seguintes etapas: (a) suspensão de bromelaína com um solução ácida opcionalmente compreendendo um antioxidante, a solução ácida tendo um pH na faixa de cerca de 2,4 a cerca de 4; (b) ajustar a suspensão de (a) para um pH na faixa de cerca de 2,4 a cerca de 4; (c) adição de um auxiliar de filtro à suspensão de (b); (d) filtração da suspensão de (c) para remoção de componentes insolúveis; (e) adição à solução filtrada de (d) de sal de sulfato de amônio para render saturação de sulfato de amônio na faixa de cerca de 40% a cerca de 50%; (f) ajuste da suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 a cerca de 4; (g) incubação da suspensão de (f) a 3oC-10oC; (h) centrifugação da suspensão de (g) para render um precipitado de sulfato de amônio; (i) dissolução do precipitado de sulfato de amônio em uma solução ácida opcionalmente compreendendo um antioxidante tendo um pH na faixa de cerca de 2,4 a cerca de 4; (j) filtração de solução de (i) através de um ultra-filtro de 10 kDa; e (k) liofilização de solução retida de (j).

[056] De acordo com algumas realizações, a suspensão de bromelaína pode ser realizada em qualquer solução ácida tendo um pH entre cerca de 2,4 e 4. Exemplos de soluções ácidas ou tampões que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitados a, ácido acético em água, tampão acetato e tampão acetato contendo ácido tioglicólico 1%, pH 2,4-4. De acordo com certas realizações exemplares, a solução ácida é selecionada dos tampões e soluções mostradas nas patentes U.S. 5 830 739 e 4 197 291, o conteúdo das quais é aqui incorporado por referência como se aqui inteiramente mostrado.

[057] A solução ácida opcionalmente pode compreender um antioxidante. Exemplos de antioxidantes incluem, mas não são limitados a, ácido ascórbico, dii- droquinona, hidroxi tolueno butilado, e ditiotreitol. O antioxidante pode ser adicionado em uma concentração de cerca de 0,5% a cerca de 2%, preferivelmente em 1%.

[058] A solução ácida ainda pode compreender um agente umectante. Exemplos de agentes umectantes incluem, mas não são limitados a, n-octanol.

[059] O pH da solução ácida, que opcionalmente compreende um antioxi- dante, pode estar na faixa de cerca de 2,4 a cerca de 4. De acordo com uma certa realização preferida, o pH da solução ácida, que opcionalmente compreende um an- tioxidante, varia de cerca de 2,4 a cerca de 2,6.

[060] De acordo com realizações adicionais, um auxiliar de filtro é adicionado à suspensão de (a). De acordo com uma realização, o auxiliar de filtro compreende sílica. Preferivelmente, o auxiliar de filtro é diatomita natural que é calcinada de modo que taxas de fluxo mais rápidas são obtidas.

[061] Precipitação de desejadas proteínas é realizada através de adição à solução filtrada de etapa (d) de sal sulfato de amônio. Sal sulfato de amônio pode ser adicionado para render saturação do sulfato de amônio em uma faixa entre cerca de 40% a cerca de 50%. Preferivelmente, sal sulfato de amônio pode ser adicionado para render 40% de saturação de sulfato de amônio.

[062] A suspensão de etapa (f) é então incubada em uma temperatura entre 3oC a 10oC. Preferivelmente, a suspensão de etapa (f) é incubada por pelo menos 10 horas em temperaturas entre 3o a 10oC. Mais preferivelmente, a suspensão de etapa (f) é incubada por 12-24 horas a 4oC.

[063] No fim da incubação, a suspensão de etapa (g) é centrifugada para precipitar as desejadas proteínas, isto é, as enzimas proteolíticas. O precipitado é então dissolvido em solução ácida opcionalmente compreendendo um antioxidante. De acordo com uma realização exemplar, a suspensão é incubada por pelo menos 10 horas a 4oC.

[064] A solução de etapa (i) é submetida a uma etapa de filtração para reter enzimas proteolíticas tendo pesos moleculares em excesso de cerca de 10 kDa. De acordo com uma realização preferida, a solução de etapa (i) é filtrada através de um filtro membrana tendo um corte de peso molecular de cerca de 10 kDa.

[065] O extrato proteolítico pode ser liofilizado após filtração, pode ser lavado com água destilada e então liofilizado ou pode ser filtrado e então liofilizado. De acordo com uma realização correntemente preferida, o extrato proteolítico é filtrado através de um filtro membrana tendo um tamanho de poro de pelo menos cerca de 0,5 micrometro para obter uma solução estéril, que é então liofilizada e estocada. Preferivelmente, o extrato proteolítico é estocado como um pó liofilizado na medida em que sua estabilidade é prolongada na ausência de umidade. Antes de uso, o extratoproteolítico é dissolvido em uma solução de modo a obter uma solução com um pH de cerca de 6 a cerca de 7.

[066] De acordo com uma realização exemplar, o extrato proteolítico pode ser preparado através de um processo compreendendo as seguintes etapas: (a) suspensão de bromelaína com ácido acético 0,3 M compreendendo 1% ácido ascórbico e n-octanol tendo um pH de cerca de 2,4 a cerca de 2,6; (b) ajuste da suspensão de (a) para um pH na faixa de cerca de 2,5 a cerca de 3,5; (c) adição de um auxiliar de filtro compreendendo sílica à suspensão de (b); (d) filtração da suspensão de (c) através de um filtro prensa para remoção de componentes insolúveis; (e) adição à solução filtrada de (d) de sal sulfato de amônio (285 g/L) para render 40% de saturação de sulfato de amônio; (f) ajuste da suspensão de (e) para um pH de cerca de 2,5 a cerca de 3,5; (g) incubação da suspensão de (f) por aproximadamente 12-24 horas a 4oC; (h) centrifugação da suspensão de (g) para render um precipitado de sulfato de amônio; (i) dissolução do precipitado de sulfato de amônio em ácido acético 0,3 M compreendendo 1% ácido ascórbico tendo um pH de cerca de 2,4 a cerca de 2,6; (j) filtração da solução de (i) através de um ultra-filtro de 10 kDa; (k) filtração da solução retida de (j) para render uma solução estéril; e (l) liofilização da solução filtrada de (k).

[067] O termo “doença de Dupuytren” e “DD” são aqui usados intercambia- velmente e referem-se a uma doença onde os dedos não podem se estender inteiramente e são usualmente flexionados na direção de palma da mão. Especificamente,doença de Dupuytren se inicia com a formação de nódulos fibromatosos na fascia palmar, usualmente no lado ulnar. Os nódulos progridem e formam uma banda ou cordão fibroso restando a partir da palma para os dedos. Eventualmente isto conduz a permanentes flexões - contraturas de dedos. O dedo de anel é mais comumente afetado, seguido pelo dedo pequeno.

[068] Os termos “cordão de Dupuytren” e “o cordão adoentado” são aqui usados intercambiavelmente e referem-se às bandas de fibras fasciais que correm longitudinalmente abaixo de pele palmar. Estas bandas conduzem a contraturas da pele de revestimento e dedos distais que são ligados às bandas e eventualmente progridem para permanente flexão - contratura dos dedos afetados. Tipicamente, o cordão de Dupuytren compreende altos números de fibroblastos, aumentada depo-sição de proteínas de matriz extracelular (ECM), particularmente colágeno, e miofi- broblastos.

[069] É para ser entendido que o extrato proteolítico da invenção é útil para tratamento de indivíduos tendo outras doenças associadas com excesso de deposição de colágeno. Outras más formações a anormalidades de tecido fibroso que envolvem deposição de colágeno incluem doença de Peyronie, Fibrose Ledderhose, e fibrose de junta - cápsulas, bainhas de tendões e ligamentos. Assim, o extrato pro- teolítico também pode ser útil para tratamento de ombro congelado (capsulite adesiva). Estas doenças de tecido conjuntivo envolvendo excesso de deposição de colá- geno ou más formações de tecido fibroso não são associadas com ferimentos ou queimaduras.

[070] Como aqui usados, os termos “tratando” ou “tratamento” referem-se a melhora ou eliminação de pelo menos um ou mais dos sintomas associados com uma doença do tecido conjuntivo. Por exemplo, sintomas associados com doença de Dupuytren incluem contratura de junta, diminuição de faixa de movimento das juntas, para listar algumas. Sintomas de doença de Peyronie incluem, por exemplo, dor, curvatura anormal, e disfunção erétil.

[071] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” do extrato proteolítico é aquela quantidade do extrato proteolítico que é suficiente para prover um efeito benéfico ao sujeito ao qual a composição é administrada.

[072] O termo “cerca” quando refere-se a pH de uma solução ou suspensão é pretendido indicar que 0,5 unidade de pH acima ou abaixo de pH indicado está dentro do escopo da presente invenção.

[073] A composição farmacêutica da presente invenção compreende o extratoproteolítico e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[074] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopéia genericamente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos.

[075] O termo “carreador” refere-se a um diluente, excipiente, ou veículo com o qual o extrato proteolítico é administrado. Tais carreadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo, e semelhantes, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos. Soluções salinas, solução Aquosa de NaCl/CaCl2, dextrose aquosa, soluções de glicerol e soluções de albumina podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Água também pode ser usada como um carreador quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente.

[076] A composição farmacêutica ainda pode compreender agentes estabili- zantes como lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, silicato de cálcio, polivinil pirrolidona e celulose. A composição adicionalmente pode incluir agentes lubrificantes, tais como, estearato de magnésio e óleo mineral, agentes umectantes agentes emulsificantes e de suspensão; conservantes como Thimerosal, álcool benzílico, parabenos, hidroxi benzoatos de metila ou propila, antioxidantes como ácido ascórbico, diidroquinona, hi- droxi tolueno butilado e ditiotreitol; e agentes tamponantes como fosfato de sódio mono básico, fosfato de sódio di-básico, benzoato de sódio, benzoato de potássio, citrato de sódio, acetato de sódio, e tartarato de sódio; agentes quelantes como ácido etileno diamino tetra acético; e agentes para o ajuste de tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose.

[077] A composição farmacêutica ainda pode compreender um agente anestésico. Agentes anestésicos incluem, mas não são limitados a, ametocaína (tetracaí- na), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaína, benzocaí- na, mepivocaína, cocaína e suas combinações.

[078] A composição farmacêutica ainda pode compreender um agente anti- bacteriano. Agentes antibacterianos incluem, mas não são limitados a, cloridrato de amafadina, sulfato de amanfadina, amicacim, sulfato de amicacim, amoglicosídeos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, bacitracina, beta lactams, candicidina, capreo- micina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, ce- fradina, cefaloglicina, quilonfenicóis, clorexidina, gliconato de closexidina, cloridrato de clorexidina, cloroxina, clorquiraldol, clortetraciclina, cloridrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, cloridrato de clindamicina, clotrimazol, cloxaci- lina, demeclociclina, diclosxacilina, diiodo hidroxiquina, doxiciclina, etambutol, clori- drato de etambutol, eritromicina, estolato de eritromicina, estearato de ermicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, giseofulvina, ha- loprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, iodo cloridroxiquina, canamicina, sulfato de canamicina, lincomicina, lineomicina, cloridrato de lineomicina, macrolidos, meclociclina, metaciclina, cloridrato de metaciclina, metenina, hipurato de metena- mina, mandelato de metenamina, meticilina, metonidazol, miconazol, cloridrato de miconazol, minociclina, cloridrato de minociclina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netimicina, sulfato de netimicina, nitrofurazona, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, orcefalosporinas, oxacilina, oxiteaclina, cloridrato de oxitetraciclina, paraclometa xilenol, paromomicina, sulfato de paromomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, cloridrato de pentamidina, feneticili- na, polimixinas, quinolonas, sulfato de streptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaf- tato, triclosan, trimfampina, rifamicina, rolitetraciclina, , sais de prata, spectinomicina, spiramicina, atruptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, tobramicina, sulfato de tobra- micina, triclocarbono, triclosam, trimetoprim - sulfametoxazol, tilosina, vancomicina, e irotricina.

[079] Ainda de acordo com uma outra realização, a composição farmacêutica pode ainda compreender um agente antiinflamatório.

[080] O agente antiinflamatório pode ser não-esteroidal, esteroidal, ou uma sua combinação. Exemplos não-limitantes de agentes antiinflamatórios não - esteroidais incluem, oxicanos, tais como piroxicam, isoxicam, tenoxicam, sudoxicam; salicilatos, como aspirina, disalcide, benorilato, trilisato, safaprim, solprim, diflunisal, e fendosal; derivados de ácido acético, como diclofenaco, fenclofenaco, indometaci- na, sulindac, tolmetina, isoxepac, furofenac, tiopinac, zidometacina, acematacina, fentiazac, zomepirac, clindanac, oxepinac, felbinac, e cetorolac; fenamatos, como ácidos mefenâmico, meclofenâmico, flufenâmico, niflúmico e tolfenâmico; derivados de ácido propiônico, como ibuprofeno, naproxeno, benoxaprofeno, flurbiprofeno, ce- toprofeno, fenoprofeno, fenbufeno, ondopropfeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, miroprofeno, tioxaprofeno, suprofeno, alminoprofeno, e tiaprofênico; pirazóis, como fenil butazona, oxifenbutazona, feprazona, azapropazona, e trimetazona. Extratos destes agentes antiinflamatórios não-esteroidais também podem ser empregados.

[081] Exemplos não-limitantes de drogas antiinflamatórias esteroidais incluem,corticosteróides como hidrocortisona, hidroxil triancinolona, alfa metil dexameta- sona, fosfato de dexametaqsona, dipropionatos de beclometasona, valerato de clo- betasol, desonida, desoxi metasona, acetato de desoxi corticosterona, dexametaso- na, diclorisona, diacetato de diflorasona, valerato de diflucortolona, fluadrenolona, fluclorolona acetonida, fludrocortisona, pivalato de flumetasona, fluosinolona acetonida, fluocinonida, butil ésteres de flucortina, fluocortolona, acetato de fluprednideno (fluprednilideno), flurandrenolona, halcinonida, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, metil prednisolona, triancinolona acetonida, cortisona, cortodoxona, flucetonida, fludrocorisona, diacetato de difluorosona, fluradrenolona, fludrocortisona, diacetato de diflurosona, fluradrenolona acetonida, medrisona, ancinafel, ancinafida, betametasona e o balanço de seus ésteres, cloroprednisona, acetato de cloropredni- sona, clocortelona, clescinolona, diclorisona, diflurprednato, flucloronida, flunisolida, flúor metalona, fluperolona, fluprednisolona, valerato de hidrocortisona, ciclo pentil propionato de hidrocortisona, hidrocortamato, meprednisona, parametasona, pred- nisolona, prednisona, dipropionato de beclometasona, triancinolona, e seus extratos.

[082] A composição farmacêutica pode ser formulada como uma formulação seca ou liofilizada, formulação semi-sólida, formulação líquida ou uma formulação de espuma. Assim, a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de um pó, solução, suspensão, emulsão, gel, spray, ou um emplastro.

[083] A composição farmacêutica pode ser administrada no sítio afetado topicamente, subcutaneamente, intracutaneamente ou intramuscularmente.

[084] De acordo com uma certa realização, a composição farmacêutica é administrada por injeção. De acordo com uma realização exemplar, a composição farmacêutica é injetada diretamente nos nódulos ou cordões fibrosos adoentados ou na placa fibrosa. Alternativamente, a composição farmacêutica é implantada em uma incisão cirúrgica. Preparações injetáveis estéreis podem ser formuladas como soluções aquosas ou suspensões oleaginosas como conhecido na técnica.

[085] Para uso tópico sobre a pele a composição farmacêutica pode ser formulada na forma de uma pomada, creme, loção, pasta, spray, ou aerossol. Exemplos de veículos apropriados incluem, mas não são limitados a, petrolatum, aqua- phor, neobase, propileno glicol, glicerina e semelhantes. Combinações de dois ou mais destes veículos também podem ser usadas.

[086] A composição farmacêutica pode ser formulada como formulações de liberação controlada ou sustentada permitindo liberação estendida dos componentes ativos sobre um período de tempo predeterminado. Em uma certa realização, a composição farmacêutica é administrada em combinação com um implante poliméri- co biocompatível, biodegradável, que libera o extrato proteolítico sobre um período de tempo controlado em um sítio selecionado. Exemplos de materiais poliméricos incluem polianidridos, poli orto ésteres, ácido poliglicólico, ácido poli lático, vinil acetato de polietileno, seus copolímeros e combinações (ver, Medical applications of controlled release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla.). Alternativamente, a composição farmacêutica é aplicada topicamente como um gel. Exemplos de materiais poliméricos que podem ser usados são polissacarídeos, particularmente derivados de celulose como, por exemplo, hidroxi propil celulose, carboxi metil celulose, e hidroxi etil celulose, quitina, quitosano, e alginatos. A formulação gel pode permitir liberação estendida dos componentes ativos sobre um período de tempo predeterminado.

[087] A composição farmacêutica pode ser formulada como uma espuma. Propelentes gasosos são usados para gerar e administrar uma composição espu- mável como espuma. Exemplos de propelentes gasosos apropriados incluem hidro- carbonetos voláteis como butano, propano, isobutano ou suas misturas, e gases flúor carbonetos. A composição pode ser aquosa, emulsão óleo-em-água, ou emulsão água-em-óleo, ainda compreendendo um agente estabilizante. O agente estabilizan- te aumenta a viscosidade da composição, pode contribuir para a estabilidade da composição, e/ou diminuir taxa de colapso de espuma. Exemplos de agentes estabi- lizantes incluem, mas não são limitados a, materiais poliméricos ocorrendo naturalmente (por exemplo, alginato, albumina, carragena, goma xantano, amido), materiais poliméricos semi-sintéticos como éteres de celulose (por exemplo, hidroxi etil celulose, metil celulose, carboxi metil celulose, hidroxi propil celulose), e materiais polimé- ricos sintéticos (por exemplo, álcool polivinílico, polímeros carboxi vinila, e polivinil pirrolidona).

[088] Técnicas para formulação e administração de drogas podem ser encontradas em “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição, que é aqui incorporada por referência.

[089] A composição farmacêutica pode ser administrada como uma dose única, ou em alíquotas em duas ou mais localizações no tecido fibroso afetado. A quantidade do extrato proteolítico a ser administrada é uma quantidade efetiva que amolece e/ou rompe a placa. Uma quantidade efetiva do extrato proteolítico pode variar de cerca de 0,2 mg/dia a cerca de 40 mg/dia. Em uma certa realização, a composição farmacêutica é administrada em duas ou mais alíquotas, cada uma compreendendo cerca de 0,5-1,5 mg, opcionalmente em 0,2-0,5 mL de solução ou suspensão.

[090] Em certas realizações, o órgão ao qual a composição farmacêutica compreendendo o extrato proteolítico é administrada é imobilizado por várias horas, por exemplo, 2 a 12 horas.

[091] Cada possibilidade mostrada por todo o relatório descritivo é uma realização separada da invenção.

[092] Os exemplos que se seguem são apresentados para provimento de um entendimento mais completo da invenção. As específicas técnicas, condições, materiais,proporções e dados reportados mostrados para ilustrarem os princípios da invenção são exemplares e não devem ser construídos como limitantes do escopo da invenção.

Exemplo 1 A atividade colagenolítica do extrato proteolítico

[093] O extrato proteolítico foi obtido de bromelaína como descrito em WO 2006/054309.

[094] A habilidade de duas bateladas de Debrase para degradar colágeno tipo IV foi primeiro determinada. O ensaio foi baseado em EnzChek Gelati- nase/collagenase Assay Kit (Invitrogen) que conteve colágeno DQ tipo IV marcado com fluoresceína como um substrato. Este substrato é conhecido ser eficientemente digerido por colagenases para render peptídeos altamente fluorescentes. O aumento em fluorescência é proporcional à atividade proteolítica.

[095] A cada cavidade, um tampão de reação Debrase (0,15 M Tris-HCl e 10 mM EDTA, pH 7,6) foi adicionado de modo a obter um volume final de 100 microli- tros. Dez microlitros de 0,5 μg/μL de solução de colágeno DQ tipo IV foi então adicionadoàs cavidades. A seguir, diferentes volumes (10-80 microlitros) de Debrase recentemente preparado em uma concentração de 0,225-1 ng/μL foram adicionados às cavidades em tampão Debrase para obter concentrações de 1,5-20 ng/cavidade. Tampão Debrase foi usado como um controle negativo. Placa de reação foi incubada em temperatura ambiente por 20 minutos. Para interromper a reação, 20 microli- tros de solução de interrupção de reação (ácido iodo acético 0,324 mM em tampão Debrase) foram adicionados. Intensidade de fluorescência foi medida por um leitor de fluorescência de micro-placa (Analyst AD, LJL) equipado com filtros padrões de fluoresceína. Fluorescência de fundo a partir de cavidades incubadas na ausência de enzima foi subtraída.

[096] A Fig. 1 mostra a atividade colagenolítica de duas bateladas de Debra- se. Como mostrado na figura, as duas bateladas de Debrase exerceram similar atividadecolagenolítica indicando que o procedimento experimental para obtenção de extrato proteolítico da presente invenção rende consistentes preparações de enzima.

[097] A seguir, a habilidade do extrato colagenolítico para degradar colágeno tipos I e IV foi determinada. Para esta finalidade, DQ colágeno tipo IV e DQ colágeno tipo I marcados com fluoresceína foram usados como substratos. O ensaio foi realizado como aqui descrito acima e continuado pelos períodos de tempo como indicados na Fig. 2. A reação foi interrompida pela adição de 20 microlitros de solução de interrupção de reação (0,324 mM ácido iodo acético em tampão Debrase) e a intensidade de fluorescência foi medida como aqui descrito acima.

[098] Colagenase purificada de Clostridium histolyticum serviu como um controle positivo com atividade pré-definida (uma unidade foi definida como a quantidade de enzima requerida para liberar 1 micromol de equivalentes de E-leucina a partir de colágeno em 5 horas a 37oC, pH 7,5).

[099] Para o ensaio com colagenase de Clostridium histolyticum, um tampão de reação para colagenase (Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,15 M, CaCl2 5 mM, azida sódi- ca 0,2 mM, pH 7,6) foi adicionado para obter um volume final de 100 microlitros por cada cavidade. Então, diferentes volumes (10-80 microlitros) de colagenase de Clostridium, 0,4-1 mU/μL, em tampão de colagenase de Clostridium foram adicionados a cavidades referência para atingir concentrações variando de 5 a 80 mU/cavidade. Para interromper reação de colagenase de Clostridium - 20 μL de 2 mg/mL de 1,10- fenantrolina em tampão colagenase foram adicionados.

[0100] Dados a partir de colagenase de Clostridium foram usados como um valor de referência por mUnidade. Dados a partir das amostras de extrato proteolíti- co (também chamado Debrase) foram divididos pelo valor de referência para determinar mU/ng Debrase.

[0101] A Fig. 2 mostra que o extrato proteolítico degradou colágeno tipo I e IV com uma atividade específica de 1,58 e 1,27 mU/ng, respectivamente.

[0102] A seguir, a atividade do extrato proteolítico foi comparada a atividade de colagenase de Clostridium histolyticum contra colagenase. A atividade proteolíti- ca de colagenase contra gelatina também foi medida usando o EnzChek Gelatinase / collagenase Assay Kit (Invitrogen) e DQ gelatina (Invitrogen) como um substrato.

[0103] A Fig. 3 mostra que o extrato proteolítico exerceu atividade colageno- lítica contra colágeno tipo IV, cuja atividade foi maior do que aquela obtida por cola- genase comercialmente disponível contra colágeno.

[0104] A Fig. 4 mostra que o extrato proteolítico exerceu atividade gelatinase. Como mostrado na figura, atividade gelatinase do extrato proteolítico foi linear em uma faixa de concentração de 2-8 ng/cavidade.

Exemplo 2 O extrato proteolítico facilita ruptura de cordão de Dupuytren

[0105] Cordões de Dupuytren foram obtidos de pacientes sofrendo fasciec- tomia (Figs. 5A, 5B e 5C). Formas consentidas foram assinadas por todos os sujeitos antes de cirurgia e o estudo foi aprovado por um comitê Helsinki. O experimento examinou a capacidade do extrato proteolítico realizar fasciectomia do cordão.

Preparação de tecido

[0106] Os cordões obtidos dos pacientes foram divididos em duas ou três peças, dependendo de seu comprimento (Fig. 6). Os cordões foram conectados através da técnica Krackov a um dispositivo de testes mecânicos via uma sutura 1 de prolene (Ethicon, Somerville, NJ) (Fig. 7). Um dos cordões foi injetado com o extratoproteolítico (0,3-0,5 mL do extrato proteolítico de acordo com o tamanho de cordão) e o segundo, cordão controle, foi injetado com solução salina (Fig. 8). Os cordões do grupo de extrato proteolítico foram imersos na solução de extrato proteo- lítico e os cordões do grupo controle foram imersos em solução salina. Ambos os grupos foram incubados a 37oC por 24 horas.

Testes Mecânicos

[0107] Após 24 horas de incubação,todos os cordões foram conectados a um dispositivo de teste de tensão de tração mecânica (Zwick 1445 testing system, Zwick Co., Germany). Cada cordão foi submetido a uma carga crescente até o cordão ou a sutura de conexão romper. O dispositivo mediu a força de tração aplicada até ruptura.

Análises Histológicas

[0108] A eficiência do grupo controle comparado ao grupo de estudo foi testada usando teste exato Fisher.

Resultados

[0109] Todos os cordões tratados com o extrato proteolítico (n = 10) foram rompidos seguindo estiramento (Figs. 10A e 10B). Alguns dos cordões tratados como extrato proteolítico foram quase completamente rompidos, praticamente dissolveram antes do teste mecânico. Todos os cordões controles (n = 9) não se rompem seguindo a aplicação de força de tração. Como mostrado na Fig. 11, todos os cor-dões controles exibiram um padrão de elongação de tensão similar representado por uma limitada elongação com crescente tensão do cordão até rompido quando uma carga muito alta é aplicada. Em contraste, todos os cordões tratados com o extrato proteolítico exibiram perda de resistência à tração do cordão, culminando em ruptura do cordão em uma tensão muito baixa (Fig. 12). Os resultados demonstraram que baixas doses, isto é, 0,8 mg/mL, do extrato proteolítico foram capazes de romper os cordões de doença de Dupuytren e que este efeito ainda foi demonstrado em maiores doses do extrato proteolítico, isto é, até 150 mg/mL.

[0110] De modo a avaliar o efeito de uma injeção única do extrato proteolíti- co sobre o estiramento de cordão de Dupuytren, os cordões foram injetados com o extrato proteolítico em três diferentes sítios ao longo de cordão e então incubados em solução salina na ausência do extrato proteolítico por 24 horas a 37oC.

[0111] A Fig. 13 mostra que injeções do extrato proteolítico dadas em três sítios dos cordões de Dupuytren foram capazes de reduzir a resistência à tração dos cordões por um fator de 4-5 (ver Fig. 13, teste 1a e 2 mostrando ruptura de cordão em uma tensão de 18 N e 15 N, respectivamente 13). Um cordão (Fig. 13, teste 1b) sofreu ruptura em uma tensão de 0,4 N. Estes resultados demonstram a eficiência do extrato proteolítico para dissolver cordões de Dupuytren e claramente implicam que o extrato proteolítico da presente invenção é uma medicação enzimática altamente efetiva para doença de Dupuytren assim como para outras doenças de tecido conjuntivo envolvendo excesso de deposição de colágeno.

[0112] Será apreciado por aqueles versados na técnica que a presente invenção não é limitada pelo que foi particularmente mostrado e descrito aqui acima. Antes o escopo da invenção é definido pelas reivindicações que se segue,

Claims

1. Uso de um extrato proteolítico obtido de bromelaína CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença do tecido conjuntivo, em que o extrato proteolítico compreende as cisteína proteases de bromelaína EC 3.4.22.32 e ananaína EC 3.4.22.31 de tronco, e uma lectina semelhante à jacalina, e em que a doença do tecido conjuntivo está associada com excesso de deposição de colágeno.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença do tecido conjuntivo é selecionada do grupo consistindo em doença de Dupuytren, doença de Peyronie, ombro congelado e doença de Ledderhose.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença do tecido conjuntivo é doença de Dupuytren.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença do tecido conjuntivo é doença de Peyronie.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o extrato proteolítico ainda compreende pelo menos um precursor de cisteína protease.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento ainda compreende um agente selecionado do grupo consistindo em um agente anestésico, agente antibacteriano e um agente antiinflamatório.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente anestésico é selecionado do grupo consistindo em ametocaína (tetra- caína), lignocaína (lidocaína), xilocaína, bupivacaína, prilocaína, ropivacaína, benzo- caína, mepivocaína, cocaína e combinações destas.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARATERIZADO pelo fato de que o agente antibacteriano é selecionado do grupo consistindo em cloridrato de aman- fadina, sulfato de amanfadina, amicacina, sulfato de amicacina, amoglicosídeos, amoxicilina, ampicilina, ansamicinas, bacitracina, beta-lactams, candicidina, capreo- micina, carbenicilina, cefalexina, cefaloridina, cefalotina, cefazolina, cefapirina, ce- fradina, cefaloglicina, quilonfenicóis, clorexidina, gliconato de closexidina, cloridrato de clorexidina, cloroxina, clorquiraldol, clortetraciclina, cloridrato de clortetraciclina, ciprofloxacina, circulina, clindamicina, cloridrato de clindamicina, clotrimazol, cloxaci- lina, demeclociclina, diclosxacilina, diiodo hidroxiquina, doxiciclina, etambutol, clori- drato de etambutol, eritromicina, estolato de eritromicina, estearato de ermicina, farnesol, floxacilina, gentamicina, sulfato de gentamicina, gramicidina, giseofulvina, ha- loprogina, haloquinol, hexaclorofeno, iminociclina, iodo cloridroxiquina, canamicina, sulfato de canamicina, lincomicina, lineomicina, cloridrato de lineomicina, macrolí- deos, meclociclina, metaciclina, cloridrato de metaciclina, metenina, hipurato de me- tenamina, mandelato de metenamina, meticilina, metonidazol, miconazol, cloridrato de miconazol, minociclina, cloridrato de minociclina, mupirocina, nafcilina, neomicina, sulfato de neomicina, netimicina, sulfato de netilmicina, nitrofurazona, norfloxacina, nistatina, octopirox, oleandomicina, orcefalosporinas, oxacilina, oxiteaclina, cloridrato de oxitetraciclina, paracloro meta xilenol, paromomicina, sulfato de paromomicina, penicilinas, penicilina G, penicilina V, pentamidina, cloridrato de pentamidina, feneti- cilina, polimixinas, quinolonas, sulfato de streptomicina, tetraciclina, tobramicina, tolnaftato, triclosam, trifampim, rifamicina, rolitetraciclina, sais de prata, spectinomici- na, spiramicina, struptomicina, sulfonamida, tetraciclinas, tetraciclina, tobramicina, sulfato de tobramicina, triclocarbono, triclosam, trimetoprim - sulfametoxazol, tilosina, vancomicina, e irotricina.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente antiinflamatório é selecionado do grupo consistindo em agentes antiin- flamatórios não-esteroidais e agentes antinflamatórios esteroidais.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento ainda compreende um componente selecionado do grupo con- sistindo em um agente estabilizante, um antioxidante, um conservante, um agente tamponante, um agente quelante e um agente de tonicidade.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado em uma forma selecionada do grupo consistindo em uma formulação sólida, uma formulação semissólida, uma formulação líquida e uma formulação de espuma.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a formulação sólida é um pó.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a formulação líquida é uma solução injetável de um pH de cerca de 6 a cerca de 7.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para administração através de injeção no tecido fibroso adoentado.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser injetado como uma dose única.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é formulado para ser injetado em alíquotas em duas ou mais localizações no tecido fibroso adoentado.