BRPI0620408B1 - Derivados de pirimidinil aril uréia sendo inibidores de fgf, seus usos, e preparação farmacêutica - Google Patents
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Abstract
compostos derivados de pirimidinil aril uréia sendo inibidores de fgf, uso dos mesmos, preparação farmacêutica e método para a sua fabricação. a invenção refere-se a heteroaril aril uréias da fórmula ia, em que os radicais e símbolos têm os significados como aqui definido, o uso de tais compostos no tratamento de doenças dependentes de proteína cina-se; às preparações farmacêuticas compreendendo a referidas heteroaril aril uréias, aos processos para a fabricação de tais novos compostos e aos métodos de tratamento compreendendo o uso de tais heteroaril aril uréias.
Description
[0001] A invenção se refere a novos compostos, formulações, mé-todos e usos. Mais particularmente se refere a novas heteroaril aril uréias, e/ou o uso de ou métodos compreendendo o uso de compostos, que podem ser descritos como heteroaril aril uréias, no tratamento, ou na fabricação de formulações de farmacêuticas úteis no tratamento, de doenças dependentes de proteína cinase. A invenção também se refere a métodos de uso de tais composto no tratamento das referidas doenças, preparações farmacêuticas compreendendo heteroaril aril uréias, e processos para a fabricação de das referida novas heteroaril aril uréias. A invenção se refere a outro assunto como descrito abaixo.
[0002] Proteína cinases (PKs) são enzimas que catalisam a fosfori-lação de resíduos de serina, treonina ou tirosina específicos em proteínas celulares. Estas modificações pós-translacionais de proteínas de substrato agem como mudança molecular na regulação proliferação, ativação e/ou diferenciação celular. A atividade de PK anormal ou excessiva foi observada em muitos estados de doença incluindo distúrbios proliferativos benignos e malignos. Em muitos casos, foi possível tratar doenças in vitroe em muitos casos in vivo, tais como distúrbios proliferativos, fazendo uso de inibidores de PK.
[0003] As cinases classificam-se em grande parte em dois grupos, aquelas específicas para fosforilação de serina e treonina, e aquelas específicas para fosforilação de tirosina. Além disso, algumas cinases, referidas como cinases de "especificidade dual", são capazes de fosfo- rilar resíduos de tirosina bem como de serina/treonina.
[0004] Proteína cinases podem da mesma forma ser caracteriza- das por sua localização dentro da célula. Algumas cinases são proteínas receptoras transmembranas capazes de ligarem ligantes externos à membrana da célula. A ligação dos ligantes altera a atividade catalítica da proteína cinase receptora. Outras são proteínas não receptoras desprovidas de um domínio de transmembrana e ainda outras são ec- tocinases que têm um domínio catalítico na porção extracelular (ecto) de uma proteína de transmembrana ou que são segregadas como proteínas extracelulares solúveis.
[0005] Muitas cinases estão envolvidas em cascatas reguladoras onde seus substratos podem incluir outras cinases cujas atividades são reguladas pelo seu estado de fosforilação. Desse modo, a atividade de um efetor a jusante é modulada por fosforilação resultando da ativação da série de reação.
[0006] Proteína tirosina cinases receptoras (RPTKs) é uma sub-classe de receptores de abrangência transmembrana dotados com atividade de tirosina cinase estimulável por ligante, intrínseca. A atividade de RPTK é firmemente controlada. Quando mutadas ou alteradas estruturalmente, as RPTKs podem se tornar oncoproteínas potentes, causando transformação celular ou pelo menos desregulação. Em princípio, para todas as RPTKs envolvidas em câncer, a desregulação oncogênica resulta da ajuda ou perturbação de um ou vários dos mecanismos de autocontrole que asseguram a repressão normal de domínios catalíticos. Mais da metade das RPTKs conhecidas foram repetidamente encontradas em formas mutadas ou superexpressas associadas com malignidades humanas (incluindo casos esporádicos; Blu- me-Jensen e outro, Nature411: 355-365 (2001)).
[0007] A superexpressão de RPTK conduz a ativação de cinase constitutiva aumentando-se a concentração de dímeros. Exemplos são o receptor de fator do crescimento da epiderme (EGFR) e Neu/ErbB2, que são frequentemente ampliados em carcinomas de mama e pulmão e os fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR) associados com distúrbios esqueléticos e prol iterativos (Blume-Jensen e outro, 2001).
[0008] Angiogênese é o mecanismo pelo qual novos capilares são formados a partir de vasos existentes. Quando requerido, o sistema vascular tem o potencial para gerar novas redes de capilares para manter o funcionamento adequado de tecidos e órgãos. No adulto, entretanto, a angiogênese é bastante limitada, ocorrendo somente no processo de cicatrização de ferimento e neovascularização do endo- métrio durante a menstruação. Veja Merenmies e outro, Cell Growth &Differentiation, 8, 3-10 (1997). Por outro lado, angiogênese não desejada é uma marca oficial de várias doenças, tais como retinopatias, psoríase, artrite reumatóide, degeneração macular relacionada com a idade (AMD), e câncer (tumores sólidos). Folkman, Nature Med., 1, 27- 31 (1995). As proteína cinases que mostrou estar envolvidas no processo angiogênico incluem três membros da família de tirosina cinase receptora do fator de crescimento: VEGF-R2 (receptor 2 de fator de crescimento endotelial vascular, também conhecido como KDR (receptor de domínio de inserção de cinase) e como FLK-1); FGF-R (receptor do fator de crescimento de fibroblastos); e TEK (também conhecido como Tie-2).
[0009] TEK (também conhecida como Tie-2) é uma tirosina cinase receptora expressa somente em células endoteliais a qual mostrou desempenhar um papel em angiogênese. A ligação do fator de angiopoe- tina-1 resulta em autofosforilação do domínio de cinase de TEK e resulta em um processo de transdução de sinal que parece mediar a interação de células endoteliais com células de sustentação periendote- liais, desse modo, facilitando a maturação de vasos sanguíneos recentemente formados. O fator de angiopoetina-2, por outro lado, parece antagonizar a ação de angiopoetina-1 em TEK e interrompe angiogênese. Maisonpierre e outro, Science, 277, 55-60 (1997).
[00010] A administração de Ad-ExTek, um domínio extracelular ex-presso adenoviral solúvel de Tie-2, inibiu metástase de tumor quando liberado no momento da excisão cirúrgica de tumores primários em um modelo de camundongo clinicamente relevante de metástase de tumor (Lin e outro, Proc Natl Acad Sei USA 95, 8829-8834 (1998)). A inibição da função de Tie-2 por ExTek pode ser uma consequência de seques- tração do ligante de angiopoietina e/ou heterodimerização com o receptor de Tie-2 nativo. Este estudo demonstra que a interrupção de séries de reações de sinalização de Tie-2, primeiro, pode ser bem tolerada em organismos saudáveis e, segundo, pode fornecer benefício terapêutico.
[00011] O Cromossoma Filadélfia é uma marca oficial para leucemia mielogenosa crônica (CML) e transporta um gene híbrido que contém éxons de terminal N do gene ber e a parte de terminal C principal (éxons 2-11) do gene c-abl. O produto de gene é uma proteína de 210 kD (p210 Bcr-Abl). A parte Abl da proteína de Bcr-Abl contém a abl- tirosina cinase que é rigorosamente regulada na c-abl do tipo selvagem, porém, constitutivamente ativada na proteína de fusão de Bcr- Abl. Esta tirosina cinase desregulada interage com múltiplas séries de reações de sinalização celular que conduzem a transformação e proliferação desregulada das células (Lugo e outro, Science 247, 1079 [1990]).
[00012] Formas mutantes da proteína de Bcr-Abl também foram identificadas. Uma revisão detalhada das formas mutantes de Bcr-Abl foi publicada (Cowan-Jones e outro, Mini Reviews in Medicinal Chemistry, 2004, 4 285-299).
[00013] EphB4 (também chamado HTK) e seu ligante, efrinB2 (HTKL) têm papéis críticos no estabelecimento e determinação de redes vasculares. No epitélio venoso, EphB4 é expresso especificamente, enquanto, durante estágios iniciais do desenvolvimento vascular, efrinB2 é especificamente e reciprocamente expresso em células endo- teliais arteriais. Genes disfuncionais conduzem à letalidade embriônica em camundongos, e os embriões mostram defeitos idênticos na formação de conexões capilares no caso de qualquer dos dois efrinB2 e EphB4 com defeito. Ambos são expressos no primeiro sítio de hema- topoiese e desenvolvimento vascular durante a embriogênese. Um papel essencial quanto ao desenvolvimento de mesoderma hematopoéti- co, endotelial, hemangioblasto e primitivo adequado foi estabelecido. A deficiência de EphB4 resulta em uma alteração no resultado de diferenciação mesodérmico de células-tronco embrionárias. Expressão ectópica de EphB4 em tecido mamário resulta em arquitetura desordenada, função de tecido anormal e uma predisposição à malignidade (veja, por exemplo, N. Munarini e outro, J. Cell. Sei. 115, 25-37 (2002)). A partir destes e outro dados, foi concluído que a expressão de EphB4 inadequada pode estar envolvida na formação de malignidades e, desse modo, que a inibição de EphB4 pode ser esperada ser uma ferramenta para combater malignidades, por exemplo, câncer e similares.
[00014] c-Src (também conhecida como p60 c-Src) é tirosina cinase não receptora, citossólica. c-Src está envolvida na transdução de sinais mitogênicos de vários fatores de crescimento de polipeptídeos tais como fator de crescimento da epiderme (EGF) e fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF). c-Src é superexpressa em cânceres mamários, cânceres pancreáticos, neuroblastomas, e outros. A c-Src mutante foi identificada em câncer de cólon humano. c-Src fosforila várias proteínas que estão envolvidas na regulação de interferências entre a matriz extracelular e o citoesqueleto de actina citoplasmática. A atividade de cSrc de modulação poderia ter implicações em doenças relacionadas à proliferação, diferenciação e morte celular. Veja Bjorge, J. D., e outro (2000) Oncogene 19(49):5620-5635; Halpern, M. S., e outro (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 93(2), 824-7; Belsches, A. P., e outro (1997) Frontiers in Bioscience 2:D501-D518; Zhan, X., e outro (2001) Chemical Reviews 101:2477-2496; Haskell, M. D., e outro (2001) Chemical Reviews 101:2425-2440.
[00015] A tirosina cinase receptora da tirosina cinase do tipo fms 3 (FLT3) é agora reconhecida como sendo um mediador crítico na pato- gênese de leucemias mielóides e algumas linfóides. A ativação de FLT3 em células leucêmicas através de ligante de FLT3 conduz à di- merização de receptor e transdução de sinal em séries de reações que promovem o crescimento celular e inibem a apoptose (Blood, Vol. 98, no. 3, páginas 885-887 (2001)).
[00016] O uso de inibidores de tirosina cinase para a terapia de AML é impedido pela aquisição de mutações no domínio catalítico de cinase, e no caso de BCR-ABL, estas mutações conferem resistência à imatiniba.
[00017] FLT3 é amplamente expressa em AML e alguns casos de leucemia linfocítica aguda. A ativação de mutações em FLT3 confere um fraco risco em pacientes com AML. Desse modo, FLT3 é um alvo promissor para intervenção terapêutica.
[00018] Tirosina cinase de receptor de fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGFR) é expressa em vários tumores tais como câncer de pulmão de célula pequena, câncer da próstata, e glioblastoma bem como nos compartimentos estromais e vasculares de muitos tumores. O termo de ambos os receptores de PDGF e PDGF (PDG- FRs) foi observado em câncer pancreático (Ebert M e outro, Int J Cancer, 62:529-535 (1995).
[00019] As Raf serina/treonina cinases são componentes essenciais do módulo de sinalização de Proteína Cinase ativada por Ras/Mito- gênio (MAPK) que controla um programa transcricional complexo com respeito a estímulos celulares externos. Genes de Raf codificam para serina-treonina-específica de proteína cinases altamente conservadas que são conhecidas por ligar-se ao oncogene de ras. Elas são parte de uma série de reação de transdução de sinal que acredita-se consistir em tirosina cinases receptoras, p21 ras, Raf proteína cinases, Mek1 (ativador de ERK ou MAPKK) cinases e ERK (MAPK) cinases, que finalmente fosforila fatores de transcrição. Nesta série de reação, Raf cinases são ativadas por Ras e fosforilam e ativam duas isoformas de Proteína Cinase Ativada por Mitógeno (chamadas Mek1 e Mek2), que são treonina/tirosina cinases de especificidade dual. Ambas os isofor-mas de Mek ativam Cinases 1 e 2 Ativadas por Mitógeno (MAPK, também chamadas Cinase 1 e 2 Reguladas por Ligante Extracelular ou Erk1 e Erk2). As MAPKs fosforilam muitos substratos incluindo fatores de transcrição e fazendo assim estabelecem seu programa transcricio- nal. A participação de Raf cinase na série de reação de Ras/MAPK influencia e regula muitas funções celulares tais como proliferação, diferenciação, sobrevivência, transformação oncogênica e apoptose.
[00020] Tanto o papel essencial quanto a posição de Raf em muitas séries de reações de sinalização foram demonstrados a partir de estudos utilizando-se mutantes de Raf inibidores dominantes e desregula- dos em células de mamífero bem como a partir de estudos utilizando- se organismos modelo de técnicas bioquímicas e genéticas. Em muitos casos, a ativação de Raf por receptores que estimulam fosforilação de tirosina celular é dependente da atividade de Ras, indicando que Ras funciona a montante de Raf. Na ativação, Raf-1 então fosforila e ativa Mek1, resultando na propagação do sinal para efetores a jusante, tais como MAPK (proteína cinase ativada por mitógeno) (Crews e outro (1993) Cell 74:215). As Raf serina/treonina cinases são consideradas como sendo efetores de Ras primário envolvidos na proliferação de células de animal (Avruch e outro (1994) Trends Biochem. Sei. 19:279).
[00021] Raf cinase tem três isoformas distintas, Raf-1 (c-Raf), A- Raf, e B-Raf, distinguidas pela sua capacidade para interagir com Ras, para ativar série de reação de MAPK cinase, distribuição de tecido e localização sub-celular (Marias e outro, Biochem. J. 351: 289-305, 2000; Weber e outro, Oncogene 19:169-176, 2000; Pritchard e outro, Mol. Cell. Biol. 15:6430-6442, 1995).
[00022] Recentes estudos mostraram que mutação de B-Raf nos nevos da pele é uma etapa crítica no início de neoplasia melanocítica (Pollock e outro, Nature Genetics 25: 1-2, 2002). Além disso, estudos mais recentes desenvolveram que mutação ativadora no domínio de cinase de B-Raf ocorre em cerca de 66% dos melanomas, 12% dos carcinomas de cólon e 14% de cânceres de fígado (Davies e outro, Nature 417: 949-954, 2002) (Yuen e outro, Cancer Research 62: 6451- 6455, 2002) (Brose e outro, Cancer Research 62: 6997-7000, 2002).
[00023] Inibidores de série de reação de Raf/MEK/ERK ao nível de Raf cinases podem ser potencialmente eficazes como agentes tera-pêuticos contra tumores com tirosina cinases receptoras superexpres- sas ou mutadas, tirosina cinases intracelulares ativadas, tumores com Grb2 anormalmente expresso (uma proteína adaptadora que permite a estimulação de Ras pelo fator de permuta de Sos) bem como tumores abrigando mutações ativadoras do próprio Raf. Em indicações clínicas precoces um inibidor de Raf-1 cinase, que também inibe B-Raf, mos- trou-se uma promessa como um agente terapêutico em terapia de câncer (Brutomp, Current Pharmaceutical Design 8: 2243-2248, 2002; Sebastien e outro, Current Pharmaceutical Design 8: 2249-2253, 2002).
[00024] A interrupção da expressão de Raf em linhagens celulares através de aplicação de tecnologia anti-sentido de RNA tem mostrado suprimir igualmente a tumorigenicidade mediada por Ras e Raf (Kolch e outro, Nature 349: 416-428, 1991; Monia e outro, Nature Medicine 2(6): 668-675, 1996).
[00025] O crescimento normal, bem como reparação e remodelação de tecido, requerem controle específico e delicado da ativação de fatores de crescimento e seus receptores. Fatores de Crescimento de Fi- broblastos (FGFs) constituem uma família de mais de vinte polipeptídeos estruturalmente relacionados que são progressivamente regulados e expressos em uma ampla variedade de tecidos. FGFs estimulam proliferação, migração e diferenciação celular e desempenham um papel principal em desenvolvimento esquelético e de membro, cicatriza- ção de ferimento, reparação de tecido, hematopoese, angiogênese, e tumorigênese (examinado em Ornitz, Novartis Found Svmp 232: 63-76; discussão 76-80, 272-82 (2001)).
[00026] A ação biológica de FGFs é mediada por receptores de su-perfície celular específica que pertencem à família de RPTK de proteína cinases. Estas proteínas consistem em um domínio de ligação de ligante extracelular, um domínio de transmembrana único e um domínio de tirosina cinase intracelular que sofre fosforilação na ligação de FGF. Quatro FGFRs foram identificados até esta data: FGFR1 (também chamado Fig, gene do tipo fms, flt-2, bFGFR, N-bFGFR, ou Cek1) FGFR2 (também chamado Cinase Expressa por Bek Bacteriano-, KGFR, Ksam, Ksaml e Cek3), FGFR3 (também chamado Cek2) e FGFR4. Todos os FGFRs maduros compartilham uma estrutura comum que consiste em um peptídeo de sinal de terminal amino, três domínios do tipo de imunoglobulina extracelulares (domínio de I de lg, domínio II de lg, domínio III de lg), com uma região acídica entre domínios de lg (o domínio de "caixa acídica"), um domínio de transmembrana, e domínios de cinase intracelulares (Ullrich e Schlessinger, Cell 61: 203,1990; Johnson e Williams (1992) Adv. Cancer Res. 60: 1-41). os isoformas de FGFR distintas têm diferentes afinidades de ligação para os diferentes ligantes de FGF, desse modo FGF8 (fator de crescimento induzido por androgênio) e FGF9 (fator de ativação glial) parecem ter seletividade aumentada quanto a FGFR3 (Chellaiah e outro J Biol. Chem 1994; 269: 11620).
[00027] Outra classe principal de sítios de ligação de superfície ce-lular inclui sítios de ligação para sulfatoproteoglicanos de heparana (HSPG) que são requeridos para interação de alta afinidade e ativação de todos os membros da família de FGF. O termo específica de tecido de variantes estruturais de sulfato de heparana confere especificidade de receptor de ligante e atividade de FGFs.
[00028] Recentes constatações mostram que um número crescente de anormalidades esqueléticas, incluindo acondroplasia, a forma mais comum de nanismo humano, resulta em mutações em FGFRs.
[00029] Mutações pontuais específicas em domínios diferentes de FGF-R1, FGF-R2, FGFR3 estão associadas com displasias esqueléticas humanas dominantes auto-sômicas classificadas como síndromes de craniossineostose e síndromes de nanismo (Coumoul e Deng, Birth Defects Research 69: 286-304 (2003). Displasias esqueléticas associadas às mutações de FGF-R3 incluem hipocondroplasia, acondroplasia severa com desenvolvimento atrasado e acantose nigricans(SAD- DAN) e displasia tanatofórica (TD) (Webster e outro, Trends Genetics 13 (5): 178-182 (1997); Tavormina e outro, Am. J. Hum. Genet.,64: 722-731 (1999)). Mutações de FGFR3 foram da mesma forma descritas em dois fenótipos de craniossinostose: craniossinostose coronal de Muenke (Bellus e outro, Nature Genetics,14: 174-176 (1996); Muenke e outro, Am. J. Hum. Genet.,60: 555-564 (1997)) e síndrome de Crouzon com acantose nigricans (Meyers e outro, Nature Genetics,11: 462- 464 (1995)). A síndrome de Crouzon está associada com mutações pontuais específicas em FGFR2 e ambas as formas familiares e esporádicas de síndrome de Pfeiffer estão associadas com mutações em FGFR1 e FGFR2 (Galvin e outro, PNAS USA, 93: 7894-7899 (1996); Schell e outro, Hum Mol Gen, 4: 323-328 (1995)). Mutações em FGFRs resultam na ativação constitutiva dos receptores mutados e atividade de proteína tirosina cinase receptora aumentada, tornando as células e tecido incapazes de diferenciarem-se.
[00030] Especificamente, a mutação de acondroplasia resulta na estabilidade realçada do receptor mutado, dissociação de ativação de receptor de sub-regulação, conduzindo à maturação de condrócito reprimida e inibição de crescimento ósseo (examinado em Vajo e outro, Endocrine Reviews, 21(1): 23-39 (2000)).
[00031] Há evidência acumulada quanto a mutações que ativam FGFR3 em vários tipos de câncer.
[00032] FGFR3 constitutivamente ativado em dois cânceres epiteli-ais comuns, bexiga e cérvice, bem como em mieloma múltiplo, é a primeira evidência de um papel oncogênico para FGFR3 em carcinomas. Além disso, um estudo muito recente relata a presença de mutações ativadoras de FGFR3 em uma grande proporção de tumores de pele benignos (Logie e outro, Hum Mol Genet2005). FGFR3 comumente parece ser o oncogene mais frequentemente mutado em câncer de bexiga onde ele é mutado em quase 50% dos casos de câncer de bexiga total e em cerca de 70% de casos tendo tumores de bexiga superficiais (Cappellen, e outro, Nature Genetics1999, 23; 19-20; van Rhijn, e outro, Cancer Research 2001, 61: 1265-1268; Billerey, e outro, Am. J. Pathol. 2001, 158:1955-1959, WO 2004/085676). A superexpressão anormal de FGFR3 foi relatada em câncer de bexiga (superficial e invasive) (Gomez-Roman e outro Clinical Cancer research 2005).
[00033] A superexpressão anormal de FGFR3 como uma conse-quência da translocação cromossômica t(4,14) é relatada em 10 a 25% de casos de mieloma múltiplo (Chesi e outro, Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Richelda e outro, Blood 1997, 90:4061-4070; Sibley e ou- tro, BJH 2002, 118: 514-520; Santra e outro, Blood 2003, 101: 2374- 2476). Mutações ativadoras de FGFR3 são observadas em 5 a 10% de mielomas múltiplos com t(4,14) e são associadas com a progressão do tumor (Chesi e outro, Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Chesi e outro, Blood, 97 (3): 729-736 (2001); Intini, e outro, BJH 2001, 114: 362- 364).
[00034] Neste contexto, as consequências de sinalização de FGFR3 parecem ser específicas do tipo de célula. Em condrócitos, a hiperati- vação de FGFR3 resulta em inibição do crescimento (examinado em Omitz, 2001), enquanto que na célula de mieloma ela contribui para a progressão do tumor (Chesi e outro, 2001).
[00035] A inibição da atividade de FGFR3 constatou-se representar um método para tratamento de doenças inflamatórias ou auto-imunes mediadas por célula T, como por exemplo, no tratamento de doenças inflamatórias ou auto-imunes mediadas por célula T incluindo mas não limitadas à artrite reumatóide (RA), artrite de colágeno II, esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjogren, doença da tiróide, sarcoidose, uveíte auto- imune, doença inflamatória do intestino (colite de Crohn e ulcerativa), doença celíaca e miastenia grave. Veja WO 2004/110487.
[00036] Distúrbios que resultam em mutações de FGFR3 também são descritos nos WO 03/023004 e WO 02/102972.
[00037] Entre as doenças promovidas por FGFR3 e também outros FGFRs (especialmente com relação a por exemplo, níveis de soro de FGF23 anormais), também Raquitismo Hipofosfatêmicos Dominantes Autossômicos (ADHR), raquitismos hipofosfatêmicos ligados ao cromossoma X (XLH), Osteomalacia induzida por tumor (TIO), displasia fibrosa do osso (FH) serão mencionados (veja também X. Yu e outro, Cytokine &Growth Fator Reviews 16, 221-232 (2005), e X. Yu e outro, Therapeutic Apheresis and Dialysis 9(4), 308-312 (2005)).
[00038] Amplificação e/ou superexpressão de gene de FGFR1, FGFR2 e FGFR4 foi/foram implicada(s) no câncer de mama (Penault- Llorca e outro, Int J Cancer 1995; Theillet e outro, Genes Chrom. Cancer 1993; Adnane e outro, Oncogene 1991; Jaakola e outro, Int J Cancer 1993; Yamada e outro, Neuro Res 2002). A superexpressão de FGFR1 e FGFR4 também está associada com astrocitomas e adenocarcinomas pancreáticos (Kobrin e outro, Cancer Research 1993; Ya- manaka e outro, Cancer Research 1993; Shah e outro, Oncogene 2002; Yamaguchi e outro, PNAS 1994; Yamada e outro, Neuro Res 2002). Câncer de próstata também foi relacionado a superexpressão de FGFR1 (Giri e outro, Clin Cancer Res 1999).
[00039] FGFs/FGFRs estão também envolvidos na angiogênese. Portanto, o alvejamento do sistema de FGFR é também previsto como uma terapia antiangiogênica para tratar tumores primários, bem como metástase. (veja por exemplo, Presta e outro, Citokine &Growth Factor Reviews 16, 159-178 (2005)).
[00040] Mutações, especialmente em FGFR3 (por exemplo, FGFR3b) foram também descritas ser responsáveis para ativação constitutiva destes receptores no caso de carcinoma de célula esca-mosa oral (veja por exemplo, Y. Zhang e outro, Int. J. Cancer 117, 166- 168 (2005).
[00041] Expressão realçada (especialmente bronquial) de FGFRs, especialmente FGFR1, foi relatada estar associada com Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD) (veja por exemplo, A. Kranenburg e outro, J. Patol. 206, 28-38 (2005)).
[00042] Translocações cromossômicas envolvendo o local de FGF- R1 e resultando em formas ativadas de FGR-R1 foram relatadas ser responsáveis por síndrome mieloproliferativa 8p11 = Síndrome Mielo- proliferativa Eosinofílica (EMS) (veja D. Macdonald e outro, Cross NCP (2002) Acta Haematologica 107: 101-107).
[00043] Métodos de antagonizar FGFRs, especialmente FGFR1 ou FGFR4, foram também descritos ser úteis no tratamento de obesidade, diabetes e/ou doenças relacionadas a isso, tal como síndrome metabólica, doenças cardiovasculares, hipertensão, níveis de triglicerídeo e colesterol anormais, distúrbios dermatológicos (por exemplo, infecções, veias varicosas, Acantose nigricans,eczema, intolerância a exercício, diabetes tipo 2, resistência à insulina, hipercolesterolemia, colelitíase, lesão ortopédica, doença tromboembólica, restrição coronária ou vascular (por exemplo, aterosclerose), sonolência durante o dia, apnéia do sono, doenças renais em estágio terminal, doença da vesícula biliar, gota, distúrbios térmicos, resposta imune comprometida, função respiratória comprometida, infecções depois de ferimentos, infertilidade, doença hepática, dor do dorso inferior, complicações obstétricas e gine-cológicas, pancreatite, acidente vascular cerebral, complicações cirúrgicas, incotinência por estresse urinária e/ou distúrbios gastrointestinais (veja por exemplo, WO 2005/037235 A2).
[00044] Fator de Crescimento de Fibroblasto Ácido (especialmente FGF-1) e FGFR1 foram também descritos por estarem envolvidos na sinalização anormal em retinoblastoma, levando à proliferação na ligação de FGF-1 (veja por exemplo, S. Siffroi-Fernandez e outro, Arch. Ophtalmology 123, 368-376 (2005)).
[00045] O crescimento de sarcomas sinoviais mostrou ser inibido por rompimento da Série de Reação de Sinalização de Fator de Cres-cimento de Fibroblato (veja por exemplo, T. Ishibe et al., Clin. Cancer Res. 11(7), 2702-2712 (2005)).
[00046] Além disso, envolvimento de FGFR no caso de carcinoma da tireoide poderia ser demonstrado.
[00047] O receptor de fator de crescimento da epiderme (EGF-R) e ErbB-2 cinase são receptores de proteína tirosina cinase que, juntos com seus membros familiares ErbB-3 e ErbB-4, desempenham um pa- pel fundamental na transmissão de sinal em um grande número de células de mamíferos, incluindo células humanas, especialmente células epiteliais, células do sistema imune e células do sistema nervoso central e periférico. Por exemplo, em vários tipos de células, a ativação induzida por EGF de proteína tirosina cinase associada com receptor é um pré-requisito para a divisão celular e consequentemente para a proliferação da população de células. Mais importante, a superexpressão do EGF-R (HER-1) e/ou ErbB-2 (HER-2) foi observada em frações substanciais de muitos tumores humanos. EGF-R, por exemplo, constatou ser superexpresso em cânceres de pulmão de célula pequena, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), cânceres de mama, gástricos, ovarianos, de cólon e de próstata bem como em gliomas. ErbB-2 foi constatado ser superexpresso em carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), cânceres de mama, gástricos, e ovarianos bem como em gliomas.
[00048] Em todos os casos mencionados acima onde proteína cina-ses estão envolvidas, a modulação de uma atividade anormal (especialmente a inibição de uma atividade de uma tal cinase) pode ser esperado razoavelmente ser útil nas doenças mencionadas.
[00049] Há, desse modo, uma necessidade imprópria quanto às mo-léculas seletivas e/ou altamente capazes de bloquear a atividade de proteína tirosina cinase receptora constitutiva anormal, em particular atividade de FGFR, desse modo controlando as manifestações clínicas associadas com as mutações anteriormente mencionadas, e modulando as várias funções biológicas.
[00050] Devido ao grande número de inibidores de proteína cinase e a multidão de doenças proliferativas e outras relacionadas com PK, há uma necessidade já existente de fornecer novas classes de com- postos que são úteis como inibidores de PK e desse modo no trata-mento destas doenças relacionadas com Proteína Tirosina Cinase (PTK). O que é requerido são novas classes de compostos de inibição de PK farmaceuticamente vantajosos.
[00051] Foi agora constatado que os compostos produzidos em mais detalhes abaixo, que podem ser descritos como pertencendo à classe de heteroaril aril uréia, mostraram inibição de várias proteína tirosina cinases, especialmente qualquer tal cinase mencionada aqui, mais especialmente de FGFR.
[00052] Como exemplos de cinases inibidas pelos compostos da descrição pode haver FGFR1, FGFR2, FGFR3 e FGFR4 especialmente mencionados. Outra cinase inibida é a tirosina cinase receptora de VEGF-R, em particular o KDR receptor de VEGF (VEGF-R2). Os compostos descritos são apropriadas para a inibição de um ou mais destes e/ou outras cinases de tirosina de proteína e/ou para a inibição de mutantes destas enzimas. Devido a estas atividades, os compostos podem ser utilizados para o tratamento de doenças realacionadas a, especialmente, atividade anormal ou excessiva de tais tipos de cinases, especialmente aquelas mencionadas.
[00053] Os compostos da descrição podem existir em formas dife-rentes, tais como ácidos livres, bases livres, ésteres e outras pró- fármacos, sais e tautômeros, por exemplo, e a descrição compreende todas as formas variantes dos compostos.
[00054] A extensão de proteção inclui produtos falsificados ou frau-dulentos que contêm ou pretendem conter um composto da invenção independente de se eles de fato contêm um tal composto e independente de se qualquer tal composto está contido em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Incluído no escopo de proteção, portanto, são pacotes que incluem uma descrição ou instruções que indicam que o pacote contém uma espécie ou formulação farmacêutica ou composição da invenção e um produto que é ou compreende, ou pretende ser ou compreender, uma tal formulação, composição ou espécies.
[00055] Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, o singular abrange o plural a menos que o contexto exija de outra forma. Em particular, onde o artigo indefinido é utilizado, a especificação deve ser entendida como considerada pluralidade bem como singularidade, a menos que o contexto exija de outra forma.
[00056] Aspectos, números inteiros, características, compostos, porções ou grupos químicos descritos em conjunção com um aspecto, modalidade ou exemplo particular da invenção deve ser entendido ser aplicáveis a qualquer outro aspecto, modalidade ou exemplo descrito aqui a menos que incompatível com este.
[00057] Em toda a descrição e reivindicações desta especificação, as palavras "compreendem" e "contém" e variações das palavras, por exemplo, "compreendendo" e "compreende", significam "incluindo, mas não limitados a", e não são pretendidas (e não pretendem) excluir outras porções, aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.
[00058] Outros aspectos e modalidades da descrição são mencio-nados na seguinte descrição e reivindicações. Descrição Detalhada da Invenção Foi agora constatado que os novos compostos da Fórmula IA,
em que dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmente Y e Z são N e Z é CH); e em que R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-Ci-Cz-alqui- lóxi, piperazin-1-ila ou 4-(fenil-Ci-C7-alquil)-piperazin-1-ila; ou fenila que é substituída por (i) halo ou Ci-C?-alcóxi e adição (ii) por hidróxi, fenil-Ci-C7-alquilóxi, N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7- alquila, pirrolidino-Ci-C7-alcóxi, 1-(Ci-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfoli- no-Ci-C7-alcóxi, tiomorfolino-Ci-C7-alcóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-Ci- C7-alquil)-piperazin-1 -ila, 4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -ila, [4-(CI-C7- alquil)-piperazin-1-il]-Ci-C7-alquila, N-mono - ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)- amino-Ci-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7- alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-Ci-C7-alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)- piperazin-1 -i l]-carbon i la; R2 é hidrogênio, Ci-C7-alquila, Ci-C7-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, Ci-C7-alquila ou fenil-Ci-C7-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, Ci-C7-alquila, halo-Ci-C7-alquila, halo ou Ci-C7-alcóxi, e n é 0, 1,2, 3, 4 ou 5; ou R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-Ci-C7-alqui- lóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-Ci-C7-alquil)-piperazin-1-ila; N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila, pirrolidino-Ci-C7-alcóxi, 1- (Ci-C7-alquil)-piperidin-4-ila, morfolino-Ci-C7-alcóxi, tiomorfolino-Ci-C7- alcóxi, 4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -ila, [4-(C i-C7-alq u i l)-pi perazin-1 -i I]- Ci-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila, N- mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)- piperazin-1 -il]-C 1 -C7-alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-carbonila; ou fenila que leva um dos substituintes mencionados até agora no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo e Ci-C7-alcóxi; R2 é hidrogênio, Ci-C7-alquila, Ci-C?-alcóxi ou halo; R3 é hidrogênio, Ci-C7-alquila ou fenil-Ci-C?-alquila, R5 é hidrogênio (preferido), Ci-C?-alquila ou fenil-Ci-Cy alquila, e n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de Ci-C?-alquila, Ci-C7-alcóxi e halo, com a condição que pelo menos um de cada den- trentre Ci-C7-alquila, Ci-C?-alcóxi e halo esteja presente; n é 2 e um R4 é halo-Ci-C?-alquila, o outro R4 é C1-C7- alcóxi; n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e Ci- Cy-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre halo, iodo e Ci-Cyalcóxi, esteja presente; n é 3, 4 ou 5 e R4 é seleciondo a partir de halo, halo-Ci-C7- alquila e Ci-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, halo-Ci-C7-alquila e Ci-C7-alcóxi esteja presente; ou Y e Z são N (nitrogênio) e X é CH, em que ou R1 é 3-piridila que é monossubstituída por N-Ci-C7-alquil- piperazin-1-ila, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, cada R4 é, independentemente dos outros, Ci-C7-alquila, halo-Ci-C7-alquila, halo ou Ci-C7-alcóxi, R5 é hidrogênio e n é 1,2, 3, 4 ou 5; ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il- etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH; ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 3-(4-metil- piperazin-1-ilmetil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6- cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 3-(4-etil-piperazin- 1 -il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5- metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 4-(2-morfolin-4-il- etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 4-(1-etil-piperidin- 4-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5- metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil-pipeazin- 1 -il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5- metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH, e/ou ou um composto da Fórmula IA em que R1 é 4-(4-etil- piperazina-1-carbonil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi, n é 4, R5 é hidrogênio, Y e Z são N e X é CH; ou misturas de dois ou mais compostos da Fórmula IA; ou em cada caso de um composto da Fórmula IA (como mencionado acima ou abaixo) sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes, são úteis no tratamento de distúrbios relacionados à ativi- dade de proteína cinase, especialmente com respeito a doenças que podem ser tratadas por compostos de modulação de Proteína Tirosina Cinase modulando compostos, mais especialmente compostos de modulação de FGFR.
[00059] Portanto, a invenção se refere a um ou mais destes com-postos da Fórmula IA, sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes, bem como para os usos, métodos e formulações farmacêuticas mencionadas acima.
[00060] Em particular, as presentes invenções referem-se a com-postos de Fórmula IA, em que dois dentre X, Y e Z são N (nitrogênio), o terceiro é CH ou N (preferivelmente Y e Z são N e Z é CH); e ou (A) R1 é fenila que é substituída por hidróxi, por fenil-Ci-C?- alquilóxi (especialmente benzilóxi), por piperazin-1-ila ou por 4-(fenil- Ci-C?-alquil)-piperazin-1 -ila (especialmente 4-benzil-piperazin-1 -ila); ou fenila que é substituída (i) (uma vez) por halo (especialmente fluoro ou cloro) ou Ci-C?-alcóxi (especialmente metoxi) e além disso (ii) (uma vez) por hidróxi, fenil-Ci-C?-alquilóxi (especialmente benzilóxi), N- mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila (especialmente di- metilaminometila), pirrolidino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-pirrolidino- etóxi), 1-(Ci-C7-alquil)-piperidin-4-ila (especialmente 1-etil-piperidin-4- il), morfolino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino-etóxi), tiomor- folino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino-etóxi), piperazin-1-ila, 4-(fenil-C 1 -C7-alquil)-piperazin-1 -ila (especialmente 4-benzilpiperazin-1 - I), 4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4-(metil, etil ou iso- propil)-piperazin-1 -il), [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-Ci-C7-alquila (es-pecialmente 2-[4-(metil ou etil)-piperazin-1-il]-etila), N-mono- ou N,N-di- (Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila (especialmente dimetilaminometila), N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2- (dimetiIamino)-etóxi), [4-(C 1 -Cy-alquil)-piperazin-1 -il]-C 1 -C?-alcóxi (especialmente 2-(4-metilpiperazin-1-il)-etóxi) ou [4-(Ci-C?-alquil)- piperazin-1 -il]-carbonila (especialmente 4-etiIpiperazin-1 -carbonila); R2 é hidrogénio (preferido), Ci-C?-alquila, Ci-C?-alcóxi ou (com preferência inferior) halo; R3 é hidrogênio (preferido), Ci-C?-alquila (preferido) ou fenil- Ci-C?-alquila, cada R4 é, independentemente dos outros, Ci-C?-alquila, halo-Ci-C?-alquila, halo ou Ci-C?-alcóxi, R5 é hidrogênio (preferido), Ci-C?-alquila ou fenil-Ci-Cz- alquila, e n é 0, 1,2, 3, 4 ou 5; ou (B) em que R1 é fenila que é substituída por hidróxi, fenil-Ci- Cyalquilóxi (especialmente benzilóxi), piperazin-1-ila, 4-(fenil-Ci-C?- alquil)-piperazin-1-ila (especialmente 4-benzil-piperazin-1 -ila), N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila (especialmente dimetila- minometila), pirrolidino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-pirrolidino-etóxi), 1 -(C1 -C7-alq u i l)-pi perid in-4-i la (especialmente 1 -eti l-pi perid in-4-i la), morfolino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-morfolino-etóxi), tiomorfolino- Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-tiomorfolino-etóxi), 4-(Ci-C7-alquil)- piperazin-1-ila (especialmente 4-(metil, etil ou isopropil)-piperazin-1- ila), [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1-il]-Ci-C7-alquila (especialmente 2-[4- (metil ou etil)-piperazin-1-il]-etila), N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)- amino-Ci-C7-alquila (especialmente dimetilaminometila), N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2- (dimetilamino)-etóxi), [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -il]-Ci-C7-alcóxi (especialmente 2-(4-metilpiperazin-1-il)-etóxi) ou [4-(Ci-C7-alquil)- piperazin-1-il]-carbonila (especialmente 4-etilpiperazin-1-carbonila); ou fenila que leva um dos substituintes mencionados até aqui para R1 no presente parágrafo e além disso um substituinte selecionado a partir de halo e Ci-Cz-alcóxi; R2 é hidrogênio (preferido), Ci-C?-alquila, Ci-C7-alcóxi ou (com preferência inferior) halo; R3 é hidrogênio (preferido), Ci-Cz-alquila (preferido) ou fenil- Ci-C7-alquila, R5 é hidrogênio (preferido), Ci-C7-alquila ou fenil-Ci-C7- alquila, e n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de Ci-C7-alquila, Ci-C7-alcóxi e halo, com a condição que pelo menos um de cada den- trentre Ci-C7-alquila, Ci-C7-alcóxi e halo esteja presente; n é 2 e um R4 é halo-Ci-C7-alquila, o outro R4 é C1-C7- alcóxi; n é 3, 4 ou 5 e R4 é selecionado a partir de halo, iodo e Ci- C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentre halo, iodo e Ci-C7-alcóxi, esteja presente; n é 3, 4 ou 5 e R41 selecionado a partir de halo, halo-Ci-C7- alquila e Ci-C7-alcóxi, com a condição que pelo menos um de cada dentrentre halo, halo-Ci-C7-alquila e Ci-C7-alcóxi esteja presente; (C) ou um composto da Fórmula IA com os nomes 1-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-3-{6-[4-(2-morfolin-4-il- etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4 e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-1 -{6-[3-(4-metil- piperazin-1 -ilmetil)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[3-(4-etil-piperazin-1- il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 3-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-metil-1-{6-[4-(2-morfolin- 4-il-etóxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -{6-[4-(1 -etil-piperidin-4-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 4-(1 -etil-piperidin-4-il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio), 3-(2,6-d icloro-3,5-d imetóxi-fen i I)-1 -eti I-1 -{6-[4-(4-eti I- piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 4-(4-etil-pipeazin-1 -il)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é etila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio) ou 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazina-1- carbonil)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-uréia (onde, referindo-se à Fórmula IA, R1 é 4-(4-etil-piperazina-1-carbonil)-fenilamino, R2 é hidrogênio, R3 é metila, R4 é 2- e 6-cloro e 3- e 5-metóxi e n é 4, e R5 é hidrogênio), (onde em cada destes compostos as porções correspon-dentes a R1, R2, R3, R4, R5, X, Y e Z e n na Fórmula IA são definidas pelos respectivos significados como determinado para estes compostos, respectivamente); onde em cada destes compostos Y e Z são nitrogênio e X é CH; e em cada caso de um composto da Fórmula IA (como mencionado acima ou abaixo) sais, pró-fármacos, N-óxidos ou ésteres destes.
[00061] Em uma modalidade, a presente invenção fornece compostos de Fórmula IA, em que Y e Z são N (nitrogênio) e X é CH, em que R1 é 3-piridila que é monossubstituída por N-Ci-C?-alquil- piperazin-1-ila, R2 é hidrogênio, R3 é hidrogênio, cada R4 é, independentemente dos outros, Ci-C?-alquila, halo-Ci-C?-alquila, halo ou Ci-C?-alcóxi, R5 é hidrogênio, e n é 1,2, 3, 4 ou 5.
[00062] Em tal modalidade, preferivelmente R4 é, independente-mente dos outros, halo ou Ci-C?-alcóxi, e n é preferivelmente 3, 4 ou 5, preferivelmente 4.
[00063] Os termos gerais utilizados aqui abaixo e em seguida prefe-rivelmente têm dentro do contexto desta descrição os seguintes significados, a menos que de outra maneira indicado:
[00064] O prefixo "inferior" ou "C1-C7" denota um radical tendo até e incluindo um máximo de 7 átomos em-cadeia, especialmente até e incluindo um máximo de 4 átomos em-cadeia. Classes particulares de alquila e alifático compreendem 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Os radicais em questão sendo ou lineares ou ramificados com ramificações únicas ou múltiplas.
[00065] Alquila inferior ou Ci-C?-alquila é preferivelmente alquila com de e incluindo 1 até e incluindo 7 átomos de carbono, preferivel-mente 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono, e é linear ou se ramificado; por exemplo, alquila inferior é butila, tal como n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, propila, tal como n-propila ou isopropila, etila ou metila. Alquila inferior exemplar é metila, etila ou isopropila.
[00066] Onde a forma plural é utilizada para compostos, sais, e si-milares, isto é utilizado para indicar da mesma forma um único com-posto, sal, ou similar.
[00067] Onde fenila está presente em R1 como ligaçção de anel R1 a NR5 na Fórmula IA, os substituintes de hidróxi, fenil-Ci-Cyalquilóxi, piperazin-1-ila, 4-(fenil-Ci-C?-alquil)-piperazin-1-il; N-mono- ou N,N-di- (Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila, pirrolid ino-C i-C7-alcóxi, 1 -(C1-C7- alquil)-piperidin-4-ila, morfolino-Ci-C7-alcóxi, tiomorfolino-Ci-C7-alcóxi, 4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1 -ila, [4-(C 1 -C7-alq u i l)-pi perazin-1 -i l]-C 1 -C7- alquila, N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alquila, N-mono- ou N,N-di-(Ci-C7-alquil)-amino-Ci-C7-alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin- 1-il]-Ci-C7-alcóxi, [4-(Ci-C7-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila estão preferivelmente presentes nas posições 3- ou 4-relativo à ligação a NR3.
[00068] Quaisquer átomos de carbono assimétricos podem estar presentes na configuração (R)-, (S)- ou (R,S)-, preferivelmente na configuração (R)- ou (S)-. Radicais tendo qualquer insaturação estão presentes na forma cis-, trans - ou (cis, trans). Os compostos podem desse modo estar presentes como misturas de isômeros ou como isôme- ros puros, preferivelmente como enantiómero - diastereômeros puros.
[00069] A invenção se refere da mesma forma a possíveis tautôme- ros dos compostos descritos.
[00070] Devido à relação íntima entre compostos da Fórmula IA na forma livre e na forma dos seus sais, incluindo aqueles sais que podem ser utilizados como intermediários, por exemplo, na purificação ou identificação dos novos compostos, e tautômeros ou misturas tautomé- ricas e seus sais, qualquer referência aqui anteriormente e em seguida a estes compostos, deve ser a como referindo-se da mesma forma aos tautômeros correspondentes destes compostos, ou sais de quaisquer destes, quando apropriado e conveniente e se não mencionado de outra maneira.
[00071] Tautômeros podem, por exemplo, estar presentes em casos onde amino ou hidróxi, cada qual com pelo menos uma ligação de hidrogênio, é ligado a átomos de carbono que são ligados a átomos adjacentes por ligações duplas (por exemplo, ceto-enol ou tautomeroismo de imina-enamina).
[00072] Onde "um composto..., um tautômero destes; ou um sal destes" ou similar é mencionado, isto significa "um composto..., um tautômero destes, ou um sal do composto e/ou o tautômero".
[00073] Halogênio (halo) especialmente é flúor, cloro, bromo, ou io-do, especialmente (preferivelmente em compostos da Fórmula I) flúor, cloro, ou iodo.
[00074] Halo-Ci-C?-alquila significa um Ci-C?-alquila em que um ou mais átomos de hidrogênio são substituídos por átomos de halogênio, por exemplo, trifluorometila.
[00075] [4-(Ci-C?-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila significa [4-(Ci-Cz- alq u i l)-pi perazin-1 -il]-C(=O)-.
[00076] A presente invenção se refere a compostos da Fórmula IA como descrito acima e sais, éster, N-óxido ou pró-fármaco destes. Em um aspecto, portanto, a invenção fornece produtos que são compostos da Fórmula IA e/ou sais, ésteres, N-óxidos ou pró-fármacos destes.
[00077] Sais são especialmente os sais farmaceuticamente aceitá-veis de compostos da Fórmula (I) (ou Fórmula exemplar desta), especialmente se eles estão formando grupos de formação de sal.
[00078] Grupos de formação de sal são grupos ou radicais que têm propriedades básicas ou acídicas. Compostos tendo pelo menos um grupo básico ou pelo menos um radical básico, por exemplo, nitrogênio básico, tal como amino, um grupo amino secundário que não forma uma ligação de peptídeo ou amino terciário, podem formar sais de adição ácidos, por exemplo, com ácidos inorgânicos, tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou um ácido fosfórico, ou com ácidos sulfônicos ou carboxílicos orgânicos adequados, por exemplo, ácidos mono- ou dicarboxílicos alifáticos, tais como ácido trifluoroacético, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido hidroximaléico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico ou ácido oxálico, ou aminoácidos tais como arginina ou lisina, ácidos carboxílicos aromáticos, tais como ácido benzóico, ácido 2-fenoxi- benzóico, ácido 2-acetoxi-benzóico, ácido salicílico, ácido 4- aminossalicílico, ácidos carboxílicos aromático-alifáticos, tais como ácido mandélico ou ácido cinâmico, ácidos carboxílicos heteroaromáti- cos, tais como ácido nicotínico ou ácido isonicotínico, ácidos sulfônicos alifáticos, tais como ácido metano-, etano- ou 2-hidroxietanossulfônico, ou ácidos sulfônicos aromáticos, por exemplo, ácido benzeno-, p- tolueno- ou naftaleno-2-sulfônico. Quando vários grupos básicos estão presentes, sais de adição de mono- ou poliácidos podem ser formados.
[00079] Compostos que têm grupos ácidos, um grupo carbóxi ou um grupo hidróxi fenólico, podem formar sais de metal ou amónio, tais como sais de metal de álcali ou metal alcalinoterroso, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou sais de amónio com amónia ou aminas orgânicas adequadas, tais como monoaminas terciárias, por exemplo, trietilamina ou tri-(2-hidróxi-etil)-amina, ou bases heterocícli- cas, por exemplo, N-etil-piperidina ou /V,/V-dimetilpiperazina. Misturas de sais são possíveis.
[00080] Compostos que têm ambos os grupos ácidos e básicos po-dem formar sais internos.
[00081] Para os propósitos de isolamento ou purificação, bem como no caso de compostos que são utilizados também como intermediá-rios, é também possível utilizar sais farmaceuticamente inaceitáveis, por exemplo, os picratos. Somente sais não-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para propósitos terapêuticos, entretanto, e esses sais são portanto preferidos.
[00082] Devido à relação íntima entre os novos compostos ou N- óxidos destes na forma livre e aqueles na forma de seus sais, incluindo aqueles sais que podem ser utilizados como intermediários, por exemplo, na purificação ou identificação dos novos compostos, qualquer referência aos compostos livres (incluindo compostos da Fórmula IA, intermediários e materiais de partida) aqui anteriormente e em seguida deve ser entendido como referindo-se também aos N-óxidos correspondentes, e/ou sais, hidratos, solvatos e/ou formas cristalinas dos compostos ou seus N-óxidos, como apropriado e expediente.
[00083] Os compostos da Fórmula IA (ou Fórmulas exemplares des-tes) têm propriedades farmacológicas valiosas, como descrito anteri-ormente e em seguida.
[00084] A eficácia dos compostos da invenção como inibidores de atividade de tirosina cinase receptora de Bcr-Abl, c-KIT, EfB4, EGF-R, VEGF-R2 (KDR), FGF-R, Tie-2 (Tek), Ret, PDGFR, raf, FLT3, c-src e/ou FGFR3 pode ser demonstrada como segue:
[00085] No seguinte, "inibidores", "compostos ativos" ou similar se refere a compostos da Fórmula IA.
[00086] A linhagem celular progenitora mielóide de murino 32Dcl3 transfectada com o vetor de expressão de p210 Bcr-Abl pGDp210Bcr/Abl (32D-bcr/abl) foi obtida de J. Griffin (Dana Faber Cancer Institute, Bosten, MA, E.U.A.). As células expressam a proteína de fusão de Bcr-Abl com uma abl cinase constitutivamente ativa e proliferam independente de fator de crescimento. As células são ampliadas em RPMI 1640 (AMIMED), soro de bezerro fetal a 10%, glutamina a 2 mM (Gibco) („meio completo"), e uma matéria-prima de trabalho é preparada por congelamento de alíquotas de 2 x 106 células por frasco em meio de congelamento (95% de FCS, 5% de DMSO (SIGMA)). Após descongelamento, as células são utilizadas de forma máxima durante 10 a 12 passagens para as experiências. O anticorpo de domínio de SH3 anti-abl cat. #06-466 de Upstate Biotechnology é utilizado para o ELISA. Para detecção de fosforilação de bcr-abl, o anticorpo antifosfo- tirosina Ab PY20, rotulado com fosfatase alcalina (PY10(AP)) de ZYMED (cat. #03-7722) é utilizado. Como composto de comparação e referência, (N-{5-[4-(4-metil-piperazino-metil)-benzoilamido]-2-metilfe- nil}-4-(3-piridil)-2-pirimidina-amina, na forma do sal de sulfonato de metano (monomesilato) (STI571) (comercializado como Gleevec® ou Gli- vec®, Novartis), é utilizado. Uma solução de matéria-prima de 10 mM é preparada em DMSO e armazenada a -20°C. Para os ensaios celulares, a solução de matéria-prima é diluída em meio completo em duas etapas (1: 100 e 1: 10) para produzir uma concentração de partida de 10 pM seguido por preparação de diluições de três vezes em série em meio completo. Nenhum problema de solubilidade é encontrado utili- zando-se este procedimento. Os compostos de teste são tratados analogamente. Para o ensaio, 200.000 células de 32D-bcr/abl em 50 pl são semeadas por cavidade em placas de cultura de tecido de base redonda de 96 cavidades. 50 pl por cavidade de diluições de três vezes em série do composto teste são adicionados às células em triplicata. A concentração final do composto teste varia, por exemplo, de 5 pM até 0,01 pM. Células não tratadas são utilizadas como controle. O composto é incubado junto com as células durante 90 minutos a 37°C, CO2 a 5%, seguido por centrifugação das placas de cultura de tecido em 1300 rpm (centrífuga Beckman GPR) e remoção dos sobrenadantes por aspiração cuidadosa tomando cuidado para não remover qualquer das células peletizadas. As péletes de células são lisadas por adição de 150 pl de tampão de lise (Tris/HCI a 50 mM, pH 7,4, cloreto de só-dio a 150 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 1 mM, NP-40 a 1% (detergente não-iônico, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), orto- vanadato de sódio a 2 mM, sulfonilfluoreto de fenilmetila a 1 mM, apro- tinina a 50 pg/mL e leupeptina a 80 pg/mL) e ou utilizadas imediatamente para o ELISA ou armazenadas congeladas a -20°C até o uso. O anticorpo de domínio de SH3 anti-abl é revestido a 200 ng em 50 pl de PBS por cavidade em placas de ELISA pretas (placas pretas Packard HTRF-96; 6005207) durante a noite a 4°C. Depois de lavar 3x com 200 pl/cavidade de PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBST) e TopBlock a 0,5% (Juro, Cat. #TB 232010), sítios de ligação de proteína residual são bloqueados com 200 pl/cavidade de PBST, TopBlock a 3% durante 4 horas em temperatura ambiente, seguido por incubação com 50 pl de lisados de células não tratadas ou tratadas com composto teste (20 pg de proteína total por cavidade) durante 3 a 4 horas a 4°C. Depois de lavar 3x, 50 pl/cavidade de PY20(AP) (Zymed) diluídos a 0,5 pg/mL em tampão de bloqueio são adicionados e incubados durante noite (4°C). Para todas as etapas de incubação, as placas são cobertas com sela- dores de placa (Costar, cat. # 3095). Finalmente, as placas são lavadas mais três vezes com tampão de lavagem e uma vez com água de- sionizada antes da adição de 90 pl/cavidade do substrato de AP CPDStar RTU com Emerald II. As placas agora seladas com seladores de placa Packard Top Seal®-A (cat. #6005185) são incubadas durante 45 minutos em temperatura ambiente no escuro e a luminescência é quantificada calculando-se as contagens por segundo (CPS) com um Contador de Cintilação de Microplaca Packard Top Count (Top Count). Para a versão otimizada final do ELISA, 50 pl dos lisados das células cultivadas, tratadas e lisadas em placas de cultura de tecido de 96 cavidades, são transferidos diretamente destas placas para as placas de ELISA que são pré-revestidas com 50 ng/cavidade do domínio AB 06- 466 ant-abl-SH3 policlonal de coelho de Upstate. A concentração anti- fosfotirosina AB PY20 (AP) pode ser reduzida para 0,2 pg/mL. Lava-gem, bloqueio e incubação com o substrato luminescente são como acima. A quantificação é obtida como segue: A diferença entre a leitura do ELISA (CPS) obtida para com os lisados das células 32D-bcr/abl não tratadas e a leitura de dados para a base do ensaio (todos os componentes, mas sem o lisado celular) é calculada e considerada como 100% refletindo a proteína de bcr-abl constitutivamente fosforila- da presente nestas células. A atividade do composto na atividade de bcr-abl cinase é expressa como percentual de redução da fosforilação de bcr-abl. Os valores para o IC50 são determinados a partir das curvas de dose resposta por inter- ou extrapolação gráfica. Os compostos da invenção aqui de preferência apresentam valores de IC50 na faixa de 15 nM a 500 pM, mais preferivelmente 15 nM a 200 pM.
[00087] Para ensaios celulares, os compostos são dissolvidos em DMSO e diluídos com meio completo para produzir uma concentração de partida de 10 pM seguida por preparação de diluições em série de 3 vezes em meio completo. Células 32D ou Ba/F3 expressando mutantes ‘wt'-Bcr-Abl ou Bcr-Abl (por exemplo, T-315-1) foram semeadas em 200.000 células em 50 pL de meio completo, são semeadas por cavidade em placas de cultura de tecido de base arredondada de 96 cavidades. 50 pL por cavidade de diluições em série de 3 vezes do composto teste são adicionados às células em triplicata. Células não tratadas são utilizadas como controle. O composto é incubado junto com as células durante 90 minutos a 37°C, CO2 a 5%, seguido por centrifugação das placas de cultura de tecido em 1.300 rpm (centrífuga Beckmann GPR) e remoção dos sobrenadantes por aspiração cuidadosa tomando cuidado para não remover qualquer das células peletizadas. Os péletes de células são lisados por adição de 150 pL de tampão de lise (Tris/HCI a 50 mM, pH 7,4, cloreto de sódio a 150 mM, EDTA a 5 mM, EGTA a 1 mM, NP-40 a 1%, orto-vanadato de sódio a 2 mM, PMSF a 1 mM, aprotinina a 50 pg/mL e leupeptina a 80 pg/mL) e ou são utilizadas imediatamente para 0 ELISA ou armazenadas congela- das nas placas a -20°C até o uso.
[00088] O domínio Ab 06-466 de anti-abl-SH3 policlonal de coelho de Upstate foi revestido a 50 ng em 50 pl de PBS por cavidade em placas ELISA pretas (placas pretas Packard HTRF-96; 6005207) durante noite a 4°C. Depois de lavar 3 vezes com 200 pL/cavidade de PBS contendo Tween20 a 0,05% (PBST) e TopBlock a 0,5% (Juro), sítios de ligação de proteína residuais são bloqueados com 200 pL/cavidade de PBST, TopBlock a 3% durante 4 horas em temperatura ambiente seguido por incubação com 50 L de lisados de células não tratadas ou tratadas com composto (20 pg de proteína total por cavidade) durante 3 a 4 horas a 4°C. Depois de 3 lavagens, 50 pL/cavidade de Ab PY20(AP) antifosfotirosina rotulado com fosfatase alcalino (Zymed) diluídos em 0,2 pg/mL em tampão de bloqueio são adicionados e incubados durante noite (4°C). Durante todas as etapas de incubação, as placas são cobertas com seladores de placa (Costar). Finalmente, as placas são lavadas mais três vezes com tampão de lavagem e uma vez com água desionizada antes da adição de 90 pL/cavidade do substrato de AP CDPStar RTU com Emerald II. As placas agora seladas com seladores de placa Packard TopSeal™-A, são incubadas, durante 45 minutos em temperatura ambiente no escuro e a luminescência é quantificada calculando-se as contagens por segundo (CPS) com uma Contadora de Cintilação de Microplaca Packard Top Count (Top Count).
[00089] A diferença entre a leitura de dados de ELISA (CPS) obtida para os lisados das células de 32D-bcr/abl não tratadas e a leitura de dados para a base do ensaio (todos os componentes, mas sem o lisa- do celular) é calculada e considerada como 100% refletindo a proteína de bcr-abl constitutivamente fosforilada presente nestas células. A atividade do composto sobre a atividade de Bcr-Abl cinase é expressa como o percentual de redução da fosforilação de Bcr-Abl. Os valores para a IC50 (e IC90) são determinados a partir das curvas de dose resposta por extrapolação gráfica.
[00090] Os compostos da invenção aqui de preferência apresentam valores de ICso abaixo de 500 nM para inibição de autofosforilação e inibição de proliferação independente de IL-3 de mutantes de Bcr-Abl em células transfectadas com Ba/F3, em particular T315I.
[00091] As células 32D cl3 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC CRL11346) e as células Ba/F3 da German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig e DSMZ N° ACC 300)
[00092] Palacios e outro, Nature, 309: 1984, 126, PubMed ID 6201749.
[00093] Palacios e outro, Cell, 41:1985, 727, PubMed ID 3924409
[00094] As células Ba/F3.p210 e as células 32D cl3 hematopoiéticas de murino, (células 32D p210) foram obtidas por transfecção da linhagens celulares de Ba/F3 hematopoéticas de murino dependentes de IL-3 com um vetor pGD contendo cDNA de p210BCR-ABL (B2A2).
[00095] Daley e Baltimore, 1988; Sattler e outro, 1996; Okuda e ou-tro, 1996.
[00096] Daley, G.Q., Baltimore, D., (1988) Transformation of an in-terleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myeloid leukemia-specific p210 BCR-ABL protein. PNAS 85, 9312-9316
[00097] Sattler M, Salgia R, Okuda K, Uemura N, Durstin MA, Pisick E, e outro, (1996) The proto-oncogene product p120CBL and the adaptor proteins CRKL and c-CRK link c-ABL, p190BCR-ABL and p210BCR-ABL to the phosphatidylinositol-3' kinase pathway. Onco-gene 12, 839-46.
[00098] Okuda K, Golub TR, Griffin JD. (1996) p210BCR-ABL, p190BCR-ABL, and TEL/ABL activate similar signal transduction pathways in hematopoietic cell lines. Oncogene 13, 1147-52.
[00099] O vetor doador de baculovírus pFbacGOl GIBCO é utilizado para gerar um baculovírus recombinante que expressa os aminoácidos 544-976 da região de aminoácido dos domínios de cinase citoplásmica de c-Kit humano. As sequências de codificação para o domínio cito- plásmico de c-Kit são amplificadas por PCR de uma biblioteca de c- DNA de útero humano (Clontech). O fragmento de DNA amplificado e o vetor de pFbacGOl são tornados compatíveis para ligação por digestão com BamHI e EcoRI. A ligação destes fragmentos de DNA resulta no plasmideo c-Kit doador de baculovírus. A produção dos vírus, a expressão de proteínas em células Sf9 e a purificação das proteínas fundidas por GST são realizadas como segue:
[000100] Produção de vírus: O vetor de transferência pFbacGOl-c-Kit contendo o domínio de c-Kit cinase é transfectado na linhagem de célula DHIOBac (GIBCO) e as células transfecctadas são semeadas nas placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da sequência de fusão no genoma virai (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA virai (bacmid) é isolado das bactérias através de procedimentos de purificação de plasmideo padrão. Células Sf9 ou células de Sf21 Coleção de Cultura do Tipo Americano são em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA virai utilizando-se reagentes Cellfectin.
[000101] Determinação de expressão de proteína em pequena em células Sf9: Meios contendo vírus são coletados da cultura celular transfectada e utilizada para infecção para aumentar seu título. Meios contendo vírus obtidos após dois ciclos de infecção são utilizados para expressão de proteína em grande escala. Para a expressão de proteína em grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 são semeadas com 5 x 107 de de células/placas e infectadas com 1 mL de meios contendo vírus (aprox. 5 MOIs). Depois de 3 dias, as células são raspadas da placa e centrifugadas a 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de células, de 10 a 20 placas de 100 cm2, são ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, NP-40 a 1%, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM). As células são agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 20 minutos.
[000102] Purificação de proteína rotulada por GST: O lisado celular centrifugado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. A proteína rotulada por GST é eluída por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenada a -70°C.
[000103] Ensaio de cinase: Ensaios de tirosina proteína cinase com GST-c-Kit purificado são realizados em um volume final de 30 pL contendo 200 -1800 ng de proteína de enzima (dependendo da atividade específica), Tris-HCI a 20 mM, pH 7,6, MnCh a 3 mM, MgCh a 3 mM, DTT a 1 mM, NasVO4 a 10 pM, poly(Glu,Tyr) 4:1 a 5 pg/mL, DMSO a 1%, ATP a 1,0 pM e [y33P] ATP a 0,1 0.1 pCi. A atividade é analisada na presença ou ausência de inibidores, medindo-se a incorporação de 33P de [y33P] ATP no substrato de poli(Glu,Tyr) 4:1. O ensaio (30 pL) é realizado em placas de 96 cavidades a temperatura ambiente durante 20 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 20 pL de EDTA a 125 mM. Subsequentemente, 40 pL da mistura rea- cional são transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, e em seguida satuada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com a fonte de vácuo desconectada. Após 0 manchamento de todas as amostras 0 vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pL de H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 x em um agitador com H3PO4 a 1,0% e uma vez com etanol. As membranas são contadas após secagem à temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 pL/cavidade de Microscint ® (Packard). Valores de IC50 são calculados por análise de regressão linear do percentual de inibição de cada composto em duplicata, a quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 pM). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [y33P] ATP para a proteína de substrato por minuto por mg de proteína a 37°C. Valores de IC50 variando preferivelmente entre 50 nM a 500 pM pode ser encontrado com um composto da Fórmula IA de acordo com a invenção.
[000104] A eficácia de compostos da Fórmula I como inibidores ou cinases receptoras de Efrina B4 (EphB4) pode ser demonstrada como segue: Geração de vetor de expressão de fusão por GST Bac-to-Bac® (Invitrogen Life Technologies, Basel, Suíça): Regiões de codificação cito- plasmática inteiras da classe de EphB são amplificadas por PCR a partir de bibliotecas de cDNA derivadas de placenta ou cérebo humano, respectivamente. Baculovírus recombinantes são gerados os quais expressam a região 566-987 de aminoácido do receptor de EphB4 humano (SwissProt Database, Acessão N° P54760). A sequência de GST é clonada em vetor de pFastBaCi® (Invitrogen Life Technologies, Basel, Suíça) e PCR amplificado. Domínios de receptor de EphB4 codificando cDNAs, respectivamente são clonados na estrutura 3' principal para a sequência de GST neste vetor de FastBaCi modificado para gerar vetores doadores pBac-to-Bac®. Colônias isoladas originando-se da transformação são inoculadas para produzir durante a noite culturas para preparação de plasmídeo de pequena escala. A análise de enzi- ma de restrição de DNA de plasmideo revela que vários clones contêm inserções do tamanho esperado. Pelo sequenciamento automatizado as inserções e aproximadamente 50 bp das sequências de vetor de flanqueamento são confirmadas em ambos os filamentos. Produção de vírus: Vírus para cada uma das cinases são produzidos de acordo com o protocolo fornecido por GIBCO se não estabelecido de outra forma. Em resumo, vetores de transferência contendo os domínios de cinase são transfectados nas linhagens celulares de DHIOBac (GIBCO) e semeados em placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da sequência de fusão no genoma virai (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA virai (bacmicí) isolado das bactérias através de procedimentos de purificação de plasmideo padrões. Células Sf9 ou células Sf21 são em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA virai utilizando-se reagente Cellfectin de acordo com o protocolo. Purificação de cinases rotuladas por GST: O lisado celular centrifugado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2mM, DTT a 1 mM, NaCI a 200 mM. As proteínas rotuladas por GST- são em seguida eluídas por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenadas a -70°C. Ensaios de proteína cinase: As atividades de proteína cinases são analisadas na presença ou ausência de inibidores, medindo-se a in-corporação de 33P de [y33P]ATP em um polímero de ácido glutâmico e tirosina (poli(Glu,Tyr)) como um substrato. Os ensaios de cinase com GST-EphB purificado (30 ng) são realizados durante 15-30 minutos a temperatura ambiente em um volume final de 30 pL contendo Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MgCh a 10 mM, MnCh a 3 - 50 mM, NasVO4 a 0,01 mM, DMSO a 1%, DTT a 1 mM, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 3 pg/mL (Sigma; St. Louis, Mo., E.U.A.) e ATP a 2,0 - 3,0 pM (y-[33P]-ATP 0,1 pCi). O en-saio é terminado pela adição de 20 pL de EDTA a 125 mM. Subse-quentemente, 40 pl da mistura reacional são transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, em seguida saturada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com fonte de vácuo desconectada. Após o manchamento de todas as amostras, 0 vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pl de H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 x em um agitador com H3PO4 a 1,0%, uma vez com etanol. As membranas são contadas após secagem à temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard To- pCount, e adição de 10 pL/cavidade de Microscint® (Packard). Os valores de IC50 são calculados por análise de regressão linear do percentual de inibição de cada composto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01,0,1, 1 e 10 pM). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [y33P] ATP para a proteína de substrato por minuto por mg de proteína a 37 °C. Valores de IC50 preferivelmente variando de 50 nM a 500 pM pode ser encontrado com compostos da Fórmula IA de acordo com a invenção.
[000105] A inibição de atividade de EGF-R tirosina cinase pode ser demonstrada utilizando-se métodos conhecidos, por exemplo, utilizan- do-se 0 domínio intracelular recombinante do receptor de EGF [EGF-R ICD; veja, por exemplo, E. McGlynn e outro, Europ. J. Biochem. 207, 265-275 (1992)]. Comparados com 0 controle sem inibidor, os compostos de Fórmula I inibem a atividade de enzima em 50% (IC50), por exemplo, em uma concentração de 0,5 a 500 pM.
[000106] Bem como ou em vez de inibir atividade de EGF-R tirosina cinase, os compostos de Fórmula IA também inibem outros membros desta família de receptores, como ErbB-2. A atividade inibidora (ICso) está aproximadamente na faixa de 0,01 a 500 pM. A inibição de ErbB-2 tirosina cinase (HER-2) pode ser determinada, por exemplo, analoga-mente ao método utilizado para EGF-R proteína tirosina cinase [veja C. House e outro, Europ. J. Biochem. 140, 363-367 (1984)]. A ErbB-2 cinase pode ser isolada, e sua atividade determinada, por meio de protocolos conhecidos de per si, por exemplo, de acordo com T. Akiyama e outro, Science 232, 1644 (1986).
[000107] A inibição de autofosforilaçãode receptor induzida por VEGF pode ser confirmada com outros experimentos in vitroem célu-las tais como células de CHO transfectadas, que permanentemente expressam de receptor de VEGF-R2 humano (KDR), são semeadas em meio de cultura completo (com soro de bezerro fetal a 10% = FCS) em placas de cultura de células de 6 cavidades e incubadas a 37°C sob CO2 a 5% até que eles apresentem cerca de 80% de confluência. Os compostos a serem testados são em seguida diluídos em meio de cultura (sem FCS, com albumina de soro bovino a 0,1%) e adicionados às células. (Controles compreendem meio sem compostos teste). Depois de duas horas de incubação a 37°C, VEGF recombinante é adicionado; a concentração de VEGF final é 20 ng/mL. Depois de uma outra incubação de cinco minutos a 37°C, as células são lavadas duas vezes com PBS gelado (salina tamponada por fosfato) e imediatamente lisadas em 100 pl de tampão de lise por cavidade. Os lisados são em seguida centrifugados para remover os núcleos de células, e as concentrações de proteína dos sobrenadantes são determinadas utilizando-se um ensaio de proteína comercial (BIORAD). Os lisados podem então ou ser imediatamente utilizados ou, se necessário, armazenados a -20°C.
[000108] Um teste ELISA intercalado é realizado para medir a fosfori- lação de VEGF-R2: um anticorpo monoclonal para VEGF-R2 (por exemplo, Mab 1495.12.14; preparado por H. Towbin, Novartis ou anticorpo monoclonal comparável) é imobilizado em placas de ELISA pretas (OptiPlate® HTRF-96 de Packard). As placas são em seguida lavadas e os sítios de ligação de proteína livre restantes são saturados com TopBlock® a 3% (Juro, Cat. #TB232010) em solução salina tam- ponada por fosfato com Tween 20® (monolaurato de polioxietile- no(20)sorbitano, ICI/Uniquema) (PBST). O lisados de células (20 pg de proteína por cavidades) são em seguida incubados nestas placas durante a noite a 4°C juntos com um anticorpo antifosfotirosina acoplado com fosfatase alcalina (PY20:AP de Zymed). As placas são lavadas de novo e a ligação do anticorpo de antifosfotirosina ao receptor fosforila- do capturado é em seguida demonstrada utilizando-se um substrato AP luminescente (CDP-Star, pronto para o uso, com Emerald II; Applied Biosystems). A luminescência é medida em um Contador de Cintila-ção de Microplaca Packard Top Count. A diferença entre o sinal do controle positivo (estimulado com VEGF) e aquele do controle negativo (não estimulado com VEGF) corresponde à fosforilação de VEGF-R2 induzida por VEGF (= 100%). A atividade das substâncias testadas é calculada como percentual de inibição de fosforilação de VEGF-R2 induzida VEGF, onde a concentração de substância que induz metade da inibição máxima é definida como o ICso (dose inibidora para 50% de inibição). Valores de ICso preferivelmente variando de 20 nM a 500 pM podem ser encontrados com compostos da Fórmula IA de acordo com a invenção. Teste para atividade contra proteína cinases recombinantes Ret (Ret-Men2A), Tie-2 (Tek) e FGFR3-K650E: Clonagem e expressão de proteína cinases recombinantes-. (Ret); O Vetor doador de Baculovírus pFB-GSTX3 foi utilizado para gerar um Baculovírus recombinante que expressa a região 658-1072 de aminoácidos do domínio de cinase intra-citoplásmica de Ret-Men2A humano que corresponde ao domínio de cinase do tipo selvagem de Ret. A sequência de codificação para o domínio citoplásmico de Ret foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo RET-Men2A de pBABEpuro que foi recebido do Dr. James Fagin, Faculdade de Medicina, Universidade de Cincinnati (colaboração de Novartis). Os fragmentos de DNA amplificados e o vetor pFB-GSTX3 tornaram-se compatíveis para ligação por digestão com Sail e Kpnl. A ligação destes fragmentos de DNA resultou no plasmídeo doador de baculovírus pFB-GX3-Ret(-Men2A). (Tie-2/Tek): O vetor doador de baculovírus pFbacGOl foi utilizado para gerar um baculovírus recombinante que expressou os 773-1124 aminoácidos da região de aminoácido do domínio de cinase citoplásmica Tek humana, N-terminalmente fundido em GST (Fornecido por Dr. Marmé, Institute of Molecular Medicine, Freiburg, Germany based on a Reseach Collaboration). Tek foi reclonada no vetor de transferência pFbacGOl por excisão de EcoRI e ligação no pFbacGOl digerido por EcoRI (FBG-Tie2/Tek). (FGFR-3-K650E): O vetor doador de baculovírus pFastBacGST2 foi utilizado para gerar um baculovírus recombinante que expressou os aminoácidos 411-806 da região de aminoácidos (aa) do domínio citoplásmico de FGFR-3 humano, N-terminalmente fundido a GST (Fornecido pelo Dr. Jim Griffin, Dana Farber Cancer Institute, Boston, E.U.A. based on a Research Collaboration). O DNA codificando os aminoácidos 411-806 foi amplificado por PCR, inserido no vetor de pFastBac- GT2 para produzir pFB-GT2-FGFR3-wt. Este plasmídeo foi por sua vez utilizado para gerar um vetor codificando FGFR3(411-806) com uma mutação em K650 utilizando-se o Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio Stratagene XL para produzir pFB-GT2-FGFR3-K650E. A produção dos vírus, a expressão de proteínas em células Sf9 e a purificação das proteínas fundidas por GST foram realizadas tal como descrito nas seções seguintes. Produção de vírus: Vetores de transferência contendo os domínios de cinase foram transfectados na linhagens celulares DHIOBac (GIBCO) e semeados em placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da sequência de fusão no genoma virai (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas foram selecionadas e o DNA virai (bacmid) isolado das bactérias através de procedimentos padrões de purificação de plasmídeo. Células Sf9 ou células de Sf21 foram em seguida transfectadas em frascos de 25 cm2 com o DNA virai utilizando- se reagente Cellfectin. Determinação de expressão de proteína em pequena escala em células Sf9: Meios contendo vírus foram coletados da cultura de células transfectadas e utilizados para infecção para aumentar seu título. Meios contendo vírus obtidos depois de dois círculos de infecção foram utilizados para expressão de proteína em grande escala. Para expressão de proteína de grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 foram semeados com 5 x 107 de células/placa e infectadas com 1 mL de meios contendo vírus (aprox. 5 Mols). Depois de 3 dias, as células foram raspadas da placa e centrifugadas em 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de célula de 10 a 20 placas de 100 cm2 foram ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCI a 25mM, pH 7,5, EDTA a 2mM, NP-40 a 1%, DTT a 1mM, PMSF a 1mM). As células foram agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 20 minutos. Purificação de proteínas rotuladas por GST: O lisado celular centri-fugado foi carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCl a 200 mM. As proteínas rotuladas por GST foram em seguida eluídas por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCI a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenadas a -70°C. Medida da atividade de enzima: Ensaios de tirosina proteína cinase com qualquer um GST-Ret, GST-Tek ou GST-FGFR-3-K650E purificado foram realizados em um volume final de 30 pL com concentrações finais dos componentes seguintes: Ret incluiu 15 ng de GST-Ret, Tris- HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCh a 1 mM, MgCh a 10 mM, DTT a 1 mM, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 3 pg/mL, DMSO a 1 % e ATP a 2,0 pM (Y-[33P]-ATP 0,1 pCi). Tek incluiu 150 ng de GST-Tek, Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCh a 3 mM, MgCh a 3 mM, DTT a 1 mM, NasV04 a 0,01 mM, PEG 20.000 a 250 pg/mL, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 10 pg/mL, DMSO a 1% e ATP a 4,0 pM (y-[33P]-ATP 0,1 pCi). FGFR-3-K650E incluiu 10 ng de GST- FGFR-3-K650E, Tris-HCI a 20 mM, pH 7,5, MnCh a 3 mM, MgCh a 3 mM, DTT a 1 mM, PEG 20.000 a 0,01 mM, poli(Glu,Tyr) 4:1 a 10 pg/mL, DMSO a 1% e ATP a 4,0 pM (y-[33P]-ATP 0,1 pCi). A atividade foi analisada na presença ou ausência de inibidores, medindo-se a incorporação de 33P de [y33P] ATP em poli(Glu,Tyr) 4:1. O ensaio foi realizado em placas de 96 cavidades à temperatura ambiente durante 30 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 50 pL de EDTA a 125 mM. Subsequentemente, 60 pL da mistura rea- cional foram transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, em seguida saturada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montado em tubulação a vácuo com a fonte de vácuo desconectada. Após 0 manchamento de todas as amostras 0 vácuo foi conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pL H3PO4 a 0,5%. As membranas foram removidas e lavadas 4 x em um agitador com H3PO4 a 1,0%, uma vez com etanol. As membranas foram contadas depois de secagem à temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 pL/cavidade de Microscint® (Packard). Os valores de IC50 foram calculados através de análise de regressão linear do porcentual de inibição de cada composto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 pM). Uma unidade de atividade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferida de [y33P] ATP para a proteína de substrato por minuto por mg de proteína a 37°C. Valores de ICso preferivelmente variando de 50 nM a 500 pM podem ser encontrados com compostos da Fórmula IA de acordo com a invenção.
[000109] Ensaio de atividade de cinase com FGFR3 purificado (Ups-tate) é realizado em um volume final de 10 pL contendo 0,25 pg/mL de enzima em tampão de cinase (Tris-HCI a 30 mM, pH 7,5, MgCh a 15 mM, MnCh a 4,5 mM, NasVO4 a 15 pM e BSA a 50 pg/mL), e substratos (biotina-poli-EY(Glu, Tyr) a 5 pg/mL (CIS-US, Inc.) e ATP a 3 pM). Duas soluções são preparadas: a primeira solução de 5 pl contém a enzima de FGFR3 em tampão de cinase foi primeiro distribuída em ProxiPlate® formato 384 (Perkin-Elmer) seguida por adição de 50 nl_ de compostos dissolvidos em DMSO, em seguida 5 pl da segunda solução contendo o substrato (poli-EY) e ATP em tampão de cinase foram adicionados a cada cavidade. As reações são incubadas a temperatura ambiente durante uma hora, interrompidas por adição de 10 pL de mistura de detecção de HTRF, que contém Tris-HCI a 30 mM, pH 7,5, M KF a 0,5, ETDA a 50 mM, BSA a 0,2 mg/mL, estreptavidina-XL665 a 15 pg/mL (CIS-US, Inc.) e anticorpo antifosfotirosina conjugado com criptato a 150 ng/mL (CIS-US, Inc.). Depois de uma hora de incubação à temperatura ambiente para permitir interação de estreptavidina- biotina, sinais florescentes resolvidos com o tempo são lidos em Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Valores de ICso são calculados por análise de regressão linear da inibição em porcentagem de cada composto em 12 concentrações (diluição de 1:3 de 50 pM a 0,28 nM). Neste ensaio, os compostos da invenção, por exemplo, podem preferivelmente ter uma ICso na faixa de 2 nM a 400 pM, mais preferivelmente na faixa de 5 nM a 100 piM.
[000110] Os compostos da invenção (= da Fórmula IA) são testados quanto a sua capacidade de inibir proliferação de células Ba/F3-TEL- FGFR3 transformadas, que depende da atividade de cinase celular de FGFR3. Ba/F3-TEL-FGFR3 são cultivadas até 800.000 célula/mL em suspensão, com RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% como o meio de cultura. As células são distribuídas em placas de formato de 384 cavidades a 5000 célula/cavidade em 50 pL de meio de cultura. Os compostos da invenção são dissolvidos e diluídos em dime- tilsufóxido (DMSO). Diluições em série 1:3 de doze pontos são preparadas em DMSO para criar gradiente de concentrações variando tipicamente de 10 mM a 0,05 pM. As células são adicionadas com 50 nl_ de compostos diluídos e incubados durante 48 horas em incubadora de cultura de células. AlamarBIue® (TREK Diagnostic Systems) que pode ser utilizado para monitorar a redução de ambiente criada pela proliferação das células, é adicionado às células a concentração final de 10%. Depois de quatro horas adicionais de incubação em uma incubadora de cultura celular a 37°C, sinais de fluorescência de AlamarBIue® reduzido (Excitação a 530 nm, Emissão a 580 nm) são quantificados em Analyst GT (Molecular Devices Corp.). Valores de ICso são calculados por análise de regressão linear da inibição em porcentagem de cada composto em 12 concentrações. Valores de ICso preferivelmente variando de 2 nM a 400 gM podem ser encontrados com um composto da Fórmula IA de acordo com a invenção.
[000111] Os compostos da invenção são avaliados quanto a sua ca- pacidade de inibir membros individuais de um painel de cinases (uma lista parcial, não limitante de cinases inclui: Abl, BCR-Abl, BMX, FGFR3, Lek, JNK1, JNK2, CSK, RAF, MKK6 e P38). Os compostos são testados em duplicatas a uma concentração final de 10 pM se-guindo este protocolo genérico. Nota-se que a composição de tampão de cinase e os substratos variam para as diferentes cinases incluídas no painel "Upstate KinaseProfiler®". Os compostos são testados em duplicatas a uma concentração final de 10 pM seguindo este protocolo genérico. Note que a composição de tampão de cinase e os substratos variam para as diferentes cinases incluídas no painel "Upstate KinaseProfiler®". Tampão de cinase (2,5 pL, 10 x - contendo MnCh quando requerido), cinase ativa (0,001 - 0,01 Unidade; 2,5 pL), peptídeo de Poli(Glu4-Tyr) ou específico (5 - 500 pM ou 0,01 mg/mL) em tampão de cinase e tampão de cinase (50 pM; 5 pl_) são misturados em um eppendorf em gelo. Uma mistura de Mg/ATP (10 pL; MgCh a 67,5 (ou 33,75) mM, ATP a 450 (ou 225) pM e [y-32P]-ATP a 1 pCi/pl (3000 Ci/mmols)) é adicionada e a reação é incubada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 10 minutos. A mistura reacional é manchada (20 pL) em um P81 de 2 cm x 2 cm (fosfocelulose, para substratos de peptídeo positivamente carregados) ou quadrado de papel Whatman N° 1 (para substrato de peptídeo de Poli (Glu4-Tyr)). Os quadrados de ensaio são lavados 4 vezes, durante 5 minutos cada, com ácido fosfórico a 0,75% e lavados uma vez com acetona durante 5 minutos. Os quadrados de ensaio são transferidos para um frasco de cintilação, 5 ml de coquetel de cintilação são adicionados e a incorporação 32P (cpm) ao substrato de peptídeo é quantificada com um contador de cintilação Beckman. A inibição em porcentagem é calculada para cada reação.
[000112] Os compostos da Fórmula IA podem também inibir outras tirosina proteína cinases tal como especialmente a cinase c-Src que desempenha um papel em regulação de crescimento e transformação em animais, especialmente células de mamífero, incluindo células humanas. Um ensaio apropriado é descrito em Andre-jauskas-Buch- dunger e outro, Cancer Res. 52, 5353-8 (1992). Utilizando-se este sistema de teste, compostos da Fórmula IA podem mostrar valores de ICso para inibição de c-Src na faixa de por exemplo, 0,05 a 500 pM.
[000113] Além disso, compostos da Fórmula IA podem também ser utilizados para inibir b-raf (V599E). A atividade de B-Raf-V599E é avaliada na presença ou ausência de inibidores que medem a incorporação de 33P de [y33P]ATP em (His)-I.B. O composto teste é dissolvido em DMSO (10 mM) e armazenado a - 20°C. Diluições seriais são feitas em DMSO frescamente e também diluídas com água pura para obter soluções de teste concentradas 3 vezes em 3% de DMSO. O volume final (30 pl) do ensaio contém 10 pl de solução teste (DMSO a 1%), 10 pl de mistura de ensaio (20 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 3 mM de MnCh, 3 mM de MgCh, 1 nM de DTT, 3 pg/mL (His)-lkB. 1 % de DMSO e 3,5 pM de ATP [y33P]-ATP 0,1 pCi) e 10 pl de diluição de enzima (600 ng of GST-B-Raf-V599E). As etapas de pipetagem são programadas para ser realizadas nos robôs MultiPROBE lix, MultiPROBE IILx ou HamiltonSTAR no formato de 96 cavidades. O ensaio é realizado como descrito na literatura (veja C. Garcia-Echeverria e outro, Cancer Cel.. 5, 231-9 (2004)) terminado pela adição de 20 pl de 125 mM de EDTA. A captura dos peptídeos fosforilados pelo método de ligação de filtro é realizada como seguindo: 40 pl da mistura reacional são transferidos em membranas de Immobilon-PVDF previamente impregnadas durante 5 minutos com metanol, enxaguado com água, em seguida empregnado durante 5 minutos com 0,5% de H3PO4 e montado em tubulação a vácuo com fonte a vácuo desconectada. Depois de manchar todas as amostras, vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pl de 0,5% de H3PO4. Membranas livres são removi- das e lavadas 4 x em um agitador com 1,0% de H3PO4, uma vez com etanol. Membranas são contadas depois de secar em temperatura ambiente, montando em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount 96 e adição de 10 pl/cavidade de Microscint®. As placas são eventualmente seladas e contadas em uma contadora de cintilação de microplaca (TopCount NXT, TopCount NXT HTS). No caso do método de placa flash,a reação de cinase é primeiro realizada em placas de plástico com base em poliestireno e em seguida interrompida depois de 60 minutos pela adição de 20 pl de 125 mM de EDTA. Para capturar (60 minutos, RT), 0 substrato biotinilado é transferido em placas flashrevestidas por Níquel. As placas de ensaio são lavadas três vezes com PBS e secadas em temperatura ambiente. Posteriormente, as placas são seladas e contadas em uma contadora de cintilação de microplaca (TopCount NXT, TopCount NXT HTS). Valores de IC50 são calculados por análise de regressão linear de inibição de porcentagem pelo com-posto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 pM) ou como IC50 de único ponto 8 partindo a 10 pM seguido por 1:3 diluições. Para inibição de b-raf, compostos da Fórmula que IA preferivelmente podem mostrar valores de IC50 na faixa de 0,05 a 500 pM.
[000114] Para procurar compostos marcadores por FLT3, dois tipos diferentes de ensaios podem ser utilizados:
[000115] Atividade de Flt3 cinase é determinada como segue: O ve-tor doador de baculovírus pFbacGOl (GIBCO) é utilizado para gerar um baculovírus recombinante expressando a região de aminoácido a de aminoácidos 563-993 do domínio de cinase citoplásmico de Flt3 humano. A sequência de codificação para 0 domínio citoplásmico de Flt3 é ampliada por PCR de bibliotecas de c-DNA humanas (Clontech). Os fragmentos de DNA ampliados e 0 vetor de pFbacGOl são feitos compatíveis para ligação por digestão com BamHI e Hindlll. Ligação destes fragmentos de DNA resulta no plasmídeo doador de baculovírus Flt-3(1,1). A produção dos vírus, a expressão de proteína em células Sf9 e a purificação da proteína fundida por GST é realizada como segue: Produção de vírus: Vetor de transferência (pFbacGOl-Flt-3) contendo o domínio de Flt3-cinase é transfectado na linhagem de célula DHIOBac (GIBCO) e as células transfecctadas são semeadas nas placas de ágar seletivas. Colônias sem inserção da sequência de fusão no genoma virai (transportado pelas bactérias) são azuis. Colônias brancas isoladas são selecionadas e o DNA virai (bacmid) é isolado das bactérias através de procedimentos de purificação de plasmídeo padrões. Células Sf9 e Sf21 (American Type Culture Collection) são em seguida transfectadas em frascos com o DNA virai utilizando-se reagente de Cellfectin. Determinação de expressão de proteína em escala pequena em células Sf9: Meios contendo vírus são coletados a partir da cultura de célula transfectadas e utilizados para infecção para aumentar seu título. Meios contendo vírus obtidos após dois ciclos de infecção são utilizados para expressão de proteína em grande escala. Para a expressão de proteína em grande escala, placas de cultura de tecido redondas de 100 cm2 são semeadas com 5 x 107 de células/placas e infectadas com 1 mL de meios contendo vírus (aproximadamente 5 MOIs). Depois de 3 dias, as células são raspadas da placa e centrifugadas a 500 rpm durante 5 minutos. Péletes de células, de 10 a 20 placas com cada qual 100 cm2, são ressuspensas em 50 mL de tampão de lise gelado (Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, NP-40 a 1%, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM). As células são agitadas em gelo durante 15 minutos e em seguida centrifugadas a 5000 rpm durante 20 minutos. Purificação de proteína rotulada por GST: O lisado celular centrifu- gado é carregado em uma coluna de glutationa-sefarose de 2 mL (Pharmacia) e lavado três vezes com 10 mL de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, EDTA a 2 mM, DTT a 1 mM, NaCl a 200 mM. A proteína rotulada por GST é eluída por 10 aplicações (1 mL cada) de Tris-HCI a 25 mM, pH 7,5, glutationa reduzida a 10 mM, NaCl a 100 mM, DTT a 1 mM, Glicerol a 10% e armazenada a -70°C. Medida de atividade de Enzima: Ensaios de Tirosina proteína cinase com GST-Flt2 purificado são realizados em um volume final de 30 pL contendo 200 -1800 ng de proteína de enzima (dependendo da ativi-dade específica), Tris-HCI a 20 mM, pH 7,6, MnCh a 3 mM, MgCh a 3 mM, DTT a 1 mM, NasVO4 a 10 pM, poly(Glu,Tyr) DMSO a 1%, ATP a 6,0 pM e [y33P]ATP a 0,1 piCi. A atividade é analisada na presença ou ausência de inibidores, medindo-se a incorporação de 33P de [y33P] ATP no substrato de poli(Glu,Tyr). O ensaio (30 pL por cavidade) é realizado em placas de 96 cavidades em temperatura ambiente durante 20 minutos sob condições descritas abaixo e terminado pela adição de 20 pL de EDTA a 125 mM. Subsequentemente, 40 pL da mistura reacional são transferidos em membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, E.U.A.) anteriormente saturada durante 5 minutos com metanol, enxaguada com água, e em seguida satuada durante 5 minutos com H3PO4 a 0,5% e montada em tubulação a vácuo com a fonte de vácuo desconectada. Após 0 manchamento de todas as amostras 0 vácuo é conectado e cada cavidade enxaguada com 200 pL H3PO4 a 0,5%. As membranas são removidas e lavadas 4 x em um agitador com H3PO4 a 1,0% e uma vez com etanol. As membranas são em seguida contadas individualmente depois da secagem em temperatura ambiente, montagem em estrutura de 96 cavidades Packard TopCount, e adição de 10 pL/cavidade de Microscint® (Packard). Valores de IC50 são calculados por análise de regressão linear do percentual de inibição de cada composto em duplicata, em quatro concentrações (normalmente 0,01, 0,1, 1 e 10 pM). Uma unidade de proteína cinase é definida como 1 nmol de 33P ATP transferido de [y33P] ATP ao polipeptídeo de substrato por minuto por mg de proteína a 37°C. Os compostos da Fórmula IA aqui preferivelmente pode mostrar valores de ICso na faixa entre 0,05 e 500 pM.
[000116] Alternativamente ou além disso, uma ensaio com base em célula pode ser utilizado para identificar inibidores de tirosina cinase receptoras de FLT3 mutante. A técnica geral envolve comparar os efeitos de possíveis inibidores em linhagem celular que dependem do FLT3 mutante para proliferação, versus linhagens celulares que não dependem de FLT3 mutante para proliferação. Linhagens celulares expressando duas formas diferentes de FLT3 mutado, ativado são utilizadas: - Células de Ba/F3-FLT3-ITD expressando um mutante de FLT3 com uma "Duplicação de Tandem Interna" (ITD) dentro do domínio de justamembrana do receptor. - Células de Ba/F3-FLT3-D835Y expressando um receptor de FLT3 contendo uma mutação que converte Asparagina na posição 835 para Tirosina.
[000117] Preferivelmente, compostos da Fórmula IA podem ser mos-trados para inibir a proliferação de ambas as células Ba/F3-FLT3-ITD e Ba/F3-D835Y em uma ICso de 50 nM a 500 pM enquanto por outro lado elas normalmente não inibem crescimento de células de Ba/F3 não transformadas em concentrações de até 500nM, e os efeitos inibitórios de crescimento de um composto da Fórmula IA em células de Ba/F3- FLT3-ITD pode ser revertida pela adição de concentrações altas de IL- 3 para fornecer de um sinal de viabilidade alternativo. Às concentrações requeridas para inibir a proliferação de linhagens celulares dependentes de FLT3, compostos da Fórmula IA podem ser mostrados para não ser citotóxicos contra várias leucemias humanas e linhagens celulares de linfoma que não têm receptores de FLT3 mutante (cinases hiperativadas), sugerindo que o fármaco tem um grau alto inesperado de especificidade como um agente citóxico. Especialmente, estes resultados indicam que compostos da Fórmula IA podem ser inibidores potentes de atividade de tirosina cinase receptora de FLT3 mutante e são um candidato promissor para uso no tratamento em pacientes com receptores de FLT3 mutante. Em particular, compostos da Fórmula IA podem ser mostrados inibir a atividade de atividade de tirosina cinase receptora de FLT3 em concentrações na faixa de 0,05 a 500 pM.
[000118] Com base nos estudos inibidores aqui anteriormente descritos, um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar deste) de acordo com a invenção apresenta eficácia terapêutica especialmente contra distúrbios dependente de (= especialmente respondendo a modulação, mais especificamente inibição de) proteína cinase, especialmente doenças proliferativas, tais como as doenças mencionadas acima sob "Antecedentes da invenção".
[000119] Há também experiências para demonstrar a atividade anti- tumor de compostos da Fórmula I in vivo. Por exemplo, para testar se um composto da Fórmula IA inibe o crescimento de carcinoma de bexiga, o seguinte sistema teste pode ser aplicado:
[000120] As linhagens celulares de carcinoma de célula transicional de bexiga urinária humanas RT-112 são utilizadas como um modelo modelo in vivo para o teste de atividade in vivo de compostos descritos na invenção. Esta linhagem celular é derivada de um paciente fêmea (idade desconhecida) com carcinoma de bexiga urinário primário não tratado em 1973. Esta linhagem celular expressa níveis altos de FGFRS.
[000121] 5 x106 de células com matrigel são inoculadas subcutane- amente no flanco de camundongos nus fêmeas (n=8) e tumores são permitidos desenvolver. Tamanhos de tumor são manualmente medi- dos a cada dois a três dias utilizando um calibrador. Peso animal é monitorado como uma medida de saúde animal.
[000122] Tratamento com inibidor começa quando volumes de tumo-res alcançarem ~100 mm3 (~7 dias). Camundongos são aleatorizados de acordo com volume de tumor e tratados com veículo (NMP/PE- G300) ou o composto teste (n=8) durante 14 dias. Via de administração é gavagem oral e horário é 1x dia/7x semanas. Atividade antitumor é calculada como % de T/C ((volume de tumor de mudança média de animais tratados/mudança média de volumes de tumor de animais de controle) x 100).
[000123] Tamanhos de tumor de xenoenxerto são manualmente me-didos com calibrador e volume de tumor são calculados utilizando a Fórmula (W x H x L) x π/6, onde largura (W), altura (H) e comprimento (L) são os três diâmetros maiores.
[000124] Avaliações estatísticas são feitas utilizando SigmaStat 2,03. Se mais do que dois grupos de animais são incluídos em uma experiência, a avaliação estatística é feita nos volumes de tumor absolutos ou pesos corporais no dia de avaliação, utilizando teste de ANOVA de um modo. Teste pós Dunnett's ad hoc é utilizado quando um grupo de controle é comparado com todos os outros grupos de tratamento. Tukey e SNK (Student-Newman-Keuls) ad hoc pós teste são utilizados quando todos os grupos são avaliados contra um ao outro.
[000125] Amostras de tumor são dissecadas e imediatamente congeladas em N2 líquido. Tumores são pulverizados enquanto mantendo congelado. Uma alíquota do pó congelado é lisada em tampão de extração de triton a 1% contendo inibidores de protease e fosfatase. Lisados são clareados por centrifugação e concentração de proteína determinada. Lisado de proteína é utilizado para determinar o grau de inibição do receptor de FGFR e série de reação nos tumores.
[000126] Compostos da Fórmula IA descritos nesta invenção podem inibir crescimento de tumor e induzir regressão em doses iguais e acima de 10 mg/kg.
[000127] Como exemplos de cinases inibidas pelos compostos da Fórmula IA como descritos podem ser mencionados c-Abl e Bcr-Abl, em particular, inibição de Bcr-Abl pode ser mencionada. Outra cinase inibida é a tirosina cinase receptora VEGF-R, em particular o KDR receptor de VEGF (VEGF-R2). Os compostos da presente invenção também inibem formas mutantes das cinases de Bcr-Abl. Os compostos descritos são apropriados para a inibição de uma ou mais destas e/ou outras proteína tirosina cinases e/ou a tirosina cinase não receptora Raf, e/ou para a inibição de mutantes destas enzimas. Devido a estas atividades, os compostos podem ser utilizados para o tratamento de doenças relacionadas a, especialmente, atividade anormal ou excessiva de tais tipos de cinases, especialmente aquelas mencionadas.
[000128] A capacidade para modular tal atividade de proteína cinase preferivelmente se refere à inibição de tal atividade de proteína cinase.
[000129] Por exemplo, como inibidores de atividade de tirosina ci-nase receptora de VEGF, os compostos da invenção podem primariamente inibir o crescimento de vasos sanguíneos e são desse modo, por exemplo, eficazes contra várias doenças associadas com angiogê- nese desregulada, especialmente doenças causadas por neovasculari- zação ocular, especialmente retinopatias, tais como retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada com a idade, psoríase, hemangioblastoma, tais como hemangioma, distúrbios proliferativos de células mesangiais, tais como doenças renais crônicas ou agudas, por exemplo, nefropatia diabética, nefroesclerose maligna, síndromes de microangiopatia trombótica ou rejeição ao transplante, ou especialmente doença renal inflamatória, tal como glomerulonefrite, especialmente glomerulonefrite mesangioproliferativa, síndrome hemolítico-urêmica, nefropatia diabética, nefroesclerose hipertensiva, ateroma, reestenose arterial, doenças auto-imunes, diabetes, endometriose, asma crônica, e especialmente doenças neoplásicas (tumores sólidos, mas também leucemias e outro "tumores líquidos", especialmente aqueles que expressam c-kit, KDR, Flt-1 ou Flt-3), tais como especialmente câncer de mama, câncer do cólon, câncer do pulmão (especialmente câncer de pulmão de célula pequena), câncer da próstata ou sarcoma de Kaposi. Um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar deste) (ou um N- óxido deste) inibe o crescimento de tumores e é especialmente adequado para prevenir a dispersão metastática de tumores e o crescimento de micrometástases.
[000130] Uma classe de cinases alvos dos compostos da presente invenção são mutantes de Bcr-Abl. Os mutantes Glu255—>Lisina, Glu255^Valina ou o Thr315—rtsoleucina podem ser especialmente mencionados, mais especialmente o mutante Thr315—>lsoleucina.
[000131] Outros mutantes de Bcr-Abl incluem Met244—>Val, Phe317->Leu, Leu248-»Val, Met343^Thr, Gly250^Ala, Met351^Thr, Gly250^Glu, Glu355^Gly, Gln252^His, Phe358-^AIa, Gln252^Arg, Phe359-»Val, TyR253^His, Val379^lle, TyR253^Phe, Phe382->Leu, Glu255->Lys, Leu387^Met, Glu255->Val, His396^Pro, Phe311—>lle, His396^Arg, Phe311^Leu, Ser417-^Tyr, Thr315^lle, Glu459->Lys e Phe486—>Ser.
[000132] Os compostos da Fórmula IA são em particular úteis para tratar AML por meio de inibição do domínio de tirosina cinase de Flt-3. Uma outra modalidade da presente invenção é um método de tratar leucemia mielóide aguda (AML) que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto reivindicado.
[000133] Os compostos da Fórmula IA (ou seus sais especialmente farmaceuticamente aceitáveis), devido à sua capacidade de inibir FGFR, são especialmente úteis no tratamento de (especialmente anormal) crescimento, reparo de tecido, remodelagem; migração celular, diferenciação celular, desenvolvimento esquelético e/ou membro, cicatrização de ferida, transdução de sinal, hematopoiese e/ou angio- gênese, bem como tumorigênese, ou tumores ou cânceres, incluindo metástase e formação de metástase, especialmente no tratamento de tumores humanos, tais cornos cânceres câncer de pulmão de célula não pequena, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), mama, gástrico, por exemplo, cânceres de adenocarcinomas pancreáticos, ovário, de cólon e/ou da próstata bem como em e astrocitomas, gliomas, câncer de bexiga, cânceres epiteliais, por exemplo, da bexiga ou cérvice, mieloma múltiplo, carcinoma escamoso (cabeça e pescoço), tal como carcinoma de célula escamosa oral, retinoblastoma, sarcoma, tal como carcinoma sinovial, e/ou tumores da pele; síndrome mieloproliferativa 8p11 = Síndrome Mieloproliferativa Eosinofílica (EMS); anormalidades esqueléticas, nanismo humano, incluindo acondroplasia, síndromes de craniosineostose e síndrome de nanismo, displasias esqueléticas incluindo hipocondroplasia, acondroplasia severa com desenvolvimento atrasado, acantose nigricans,displasia tanatofórica, fenótipos de cra- niossinostose, por exemplo, craniossinostose coronal de Muenke ou síndrome de Crouzon com acantose nigricans,síndrome de Pfeiffer, maturação de condrócito reprimida, inibição de crescimento ósseo; doenças inflamatórias ou auto-imunes, tal como artrite reumatóide (RA), artrite de colágeno II, esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjogren, doença da tiróide, sarcoidose, uveíte auto-imune, doença inflamatória intestinal (colite de Crohn e ulcerativa), doença celíaca e miastenia grave; Raquitismos Hipofosfatêmicos Dominantes Autossômicos (ADHR), Raquitismos hipofosfatêmicos ligados ao cromossoma X (XLH), Osteomalacia induzida por tumor (TIO), displasia fibrosa do osso (FH); Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (COPD); obesidade, diabetes e/ou doen- ças relacionadas a isso, tal como síndrome metabólica, doenças cardiovasculares, hipertensão, níveis de triglicerídeo e colesterol anormais, distúrbios dermatológicos (por exemplo, infecções, veias varicosas, acantose nigricans,eczema, intolerância ao exercício, diabetes tipo 2, resistência a insulina, hipercolesterolemia, colelitiase, lesão ortopédica, doença tromboembólica, restrição coronária ou vascular (por exemplo, aterosclerose), sonolência durante o dia, apnéia do sono, doença renal de estágio terminal, doença da vesícula biliar, gota, distúrbios térmicos, resposta imune comprometida, função respiratória comprometida, infecções seguindo ferimentos, infertilidade, doença hepática, dor do dorso inferior, complicações obstétricas e ginecológicas, pancreatite, acidente vascular cerebral, complicações cirúrgicas, incotinência por estresse urinária e/ou distúrbios gastrointestinais.
[000134] Um método de promover neocondrogênese localizada em uma cartilagem em um mamífero compreendendo administrar local-mente à cartilagem certos inibidores de cinase é descrito no W02006/038112. Surpreendentemente, foi constatado que os compostos da Fórmula IA como definido aqui podem ser utilizados da mesma maneira. Consequentemente, a presente invenção também se refere a um método de promover neocondrogênese localizada em uma cartilagem em um mamífero compreendendo administrar localmente à cartilagem derivados de uréia da Fórmula (IA) como definido acima ou sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, solvatos, ésteres, derivados protegidos por N-óxidos, isômeros individuais e mistura de isômeros destes ou pró-fármacos destes, em uma quantidade que é eficaz para promover neocondrogênese localizada. O composto da Fórmula IA é também útil no tratamento de osteoartrite no contexto de neocondrogênese.
[000135] O termo "tratamento" inclui também profilaxia incluindo tra-tamento preventivo, por exemplo, em pacientes onde mutações ou mudanças foram constatadas indicar que elas são ou podem estar propensas ao desenvolvimento de uma doença, ou preferivelmente tratamento terapêutico (incluindo porém não limitado a paliativo, curativo, alívio de sintoma, redução de sintoma, supressão de doença ou sintoma, retardamento de progressão, regulação de cinase e/ou inibição de cinase) das referidas doenças, especialmente de qualquer uma ou mais das doençãs mencionadas acima.
[000136] Tratamento de um animal é preferido. Um animal é preferi-velmente um animal de sangue quente, mais preferivelmente um mamífero. Um ser humano (que geralmente também cai sob o termo geral "animal") é especialmente um paciente ou uma pessoa que (por exemplo, devido a algumas mutações ou outras características) é propensa a um risco para uma doença como definido acima ou abaixo.
[000137] A presente invenção se refere também a composições far-macêuticas que compreendem um composto da Fórmula IA (ou Fór-mula exemplar desta) ou um N-óxido deste como ingrediente ativo e que pode ser utilizado especialmente no tratamento das doenças anteriormente mencionadas.
[000138] Os compostos farmacologicamente aceitáveis da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, para a preparação de composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade far-maceuticamente eficaz de um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como ingrediente ativo junto ou em mistura com uma quantidade significante de um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, sólidos ou líquidos, orgânicos ou inorgânicos.
[000139] A invenção se refere também a uma composição farmacêutica que é adequada para administração a um animal de sangue quente, especialmente um ser humano (ou a células ou linhagens celulares derivadas de um animal de sangue quente, especialmente um ser humano , por exemplo, linfócitos), para o tratamento ou, em um aspecto mais amplo da invenção, prevenção de (= profilaxia contra) uma doença que responde a inibição da atividade de tirosina proteína cinase, especialmente um das doenças mencionadas acima como sendo preferida para uso de um composto da Fórmula IA(ou Fórmula exemplar desta), compreendendo uma quantidade de um novo composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta), ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, que é eficaz para a referida inibição, juntamente com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000140] Composições para administração entérica, tal como admi-nistração nasal, bucal, retal ou, especialmente, oral, e para administração parenteral, tal como administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea, a animais de sangue quente, especialmente seres humanos, são especialmente preferidas. As composições compreendem o ingrediente ativo sozinho, de preferência, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável. A dosagem do ingrediente ativo depende da doença a ser tratada e da espécie, sua idade, peso, e condição individual, os dados farmacocinéticos individuais, e o modo de administração.
[000141] A presente invenção se refere especialmente a composi-ções farmacêuticas que compreendem um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta), um tautômero, um N-óxido ou um sal farmaceuticamente aceitável, ou um hidrato ou solvato deste, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000142] A invenção se refere também às composições farmacêuti-cas para uso em um método para controle profilático especialmente terapêutico do corpo humano ou animal, a um processo para a preparação desta (especialmente na forma de composições para o tratamento de tumores) e a um método de tratamento (especialmente tumor) de doenças, especialmente aquelas mencionadas aqui anteriormente.
[000143] A invenção se refere também a processos e ao uso de compostos da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) ou N-óxidos destes para a preparação de preparações farmacêuticas que compreendem compostos da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) ou N- óxidos destes como componente ativo (ingrediente ativo).
[000144] As composições farmacêuticas compreendem aproximadamente de 1% a aproximadamente 95% de ingrediente ativo, formas de administração de dose única compreendendo na modalidade preferida aproximadamente de 20% a aproximadamente 90% de ingrediente ativo e formas que não são do tipo dose única compreendendo na modalidade preferida aproximadamente de 5% a aproximadamente 20% de ingrediente ativo. Formas de dose unitárias são, por exemplo, comprimidos revestidos e não revestidos, ampolas, frascnetes, supositórios, ou cápsulas. Outras formas de dosagem são, por exemplo, unguentos, cremes, pastas, espumas, tinturas, sprays,etc. Exemplos são cápsulas contendo de cerca de 0,05 g a cerca de 1,0 g de ingrediente ativo.
[000145] As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas de uma maneira conhecida por si própria, por exemplo, por meios de processos de mistura, granulação, revestimento, dissolução ou liofilização convencionais.
[000146] É dada preferência ao uso de soluções do ingrediente ativo, e também suspensões ou dispersões, especialmente soluções, dispersões ou suspensões aquosas isotônicas que, por exemplo, no caso de composições liofilizadas compreendendo o ingrediente sozinho ou junto com um veículo podem ser preparadas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, preservativos, estabilizantes, agentes umectantes e/ou emulsificantes, solubilizantes, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões e são preparados de uma maneira conhe- cida de per si, por exemplo, por meio de processos de dissolução e liofilização convencionais. As referidas soluções ou suspensões podem compreender agentes de aumento de viscosidade ou solubilizantes, tais como carboximetilcelulose sódica, carboximetilcelulose, dextrana, polivinilpirrolidona ou gelatina.
[000147] Suspensões em óleo compreendem como o componente de óleo os óleos vegetais, sintéticos ou semi-sintéticos habituais para propósitos de injeção. Neste contexto, podem ser mencionados como tais especialmente ésteres de ácido graxo líquidos que contêm como o componente de ácido um ácido graxo de cadeia longa tendo de 8 a 22, especialmente de 12 a 22, átomos de carbono, por exemplo, ácido láu- rico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácido pentadecílico, ácido palmí- tico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beênico ou ácidos não saturados correspondentes, por exemplo, ácido oléico, ácido elaídico, ácido erúcico, ácido brasídico ou ácido linoléico, se de-sejado com a adição de antioxidantes, por exemplo, vitamina E, β- caroteno ou 3,5-di-terc-butil-4-hidroxitolueno. O componente de álcool desses ésteres de ácido graxo tem um máximo de 6 átomos de carbono e é um mono- ou polihidróxi, por exemplo, um mono-, di- ou tri- hidróxi, álcool, por exemplo, metanol, etanol, propanol, butanol ou pentanol ou os isômeros destes, mas especialmente glicol e glicerol. Os exemplos seguintes de ésteres de ácido graxo por esse motivo devem ser mencionados: oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, "Labrafil M 2375" (trioleato de glicerol de polioxietileno, Gat- tefossé, Paris), "Miglyol 812" (triglicerídeo de ácidos graxo saturados com um tamanho de cadeia de Cs a C12, Huis AG, Germany), mas especialmente óleos vegetais, tais como óleo de caroço de algodão, óleo de amêndoa, azeite de oliva, óleo de rícino, óleo gergelim, óleo de soja e mais especialmente óleo de amendoim.
[000148] Composições de injeção são preparadas de maneira habi- tual sob condições estéreis; o mesmo aplica-se também para introdução das composições em ampolas ou frasconetes e selagem dos recipientes.
[000149] Composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas por combinação do ingrediente ativo com veículos sólidos, se desejado granulação de uma mistura resultante, e processamento da mistura, se desejado ou necessário, após a adição de excipientes apropriados, em comprimidos, núcleos de drágeas ou cápsulas. Também é possível para elas serem incorporadas em veículos plásticos que permitem os ingredientes ativos difundir-se ou ser liberados em quantidades medidas.
[000150] Veículos adequados são especialmente cargas, tais como açúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfato de cálcio, por exemplo, fosfato de tricál- cio ou hidrogeno fosfato de cálcio, e aglutinantes, tais como pastas de amido empregando por exemplo, amido de milho, trigo, arroz ou batata, gelatina, tragacanto, metilcelulose, idroxipropilmetilcelulose, carbo- ximetilcelulose sódica e/ou polivinilpirrolidona, e/ou, se desejado, disin- tegradores, tais como os amidos acima mencionados, e/ou amido de carboximetila, polivinilpirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio. Excipientes são especialmente condicionadores de fluidez e lubrificantes, por exemplo, ácido silícico, talco, ácido esteárico ou sais deste, tais como estearato de magnésio ou cálcio, e/ou polietileno glicol. Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados, opcionalmente entéricos, neste contexto sendo utilizadas, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações de celulose adequadas, tais como ftalato de etilcelulose ou ftalato de hidroxipropilmetilcelulose. Cápsulas são cápsulas de enchimento seco feitas de gelatina e cápsulas seladas macias feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de enchimento seco podem compreender o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, com cargas, tais como lactose, aglutinantes, tais como amidos, e/ou deslizantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e se desejado com estabilizantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferência dissolvido ou suspenso em excipientes oleosos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos, sendo possível também quanto a estabilizantes e/ou agentes antibacterianos serem adicionados. Tinturas ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos drágeas ou os invólucros de cápsulas, por exemplo, para propósitos de identificação ou para indicar diferentes doses de ingrediente ativo.
[000151] Núcleos de comprimidos podem ser fornecidos com reves-timentos adequados, opcionalmente entéricos, através do uso de, entre outras, soluções de açúcar concentradas que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados ou misturas do solvente, ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações de celulose adequadas.
[000152] Composições farmacêuticas para administração oral também incluem cápsulas duras consistindo em gelatina, e também cápsulas seladas macias, consistindo em gelatina e um plastificante. As cápsulas duras podem conter o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, em mistura com cargas, aglutinantes, e/o deslizantes, e opcionalmente estabilizantes. Em cápsulas macias, o ingrediente ativo é de preferência dissolvido ou suspenso em excipientes líquidos adequados aos quais estabilizantes e detergentes também podem ser adicionados.
[000153] Composições farmacêuticas adequadas para administração retal são, por exemplo, supositórios que consistem em uma combinação do ingrediente ativo e uma base de supositório.
[000154] Para administração parenteral, soluções aquosas de um ingrediente ativo em forma solúvel em água, por exemplo, de um sal solúvel em água, ou suspensões de injeção aquosas que contêm substâncias que aumentam a viscosidade, por exemplo, carboximetilcelulo- se sódica, sorbitol e/ou dextrana, e, se desejado, estabilizantes são especialmente adequados. O ingrediente ativo, opcionalmente junto com excipientes, pode também estar na forma de um liofilizado e pode ser preparado em uma solução antes da administração parenteral pela adição do solventes adequados.
[000155] Soluções tais como são utilizadas, por exemplo, para admi-nistração parenteral podem também ser utilizadas como soluções de infusão.
[000156] A invenção se refere igualmente a um processo ou um mé-todo para o tratamento de um das doenças (condições patológicas) mencionadas aqui, especialmente uma doença que responde a uma inibição de uma tirosina cinase, mais especialmente como mencionado acima, mais especialmente FGFR, especialmente uma doença neo- plástica correspondente. Os compostos da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) ou N-óxidos destes (isto também incluindo sais, ésteres ou similar) podem ser administrados tal como ou especialmente na forma de composições farmacêuticas, profilaticamente ou terapeuticamente, preferivelmente em uma quantidade eficaz contra as referidas doenças, a um animal, preferivelmente a um de sangue quente, por exemplo, um ser humano , cada qual preferivelmente requerendo tal tratamento. No caso de um indivíduo tendo um peso corporal de cerca de 70 kg a dose diária administrada é de aproximadamente 0,001 g a aproximadamente 12 g, preferivelmente por exemplo, de aproximada- mente 0,1 g a aproximadamente 3 g, de um composto da presente invenção. "Aproximadamente"preferivelmente significa com até 10% de desvio, mais preferivelmente com menos do que 1 % de desvio do determinado número, respectivamente.
[000157] Uma doença "que responde" é aquela onde pode ser mos-trado que algum efeito benéfico pode ser encontrado.
[000158] A invenção também fornece um método de tratar de uma doença dependente de proteína cinase, compreendendo administrar a um animal de sangue quente, por exemplo, um ser humano , um ou mais compostos citostáticos ou citotóxicos por exemplo, Glivec® em combinação com um composto da invenção, seja ao mesmo tempo, ou em um tempo separado. O termo "o mesmo tempo" é empregado para indicar em sequência rápida ou imediatamente após a outro.
[000159] A presente invenção se refere especialmente também ao uso de um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) ou N- óxidos deste, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, especialmente um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) que é referido ser preferido, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, como tal ou na forma de uma formulação farmacêutica com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável para o controle terapêutico e também profilático de uma ou mais das doenças mencionada aqui anteriormente, preferivelmente uma doença que responde a uma inibição de uma proteína cinase, especialmente uma doença neoplástica, mais especialmente leucemia que responde a uma inibição da Abl tirosina cinase.
[000160] A quantidade de dose preferida, composição, e preparação de formulações farmacêuticas (medicinas) que será utilizada em cada caso é descrita acima.
[000161] Um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) pode também ser utilizada com vantagem em combinação com outros agentes antiproliferatives. Tais agentes antiproliferatives incluem, porém não estão limitados a inibidores de aromatase, antiestrogênios, inibidores de topoisomerase I, inibidores de topoisomerase II, agentes ativos de microtubule, agentes de alquilação, inibidores de histona de- sacetilase, inibidores de farnesil transferase, inibidores de COX-2, inibidores de MMP, inibidores de mTOR, antimetabólitos antineoplásicos, compostos de platina, compostos que diminuem a atividade de proteína cinase e atividade de ATPase, também compostos antiangiogêni- cos, agonistas de gonadorelina, antiandrogênios, bengamidas, bisfos- fonatos, anticorpos antiproliferativos e temozolomida (TEMODAL®) es-teróides, tipo dexametasona, inibidores de proteassoma, tipo velcade e/ou talidomida.
[000162] O termo "inibidores de aromatase"quando utilizado aqui se refere a compostos que inibem a produção de estrogênio, isto é, a conversão dos substratos androstenodiona e testosterona para estrona e estradiol, respectivamente. O termo inclui, porém não está limitado a esteróides, especialmente exemestano e formestano e, em particular, não-esteróides, especialmente aminoglutetimida, vorozol, fadrozol, anastrozol e, muito especialmente, letrozol. Exemestano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é fabricado, por exemplo, sob a marca comecial AROMASIN®. Formestano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial LENTARON®. Fadrozol pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial AFEMA®. Anastrozol pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ARIMIDEX®. Letrozol pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FEMARA® ou FEMAR®. Aminoglutetimida pode ser administrado, por exemplo, na forma como ela é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ORIMETEN®.
[000163] Uma combinação da invenção compreendendo um agente antineoplásico que é um inibidor de aromatase é particularmente útil para o tratamento de tumores de mama positivos para receptor de hormônio.
[000164] O termo "antiestrogênios"quando utilizado aqui se refere aos compostos que antagonizam o efeito de estrogênios no nível de receptor de estrogênio. O termo inclui, porém não está limitado a ta- moxifeno, fulvestrante, raloxifeno e cloridrato de raloxifeno. Tamoxifeno pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial NOLVADEX®. Cloridrato de raloxifeno pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial EVISTA®. Fulvestrante pode ser formulado como descrito na Patente US 4.659.516 ou pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FASLODEX®.
[000165] O termo "inibidores de topoisomerase I" como utilizada aqui inclui, porém não está limitado a topotecano, irinotecano, 9- nitrocamptotecina e o conjugado de camptotecina macromolecular PNU-166148 (composto A1 em WO99/17804). Irinotecano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial CAMPTOSAR®. Topotecano pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial HYCAMTIN®.
[000166] O termo "inibidores de topoisomerase II" quando utilizado aqui, porém não está limitado às antraciclinas doxorrubicina (incluindo Formulação lipossômica, por exemplo, CAELYX®), epirrubicina, idarru- bicina e nemorrubicina, as antraquinonas mitoxantrona e losoxantrona, e as podofillotoxinas etoposida e teniposida. Etoposida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exem- pio, sob a marca comercial ETOPOPHOS®. Teniposida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial VM 26-BRISTOL®. Doxorrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ADRIBLASTIN®. Epirrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial FARMORUBICIN®. Idarrubicina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ZAVEDOS®. Mitoxantrona pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial NOVANTRON®.
[000167] O termo "agentes ativos de microtúbulo" se refere aos agentes de estabilização de microtúbulos e desestabilização de mi- crotúbulos incluindo, porém não limitados aos taxanos paclitaxel e docetaxel, os alcalóides de vinca, por exemplo, vimblastina, especialmente sulfato de vimblastina, vincristina especialmente sulfato de vincristi- na, e vinorelbina, discodermolida e epotilonas, tais como epotilona B e D. Docetaxel pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial TAXOTERE™. Sulfato de vimblastina pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial VIN- BLASTIN R.P.®. Sulfato de vincristina pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FARMISTIN™.
[000168] O termo "agentes de alquilação" quando utilizado aqui in-clui, porém não está limitado a ciclofosfamida, ifosfamida e melfalan. Ciclofosfamida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial CICLOSTIN™. Ifosfamida pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial HOLOXAN™.
[000169] O termo "inibidores de histona desacetilase" se refere aos compostos que inibem a histona desacetilase e que possuem atividade antiproliferativa.
[000170] O termo "inibidores de farnesil transferase"se refere aos compostos que inibem a farnesil transferase e que possuem atividade antiproliferativa.
[000171] O termo "inibidores de COX-2" se refere aos compostos que inibem a enzima ciclooxigenase tipo 2 (COX-2) e que possuem atividade antiproliferativa tal como celecoxib (Celebrex®, rofecoxibe (Vioxx® e lumiracoxibe (COX189).
[000172] O termo "inibidores de MMP" se refere aos compostos que inibem a metaloproteinase matriz (MMP) e que possuem atividade antiproliferativa.
[000173] O termo "inibidores de mTOR" se refere aos compostos que inibem o alvo mamífero de rapamicina (mTOR) e que possuem atividade antiproliferativa tias como sirolimus (Rapamune®, everolimus (Certi- can®), CCI-779 e ABT578.
[000174] O termo "antimetabólitos antineoplásicos" inclui, mas não está limitada a 5-fluorouracila, tegafur, capecitabina, cladribina, citara- bina, fosfato de fludarabina, fluorouridina, gencitabina, 6-mercap- topurina, hidroxiuréia, metotrexato, edatrexato e sais de tais compostos, e além disso ZD 1694 (RALTITREXED®), LY231514 (ALIMTA®), LY264618 (LOMOTREXOL®) e OGT719.
[000175] O termo "compostos de platina" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a a carboplatina, cisplatina e oxaliplatina. Car- boplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial CARBOPLAT®. Oxaliplatina pode ser administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ELOXATIN®.
[000176] O termo "compostos que reduz a atividade de proteína ci- nase e também compostos antiangiogênicos" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a compostos que reduzem a atividade, por exemplo, do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), do Fator de Crescimento da Epiderme (EGF), c-Src, proteína cinase C, do Fator de Crescimento Derivado das Plaquetas (PDGF), Bcr-Abl, c-Kit, Flt-3, do Receptor do Fator I de Crescimento Semelhante à Insulina (IGF-IR) e das Cinases dependentes de Ciclina (CDKs), e compostos antiangiogênicos tendo outro mecanismo de ação de redução da atividade de proteína cinase.
[000177] Compostos que reduzem a atividade de VEGF são especi-almente compostos que inibem o receptor de VEGF, especialmente a atividade de tirosina cinase do receptor de VEGF, e compostos ligante- se a VEGF, e são em particular aqueles compostos, proteínas e anticorpos monoclonais geralmente e especificamente descritos nos WO 98/35958, WO 00/09495, WO 00/27820, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819, WO 01/55114, WO 01/58899 e EP 0 769 947; aqueles como descritos por M. Prewett e outro em Cancer Research 59 (1999) 5209-5218, por F. Yuan e outro em Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., vol. 93, pp. 14765-14770, dezembro de 1996, por Z. Zhu e outro em Cancer Res. 58, 1998, 3209-3214, e por J. Mordenti e outro em Toxicologic Pathology, vol. 27, n°. 1, pp 14-21, 1999; nos WO 00/37502 e WO 94/10202; Angiostatin®, descrito por M. S. O'Reilly e outro, Cell 79, 1994, 315-328; e Endostatin®, descrito por M. S. O'Reilly e outro, Cell 88, 1997, 277-285; compostos que reduzem a atividade de EGF são especialmente compostos que inibem o receptor de EGF, especialmente a atividade de tirosina cinase do receptor de EGF, e compostos ligante-se a EGF, e são em particular aqueles compostos genericamente e especificamente descritos nos WO 97/02266, EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 226, EP 0 787 722, EP 0 837 063, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983 e, especialmente, WO 96/33980; compostos que reduzem a atividade c-Src incluem, mas não estão limitados a, compostos inibindo a atividade de c-Src proteína tirosina cinase tal como definido abaixo e a inibidores de interação de SH2 tais como aqueles descritos nos WO97/07131 e WO97/08193; compostos inibidores da atividade de c-Src proteína tirosina cinase incluem, mas não estão limitados a, compostos pertencentes às classes de estrutura de pirrolopirimidinas, especialmente pirrolo[2,3-d]pirimi- dinas, purinas, pirazopirimidinas, especialmente pirazo[3,4-d]pirimi- dinas, pirazopirimidinas, especialmente pirazo[3,4-d]pirimidinas e piri- dopirimidinas, especialmente pirido[2,3-d]pirimidinas. De preferência, o termo se refere à aqueles compostos descritos nos WO 96/10028, WO 97/28161, WO97/32879 e WO97/49706; compostos que reduzem a atividade da proteína cinase C especial-mente aqueles derivados de estaurosporina descritos na EP 0 296 110 (preparação farmacêutica descrita no WO 00/48571) cujos os compostos são inibidores de proteína cinase C; outros compostos específicos que reduzem a atividade de proteína cinase e que também podem ser utilizados em combinação com os compostos da presente invenção são Imatinibe (Gleevec®/Glivec®), PKC4I2, Iressa™ (ZD1839), PKI166, PTK787, ZD6474, GW2016, CHIR-200131, CEP-7055/CEP-5214, CP-547632, KRN-633 e SU5416; compostos antiangiogênicos tendo outro mecanismo de ação de redução da atividade de proteína cinase incluem, mas não estão limitados a por exemplo, talidomida (THALOMID), celecoxibe (Celebrex) e ZD6126.
[000178] O termo "agonista de gonadorelina" tal como empregada aqui inclui, mas não está limitada a abarelix, gosserrelina e acetato de gosserrelina. Gosserrelina é descrita na patente US 4,100,274 e é administrada, por exemplo, na forma como ela é comercializada, por exemplo, sob a marca comercial ZOLADEX®. Abarelix pode ser formulado, por exemplo, tal como descrito na US 5,843,901.
[000179] O termo "anti-androgênios"quando utilizado aqui inclui, po-rém não está limitado à bicalutamida (CASODEX™) que pode ser formulado por exemplo, tal como constatado na US 4,636,505.
[000180] O termo "bengamidas" se refere a bengamidas e derivados desta tendo propriedades antiproliferativas.
[000181] O termo "bisfosfonatos" quando utilizado aqui inclui, porém não está limitado a ácido etridônico, ácido clodrônico, ácido tiludrônico, ácido pamidrônico, ácido alendrônico, ácido ibandrônico, ácido rise- drônico e ácido zoledrônico. "Ácido etridônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial DIDRONEL®. "Ácido clodrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial BONEFOS®. "Ácido tiludrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial SKELID®. "Ácido pamidrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial AREDIA®. "Ácido alendrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial FOSAMAX®. "Ácido ibandrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial BONDRANAT®. "Ácido ri- sedrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ACTONEL®. "Ácido zoledrônico" pode ser administrado, por exemplo, na forma como ele é comercializado, por exemplo, sob a marca comercial ZOMETA®.
[000182] O termo "anticorpos antiproliferatives"tal como aqui empre-gada inclui, mas não está limitada a trastuzumabe (Herceptin®), Tras- tuzumab-DM1, erlotinibe (Tarceva®), bevacizumabe (Avastin®), rituxi- mabe (Rituxan®), PRO64553 (anti-CD40) e Anticorpo de 2Ü4.
[000183] Para o tratamento de leucemia mielóide aguda (AML), com-postos da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) podem ser utiliza-dos em combinação com terapias de leucemia padrões, especialmente em combinação com terapias utilizadas para o tratamento de AML. Em particular, os compostos da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta) podem ser administrados em combinação com por exemplo, inibidores de farnesiltransferase e/ou outras drogas úteis para o tratamento de AML, tais como Daunorrubicina, Adriamicina, Ara-C, VP-16, Teniposi- da, Mitoxantrona, Idarrubicina, Carboplatina e PKC412.
[000184] A estrutura dos agentes ativos identificados pelos números de código; nomes genéricos ou comerciais podem ser apanhados da edição atual do compêndio padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo, Patentes Internacionais (por exemplo, IMS World Publications).
[000185] Os compostos acima mencionados que podem ser utiliza-dos em combinação com um composto da Fórmula IA (ou Fórmula exemplar desta), podem ser preparados e administrados tal como descrito na técnica tal como nos documentos citados acima.
[000186] Os termos "co-administração" ou "administração combina-da" ou similar quando utilizado aqui são pretendidos abranger administração dos agentes terapêuticos selecionados a um único paciente, e são pretendidos incluir regimes de tratamento em que os agentes necessariamente não são administrados pela mesma via de administração ou ao mesmo tempo.
[000187] Onde subsequentemente acima o termo "uso" é mencionado (como verbo ou substantivo) (relativo ao uso de um composto da Fórmula IA ou um sal destes (especialmente farmaceuticamente aceitável), isto (se não identificado diferentemente ou sugerido diferentemente pelo contexto) inclui quaisquer uma ou mais das seguintes modalidades mo- dalidades da invenção, respectivamente (se não declarado de outra maneira): o uso no tratamento de uma doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente tirosina) (especialmente inibição), o uso para a fabricação de composições farmacêuticas para uso no tratamento de uma doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), métodos de uso de um ou mais compostos da Fórmula IA no tratamento de uma doença responsiva e/ou proliferativa de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), preparações farmacêuticas compreendendo um ou mais compostos da Fórmula IA para o tratamento da referida doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), e um ou mais compostos da Fórmula IA no tratamento da referida doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição), quando apropriado e expediente, se não declarado de outra maneira. Em particular, doenças a ser tratadas e são desse modo preferidas para "uso" de um composto da Fórmula IA são selecionadas a partir de responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente tirosina) (especialmente inibição) (significando também, "suportada" não apenas "dependente", incluindo também situações onde uma doença é responsável para modulação, especialmente inibição, de uma proteína cinase, isto é, a atividade da proteína cinase suporta ou ainda causa manifestação de doença) doenças mencionadas acima ou, especialmente doenças proliferativas mencionadas acima ou abaixo. Preferivelmente, uma doença responsiva de modulação de proteína cinase (especialmente inibição) é uma que responde a inibição de uma ou mais das cinases mencionadas acima e abaixo, porém preferivelmente FGFR.
[000188] Um composto da Fórmula IA é analogamente preparado em métodos que, para outras compostos, é em princípio conhecido na técnica, de forma que para os novos compostos da Fórmula IA o pro- cesso é novo como processo de analogia, preferivelmente reagindo-se um composto de anilina da Fórmula IIA,
em que R4 e n são como definido para um composto da Fórmula IA, com uma amina da Fórmula IIIA,
em que R1, R2, R3, R5, X, Y e Z são como definido para um composto da Fórmula IA, na presença de um derivado de ácido carbônico bisreativos; e, se desejado, transformando um composto de Fórmula IA em um composto diferente da Fórmula IA, transformando um sal de um composto obtenível da Fórmula IA no composto livre ou um sal diferente, transformando um composto livre obtenível da Fórmula IA em um sal destes, e/ou separando uma mistura obtenível de isômeros de um composto da Fórmula I em isômeros individuais.
[000189] Na reação, os derivados de ácido carbônico bisreativo é preferivelmente um anidrido de ácido carbônico ou mais preferivelmente um dialogeneto carbônico, especialmente dicloreto carbônico (fos- gênio). A reação pode preferivelmente ocorrer reagindo-se primeiro um composto da Fórmula IIA (preferido) ou um composto da Fórmula IIIA com o dericado de ácido carbônico bisreativo ao isocianato correspondente o qual em seguida o outro composto (da Fórmula IIIA ou IIA, respectivamente) é adicionado. A primeira reação preferivelmente ocorre em um solvente apropriado, tal como um éter, por exemplo, dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 20°C à temperatura de refluxo da mistura reacional, e pode preferivelmente ser seguido por concentração da solução de isocianato resultante para fornecer o isocianato preferivelmente dentro sólido ou forma de óleo. A segunda reação do isocianato em seguida ocorre depois da adição de um solvente apropriado, especialmente N-metilpirrolidona (NMP) e/ou tolueno, em temperatura elevada, por exemplo, de 20°C à temperatura de refluxo da mistura reacional, e adição da amina complementar da Fórmula formula IIIA ou IIA, respectivamente.
[000190] Ambas as reações preferivelmente ocorrem sob um gás de proteção, especialmente nitrogênio ou argônio.
[000191] Um composto da Fórmula que IA pode ser convertido em compostos diferentes da Fórmula I.
[000192] Por exemplo, em um composto da Fórmula IA em que R1 é benziloxifenilamino ou 4-benzil-piperazin-1-il-fenilamino, a porção de benzila pode ser removido por hidrogenação, por exemplo, na presença de catalisador de metal nobre, tal como paládio em carvão, em um solvente apropriado, tal como um álcool, por exemplo, metanol, em temperaturas apropriadas, por exemplo, de 0 a 50°C, no caso de remoção nitrogênio de piperazina na presença adicional de um ácido, por exemplo, HCI, para produzir o composto correspondente em que em vez da porção de benzila um hidrogênio está presente.
[000193] Um composto de Fórmula que IA pode ser convertido a um N-óxido correspondente. A reação é realizada com agente de oxidação adequado, preferivelmente um peróxido, por exemplo, ácido m- cloroperbenzóixco, em um solvente adequado, por hidrocarboneto halogenado, tipicamente clorofórmio ou diclorometano, ou em um ácido alcanocarboxílico inferior, tipicamente ácido acético, preferivel-mente em uma temperatura entre 0°C e a temperatura de ebulição da mistura reacional, especialmente a cerca de temperatura ambiente.
[000194] Compostos da invenção na forma não oxidada podem ser preparados a partir de N-óxidos de compostos da invenção por tratamento com um agente de redução (por exemplo, enxofre, dióxido de enxofre, trifenil fosfina, boroidreto de lítio, boroidreto de sódio, tricloreto de fósforo, tribrometo, ou similares) em um solvente orgânico inerte adequado (por exemplo, acetonitrila, etanol, dioxano aquoso, ou similares) a 0 a 80°C.
[000195] Sais de compostos de Fórmula IA que tem pelo menos um grupo formador de sal podem ser preparados de maneira conhecida por si própria. Por exemplo, um sal de adição ácido de compostos de Fórmula IA com grupos básicos (por exemplo, nitrogênio básico) pode ser obtido de maneira habitual, por exemplo, por tratamento de um composto da Fórmula IA com um ácido ou um reagente de troca aniô- nica adequado. Um sal de um composto de Fórmula IA tendo grupos ácidos pode ser formado tratando-se o composto com um composto de metal, tal como um sal de metal de ácali de um ácido carboxílico orgâ-nico adequado, por exemplo, o sal sódico de ácido 2-etilexanóico, com um composto de metal de álcali orgânico ou metal alcalinoterroso, tal como o hidróxido correspondente, carbonato ou hidrogenocarbonato, tal como o hidróxido de sódio ou de potássio, carbonato ou hidrogenocarbonato, com um composto de cálcio correspondente ou com amónia ou uma amina orgânica adequada, quantidades estequiométricas ou apenas um pequeno excesso do agente de formação de sal preferivelmente a ser utilizado. Sais internos de compostos de Fórmula IA que contém grupos de formação de sal básico ou ácido, por exemplo, um grupo carbóxi e um grupo amino livre, podem ser formados, por exemplo, pela neutralização de sais, tais como sais de adição ácido, ao ponto isoelétrico, por exemplo, com bases fracas, ou por tratamento com trocadores iônicos.
[000196] Um sal de um composto da Fórmula IA (= composto da invenção) pode ser convertido de maneira habitual no composto livre; um metal ou sal de amónio pode ser convertido, por exemplo, por tratamento com um ácido adequado, e um sal de adição de ácido, por exemplo, por tratamento com um agente básico adequado em um sal diferente. Em ambos os casos, trocadores iónicos adequados podem ser utilizados.
[000197] Misturas estereoisoméricas, por exemplo, misturas de dias- tereômeros, podem ser separadas em seus isômeros correspondentes de uma maneira conhecida por si própria por meios de métodos de separação apropriados. Misturas diastereoméricas, por exemplo, podem ser separadas em seus diastereômeros individuais por meios de cristalização fracionada, cromatografia, distribuição do solvente, e procedi-mentos similares. Esta separação pode ocorrer no nível de um dos composto de partida ou em um composto da Fórmula IA propriamente dito. Enantiômeros podem ser separados através da formação de sais de diastereoméricos, por exemplo, por formação de sal com um ácido quiral enantiomericamente puro, ou por meios de cromatografia, por exemplo, por HPLC, utilizando-se substratos cromatográficos com ligantes quirais. Uma descrição mais detalhada das técnicas aplicáveisl à resolução de estereoisômeros de compostos a partir de sua mistura racêmica pode ser encontrada em Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, “Enantiomes, Racemates and Resolutions”, John Wiley E Sons, Inc., 1981.
[000198] Derivados de pró-fármaco dos compostos da invenção podem ser preparados por métodos conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica (por exemplo, para mais detalhes veja Saulnier e outro, (1994), Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, pág. 1985). Por exemplo, pró-fármacos apropriadas podem ser preparadas por reação de um composto não derivado da invenção com um agente de carbamilação adequado (por exemplo, 1,1 –aciloxialquil- carbanocloridato, carbonato de para-nitrofenila, ou similares).
[000199] Derivados protegidos dos compostos da invenção podem ser feitos por meios conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica. Uma descrição detalhada de técnicas aplicáveis à criação de grupos de proteção e sua remoção pode ser encontrada em T. W. Greene, “Protecting Groups in Organic Chemistry”, 3ª edição, John Wiley e Filhos, Inc., 1999.
[000200] Compostos da presente invenção podem ser convenientemente preparados, ou formados durante o processo da invenção, como solvatos (por exemplo, hidratos). Hidratos de compostos da presente invenção podem ser convenientemente preparados por recristalização de uma mistura do solvente aquosa/ orgânica, utilizando-se solventes orgânicos tais como dioxina, tetraidrofurano ou metanol.
[000201] Intermediários e produtos finais podem ser elaborados e/ou purificados de acordo com métodos padrão, por exemplo, utilizando-se métodos cromatográficos, métodos de distribuição, (re-) cristalização, e similares.
[000202] Materiais de partida e intermediários (ambos em cada caso incluindo sais destes), especialmente das Fórmulas IIA e IIIA, podem ser preparados em analogia aos métodos descritos nos Exemplos, de acordo com ou em analogia aos métodos que são conhecidos na técnica e/ou eles estão comercialmente disponíveis.
[000203] Por exemplo, materiais de partida podem ser preferivelmente preparados como segue:
[000204] Onde nos materiais de partida e intermediários R1, R2, R3, R4, R5, X, Y, Z e n são utilizados, estes símbolos têm preferivelmente os os significados dados para um composto da Fórmula IA, se não indicados de outra maneira.
[000205] Um composto da Fórmula IIA que transporta uma ou mais porções de halo pode, por exemplo, ser preparado por halogenação, por exemplo, com um haleto de ácido inorgânico, tal como cloreto de sulfuri- la, em um solvente apropriado, por exemplo, acetonitrila, diclorometano e/ou tetraidrofurano, preferivelmente nas temperaturas na faixa de -40 a 25°C, de um composto correspondente à Fórmula HA, em que até 4 outras porções R4 selecionadas de Ci-C?-alquila, halo-Ci-C?-alquila, halo e Ci-C?-alcóxi estão presentes e o grupo amino é protegido, por exemplo, por acetila ou terc-butoxicarbonila (introdução dos grupos protetores, veja, por exemplo, nos Exemplos ou sob as Condições de processo gerais abaixo), seguido por remoção do grupo protetor (por exemplo, acetila por tratamento com um hidróxido de metal de álcali, tal como hidróxido de potássio, em um solvente apropriado, tal como etanol, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 30°C à temperatura de refluxo da mistura, terc-butoxicarbonila por eação com um ácido, por exemplo, HCI, em um solvente apropriado, por exemplo, dioxano, em temperaturas por exemplo, a partir de -20 a 30°C).
[000206] R4 = C1-C7-alquila, especialmente metila, pode ser introduzida por alquilação do anel de fenila (especialmente onde anteriormente porções de C1-C7-alcóxi R4 estão presentes) em um composto precursor correspondente da mesma forma da Fórmula IIA (com proteção e deproteção do grupo amino como no parágrafo precedente) com um C1-C7-alquilalogeneto (por exemplo, -iodeto) em um solvente apropria-do, por exemplo, tetraidrofurano, em temperaturas preferivelmente a partir de -50 a 25°C, depois da reação do composto precursor da Fórmula IIA com uma base forte, por exemplo, butil- ou terc-butil-lítio, em um solvente apropriado, por exemplo, pentano e tetraidrofurano, as temperaturas preferidas na faixa a partir de -80 a 0°C.
[000207] Um composto da Fórmula que IIIA pode, por exemplo, ser preparados como segue reagindo-se um composto da Fórmula VIA,
em que Hal é halogênio, especialmente cloro ou bromo, com uma ami- na da Fórmula o VA,
" na presença de um ácido, por exemplo, ácido acético ou ácido clorídrico, em um solvente apropriado, por exemplo, água ou dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, na faixa de 50 a 160°C (se requerida em um tubo).
[000208] Alternativamente, um composto da Fórmula IIIA em que R1 é fenila substituída por [4-(C1-C7-alquil)-piperazin-1-il]-carbonila pode ser obtido reagindo-se um composto da Fórmula o IVA como definido acima com um composto da Fórmula VIA,
em que A é hidrogênio, C1-C7-alcóxi ou halo, preferivelmente na presença de um ácido, por exemplo, HCI, em um solvente apropriado, por exemplo, dioxano, em temperaturas elevadas, por exemplo, de 50 a 170°C (por exemplo, em um forno de microondas), e em seguida rea- gindo-se o composto resultante da Fórmula VIIA (VIIA)
em que as porções são como definidas sob a Fórmula IVA e VIA, na presença de um agente de acoplamento, tal como anidrido propilfosfô- nico, em um solvente apropriado, tal como DMF, na presença de base de nitrogênio, por exemplo, trietilamina e/ou 4-dimetilamino-piridina, preferivelmente nas temperaturas na faixa de 0 a 50°C ao composto correspondente da Fórmula IIIA.
[000209] Um composto da Fórmula VA em que R5 é hidrogênio pode, por exemplo, ser obtido reduzindo-se um composto correspondente em que em vez do grupo amino (NR3) um grupo nitro está presente, por exemplo, com pó de ferro em etanol, água e ácido acético em temperaturas elevadas, por exemplo, a partir de 30 a 100°C, ou com hidrogênio na presença de um catalisador, por exemplo, Ni Raney em metanol em temperaturas, por exemplo, a partir de 0 a 50°C. Em ambos os casos, outros solventes habituais são possíveis. Um composto correspondente da Fórmula VA em que R5 é C1-C7-alquila pode, em seguida, ser obtido por al- quilação, por exemplo, com um C1-C7-alquilalogeneto correspondente.
[000210] Os materiais de partida correspondentes bem como outros compostos da Fórmula VA podem ser obtidos em analogia a ou pelos métodos descritos nos Exemplos, de acordo com procedimentos conhecidos na técnica ou eles estão comercialmente disponíveis.
[000211] O seguinte aplica-se em geral a todos os processos mencionados aqui anteriormente e em seguida, embora as condições de reação especificamente mencionadas acima ou abaixo sejam preferidas:
[000212] Em quaisquer das reações mencionados aqui anteriormente e em seguida, os grupos de proteção podem ser utilizados onde apropriado ou desejado, até mesmo se este não foi especificamente mencionado, para proteger grupos funcionais que não estão destinados a tomar parte em uma determinada reação, e eles podem ser apresenta-dos e/ou removidos em estágios apropriados ou desejados. Reações que compreendem o uso de grupos protetores são, portanto, incluídas quando possível sempre que as reações sem mencionamento específico de proteção e/ou desproteção são descritas neste relatório.
[000213] Dentro do escopo desta descrição apenas um grupo facilmente removível que não é um constituinte do produto final desejado particular de Fórmula IA é designado um "grupo protetor", a menos que o contexto indique de outra maneira. A proteção de grupos funcionais por tais grupos protetores, os grupos protetores por si próprios, e as reações apropriadas para sua remoção são descritas, por exemplo, nos trabalhos de referência padrão, tal como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London e New York 1973, em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Terceira edição, Wiley, New York 1999, em "The Peptides"; Volume 3 (editores: E. Gross e J. Meienhofer), Academic Press, London e New York 1981, em "Methoden der organischen Chemie"{Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4a edição, Volume 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, em H.-D. Jakubke e H. Jesch- keit, "Aminosauren, Peptide, Proteine"{Amino acids, Peptides, Proteins), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, e Basel 1982, e em Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate"{Chemistry of Carbohydrates: Monosaccharides and Derivatives), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Uma característica de grupos protetores é que eles podem ser removidos facilmente (isto é, sem a ocorrência de reações secundárias indesejadas) por exemplo, por solvólise, redução, fotólise ou alternativamente sob condições fisiológicas (por exemplo, por clivagem enzimática).
[000214] Todas as etapas de processo supracitadas podem ser realizadas sob condições de reação que são conhecidas por si prórpias, preferivelmente aquelas especificamente mencionadas, na ausência ou, habitualmente, na presença do solventes ou diluentes, preferivelmente solventes ou diluentes que são inertes para os reagentes utilizados e dissolvê-los, na ausência ou presença de agentes de neutralização, condensação ou catalisadores, por exemplo, trocadores iónicos, tais como trocadores catiônicos, por exemplo, na forma de H+, dependendo da natureza da reação e/ou de reagentes em temperatura redu-zida, normal ou elevada, por exemplo, em uma faixa de temperatura de cerca de -100 °C a cerca de 190°C, preferivelmente de aproximadamente -80°C a aproximadamente 150°C, por exemplo, de -80 a -60°C, em temperatura ambiente, de -20 a 40 °C ou em temperatura de refluxo, sob pressão atmosférica ou em um vaso fechado, onde apropriado sob pressão, e/ou em uma atmosfera inerte, por exemplo, sob uma atmosfera de argônio ou nitrogênio.
[000215] Os solventes a partir dos quais estes solventes que são adequados para qualquer reação particular podem ser selecionados incluem aqueles mencionados especificamente ou, por exemplo, água, ésteres, tais como alquila inferior-alcanoatos inferiores, por exemplo, acetato de etila, éteres, tais como éteres alifáticos, por exemplo, dietil éter, ou éteres cíclicos, por exemplo, tetraidrofurano ou dioxano, hidrocarbonetos aromáticos líquidos, tal como benzeno ou tolueno, álcoois, tal como metanol, etanol ou 1-ou 2-propanol, nitrilas, tal como acetonitrila, hidrocarbonetos halogenados, por exemplo, cloreto de metileno ou clorofórmio, amidas ácidas, tal como dimetilformamida ou dimetil acetamida, bases, tais como bases de nitrogênio heterocíclicos, por exemplo, piridina ou N- metilpirrolidin-2-ona, anidridos de ácido carboxílico, tais como anidridos de ácido alcanóico inferior, por exemplo, anidrido acético, hidrocarbonetos cíclicos, lineares ou ramificados, tal como cicloexano, hexano ou iso- pentano, ou misturas destes, por exemplo, soluções aquosas, a menos que de outra maneira indicado na descrição dos processos. Tais misturas do solventes podem da mesma forma ser utilizados na elaboração, por exemplo, por cromatografia ou divisão.
[000216] A invenção da mesma forma se refere àquelas formas do processo no qual um composto obtinível como intermediário em qualquer estágio do processo é utilizado como material de partida e as etapas de processo restantes são realizadas, ou em que um material de partida é formado sob as condições de reação ou é utilizado na forma de um derivado, por exemplo, em forma desprotegida ou na forma de um sal, ou um composto obtenível pelo processo de acordo com a invenção é produzido sob condições de processo e processados também in situ. No processo da presente invenção, aqueles materiais de partida são preferivelmente utilizados, os quais resultam em compostos de Fórmula IA descrito como sendo preferido. A invenção da mesma forma se refere a novos intermediários e/ou materiais e partida. Preferência especial é dada às condições de reação e novos intermediários que são idênticos ou análogos àqueles mencionados nos Exemplos.
[000217] Nas modalidades preferidas bem como nas modalidades seguintes e anteriores do escopo mais geral, da mesma forma nas reivindicações, quaisquer uma ou mais ou todas as expressões gerais ou símbolos, independentemente um do outro, podem ser substituídos pelas definições mais específicas correspondentes fornecidas acima e abaixo, desse modo produzindo modalidades mais preferidas da invenção.
[000218] Preferidas são as modalidades dadas nas reivindicações que são, portanto, incorporadas aqui por referência. Especialmente preferido é um composto da Fórmula IA como dado em qualquer um grupo A, B ou C acima. Muito preferido são um ou mais compostos da Fórmula IA dados nos Exemplos, bem como sais (especialmente farmaceuticamente aceitáveis) destes.
[000219] Os Exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção sem limitar o escopo desta. Temperaturas são medidas em graus Celsius. A menos que de outra maneira indicado, as reações ocorrem em temperatura ambiente. Os valores de Rf que indicam a relação da distância movida por cada substância para a distância movida pela frente de eluente são determinados em placas de camada fina de sílica-gel, placas de TLC de 5 x 10 cm, sílica-gel F254 (Merck, Darmstadt, Germany) por cromatografia de camada fina utilizando os sistemas do solvente indicados abaixo. Condições de HPLC analíticas: Sistema 1 Gradiente linear 20-100% de CH3CN em 5 min + 1,5 min 100% de CH3CN (0,1% de TFA); detecção em 215 nm, taxa de fluxo 1 mL/min a 30°C. Coluna: Nucleosil 100-3 C18 (70 x 4,0mm). Abreviações e Acrônimos: AcOH Ácido acético API-MS espectroscopia de massa por ionização de pressão atmosférico salmoura solução saturada de NaCI em água celite Celite® (The Celite Corporation) = auxiliar de filtragem com base em terra diatomácea CH3CN acetonitrila DCM diclorometano conc. concentrado DIEA diisopropiletilamina DMAP 4-dimetilamino-piridina DMF dimetil formamida DMP 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetraidro-2-(1H)-pirimidinona DMSO dimetilsulfóxido equiv equivalente(s) ESI-MS espectroscopia de massa de ionização por eletrovaporização Et2O dietil éter Et3N trietilamina EtOAc acetato de etila EtOH Etanol HNO3 ácido nítrico H2SO4 ácido sulfúrico h hora(s) Hex hexano HCl ácido clorídrico H2O água HPLC cromatografia líquida de alta pressão L litro(s) LiOH hidróxido de lítio Me metila MeOH Metanol mL mililitro(s) min minuto(s) m.p. ponto de fusão MPLC cromatografia líquida de média pressão MS espectro de massa NaH hidreto de sódio Na2CO3 carbonato de sódio NaHCO3 bicarbonato de sódio Na2SO4 sulfato de sódio NH3aq amônia aquosa Petição 870200084469, de 07/07/2020, pág. 91/133 NMP 1-metil-2-pirrolidona NMR Ressonância Magnética Nuclear PdCl2(dppf) [1,r-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaládio(ll) Pd(PPhs)4 T etracis(trifenilfosfina)palâdio(0) Pd(PhCN)2Cl2 Cloreto de bis(benzonitrila)paládio (II) Ph Fenila Rf Relação de frentes (TLC) RT temperatura ambiente TBTU tetrafluoroborato de O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametilurônio TFA CF3COOH (ácido trifluoroacético) THF Tetraidrofurano TLC cromatografia de camada fina TR tempo de retenção wt. peso Mecanismo de microonda: Emris Optimizer (Biotaqe) Exemplo para Esquema de Reação
[000220] Fosgênio (20% em tolueno, 0,8 mL, 1,58 mmols, 2,4 equivalente) é adicionado a uma solução de 2,6-dicloro-3,5-dimetoxianilina (175 mg, 0,79 mmols, 1,2 equivalente) em dioxano (2,5 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 1 hora, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. O isocianato resultante é adicionado a uma solução de N-[4- (2-morfolin-4-il-etóxi)-fenil]-pirimidina-4,6-diamina (208,5 mg, 0,66 mmols) em NMP (2 mL), a 75°C e sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada a 75°C durante 2 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e é em seguida diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 96:4), seguido por trituração do material resultante em MeOH, proporciona o composto do título como um sólido branco: ESI-MS: 562,9/564,9 [MH]+; tR = 2,99 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,36 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000221] Uma mistura de 6-cloro-pirimidin-4-ilamina (194 mg, 1,5 mmols, 1,3 equiv), 4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenilamina (256 mg, 1,15 mmols) em H2O (1 mL) e ácido acético glacial (5 mL) é agitada durante 16 horas a 100°C. Depois da evaporação do solvente, o resíduo é apreendido em DCM e diluído com uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é triturado em EtOAc para fornecer o composto do título como um sólido cinza: ESI-MS: 316,2 [MH]+; tR = 1,00 min (pure- za: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,22 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000222] Cloridrato de 4-(2-Cloro-etil)-morfolina (4,2 g, 22 mols, 1,2 equiv) é adicionado em uma porção a uma mistura de 4-aminofenol (2 g, 18,3 mols) e hidróxido de sódio finamente pulverizado (1,87 g, 45,8 mols, 2,5 equiv) em DMF (32 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada durante 23,5 horas em temperatura ambiente. A suspensão escura resultante é filtrada. O filtrado é diluído com DCM (200 ml) e lavado com salmoura (2 x 60 mL). A fase orgânica é secada (sulfato de sódio), filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/EtOH, 95:5 (7:3) fornece o composto do título como um sólido amarelo-marrom: API- MS: 223,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,31 (DCM/EtOH, 9:1).
[000223] Em uma solução de N-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)- acetamida (34,5 g, 264 mols) em etanol (1,3 L), 2M de KOH (0,72 L) é adicionado. Em seguida, a mistura reacional é aquecida em refluxo, agitada durante 44 horas em refluxo, em seguida permitida resfriar em temperatura ambiente. A suspensão resultante é resfriada a 0°C agitada durante 1 hora, e filtrada. O resíduo é lavado com uma porção pequena de EtOH frio/H2O (1:1) e com H2O frio até neutralidade, e secada para fornecer 0 composto do título como um sólido branco: ESI-MS: 222,0/224,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,52 (Hex/EtOAc, 1:1).
[000224] Sulfurilcloreto (26,9 ml, 325 mols, 1,93 equiv) é adicionado (em 7 min) a uma suspensão fria (0°C) de A/-(3,5-dimetoxifenil)- acetamida (32,9 g, 169 mols) em CH3CN (500 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura amarelada resultante é permitida agitar durante 30 minutos e extinguida por adição gota a gota de uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (250 mL). O precipitado resultante é coletado por filtração a vácuo, lavado com H2O (300 ml) e secado para proporcionar 20 g do produto desejado (grupo 1). O filtrado é diluído com uma solução aquosa saturada de NaHCOs (300 mL) e extraído com EtOAc (2 x 300 mL). A fase orgânica é lavada com H2O e salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (EtOAc/Hex, 1:1 -> 2:1) para fornecer 8,8 g do produto (batelada 2). Batelada 1 e 2 são combinadas e agitadas em hexano. O sólido é coletado por filtração, lavado com he- xano e secado para proporcionar 0 composto do título como um sólido branco. ESI-MS: 264,0/266,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,15 (Hex/EtOAc, 1:1).
[000225] Anidrido acético (13 ml, 137 mols, 1,05 equiv) é adicionado (em 15 minutos) a uma suspensão de 3,5-dimetoxianilina (20 g, 131 mols) em tolueno (110 mL), mantendo a temperatura interna na faixa de 35-45°C. A mistura reacional é permitida agitar durante 20 horas em temperatura ambiente. A suspensão grossa, cinza resultante é diluída com hexano (55 mL) e filtrada. O resíduo no filtro é lavado com tolue- no/Hex (2:1, 70 mL) e Hex, e secado para fornecer 0 composto do título como um sólido branco. API-ES-MS: 196,1 [MH]+, ÍR = 3,03 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000226] Fosgênio (20% em tolueno, 1 mL, 2,0 mols, 2,4 equiv) é adicionado a uma solução de 2,6-dicloro-3,5-dimetoxianilina (221 mg, 1,0 mmols, 1,2 equiv) em dioxano (2,5 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 1 hora, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. O iso- cianato resultante é adicionado a uma solução de N-metil-N'-[3-(4- metil-piperazin-1-ilmetil)-fenil]-pirimidina-4,6-diamina (Etapa 2,1) (259 mg, 0,83 mmols) em tolueno (5 mL), em refluxo e sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada em refluxo durante 3 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) proporciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 560,0/562,0 [MH]+; ÍR = 3,26 min (pureza: 99%, sistema 1); TLC: Rf = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000227] Uma mistura de (6-cloro-pirimidin-4-il)-metil-amina (385 mg, 2,68 mmols, 1,1 equiv), 3-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-fenilamina (500 mg, 2,44 mmols) e 4N de HCI em dioxano (7 mL) é aquecida em um tubo selado a 150°C durante 17,5 horas. O solvente é removido e o resíduo diluído com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCO3. A camada aquosa é separada e extraída com DCM e DCM/MeOH (95:5). A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por sílica-gel MPLC (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) proporciona o composto do título como um sólido bege: ESI-MS: 313.2 [MH]+; ÍR = 1,00 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,05 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000228] Uma suspensão de 1-metil-4-(3-nitro-benzil)-piperazina (6,9 g, 29,14 mmols) e Níquel raney (2 g) em MeOH (150 mL) é agitada durante 5 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 206,1 [MH]+.
[000229] Uma mistura de 3-nitrobenzilcloreto (5 g, 29,14 mols), N- metilpiperazina (3,9 mL, 34,97 mols, 1,2 equiv), carbonato de potássio (8 g, 58,28, 2 equiv), e acetona (100 ml) é agitada durante 15 horas em refluxo. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por MPLC em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar o composto do título como um óleo marron: ESI-MS: 236,0 [MH]+; ÍR = 1,40 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,31 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000230] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 559,9/561,9 [MH]+; ÍR = 3,75 minutos (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 92:8).
[000231] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 313,2 [MH]+; ÍR = 1,20 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,10 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000232] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,2: API-MS: 206,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,31 (DCM/EtOH, 9:1).
[000233] Uma mistura de 1-fluoro-3-nitrobenzeno (3,2 mL, 29,7 mols) e N-etil-piperazina (7,6 mL, 59,4 mols, 2 equiv) é aquecida em refluxo e agitada durante 117 horas. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente e diluída com H2O (40 mL) e DCM/MeOH (9:1, 80 mL). A camada aquosa é separada e extraída com DCM/MeOH (9:1). A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2S©4), filtrada e concentrada. A purificação do produto bruto por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 1:0 (95:5) proporciona o composto do título como um óleo marrom: ESI-MS: 236,0 [MH]+; ÍR = 2,49 minu-tos (pureza: 99%, sistema 1); TLC: Rf = 0,26 (DCM/MeOH, 95:5).
[000234] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 577,0/579,0 [MH]+; ÍR = 3,53 minutos (pureza: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,40 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7). Etapa 4.1: N-metil-N'-[4-(2-morfolin-4-il-etóxi)-fenill-pirimidina-4,6-diamina
[000235] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 330,2 [MH]+; tR = 1,10 minuto (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,16 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000236] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 553,9/555,9 [MH]+; ÍR = 5,16 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000237] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 307,2 [MH]+; ÍR = 3,72 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000238] Uma suspensão de 1-[6-(4-benzilóxi-fenilamino)-pirimidin-4- il]-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-fenil)-1 -metil-uréia (Exemplo 5) (67 mg, 0,121 mmols), paládio em carbono (20 mg), e MeOH (3,5 mL) é agitada durante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel para fornecer o composto do título como um sólido marrom: ESI-MS: 464,2/466,2 [MH]+; tR = 3,91 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000239] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 526,1/528,1 [MH]+; ÍR = 3,12 minutos (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000240] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 299,1 [MH]+; ÍR = 1,00 minuto (pureza: >95%, sistema 1).
[000241] Uma suspensão de 1-etil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (6,2 g, 26,35 mols) e Níquel raney (2 g) em MeOH (120 mL) é agitada durante 7 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um sólido violeta: ESI-MS: 206,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000242] Uma mistura de 1-bromo-4-nitrobenzeno (6 g, 29,7 mmols) e 1 -etilpiperazina (7,6 mL, 59,4 mmols, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 15 horas. Depois de resfriar em temperatura ambiente, a mistura reacional é diluída com água e DCM/MeOH, 9:1. A camada aquosa é separada e extraída com DCM/MeOH, 9:1. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (sulfato de sódio), filtrada e concentrada. A purificação do resíduo através de cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1) proporciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 236,0 [MH]+; ÍR= 2,35 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,50 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1).
[000243] HCI (91 mL, 360 mols, 8 equiv, 4N em dioxano) é adicionado gota a gota a uma solução resfriada (10°C) terc-butil éster de ácido (2-cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-carbâmico (13,8 g, 45,7 mmols) em dioxano (150 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente, agitada durante 24 horas e concentrada. O resíduo é diluído com EtOAc, lavado com uma solução aquosa saturada de NaHCO3, e salmoura, secado (Na2SO4), filtrado e concentrado. O resíduo é purificado por cristalização a partir de DCM/Hex para proporcionar o composto do título. ESI-MS: 202,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,37 (DCM).
[000244] Uma solução de sulfurilcloreto (6,7 ml, 79,8 mols, 1,05 equiv) em DCM (140 mL) é adicionada gota a gota (75 minutos) a uma solução resfriada (-15°C) de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-2- metil-fenil)-carbâmico (20,4 g, 76,3 mols) em THF (330 ml), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida agitar durante 3 horas a -15°C e em seguida vertida sobre uma mistura de gelo/H2O (400 mL), uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (400 ml), e EtOAc (400 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 200 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 200 mL) e salmoura (200 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por trituração em dietil éter seguido por cromatografia de coluna em sílica-gel (Hex/acetona, 95:5) para proporcionar 0 composto do título. ESI-MS: 302,2 [MH]+, TLC: Rf = 0,13 (Hex/acetona, 9:1).
[000245] Uma solução de terc-butilítio (200 mL, 340 mols, 2,4 equiv, 1,7M em pentano) é adicionada gota a gota a uma solução resfriada (- 65°C) solução de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-fenil)- carbâmico (36,1 g, 142 mols) em THF (250 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é agitada durante 15 minutos a -65°C e em seguida permitida aquecer a -25°C. Uma solução de metiliodeto (10,7 mL, 171 mols, 1,2 equiv) em THF (140 mL) é em seguida adicionada. A mistura reacional é permitida agitar durante 1 hora a -25°C e em seguida vertida sobre uma mistura de gelo/H2O (300 mL) e EtOAc (300 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 150 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 150 mL) e salmoura (200 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (Hex/acetona, 95:5 (9:1 (4:1) para fornecer 0 composto do título. ESI-MS: 268,1 [MH]+, TLC: Rf = 0.25 (Hex/acetona, 9:1).
[000246] Uma solução de di-terc-butil-dicarbonato (145 g, 651 mols, 1,3 equiv) em THF (200 mL) é adicionada gota a gota a uma solução de 3,5-dimetoxianilina (78,2 g, 500 mols) em THF (1,5 L) em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é aquecida em refluxo durante 4,5 horas (sob aquecimento evolução de gás considerável é observada), permitida resfriar em temperatura ambiente e concentrada. O resíduo é diluído com EtOAc (800 mL) e H2O (800 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 200 mL). A fase orgânica combinada é lavada com 0,1N de HCI (200 mL), H2O, e salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é cristalizado a partir de DCM/Hex para fornecer 0 composto do título. ESI-MS: 252,1 [M-H]’, TLC: Rf = 0,34 (Hex/EtOAc, 3:1).
[000247] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 540,1/542,1 [MH]+; ÍR= 3,56 minutos (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000248] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 515,2/517,2 [MH]+; tR = 3,47 min (pureza: >95%, sistema 1).
[000249] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 288,2 [MH]+; ÍR= 0,95 min (pureza: 95%, sistema 1).
[000250] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,2: ESI-MS: 181,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,18 (DCM/MeOH, 7:3).
[000251] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 570,0 [MH]+; ÍR= 3,20 minutos (pureza: 90%, sistema 1), TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000252] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 343,2 [MH]+; ÍR= 1,00 minuto (pureza: 95%, sistema 1), TLC: Rf = 0,23 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1). Exemplo 11: 3-(2-Cloro-6-iodo-3,5-dimetóxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin- 1 -il)-fenilamino}-pirimidin-4-il}-1 -metil-uréia
[000253] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 651,8/653,7 [MH]+; ÍR = 3,20 minutos (pureza: 95%, sistema 1), TLC: Rf = 0,18 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000254] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 313,2 [MH]+; ÍR = 1,10 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,21 (DCM/MeOH, 93:7).
[000255] HCI (6,46 mL, 26 mols, 9,1 equiv, 4N em dioxano) é adicionado a uma solução resfriada (10°C) de terc-butil éster de ácido (2- cloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-carbâmico (1,28 g, 2,85 mols, 92% pureza) em dioxano (10 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente e em seguida agitada durante 1,5 hora. O resíduo é diluído com EtOAc e gelo/água, e tornado básico por adição de uma solução aquosa saturada de NaHCO3. As camadas são separadas. A camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM) para proporcionar o composto do título. API- ES-MS: 314,0 [MH]+, TLC: Rf = 0,53 (DCM).
[000256] Uma solução de sulfurilcloreto (0,92 ml, 11,0 mols, 1,16 equiv) em DCM (20 mL) é adicionada gota a gota (30 min) a uma solução fria (-15°C) de terc-butil éster de ácido (2-iodo-3,5-dimetóxi-fenil)- carbâmico (3,6 g, 9,49 mols) em THF (48 ml), sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é permitida agitar durante 1 hora a -15°C e em seguida vertida sobre uma mistura de gelo/H2O (100 mL), uma solução aquosa saturada de NaHCOs (80 ml), e EtOAc (100 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 100 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 60 mL) e salmoura (60 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM) seguido por cristalização a partir de DCM/Hex para proporcionar 0 composto do título. ESI-MS: 411,9, 413,9 [M-H]; TLC: Rf = 0,18 (DCM/Hex, 7:3).
[000257] Uma solução de terc-butilítio (14,1 mL, 24 mols, 2,4 equiv, 1,7M em pentano) é adicionada gota a gota (15 minutos) a uma solução fria (-65°C) de terc-butil éster de ácido (3,5-dimetóxi-fenil)- carbâmico (2,53 g, 10 mols) em THF (18 mL), sob uma atmosfera de argônio. A mistura é agitada durante 15 minutos a -65°C e em seguida permitida aquecer a -25°C. Um excesso de trifluorometiliodeto é borbulhado na mistura reacional amarela. A mistura escura resultante é vertida sobre uma mistura de gelo/H2O (60 mL) e EtOAc (60 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 30 mL). A fase orgânica combinada é lavada com H2O (3 x 40 mL), e sal-moura (60 mL), secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/Hex, 2:1) para fornecer 0 composto do título. ESI-MS: 380,1 [MH]+, TLC: Rf = 0,27 (DCM/Hex, 2:1).
[000258] Uma solução de di-terc- butil-dicarbonato (69,5 g, 312 mols, 1,3 equiv) em THF (100 mL) é adicionado a uma solução de 3,5- dimetoxianilina (37,5 g, 240 mols) em THF (600 mL). A mistura reacional é aquecida em refluxo durante 3 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, agitada durante a noite, e concentrada. O resíduo é dividido entre EtOAc (500 mL) e H2O (500 mL). As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc (2 x 100 mL). A fase orgânica combinada é lavada com 0,1N de HCI (2 x 100 mL), H2O e sal-moura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por trituração com hexano para proporcionar 0 composto do título. ESI- MS: 254,1 [MH]+, TLC: Rf = 0,42 (Hex/EtOAc, 3:1).
[000259] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1: ESI-MS: 554,0/555,0 [MH]+; ÍR = 3,49 minutos (pureza: >95%, sistema 1), TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000260] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 288,2 [MH]+; ÍR = 0,95 min (pureza: 95%, sistema 1).
[000261] Uma suspensão de 1-isopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (5,18 g, 20,80 mols) e 5% de paládio em carbono (0,5 g) em MeOH (100 mL) é agitado durante 2,7 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar 0 composto do título como um sólido violeta: ESI-MS: 220,1 [MH]+; ÍR = 0,95 min (sistema 1).
[000262] Uma mistura de 1-bromo-4-nitrobenzeno (6 g, 29,7 mols) e 1 -etilpiperazina (7,6 ml, 59,4 mols, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 15 horas. Depois de resfriar em temperatura ambiente a mistura reacional é concentrada. A purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 95:5) proporciona 0 composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 250,1 [MH]+; ÍR= 2,57 minutos (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,16 (DCM/MeOH, 95:5).
[000263] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 621,9/623,9 [MH]+; ÍR = 4,04 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000264] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 375,1 [MH]+; ÍR = 2,36 minutos (pureza: 95%, sistema 1).
[000265] Pó de férro (5,4 g, 97 mols, 4 equiv) é adicionado porção a porção a uma mistura a 80°C de 1-benzil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (7,2 g, 24,2 mols), EtOH (150 mL), H2O (40 mL), e AcOH (20 mL). A mistura reacional é agitada durante 1,75 hora a 80°C, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada. O resíduo é diluído com EtOAc e uma solução saturada aquosa de Na2CO3. As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada para proporcionar o composto do título: ES-MS: 268,3 [MH]+; único pico em ÍR = 1,30 minuto (sistema 1).
[000266] Uma mistura de 1-bromo-4-nitrobenzeno (5 g, 24,8 mols) e 1-benzilpiperazina (8,6 ml, 49,5 mols, 2 equiv) é aquecida a 80°C durante 17 horas. A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, e é diluída com DCM/H2O. As camadas são separadas e a fase aquosa é extraída com DCM. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. A purificação do resíduo por cromatografia de coluna em silica-gel (Hex/EtOAc, 1:1) proporciona o composto do título como um sólido amarelo: ESI-MS: 298,3 [MH]+; ÍR= 3,25 minuto (pureza: 100%, sistema 1).
[000267] Uma suspensão de 1-{6-[4-(4-benzil-piperazin-1-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetóxi-6-metil-fenil)-1- metil-uréia (100 mg, 0,161 mmols) (Exemplo 13), paládio em carbono (30 mg), MeOH (6 mL), e HCI (37%, 16 pL) é agitado durante 5 dias em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/2N de NH3 em MeOH, 95:5) proporciona 0 composto do título como um sólido bege: ESI-MS: 532,0/534,0 [MH]+; ÍR = 3,39 min (pureza: 100%, sistema 1).
[000268] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 485,0/487,0 [MH]+; ÍR = 3,69 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000269] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 540,0/542,0 [MH]+; ÍR = 3,74 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000270] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 541,0/543,0 [MH]+; ÍR = 3,66 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000271] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 314,1 [MH]+; ÍR= 1,15 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 9:1). Etapa 17.2: 4-(2-Pirrolidin-1-il-etóxi)-fenilamina
[000272] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,2: ESI-MS: 207,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,22 (DCM/MeOH, 1:1).
[000273] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 578,9/580,9 [MH]+; ÍR= 3,96 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,38 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 92:8).
[000274] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 332,2 [MH]+; ÍR= 1,30 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,37 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 99:1).
[000275] Uma suspensão de 1-[2-(2-fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil]-pirroli- dina (1,25 g, 4,92 mols) e 10% de paládio em carbono (0,2 g) em EtOH (20 mL) é agitada durante 1 hora em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo marrom: ESI-MS: 225,1 [MH]+; ÍR= 0,80 min (sistema 1).
[000276] Cloridrato de 1-(2-Cloro-etil)-pirrolidina (1,2 g, 7,0 mols, 1,1 equiv) é adicionado a uma suspensão de 2-fluoro-4-nitrofenol (1 g, 6,4 mols) e carbonato de césio (5,2 g, 15,9 mmols, 2,5 equiv) em DMF (20 mL). A mistura resultante é aquecida a 80°C e agitadau durante 18 horas. Cloridrato de 1-(2-cloro-etil)-pirrolidina adicional (1 g) é adicionado e a mistura é agitada durante 3 horas a 80°C. A mistura reacional é resfriada em temperatura ambiente, diluída com EtOAc e H2O. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com H2O, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para fornecer 0 composto do título como um sólido amarelo. ESI-MS: 255,1 [MH]+; ÍR= 2,57 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,55 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000277] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 558,9/560,9 [MH]+; ÍR= 3,85 min (pureza: 100%, sistema 1); TLC: Rf = 0,14 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000278] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 312,2 [MH]+; tR = 1,3 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,27 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 92:8).
[000279] Uma suspensão de 1-etil-4-(4-nitro-fenil)-piperidina (0,8 g, 4,92 mols) e 10% de paládio em carbono (0,1 g) em EtOH (10 mL) é agitada durante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para fornecer 0 composto do título. ESI-MS: 205,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,29 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000280] Triacetoxiboroidreto de sódio (3,1 g, 14,6 mols, 3 equiv) é adicionado a uma solução fria (5°C) de 4-(4-nitro-fenil)-piperidina (1 g, 4,9 mols) e acetaldeído (0,82 mL, 14,6 mols, 3 equiv) em DCM (20 mL). A mistura reacional é agitada durante 1 hora a 5°C e em seguida diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 98:2) para fornecer o composto do título como um óleo amarelo. ESI-MS: 235,1 [MH]+; ÍR = 2,64 minutos (pureza: 85%, sistema 1); TLC: Rf = 0,14 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 98:2).
[000281] Uma solução de H2SO4 concentrada (2,65 mL) em AcOH (40 mL) e uma solução de HNO3 concentrado (2,1 mL) em AcOH (20 mL) são adicionadas sequencialmente e gota a gota a uma solução de 4-fenilpiperidina em AcOH (40 mL), mantendo-se a temperatura abaixo de 20°C. Em seguida, H2SO4 concentrado (40 mL) é adicionado (nenhum resfriamento aplicado; temperatura interna alcança 60°C). A mistura reacional é permitida resfriar em temperatura ambiente, vertida sobre gelo/água (100 g), neutralizada por adição de NaHCOs sólido (150 g), e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado através de trituração em Et2θ para proporcionar 0 composto do título como um sólido amarelo. ESI-MS: 207,1 [MH]+; ÍR = 2,42 minutos (sistema 1).
[000282] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 573,9/575,9 [MH]+; ÍR = 3,69 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000283] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 327,2 [MH]+; ÍR= 1,5 minuto (sistema 1).
[000284] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: ESI-MS: 578,9/580,9 [MH]+; ÍR= 3,79 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000285] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2.1: ESI-MS: 332,2 [MH]+.
[000286] Uma suspensão de 1-[2-(3-fluoro-4-nitro-fenóxi)-etil]-pirroli- dina (1,96 g, 7,7 mols) e 10% de paládio em carbono (0,2 g) em MeOH (40 mL) é agitada durante 0,5 hora em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para fornecer o composto do título. ESI-MS: 225,1 [MH]+; tR = 0,95 min (sistema 1).
[000287] Cloridrato de 1-(2-Cloro-etil)-pirrolidina (2,6 g, 15,4 mols, 1,3 equiv) é adicionado a uma mistura de 2-fluoro-4-nitrofenol (1,84 g, 11,7 mols) e carbonato de césio (9,1 g, 27,9 mols, 2.5 equiv) em DMF (40 mL). A mistura resultante é aquecida a 80°C e agitada durante 3 horas. A mistura reacional é resfriada em temperatura ambiente, em seguida diluída com DCM e H2O. As camadas são separadas e a camada aquosa é extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3) para fornecer 1,96 g do composto do título como um sólido amarelo escuro. ESI-MS: 255,1 [MH]+; ÍR = 2,55 minutos (pureza: 93%, sistema 1); TLC: Rf = 0,40 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000288] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 API-MS: 589,9/591,8 [MH]+; ÍR = 3,59 minutos (sistema 1); TLC: Rf = 0,13 (DCM/MeOH + 0,5% NH3aq, 95:5).
[000289] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 343,2 [MH]+; ÍR = 1,30 minuto (sistema 1).
[000290] Uma suspensão de 1-etil-4-(3-metóxi-4-nitro-fenil)-pipera- zina (4 g, 15,1 mols) e Níquel raney (1 g) em MeOH (80 mL) é agitada durante 10,5 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo marrom: ESI-MS: 236,2 [MH]+; ÍR = 0,95 min (sistema 1).
[000291] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 248,3: ESI-MS: 266,1 [MH]+.
[000292] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 233: API-MS: 587,8/589,8 [MH]+; ÍR = 3,58 minutos (pureza: 94.8%, sistema 1); TLC: Rf = 0,47 (DCM/2N NH3 em MeOH, 9:1).
[000293] Anidrido propilfosfònico (50% em DMF, 2,72 mL, 4,7 mols, 2 equiv) é adicionado a uma solução de ácido 4-(6-metilamino-pirimidin- 4-ilamino)-benzóico (0,570 g, 2,33 mols), N-etil-piperazina (0,33 mL, 2,57 mols, 1,1 equiv), DMAP (7 mg), e Et3N (3,3 mL, 23,3 mols, 10 equiv) em DMF (25 mL), em temperatura ambiente e sob uma atmosfera de argônio. A mistura reacional é agitada em temperatura ambiente durante 1 hora, diluída com EtOAc e lavada com H2O. A camada aquosa é extraída com EtOAc. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM (DCM/2N NH3 em MeOH, 86:14) para fornecer 0 composto do título como uma espuma amarela: ES-MS: 341,2 [MH]+; ÍR = 1,00 minuto (sistema 1); Rf = 0,33 (CH2CI2/2 N NH3 em MeOH, 9:1).
[000294] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1: ESI-MS: 245,0 [MH]+; ÍR = 1,58 minuto (sistema 1).
[000295] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2: API-MS: 577,9/579,9 [MH]+; ÍR = 3,87 minutos (pureza: 90%, sistema 1); TLC: Rf = 0,20 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000296] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2.1, porém agitando a mistura reacional durante 15 minutos a 160°C em um mecanismo de microonda. O produto bruto é purificado por trituração em EtOAc para proporcionar 0 composto do título: ESI-MS: 331,2 [MH]+.
[000297] Uma suspensão de 1-etil-4-(2-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina (1,24 g, 15,1 mols) e Níquel raney (13 mg) em MeOH (6 mL) é agitada durante 17 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada para proporcionar o composto do título como um óleo roxo: ESI-MS: 224,1 [MH]+; tR = 0,90 min (sistema 1).
[000298] N-Etilpiperazina (0,96 mL, 7,6 mols, 1,2 equiv) é adicionado a uma mistura de 3,4-difluoronitrobenzeno (0,7 mL, 6,32 mols) e carbonato de potássio (1,74 g, 12,6 mols, 2 equiv) em DMF (10 mL). A mistura reacional é agitada a 90°C durante 17 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, diluída com H2O e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica- gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3) para fornecer 0 composto do título como um sólido amarelo: ES-MS: 254,1 [MH]+; ÍR = 2,65 minutos (sistema 1); Rf = 0,30 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 93:7).
[000299] Fosgênio (20% em tolueno, 0,54 mL, 1,0 mmols, 2,0 equiv) é adicionado a uma solução de 2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometila- nilina (156 mg, 0,60 mmols, 1,2 equiv) em dioxano (2 mL), sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 75 minutos, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. O sólido resultante 2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluo- rometil-fenilisocianato é adicionado porção a porção a uma solução de ebulição de N-[4-(4-etil-piperazin-1 -il)-fenil]-N'-metil-pirimidina-4,6-dia- mina (156 mg, 0,50 mmols; preparação veja Etapa 25.5) em 6 ml de tolueno sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional é agitada a 110°C durante 3,3 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A camada aquosa é separada e extraída duas vezes com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. Trituração do sólido resultante com 2 porções de MeOH produz o composto do título: ESI-MS: 598/600 [MH]+; ÍR = 5,1 minutos (pureza: 97%, sistema 1).
[000300] Uma solução a 2M de KOH em água (1,87 mL) é adicionada a uma solução de N-(2,4-dicloro-5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)- acetamida (104 mg, 0,344 mmols) em EtOH (3 mL). Depois de agitar durante 3,5 horas a 80°C seguido por resfriamento em temperatura ambiente, o solvente é evaporado e o resíduo é apreendido em EtOAc e uma solução aquosa saturada de NaHCOa. A camada aquosa separada é extraída duas vezes com EtOAc. As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (Na2SO4), filtradas e concentradas, forne-cendo o composto do título: ESI-MS: 258/260 [M-H]-; ÍR = 4,8 minutos (sistema 1); TLC: Rf = 0,54 (EtOAc).
[000301] Uma solução de N-(5-metóxi-3-trifluorometil-fenil)-acetami- da (233 mg, 1,0 mmols) sob uma atmosfera de nitrogênio é resfriada em um banho de gelo (precipitação). Em seguida 1,93 mL de uma solução de 1M de SO2CI2 em DCM são adicionados. Depois de 2 horas, outro 1,93 mL da solução de SO2CI2 são adicionados e agitação é continuado durante totalmente 4 horas a 0°C. A suspensão é diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A fase inorgânica separada é extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com água e salmoura, secadas (Na2SO4), filtradas e concentradas. Cromatografia de coluna (hexano/EtOAc, 7:3) fornece 0 composto do título: mp: 143-144°C; API-MS: 300/302 [M-H]-; TLC: Rf = 0,23 (Hex/EtOAc, 1:1); 1H-NMR (DMSO-de) δ 2,13 (s, H3C), 3,88 (s, H3C), 7,84 (s, Hfenii), 9,81 (s, HN).
[000302] Anidrido acético (1,22 ml, 12,8 mols) é adicionado durante 10 minutos a uma solução de 5-metóxi-3-trifluorometil-anilina (2,29 g, 12,0 mols) em tolueno (10 ml) a uma temperatura de 25-33°C. Depois de 90 minutos em temperatura ambiente, hexano (10 ml) é adicionado e a suspensão é agitada durante 20 minutos. Filtração, lavagem com tolueno/hexano 2:1 e hexano produz o composto do título: mp: 123- 124°C; API-MS: 234 [MH]+; TLC: Rf = 0.27 (Hex/EtOAc, 1:1).
[000303] Hidrogenação de uma solução de 3-metóxi-5-nitrobenzo- trifluoreto (6,19 g, 28 mols) em MeOH (140 ml) na presença de Pd-C (0,62 g, 10%), remoção do catalisador por filtração e concentração em vácuo do filtrado resultante produz o composto do título: API-MS: 190 [M-H]-; TLC: Rf = 0,7 (EtOAc).
[000304] Uma mistura de 4-(4-etilpiperazin-1-il)-anilina (1 g, 4,88 mmols) (preparado em analogia ao Exemplo 238, Etapa 238,1), (6- cloro-pirimidin-4-il)-metil-amina (1,81 g, 12,68 mols, 1,3 eq.) e 4N de HCI em dioxano (15 ml) é aquecida em um tubo selado a 150°C durante 5 horas. A mistura reacional é concentrada, diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio. A camada aquosa é separada e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (sulfato de sódio), filtrada e concentrada. Purificação do resíduo por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH, 93:7) seguido por trituração em dietil éter proporciona o composto do título como um sólido branco: ESI-MS: 313,2 [MH]+; ÍR= 1,10 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,21 (DCM/MeOH, 93:7).
[000305] Fosgênio (20% em tolueno, 1,62 mL, 3,0 mols, 2,0 equiv) é adicionado a uma solução de 5-metóxi-3-trifluorometilanilina (344 mg, 1,8 mmols, 1.2 equiv) em dioxano (6 mL) sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura é aquecida em refluxo, agitada durante 80 minutos, permitida resfriar em temperatura ambiente, e concentrada em vácuo. Durante 45 min, uma solução concentrada do 5-metóxi-3-trifluorometil- fenilisocianato oleoso resultante em tolueno é adicionado porção a porção para uma solução de ebulição de N-[4-(4-etil-piperazin-1-il)- fenil]-N'-metil-pirimidina-4,6-diamina (468 mg, 1,50 mmols; Etapa 242,1) em 18 ml de tolueno sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura reacional é agitada a 110°C durante 4 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, e diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A camada aquosa é separada e extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (N32SO4), filtradas e concentradas. Cromatografia de coluna (DCM/MeOH, 49:1 24:1) fornece o composto do título: API-MS: 530/532 [MH]+; TLC: Rf = 0,4 (DCM/MeOH, 9:1); tR = 4,3 minutos (pureza: 100%, sistema 1).
[000306] Porções de 0,4 mL de uma solução a 1M de SO2CI2 em DCM são adicionadas repetidamente durante um período de 27 horas a uma suspensão resfriada com gelo de 3-(5-metóxi-3-trifluorometil- fen i I)-1 -{6-[4-(4-etil-piperazin-1 -i l)-fen i Iam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil- uréia (105 mg, 0,20 mmols) (Exemplo 26) em acetonitrila (6 mL). A reação é seguida por análise de HPLC. A mistura reacional (ainda contendo material de partida) é diluída com DCM e uma solução aquosa saturada de NaHCOs. A camada aquosa é separada e extraída duas vezes com DCM. As fases orgânicas são lavadas com salmoura, secadas (Na2SO4), filtradas e concentradas. MPLC de fase reversa (H2O/CH3CN + 0,1% de TFA) produz, depois da neutralização do produto contendo frações com NaHCO3, concentração parcial e extração com DCM, 0 composto do título: API-MS: 564/566 [MH]+; TLC: Rf = 0,28 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5); 1H-NMR (DMSO-d6) δ 1,02 (t, H3C), 2,37 (q, H2C), 2,51 (m, 4H), 2,92 (m, 4H), 3,33 (s, H3C), 3,82 (s, H3C), 6,48 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 7,12 (d, 1H), 7,43 (m, 2H), 7,59 (s, 1H), 7,82 (s, 1H), 8,55 (s, 1H), 9,66 (s, HN), 12,33 (s, HN).
[000307] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 (1 hora 20 minutos agitando em refluxo): ESI-MS: 593,8/595,8 [MH]+; ÍR = 3,80 min (pureza: 95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,45 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000308] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1: ESI-MS: 347,1/349,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,15 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000309] Uma suspensão de 1-(3-cloro-4-nitro-fenil)-4-etil-piperazina (1 g, 3,7 mols) e Níquel raney (0,1 g) em MeOH (20 mL) é agitada durante 8 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em síli- ca-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar 0 composto do título como um sólido quase branco: ESI-MS: 240,1/242,1 [MH]+; tp = 0,90 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,46 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000310] N-Etilpiperazina (4,3 mL, 34,3 mmols, 1,2 equiv) é adicionado a uma mistura de 2-cloro-4-fluoronitrobenzeno (5 g, 28,6 mmols) e carbonato de potássio (7,9 g, 57,1 mols, 2 equiv) em DMF (50 mL). A mistura reacional é agitada a 100°C durante 6 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, diluída com H2O e extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado através de trituração em dietil éter para fornecer 5,6 g do composto do título como um sólido amarelo: ES- MS: 270,0 [MH]+; ÍR= 2,90 min (sistema 1).
[000311] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 2 (1 hora agitando em refluxo, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair 0 produto): ESI-MS: 577,9/579,9 [MH]+; ÍR= 4,00 minutos (pureza: >95%, sistema 1); TLC: Rf = 0,35 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 97:3).
[000312] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 2,1, porém agitando a mistura reacional durante 1 hora a 160°C em um mecanismo de microonda e utilizando EtOAc em vez de DCM para extrair 0 produto. Composto do título: ESI- MS: 331,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,10 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000313] Uma suspensão de 1-etil-4-(3-fluoro-4-nitro-fenil)-piperazina (7 g, 27,7 mols) e Pd (10%) em carbono (0,35 g) em MeOH (140 mL) é agitada durante 3 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para proporcionar o composto do título como um sólido branco: ESI-MS: 224,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,54 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000314] N-Etilpiperazina (4,8 mL, 37,7 mols, 1,2 equiv) é adicionada a uma mistura de 2,4-difluoronitrobenzeno (5 g, 31,4 mols) e carbonato de potássio (8,7 g, 62,9 mols, 2 equiv) em DMF (50 mL). A mistura reacional é agitada a 100°C durante 6 horas, permitida resfriar em temperatura ambiente, diluída com H2O e extraída com EtOAc. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5) para fornecer 0 composto do título como um óleo amarelo: ES-MS: 254,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,67 (DCM/MeOH + 1% NH3aq, 95:5).
[000315] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1 (2 equiv de fosgénio para a formação de isocianato, 16 horas agitando a 70°C na etapa subsequente, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair 0 produto): ESI-MS: 574,8/576,8 [MH]+; tR = 3,32 minutos (sistema 1); TLC: Rf = 0,10 (DCM/Me- OH/NH3aq, 94:5:1).
[000316] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1. Composto do título: ESI-MS: 328,2 [MH]+.
[000317] Uma mistura de pó de férro (1,4 g, 25,3 mols, 4 equiv), 1- isopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (1,58 g, 6,32 mols), EtOH (20 mL), H2O (5 mL), e AcOH (2,5 mL) é agitado durante 2 horas a 90°C, permitida resfriar em temperatura ambiente, baseficada por adição de amónio aquoso, filtrada através de uma almofada de celite e parcialmente concentrada para remover EtOH. O resíduo aquoso é saturado com cloreto de sódio e extraído com EtOAc e DCM. A fase orgânica combinada é lavada com salmoura, secada (Na2SO4), filtrada e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica- gel (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1) para proporcionar o composto do título como um sólido roxo: ESI-MS: 221,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,.20 (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1).
[000318] N-lsopropilpiperazina (1,8 mL, 12,7 mols, 2 equiv) é adicionada a uma mistura fria (5°C) de 2-cloro-5-nitropiridina (1 g, 6,3 mols) em DCM (5 mL). A mistura reacional é permitida aquecer em temperatura ambiente, agitada durante 16 horas, diluída com DCM/H2O e extraída com DCM. A fase orgânica é lavada com salmoura, secada (Na2SÜ4), filtrada e concentrada para fornecer 0 composto do título como um sólido amarelo: ES-MS: 251,2 [MH]+; tR = 2,20 min (sistema 1).
[000319] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito no Exemplo 1 (2 equiv de fosgênio para a formação de isocianato, 4 horas agitando em refluxo na etapa subsequente, e EtOAc utilizado em vez de DCM para extrair 0 produto): ESI-MS: 560,8/562,8 [MH]+; tR = 3,20 min (sistema 1); TLC: Rf = 0,35 (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1).
[000320] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 1,1. Composto do título: ESI-MS: 314,2 [MH]+; TLC: Rf = 0,20 (DCM/MeOH/NH3aq, 91:8:1).
[000321] Uma suspensão de 1-etil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina (1,4 g) e níquel raney (140 mg) em MeOH (30 mL) é agitada durante 10 horas em temperatura ambiente, sob uma atmosfera de hidrogênio. A mistura reacional é filtrada através de uma almofada de celite e concentrada. O resíduo é purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1) para proporcionar o composto do título como um óleo roxo: ESI-MS: 207,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,26 (DCM/MeOH/NH3aq, 94:5:1).
[000322] O composto do título é preparado em analogia ao procedimento descrito na Etapa 30.3, porém utilizando N-etilpiperazina. O composto do título: ES-MS: 237,1 [MH]+; TLC: Rf = 0,25 (DCM/MeOH/NH3aq, 96:3:1).
[000323] 5000 cápsulas de gelatina macias, cada qual compreendendo como ingrediente ativo 0,05 g de qualquer um dos compostos da Fórmula IA mencionados em qualquer um dos Exemplos anteriores 1 a 29 ou são preparadas como segue: Composição Ingrediente ativo 250 g Lauroglicol 2 litros Processo de preparação: O ingrediente ativo pulverizado é suspenso em Lauroglikol * (laurato de propileno glicol, Gattefossé S.A, Saint Priest, France) e moído em um pulverizador úmido para produzir um tamanho de partícula de cerca de 1 a 3 pm. Porções de 0,419 g da mistura são em seguida introduzidas em cápsulas de gelatina macias utilizando uma máquina de carga de cápsula.
[000324] Comprimidos, compreendendo, como ingrediente ativo, 100 mg de qualquer um dos compostos da Fórmula IA em qualquer um dos Exemplos anteriores 1 a 29 são preparados com a seguinte composição, seguindo procedimentos padrões:
Fabricação: O ingrediente ativo é misturado com os materiais de veículo e comprimidos por meio de uma máquina de comprimido (Korsch EKO, diâmetro do rótulo 10 mm). AviceF is microcrystalline cellulose (FMC, Philadelphia, USA). PVPPXL is polyvinil-polypyrrolidone cross-linked (BASF, Germany). Aerosil® is silicon dioxide (Degussa, Germany).
Claims (5)
1. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em: 1-[6-(4-benziloxi-fenilamino)-pirimidin-4-il]-3-(2,6-dicloro-3,5- dimetoxi-fenil)-1-metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-[6-(4-hidroxi-fenilamino)- pirim id in-4-i I]-1 -metil-ureia, 1 -{6-[4-(4-benzil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-3- (2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -metil-1 -[6-(4-piperazin-1 - il-fenilamino)-pirimidin-4-il]-ureia, 3-(2,6-d icloro-3,5-d imetoxi-fen i I)-1 -{6-[2-f luoro-4-(2- pirrolidin-1 -il-etoxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1- il)-2-metoxi-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1- il)-3-fluoro-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(5-metoxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[3-cloro-4-(4-etil- piperazin-1 -i l)-fen i lam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 1-{6-[2-cloro-4-(4-etil-piperazin-1-il)-fenilamino]-pirimidin-4- il}-3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-feniI )-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1- il)-2-fluoro-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 1-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-3-{6-[4-(4-etil-piperazin- 1 -il)-fenilamino]-pirimidin-4-iI}- ureia 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin- 1 -i l)-fen i lam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(2-dimetilamino- etoxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-metil-(6-{4-[2-(4- metil-piperazin-1 -il)-etoxi]-fenilamino}-pirimidin-4-il)-ureia, 3-(2-cloro-6-iodo-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin- 1 -i l)-fen i lam ino}-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(4-isopropil- piperazin-1 -i l)-fen i lam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-[6-(3- dimetilaminometil-fenilamino)-pirimidin-4-il]-1-metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[3-(4-etil-piperazin- 1 -i l)-fen i lam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[4-(2-pirrolidin-1-il- etoxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2-cloro-3,5-dimetoxi-6-metil-fenil)-1-{6-[3-fluoro-4-(2- pirrolid in-1 -il-etoxi)-fen ilamino]-pirimid in-4 -iI}-1 -metil-ureia, 3-(2,4-dicloro-5-metoxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil- piperazin-1 -i l)-fen i lam ino]-pirim id in-4-i I}-1 -metil-ureia, 3-(5-metoxi-3-trifluorometil-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazin-1- il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 1-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-3-{6-[4-(2-morfolin-4-il- etoxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -metil-1 -{6-[3-(4-metil- piperazin-1 -ilmetil)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[3-(4-etil-piperazin-1- il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-metil-1-{6-[4-(2-morfolin- 4-il-etoxi)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -{6-[4-(1 -etil-piperidin-4-il)- fenilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -etil-1 -{6-[4-(4-eti I- piperazin-1 -il)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[4-(4-etil-piperazina-1- carbonil)-fenilamino]-pirimidin-4-il}-1-metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -{6-[6-(4-etil-piperazin-1 - il)-piridin-3-ilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, 3-(2,6-dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1-{6-[6-(4-isopropil- piperazin-1 -il)-piridin-3-ilamino]-pirimidin-4-il}-1 -metil-ureia, ou um sal ou um N-óxido do mesmo.
2. Composto, caracterizado pelo fato de que é 3-(2,6- dicloro-3,5-dimetoxi-fenil)-1 -metil-1 -[6-(4-piperazin-1 -il-fenilamino)- pirimidin-4-il]-ureia.
3. Preparação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um sal ou N-óxido farmaceuticamente aceitável do mesmo, e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Uso de um composto, ou de um sal, óxido ou éster farmaceuticamente aceitável do mesmo, como definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de uma preparação farmacêutica para tratamento de uma doença selecionada a partir de: Câncer; Doença inflamatória ou autoimune mediada por células T não limitada à artrite reumatóide (AR), artrite colágena II, esclerose múltipla (EM), lúpus eritematoso sistêmico (LES), psoríase, diabetes de início juvenil, doença de Sjõgren, doença da tireóide, sarcoidose, uveí- te autoimune, doença inflamatória intestinal, doença celíaca e miaste- nia gravis; Raquitismo hipofosfatêmico dominante autossômico (ADHR), raquitismo hipofosfatêmico ligado ao cromossomo X (XLH), osteomalácia induzida por tumor (TIO), displasia fibrosa do osso (FH); Displasias esqueléticas humanas autossômicas dominantes classificadas como síndromes de craniossinostose e síndromes de nanis- mo, incluindo hipocondroplasia, acondroplasia grave com atraso no desenvolvimento e acantose nigricans (SADDAN), displasia atatofórica (TD), Craniossinostose coronal de Muenke, sindrome de Crouzon com acanthosis nigricans, sindrome de Pfeiffer; e Obesidade, diabetes, sindrome metabólica, doenças cardi-ovasculares, hipertensão, colesterol aberrante e níveis de triglicerí- deos, distúrbios dermatológicos.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é em combinação com um agente antiproliferativo.
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