BRPI0610951A2

BRPI0610951A2 - levedura geneticamente modificada da espécie issatchenkia orientalis e espécies estreitamente relacionadas e processos de fermentação utilizando as mesmas

Info

Publication number: BRPI0610951A2
Application number: BRPI0610951-9A
Authority: BR
Inventors: Pirkko Suominen; Aristos Aristidou; Marja Ilmen; Laura Ruohonen; Kari Koivuranta; Kevin Robert-Perez; Merja Penttila
Original assignee: Cargill Inc
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2010-08-03
Also published as: CN101287824A; JP2008545429A; US8097448B2; CA2611028A1; EP1885842A2; KR20080028902A; AU2006291566A1; WO2007032792A3; US20120129230A1; EP1885842A4; ZA200711038B; US20090226989A1; AR055964A1; AU2006291566A8; MX2007015170A; WO2007032792A2

Abstract

Células da espécie Issatchenkia orientalis e espécies de levedura estreitamente relacionadas são transformadas com um vetor para introduzir um gene lactato desidrogenase exógeno. As células produzem ácido lático de modo eficaz e são resistentes a baixo pH, condições de titulo de lactato elevado.

Description

"LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA DA ESPÉCIEISSATCHENKIA ORIENTALIS E ESPÉCIES ESTREITAMENTE RELACIO-NADAS E PROCESSOS DE FERMENTAÇÃO UTILIZANDO AS MESMAS"

Esta invenção se deu sob o contrato n° DE-FC07-02ID 14349 com o Departamento de Energia dos Estados Unidos. 0Governo dos Estados Unidos tem certos direitos sobre estainvenção.

Este pedido reivindica beneficio da Pedido de Pa-tente Provisória US 60/686899, depositado em 2 de junho de2005.

Esta invenção se refere a certas espécies de leve-dura geneticamente modificadas.

Alguns ácidos orgânicos, como ácido lático são fa-bricados, através de um processo de fermentação industrial. Afermentação é realizada utilizando vários tipos de espéciesbacterianas, que consomem açúcares (principalmente, glicose)e converter estes açúcares ao ácido desejado.

Há vários motivos pelos quais seria desejável de-senvolver uma levedura ou fungo biocatalizador para a produ-ção de açúcar a partir de substratos ácidos orgânicos. Mui-tas bactérias são incapazes de sintetizar alguns dos aminoá-cidos ou proteínas que necessitam para crescer e metabolisaraçúcares eficientemente. Como resultado, muitas vezes asbactérias devem ser alimentadas com um pacote de nutrientesde certo modo complexo. Isso aumenta a despesa direta neces-sária para operar a fermentação. A crescente complexidade docaldo faz com que seja mais difícil para recuperar o produtode fermentação razoavelmente puro, assim os maiores custosoperacionais e de capital são necessários para recuperar oproduto. Por outro lado, muitas espécies de levedura podemsintetizar seus aminoácidos ou proteínas necessárias a par-tir de compostos de nitrogênio inorgânico. Elas freqüente-mente crescem e fermentam bem no chamado meio "definido",que são simplificados, muitas vezes menos caros e apresentammenos dificuldades nas operações de recuperação do produto.

Outra- razão pela qual as leveduras são de interes-se como um biocatalizador para a produção ácido orgânico tema ver com a natureza do produto em si. Para ter um processoeconomicamente viável, uma alta concentração do produto áci-do orgânico deve se acumular na fermentação do caldo. Alémdas habituais preocupações de toxicidade (o produto de fer-mentação pode ser tóxico para 'o biocatalizador quando pre-sente em concentrações elevadas), mais uma preocupação comacidez existe quando .a fermentação é um produto ácido. 0meio se tornará cada vez mais ácido a medida que mais do á-cido orgânico é produzido. A maioria das bactérias que pro-duzem esses ácidos orgânicos não atua bem em ambientes for-temente ácidos ou não sobrevive sob essas condições ou entãoproduz o produto tão lentamente fazendo com que seja econo-micamente inviável.

Por este motivo, os processos comerciais de fer-mentação ácida são tamponados por meio da adição de um agen-te que neutraliza o ácido a medida que o mesmo é formado.Isto mantém o caldo a ou perto de pH neutro e permite que asbactérias cresçam e produzam de forma eficiente. No entanto,isso converte o ácido em um sal, que posteriormente deve serdividido para obter o produto desejado na sua forma ácida.

0 agente tamponador mais comum é um composto decálcio, que neutraliza os ácidos orgânicos para formar ocorrespondente sal de cálcio. Após o sal de cálcio ser recu-perado a partir do caldo de fermentação, ele é dividido pelaadição de um ácido mineral, normalmente ácido sulfúrico, pa-ra regenerar os ácidos orgânicos e insolúveis e formar umsal de cálcio do ácido mineral. Este processo envolve, por-tanto, custo direto para o agente tampão e ácido mineral,bem como os custos de tratamento e eliminação do subprodutosal de cálcio indesejado. Estes custos podem ser reduzidosou eliminados, se o biocatalizador pudesse crescer e produ-zir de forma eficiente sob condições de menor pH.

Espécies de levedura têm sido consideradas comocandidatas para tais baixo pH fermentações. Muitas espéciesnaturalmente levedura fermentar hexose açúcares ao etanol,mas poucos ou nenhuns naturalmente desejado produzir ácidosorgânicos, como ácido lático. Esforços têm sido feitos paramodificar geneticamente diferentes espécies de levedura parainserir um ou mais genes que permitirão à célula produzirácido lático. A fim de desviar o metabolismo do açúcar paraprodução de etanol a partir da produção de ácido lático, es-sas células também foram geneticamente modificadas para des-naturar ou excluir os genes nativos piruvato descarboxilase(PDC) . Este trabalho é descrito, por exemplo, em WO99/14335, WO 00/71738 Al, WO 02/42.471 A2, WO 03/049525 A2,WO 03/102152 A2 e WO 03/102201A2. Grande parte dos esforçosdescritos nestas diversas publicações se concentram em espé-cies Kluyveromyces, como K. marxianus, e certas espéciesclassificadas sob o gênero Cândida, como C. sonorensis e C.methanosorbosa.

Resta o desejo de proporcionar ainda melhores bio-catalizádores para processos de fermentação de ácido orgâni-co. Um biocatalizador para estes processos de fermentaçãopode desejavelmente atingir alta produtividade volumétrica eespecifica; um elevado rendimento do ácido desejado do subs-trato orgânico fermentação, a capacidade de crescer e produ-zir com eficiência razoável sob condições ácidas; e a capa-cidade de crescer e produzir com razoável eficiência sobcondições microaeróbicas e sobretudo anaeró-bicas. 0 bioca-talizador preferivelmente pode alcançar estes resultados u-sando um meio simples definido. Em um aspecto, esta é umainvenção de células de levedura geneticamente modificadas deuma determinada espécie dentre Issatehenkia orienta-lis/Pichia fermentans ciado que tenham pelo menos um genelactato desidrogenase exógeno integrados em seu genoma.

Esta invenção é também um processo de fermentaçãono qual uma célula de levedura geneticamente modificada deprimeiro aspecto é cultivada sob condições de fermentação emuma caldo de fermentação que inclui um açúcar fermentávelpara a produção de ácido lático ou de um sal.

Esta invenção é também um processo de fermentaçãoem que uma célula de levedura geneticamente modificada deprimeiro aspecto é cultivada sob condições de fermentação emum caldo de fermentação que inclui um açúcar fermentável pa-ra a produção de ácido lático ou de sal, onde o pH do Caldode fermentação durante pelo menos uma parte do periodo defermentação está na faixa de entre cerca de 1,5 a cerca de 4,5.

Descobriu-se surpreendentemente que as células mo-dificadas da invenção apresentam uma excelente tolerância apH moderadamente baixo; condições de titulo elevado de ácidolático, e pode crescer e produzir ácido lático em boas taxasem um meio não tamponado, mesmo sob condições anaeróbicas ouquase-anaeróbicas. Além disso, as células modificadas cres-cem bem no meio definido.

A Figura 1 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI318

A Figura 2 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI320.

A Figura 3 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI321

A Figura 4 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI355.

A Figura 5 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI356.

A Figura 6 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI357

A Figura 7 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI319.

A Figura 8 é um diagrama ilustrando o plasmideo pMI433.A Figura 9 é um diagrama ilustrando o plasmideopMM25.

A Figura 10 é um diagrama ilustrando o plasmideopMM2 8.

A Figura 11 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI445.

A Figura 12 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI355.

A Figura 13 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI446.

A Figura 14 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI447.

A Figura 15 é um diagrama ilustrando o plasmideopM1448.

A Figura 16 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI457.

A Figura 17 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI458.

A Figura 18 é um diagrama ilustrando plasmideo opMI449.

A Figura 19 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI454.

A Figura 20 é um diagrama ilustrando o plasmideopBHl65.

A Figura 21 é um diagrama ilustrando o plasmideopMI464.

A levedura geneticamente modificada da invenção éproduzida através da execução de certas modificações genéti-cas para uma célula de levedura hospedeira. A célula hospe-deira é de uma espécie incluídas no grupo I. orientalis/P.Fermentans ciado. Este ciado é o mais terminais ciado quecontenha, pelo menos, as espécies Issatchenkia orientalis,Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149 (designação NRRL),Cândida ethanolica, P. deserticola, P. membranifadens e P.Fermentans. Os membros do ciado I. Orientalis/P. Fermentanssão identificados pela análise do dominio variável D1/D2 doDNA ribossômico 26S de espécies de levedura, utilizando ométodo descrito por Kurtzman e Robnett em "Identificationand Phylogeny of Ascomycetous Yeasts from Analysis of Nucle-ar Large Subunit (26S) Ribosomal DNA Partial Sequences", An-tonie van Leeuwenhoek 73:331- 371, 1998, incorporados nestedocumento por referência. Ver especialmente a pág. 349. Aanálise do dominio variável D1/D2 do DNA ribossômico 26S decentenas de ascomycetes revelou que o ciado I. orientalis/P.Fermentans contém muitas espécies estreitamente relaciona-das. Os membros do ciado I. orientalis/P. Fermentans apre-sentam maior similaridade no dominio variável D1/D2 do DNAribossômico 2 6S àquele de outros membros do ciado do que à-quele das espécies de levedura fora do ciado. Portanto, ou-tros membros do ciado I. orientalis/P. Fermentans podem seridentificados por comparação dos dominios D1/D2 do seu res-pectivo DNA ribossômico e comparando àquele de outros mem-bros do ciado e espécies estreitamente relacionadas fora dociado, utilizando Os métodos de Kurtzman e Robnett's.

Quando caracterizada pela primeira vez, à espécieI. orientalis foi atribuído o nome Pichia kudriavzevii. 0anamorfo (forma assexuada), de I. orientalis é conhecido co-mo Cândida krusei.

Uma célula hospedeira particularmente adequada éI. Orientalis cepa ATCC 32196. Outra célula hospedeira par-ticularmente adequado é a cepa ATCC PTA-6658 de I. orientalis.

A célula da invenção contém pelo menos um genelactato desidrogenase funcional e exógena (LDH) genes inte-grado em seu genoma. Um gene LDH é qualquer gene que codifi-ca para uma enzima lactato desidrogenase, ou seja, um quetenha atividade de lactato desidrogenase. "Atividade de lac-tato desidrogenase" refere-se à capacidade das proteínas decatalisar a reação de piruvato a lactato. Enzimas lactatodesidrogenase incluem (mas não estão limitadas a) aquelasclassificados pela Enzyme Commission números 1.1.1.27 e1.1.1.28.

Neste contexto, "exógeno" significa que o materialgenético em estudo (neste caso, o gene LDH), não é nativopara a cepa hospedeira. 0 termo "nativo" é usado aqui comrelação ao material genético (por exemplo, um gene, promotorou terminador), que são encontrados (além das mutações indi-viduo-a-individuo que não afetem a função) dentro do genomado tipo nativas de células da célula hospedeira.

0 gene LDH poderá permitir que a célula modificadaproduza tanto o estereoisômero ácido L- como D-lático. Épossivel que as células modificadas da invenção contém tantoL-e D-genes LDH, e assim é capaz de produzir tanto ácido lá-tico estereoisômeros. No entanto, é preferido que apenas osgenes L- ou apenas D-LDH estejam presentes, de modo que acélula produza um produto ácido lático mais opticamente puro.

Genes LDH adequados incluem aqueles obtidos a par-tir de fontes de bactérias, fungos, leveduras ou mamíferos.Exemplos específicos de genes L-LDH são aqueles obtidos apartir de fontes Lactobacillus helveticus, L. casei, Bacil-lus megaterium, Pediococcus acidilactici, Rhizopus oryzae ebovina, como Bos Taurus. Exemplos específicos de genes D-LDHsão as obtidas a partir de genes de L. helveticus, L. john-sonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, L. plantarum, L. pen-tosus e P. acidilactici. Os genes funcionais que são idênti-cos a esses genes L-LDH ou D-LDH ou que têm Índices de iden-tidade de, pelo menos, 35%, 60%, 70% ou 80% em relação atais genes no nível de aminoácido são adequados. Os genesnativos obtidos a partir de qualquer uma destas fontes podemser submetidos a mutagênese, se necessário, para forneceruma seqüência de codificação começando com o códon de parti-da eucariótico habitual (ATG), ou para outros fins. Um genepreferido L-LDH é aquele que -é obtido a partir de L. helve-ticus ou aquele que tem um índice de identidade relativo atal gene de, pelo menos, 35%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou95%. Outro gene L-LDH preferido é aquele que é obtido a par-tir de B. megaterium ou aquele que tem um índice de identi-dade de, pelo menos, 35%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95%, emcomparação com esses genes. Outro gene L-LDH preferido é a-quele que é obtido a partir de Bos Taurus ou aquele que temum índice de identidade de, pelo menos, 35%, 60%, 70%, 80%,85%, 90% ou 95%, em comparação com esses genes. Um gene D-LDH preferido é aquele que é obtido a partir de L. helveti-cus ou aquele que tem um indice de identidade de, pelo me-nos, 45%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95%, em comparação comesses genes.

Os Índices de identidade de seqüências de aminoá-cidõs de DNA, RNA ou proteínas são, para efeitos da presenteinvenção, calculados utilizando o software BLAST versão2.2.1 com parâmetros padrão. Genes LDH particular-mente ade-quados incluem aqueles que codificam para uma enzima com umaseqüência de aminoácidos que tem um índice de identidade de,pelo menos, 60%, sobretudo de pelo menos, 80%, 85% ou 95%,em comparação com a seqüência identificada como SEQ. ID. NO.93 (que aparece como SEQ. ID. NO. 45 em WO 03/049525) oucomparada com aquela identificada como SEQ. ID. NO. 94 (queaparece como SEQ. ID. NO. 49 em WO 03/049525) . Genes LDHparticularmente adequados incluem também aqueles que codifi-cam uma enzima com uma proteína que tem uma seqüência de ín-dice de identidades de, pelo menos, 60%, 80%,'85% ou 95%, emcomparação com SEQ. ID. NO. 95 ou SEQ. ID. NO. 96 (que apa-recem como SEQ ID. NO. .46 e 50, respectivamente, em WO03/049525).

A célula transformada pode conter um único geneLDH ou diversos genes LDH, tal como a partir de 1 a 10 genesLDH, especialmente a partir de 1 a 5 genes LDH. Quando ascélulas transformadas contém vários genes LDH, os genes in-dividuais podem ser cópias dos mesmos genes, ou incluir có-pias de dois ou mais genes LDH diferentes. Várias cópias degenes LDH exógenos podem ser integrados em uma única locali-zação (de modo que sejam adjacentes uns aos outros), ou emvários locais dentro do genoma da célula hospedeira.

Os genes LDH exógenos estão sob o controle trans-cricional de um ou mais promotores e um ou mais terminais,qüe são funcionais na célula de levedura modifi-cada. Con-forme utilizado neste documento, o termo "promotor" refere-se a uma seqüência não traduzida situada no sentido acima(ou seja, 5') em relação ao códon de inicio de tradução deum gene estrutural (geralmente dentro de aproximadamente 1para 1000 pb, preferivelmente 1-500 pb, especialmente 1-100pb) , que controla o inicio da transcrição do gene estrutu-ral. Do mesmo modo, o termo "terminador" refere-se a uma se-qüência não traduzida localizado no sentido abaixo (ou seja,3' ) em relação ao códon de término de tradução de um geneestrutural (geral-mente dentro de aproximadamente 1 para1000 pb, mais tipicamente 1-500 pares de base e especialmen-te 1-100 pares de base) e que controla o fim da transcriçãodos genes estruturais. Um promotor ou terminador é "operati-vamente ligado" a um gene estrutural se a sua posição no ge-noma em relação àquela do gene estrutural for tal que o pro-motor ou terminador, consoante o caso, desempenhe a sua fun-ção de controle transcricional.

As seqüências promotoras e terminadoras podem sernativas para I. orientalis ou exógenas à célula. Seqüênciaspromotoras e terminadoras úteis incluem aquelas que são mui-to idênticos (isto é, têm um indice de identidade de 90% oumais, especialmente 95% ou mais, a maioria preferivelmente99% ou mais) em suas porções funcionais, em comparação comas porções funcional das seqüências promotoras e terminadoras,respectivamente, que são nativas à célula hospedeira, espe-cialmente quando a inserção dos genes exógenos dirige-se aum local especifico no genoma da célula.

Um tipo adequado de promotor tem um Índice de i-dentidade de, pelo menos, 90%, 95% ou 99% em relação a umpromotor que é nativo para um gene de levedura. Um tipo maisadequado de promotor tem um índice de identidade de, pelomenos, 90%, 95% ou 99% em comparação a um gene promotor queé nativo para a célula hospedeira. Promotores particu-larmente úteis incluem promotores de piruvato descarboxilase(PDC) de levedura, fosfoglicerato quinase (PGK), e genes fa-tor-1 de alongamento de transcrição (TEF-I), especialmente apartir dos respectivos genes I. orientalis. Um promotor es-pecialmente útil inclui a porção funcional de um promotor deum gene PGK de I. Orientalis.

Um tipo adequado de terminador tem um índice deidentidade de, pelo menos, 90%, 95% ou 99% em comparação comum terminador de um gene que é nativo para uma levedura. Oterminador pode ter um índice de identidade de, pelo menos,90%, 95% ou 99% homólogo a uma terminação de um gene que énativo para a célula hospedeira. Terminadores particu-larmente úteis incluem terminadores de genes de piruvatodescarboxilase (PDC) de levedura, xilose redutase, (XR), xi-litol desidrogenase (XDH) ou iso-2-citocromo c (CYC), ou umterminador da família galactose de genes em levedura, espe-cialmente o chamado terminador GAL10. Um terminador funcio-nal especialmente preferido inclui uma porção de um termina-dor para um gene PDC da célula hospedeira.

A utilização dos promotores e terminadores nativos(para a célula hospedeira), juntamente com as respectivasregiões de acompanhamento sentido acima e sentido abaixo,pode permitir a integração alvejada do gene LDH em locaisespecíficos da célula hospedeira do genoma, e para a inte-gração simultânea do gene LDH e supressão de um outro genenativo, como, por exemplo, um gene PDC.

É possível que diferentes genes LDH exogenos este-jam sob o controle de diferentes tipos de promotores e/outerminadores.

0 gene LDH exógeno pode ser integrado aleatori-amente na célula hospedeira do genoma ou inserido em um oumais locais direcionados. Exemplos de locais segmentados in-cluem o local de um gene que é desejavelmente suprimido oudesnaturado, como um gene PDC. A integração no local do PDCpode ser conseguida com ou sem supressão ou desnaturação dogene PDC nativo, mas é geralmente preferido desnaturar ousuprimir o gene PDC, de modo que as células modificadas pro-duzam menos etanol.

A célula hospedeira pode conter múltiplos genesPDC. As células I. orientalís nativas, por exemplo, contêmdois genes PDC, que aqui são designados como IoPDClA e I-oPDClB. Em algumas cepas, incluindo ATCC PTA-6658, os mesmossão visualizados como bandas HindIII ~ 8 kbp e ~ 10 kbp,respectivamente, sob a análise Southern do organismo do tiponativo. Outras cepas I. orientalís, tais como ATCC 32196,parecem ter dois alelos que produzem bandas de dimensão se-melhante. Quando a célula hospedeira contém vários genesPDC, é preferido suprimir ou desnaturar pelo menos um delese mais preferido desnaturar todos eles, uma vez que istodestrói a capacidade da célula de produzir etanol. Assim, emI. orientalis, è preferido desnaturar o gene IoPDClA ou I-oPDClB e mais preferido suprimir ou desnaturar tanto o. geneIoPDClA como o gene IoPDClB.

Entende-se por "deletar ou desnaturar" que toda aregião codificadora do gene é eliminada (deleção), ou o geneou a sua região promotora e/ou terminadora é modificada (co-mo por deleção, inserção, ou mutação) , a fim de que o genejá não produza uma enzima ativa, ou produza uma enzima comatividade gravemente reduzida. A deleção ou desnaturação po-de ser realizada por métodos de engenharia genética, evolu-ção forçada ou mutagênese e/ou de seleção ou triagem. A for-ma preferida de realizar a mesma é substituir o gene PDC comuma fita contendo uma gene LDH, como descritos mais detalha-damente sentido abaixo.

A modificação genética da célula hospedeira é rea-lizada em uma ou mais etapas através da concepção e constru-ção dos vetores adequadas e transformação da célula hospe-deira com esses vetores. Os métodos de transformação por e-letroporação e/ou quimica (como os baseados em cloreto decálcio ou acetato de litio) podem ser usados. Os métodos pa-ra transformar as cepas de leveduras para inserir um geneLDH exógeno são descritos em WO 99/14335, WO 00/71738, WO02/42471, WO 03/102201, WO 03/102152 e WO 03/049525; essesmétodos são geralmente aplicáveis para transformar célulasL. orientalis, de acordo com esta invenção. Os vetores podemtanto ser cortados com enzimas de restrição especiais ou u-tilizados como DNA circular.

Em geral, um vetor é preparado de modo a conter ogene LDH associado e as seqüências promotoras e terminado-ras. 0 vetor pode conter sitios de restrição de vários tiposde linearização ou fragmentação. Os vetores poderão igual-mente incluir uma porção estrutural central (como para apropagação em E. Coli) muitas das quais são convenientementeobtidas a partir de vetores leveduras ou bactérias comerci-almente disponíveis.

0 vetor preferivelmente contém uma ou mais fitasde genes marcadores de seleção. 0 "gene marcador de seleção"é aquele que codifica uma proteina necessária para a sobre-vivência e/ou crescimento das células transformadas em ummeio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típi-cos codificam proteínas que (a) conferem resistência a anti-bióticos ou outras substâncias tóxicas, tais como zeocina(gene sh ble de Streptoalloteichus hindustanus) , G418 (genede resistência a canamicina de Tn903), higro-micina (gene deresistência aos antibióticos aminoglico-sideos de E.coli),Ampicilina, tetraciclina, ou canamicina); (b) complementamas deficiências auxotróficas da célula. Dois exemplos proe-minentes de deficiências auxotróficas são a deficiência doaminoácido leucina (por exemplo, gene LEU2) ou deficiênciade uracila (por exemplo, gene URA3) . As células que são ne-gativas para orotidina-5'-fosfato descarboxilase (ura3-) nãopodem crescer em meios sem uracila. Assim, um gene UBA3 fun-cional pode ser utilizado como um marcador em uma célula comuma deficiência de uracila, e transformantes bem sucedidospodem ser selecionados em um meio sem uracila. Apenas célu-las transformadas com o gene URA3 funcional são capazes desintetizar uracila e crescer em tal meio. Se a cepa do tiponativa não tiver uma deficiência de uracila (como é o casode I. orientalis, por exemplo.), um mutante auxotrófico coma deficiência deve ser produzido no sentido de utilizar URA3como um marcador de seleção para a cepa. Os métodos para arealização disto são bem conhecidos na técnica.

Os marcadores de seleção preferidos incluem o genede resistência a zeocina, gene de resistência G418, gene deresistência higromicina e MEL5 (gene melibiase) . A fita domarcador de seleção irá incluir uma seqüência promotora eterminadora, operatoriamente ligada ao gene marcador de se-leção, e que são acionados em J. orientalis. Promotores ade-quados incluem os descritos sentido acima com relação ao ge-ne LDH, assim como tantos outras, como são descritos em WO99/14335, WO 00/71738, WO 02/42471, WO 03/102201, WO03/102152 e WO 03/049525. Um promotor especialmente preferi-do é um promotor PGK ou PDC (ou parte funcional do mesmo) ,da cepa hospedeira, ou uma seqüência com um indice de iden-tidade de, pelo menos, 80, 85, 90 ou 95%, em comparação comum tal promotor PGK ou PDC. Terminadores adequados incluemos descritos sentido acima com relação ao gene LDH. Tanto opromotor como o terminador (ou ambos) pode ser o mesmo quefoi usado com o gene LDH.A integração alvejada pode ser conseguida pela construção de um vetor com regiões que são muito idênticas a(ou seja, Índices de identidade de 80% ou mais, preferivel-mente 95% ou mais e mais preferivelmente 100%) para os flan-cos sentido acima (5'—) e sentido abaixo (3'-)do gene alvo.Uma ou ambas destas regiões podem incluir uma parte do códi-go da região do gene alvo, bem como uma parte ou a totalida-de das respectivas regiões promotoras ou terminadoras. A fi-ta LDH (incluindo promotores e terminadores associados casoseja diferente daqueles dos genes alvo) e marcador(es) deseleção (associados com promotores e terminadores que podemser necessários) irá residir no vetor entre as regiões quesejam muito idênticas aos flancos sentido acima e sentidoabaixo do gene alvo. Como mencionado, um alvo preferido geneé o gene IoPDClA. ou IoPDClB (ou ambos) , como a desnaturaçãoou deleção de um ou de ambos estes genes é preferida. No en-tanto, outros genes nativos podem servir como metas para ainserção da fita do gene LDH.

Transformantes bem sucedidos podem ser selecio-nados por forma conhecida, aproveitando-se dos atributoscontribuídos pelo gene marcador, ou por outras caracterís-ticas (tais como a capacidade de produzir ácido lático, in-capacidade de produzir etanol, ou a capacidade de crescer emsubstratos específicos) contribuídas pelos genes introdu-zidos. O rastreio pode ser realizado por análise PCR ou Sou-thern para confirmar que as inserções e deleções desejadas te-nham ocorrido, para confirmar o número de copias e para i-dentificar o ponto de integração dos genes no genoma da cé-lula hospedeira. A atividade da enzima codificada pelos ge-nes inseridos e/ou a falta de atividade da enzima codificadapelo gene suprimido pode ser confirmada utilizando métodosde análise conhecidos.

A deleção ou desnaturação dos Genes PDC pode serfeita de diversas formas, incluindo, por exemplo, os métodosanálogos aos descritos em WO 99/14335, WO 02/42471, WO03/049525, WO 03/102152 e WO 03/102201. Em um método de par-ticular interesse (no que diz respeito à transformação de I.Orientalis) , (1) as regiões de flanco 5' e 3' de um dos ge-nes PDC de I. orientalis são clonadas, opcionalmente juntocom uma parte do gene PDC funcional; (2) um vetor contendoas regiões de flanco 5' e 3' é produzido, e (3) a célula deL. orientalis é transformada com o vetor. Um evento de re-combinação homólogo resulta em uma deleção do gene PDC fun-cional. Foi verificado que as regiões de flanco 5' e 3' paraIoPDClA podem ser usadas no vetor para suprimir ou desnatu-rar tanto IoPDClA e IoPDCl-B. Os métodos análogos podem serusados para impedir ou excluir um ou mais genes PDC em ou-tras células hospedeiras úteis para a invenção.

0 vetor de deleção ou .desnaturação de PDC pode in-cluir um ou mais genes funcionais estruturais, designada-mente um gene LDH como descrito sentido acima, inserido en-tre as porções de flanco 5' e 3' de um dos genes PDC da cé-lula hospedeira. O gene funcional preferencialmente incluiseqüências funcionais promotoras e terminadoras operatori-amente ligadas ao gene estrutural. Esta abordagem permite adeleção simultânea do•gene PDC e inserção dos genes funcio-nais. O vetor pode incluir um gene marcador de seleção, emvez de ou além dos genes estruturais. Novamente, o gene mar-cador de seleção está posicionado sobre o vetor entre asporções de flanco 5' e 3' do gene PDC sendo alvejado, e tor-na-se inserido no local do gene PDC funcional. A utilizaçãode um gene marcador de seleção tem a vantagem de introduziruma forma de seleção para o transformantes bem sucedidos. Noentanto, pode ser possível selecionar para transformantesbem sucedidos baseados nas suas capacidade reduzida ou eli-minada para produzir etanol, especialmente em transformantestendo desnaturações ou supressões de múltiplos genes PDC(tanto como os genes IoPDClA e IoPDClB de I. Orientalis).

In I. orientalis, é possivel eliminar tanto I-oPDClA como IoPDClB em uma única etapa, transformando a cepahospedeira com um único vetor contendo o flanco 5' de ambosgenes alvos, uma fita incluindo genes promotores e termina-dores funcionais associados, e/ou uma fita genética marcadorde seleção incluindo promotores e terminadores associados, eo flanco 3' de ambos os genes. Um exemplo de tal vetor é a-quele designado pMI356 no Exemplo 2B. As transformações deI. Orientalis com um tal vetor produzem transformantes tendoum único alelo PDC deletado e transformantes tendo uma dele-ção de ambos os alelos IoPDClA e IoPDClB. Normalmente, pelomenos um dos alelos PDC é substituído por um gene LDH fun-cional (ou outros genes estruturais). Novamente, métodos a-nálogos são aplicáveis em relação a outras células hospedei-ras tendo múltiplos alelos PDC.Como alternativa, é possivel em I. orientalis su-primir IoPDClA e IoPDClB em um processo de duas etapas. Porexemplo, I. orientalis pode ser transformado com um vetorcomo descrito sentido acima, e cepas de deleção única de PDCtransformadas uma segunda vez com um vetor similar ou análo-go para eliminar o segundo alelo PDC. Os exemplos 2D e 3Bsentido abaixo ilustram essa abordagem.

A célula de levedura geneticamente modificada dainvenção pode incluir as modificações genéticas adicionaisque fornecem alguns atributos desejados para as células.A(s) modificação(ões) adicionais de especial interesse con-fere à célula a capacidade de fermentar açúcares pentose aprodutos de fermentação desejáveis. Entre essas modifi-cações estão (1) inserção de um gene funcional exógeno dexilose isomerase, (2) uma deleção ou ruptura de um gene na-tivo que produza uma enzima que catalise a conversão de xi-lose para xilitol, (3) a exclusão ou desnaturação de um genefuncional de Xilitol desidrogenase e/ou (4) modifica-çõesque fazem com que a célula super-expresse uma xiluloquinasefuncional. Os métodos, para a introdução de tais modifica-ções em células de levedura são descritos, por exemplo, emWO 04/099381, incorporado neste documento por referência.

No processo de fermentação da invenção, a célulada invenção é cultivada em um meio de fermentação, que in-clui um açúcar que seja fermentável pelas células transfor-madas. O açúcar pode ser um açúcar de hexose, como a glico-se, glicano ou outros polímeros de glicose, os oligômeros deglicose como maltose, maltotriose e isomaltotriose, panose,frutose, frutose e oligômeros. Se a célula é modificada paraexpandir a capacidade de fermentar açúcares de pentose, omeio de fermentação pode incluir um açúcar de pentose como axilose, xilano ou outros oligômeros de xilose. Tais açúcaresde pentose são devidamente hidrolisados de uma biomassa con-tendo hemicelulose. Em caso de açúcares oligoméricos, podeser necessário adicionar enzimas ao caldo de fermentação, afim de digestão de estes açúcares correspondentes monòméri-cos para a .fermentação pela célula.

0 meio tipicamente conterá nutrientes como exigidopela célula em particular, incluindo uma fonte de nitrogênio(como os aminoácidos, proteínas, fontes inorgânicas de ni-trogênio, tais como amônia ou sais de amônio, e outras), evárias vitaminas, minerais e similares. I. Orientalis é ca-paz de satisfazer as suas necessidades de nitrogênio, fósfo-ro e magnésio a partir de fontes inorgânicas e por isso écapaz de crescer e fermentar em um meio quimico definidocontendo fontes inorgânicas desses elementos. Assim, as cé-lulas da invenção podem ser cultivadas em tal meio quimicodefinido. No entanto, também é possivel cultivar as célulasda invenção em um meio de cultura complexo que não seja qui-micamente definido e que possa conter fontes orgânicas denitrogênio, tais como proteínas, proteínas parcialmente di-geridas, ou aminoácidos.

Outras condições de fermentação, tais como tempe-ratura, densidade de células, seleção de substratos, seleçãode nutrientes, e similares, não são considerados como criti-cos para a.invenção e geralmente são selecionados para pro-porcionar um processo econômico. As temperaturas durante ca-da fase do crescimento e fase de produção pode variar entrea temperatura de congelamento sentido acima da média de cer-ca de 50 °C. A temperatura preferida, em especial durante afase de produção, é de cerca de 30-45°C.

Durante a fase de produção, a concentração de cé-lulas do meio de fermentação é tipicamente no intervalo deaproximadamente 0,1-20, preferivelmente cerca de 0,1-5, maispreferivelmente ainda cerca de 1-3 gramas de células se-cas/litro de meio de fermentação.

A fermentação pode ser conduzido aeróbia, microae-robicamente ou anaerobicamente. Condições quase anaeróbicas,na qual nenhum oxigênio é adicionado durante a fermentação,mas oxigênio dissolvido está presente no meio de fermentaçãono inicio da fermentação, também pode ser usadas. Se deseja-do, taxas especificas de reabsorção de oxigênio podem serusadas como um controle processo, conforme descrito em WO03/102200. As células da invenção apresentam uma boa capaci-dade de fermentar açúcares de ácido lático ou misturas deácido lático/etanol, em boas produtividades volumétricas eespecificas mesmo sob condições anaeróbicas. Quando o produtode fermentação é um ácido, o meio pode ser armazenado duran-te a fase de produção da fermentação, a fim de que o pH sejamantido em um intervalo de cerca de 5,0 a cerca de 9,0, pre-ferivelmente cerca de 5,5 a cerca de 7,0. Agentes tamponado-res adequados são insumos básicos que neutralizam o ácidolático a medida que é formado, e incluem, por exemplo, hi-dróxido de cálcio, carbonato de cálcio, hidróxido de sódio,hidróxido de potássio, carbonato de potássio, carbonato desódio, carbonato de amônio, amônia, hidróxido de amônio esimilares. Em geral, esses agentes tamponadores que têm sidousados em processos de fermentação convencionais também sãoadequados aqui.

Em uma fermentação tamponada, os produtos de fer-mentação ácida como o ácido lático são neutralizados ao cor-respondente sal como elas são formadas. A recuperação do á-cido portanto envolve regenerar o ácido livre. Isto é nor-malmente feito através da eliminação das células e acidulan-do o caldo de fermentação com um ácido forte como o ácidosulfúrico. 0 sal subproduto é formado (gesso no caso onde umsal de cálcio é o agente neutralizador e o ácido sulfúrico éo agente acidulante), que é separado do ácido. 0 ácido é en-tão recuperado através de técnicas como a de extração líqui-do-liquido, destilação, absorção, etc, tal como são descri-tos em T.B. Vickroy, Vol. 3, capitulo 38 de ComprehensiveBiotechnology, (ed. M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985;R. Datta, et al. , FEMS Microbiol. Rev., 1995; 16:221-231;Patente US n° 4.275.234.. 4.771.001. 5.132.456. 5.420.304.5.510.526. 5.641.406, e 5.831.122, e WO 93/00440.

É preferível, no entanto, conduzir a fermentaçãode modo que o pH do meio no final da fermentação seja igualou inferior a pKa do produto de fermentação ácida. Um pH fi-nal adequado está adequadamente no intervalo de cerca de 1,5a cerca de 3,5, no intervalo de entre cerca de 1,5 a cercade 3,0, ou na faixa de cerca de 1,5 a cerca de 2,5. 0 pH departida pode ser um pouco mais elevado, como a partir decerca de 3,5 a cerca de 6,0, em especial a partir de cercade 3,5 a cerca de 5,5, ou pode ser ajustado para um pH maisácido de 1,5 a cerca de 3,5. As células desta invenção de-monstraram ter uma capacidade inesperado de crescer e produ-zir bem mesmo em meio de fermentação ácida quando o pH é in-ferior a 3,5, inferior a 3,0, inferior a 2,5, e mesmo infe-riores a 2,0. Descobriu-se que as células de I. orientalisapenas com modificações genéticas básicas, como a inserçãode um gene LDH e deleção de Genes IoPDClA e IoPDClB produzema partir de 15-20 ug/L de ácido lático em condições anaeró-bias em um meio não tamponado originalmente contendo 10 %por peso de glicose.

A recuperação de ácido lático a partir de um meiode fermentação de baixo pH podem ser realizada utilizandométodos tais como os descritos no Patente US n ° 6.229.046.

O processo da invenção pode ser conduzido continu-amente, em lotes, ou alguma combinação das mesmas.

Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrara invenção, mas não são destinados a limitar o âmbito damesma. Todas as partes e percentagens estão em peso salvoindicação contrária.

Exemplo IA: Clonagem de região promotora de I. o-rientalis PGK (IoPGKl); construção de um plasmideo (pMI318,Fig. 1) com gene higromicina de E. Coli sob o controle dopromotor IoPGKl e de terminador S. Cerevisiae GAL10.

Um fragmento sonda 920 pb de gene PGK1 C. sonorensisé obtido a partir do genoma de DNA C. sonorensis da mesmaforma que foi descrito no Exemplo 22 de WO 02/042471, usandoiniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 1 e SEQ. ID. NO.2. O DNA genômico é isolado a partir de uma cepa I. Orienta-lis em crescimento e ressuspenso em Tris-HCl 10 mM + EDTA 1mM (pH 8) (TE) . O DNA genômico I. orientalis é cortado comHindIII, e um Southern Blot é preparado e hibridizado usandométodos padrão com o gene PGK1 de C. sonorensis como umasonda. Fragmentos de ~ 2 kb de tamanho são isolados a partirde gel de agarose e clonado em um Plasmideo de corte Hindll-I. A hibridização da colônia de transformantes de E. Colicom o sonda PGK1 resulta em isolamento de um fragmento Hin-dIII contendo mais seqüências de proteínas que codificamPGK1 de I. Orientalis (IoPGKl) mas nenhuma seqüência promo-tora, como verificado pela seqüenciação.

Os fragmentos genômicos contendo a região promoto-ra IoPGKl são obtidas com amplificação de PCR mediada porligação (Mueller, P.R. e Wold, B. 1989, "In vivo footprin-ting of a muscle specific enhancer by ligation mediatedPCR." Science 246:780-786). A mistura de um ligante identi-ficado como SEQ. ID. NO. 3 e um ligante identificado comoSEQ. ID. NO. 4 é ligada a DNA genômico I. orientalis digeri-da com HindIII com T4 DNA ligase (New England BioLabs) . A-mostras de misturas de ligação são usadas como modelos para50 uL de reações de PCR contendo 0,1 uM de um iniciador i-dentificado como SEQ. ID. NO. 5 e 1 de uM de um iniciadoridentificado como SEQ. ID. NO. 6. A mistura reacional é a-quecida a 94 °C durante 3 minutos depois que 2 U de DynazymeEXT são adicionadas. As reações são 30 vezes como segue: 1minuto a 94 °C, 2 minutos a 68 °C e 2 minutos a 72 °C, comuma última prorrogação de 10 minutos a 72 °C. A amostra di-luída desta primeira amplificação PCR é usada como modelo emuma reação nested PCR (50 uL de) contendo 0,05 uM de um ini-ciador identificado como SEQ. ID. NO. 7 e 0,5 uM de um ini-ciador identificado como SEQ. ID. NO. 8. A mistura reacionalé aquecida a 94 °C durante 3 minutos depois que 2 U de Dy-nazyme EXT é adicionado. As reações são, em seguida, cíclico30 vezes como segue: 1 minuto a 94 °C, 2 minutos a 67 °C e 2minutos a 72 °C, com uma última prorrogação dè 10 minutos a 72 °C.

Um fragmento de PCR com ~ 600 pb é isolado e se-qüenciado. Iniciadores nested identificados como SEQ. ID.NO. 9 e SEQ. ID. NO. 10 são projetados e utilizados em umamplificação de PCR mediada por ligação juntamente com oli-gonucleotideos identificados como SEQ. ID. NO. 11 e SEQ. ID.NO. 12 do mesmo modo como sentido acima, exceto que o DNA deI. orientalis digerido é utilizado e o PCR é efetuado atra-vés de uma temperatura de anelamento de 65 °C.

O promotor I. orientalis PGK1 é PCR amplificadousando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 13 e SEQ.ID. NO. 14 e os I. orientalis DNA genômico como modelo. Ofragmento é preenchido utilizando a enzima Klenow e, em se-guida, corte com Xbal. Um fragmento de 633 pb é isolado emgel e ligado a um fragmento de 4428 pb obtido pela digestãode um plasmided designado como pMI270 (descrito na Fig. 4 deWO 03/049525), com Xhol, preenchendo o fragmento no uso deenzima Klenow e dNTP 0,1 mM, e digerindo com Xbal. O plasmi-deo pMl270 contém o gene higromicina de E. Coli ligado a umpromotor PGK1 de C. sonorensis e um terminador GAL10 de S.Cerevisiae. 0 plasmidio resultante é designado pMI318 (Fig.1) . 0 plasmideo pMI318 contém o gene higromicina de E. Colisob o controle do promotor PGK1 de Z. orientalis e do termi-nador GAL10 de S. Cerevisiae.

Exemplo 1B: Construção de um plasmidio (pMI321,Fig 3.) Contendo o gene higromicina sob o controle do promo-tor IoPGKl e do terminador GAL10 S. Cerevisiae, e os geneLDH de L. helveticus sob o controle do promotor IoPGKl eterminador CYC1 de S. Cerevisiae.

0 promotor PGK1 de J. orientalis do Exemplo IA éPCR amplificado usando iniciadores identificados como SEQ.ID. NO. 15 e SEQ. ID. NO. 16 e o DNA genômico de I. orienta-lis como modelo. 0 fragmento é preenchido utilizando a enzi-ma Klenow e dNTP 0,1 mM e, em seguida, corte com Ncol. Umfragmento de 633 pb é isolado em gel.

O plasmideo pVRl (descrito no WO 03/102152, Figura7), contém os genes LDH de L. helveticus sob o controle dopromotor TEF1 de S. Cerevisiae e do terminador CYC1 de S.Cerevisiae. O plasmideo pVRl é digerido com Xhol, preenchidono uso de enzima Klenow, e corte com Ncol. Um fragmento de7386 pb de plasmideos pVRl é ligado ao fragmento promotorIoPGKl de 633 pb. O plasmidio resultante é designado pMI320(Fig. 2) . O plasmideo pMI320 contém o gene LDH de L. helve-ticus sob o controle do promotor IoPGKl e terminador CYC1 deS. Cerevisiae.Os plasmídeos pMI318 (Ex. IA, Fig. 1) e pMI320 sãodigeridos com Apal e NotI. Um fragmento de 5008 pb de plas-mideo pMl318 é ligado ao fragmento de 1995 pb de plasmideospMI320 para formar o plasmideo pMI321 (Fig. 3).

O gene higromicina (e sua terminação) está posi-cionado em plasmideo pMI321 entre duas cópias do promotorIoPGKl. Isso pode permitir a contrução de uma célula trans-formada com plasmideo pMl321 de se envolver em uma recombi-nação homóloga de "laço para fora" o gene higromicina e ter-minação, juntamente com uma cópia do promotor IoPGKl.

Exemplo 1C: Geração de um mutante I. Orientalis(CD 990), com gene LDH integrado e gene higromicina resis-tente, transformando tipo nativo I. Orientalis com plasmideopMI321 parcialmente digerido (Fig. 3, Ex. IB).

O plasmideo pMI321 encontra-se parcialmente restritocom Xhol, assim como a mistura resultante do DNA linear ecircular é utilizada para transformar uma cepa I. Orientalistipo nativa designada como ATCC PTA-6658, usando métodos pa-'drão de acetato de litio como descrito em Gietz et al.(1992, Nucleic Acids Rs. 20:1425). As células transformadassão selecionadas para resistência a higromicina. Vários co-lônias higromicina resistentes são cultivadas e o meio decultura é analisado para a produção de ácido lático. A colô-nia resistente a higromicina, que produz ácido lático é de-signada cepa CD990.

Exemplo 1D: Geração de um mutante I. orientaliscom um gene LDH integrado e gene de resistência a higromici-na, transformando I. Orientalis tipo nativa com plasmídeopMI321 parcialmente digerido (Fig. 3, Ex. 1B).

0 plasmideo pMl321 encontra-se parcialmente res-trito com Xhol, bem como a mistura resultante de DNA lineare circular é usada para transformar cepa ATCC 32196 de I.orientalis de tipo nativos, utilizando métodos padrão de a-cetato de litio, como descrito anteriormente. As célulastransformadas são selecionados para resistência a higromicina.

Várias colônias higromicina-resistentes são cultivadas e acultura é analisada para a produção de ácido lático. São en-contradas várias colônias que produzem ácido lático.

Exemplo 1E: Geração de um mutante I. orientaliscom um gene LDH integrado e gene de resistência a higromici-na, transformando I. Orientalis tipo nativa com plasmideopM!320 parcialmente digerido e plasmideo pM!321 digerido(Figs. 2, 3, Ex. IB).

O plasmideo pMI320 é parcialmente digerido comXhol. O plasmideo pMl321 é digerido com Smal e Sall. Os ma-teriais digeridos são combinados e utilizados para transfor-mar cepa ATCC PTA-6658 de I. orientalis do tipo nativo, u-sando métodos padrão de acetato de litio, tal como descritoanteriormente. As células transformadas são selecionados pa-ra resistência a higromicina. Várias colônias resistentes ahigromicina são cultivadas e a cultura é analisada para aprodução de ácido lático. são encontradas várias colôniasque produzem ácido lático.

Exemplo 1F: Geração de um mutante de I. orientaliscom um gene LDH integrado e genes resistentes a higromicina,transformando I. orientalis do tipo nativo com plasmídeopM!320 parcialmente digerido e plasmideo pM!321 digerido(Figos 2, 3, Ex. IB).

O plasmideo pMI320 é parcialmente digerido comXhol. O plasmideo pMl321 é digerido com Smal e Sall. Os ma-teriais digeridos são combinados e utilizados para transfor-mar uma cepa I. orientalis do tipo nativo designada comoATCC 32196, utilizando métodos padrão de acetato de litio,como descrito anteriormente. As células transformadas sãoselecionados para resistência a higromicina. Várias colôniasresistentes a higromicina são cultivadas e a cultura é ana-lisada para a produção de ácido lático. É encontrada uma co-lônia que produz ácido lático.

Exemplo 2A: Clonagem de região promotora de PDC deI. orientalis (IoPDClA); construção de um plasmideo (pM!355,Fig. 4) com o gene para higromicina de E. Coli sob o contro-le do promotor IoPGKl e do terminador GAL10 S. Cerevisiae,um gene LDH de L. helveticus sob o controle do promotor I-oPGKl e terminador CYC1S. Cerevisiae, e a região de flanço5' de IoPDClA.

Uma biblioteca genômica da cepa nativa de I. ori-entalis ATCC PTA-6658 é construída no vetor cosmideo Super-Cosl (Stratagene), de acordo com instruções fornecidas pelofabricante, seqüências similares a PDC são amplificados porPCR do DNA genômico das cepas com iniciadores designado comoSEQ. ID. NO. 17 e SEQ. ID. NO. 18. Um fragmento de 700 pb deum gene PDC é amplificado. A biblioteca genômica é examinadautilizando técnicas de hibridização com fragmentos de PCRrotulados como sondas, conforme descrito no WO 03/049525 eclones de cosmideo contendo o gene PDC são isolados e se-qüenciados. A região 5' PDC1A de I. orientalis de 1000 pb a167 pb sentido acima do inicio do quadro de leitura aberto éPCR amplificado usando iniciadores identificados como SEQ.ID. NO. 19 e SEQ. ID. NO. 20 e os DNA de cosmideo de PDC deI. Orientalis como modelo. O gene amplificado (do códon deinicio ao de fim), tem a seqüência identificada como SEQ.ID. NO. 97. O fragmento é cortado com Sall e Saci. Um frag-mento de 836 pb é isolado em gel e ligado a um fragmento de6992 pb obtido por digestão com plasmideo pMI321 (ExemploIB, Fig. 3), com Sall e Saci. O plasmidio resultante é nome-ado pMI355 (Fig. 4).

Exemplo 2B: Clonagem de região terminadora PDC (I-oPDClA) de I. orientalis; construção de plasmideos (pMIS56 epMl357, Figs. 5 e 6)

A região PDC 3' de I. orientalis correspondente àsseqüências de 233 pb para 872 pb sentido abaixo do códon deparada de tradução de PDC é PCR amplificado usando iniciado-res identificados como SEQ. ID. NO. 21 e SEQ. ID. NO. 22 e oDNA de cosmideo PDC1A de I. Orientalis (Exemplo 2A) , confor-me o modelo. O fragmento é cortado com Apal e Smal. Um frag-mento de 630 pb é isolado em gel e ligado a 7809 pb fragmen-to obtido por digestão de plasmideo pMl355 (Ex. 2A, Fig. 4),com Apal e Smal. O plasmídio resultante é nomeado pMl356(Fig. 5) . Ele contém a fitas de plasmideos pMI355 de higro-micina e LDH entre o flanco 5' e uma parte do flanco 3' dogene IoPDClA.

A região 3' PDC1A de I. Orientalis correspondenteàs seqüências de 524 pb sentido acima a 217 pb sentido abai-xo do códon de parada de tradução PDC é PCR amplificada u-sando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 23 e SEQ.ID.' NO. 24 e o DNA de cosmideo PDC de I. Orientalis (Exemplo2A) , conforme o modelo. 0 fragmento é cortado com Apal eSmal. Um fragmento de 764 pb é isolado em gel e ligado a umfragmento de 7809 pb obtido por digestão de plasmideo pMl355com Apal e Smal. O plasmidio resultante é nomeado pMl357(Fig. 6). Ele' contém as fitas higromicina e LDH de plasmi-deos pMl355 entre o flanco 5' e uma parte do flanco 3' dogene IoPDClA. O plasmideo pMI357 difere do plasmideo pMl356com relação à parte do flanco 3' IoPDClA, que está presente.

Exemplo 2C: Geração de um mutante de I. orientalis(ATCC/357-5) com gene suprimido PDC e gene LDH integrado deL. helveticus e gene de resistência a higromicina, transfor-mando I. Orientalis tipo nativo com plasmideo pMI357 (Fig.6, Ex. 2B).

O plasmideo pMl357 é restrito com Saci e Apal eusado para transformar cepa ATCC 32196 de I. orientalis, u-tilizando métodos químicos padrão, como descrito anterior-mente.

As colônias que crescem sobre o meio higromicinasão submetidas a análises Southern para confirmar a integra-ção do Gene LDH do plasmideo pMl357 e para confirmar a ex-clusão do alelo IoPDClA e/ou IoPDClB. Os transformantes con-tendo o gene LDH e uma deleção de um dos alelos IoPDClA ouIoPDClB é designado como ATCC/357-5.

Exemplo 2D: Geração de mutantes de I. Orientalis(CD 1027 e CD 1030) com gene PDC suprimido e gene LDH L.helveticus integrado e gene de resistência a higromicina,nativo, transformando I. orientalis tipo nativo com plasmi-deo pM!356 (Fig.5, Ex. 2A).

O plasmideo pMI356 é restrito com Saci e Apal eutilizado para transformar a cepa ATCC PTA-6658 de I. orien-talis, usando métodos quimicos padrão, como descrito anteri-ormente.

As colônias que crescem sobre o meio de higromici-na são selecionadas. Análise Southern de DNA genômico hibri-dizado com LhLDH cortado com HindII-Xbal e sondas 5' PDCconfirmam a integração do Gene LDH de plasmideo pMl356 e adeleção de Gene IoPDClB- em um transformante, que é designadocomo CD 1030. Um transfor-mante tendo LDH integrado e umadeleção do gene IoPDClA é designado como CD 1027.

Exemplo 2E: Geração de um mutante de I. orientalis(ATCC/356-23) com gene suprimido IoPDClA e gene LDH de L.helveticus integrado e gene de resistência a higromicina,transformando I. orientalis tipo nativo com plasmideo pM!356(Fig. 5, Ex. 2A).

O plasmideo pMI356 é restrito com Saci e Apal eusado para transformar cepa ATCC 32196 de I. Orientalis tiponativo, utilizando métodos químicos padrão, como descritoanteriormente.

As colônias que crescem sobre o meio de higromici-na são selecionadas. A análise Southern de DNA genômico hi-bridizado com LhLDH cortado com HindII-Xbal e sondas PDC 5'confirmam a integração do Gene LDH do plasmideo pMl356 e adeleção de um dos alelos IoPDClA ou IoPDClB em um transfor-mante, que é designado como ATCC/356-23.

Exemplo 3A: Construção de plasmideos pMI433 (Fig.8) contendo a região de flanço 5' IoPDClA, o gene ScMEL5 sobo controle do promotor IoPGKl, o gene LDH de L. helveticussob o controle do promotor IoPGKl e terminador ScCYCl , e aregião de flanco 3' IoPDClA.

Um promotor I. orientalis PGKl é PCR amplificadousando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 25 e SEQ.ID. NO. 26 e o DNA genômico de I. orientalis como modelo. Ofragmento é preenchido utilizando a enzima Klenow e 0,1 mmdNTP e, em seguida, corte com Sphl. Um fragmento de 669 pb éisolado em gel. Um plasmideo designado como pMI233 (descritona Fig. 23C de WO 03/049525) é cortado com Xhol. O fragmentoé preenchido com a enzima Klenow e cortado com Sphl. Osfragmentos de 4534 pb e de 669 pb são ligados e o plasmideoconseqüente é nomeado pMI319 (Fig. 7). O plasmideo pMl319contém' o gene MEL5 de S. cerevísiae (ScMEL5) e a região pro-motora IoPGKl.

O plasmideo pMl319 é cortado com Apal, terminadocom T4 polimerase, e cortado com NotI. Um fragmento de 2317pb é isolado em gel. É ligado a um fragmento de 64 98 pb ob-tido por digestão do plasmideo pMl357 (Exemplo 2B, Fig. 6),com Sall, terminando-se com a enzima Klenow e, em seguida,corte com NotI. 0 plasmideo resultante contém o gene ScMEL5(com o seu terminador nativo), em lugar do gene higromicinado plasmidio pMI357. 0 plasmidio resultante é designadopMI433 (Fig. 8).

Exemplo 3B: Geração de mutantes de L. orientalis(C258/433-3 e C258/433- 4), com Genes IoPDClA e IoPDClB su-primidos e gene LDH de L. helveticus integrado e genes mu-tantes ScMEL5, transformando a cepa CD1027 (Ex. 2B) complasmideo pMI433 (Fig. 8, Ex. 3A).

A cepa mutante CD1027 é transformada com um frag-mento de Sacl/Apal de 5,9kb de plasmideos pMI433 utilizandométodos quimicos padrão. A análise Southern é realizada emtransformantes que apresentam atividade melibiase, usando DNAgenômico digerido com várias combinações de enzimas e realiza-do com sondas LhLDH e PDC 5'. Dois transformantes que perde-ram o alelo IoPDClB e ganharam uma segunda cópia do genehLDH são designados C258/433-3 e C258/433-4, respectivamen-te. No entanto, a integração ocorre de maneira diferente nosdois transformantes, onde a banda. 3' de LhLDH correspondenteà fita LhLDH do plasmideo pMl433 aparece diferentemente nasduas cepas. Não é claro se a fita de expressão de LhLDH in-serida está intacta nestes transformantes.

Exemplo 4: Geração de um mutante de I. orientalis(CD 1184), com alelos IoPDCJA e IoPDClB suprimido e gene L-hLDH integrado em uma única etapa, transformando cepa I. o-rientalis tipo nativo com plasmideo pM!356 (Fig. 5, Ex. 2B )A cepa ATCC PTA-6658 de I. Orientalis é transfor-mada com o plasmideo pMI356 usando o método geral descritono Exemplo 3B. As cepas transformada que crescem sobre pla-cas de higromicina são cultivadas. Um transformante que nãoproduza etanol é selecionado para Análise Southern, o queconfirma a deleção de ambas os alelos IoPDCJA e IoPDClB einserção de, pelo menos, uma cópia de gene LhLDH. Esta cepaé designada CD 1184.

Exemplo 5: Geração de um mutante de I. Orientalis(CD 1270) com alelos IoPDClA e IoPDClB suprimidos e gene L-hLDH integrado em uma única etapa, transformando a cepaATCC32196 do tipo nativo de J. Orientalis com plasmideopMI356 (Fig. 5, Ex. 2B) .

A cepa ATCC 32196 de I. orientalis é transformadacom o plasmideo pMl356 utilizando o método geral descrito noExemplo 3B. As cepas transformadas que crescem sobre placasde higromicina são cultivadas. Um transformante que não pro-duza etanol é selecionado para Análise Southern, o que con-firma a deleção de ambos os alelos IoPDClA e IoPDClB e a in-serção de uma cópia do gene LhLDH. Esta cepa é designada CD 1270.

Exemplo 6: Caracterização de cepas CD 990 (Ex. 1C)ATCC/357-5 (Ex. 2C), ATCC 356-23 (Ex. 2E), CD1030 (Ex. 2D) ,CD1184 (Ex .4) e CD1270 (Ex. 5) em frasco de agitação mi-croaeróbica em meio definido não-tamponado.

Os transformantes CD990, ATCC/357-5, ATCC 356-23,CD1030, CD1184 e CD 1270 são separadamente cultivados em 50mL de base nitrogenada para levedura (YNB) sem aminoácidos,complementada com 100 g/L de glicose em um frasco de Erlen-meyer de 250 mL. As culturas não são tamponadas, de modo queo pH dentro do meio caia a medida que o ácido lático sejaproduzido, com um pH final de 2,0 ± 0,1 em cada caso. Cadafrasco é inoculada com um OD6oo de 0,2 com células cultivadasem placas de peptona levedura acrescidas de glicose. As cul-turas são mantidas a uma temperatura de 30 °C com agitação a100 RPM. As amostras são retiradas periodi-camente durante ocultivo, e OD600 é medido. As células são recuperadas a par-tir de cada amostra por centrifugação e o sobrenadante é a-nalisado por HPLC para ácido lático, glicose e etanol.

As análises HPLG são conduzidas com uma cromato-grafia liquida Waters 2690 Separation Module e Water SystemInterfase Module acoplada com um refratômetro diferencialWaters 2414 e um detector de absorbância dupla À Waters2487. As colunas de cromatografia liquida são uma colunaFast Juice de 50 X 7,8 mm de Phenomenex e uma coluna FastAcid Analysis de 100 X 7,8 mm de Bio-Rad. As colunas são e-quilibradas com H2S04 2, 5 mM em água a 60 °C e as amostrassão eluidas com H2S04 2, 5 mM em água a taxa de fluxo de 0,5mL/minuto. A aquisição de dados é feita usando o softwareWaters Millennium.

As cepas de PDC único suprimido (ATCC/357-5,ATCC/356-23 e CD 1030) produzem todas tanto etanol como áci-do lático. O consumo de glicose para essas três cepas é qua-se linear em todas as 168 horas de cultivo, com cada umaconsumindo cerca de 50% da glicose após cerca de 72 horas epraticamente toda a glicose após cerca de 168 horas. Cadauma dessas cepas produz cerca de 20-24 ug/L de etanol após168 horas. A produção de ácido lático atinge o pico apóscerca de 96 horas, a um nivel de 15-20 ug/L para cada umadessas cepas. As cepas a partir dai consumem uma pequenaquantidade de ácido lático. O rendimento de ácido lático pa-ra essas cepas atinge o pico em cerca de 35% após 48 horas,e depois cai devido ao consumo de ácido lático e produçãocontinuada de etanol.

A cepa CD990, que não tem deleção de PDC, tem de-sempenho similar às cepas de PDC único suprimido.

As cepas de PDC duplo deletado (CD 1184 e CD 1270)produzem ácido lático, mas não etanol. Essas cepas consumemglicose mais lentamente do que fazem as outras, com cerca de48-55% da glicose não sendo consumida após 168 horas. A cepaCD 1270 produz ácido lático, através das primeiras 96 horasde cultivo, após o qual o titulo de ácido lático aumenta a-penas ligeiramente. A cepa CD 1270 produz um pico de rendi-mento do ácido lático de cerca de 56%. A cepa CD 1184 conti-nua a produzir ácido lático através de todo o periodo decultivo, com o titulo de ácido lático no final do cultivosendo de cerca de 31 ug/L. O rendimento de ácido lático paraessa cepa é de cerca de 55%.

Exemplo 7: Caracterização de cepas CD990 (Ex. 1C),CD1030 (Ex. 2D) , CD1184 (Ex. 4) e CD1270 (Ex. 5) em frascode agitação em duas fases microaeróbicas, em meio definidotamponado.

Os transformantes CD 990, CD1030, CD1184 e CD1270são separadamente cultivados em levedura peptona mais 5% deglicose. As células são usadas para inocular frascos separa-dos contendo YNB + 5% de glicose + 0,5 M MES, o pH 5,5 médiopara OD6oo = 0,1. Os balões são incubados durante a noite a30 °C e agitação de 250 rpm. As células são então transferi-das para frascos separados contendo 50 mL YNB + 10% de gli-cose + 4 g CaC03 a OÜ600 = 12 , e incubadas durante 5 dias a30 °C e agitação de 100 rpm. As amostras são retiradas peri-odicamente durante o cultivo, e OD6oo é medido. As célulassão recuperados a partir de cada amostra por centrifugação eo sobrenadante é analisado por HPLC para ácido lático, gli-cose e etanol, como descrito no Exemplo 6.

A cepa CD 1030 de PDC único suprimido produz tantoetanol como ácido lático. Ela consome toda a glicose nas 48horas e produz cerca de 56 ug/L de ácido lático. O rendimen-to de ácido lático para essa cepa é ligeiramente inferior a60%. Essa cepa também produz cerca de 13 ug/L de etanol. Es-te desempenho é muito semelhante ao de CD990, que tem o geneLhLDH PDC sem qualquer deleção.

As cepas de PDC duplo suprimido (CD1184 e CD1270)novamente produzem ácido lático, mas não etanol. A cepa CD1270 consome glicose ligeiramente mais rápido do que a cepaCD 1184, mas mais ou menos na mesma taxa da cepa CD 1030. Otitulo de ácido lático da cepa CD1270 atinge o pico de cercade 85 ug/L após 50 horas, e diminui um pouco depois que acepa começa a consumir ácido lático quando a glicose torna-se esgotada. O rendimento de ácido lático para esta cepa éde cerca de 85% após 50 horas. A cepa CD 1184 consome cercade 90% da glicose após 50 horas, e consome o restante aolongo das 72 horas seguintes. Produz um titulo máximo de á-cido lático de cerca de 73 ug/L e um rendimento máximo deácido lático de cerca de 80%.

Exemplo 8: Caracterização de cepas CD990 (Ex. 1C) ,CD1030 (Ex. 2D) , CD1184 (Ex. 4) e CD1270 (Ex. 5), em frascode agitação em duas fases quase anaeróbicas em meio definidotamponado.

Transformantes CD 990, CD1030, CD1184 e CD1270 sãocultivadas em levedura peptona separada mais 2% de glicose.As células são usadas para inocular frascos separados con-tendo levedura peptona + 10% de glicose e incubados durantea noite a 30 °C e agitação de 250 rpm. As células são entãotransferidas para os frascos separados contendo 50 mL de le-vedura peptona + 10% de glicose para OD6oo = 13. Os frascossão fechados com travas de água e incubados durante cerca de6 dias a 30 °C e agitação de 100 rpm em levedura peptona +10% de glicose. No entanto, o ar residual não é removido doespaço superior do frasco e não foram tomadas medidas pararemover o oxigênio dissolvido. Estas culturas, portanto, nãosão estritamente anaeróbicas, já que algum oxigênio encon-tra-se disponível, pelo menos no inicio do cultivo.

O pH do caldo cai para 3,2 ± 0,1 durante as cultu-ras, devido à produção de ácido lático.

As amostras são retiradas periodicamente durante ocultivo, e OD6oo é medido. As células são recuperadas . a par-tir de cada amostra por centrifugação e o sobrenadante é a-nalisado por HPLC para ácido lático, glicose e etanol, comodescrito no Exemplo 6.A cepa de PDC único suprimido CD 1030 produz cercade 19 pg/L de ácido lático após 24 horas, cerca de 24 pg/Lde ácido lático após 72 horas e pouco mais de 25 ug/L de á-cido lático após 141 horas. A cepa CD990., que não tem dele-ção de PDC, produz aproximadamente 20 pg/L de ácido láticoapós 24 horas e cerca de 22 ug/L de ácido lático após 141horas. As cepas CD990 e CD 1030 tanto produzem etanol, comoácido lático.

A cepa CD 1184 de PDC duplo suprimido produz apro-ximadamente 15 ug/L de ácido lático após 24 horas e aproxi-madamente 18 pg/L de ácido lático após 72 horas A cepa CD1270 de PDC duplo suprimido produz cerca de 15,5 ug/L de á-cido lático após 24 horas, cerca de 14,5 pg/L de ácido láti-co após 72 horas e cerca de 19,5 pg/L de ácido lático após141 horas.

Exemplo 9A: Cultivo de cultura microaeróbica emlote da cepa CD1184 (Ex. 4) a pH 3.

Reatores de cultura em lote de etapa única dupli-cados contendo um meio definido, que inclui sulfato de amô-nio, diidrogenofosfato de potássio e sulfato de magnésio,oligoelementos, vitaminas e 83 pg/L de glicose são inocula-dos com 1 mL de cepa CD1184. O pH do meio é ajustado para3,3 antes da adição das células. As células são cultivadasem 30 °C em agitação de 380 rpm e arejamento de 0,1 vvm. Es-sas condições levam a uma taxa de oxigênio (ver WO03/102200) de 2,9-3,1 mmol/L/hora. O pH da cultura é deixadobaixar para 3,0 a medida que as células crescem e começam aproduzir o ácido lático. Em seguida, o pH é mantido em 3,0pela adição de hidróxido de potássio.

As análises HPLC são conduzidas como descrito sen-tido acima. Sob essas condições, o organismo produz 67 ug/Lde ácido lático após ~ 120 horas de fermentação. A taxa deprodução de lactato é de 0,62 ug/L/h, e o rendimento do lac-tato em glicose é de 0,76 ug/g

Exemplo 9B: Cultivo de cultura aeróbica em lote dacepa CD1184 (Ex. 4) a pH 3.

Um reator de fase única de cultura em lote conten-do um meio definido, que inclui sulfato de amônio, diidroge-nofosfato de potássio e sulfato de magnésio, oligoelementos,vitaminas, agente anti-espumante, e 90 ug/L de glicose é i-noculado com .1 mL de cepa CD 1184. O pH do meio é ajustadopara cerca de 3,3 antes de adicionar as células. O pH dacultura é deixado baixar para 3,0 a medida que as célulascrescem e começam a produzir ácido lático. Em seguida, o pHé mantido a cerca de 3,0 por adição de hidróxido de potás-sio. As células são cultivadas em 30 °C em agitação de 490rpm e arejamento de 0,1 vvm. Essas condições levam a uma ta-xa de oxigênio (ver WO 03/102200), de cerca de 8 mmol/L/h.40 ug/L de glicose adicional são acrescentados à fermentaçãoapós cerca de 50 horas de fermentação

As análises HPLC são conduzidas como descrito sen-tido acima. Sob essas condições, o organismo produz 80 ug/Lde ácido lático ~ 90 horas após a fermentação (incluindo umafase lag de cerca de 18 horas durante a qual ocorre poucafermentação) . Durante todo a fermentação do lote, a taxa deprodução de lactato é de 1,0 g/L/h, o rendimento do lactatoem glicose é de 0,71 ug/g durante o periodo de tempo entre ofim da fase lag (18 horas) e um titulo de 70 ug/L de lactatoé atingido (69 horas), a taxa de produção de lactato é de1,5 g/L/h, o rendimento do lactato em glicose é de 0,75jag/g, depois de levar em consideração os efeitos de diluiçãoa partir da adição de glicose e hidróxido de potássio.

Exemplo 10A: Construção de um plasmídio (pMI445,Fig. 11) , contendo a fita do gene M.EL 5 de S. Cerevisiae en-tre repetições idênticas de K. thermotolerans.

A totalidade da fita do gene de K. marxianus CYB2(KmCYB2), incluindo as regiões promotoras e terminadoras, éPCR amplificado do DNA genômico de uma cepa nativa de K.marxianus, com a introdução de sitios de restrição BamJH eSall, por PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID.NO. 27 e SEQ. ID. NO. 28. O produto de PCR é ligado a um ve-tor comercial designado como pUC18 (de Invitrogen Corp, Car-lsbad, CA), que é digerido com BamIII e Sall. 0 plasmidioresultante é designado como pMM25 (Fig.9).

A seqüência de 705 pb identificada como SEQ. ID.NO. 29 é PCR amplificada do DNA genômico de K. thermotole-rans, com a introdução de locais de restrição Sphl e Sall,usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 30 e SEQ.ID. NO. 31. Esta seqüência de K. thermotolerans não codificapara qualquer proteína ativa. O plasmideo pMM25 é digeridocom Sphl e Sall e a' seqüência de K. thermotolerans é ligadaa ele sentido acima (5') da fita KmCYB2 para formar um plas-mideo designado como pMM27.Uma seqüência idêntica a K. thermotolerans é PCRamplificada com adição de sitios de restrição BamlII e Xmal,usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 32 e SEQ.ID. NO. 33. 0 plasmideo pMM27 é digerido com BamlII e Xmal ea seqüência de K. thermotolerans é ligada a ele sentido a-baixo (3'), a partir da fita KmCYB2 para formar um plasmideodesignado como pMM28 (Fig. 10).

O plasmideo pMM28 contém a fita KmCYB2 flanqueadapor seqüências idênticas de K . thermotolerans, ambas orientadasna mesma direção.

O plasmideo pMM28 é digerido com BamlII, preenchi-do com a enzima Klenow, e digerido com Sall. Um fragmento de4077 pb assim obtido é ligado ao fragmento de 2317 pb obtidopor digestão de pMI433 (Fig. 8, Ex. 3A) , com Notl, preen-chendo as saliências com a enzima Klenow, e digerindo comSall. O plasmidio resultante é designado pMI445 (Fig. 11).

Exemplo 10B: Isolamento de homólogos CYB2 de L.orientalis.

0 gene KmCYB2 é usado como uma sonda para isolargenes homólogos de uma biblioteca de DNA genômico obtido apartir de uma cepa de I. orientalis em crescimento. A sondaé sintetizada por PCR utilizando oligonucleótidos de SEQ.ID. NO. 34 e SEQ. ID. NO. 35 como iniciadores e DNA genômicode K. marxianus como modelo e identificados com 32P. O geneKmCYB2 assim obtido é usado para isolar genes CYB2 de I. o-rientalis de uma biblioteca genômica de I. orientalis. UmSouthern blot contendo DNA digerido com EcoRI de seis clonesde cosmideos de I. orientalis e DNA genômico de uma cepa deL. orientalis do tipo nativo são preparadas e hibridizadoscom o gene KmCYB2. Bandas de ~ 1,5 kbp são detectadas, iso-ladas em gel e clonadas em um plasmidio pBluescript SK (-)digerido com Eco.RI. As bandas são seqüenciadas usando M13iniciadores reverso e de avanço. Os iniciadores específicosde seqüência são concebidos com base nas seqüências assimobtidas. Dois genes CYB2 são identificados, que são designa-dos IoCYB2A e IoCYB2B. A região de codificação e aproximada-mente 1 kbp das regiões de flanco 5' e 3' de cada uma dasregiões de clonagem são seqüenciadas. As seqüências são i-dentificadas como SEQ. ID. NO. 36 e SEQ. ID. NO. 37, respec-tivamente.

Exemplo 10C: Construção de um plasmidio (pMI447,Fig. 14), contendo o promotor I. Orientalis PDC1A, seqüênciade K. thermotolerans, fita ScMELl, segunda seqüência idênti-ca de K. thermotolerans, fita genética de LhLDH e terminadorPDC1A de I. orientalis.

Um vetor designado como pNC16 é obtido a partir doNational Energy Research Laboratories, em Golden, Colorado.Este plasmideo contém o gene MEL1 de S. cerevisiae sob ocontrole de promotor ET de S. Cerevisiae e terminador GAL10S. cerevisiae. A fita do gene MELl é PCR amplificada com a-dição de sitios de restrição BglII e Saci usando iniciadoresdesignados como SEQ. ID. NO. 38 e SEQ. ID. NO. 39. 0 plasmi-deo pMM28 (Ex. 10A. Fig. 10) é digerido com BglII e Saci eligado à fita MELl. Esta simultaneamente suprime a FitaKmCYB2 de plasmideos pMM28 e a substitui com a fita MELl. Oplasmidio resultante é designado pMM31. Ele contém a fitaMELl flanqueada pelas seqüências repetidas de K. thermotolerans.

Uma região de flanco de ~ 2kbp diretamente 3' daregião de codificação KmCYB2 é amplificada com a introduçãode sitios de restrição Xmal e Saci por PCR usando iniciado-res identificados como SEQ. ID. NO. 40 e SEQ. ID. NO. 41 eDNA genômico como modelo. O fragmento resultante é ligado aoplasmideo pMM31 digerido com Xmal/SacI para inserir o flanco3' CYB2 sentido abaixo (31) da seqüência de K. thermotole-rans que é ela própria sentido abaixo da fita MELl . O plas-mídio resultante é designado como pMM32.

Uma região de flanco de ~ 2kbp diretamente 5'daregião de codificação KmCYB2 é amplificada com a introduçãode sitios de restrição Aatll e NarI por PCR usando iniciado-res identificados como SEQ. ID. NO. 42 e SEQ. ID. NO. 43 eDNA genômico como modelo. O fragmento resultante é ligado aoplasmideo pMM32 digerido com Aatll/Narl. O plasmideo resul-tante (designado pMM35, Fig 12.) contém, em ordem, a regiãode flanco 5' KmCYB2, em uma primeira seqüência idêntica deK. thermotolerans, a fita MELl, a segunda seqüência idênticade K. thermotolerans e a região de flanco 3' KmCYB2.

A seqüência K. thermotolerans é amplificada porPCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 44 eSEQ. ID. NO. 45, com o plasmideo pMM35 conforme o modelo. Oproduto de PCR é digerido com Notl e Spel. O fragmento re-sultante de 712 pb é ligado a um fragmento de 8798 pb obtidopor digestão de pMI433 (Ex. 3A, Fig. 8), com Spel e Notl. Oplasmidio resultante é designado pMI446 (Fig. 13). Ele con-tém, na ordem, o promotor I. orientalis PDC, fita genéticaScMEL5, a seqüência K. thermotolerans, a fita LhLDH, e ter-minador PDC1A I. orientalis.

A seqüência K. thermotolerans é amplificada porPCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 46 eSEQ. ID. NO. 47, utilizando plasmideo pMM35 conforme o mode-lo. 0 produto de PCR é digerido com Sall. 0 fragmento resul-tante de 711 pb é ligado ao fragmento de 9510 pb de Sall deplasmideos pMI446. O plasmidio resultante é designado pMI447(Fig. 14). Ele contém, na ordem, o promotor PDC I. orienta-lis, uma primeira seqüência repetida K. thermotolerans, fitaScMEL5, uma segunda seqüência repetida K. thermotolerans,fita genética LhLDH e terminador PDC I. orientalis.

Exemplo 10D: Construção de um plasmidio (pMI448,Fig 15.) contendo uma seqüência K. thermotolerans, fita Sc-MEL5 genética, segunda seqüência idêntica K. thermotolerans eterminador IoCYB2A.

A região de flanco 3' do gene IoCYB2A de ~ 90-676pb no sentido abaixo do quadro leitura aberta é amplificadopor PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO.48 e SEQ. ID. NO. 49 e um clone de cosmideo contendo os ge-nes CYB2A I. orientalis como modelo. O produto de PCR é di-gerido com Saci e Smal. Um fragmento de 607 pb é obtido eligado a um fragmento 6386 obtido por digestão de plasmideopMI445 (Exemplo 10A, Fig. 11), com Saci e Smal. O plasmidioresultante é designado pMI448 (Fig.15).

Exemplo 10E: Isolamento de gene URA3 da I. Orien-talis.Um fragmento do gene URA3 de I. Orientalis (IoU-RA3) é amplificado por PCR de DNA genômico de uma cepa nati-va de I. orientalis usando iniciadores identificados comoSEQ. ID. NO. 50 e SEQ. ID. NO. 51. Um fragmento de ~ 650 pbé obtido, o qual é ordenado para confirmar estreita homolo-gia com o gene URA3 de outras leveduras. Este fragmento de ~650 pb é então usado como uma sonda para isolar o gene decomprimento máximo de uma biblioteca de cosmideo genômica dacepa nativa de I. orientalis. Um clone é obtido, o qual épurificado e seqüenciado. O Clone inclui o gene funcionalIoURA3 e as regiões de flanco, e inclui uma seqüência iden-tificada como SEQ. ID. NO. 52. O quadro de leitura abertadeste gene codifica para uma proteina com 262 aminoácidos.Esta seqüência aminoacidica é identificada como SEQ. ID. NO.53.

Exemplo 10F: Construção de plasmídeo de transfor-mação pMI457 (Fig. 16) contendo o promotor IoURA3, fita ge-nética ScMEL5 entre seqüências idênticas de K. thermotole-rans, fita genética de LhLDH e terminador IoURA3 e plasmideode transformação pMI458 (Fig. 17) contendo o promotor IoU-RA3, fita ScMEL5 genética entre idêntico JL thermotoleransseqüências, e IoURA3 terminador.

A IoURA3 3'acompanhamento seqüência de /, orienta-lis é amplificado com iniciadores identificados como SEQ.ID. NO. 54 e SEQ. ID. NO. 55, com uma I. orientalis clone decosmideo contendo o gene URA3 como modelo. Um fragmento de630 pb é obtido, que é cortado com Smal e Apcxl e ligado a umSmal/Apal fragmento de plasmideos pMI447 (Ex. IOC, Fig. 14)para produzir um plasmideo designado pMI455. PlasmideopMI455 contém o I. orientalis PDC promotor, fita ScMEL5 ge-nética entre repetindo K. thermotolerans seqüências, geneLhLDH fita e IoURA33'flanço.

A IoURA3 5'acompanhamento da seqüência I. Orienta-lis é amplificado com iniciadores identificados como SEQ.ID. NO. 56 e SEQ. ID. NO. 57 com o I. Orientalis clone decosmideo contendo o gene URA3 como modelo. A 554 pb fragmen-to é obtido, que é cortado com Sphl e ligado a 6994 pb Sphl-corte fragmento de plasmideos pMI448 (Ex 10C, Fig 15.) Paraproduzir plasmideo pMI456. Plasmideo pMI456 contém o promo-tor IoURA3, a fita genética ScMEL5 entre seqüências repeti-das de K. thermotolerans e os I. orientalis terminadorCYB2A.

O plasmideo pMI455 é cortado com Saci e Sall. Ofragmento resultante 8542 pb é ligado ao fragmento de 1264pb Sacl-Xhol de plasmideos pMI456 para produzir o plasmideopMI457 (Fig. 16).

O plasmideo pMI457 é cortado com Notl e Smal, pre-enchido utilizando-se a enzima Klenow e o conseqüente frag-mento de 7834 pb é religado para formar o plasmideo pMI458(Fig. 17) .

Exemplo 10G: Geração de mutante de I. orientalis(CD 1439 e CD1440), com dois (CD1439) e.uma (CD1440) cópiados gene LhLDH e fita ScMEL5 inserida no local do gene nati-vo URA3 (e deleção de URA3) transformando a cepa mutanteCD1184 (Ex. 4) cm plasmideos pMI457 (Ex. 10F, Fig 16) epMI45 (Ex 10F, Fig 17)A cepa mutante CD 1184 é transformada com o plas-mideo pMI457 utilizando o método geral descrito no Exemplo3B e plaqueada em placas YPD + X-a-gal. Transfor-mantes con-tendo o gene ScMELS são identificados com base na cor azul.Aqueles transformantes são selecionados através de PCR usan-do iniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 58 e SEQ. ID.NO. 59 para identificar integrantes URA3. Transformantes po-sitivos são ainda identificados pela Análise Southern de DNAdigerido com EcoRV-HindIII e NcoI-BsmI. A sonda URA3 marcadacom digoxigenina é sintetizada usando iniciadores identifi-cados como SEQ. ID. NO. 56 e SEQ. ID. NO. 55 e os clone decosmideo contendo o gene URA3 I. orientalis como modelo. Otransformante que produz as bandas esperadas é identificadocomo cepa CD 1439. A cepa CD 1439 tem o mesmo antecedentegenético que a cepa CD1184, exceto que ela possui uma cópiaextra da fita LhLDH e fita ScMEL5 no locus de um gene nativoURA3.

A cepa CD 1440 é produzida de forma idêntica, ex-ceto que é transformada com o plasmideo pMI458. O plasmideopMI458 não tem a fita LhLDH, mas por outro lado promove asmesmas transformações que o plasmideo pMI457. As cepas CD1439 e CD 1440, portanto, têm o mesmo antecedente genéticoexceto pelo número de fitas LhLDH.

Exemplo 11 - caracterização de cepas CD 1184(Ex.4), CD1439 (Ex. 10F) e CD1440 (Ex. 10F) em frasco de a-gitação microaeróbica.

As cepas CD 1439 e CD 1440 são inoculadas separa-damente, a uma primeira OD6oo de 0,15 em 50 mL de YP +100ug/L de glicose em frascos não Erlenmeyer. Os balões são in-cubados a 30 °C com agitação de 100 rpm e analisados após22, 47, 62, 91, 119 e 143 horas.

As amostras para medições de atividade enzimática(5 mL) são recolhidas periodicamente por centrifugação. Osprecipitados de células são lavados com 1 mL de K2HP04/KH2P0410 mM frio (pH 7,5) suplementado com EDTA 2 mM. Os precipi-tados lavados são ressuspensos em 1 mL do mesmo tampão e ar-mazenados a -70 °C. As amostras são descongeladas à tempera-tura ambiente e lavadas em tampão de homogeneização(K2HPO4/KH2PO4 100 mM (pH 7,5) suplementado com MgCl2 2 mM,TDT 1 mM e inibidor de Protease (livre de EDTA, Roche) . Asamostras lavadas são ressuspensas em 0,5 mL de Tampão de ho-mogeneização e duas vezes homogeneizadas por 30 segundos com0,5 mL de grânulos e vidro usando um homogeneizador Bead Be-ater. As amostras são então centrifugadas a 14000 rpm duran-te 30 minutos a 4 °C. A atividade LDH é determinada anali-sando o sobrenadante espectrofotometricamente (A340), utili-zando um analisador automatizado Cobas MIRA a 30 °C, em tam-pão de acetato de sódio contendo NADH 0,4 mM, frutose-1,6-difosfato 5 mM e piruvato 2 mM. 1 U de atividade é definidacomo a quantidade de atividade de conversão de 1 umol deNADH para NAD+/minuto. As concentrações de proteína são de-terminadas de acordo com o método Bio-Rad, com gama-globulina bovina usada como uma proteína padrão.

Todas as cepas CD 1184, CD 1439 e CD 1440 consomemglicose aproximadamente à mesma taxa, e todas produzem apro-ximadamente 55-60 ug/L de lactato. Cada uma produz cerca de0,6 g/L de piruvato e 6 ug/L de glicerol. A atividade de LDHda cepa CD 1439 é de aproximadamente 40% superior a de CD1440 em todo o cultivo, devido à presença da segundo cópiada fita LhLDH.

Exemplo 12A: Clonagem de gene GPD1 de I. Orientalisnativa em conjunto com a região de flanco sentido acima esentido abaixo.

Genes conhecidos de glicerol-3-fosfato-desidrogenasede várias espécies de levedura (5. cerevisae, K. marxianus,Y. lipolytica, P. jadiníi, D. hansenii e C. glabrata) estãoalinhados e as regiões que são altamente conservadas entreos vários genes são identificadas. Dois conjuntos de inicia-dores de degeneração foram concebidos nestas regiões dê altahomologia. Estes conjuntos são identificados como SEQ. ID.NO. 60 e SEQ. ID. NO. 61, e SEQ. ID. NO. 62 e SEQ. ID. NO.63, respectivamente. PCR é realizada utilizando o primeiroconjunto de iniciadores e DNA genômico de I. orientalis comomodelo, e um produto de ~ 200 pb é obtido como esperado. PCRé realizada utilizando novamente o segundo conjunto de ini-ciadores e DNA genômico de I. orientalis como modelo, e umproduto de ~ 400 pb é obtido como esperado. Os dois produtosde PCR são purificados em gel e seqüenciados utilizando osmesmos iniciadores. Usando a seqüência parcial assim obtida,os iniciadores são projetados para o genoma walking. Genomawalking é realizado utilizando o BD Clontech Genoma WalkingKit, de acordo com as instruções do fabricante utilizandoiniciadores de PCR primários identificados como SEQ. ID. NO.64 e SEQ. ID. NO. 65 e iniciadores PCR nested identificadoscomo SEQ. ID. NO. 66 e SEQ. ID. NO. 67. As seqüências obti-das no sentido acima e sentido abaixo do genoma walking es-tão alinhadas e fundidas com a seqüência parcial anterior-mente obtida para construir o gene de glicerol-3-fosfato-desidrogenase de I. orientalis.

Exemplo 12B: Construção de plasmideos pMI449 (Fig.18) e pMI454 (Fig. 19) contendo região de flanco 5' CYB2 deI. Orientalis, fita genética ScMEL5 entre as seqüências re-petidas diretas de K. thermotolerans e região de flanço 3'CYB2de I. orientalis.

O plasmideo pMM28 (Fig. 10, Ex. 10A) é digeridocom BamHI, preenchido com a enzima Klenow, e digerido comSall. O fragmento de 4077 pb assim obtido é .ligado ao frag-mento de 2317 pb Notl (preenchidos com enzima Klenow alfa)-Sall de pMI433 (Fig. 8, Ex. 3A) . O plasmidio resul-tante édesignado pMI445.

A região de flanco 3' do gene de L-lactato:ferricitocromo c oxidoredutase (IoCYB2A) de I. ori-entalis (correspondente às seqüências de 90 a 676 pb sentidoabaixo do quadro de leitura aberto previsto) é amplificadopor PCR usando iniciadores identificados como SEQ. ID. NO.68 e SEQ. ID. NO. 69, utilizando um clone de cosmideo CYB2-2como um modelo. O produto de PGR é digerido com Saci e Smale o fragmento de 607 pb é ligado ao fragmento de 6386 pb Sa-cl-Smal de plasmideos pMI445. O plasmidio resultante é de-signado pMI448.

A região de flanco 5' IoCYB2A (correspondente àsseqüências de 913 a 487 pb sentido acima do quadro de leitu-ra aberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadoresidentificados como SEQ. ID. NO. 70 e SEQ. ID. NO. 71, nova-mente usando os clones de cosmideo CYB2-2 como um modelo. Oproduto de PCR é digerido com Sphl e os 454 pb fragmento éligado ao fragmento de 6993 pb Sphl obtido por digestão par-cial de pMI448. O plasmidio resultante é designado pMI449(Fig. 18) .

A região de flanco 5' IoCYB2A (correspondente àsseqüências de 4 66 a 7 pb sentido acima do quadro de leituraaberto previsto) é amplificada por PCR usando iniciadoresidentificados como SEQ. ID. NO. 72 e SEQ. ID. NO. 73, maisuma vez usando o clone de cosmideo CYB2-2 como modelo. Oproduto de PCR é digerido com SpM e o fragmento de 4 93 pb éligado ao fragmento de 6993 pb Sphl obtido por digestão par-ciai de plasmideo pMI448. O plasmidio resultante é designadopMI453.

A região de flanco 3' IoCYB2A (correspondente àsseqüências de 402 pb sentido acima para 77 pb sentido abaixodo códon de parada previsto) é amplificado por PCR usandoiniciadores identificados como SEQ. ID. NO. 74 e SEQ. ID.NO. 75, utilizando o cosmideo CYB2-2 como um modelo. O pro-duto de PCR é digerido com Apal e Smal e o fragmento de 506pb é ligado ao fragmento de 6886 pb Apal-Smal de plasmideospMI453. O plasmidio resultante é designado pMI454 (Fig. 19).

Exemplo 12C: Construção de um plasmidio (pBH!65,Fig. 20) contendo um fragmento do gene IoGPDl sentido acima,uma primeira seção direta repetida de K. thermotolerans, umafita genética MEL5, uma segunda seção repetida direta K.thermotolerans, e um fragmento do gene IoGPDl sentido abaixo.

0 plasmideo pMI449 (1%. 18, Ex. 12B) é digeridocom Ndel e Sbfl para retirar a homologia do flanco 5' CYB2A.

Um fragmento de 6,8 kbp é purificado em gel e desfosforila-do. Um fragmento de 302 pb do gene IoGPDl do Exemplo 12A(correspondente a 1-302 pares de base desde o códon de ini-cio do gene) é amplificado por PCR usando iniciadores iden-tificados como SEQ. ID. NO. 76 e SEQ. ID. NO. 77. O produtode PCR é purificado em gel, digerido com Ndel e Sbfl, e li-gado ao fragmento de 6,8 kbp de plasmideos pMI449 para pro-duzir o plasmideo pBH164. 0 plasmideo pBH164 é depois dige-rido com Xmal e EcoRI para retirar a homologia do flanco 3'CYB2A. Um fragmento de 6,5 kbp é purificado em gel e desfos-forilado. Um fragmento de 34 6 pb do gene IoGPDl do Exemplo12A (correspondente a 322-668 pares de base desde o códon deinicio) é amplificado por PCR usando iniciadores identifica-dos como SEQ. ID. NO. 78 e SEQ. ID. NO. 79. O produto de PCRé purificado em gel, digerido.com Xmal e EcoRI, e ligado aofragmento de 6,5 kbp obtido a partir de pBH164 para produzirpBH165 (Fig.20).

0 plasmideo pBH165 contém, a fim de transcrição,um fragmento 302 pb do gene IoGPDl, uma primeira seção repe-tida direta K. thermotolerans, uma fita genética MEL5, umasegunda seção repetida direta K. thermotolerans, e o frag-mento de 346 pb do gene IoGPDls. Ele é projetado para inser-ção no local do gene IoGPDls nativo (com desnaturação do ge-ne), seguido por uma fita genética MEL5 fora da alça.Exemplo 12D: Geração de cepa mutante de I. orien-talis (CD1496) transformando sucessivamente a cepa CD 1184(Ex. 4) com plasmídeos pMI449 (Ex. 12B, Fiq. 18) e pMI454(Ex. 12B, Fig 19.) seguido por mutagênese.

A cepa CD 1184 é transformada com o plasmídeopMI449 utilizando o método de acetato de lítio e transfor-mantes (colônias azuis) são selecionados com base em ativi-dade de melibiase em placas YPD X-a-gal. A substituição dogene IoCYB2A da cepa CD 1184 é confirmada por PCR da colôniae Análise Southern em alguns dos transformantes. O marcadorMEL5 é retirado da alça de um desses transformantes através,de um evento de recombinação homóloga de seqüências repeti-das de K. thermotolerans, como confirmado pela Análise Sou-thern. O segundo alelo CYB2A é então excluído deste trans-formante usando o plasmídeo pMI454. Os transformantes sãoanalisados por PCR de colônia para a ausência de um produtode 1000 pb de PCR específico para CYB2A. O marcador de plas-mídeo pMI454 MEL5 é retirado da alça de um transf ormantestendo uma deleção do segundo alelo CYB2A através da recombi-nação como antes. Este transformante é designado cepa CD1436. A cepa CD 1436 tem uma deleção de ambos os alelos PDC1(com a substituição por uma fita genética funcional L-LDH),e uma exclusão de cada um dos seus dois Genes IoCYB2 nativos.

As células da cepa CD1436 de uma nova placa YPDsão ressuspensas em 2 mL de fosfato-salina tamponada a umaOD6oo aproximada de 6. Doze alíquotas de 200 uL desta suspen-são de células são pipetadas em doze tubos com tampa de en-caixe de 14 mL, e 8 uL de metanosulf onato de etila (EMS,Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, n° catálogo M0880, solu-ção a l,17g/mL) são adicionados a dez dos doze tubos. Osdois tubos restantes servem como simulação de controles tra-tados. Os tubos são, em seguida, incubados a 30 °C com agi-tação (225 rpm) durante 60 minutos, para matar 90-99% dascélulas. Após a exposição a SME, células de doze tubos sãogranuladas, lavadas duas vezes com 5,0% Na2S203 a neutraliza-das com EMS e depois lavadas com água. As células mutagêni-cas são deixadas recuperar durante 6 horas em 200 uL de meioYP + 20g/L de glicose e, em seguida, plaqueadas em placasPDA + 35 ug/L de ácido lático e incubadas durante uma semanaa 30 °C. Uma cepa que produza mais lactato e menos gliceroldo que a cepa CD 1436 é designada como cepa CD 1496.

Exemplo 12E: Transformação da cepa CD 14 96 (Ex.12D) , com plasmideo pBH165 (Ex. 12 C, Fig. 20), seguido porretirada da alça do marcador de seleção para produzir cepaCD1671 transformante, que tenha um único alelo GPD1 suprimido.

A cepa CD 1496 é cultivada e transformada com 5 ugde fragmento 4,4 kbp obtido por digestão de plasmideo pBH165com Ndel e EcoRI. São selecionados transformantes em placasde base de nitrogênio para levedura (YNB) + 2% melibiose co-bertas com x-a-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactosideo). transformantes coloridos de azul são visíveisdepois de ~ 4 dias de crescimento a 30 °C. Oito transforman-tes são colhidos e plaqueados de colônias únicas sobre pla-cas de YP + 20 ug/L de glicose contendo x-a-gal. Uma únicacolônia azul para cada transformante é colhida e ressemeadanas placas de YP + 20 ug/L de glicose. DNA genômico é isola-do do transf ormante. A desnaturação de um alelo do gene I-oGPDl é verificada por PCR usando iniciadores identificadoscomo SEQ. ID. NO. 80 e SEQ. ID. NO. 81. Um transformante queexiba ~ 2 kb do produto esperado é designado como cepa CD1657. A desnaturação de uma cópia do gene nativo IoGPDl éainda confirmada por PCR usando iniciadores designados comoSEQ. ID. NO. 82 e SEQ. ID. NO. 83.

A cepa CD 1657 é cultivada por várias rodadas emYP + 100 g/L de glicose a 30 °C. A série de diluição é pla-queadas para placas YP + 20 ug/L cobertas com x-a-gal, ecresceu rapidamente a 30 °C. Uma colônia branca (indicativoda fita marcadora MEL5 fora da alça) é selecionada e resse-meada para as placas YP + 20 ug/L de glicose + x-a-gal. Umacolônia branca é selecionada. A desnaturação de um alelo dogene nativo IoGPDl é verificada por PCR usando iniciadoresidentificados como SEQ. ID. NO. 84 e SEQ. ID. NO. 85. Estetransformante é designado como cepa CD1671.

Exemplo 12F: Transformação de cepas CD1671 (Ex.12E), com plasmideo pBH165 (Ex. 12C, Fig. 20) para produzircepa CD1690 transformante com ambos alelos IoGPDl suprimidos.

A cepa CD 1671 é transformada em 5 ug de um frag-mento de 4,4 kbp obtido por digestão de plasmideo pBH165 comtransformantes Ndel e EcoRI são selecionados em placas deYNB + 2% melibiose cobertas com x-a-gal. Os transformantescoloridos de azul são visiveis depois de ~ 4 dias de cresci-mento a 30 °C. Dez transformantes são colhidos e plaqueadasde colônias únicas sobre placas YP + 20 ug/L de glicose con-tendo x-a-gal. Uma única colônia azul para cada transforman-te é colhida e ressemeada para YP + 20 ug/L de glicose. ODNA genômico é isolado do transformante. A desnaturação dosegundo alelo do gene IoGPDl é verificada por PCR usando i-niciadores identificados como SEQ. ID. NO 86 e SEQ. ID. NO.86.Este transformante é designado como cepa CD 1690.

Exemplo 12G - Caracterização da cepa CD1690 (Ex.12F) em frasco de agitação microaeróbica.

A cepa CD 1690 é inoculada com uma primeira OD60ode 0,2 em YP + 100 g/L de glicose em um fermentador de lotede 3 L. Os frascos são incubados durante 40 horas a 38-40 °Ccom agitação de 100 rpm. O cultivo é tamponado a pH 5,5 emtodo o cultivo. Sob essas condições, a cepa CD 1690 produzum rendimento de 88 gramas de ácido L-lático /100 gramas deglicose que é consumido. A produtividade de ácido L-lático éde 2,6 ug/L/h. Os rendimentos de subprodutos são CO2: 8%;biomassa: 2,4%, e piruvato: 1%. O último OD6oo é 6,3.

Exemplo 13A: Clonagem de fragmento de gene PDC1nativo de P. membranifaciens.

Um par de iniciadores de degeneração é projetadopara clonar uma parte do gene PDC1 em P. membranifaciens.Estes iniciadores são identificados como SEQ. ID. NO. 88 eSEQ. ID. NO. 89. PCR é feita utilizando os iniciadores e DNAgenômico de P. membranifaciens como modelo, e um produto de~ 700 pb é obtido. O fragmento é clonado em um vetor comer-cial TOPO para produzir um plasmideo designado como plasmi-deo PDC-7 clonado. O fragmento é seqüenciado usando inicia-dores identificados como SEQ. ID. NO. 90 e SEQ. ID. NO. 91.A seqüência nucleotidica do fragmento é identificada comoSEQ. ID. NO. 92. O fragmento tem alta identificação com ou-tras seqüências genéticas de PDC de leveduras conhecidas.

Exemplo 13B: Construção de plasmideos pMI464 (Fig.21) contendo fragmento de gene PDC1 P. membranifaciens, fitade expressão de higromicina e fita de expressão LhLDH.

O plasmideo pMI357 (Fig. 6, Ex. 2B) é digerido comSaci e Sall para formar um fragmento de ~ 7735 pb. O clonede plasmideo PDC-y é digerido com Saci e Xhol para produzirum fragmento de ~ 700 pb. Os dois fragmentos são ligados emconjunto para formar um plasmideo designado como plasmideopMI464.

Exemplo 13C: Geração de cepa CD1598 pela transfor-mação de uma cepa do tipo nativo de P. membranifaciens complasmideo pMI464 para integrar a fita genética LhLDH.

Uma cepa do tipo nativo de P. membranifaciens de-signada como NCYC2696 é transformada em um fragmento obtidopor digestão de plasmideo pMI464 com Agel. São selecionadostransformantes em placas YDP +' higromicina e semeada em YDP+200 ug/mL higromicina. Uma colônia é designada como cepa CD1598. A presença da fita genética LhLDH na cepa é verificadapor PCR.

Exemplo 13D - Caracterização da cepa CD1598 (Ex.13C) em frasco de agitação microaeróbica.

A cepa CD 1598 é inoculada com uma ODgoo inicial de0,2 em 50 mL de meio não-tamponado YP + 10% de glicose em umbalão de agitação. O frasco é incubado durante 7 dias a 30°C com agitação de 100 rpm. A cepa CD 1598 produz ácido lá-tico a um título de 47 ug/L. O rendimento de ácido lático éde 70% baseado na glicose consumida. A' taxa de produção deácido lático é de 0,41 ug/L/h. A cepa não produzir etanol.1204A Lista de Seqüência.ST25

Lista de Seqüência

<110> Natureworks LLC

Suominen, Pirkko

Aristidou, Aristos

Penttila, Merja

Ilmen, Marja

Ruohonen, Laura

Koivuranta, Kari

Roberg-Perez, Kevin

<120> "LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA DA ESPÉCIE ISSATCHENKIAORIENTALIS E ESPÉCIES ESTREITAMENTE RELACIONADAS E PROCESSOS DE FERMEN-TAÇÃO UTILIZANDO AS MESMAS"<130> 1204A WO

<150> US 60/686,899 <151> 2005-06-02<160> 97

<170> Patente na Versão 3.2<210> 1<211> 23<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PGK<400> 1

aaccaaagaa ttgttgctgc ttt 23<210> 2<211> 25<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PGK.<400> 2

ttcgaaaaca cctggtggac cgttc 25<210> 3<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de ligação<400> 3

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25<211> 12<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de ligação<400> 4 gaattcagat ct 12<210> 5<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR<400> 5

gcggtgaccc gggagatctg aattc 25<210> 6<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial .<220>

<223> Iniciador PCR<400> 6

ccaattctgc agcaactggc tttaacg<210> 7<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Nested<400> 7

gcggtgaccc gggagatctg aattc

<210> 8

<211> 21

<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador PCR Nested<400> 8

gcctcaccat ttggtctgcc c<210> 9<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<223> Iniciador PCR Nested<400> 9

gactccccgg agtgtcgaaa tatga<210> 10<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Nested<400> 10

gtgatagcgg gtcctttcgc tacc<210> 11<211> 25<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Mediado por ligação<400> 11

gcggtgaccc gggagatctg aattc<210> 12<211> 12<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Mediado por ligação<400> 12 gaattcagat ct<210> 13<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação de promotor PGK 1<400> 13

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg<210> 14<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação de promotor PGK 1<400> 14

ctagcatctg attgttgttg tcgttgtttt tgtttt 36<210> 15<211> 36<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PGK1<400> 15

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36<210> 16<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PGK1<400> 16

acttggccat ggttgttgtt gttgtcgttg tttttg<210> 17<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PDC<400> 17

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc<210> 18<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PDC<220>

<221> misc_feature

<222> (21)-(21)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature<222> (33)..(33)<223> n é a, c, g, ou t<400> 18

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra arte<210> 19<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PDC<400> 19

actgtcgagc tcagtatatg gaattgacgg ctcatc 36<210> 20<211> 38<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PDC<400> 20

actgacgcgt cgacgtatca tttgtagccc acgccacc 38<210> 21<211> 35<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação PDC de flanco 3'<400> 21

cctcccccgg gctgatagaa gggtgatatg taatt 35<210> 22<211> 24<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação PDC de flanco 3'<400> 22

ccaagagtta tggggcccca gttg 24<210> 23<211> 49<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação PDC de flanco 3'<400> 23

actgacgccc cgggtagtta gatagttggc tacccactta ccaagagat 49<210> 24<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação PDC de flanco .3'<400> 24

gggacgggcc caatagagag tgacctatcc aagct 35<210> 25<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de amplificação de promotor PGK<400> 25

gcgatctcga gatttgctgc aacggcaaca tcaatg 36<210> 26<211> 69<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação de promotor PGK<400> 26

tggactagta catgcatgcg gtgagaaagt agaaagcaaa cattgttgtt gttgttgtcg 60ttgtttttg 69<210> 27<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para gene CYB2<400> 27

tccccggtcg accggaactt agcttactcg tc 32<210> 28<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para CYB2 gene<400> 28

ttgcgaggat cctgagtgca gtagctgtac ac 32<210> 29<211> 706<212> DNA<213> Kluyveromyces thermotolerans<400> 29

cactcgcaag ctgtgccatc gcccaacggt taattataag aaatcaacat cagccaacaa 60ctattttcgt ccccctcttt tcagtggtaa cgagcaatta cattagtaag agactatttt 120cttcagtgat ttgtaatttt ttttcagtga tttgtaattc tttctcgaaa tatgcgggct 180waamtaatcc ggacattcac tacatgcaag gaaaaacgag aaccgcggag atttcctcag 240taagtaacaa tgatgatctt tttacgcttc atcatcactt tccaaagttc taagctataa 300gttcaagcct agatacgctg aaaaactcct gaccaacaat gtaaagaaaa caattacaat 360tgtaaggttg aaaacatcta aaaatgaaat attttattgt acatgcacac cctgatagtc 420attctcttac ttcatccctg aaagacgtgg ctgtacaaga gttggaatcg caaggtcatg 480aggttaaagt tagtgatctt tatgctcaaa agtggaaggc ctcaatagac cgtgacgacw 540wmaaaaaama aamrmaagaa gagaggttaa aaatacccca agcttcttat gaagcgtatg 600ccagaggagc attaacaaaa gacgtaaatc aggaacagga aaaacttatt tgggcggact 660ttgtcatttt gtcgtttcct atatggtggt cttctatgcc ggctag 706

<210> 30<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 30

tgtcagcatg cactcgcaag ctgtgccatc 30<210> 31<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans.<400> 31

aaccttgtcg actagccggc atagaagacc acc<210> 32<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 32

tgtcaggatc cactcgcaag ctgtgccatc<210> 33<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 33

aaccttcccg ggtagccggc atagaagacc acc<210> 34<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para gene cYB2<400> 34

ctggatctac agcgattctc<210> 35<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para gene CYB2<400> 35

tgtaccggct gtccttaaac<210> 36<211> 4160<212> DNA<213> Issatchenkia orientalis<220>

<221> misc_feature<222> (609)..(609)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (770)..(770)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (949)..(949)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (1592) .. (1592)

<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc feature<222> (3716) .. (3716)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (3849) .. (3849)

<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (3903) .. (3903)<223> n é a, c, g, ou t<400> 36

tcaaatagta tctcattgta tactaagatagtgttagtat acttgttttc ctctttccccacattagatg cataatgcgt gacaccgccaccgctgatcc tgttgtgtgg gtcatgggactggcaccgtg tatgcctcaa ccactaacttaaatctactt tttgtttgtg ttgatcgccacaacgctgct gttctatcgg tatcctaagaatccaccttc gttgctgttt gactagacagggctcgctct catgatcact tctctacatcgtgggtgttg ctgttggtgc tagccttagtatttggagna taatgaaaag ggatcactacggaaaaacca cccacccttt cttttcccccgaatggccca cttggttctc tgttaacccattttttcata ccccacactt tcccttgaaacccaccactt gcattcatta gtgagtcaatcctactggta atctgtaatc tatattcccgaattgcggta gtgctccaac aaattgtaag

gtttgtattt gtgtgtgtgt gtcagtgtaa 60

tagagttggt ggtgtgtttt gttggaacgt 120

tgatggttgt attctaccaa tgagacatgg 180

atcacctctt gggggggatt ctcctataat 240

ccaccctata actgaatata ttacataagc 300

tcgttgaaat tcgcgcaact tctggtggct 360

gatgtctttg ccetgagtct agggtaaact 420

ctactaactt tacggtagta aatgaataac 480

accctaacaa gtgtattatt tttttttcag 540

gccctcgtta atagttgaac aaacactggc 600

cccccgcttc ctgttccgct tctcccttcc 660

actaatgtat gaatttttcc gttcccaggg 720

cacaattttg acgcatcccn cacacctttt 780

atctccaatt tgaactggca atttcacccc 840

ccatccccgc ggtcggagat tcggaatcca 900

ctgacccttt ataaatganc tattgtcgtc 960

gaccttcttt aaccttttcg attcaatcca 1020tctccacata aacctagttg cacacaatgtgtgtcaaaca aacaaccaga acaaaggttatggcgaaacc tacattgaag aacaactcgattgctgctgt gacagcattg gctgtatcaaaccccttgta taâcgatgct accggcagtgttgtcaagca taattcacaa aacgactgtttcactgattt tattccaaac catccaggtgatgatggtac taaactttat gagaaattgccaaaggataa gtttctgggt gtgttagatgtggttgacga tgatgaaeaa gagcgactggctattcagaa tgtttatgat ttcgaatactgggcatatta ttcttgtggt gccgatgatgatcaaagagt ttatttcaga ccaagaatttatgaaatgtt aggcactaaa acctctgttcaattaggcca tcctgatggt gaatgctcaattcaaatgat ttcgaccctt tcctcaatgtcaggtgcaac ccáatggttc caattatacatggtcaaaca tgcagaagac ttgggtatgactctaggtaa cagagaaaag gataaaagattgggtgattc cgcagatcga aacagtggtgcttctgtctc ttggaatgac gtcaaagcggttaaaggtgt tcaaacagtt gaagacgttattgttttgtc aaaccacggt ggtaggcaactagctgaaac tgttccaact ttgaagagattaattgacgg tggtgtcaaa agaggtaccgaagatgtcag agtttcagtt ggtatgggtagtgaagcagg tgttagaaaa ttaattcaaagattgttggg tgtcactaaa atggaccagc

tactcagatc actaaactct tctgctcgtt 1080

ggtatctcag ccacgtcagt ggtgcaagca 1140

gagaatccaa caaatccaga aactatctaa 1200

cctcaattgg agttgccgta catgtgaagg 1260

attctccgag aagtatatct gttgacgagt 1320

ggattgcaat caatggcaag gtttatgatt 1380

gggtacctcc attagttaat catgctggtt 1440

atccaaaagg tacaattgag aaattcttgc 1500

gtgaagcgcc aaaattggaa gcagactatt 1560

antatttggg caacttacct cctttgtcat 1620

tggccaagaa gattttacct aaagatgcct 1680

aaatcacaat gagagaaaac cattatgctt 1740

gtgttgatgt caaggaagtt gatacttctt 1800

ctttttatgt atctgccacc gctttggcta 1860

ttgctagagg cgctggtaag gaaggtgtcg 1920

cattagatga aattgccgct gctagaattc 1980

ttaatgagga tagaaatgtc gctaaaggtc 2040

aggctatctt tataactgtt gatgctcctt 2100

taaagtttgt taatgacacc gatgtcgatt 2160

cttcaaaggc actatcttcg ttcattgatg 2220

tcaagtcgtg gactaaattg cctgtcttag 2280

ttgaagctta cgatgctggt tgtcaaggtg 2340

tagatactgc tcctcctcca atcgaattat 2400

tgggtaaatt aagaccagat tttgaaattt 2460

atattttgaa agcagtcgca atcggtggcc 2520

gacctttctt atatgccaac tcttgctatg 2580

atctaaagga tgaattagaa atggatatga 2640

tatcttcgaa acatgtcgat actaaacgtt 2700tgattggtag agatgcgatc aactatttgtttaaattcaa caatgaagat tgattgttggcccttggtat tttattccaa atttatgataattattaatg attcaagaaa aagttcaaattcttcattgc tacttcttcc ttaagcaacaaatagtatct cgccgaggag ttatacttgagtactagcct agcatagtaa tctgtttgtttcattgaatc aatatctcca atgtcttcgatctctttttt gttggaatac gacattaaagccattgaggg attaaatttg atttctttgacttcgtcatc atgatcatca gatatgtcactcagtttatt gtgatcttgt atcaattcatttttcttccc gctagactca aaatcaactctttcatggat taattctcta ttgatattcttattatgaac cgcctttaaa tgtttcaataattcaggtaa taaacagtaa aatggcttctgcgcaaatct actgtgttgt ggagtaccatggtctgtgtt gggttgttta aaatgattagctctgaactg tgtcgagcag tcgtcccaacttgcctctnc ctccgaaata gtgtccttgttgnactcttg ttcgagatcc tcatcggttatcagttctga tggtatgttc attcccaatatttcgttact tctcctacta tccctcatgatgtttttgaa tttctgtgtt ttcttttcgcagtttctcaa atattgaacg<210> 37<211> 3840<212> DNA

atgataatgt atacagccca atcgaaaccg 2760

aaatatatta ttcataaagg cgaaaacatt 2820

catagacgta ttttttatat ataaagttat 2880

aaactaatgg atcaacctat ttcgaccctt 2940

gatgattaag tagatactgt ttttttagcc 3000

ctagctcttg ctcaagaatc ttcctaagac 3060

tctgtattgt ttgttctaac tgttctacag 3120

cgttgacaac tttccccccc ttggcagcat 3180

attccttgat tttctgggta ccttcaatga 3240

ttttataatg gtcggctatt agctcttcca 3300

gttgcctttt caatttatta aaattgttta 3360

tgcgtactct tttctcaata tcaaaagcta 3420

tgaagtcatt ttctcgctgg aattcatgta 3480

catatgcatc ctgtaaactg ttgccgttga. 3540

aggcatctgc tctagtaaat gccttcagac 3600

cggctgtatg cgtcctaata tgagacaata 3660

atcttggaca atttccccac ttacangaat 3720

tattcatgtg attaaccatc tcatccattt 3780

ggcaaatatg aatatctttg ggatccaatt 3840

ctgattttag cctaaggcag tccatacttt 3900

tccgcctagc aaacactata tcacttgtca 3960

agttgccgcc tttcctgtct aaacttcgtg 4020

aaataaagta ctcattcaca ttcattcccc 4080

tcacaaaaat tctcaatttt tcacttaatt 4140

4160<213> Issatchenkia orientalis<220>

<221> misc_feature<222> (2042)..(2042)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (2044) . . (2044)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (2970)..(2970)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature

<222> (3240) .. (3240)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_feature<222> (3654)..(3654)

<223> n é a, c, g, ou t<400> 37

gcattaaaaa acattaacat tcgccacattacgtgaggca tcgtagtttt gagttttttttttgccgtgc gcctggtcga ttttcaccttggaaaaagcc aaggagaaag aaaacaaaaaagaaaccaga cagttgatgg ctggtttccgatttgcacac tagagccgtc tctgcattgt

cgacacattc gctgcattcg ccacaacgtc 60

tttttgataa atctcgtttc ctgtgatatg 120

ctttgaaatc cgagttcggg aatgcaattg 180

gagagttgcg tagaaactcg gaatgctcga 240

ttttgaggac gcttggtgtg tgtaacttgg 300

attaaggtgt aaggacggtg aatcatcgcg 360atggagcggg gttttttctt ttggcaggtt tttccgcgga aggcgagagg gcggaagggg 420

ggggggtgta tgtagttcat atttcggcat tactacaagg atgtttccgt acattgcatg 480

gtactggggt tctccttttc ttgcacatct ccataaacta aatatcaata gatgtatccg 540

tttggaatct catgactttt ggtgtgtggt ctgtgtcttc ccagttatct acttgagtga 600

ttatgaacca gttttcacca ttggttacat accaaacaga gaacttatac gcaccagaac 660

gccttttgtg tctttttgtt tctcaagtat ttctatcagt ttccttcatg tatcccggga 720

ctccattgtc ctcggtagtg cctaccaatt taatgtttga ctcctgcgtt ttctcctgtc 780

gcggacaaac ggtgcggctc ccccgatgat tcacgtaata agccggagtc aaccacagag 840

gtcccctatg actcaacaag gcctcgtaga aactcggctt ctcggagaaa gagtcttttc 900

tttttcactg gaaaatattt tttttttcct ttatattctt ttgaaccaaa atgtggctac 960

tataaaagtg cctttattcc ccagcttttc tagcatgatt gagtcacctt ccacaatgag 1020

tcttctttgt tgttagtatt gtgaatatta tccgtgcagt tttcaagaac gttaatcaac 1080

agcagtgata ataccttcaa aatgttaaga tcccagttca aaaacatttt gaaaaatgtt 1140

aacaagaacc attctctaag gagaactttt acttccagca cctcaaaggc tggaaaaaat 1200

gcttcataca atgccaagat tatatctgca accgtggcct cgattgttgc agcagctggc 1260

tcttatatgt tggtccagcc ttcactagct aatgatgagg cacagtctgc taatccaact 1320

aggaagatct ctgttgacga atttgttaaa cacaaccatg ccgatgattg ttggatcact 1380

gttaacggta acgtctatga cttgactgat ttcatttcaa tgcatccagg tggtactacc 1440

ccattgattc aaaatgcagg tcacgacgca actgaaattt acaacaagat tcatccaaag 1500

ggtacaatcg agaacttctt accaaaggaa aagcaattgg gtgttttgga tggtgaagct 1560

cctaaaatcg aagttgtgct tgacgaaaag gagaaacaca gattggagtt gttgaatcat 1620

ctccctgctc tttccagaat tcaaaacatt tatgatttcg aacatattgc ttctagagtt 1680

ttgagcgacc aagcatggaa ctactattca tgtggtgccg aagatgaaat caccttgagg 1740

gaaaatcatt atgcttacca aagaatctac tttaagccaa aatgttgtgt caatgttgca 1800

gaagttgata cctctcatga aattttaggt acaaaagctt ctgttccttt ctacgtttcc 1860

gcagccgctt ctgcaaagtt ggggcacgag gatggtgaat gttccattgc tagaggtgca 1920

ggtaaggaag gcgttattca aatgatttct tccttctctt ccaactcttt ggaggaaat.t 1980

gcagaatcca gaattcctgg tgcaacacaa tggtttcaat tatacgttaa tgaagacaag 2040gntnttgtga agaagacttt aaaaagggccactgtggacg ctgctagtag aggtaatagagatacagatg agttaataga cgattcttctccagctttca ttgacaagag gctgacttggaagttaccag ttttgctgaa gggtgttcaaattggttgta agggtgttgt cttgtccaatcctccaatag aagttatggc tgaatctgttccaaatttca gtattttcgt tgatggtggtttggctattg gtggcagaga ctgtaaagttgcaaatactg gttatggtga aaagggtgtcttaaaggctg acatgagaat gttgggcgttattgacacca gaagattact aggtagagattacccaatgt ctaagattca attcaaaaacaatgaacctt accatgccac atctatagactttgcatatc aaagtaatac caagcatgtttctattcgaa acactccgat ccacaacacnctattacttt attcctaact gtatttttatatagcgcatt ctttttgggt acaaacatacagttccgact ggtgtttcgg atgcctctttagtctttgaa ctcgttgctc ccttaccaccagtagcatac tctgcgtgtt tgactaaatttatcattaaa tacccactga aacttctaacaattgtatct accaaacctg ccttcaagggactttgaact tcctctggga cgtcttcctttttagatttg tctatctcac ggaaaattgacctgatgtta gaagacagtt ttgctaaattaactgaatca gatggtttca tcgatgattcgggtctcaga tgctgctgga tttagcttta

gaaaacttgg gtatgaaggc catctttgtc 2100

gaaaaagaca ttacaatgag aattaccgaa 2160

gttagagctg gttctacctc tggtgcattg 2220

gatgaagtta aggatatcat ttcatggacc 2280

agaactgatg atattgagaa ggcaattgat 2340

catggtggta gacaattaga tacttctcct 2400

ccaatcctaa agcaaaaggg taaactggat 24 60

gttagaagag gtacagatat tttgaaagct 2520

gctgttggtc tgggtagacc tttcctttat 2580

agaaaggccg tgcaaattct aagagaagaa 2640

acctctttga acgagctaga cgactcttac 2700

gctgttaacc acatatacaa caacaactac 2760

gaaaaataag tctgatattt gctaaattga 2820

atcaaaacca ttttcaattt gtcgatatct 2880

caaaaagaaa agaaagcata actttaatac 2940

ttagtctttt tagacccgtt gttcatcttt 3000

aattccgggt ttataaaaga ttaaactaat 3060

ataacggagc tcattcatac atcgcttttc 3120

ttctaaggag ctagattctg gccccacact 3180

cttaccacca gccttacttg taggtttttn 3240

cccttcctta actttgtgcc agcttggcca 3300

aactcttcga ccttcctgat gggcctttga 3360

atgttcttta tatcccctga cgtctttcat 3420

tccatatttt tçccattggc ccggcttgtt 3480

ggggttcata cttaatccac tcacaccaac 3540

atttacattc tgacttgtgt ttgtcgatat 3600

tcgggagact ggttctgatg gcgntcaccg 3660

atttgagccg tttaataggt tcttcattta 3720atgtttgttt tctttttttg tcgtagaaat gtgctgtgag atcaggaaat tgttcaagct 3780gttcacgact tagttttagg gtgacatact tggttttttt aggtgccatt tctgtacaac 3840<210> 38<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para MEL5 gene<400> 38

aaaaaagtcg accgataaca agctcatgca aag 33<210> 39<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para gene MEL5<400> 39

aaaaaaagat ctgcgtaacg aaataaatcc gc 32<210> 40<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 3' CYB2<400> 40

aaaaaacccg ggcttcctcc gctgcaggtt ca 32<210> 41<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 3' CYB2<400> 41

aaaaaagagc tcgaagtctc tggatcctct tc<210> 42<211> 33<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 5' CYB2.<400> 42

aaaaaagacg tcctggctcg atacttctta ttc<210> 43<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 5' CYB2<400> 43

aaaaaaggcg ccgctggcag atactagttc ag<210> 44<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 44

tggactagtc actcgcaagc tgtgccatcg ccca<210> 45<211> 37<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 45

ggcccgcggc cgctagccgg catagaagac caccata<210> 46<211> 39<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 46

actgacgcgt cgaccactcg caagctgtgc catcgccca<210> 47<211> 38<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para seqüência K. thermotolerans<400> 47

actgacgcgt cgactagccg gcatagaaga ccaccata<210> 48<211> 42<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 3' CYB2<400> 48

cctcccccgg ggatatcaaa gttatattat taatgattca ag<210> 49<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 3' CYB2<400> 49

ggacgagagc tcgggcccat gacttcagag ttgattttga gtc<210> 50<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> gene URA3 iniciador de amplificação<400> 50

aagmaracha ayttrtgtgc<210> 51<211> 19<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Gene URA3 iniciador de amplificação<400> 51

aaharkcctc tccaacaat 19<210> 52<211> 2880<212> DNA

<213> Issatchenkia orientalis<220>

<221> misc_feature<222> (2747) .. (2747)<223> n é a, c, g, ou t<220>

<221> misc_féature<222> (2866)..(2866)<223> n é a, c, g, ou t<400> 52

gaaggtaatt ccataagtgt gagtgtaccg cacaaccatc atggatatac aaaagatcaa 60actaatgata atgaaggcaa aaggaaactt gatgatggag atgtagaaga ggcacgtgac 120agcaaaatct tgaagaagcc aaaaacagag gaaacttcaa tcgtcgaaga agataagcca 180caaattaggt tgaggaccag aagtatggtt aataatgaaa acacagtcaa aaaatttcag 240caattatccc tacctatact aacaaatatt tcgtcgcatc gtatcgcttc aatgtttttg 300acgccagtca atgctatgga agagcctgat tattttaaag taattaagaa accaattgac 360ttgaagacta taataaaaaa ggtcaggaac ttttctataa acaccctcga agagcttgaa 420tttgaaatgc aactgatgtt cacgaatgcg ataatgtaca atacaagtga taaagttgaa 480ggaatatcgg atatgatgaa agaatggcaa gatctagtag taatattgaa agaaaatatg 540taataggtat agtccgtcag ttatattgga agataataag aaaagaatat caaaactatt 600taattagtta attgtataaa ctgtatgtca ttataaacag ggaaggttga cattgtctag 660cggcaatcat tgtctcattt ggttcattaa cttttggttc tgttcttgga aacgggtacc 720aactctctca gagtgcttca aaaatttttc agcacatttg gttagacatg aactttctct 780gctggttaag gattcagagg tgaagtcttgagatgtgtat agcctcatga aatcagccatttgttgttct tggtagttaa gttgatccatattcttagta tattcctgtc ctgagtttaggctgaaattc gtcgacatac aatttttcaatttttaaagg aagtactcta taccagttattcttcaacgc tttaataaag tagtttgtttagaatcacac acttcccctg ttgctaggagtaacctttgt gcatcattgg atattactgatattggtcct tacatctgtc tagttaaaactgaaggaact gtgttgcctt tgaaggagctagatagaaaa tttgctgata ttggtaacacccgtattgcc gaatgggctg acatcactaattctggcttg aaggaggccg cccaagaaactgctgagtta tcatcaaagg gttctttagcaattgctaaa tctgataaag agtttgtcattagagaagaa ggttttgact ggatcattattgatgcactt ggtcaacaat atagaactgtcataattgtt ggtagaggtt tgtatggtcaataccaacaa gctggttgga atgcttattttttgatacat gtacactagt ttaaataagctaaatgaggt actttacgtt cacctacaacatttagaaaa agttgtttaa caaaggcttttaactaataa acataaacaa aagtatggttttgttccgcg tattctaagt gttttatatcctgtattctc agcataagat agtaaaggatttccatggca tgtatcccca tcggatacttaccgataatg ttaccaactg cataccaaac

aacacaatcg ttgaaacatc tgtccacaag 840

ttgcttttgt tcaacgatct tttgaaattg 900

cttggcttat gttgtgtgta tgttgtagtt 960

tgaaacataa tatcgccttg aaatgaaaat 1020

actttttttt tttcttggtg cacggacatg 1080

tcttcacaaa tttaattgct ggagaataga 1140

gtcaaggatg gcgtcataca aagaaagatc 1200

acttttctcc atcatggagg aaaagaagtc 1260

aactgaaaag cttctctcta ttttggacac 1320

acacatcgat attgtttctg attttacgta 1380

tgccaagaaa cataatttta tgatttttga 1440

tgttaaaaat caatataaat ctggtgtctt 1500

tgcacatggt gtaacgggtg caggtattgt 1560

aaccagtgaa cctagaggtt tgctaatgct 1620

atatggtgaa tatacagaaa aaacagtaga 1680

tggttttatt gcgcaacacg atatgggcgg 1740

gactccaggg gttggtttag atgacaaagg 1800

tgatgaagtt gtaaagactg gaacggatat 1860

aggaagagat cctgtagagc aagctaaaag 1920

aaacagattt aaatgattct tacacaaaga 1980

atgaaaagaa ttacacaagc aaaaaaaaat. 2040

caaaaaaact agatagagta aaatcttatg 2100

agtatgtgaa tttttaatgt agcaaagcga 2160

ttctttatca gtcaaatcat tatcgattga 2220

attcatagtt aacgattgct tttgtttatt 2280

accggtgaac gccataattg aaaaggaagc 2340

tggtgcttga gaacctttga aaaaatatgg 2400

tgcaacagaa acatacatga acgtcttctt 2460ggtagatcct gaggtgtttg aagataccaa cgccaacatt aatgtccatg gcacattgta 2520gaatcccatc aaataaattc cagctaatgc agcatgtcga ttttcgtgtg gatcaatctt 258.0atttaccata atagccccag ctaaagcagg tagacacgtt aatacccaca ataaacacct 2640aatattatga atccacatgc agattgctgt tatcagcata ccacctccca aggcaactgc 2700tgcctgagga gacgccataa gtgttgtttt gagagcagaa aacccanaac ctttgattat 2760aagaggattg aaatttgtta gtcccgaatt acagatggac tgacatataa taaatgcaac 2820aacaatataa tatttgggat ccaacaaagc ctcccagatt tgatanattt tcaatttgtg 2880<210> 53<211> 262<212> PRT

<213> Issatchenkia orientalis<400> 53

Met Ala Ser Tyr Lys Glu Arg Ser Glu Ser His Thr Ser Pro Vai Ala1 5 10 15

Arg Arg Leu Phe Ser lie Met Glu Glu Lys Lys Ser Asn Leu Cys Ala20 25 30

Ser Leu Asp lie Thr Glu Thr Glu Lys Leu Leu Ser lie Leu Asp Thr

35 40 45

lie Gly Pro Tyr lie Cys Leu Vai Lys Thr His lie Asp lie Vai Ser50 55 60

Asp Phe Thr Tyr Glu Gly Thr Vai Leu Pro Leu Lys Glu Leu Ala Lys65 70 75 80

Lys His Asn Phe Mét lie Phe Glu Asp Arg Lys Phe Ala Asp lie Gly85 90 95

Asn Thr Vai Lys Asn Gin Tyr Lys Ser Gly Vai Phe Arg lie Ala Glu100 105 110

Trp Ala Asp lie Thr Asn Ala His Gly Vai Thr Gly Ala Gly lie Vai115 120 125Ser Gly Leu Lys Glu Ala Ala Gln Glu Thr Thr Ser Glu Pro Arg Gly

130 135 140

Leu Leu Met Leu Ala Glu Leu Ser Ser Lys Gly Ser Leu Ala Tyr Gly145 150 155 160

Glu Tyr Thr Glu Lys Thr Vai Glu lie Ala Lys Ser Asp Lys Glu Phe

165 170 175

Vai lie Gly Phe lie Ala Gln His Asp Met Gly Gly Arg Glu Glu Gly

180 185 190

Phe Asp Trp lie lie Met Thr Pro Gly Vai Gly Leu Asp Asp Lys Gly

195 200 205

Asp Ala Leu Gly Gln Gln Tyr Arg Thr Vai Asp Glu Vai Vai Lys Thr

210 215 220

Gly Thr Asp Ile-Ile lie Vai Gly Arg Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Arg225 230 235 240

Asp Pro vai Glu Gln Ala Lys Arg Tyr Gln Gln Ala Gly Trp Asn Ala

245 250 255

Tyr Leu Asn Arg Phe Lys260

<210> 54<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Amplifciation iniciador para URA3 flanco 3'<400> 54

ctcccccggg caacaaagcc tcccagattt gata<210> 55<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 3' URA3<400> 55

ggacgggccc cctaggtatt gcggctgttt atac 34<210> 56<211> 43<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para URA3 flanco 5'<400> 56

ggacatgcat gcgagctctc aaaactattt aattagttaa ttg 43<210> 57<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador de amplificação para flanco 5' URA3<400> 57

ggacatgcat gctacgtacc ctgcagggtg aagaataact ggtatagagt ac 52<210> 58<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de teste URA 3<400> 58

gatatgatga aagaatggca agatctag<210> 59<211> 26<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de teste URA 3<400> 59

sattgctcgt taccactgaa aagagg<210> 60<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador degenerativo<400> 60

ggkgctaach tbgcymcmga r<210> 61<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador degenerativo<400> 61

dgtratbara tcrgcvacac c<210> 62<211> 21<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Oligo degenerativo<400> 62

krtygghycy ggtaactggg g<210> 63<211> 21<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> oligo degenerativo<400> 63

rtgraagtad ggtckgtgga a<210> 64<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de avanço PCR<400> 64

ccattgccgg tgcactcaag aatgtcg<210> 65<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador reverso PCR<400> 65

cgacattctt gagtgcaccg gcaatgg<210> 66<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Nested<400> 66

ggctgctgga tttgtcgaag gtttagg<210> 67<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR Nested<400> 67

ccttgccttt acctctgaaa tcgtccg<210> 68<211> 42<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR flanco 3' CYB2<400> 68

cctcccccgg ggatatcaaa gttatattat taatgattca ag<210> 69<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador PCR flanco 3' CYB2<400> 69

ggacgagagc tcgggcccat gacttcagag ttgattttga gtc<210> 70<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 5' CYB2<400> 70

ggacatgcat gcgagctcaa tgcgtgacac cgccatgatg gttg<210> 71<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 5' CYB2<400> 71

ggacatgcat gctacgtacc ctgcagggca ccaacagcaa cacccacctg<210> 72<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 5' CYB2<400> 72

ggacatgcat gcgagctcat agttgaacaa acactggcat ttg 43<210> 73<211> 52<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 5' CYB2<400> 73

ggacatgcat gctacgtacc ctgcaggtgt gtgcaactag gtttatgtgg ag 52<210> 74<211> 53<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 3' CYB2<400> 74

cctcccccgg ggatatctag ttagatagct cctcctccaa tcgaattatt age 53<210> 75<211> 42<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador flanco 3' CYB2<400> 75

ggacgagagc tcgggcccta cgtctatgta tcataaattt gg 42<210> 76<211> 33<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> gene GPD1 iniciador<400> 76

aaaaaacata tggagatgtt aatatgtggg tct<210> 77<211> 33<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 77

ttttttcctg caggtcagta ataacagtgg aga<210> 78<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> gene GPD1 iniciador<400> 78

aaaaaacccg gggtgcctta tcaggtgcta<210> 79<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 79

ttttttgaat tcaaggttgc agcatgacag<210> 80<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 80gagttcaccc gtccagatag<210> 81<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 81

ggacaacgta catggacgat tc<210> 82<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 82

ctatctggac gggtgaactc<210> 83<211> 18<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 83 ggactggggg tgtacaat<210> 84<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 84

cttgtgcagg ctcagacttg<210> 85<211> 20<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 85

caaggcattc tggcagcttc

<210> 86

<211> 22

<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Iniciador<400> 86cggcttccaa agcggactta cc<210> 87<211> 22<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> GPD1 iniciador<400> 87

aaggccgaca gcccattcaa gg<210> 88<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> PDC1 iniciador<400> 88

ccggaattcg atatctgggc wggkaatgcc aaygarttra atgc<210> 89<211> 44<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> PDC1 iniciador<220>

<221> misc_feature<222> (21)..(21)<223> n é a, c, g, ou t<220><221> misc_feature<222> (33)..(33)<223> n é a, c, g, ou t<400> 89

cgcggattca ggcctcagta ngaraawgaa ccngtrttra arte 44<210> 90<211> 28<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> iniciador de seqüência PDC1<400> 90

atggcaagag aggaaaaacc tcgtaaag 28<210> 91<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<400> 91

ccacgaagag tcattgaaga accttaa 27<210> 92<211> 714<212> DNA

<213> Pichia membranifaciens <400> 92

gggtatgaag ctgatggata ctccagagtc aacggctttg catgcctggt taccaccttc 60ggtgtcggcg aattgtctgc tgtcaacgcc gttgcaggtg cgtatgcaga gcacattcca 120ttaatccacg tggtcggtat gccttccatc tccgccgaga agcaaaagct tctacttcac 180cacacgttag gtgattcgag gttcgatgataagctcaagg ttatcactga gtttgacgatacagccatac tcaccaagag accggtttatttgataccag cctccgattt gacaaagtacgaagagtctg aaaatgagtt tgtggaaaaccctgtgattt tggttgatgc ctgtgcttccgttgctagac ttacaaagtt cccagtttttgaagacaata gcgaatatta cggtatgtacgagatcgtcg agtccacaga ctgtatcatc<210> 93<211> 957<212> DNA

<213> Bacillus megaterium<400> 93

atgaaaacac aatttacacc aaaaacacgaggctcaagct acgctttttc aatggtgaatgatatgaacà aagaaaaagc agaaggtgaagccacaccga tgaaaatctg ggctggagatgttattacag cgggcgctaa tcaagctcca

aacgttaaaa ttttcgaatg cattgtaaaaattttagtgg caacaaatcc agttgatattttaccaaacg gacgggtaat tggttcaggattgttaagcg actatttcga agtagattctcatggagata cggaatttcc tgtttggagc

cattttatca atactgccgc tattgaaaaaacccgcgatg cggcttacca tattattaatatggggcttg tacgcattac caaggctatttctgctttat tagaaggaca atacggtatt

tttaccgcaa tgtcccagaa gatcagcatc 240

gcaccaaagg ttataaacga cttgattgaa 300

ctcggtttcc caagtaactt ttcagaggca 360

aagcttaagt tgtctttgcc tccaaacaat 420

gttattcagc tgatggagaa ggctaagaac 480

cgtcatgctg tcattgaaca agttgaagaa 540

accactccaa tgggtaaagg ctctttcaac 600

attggtgctt tatctgctcc tgatgttaag 660

tctatcggtg ggttattatc agat 714

aaagttgccg ttatcggaac tggttttgtt 60

caaggtattg ccaatgaatt agtgttaatc 120

gcacgtgata tcaatcatgg aatgccattt 180

tataaagact gtgctgacgc tgatttagca 240

ggggaaacac gcttagatct agttgaaaaa 300

gatattatga acagcggatt tgacggcatc 360

ctcgcacacg ttacacaaaa agtatcagga 420

acgattcttg acacagctcg cttccgctac 480

cgcaacgtcc acgcttatat tatgggggaa 540

cacgcgcaaa ttggcggtgt gaagctcgaa 600

gaaccggata tgcagcatct attcgaacaa 660

cgaaaaggag cgacttatta cggaattgca 720

ttagatgatg aaaattctat tttaacagta 780

tctgatgtgt atatcggcgt accagctatc 840attaataaaa acggcgtgcg tcaaattatt gaattgaatt taactcctca cgaacagcag 900cagctcgagc actctgctag cattcttaag caaactcgcg acagagcttt tgtgtaa 957<210> 94<211> 972<212> DNA

<213> Lactobacillus helveticus<400> 94

atggcaagag aggaaaaacc tcgtaaagtt attttagtcg gtgatggtgc tgtaggttct 60

acctttgcat tttcaatggt acaacaaggt atcgctgaag aattaggtat tatcgatatc 120

gctaaggaac acgttgaagg tgacgcaatc gatttagctg acgcaactcc ttggacttct 180

ccaaagaaca tttacgcagc tgactaccca gattgtaagg atgctgactt agttgttatt 240

actgctggtg ctccacaaaa gccaggcgaa actcgtcttg atcttgttaa caagaacttg 300

aagattttat catcaatcgt tgaaccagtt gttgaatcag gttttgaagg tattttctta 360

gtagttgcta acccagttga tatcttaact cacgcaactt ggagaatgtc aggcttccct 420

aaggatcgtg ttatcggttc aggtacttca cttgatactg gtcgtcttca aaaagttatt 480

ggtaaaatgg aaaacgttga cccaagttca gttaatgcat acatgcttgg tgaacacggt 540

gatactgaat tcccagcatg gagctacaac aatgttgctg gcgtaaaggt tgctgactgg 600

gttaaggctc acaacatgcc tgaatctaag cttgaagaca tccaccaaga agttaaggac 660

atggcttacg acattattaa caagaaaggt gctaccttct acggtatcgg tactgcttca 720

gcaatgatcg ctaaggctat cttgaacgat gaacaccgtg tacttccact ttcagtacca 780

atggatggtg aatatggttt acacgatctt cacatcggta ctcctgcagt tgttggccgc 840

aagggtcttg aacaagttat cgaaatgcca ttaagcgata aggaacaaga attaatgact 900

gcttcagcag atcaattaaa gaaggttatg gacaaggcct tcaaagaaac tggcgttaag 960

gttcgtcaat as 972<210> 95<211> 318<212> PRT

<213> Bacillus megaterium<400> 95

Met Lys Thr Gin Phe Thr Pro Lys Thr Arg Lys Vai Ala Vai lie Gly

1 5 10 15

Thr Gly Phe Vai Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Met Vai Asn Gln Gly

20 25 30

lie Ala Asn Glu Leu Vai Leu lie Asp Met Asn Lys Glu Lys Ala Glu

35 40 45

Gly Glu Ala Arg Asp lie Asn His Gly Met Pro Phe Ala Thr Pro Met

50 55 60

Lys lie Trp Ala Gly Asp Tyr Lys Asp Cys Ala Asp Ala Asp Leu Ala65 70 75 80

vai lie Thr Ala Gly Ala Asn Gln Ala Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

85 90 95

Leu Vai Glu Lys Asn Vai Lys lie Phe Glu Cys lie Vai Lys Asp lie

100 105 110

Met Asn Ser Gly Phe Asp Gly lie lie Leu Vai Ala Thr Asn Pro Vai

115 120 125

Asp lie Leu Ala His Vai Thr Gln Lys Vai Ser Gly Leu Pro Asn Gly

130 135 140

Arg Vai lie Gly Ser Gly Thr lie Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Tyr145 150 155 160

Leu Leu Ser Asp Tyr Phe Glu Vai Asp Ser'Arg Asn Vai His Ala Tyr

165 170 175

lie Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Vai Trp Ser His Ala

180 185 190

Gln lie Gly Gly Vai Lys Leu Glu His Phe lie Asn Thr Ala Ala lie

195 200 205

Glu Lys Glu Pro Asp Met Gln His Leu Phe Glu Gln Thr Arg Asp Ala210 215 220

Ala Tyr His lie lie Asn Arg Lys Gly Ala Thr Tyr Tyr Gly lie Ala225 230 235 240

Met Gly Leu Vai Arg lie Thr Lys Ala lie Leu Asp Asp Glu Asn Ser245 250 255

lie Leu Thr Vai Ser Ala Leu Leu Glu Gly Gin Tyr Gly lie Ser Asp260 265 270

Vai Tyr lie Gly Vai Pro Ala lie lie Asn Lys Asn Gly Vai Arg Gln275 280 285

lie lie Glu Leu Asn Leu Thr Pro His Glu Gin Gin Gin Leu Glu His290 295 300

Ser Ala Ser lie Leu Lys Gin Thr Arg Asp Arg Ala Phe Vai305 310 315

<210> 96<211> 323<212> PRT

<213> Lactobacillus helveticus<400> 96

Met Ala Arg Glu Glu Lys Pro Arg Lys Vai lie Leu Vai Gly Asp Gly1 5 10 15

Ala Vai Gly ser Thr Phe Ala Phe ser Met Vai Gin Gin Gly lie Ala

20 25 30

Glu Glu Leu Gly lie lie Asp lie Ala Lys Glu His Vai Glu Gly Asp35 40 45

Ala lie Asp Leu Ala Asp Ala Thr Pro Trp Thr Ser Pro Lys Asn lie50 55 60

Tyr Ala Ala Asp Tyr Pro Asp Cys Lys Asp Ala Asp Leu Vai Vai lie65 70 75 80Thr Ala Gly Ala Pro Gin Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Vai

85 90 95

Asn Lys Asn Leu Lys lie Leu Ser Ser lie Vai Glu Pro Vai Vai Glu100 105 110

Ser Gly Phe Glu Gly lie Phe Leu Vai Vai Ala Asn Pro Vai Asp lie115 120 125

Leu Thr His Ala Thr, Trp Arg Met Ser Gly Phe Pro Lys Asp Arg vai

130 135 140

lie Gly ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Gly Arg Leu Gln Lys Vai lie145 150 155 160

Gly Lys Met Glu Asn Vai Asp Pro Ser Ser Vai Asn Ala Tyr Met Leu

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Ala Trp Ser Tyr Asn Asn Vai180 185 190

Ala Gly Vai Lys Vai Ala Asp Trp Vai Lys Ala His Asn Met Pro Glu195 200 205

Ser Lys Leu Glu Asp Ile.His Gln Glu Vai Lys Asp Met Ala Tyr Asp

210 215 220

lie lie Asn Lys Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly lie Gly Thr Ala Ser225 230 235 240

Ala Met lie Ala Lys Ala lie Leu Asn Asp Glu His Arg Vai Leu Pro

245 250 255

Leu Ser Vai Pro Met Asp Gly Glu Tyr Gly Leu His Asp Leu His lie260 265 270

Gly Thr Pro Ala vai vai Gly Arg Lys Gly Leu Glu Gln Vai lie Glu275 280 285

Met Pro Leu Ser Asp Lys Glu Gln Glu Leu Met Thr Ala Ser Ala Asp290 295 300Gin Leu Lys Lys Vai Met Asp Lys Ala Phe Lys Glu Thr Gly Vai Lys

Vai Arg Gln<210> 97<211> 1728<212> DNA

<213> Issatchenkia orientalis<400> 97

atgactgaca aaatctccct aggtacttat ctgtttgaaa agttaaagga agcaggctct 60

tattccatct ttggtgttcc tggtgatttc aatttggcat tgttggacca cgtcaaggaa 120

gttgaaggca ttagatgggt cggtaacgct aacgagttga atgccggcta cgaagctgat 180

ggttatgcaa gaatcaatgg atttgcatcc ctaatcacca cctttggtgt cggtgaattg 240

tctgccgtca atgccattgc aggttcttat gctgaacacg tcccattgat ccatattgtt 300

ggtatgcctt ccttgtctgc tatgaagaac aacttgttgt tacaccatac cttgggtgac 360

acaagattcg acaacttcac cgaaatgtca aagaaaatca gtgcaaaggt tgaaattgtt 420

tacgatttgg aatcagctcc aaaattaatt aataacttga ttgaaaccgc ttatcacaca 480

aagagaccag tctacttggg acttccttcc aactttgctg atgaattggt tccagcggca 540

ttagttaagg aaaacaagtt acatttagaa gaacctctaa acaaccccgt tgctgaagaa 600

gaattcattc ataacgttgt tgaaatggtc aagaaggcag aaaaaccaat cattctcgtt 660

gacgcttgtg ctgcaagaca taacatttct aaggaagtga gagagttggc taaattgact 720

aaattccctg tcttcaccac cccaatgggt aaatctactg ttgatgaaga tgatgaagaa 780

ttctttggct tatacttggg ttctctatct gctccagatg ttaaggacat tgttggccca 840

accgattgta tcttatcctt aggtggttta ccttctgatt tcaacaccgg ttccttctca 900

tatggttaca ccactaagaa tgtcgttgaa ttccattcca actactgtaa attcaaatct 960

gcaacttatg aaaacttgat gatgaagggc gcagtccaaa gattgatcag cgaattgaag 1020

aatattaagt attccaatgt ctcaacttta tctccaccaa aatçtaaatt tgcttacgaa 1080

tctgcaaagg ttgctccaga aggtatcatc actcaagatt ãcctgtggaa gagattatct 1140

tacttcttaa agccaagaga tatcattgtc actgaaactg gtacttcctc ctttggtgtc 1200ttggctaccc acttaccaag agattcaaag tctatctccc aagtcttatg gggttccatt 1260

ggtttctcct taccagctgc agttggtgct gcatttgctg ctgaagatgc acacaaacaa 1320

actggcgaac aagaaagaag aactgttttg tttattggtg atggttcttt acaattgact 1380

gtccaatcaa tctcagatgc tgcaagatgg aaoatcaagc catacatctt catcttaaac 1440

aacagaggtt acactatcga aaagttgatc cacggtcgtc atgaggacta caaccaaatt 1500

caaccatggg atcaccaatt gttattgaag ctctttgctg acaagaccca atatgaaaac 1560

catgttgtta aatccgctaa ggacttggac gctttgatga aggatgaagc attcaacaag 1620

gaagataaga ttagagtcat tgaattattc ttggatgaat tcgatgctcc agaaatcttg 1680

gttgctcaag ctaaattatc tgatgaaatc aactctaaag ccgcttaa 1728

Claims

1. Célula de levedura geneticamente modificada deuma espécie dentro do ciado I. oríentalis/P. fermentans,CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos um gene delactato desidrogenase (LDH) exógeno.

2. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que é da espécie Issat-chenkia orientalis, Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149(designação NRRL), Cândida ethanolica, P. deserticola, P.membranifaciens ou P. fermentans.

3. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pêlo fato de que o gene LDH exógeno es-tá integrado no genoma da célula de levedura.

4. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene LDH exógeno éum gene LDH funcional que é pelo menos 35% idêntico a um ge-ne L-LDH funcional de qualquer uma das espécies Lactobacil-lus helveticus, L. casei, Bacillus megaterium, Pediococcusacidilactici, Bos taurus ou Rhizopus oryzae.

5. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene LDH exógeno éum gene LDH funcional que codifica uma. proteína pelo menos80%. idêntica àquela codificada por um gene L-LDH funcionalde qualquer uma das espécies Lactobacillus helveticus, L.casei, Bacillus megaterium, Pediococcus acidilactici, Bostaurus ou Rhizopus oryzae.

6. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene LDH exógenofuncional codifica uma proteína que é, pelo menos, 60% idên-tica a pelo menos uma dentre SEQ. ID. NO. 93, SEQ. ID. NO. 94, SEQ. ID. NO. 95 ou SEQ. ID. NO. 96.

7. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene LDH exógeno éum gene D-LDH funcional que é pelo menos 45% idêntico a umgene D-LDH funcional de qualquer uma das espécies L. helve-ticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, L. delbrueckii, P. aci-dilactici, L. plantarum e L. pentosus.

8. Célula de levedura, de acordo com a reivindica-ção 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o gene LDH exógeno éum gene LDH funcional que codifica uma proteína pelo menos45% idêntica àquela codificada por um gene D-LDH funcionalde qualquer uma das espécies L. helveticus, L. johnsonii, L.bulgaricus, L. delbrueckii, P. addilactici, L. plantarum eL. pentosus.

9. Célula de levedura, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que tem umadeleção ou- ruptura de um gene piruvato descarboxilase (PDC)nativo.

10. Célula de levedura, de acordo com a reivindi-cação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que é incapaz de produ-zir etanol.

11. Célula de levedura, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o geneLDH exógeno está sob o controle transcricional de um promo-tor que é nativo para uma célula de levedura.

12. Célula de levedura, de acordo com a reivindi-cação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que o promotor é nativoà célula hospedeira.

13. Célula de levedura, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o geneLDH é integrado em um local de um gene PDC nativo.

14. Célula de levedura, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que a célu-la hospedeira é I. orientalis ou P. membranifaciens.

15. Célula de levedura, de acordo com a reivindi-cação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeiraé I. orientalis ou P. membranifaciens.

16. Célula de levedura, de acordo com a reivindi-cação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula hospedeiraé I. orientalis ou P. membranifaciens.

17. Célula de levedura, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que adicio-nalmente tem pelo menos uma outra modificação genética sele-cionada a partir de (1) uma inserção de um gene xilose iso-merase funcional exógeno, (2) uma deleção ou ruptura de umgene nativo que produza uma enzima que catalise a conversãode xilose para xilitol, (3) uma deleção ou ruptura.de um ge-ne xilitol desidrogenase funcional e/ou (4) uma modificaçãoque faça com que a célula super-expresse uma xiluloquinasefuncional.

18. Célula de levedura de uma espécie do ciado Is-satchenkia orientalis/'P. Fermentans, CARACTERIZADA pelo fatode que tem pelo menos mais uma modificação genética selecio-nada a partir de (1) uma inserção de um gene xilose isomera-se funcional exógeno, (2) uma deleção ou ruptura de um genenativo que produza uma enzima que catalise a conversão dexilose para xilitol, (3) uma deleção ou ruptura de um genexilitol desidrogenase funcional e/ou (4) uma modificação quefaça com que a célula super-expresse uma xiluloquinase fun-cional.

19. Célula de levedura, de acordo com a reivindi-cação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que é da espécie Issat-chenkia orientalis, Pichia galeiformis, Pichia sp. YB-4149(designação NRRL), Cândida ethanolica, P. desertícola, P.membranifaciens ou P. fermentans.

20. Processo, de fermentação, CARACTERIZADO pelofato de que uma célula de levedura geneticamente modificada,conforme definida na reivindicação 1, é cultivada sob condi-ções de fermentação em um caldo de fermentação que inclui umaçúcar fermentável para a produção de ácido lático ou de umsal do mesmo.

21. Processo de fermentação, de acordo com a rei-vindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar fer-mentável inclui glicose.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que o pH do caldo de fermen-tação durante pelo menos uma parte do período de fermentaçãoestá na faixa de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 4,5.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH do caldo de fermentaçãodurante pelo menos uma parte do período de fermentação estáno intervalo de aproximadamente 1,9 a aproximadamente 3,5.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH do caldo de fermentaçãoestá dentro do intervalo de aproximadamente 1,9 a aproxima-damente 3,5 durante todo o periodo de fermentação.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 23,CARACTERIZADO pelo fato de que o pH do caldo de fermentaçãono inicio da fermentação é de aproximadamente 3,5 a aproxi-madamente 6, e o pH cai durante a fermentação para aproxima-damente 1,9 a aproximadamente 3,5.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma fermentação anaeró-bia ou microaeróbia.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou-21, CARACTERIZADO pelo fato de que é uma fermentação quaseanaeróbia ou anaeróbia.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 20 ou-21., CARACTERIZADO pelo fato de que o rendimento de lactatoem glicose é 0,55 - 0,95 g/g

29. Processo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende arecuperação do lactato do caldo de fermentação.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende aprodução de lactideo do lactato recuperado.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende a.polimerização do lactideo para formar um po-li (lactideo)polimero..

32. Vetor de transformação de levedura,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um gene . lactatodesidrogenase funcional opefativamente ligado a uma seqüên-cia promotora que é nativa a uma espécie do ciado I. orien-talís/P. fermentans.

33. Vetor de' transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a se-qüência promotora é nativa para I. orientalis, Pichia galei-formis, Pichia sp. YB - 4149 (designação NERL), Cândida e-thanolica, P. deserticola, P. membranifaciens ou P. fermentans.

34. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de queo gene LDH exógeno é um gene LDH funcional que é pelo menos-35% idêntico a um gene L-LDH funcional de qualquer uma dasespécies Lactobacillus helveticus, L. casei, Bacillus Mega-terium, Pediococcus acidilactici ou Rhizopus oryzae.

35. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de queo gene LDH exógeno é um gene LDH funcional que codifica umaproteína pelo menos 35% idêntica àquela codificada por umgene L-LDH funcional de qualquer uma das espécies Lactoba-cillus helveticus, L. casei, Bacillus megaterium, Pediococ-cus acidilactici ou Rhizopus oryzae.

36. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o ge-ne LDH exógeno codifica uma proteína funcional que é pelomenos 60% idêntica a pelo menos uma dentre SEQ. ID. NO. 93,SEQ. ID. NO. 94, SEQ. ID. NO. 95 ou SEQ. ID. NO. 96.

37. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de queo gene LDH exógeno é um gene D-LDH funcional que é pelo me-nos 45% idêntico a um gene D-LDH funcional de qualquer umadas espécies L. helveticus, L. Johnsonii, L. bulgaricus, L.delbrueckii, P. acidilactici, L. plantarum e L. pentosus.

38. Vetor de transformação, de levedura, de acordocom a reivindicação 32 ou 33, CARACTERIZADO pelo fato de queo gene LDH exógeno é um gene LDH funcional que codifica umaproteina pelo menos 45% idêntica àquela codificada por umgene D-LDH funcional de qualquer uma das espécies L. helve-ticus, L. johnsonii, L. bulgaricus, P. acidilactici, L. del-brueckii, L. plantarum e L. pentosus.

39. Vetor de transformação de levedura,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um gene LDH casse-te posicionado entre uma seqüência acima (5'), bem como umaseqüência abaixo (3'), o gene LDH cassete incluindo um genelactato desidrogenase funcional funcionalmente ligado a umpromotor e terminador que são, cada um, operantes em pelomenos uma espécie de levedura do ciado J. orientalis/P. fer-mentans e as seqüências acima (5')" e abaixo (3') sendo acimae abaixo de regiões flanqueadoras para um gene nativo em umaespécie de levedura do ciado I. Orientalis/P. fermentans.

40. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que pelomenos um gene marcador cassete, que inclui um gene marcadorfuncionalmente ligado a uma seqüência promotora e a uma se-qüência terminadora que são, cada uma, operantes em uma es-pécie de levedura do ciado J. orientalis/P. fermentans tam-bém está posicionado entre as referidas seqüências acima eabaixo.

41. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de queas seqüências acima e abaixo são regiões flanqueadoras 5'- e 3'-,respectivamente, de um gene piruvato descarboxilase de I. orientalis.

42. Vetor de transformação de levedura, de acordocom a reivindicação 39 ou 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo promotor do gene LDH cassete é um promotor que é nativo deum gene I. orientalis.

43. Célula de levedura geneticamente modificada deuma determinada espécie no ciado I. orientalis/P. fermen-tans, CARACTERIZADA pelo fato de que tem a capacidade deproduzir ácido lático.

44. Processo de fermentação, CARACTERIZADO pelofato de que uma célula de levedura geneticamente modificadaconforme definida na reivindicação 43 é cultivada sob condi-ções de fermentação em um caldo de fermentação que inclui umaçúcar fermentável para a produção de ácido lático ou de umsal do mesmo.

45. Célula geneticamente modificada, CARACTERIZADApelo fato de que é de uma determinada espécie no ciado I.orientalis/P. Fermentans.