KR102208959B1 - 락테이트 데히드로게나제가 활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있거나, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자를 포함하는 효모 세포 및 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

락테이트 데히드로게나제가 활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법{Yeast cell with activated lactate dehydrogenase and method for producing lactate using the same}

락테이트 데히드로게나제가 활성화된 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.

락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.

PLA는 기술적으로는 고분자 중합을 위해 다이머인 락티드 (lactide)로 전환하여 개환 중합된 (ring-open polymerization) 폴리에스터계 수지이며, 필름, 시트, 섬유, 사출 등의 다양한 가공이 가능하다. 따라서, PLA는 폴리에틸렌 (PE), 폴리프로필렌 (PP), 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET), 폴리스틸렌 (PS) 등 기존 범용 석유화학 플라스틱을 광범위하게 대체할 수 있는 바이오 플라스틱으로서 최근 수요가 크게 증가하고 있다.

또한, 락테이트는 수산기와 카르복실기를 동시에 갖고 있어 반응성이 매우 크고, 그에 따라 락테이트 에스테르, 아세트알데이드, 프로필렌글리콜 등 공업적으로 중요한 화합물로의 전환이 용이하여, 화학공업 분야에 있어서도 차세대 대체 화학 원료로서 주목받고 있다.

현재, 락테이트는 산업적으로 석유화학적 합성 공정과 생물공학적 발효 공정에 의해 생산되고 있다. 석유화학적 합성 공정은, 원유에서 유래된 에틸렌을 산화시키고, 아세트알데히드를 거쳐 시안화수소 첨가 반응에 의해 락토니트릴을 만든 후, 증류시켜 정제하고, 염산이나 황산을 사용하여 가수분해함으로써 제조된다. 또한, 생물공학적 발효 공정은 전분, 수크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스, 자일로스 등의 재생가능한 탄수화물을 기질로 하여 락테이트를 제조할 수 있다.

따라서, 이러한 종래 기술에 의하더라도, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있는 균주 및 그를 이용한 락테이트 생산 방법이 요구되고 있다.

일 양상은 락테이트 생산능이 향상된 효모 세포를 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

일 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 효모 세포를 제공한다. 상기 효모 세포에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래일 수 있다.

다른 양상은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자를 포함하는 효모 세포로서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래의 것인 효모 세포를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "락테이트 (lactate)"는 "젖산 (lactic acid)" 또는 그의 염을 의미한다.

또한, 상기 효모 세포는 사카로마이세스 속일 수 있다. 상기 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus) 일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 락테이트 생산용 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 이러한 변이 효모 세포는 예를 들면, 우라신, 설파구아니딘, 설파티아졸, 아자세린, 트리메토프림, 또는 모노플루오로아세테이트에 대하여 내성을 가질 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다. 상기 활성은 대조군 대비 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다.

상기 효모 세포에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 발현의 증가에 의하여 증가된 것일 수 있다.

상기 발현의 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자는 외인성 유전자일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 이종성(heterogenous)일 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 외인성 유전자는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 발현을 가능하게 하는 프로모터의 다운스트림 위치(downstream position)에 도입될 수 있다. 또한, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 게놈에 포함될 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 L-LDH 또는 D-LDH의 생산에 특이적이어서, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한 효모 세포는 L-락테이트 거울상 이성질체 또는 D-락테이트 거울상 이성질체, 또는 그의 염을 생산할 수 있다.

락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자에 의하여 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피수가 증가될 수 있다.

상기 효모 세포는 단일 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 또는 1 내지 10 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자와 같은 복수의 유전자를 포함할 수 있다. 상기 복수의 유전자는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자일 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 경우, 각각의 유전자는 동일한 유전자의 카피이거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다. 상기 외인성 락테이트 데히드로게나제는 효모 세포의 내인성 락테이트 데히드로게나제보다 활성이 좋은 것일 수 있다.

상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 진균은 소르다리아 속을 포함할 수 있다. 상기 소르다리아 속은 소르다리아 마크로스포라 (Sordaria macrospora), 소르다리아 피미콜라 (Sordaria fimicola), 소르다리아 알치나 (Sordaria alcina), 소르다리아 아라네오사 (Sordaria araneosa), 소르다리아 브레비콜리스 (Sordaria brevicollis), 소르다리아 에퀴나 (Sordaria equina), 소르다리아 헤테로탈리스 (Sordaria heterothallis), 소르다리아 후마나 (Sordaria humana), 소르다리아 라페 (Sordaria lappae), 소르다리아 스클레로게니아 (Sordaria sclerogenia), 소르다리아 수페르바 (Sordaria superba), 또는 소르다리아 토멘토-알바 (Sordaria tomento - alba)일 수 있다.

또한 상기 발현의 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 락테이트 데히드로게나제의 활성 증가는 락테이트 데히드로게나제의 돌연변이에 의한 변형에 의한 것일 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있고, 이는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 LDH를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 CYC 프로모터, TEF 프로모터, GPD 프로모터, 및 ADH 프로모터는 각각 서열번호 9, 10, 11, 및 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c transcription), 및 GAL1로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다.

"락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: LDH)"는 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 "감소"는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 조작된 상기 효모 세포에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다.

상기 미생물은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다.

용어 "불활성화 (inactivation)"는 전혀 발현이 되지 않는 유전자 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없는 유전자가 생성되는 것을 의미할 수 있다. 용어 "감소 (depression)"는 유전자의 발현이 조작되지 않은 효모 세포에 비하여 낮은 수준으로 발현되거나, 또는 발현이 되더라도 그 활성이 낮은 것을 의미할 수 있다. 상기 활성은 적절한 대조군 종에 비하여, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.

상기 불활성화 또는 감소는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 한 후, 상동재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다. 상기 선별 마커는 물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성, 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커일 수 있다.　

피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1 또는 pdc2일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 효모 세포로서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래인 것인 세포이고; 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 수탁번호 KCTC 12443BP일 수 있다. 상기 효모 세포는 소비된 글루코스 대비 생산된 락테이트의 비율인 약 1.50 내지 약 1.95% 이상, 예를 들면 약 1.70% 내지 약 1.95%, 약 1.75% 내지 약 1.95%, 약 1.8% 내지 약 1.95%, 약 1.85% 내지 약 1.95%, 또는 약 1.90% 내지 약 1.95%의 수율로 락테이트를 생산할 수 있다.

또한, 상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성, 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GDP1)일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gdp1일 수 있다.

상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 효모 세포로서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래인 것인 세포이고; 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트(DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 소비된 글루코스 대비 생산된 락테이트의 비율인 약 57.20% 내지 약 58.50% 이상, 예를 들면 약 57.50% 내지 약 58.50%, 약 57.53% 내지 약 58.50%, 약 57.53% 내지 약 58.45%, 또는 약 57.53% 내지 약 58.40%의 수율로 락테이트를 생산할 수 있다.

피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있거나, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 도입된 유전자를 포함하는 효모 세포로서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래인 것인 세포를 제작하기 위한, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 내에서 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있기에 적합한 조절 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프로모터는 유전자를 코딩하는 서열과 작동적으로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미할 수 있다. 이로 인해, 상기 조절 서열은 상기 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역을 조절할 수 있다.

상기 효모 발현 벡터는 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터일 수 있고, 그의 예로 pYepSec1, 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa, pJRY88, 또는 pYES2를 포함할 수 있다.

발현 벡터로서 작동하려면, 복제원점, 프로모터, 다중 클로닝 사이트 (multiple cloning site: MCS) 및 선택 마커를 포함할 수 있다. 복제원점은 플라스미드가 숙주 세포의 염색체와 별도로 복제할 수 있는 기능을 부여해주고, 프로모터는 삽입되는 외래유전자의 전사 과정에 작용을 하며, MCS는 외래 유전자가 다양한 제한효소 사이트를 통해 삽입될 수 있게 하며, 선별 마커는 벡터가 숙주 세포에 제대로 들어갔는지를 확인시켜 주는 역할을 한다. 선별 마커는 항생제 내성유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 선별 마커는 영양요구성 유전자 (auxotrophic gene)를 포함하며, 예를 들어 우라실, 트립토판, 루신, 및 히스티딘으로부터 선택되는 것에 대해 영양요구성을 제공하는 유전자를 포함할 수 있다.

다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계; 및 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.

상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.

상기 유전적으로 조작된 효모 세포에서 락테이트를 수득하기 위하여 배양 조건을 적절히 조절할 수 있다. 상기 세포는 증식을 위하여 호기성 조건에서 배양한다. 그 후 락테이트를 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 조건에서 배양한다. 상기 혐기 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 또는 0 내지 2%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.

용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함된다. 구체적으로 글루코오즈, 프럭토오즈, 만노오즈, 또는 갈락토오즈가 이용될 수 있다. 효모 세포가 이용할 수 있는 질소원은 유기질소화합물, 또는 무기질소화합물일 수 있다. 구체적으로 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.

배양물로부터의 락테이트의 분리는 당해 기술분야에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법은 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피 또는 결정화 등의 방법일 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 락테이트 생산능을 가질 수 있다.

일 양상에 따른 벡터에 의하면 락테이트 생산능을 가진 효모 세포의 제조 방법에 이용될 수 있다.

일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 효율적으로 생산할 수 있다.

도 1은 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다.
도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.
도 3은 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 5는 효모 세포의 락테이트를 생산하는 경로에 대한 모식도이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 락테이트 생산을 위한 락테이트 데히드로게나제 (L- LDH ) 과발현 벡터의 제작

락테이트 데히드로게나제 (L-LDH)를 과발현 하기 위한 카세트를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애에서 유전자 발현을 유도한다고 알려진 CCW12 유전자의 프로모터 부분(CCW12p)을 클로닝하기 위해 사카로 마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, 유전자형: MATα ura3-52; trp1-289; leu2-3,112; his3ㅿ1; MAL2-8^C; SUC2, EUROSCARF accession number: 30000B)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 14과 15의 프라이머를 사용하여 PCR (95℃ 4분, 30번 반복으로 94℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 1분 수행 후 72℃ 10분)을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.

그 후 소르디아 마크로스포라 (Sordaria macrospora)로부터 유래한 서열번호 2의 L-LDH 유전자(SmLDH)(코스모진텍)를 제한효소 EcoRI과 HindIII으로 절단하고 이를 p416-CCW12p에 라이게이션하여 p416-CCW12-SmLDH을 제작하였다.

실시예 2. PDC1 유전자 결실 카세트 제작

피루베이트로부터 에탄올을 생산하는데 관여하는 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase 1, PDC1)을 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 유전자 결실 벡터를 다음과 같이 제작하였다.

항생제 마커를 사용하기 위하여 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae , CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 16와 17의 프라이머를 사용하여 Gal10 터미네이터 (Gal10t) PCR절편을 제작한 후 NotI으로 절단하고 이를 pGEM-5Zf (Promega USA)에 도입하여 pGEM-Gal10t를 제작하였다.

또한 서열번호 18과 19을 사용하여 PDC 프로모터 (PDCp)를 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae, CEN.PK2-1D)의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후 제작된 절편을 EcoRI로 절단하고 이를 동일한 EcoRI로 절단된 pGEM-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-Gal10t을 제작하였다. 도 1은 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 제네티신 항생제 저항성 유전자인 NPT를 삽입하여 과발현하기 위하여 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터를 제작하였다.

그 후, 서열번호 20과 21의 프라이머를 사용하여 제네티신 (G418) 항생제에 내성을 갖게 할 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (neomycin phosphotransferase, NPT) 유전자를 pcDNA3.3-TOPO (Invitrogen 社)를 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 후, 수득된 절편을 XhoI과 BamHI으로 절단하고 이를 동일한 제한효소로 절단된 pGEM-PDCp-Gal10t에 라이게이션하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t을 제작하였다. 도 2는 pGEM-PDCp-Gal10t 벡터의 모식도이다. 상기 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t 벡터는 PDC1을 결실하기 위한 카세트 제작의 주형이 되는 NPT 과발현 결실 벡터이다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여 pGEM-PDCp-NPT-Gal10t를 주형으로 하고, 하기 서열번호 22과 23의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

실시예 3. PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제작

사카로마이세스 세레비지애에서 PDC1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 도 3은 모균주 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D에서 PDC1이 결실된 변이균주를 제작하는 과정을 나타낸 것이다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여, 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 사카로마이세스 세레비지애 세포를 수득한 다음, 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 재현탁한 세포를 수득한 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 수득된 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

PDC1 제거를 위해 실시예 2에서 제작된 PDC1 유전자 결실카세트 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 약 100 ug/ml 제네시틴이 함유되어 있는 YPD 고체 배지에 옮겼다. 이와 동시에, 동일한 성분의 액체 배지에 선별된 콜로니를 배양한 후 배양한 콜로니로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 변이 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PDC1 결실을 확인하기 위해 하기 서열번호 24과 25의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PDC1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1)를 수득하였다.

실시예 4. PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 소르다리아 마크로스포라 유래 L- LDH 과발현 벡터 도입

(4.1) PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 소르다리아 마크로스포라 유래 L- LDH 과발현 벡터 도입된 균주 제작

실시예 1에서 제작한 p416-CCW12-SmLDH 플라스미드를 실시예 3의 PDC1이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1) 균주에 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 제작한 p416-CCW12-SmLDH 플라스미드를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 SmLDH를 포함한 플라스미드를 확인하기 위해 하기 서열번호 26와 27의 프라이머 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-CCW12-SmLDH임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+SmLDH)를 수득하였다.

PDC1이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 소르다리아 마크로스포라 유래 L-LDH 과발현 벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+SmLDH)를 2013년 7월 11일에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12443 BP호를 부여받았다.

(4.2) PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 일본 자라( Pelodiscus sinensis japonicus ) 유래 L- LDH 과발현 벡터 도입된 균주 제작

일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh (PsLDH) (서열번호 28)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29와 30의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 실시예 1에서 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다.

또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 31의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 9의 CYC 프로모터, 서열번호 11의 GPD 프로모터, 및 서열번호 13의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 18의 일본 자라 유래의 L-ldh를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다. 도 4는 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 LDH (PsLDH)가 도입되어 있다.

제작된 p416-CCW12p-LDH 벡터를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 PsLDH를 포함한 플라스미드를 확인하기 위해 하기 서열번호 29와 30의 프라이머 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-CCW12-PsLDH임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+PsLDH)를 수득하였다.

실시예 5. 소르다리아 마크로스포라 유래 L- LDH 가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용한 L- 락테이트 생산

실시예 4.1에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+SmLDH)를 YSD (-ura) 고체배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후 40 g/L 포도당을 포함한 50 ml YSD (-ura)에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.

발효는 상기의 50 ml의 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+SmLDH) 배양액 내의 세포 농도를 분광광도계를 이용하여 광학 밀도 (optical density, OD)가 약 600 nm에서 약 5.0이 되는 양을 정량한 후, 원심분리 하여 상층액을 버린 후 세포를 재현탁하여 약 40 g/L 포도당이 포함된 새로운 약 50 ml의 YSD (-ura)에 다시 접종하여 실시하였다. 약 90 rpm을 유지하는 교반 배양기에서 약 30℃에서 약 8시간 동안 배양하여 세포를 발효하였다. 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하여, 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물, 락테이트, 및 글리세롤의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.

또한, 실시예 4.2에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿPDC1+PsLDH)도 상술한 조건과 동일한 방법으로 배양하여 발효한 후, 각종 대사산물, 락테이트, 및 글리세롤의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, SmLDH 과발현 벡터가 도입된 균주는 일본 자라 유래의 L-LDH(PsLDH)가 도입된 균주보다 우수한 락테이트 생산성을 보일 뿐만 아니라 비해 수율도 상승하였다. 대조군인 PsLDH 과발현 벡터가 도입된 균주에 비해 락테이트 생산성은 약 610 mg/L에서 약 1,110 mg/L로 상승하였고, 수율은 약 1.69%에서 약 1.94%로 향상되었다.

PDC1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애에 도입된 벡터	% 수율 (g/g)	락테이트 ( mg /L)	글리세롤 (g/L)
SmLDH 과발현 벡터	1.94	1,110	1.34
PsLDH 과발현 벡터	1.69	610	1.07
control	0.00	0.00	1.11

SmLDH: 소르다리아 마크로스포라 유래 L-LDH

PsLDH: 일본 자라(Pelodiscus sinensis japonicus) 유래 L-LDH

control: 빈 벡터

실시예 6. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작 및 발현 벡터의 제작

사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae CEN . PK2 -1D( MATα ura3 -52; trp1-289; leu2 -3,112; his3ㅿ1; MAL2 -8 ^C ; SUC2 ))를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 제거하여 락테이트 생산을 위한 균주로 활용하였다. 또한, 락테이트 생산을 위해 상기 3개의 유전자를 제거하는 동시에 각 제거 위치에 서열번호 28의 락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: ldh) 유전자를 삽입하여, 3개의 카피의 락테이트 데히드로게나제를 삽입하였다.

상기 각 유전자의 제거 및 락테이트 데히드로게나제 유전자의 동시 삽입은 제거하고자 하는 각 유전자의 코딩 영역 (open reading frame) 또는 프로모터 및 터미네이터를 포함하는 영역의 표적 유전자좌 (target locus)의 상류부와 하류부에 상동 재조합을 통해 이루어졌다.

(6.1) L- LDH 과발현 벡터 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화 벡터의 제조

(6.1.1) L- LDH 과발현 벡터 제조

L-ldh 과발현을 위해 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 32과 33의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (http://www.atcc.org/products/all/87360.aspx)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.

그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh (PsLDH) (서열번호 28)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29와 30의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-PsLDH을 제작하였다.

또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 31의 효모 자가복제 서열/효모 동원체 서열, 서열번호 9의 CYC 프로모터, 서열번호 11의 GPD 프로모터, 및 서열번호 13의 CYC1 터미네이터를 갖고, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 28의 일본 자라 유래의 L-ldh(PsLDH)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하였다.

(6.1.2) 유전자 교환 벡터 제조

PDC1, CYB2, GPD1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 3은 pUC57-ura3HA (Genetics 116: 541-545, August, 1987) 벡터를 나타내는 도면이다. 도 4는 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.

제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 34와 35의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 제작하였다.

PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 36과 37의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 38과 39의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 CYB2 유전자 결실카세트를 제작하였다.

GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 40과 41의 프라이머를 사용하여 2PCR을 수행하여 GPD1 유전자 결실카세트를 제작하였다.

(6.2) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 pdc1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD (10 g 효모 추출물, 20 g 펩톤, 20 g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

pdc1 유전자 제거를 위해, 실시예 1.1.2에서 제작된 PDC1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 결실을 확인하기 위해 서열번호 42와 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh+ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::Psldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 PDC1 결실 카세트의 선별 마커인 URA3 유전자를 다음과 같이 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1+Psldh)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix, 1μg/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 42와 43의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::Psldh)에서 cyb2가 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::Psldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

cyb2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 6.1 및 6.2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 결실을 확인하기 위해, 서열번호 44와 45의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh ㅿcyb2::Psldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 cyb2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::Psldh Δcyb2::Psldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix, 1μg/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 44와 45의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::Psldh Δcyb2::Psldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::PsldhΔcyb2::Psldh)에서 gpd1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::PsldhΔcyb2::Psldh)를 YPD (10g yeast extract, 20g peptone, 20g 포도당) 고체배지에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD₆₀₀이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.

gpd1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.2에서 제작된 gpd1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 uracil 무첨가 최소 고체배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 결실을 확인하기 위해 서열번호 46과 47의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 결실을 확인하였다). 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh ㅿcyb2::Psldhㅿgpd1::Psldh +ura3)을 수득하였다.

또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 gpd1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::PsldhΔcyb2::Psldh ㅿgpd1::Psldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix, 1㎍/L 5-Fluoroorotic Acid) 고체 배지에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 고체배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 46과 47의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh Δcyb2::Psldh ㅿgpd1::Psldh)을 수득하였다.

사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldhㅿcyb2::PsldhΔgpd1::Psldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.

실시예 7. KCTC12415BP +l- LDH 균주에 L- LDH 과발현 벡터 도입된 균주 제작 및 제작된 균주를 이용한 L- 락테이트 생산

(7.1) 소르다리아 마크로스포라 유래 L- LDH 과발현 벡터 도입된 균주 제작

실시예 1에서 제작한 p416-CCW12-SmLDH 플라스미드를 실시예 6에서 제작된 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldhㅿcyb2::PsldhΔgpd1::Psldh) 균주에 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다.

실시예 1에서 제작한 p416-CCW12-SmLDH 플라스미드를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 SmLDH를 포함한 플라스미드를 확인하기 위해 하기 서열번호 26과 27의 프라이머 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-CCW12-SmLDH임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldh ㅿcyb2::PsldhΔgpd1::Psldh::SmLDH)를 수득하였다.

(7.2) 일본 자라( Pelodiscus sinensis japonicus ) 유래 L- LDH 과발현 벡터 도입된 균주 제작

실시예 6.1.1에서 제작된 p416-CCW12p-LDH 벡터를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA와 혼합한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(uracil, ura) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-ura))에 도말하여 약 30℃에서 약 24시간 이상 배양하였다.

상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 8개를 선별해 다시 YSD (-ura) 고체 배지에 옮김과 동시에 YSD (-ura) 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Yeast plasmid isolation kit, Clontech)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하였다. 분리된 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 PsLDH를 포함한 플라스미드를 확인하기 위해 하기 서열번호 29와 30의 프라이머 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 삽입된 플라스미드가 p416-CCW12-PsLDH임을 확인하였다. 그 결과, 사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::Psldhㅿcyb2::PsldhΔgpd1::Psldh::PsLDH)를 수득하였다.

(7.3) 소르다리아 마크로스포라 유래 L- LDH 가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용한 L- 락테이트 생산

실시예 5에 기재된 조건과 동일하게 실시예 7.1 및 7.2에서 제작된 균주를 배양 및 발효한 후, 발효 중 플라스크로부터 주기적으로 샘플을 채취하여, 채취된 시료는 약 13,000 rpm에서 약 10분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물, 및 락테이트의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다.

표 2에 나타낸 바와 같이, SmLDH 과발현 벡터가 도입된 KCTC12415BP 균주는 일본 자라 유래의 L-LDH(PsLDH)가 도입된 KCTC12415BP 균주보다 우수한 락테이트 생산성을 보일 뿐만 아니라 비해 수율도 상승하였다. 대조군인 PsLDH 과발현 벡터가 도입된 균주에 비해 락테이트 생산성은 약 15.31 g/L에서 약 15.62 g/L로 상승하였고, 수율은 약 57.52%에서 약 58.40%로 향상되었다.

KCTC12415BP 에 도입된 벡터	% 수율 (g/g)	락테이트 (g/L)
SmLDH 과발현 벡터	58.40	15.62
PsLDH 과발현 벡터	57.52	15.31
KCTC12415BP (control)	57.18	14.75

SmLDH: 소르다리아 마크로스포라 유래 L-LDH

PsLDH: 일본 자라(Pelodiscus sinensis japonicus) 유래 L-LDH

control: 빈 벡터

한국생명공학연구원 KCTC12443BP 20130711 한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530

<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Yeast cell with activated lactate dehydrogenase and method for producing lactate using the same <130> PN101051 <160> 47 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> Sordaria macrospora <400> 1 Met Ser Val Pro Ser Thr Glu Ile Ser Ser His Ala Lys Ser Ile Lys 1 5 10 15 Val Val Ile Val Gly Ala Gly Ser Val Gly Val Thr Thr Ala Tyr Ala 20 25 30 Leu Leu Leu Ser His Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Ile Asp Ile Asp 35 40 45 Lys Asn Arg Ala Leu Gly Glu Ala Met Asp Leu Ser His Ala Ala His 50 55 60 Tyr Ala His Ala Lys Val Ser Val Gly Asn Tyr Glu Asp Cys Ala Gly 65 70 75 80 Ala Thr Ala Val Ile Ile Thr Ala Gly Val Asn Gln Lys Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Arg Met Asp Leu Val Lys Thr Asn Phe Gly Leu Phe Glu Lys Ile 100 105 110 Val Pro Gln Ile Ala Lys His Ala Pro Asn Thr Ile Leu Ile Val Ala 115 120 125 Thr Asn Pro Cys Asp Val Leu Thr Lys Ala Ala Gln Glu Leu Ser Gly 130 135 140 Phe Pro Val Gln Arg Val Ile Gly Ser Gly Thr Ala Met Asp Thr Thr 145 150 155 160 Arg Phe Arg His Glu Leu Gly Lys His Tyr Gly Val Asn Pro Arg Asn 165 170 175 Val His Ala Val Ile Val Gly Glu His Gly Asp Ser Gln Leu Pro Val 180 185 190 Trp Ser Leu Ala Thr Ile Ala Gly Met Arg Leu Glu Asp Tyr Cys Asn 195 200 205 Gln Lys Gly Ile Ala Tyr Asp Glu Lys Ala Met Asp Ala Leu Gly Lys 210 215 220 Arg Thr Arg Glu Ala Ala Tyr Glu Ile Ile Gln Arg Lys Gly Lys Thr 225 230 235 240 Asn Tyr Gly Val Ala Ser Val Leu Val Ser Ile Leu Glu Pro Ile Ile 245 250 255 Thr Asn Ala Asp Gln Leu Val Thr Val Ser Arg Val Gly Asn Tyr Ala 260 265 270 Gly Val Glu Gly Val Ala Leu Ser Met Pro Cys Lys Leu Asn Ser Leu 275 280 285 Gly Ala His Gln Asp Val Glu Leu Leu Leu Asn Asp Lys Glu Lys Glu 290 295 300 Ala Leu Arg Lys Ser Ala Thr Ser Ile Lys Glu Cys Phe Asp Ser Val 305 310 315 320 Ala Lys Lys Glu <210> 2 <211> 975 <212> DNA <213> Sordaria macrospora <400> 2 atgagcgttc caagcacaga gatttcatct catgccaaat ctataaaggt tgtcatcgtt 60 ggtgcgggtt cagttggtgt cacaactgct tatgccttat tgctttcgca cttagcacca 120 gagatcgttc tgatcgacat tgataaaaat agagctttag gagaggcaat ggacctgtca 180 catgcagctc attacgctca cgcaaaagtt agtgttggaa actatgagga ttgtgctggg 240 gccacagcag ttatcataac agctggtgtt aaccaaaagc cagggcaaac taggatggat 300 ttagtcaaaa caaactttgg actatttgag aagatagtgc cccaaatagc taagcacgcg 360 cctaatacta ttttaatagt cgctaccaat ccctgtgatg tcttaacaaa agcggcacag 420 gagttatcag gattccctgt acagagagtt atcggttctg gaaccgctat ggatactacc 480 cgtttcagac acgaactggg caagcattat ggagtaaatc caagaaacgt acatgctgtg 540 attgtaggtg aacatggtga ttcccaacta cctgtatggt ccttagctac tattgctggt 600 atgcgtttgg aagattattg caatcaaaaa ggtatagcct acgatgaaaa agctatggat 660 gccttgggta aaagaactag ggaagcagca tacgaaatca ttcaaagaaa aggcaagacg 720 aattatggcg tggcatcggt ccttgtatct attttggaac cgattattac caatgcagac 780 caacttgtga ctgtctctag ggtgggcaat tacgccggtg tagaaggcgt ggctttaagt 840 atgccatgca aattgaacag tctaggtgcg catcaggacg ttgaattgtt gcttaacgac 900 aaggaaaaag aagccctacg taaatcagcc acgtccatta aagaatgttt tgattctgtt 960 gcaaagaagg aataa 975 <210> 3 <211> 563 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Glu Ile Thr Leu Gly Lys Tyr Leu Phe Glu Arg Leu Lys Gln 1 5 10 15 Val Asn Val Asn Thr Val Phe Gly Leu Pro Gly Asp Phe Asn Leu Ser 20 25 30 Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Glu Val Glu Gly Met Arg Trp Ala Gly Asn 35 40 45 Ala Asn Glu Leu Asn Ala Ala Tyr Ala Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Ile 50 55 60 Lys Gly Met Ser Cys Ile Ile Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser 65 70 75 80 Ala Leu Asn Gly Ile Ala Gly Ser Tyr Ala Glu His Val Gly Val Leu 85 90 95 His Val Val Gly Val Pro Ser Ile Ser Ser Gln Ala Lys Gln Leu Leu 100 105 110 Leu His His Thr Leu Gly Asn Gly Asp Phe Thr Val Phe His Arg Met 115 120 125 Ser Ala Asn Ile Ser Glu Thr Thr Ala Met Ile Thr Asp Ile Ala Thr 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ile Asp Arg Cys Ile Arg Thr Thr Tyr Val Thr Gln 145 150 155 160 Arg Pro Val Tyr Leu Gly Leu Pro Ala Asn Leu Val Asp Leu Asn Val 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Leu Gln Thr Pro Ile Asp Met Ser Leu Lys Pro Asn 180 185 190 Asp Ala Glu Ser Glu Lys Glu Val Ile Asp Thr Ile Leu Ala Leu Val 195 200 205 Lys Asp Ala Lys Asn Pro Val Ile Leu Ala Asp Ala Cys Cys Ser Arg 210 215 220 His Asp Val Lys Ala Glu Thr Lys Lys Leu Ile Asp Leu Thr Gln Phe 225 230 235 240 Pro Ala Phe Val Thr Pro Met Gly Lys Gly Ser Ile Asp Glu Gln His 245 250 255 Pro Arg Tyr Gly Gly Val Tyr Val Gly Thr Leu Ser Lys Pro Glu Val 260 265 270 Lys Glu Ala Val Glu Ser Ala Asp Leu Ile Leu Ser Val Gly Ala Leu 275 280 285 Leu Ser Asp Phe Asn Thr Gly Ser Phe Ser Tyr Ser Tyr Lys Thr Lys 290 295 300 Asn Ile Val Glu Phe His Ser Asp His Met Lys Ile Arg Asn Ala Thr 305 310 315 320 Phe Pro Gly Val Gln Met Lys Phe Val Leu Gln Lys Leu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ala Asp Ala Ala Lys Gly Tyr Lys Pro Val Ala Val Pro Ala Arg 340 345 350 Thr Pro Ala Asn Ala Ala Val Pro Ala Ser Thr Pro Leu Lys Gln Glu 355 360 365 Trp Met Trp Asn Gln Leu Gly Asn Phe Leu Gln Glu Gly Asp Val Val 370 375 380 Ile Ala Glu Thr Gly Thr Ser Ala Phe Gly Ile Asn Gln Thr Thr Phe 385 390 395 400 Pro Asn Asn Thr Tyr Gly Ile Ser Gln Val Leu Trp Gly Ser Ile Gly 405 410 415 Phe Thr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Ala Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ile 420 425 430 Asp Pro Lys Lys Arg Val Ile Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu Gln 435 440 445 Leu Thr Val Gln Glu Ile Ser Thr Met Ile Arg Trp Gly Leu Lys Pro 450 455 460 Tyr Leu Phe Val Leu Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Ile Glu Lys Leu Ile 465 470 475 480 His Gly Pro Lys Ala Gln Tyr Asn Glu Ile Gln Gly Trp Asp His Leu 485 490 495 Ser Leu Leu Pro Thr Phe Gly Ala Lys Asp Tyr Glu Thr His Arg Val 500 505 510 Ala Thr Thr Gly Glu Trp Asp Lys Leu Thr Gln Asp Lys Ser Phe Asn 515 520 525 Asp Asn Ser Lys Ile Arg Met Ile Glu Val Met Leu Pro Val Phe Asp 530 535 540 Ala Pro Gln Asn Leu Val Glu Gln Ala Lys Leu Thr Ala Ala Thr Asn 545 550 555 560 Ala Lys Gln <210> 4 <211> 1692 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60 accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120 gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180 tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240 gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300 gtcccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc accacacctt gggtaacggt 360 gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc tatgatcact 420 gacattgcta ccgccccagc tgaaattgac agatgtatca gaaccactta cgtcacccaa 480 agaccagtct acttaggttt gccagctaac ttggtcgact tgaacgtccc agctaagttg 540 ttgcaaactc caattgacat gtctttgaag ccaaacgatg ctgaatccga aaaggaagtc 600 attgacacca tcttggcttt ggtcaaggat gctaagaacc cagttatctt ggctgatgct 660 tgttgttcca gacacgacgt caaggctgaa actaagaagt tgattgactt gactcaattc 720 ccagctttcg tcaccccaat gggtaagggt tccattgacg aacaacaccc aagatacggt 780 ggtgtttacg tcggtacctt gtccaagcca gaagttaagg aagccgttga atctgctgac 840 ttgattttgt ctgtcggtgc tttgttgtct gatttcaaca ccggttcttt ctcttactct 900 tacaagacca agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccaatat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta cgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga ggttatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 5 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 Met Leu Lys Tyr Lys Pro Leu Leu Lys Ile Ser Lys Asn Cys Glu Ala 1 5 10 15 Ala Ile Leu Arg Ala Ser Lys Thr Arg Leu Asn Thr Ile Arg Ala Tyr 20 25 30 Gly Ser Thr Val Pro Lys Ser Lys Ser Phe Glu Gln Asp Ser Arg Lys 35 40 45 Arg Thr Gln Ser Trp Thr Ala Leu Arg Val Gly Ala Ile Leu Ala Ala 50 55 60 Thr Ser Ser Val Ala Tyr Leu Asn Trp His Asn Gly Gln Ile Asp Asn 65 70 75 80 Glu Pro Lys Leu Asp Met Asn Lys Gln Lys Ile Ser Pro Ala Glu Val 85 90 95 Ala Lys His Asn Lys Pro Asp Asp Cys Trp Val Val Ile Asn Gly Tyr 100 105 110 Val Tyr Asp Leu Thr Arg Phe Leu Pro Asn His Pro Gly Gly Gln Asp 115 120 125 Val Ile Lys Phe Asn Ala Gly Lys Asp Val Thr Ala Ile Phe Glu Pro 130 135 140 Leu His Ala Pro Asn Val Ile Asp Lys Tyr Ile Ala Pro Glu Lys Lys 145 150 155 160 Leu Gly Pro Leu Gln Gly Ser Met Pro Pro Glu Leu Val Cys Pro Pro 165 170 175 Tyr Ala Pro Gly Glu Thr Lys Glu Asp Ile Ala Arg Lys Glu Gln Leu 180 185 190 Lys Ser Leu Leu Pro Pro Leu Asp Asn Ile Ile Asn Leu Tyr Asp Phe 195 200 205 Glu Tyr Leu Ala Ser Gln Thr Leu Thr Lys Gln Ala Trp Ala Tyr Tyr 210 215 220 Ser Ser Gly Ala Asn Asp Glu Val Thr His Arg Glu Asn His Asn Ala 225 230 235 240 Tyr His Arg Ile Phe Phe Lys Pro Lys Ile Leu Val Asp Val Arg Lys 245 250 255 Val Asp Ile Ser Thr Asp Met Leu Gly Ser His Val Asp Val Pro Phe 260 265 270 Tyr Val Ser Ala Thr Ala Leu Cys Lys Leu Gly Asn Pro Leu Glu Gly 275 280 285 Glu Lys Asp Val Ala Arg Gly Cys Gly Gln Gly Val Thr Lys Val Pro 290 295 300 Gln Met Ile Ser Thr Leu Ala Ser Cys Ser Pro Glu Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Ala Ala Pro Ser Asp Lys Gln Ile Gln Trp Tyr Gln Leu Tyr Val Asn 325 330 335 Ser Asp Arg Lys Ile Thr Asp Asp Leu Val Lys Asn Val Glu Lys Leu 340 345 350 Gly Val Lys Ala Leu Phe Val Thr Val Asp Ala Pro Ser Leu Gly Gln 355 360 365 Arg Glu Lys Asp Met Lys Leu Lys Phe Ser Asn Thr Lys Ala Gly Pro 370 375 380 Lys Ala Met Lys Lys Thr Asn Val Glu Glu Ser Gln Gly Ala Ser Arg 385 390 395 400 Ala Leu Ser Lys Phe Ile Asp Pro Ser Leu Thr Trp Lys Asp Ile Glu 405 410 415 Glu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Leu Pro Ile Val Ile Lys Gly Val Gln 420 425 430 Arg Thr Glu Asp Val Ile Lys Ala Ala Glu Ile Gly Val Ser Gly Val 435 440 445 Val Leu Ser 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ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag aatctcaagg tgcttcgaga 1200 gcgttatcaa agtttattga cccctctttg acttggaaag atatagaaga gttgaagaaa 1260 aagacaaaac tacctattgt tatcaaaggt gttcaacgta ccgaagatgt tatcaaagca 1320 gcagaaatcg gtgtaagtgg ggtggttcta tccaatcatg gtggtagaca attagatttt 1380 tcaagggctc ccattgaagt cctggctgaa accatgccaa tcctggaaca acgtaacttg 1440 aaggataagt tggaagtttt cgtggacggt ggtgttcgtc gtggtacaga tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 7 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys 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Sequence <220> <223> reverse primer <400> 27 caaattaaag ccttcgagcg t 21 <210> 28 <211> 999 <212> DNA <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 28 atgtccgtaa aggaactact tatacaaaac gtccataagg aggagcattc tcacgctcac 60 aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac 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300 tttaaatttt tatttttata ttttattact tttaaaaata atgtttttat ttaaaacaaa 360 attataagtt aaaaagttgt tccgaaagta aaatatattt tatagttttt acaaaaataa 420 attattttta acgtattttt tttaattata tttttgtatg tgattatatc cacaggtatt 480 atgctgaatt tagctgtttc agtttaccag tgtgatagta tgattttttt tgcctctcaa 540 aagctatttt tttagaagct tcgtcttaga aataggtggt gtataaattg cggttgactt 600 ttaactatat atcattttcg atttatttat tacatagaga ggtgctttta attttttaat 660 ttttattttc aataatttta aaagtgggta cttttaaatt ggaacaaagt gaaaaatatc 720 tgttatacgt gcaactgaat tttactgacc ttaaaggact atctcaatcc tggttcagaa 780 atccttgaaa tgattgatat gttggtggat tttctctgat tttcaaacaa gaggtatttt 840 atttcatatt tattatattt tttacattta ttttatattt ttttattgtt tggaagggaa 900 agcgacaatc aaattcaaaa tatattaatt aaactgtaat acttaataag agacaaataa 960 cagccaagaa tcaaatactg ggtttttaat caaaagatct ctctacatgc acccaaattc 1020 attatttaaa tttactatac tacagacaga atatacgaac ccagattaag tagtcagacg 1080 cttttccgct ttattgagta tatagcctta catattttct gcccataatt tctggattta 1140 aaataaacaa aaatggttac tttgtagtta tgaaaaaagg cttttccaaa atgcgaaata 1200 cgtgttattt aaggttaatc aacaaaacgc atatccatat gggtagttgg acaaaacttc 1260 aatcgat 1267 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 32 cgagctcttc gcggccacct acgccgctat c 31 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 33 gctctagata ttgatatagt gtttaagcga at 32 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 34 gagctcaatt aaccctcact aaaggg 26 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 35 gagctccaaa ttaaagcctt cgagcg 26 <210> 36 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 36 aagatctacg aagttgaagg tatgagatgg gctggtaacg ccagtcacga cgttgtaaaa 60 60 <210> 37 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 37 gcttccttaa cttctggctt ggacaaggta ccgacgtaaa aggtttcccg actggaaagc 60 60 <210> 38 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 38 cgatgcgtat tttaagtggt tctctgaaca gcacaatgtc ctcgacacca ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 39 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 39 ggatcacccc ccactcaagt cgttgcattg ctaacatgtg gcattctgcc caaggtttcc 60 cgactggaaa gc 72 <210> 40 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 40 ccctatgtct ctggccgatc acgcgccatt gtccctcaga aacaaatcaa ccagtcacga 60 cgttgtaaaa 70 <210> 41 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 41 tagaagcaac tgtgccgaca gcctctgaat gagtggtgtt gtaaccaccc aggtttcccg 60 actggaaagc 70 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 42 gctcttctct accctgtcat tc 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 43 tagtgtacag ggtgtcgtat ct 22 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 44 ggagttgaag gcaaaattag aagtga 26 <210> 45 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 45 attccctttc ctgcacaaca cgagat 26 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 46 tcaatgagac tgttgtcctc ctact 25 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 47 tacatccttg tcgagccttg ggca 24

Claims (19)

1. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 효모 세포로서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 소르다리아 속 유래인 것인 세포로서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성, 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것인 효모 세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제의 활성은 락테이트 데히드로게나제의 발현의 증가에 의하여 증가된 것인 효모 세포.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 증가는 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 것인 효모 세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 소르다리아 속은 소르다리아 마크로스포라, 소르다리아 피미콜라, 소르다리아 알치나, 소르다리아 아라네오사, 소르다리아 브레비콜리스, 소르다리아 에퀴나, 소르다리아 헤테로탈리스, 소르다리아 후마나, 소르다리아 라페, 소르다리아 스클레로게니아, 소르다리아 수페르바, 또는 소르다리아 토멘토-알바인 것인 효모 세포.
5. 청구항 2에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 효모 세포.
6. 청구항 3에 있어서, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
7. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 속인 것인 효모 세포.
8. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
9. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성이 제거되거나 감소된 것인 효모 세포.
10. 청구항 9에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
11. 청구항 10에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
12. 청구항 10에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
13. 청구항 1에 있어서, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
14. 청구항 13에 있어서, 수탁번호 KCTC 12443 BP인 것인 효모 세포.
15. 삭제
16. 청구항 1에 있어서, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감소된 것인 효모 세포.
17. 삭제
18. 삭제
19. 청구항 1 내지 14 및 16 중 어느 한 항의 효모 세포를 배양하는 단계; 및
    배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계;를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.

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