DE102009029651A1

DE102009029651A1 - Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren

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Publication number: DE102009029651A1
Application number: DE102009029651A
Authority: DE
Inventors: Achim Dr. Marx; Markus Dr. Pötter; Henrike Dr. Gebhardt; Murillo Dr. Villela Filho; Juraj Obuch; Nicole Decker; Alexander Mohr
Original assignee: Evonik Roehm GmbH
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2011-03-24
Also published as: WO2011036000A1

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren, umfassend die Verfahrensschritte A) das Inkontaktbringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das Inkontaktbringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium, enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5, durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur erstgenannten Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.

Description

Gebiet der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren mit Hilfe von Hefezellen.
Stand der Technik
Die biochemische Herstellung von Carbonsäuren ist aufgrund von z. B. der Milch- oder Zitronensäureproduktion gut bekannt. Da die meisten Fermentationsprozesse bei einem pH-Wert des Mediums durchgeführt werden, der oberhalb des pK_S-Wertes der herzustellenden Carbonsäure liegen, fallen die Carbonsäuren zum Grossteil als Salze und nicht als freie Säuren an. Diese Carboxylate werden meist durch Zugabe von Säuren in ihre freien Säuren überführt.
Die Produktion freier Säuren ist entscheidend für eine Vereinfachung der Produktaufreinigung. Bei beispielsweise einem Extraktionsverfahren geht oft nur die freie Säure von der Fermentationsbrühe ins Extraktionsmittel über. In der Kulturbrühe sollte demzufolge idealerweise die freie Säureform zur Verfügung gestellt werden. Solange der Bioprozess bei pH Werten oberhalb des pKs Wertes der jeweiligen Säure durchgeführt wird, wird hauptsächlich die Salzform der Säure gebildet.
1 zeigt exemplarisch für 3-Hydroxyisobuttersäure (3HIB) den Anteil freier Säure in Abhängigkeit vom pH-Wert. Solange keine freie Säure gebildet wird, ist ein Ansäuern der Kulturbrühe zur Produktaufreinigung erforderlich. Dabei entstehen Salze wie beispielsweise CaSO₄, deren Entsorgung aufwändig ist.
Die PCT/US2006/020782 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure mit Hefezellen der Gattung L. orientalis und P. fermentans, die derart gentechnisch verändert wurden, dass sie eine exogene Lactatdehydrogenase exprimieren, wodurch eine bessere Kultivierung der Zellen bei niedrigen pH-Werten ermöglicht wird.
Die JP 2009000089 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Milchsäure mit einem Hefestamm, der derart gentechnisch verändert wurde, dass die Aktivität eines oder mehrer Gene, die sich unter sauren Bedingungen negativ auf die Produktbildung auswirkt, unterdrückt wird. Dadurch wird die Fähigkeit der Zellen, Milchsäure unter sauren Bedingungen zu produzieren, verbessert.
Die DD267999 beschreibt ein aerobes Verfahren zur Herstellung von 2-Oxoglutarsäure in Yarrowia lipolytica DSM 8068 bei pH-Werten kleiner 6 und Temperaturen unter 37°C.
Die DE 10 2006 057 724 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit Hilfe der Kultivierung von Pilzen in einem pH-Bereich von 1–4, wobei die im Verfahren eingesetzten Medien und Gefäße nicht sterilisiert werden.
Den Verfahren des Standes der Technik ist gemein, dass generell eine Herstellung von freien Carbonsäuren in Hefezellen bei niedrigem pH-Wert gelingt, jedoch die Ausbeuten an gesamter Carbonsäure, d. h. freie Säure und deren Salzform, gering sind.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, welches effektiv und produktiv freie Carbonsäuren, insbesondere Hydroxycarbonsäuren, bereitstellt.
Beschreibung der Erfindung
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das in Anspruch 1 beschriebene Verfahren die gestellte Aufgabe löst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die Verfahrensschritte A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae, mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0, bevorzugt von 2,5 bis 1,2, insbesondere von 2,0 bis 1,5 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) erhöht ist.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht in der Tatsache, dass eine Kontamination bei dem erfindungswesentliche, niedrigen pH-Wert unwahrscheinlicher ist als bei hohem pH-Wert. Dadurch erniedrigt sich insgesamt der Aufwand für Steriltechnik, wie z. B. in Form der notwendigen Erzeugung von Dampf und der Notwendigkeit von druckstabilen Behältnissen und Leitungen. Dadurch kann auch ein Prozess mit geringeren Produktivitäten wirtschaftlich sein, was den Einsatz von Minimalmedien ohne die teuren komplexen Bestandteile in der Fermentation ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von Minimalmedien gegenüber komplexen Medien besteht in der Tatsache, dass zur Selektion des Produktionsstammes Komplementationsmarker wie z. B. Aminosäureauxotrophien eingesetzt werden können. Diese Art der Selektion ist nicht nur preisgünstiger im Vergleich zur Selektion z. B. mit Antibiotika, wie in komplexen Medien üblich, sondern kann auch im Bereich der Nahrungsmittelherstellung problemlos eingesetzt werden.
Unter „Hefen” im Sinne der vorliegenden Erfindung werden einzellige Pilze, insbesondere Schlauchpilze, die sich durch Sprossung oder Teilung vermehren, verstanden.
Der Begriff „Carbonsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung beinhaltet sowohl die freie Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO^–).
Der Begriff „Hydroxycarbonsäure” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt Carbonsäuren mit mindestens einer Hydroxyl- und einer Carbonsäuregruppe und beinhaltet sowohl die freie Carbonsäure (-COOH) als auch das korrespondierende Salz (-COO^–). Die Formulierung „Die Zellen vermögen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt, dass die Zelle aus der ihr zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle mindestens ein Kohlenstoffatom nutzt, um damit die Carbonsäure zu synthetisieren. Dies kann etwa durch eine Isotopenmarkierung der Kohlenstoffquelle nachgewiesen werden, so dass sich das Isotop in der gebildeten Carbonsäure nachweisen lässt.
Der Begriff „Eigenansäuerung” im Sinne der vorliegenden Erfindung beschreibt das Phänomen der pH-Wert-Erniedrigung des eine Hefezelle umgebenden Mediums hervorgerufen durch Substanzen, die von der Hefezelle abgegeben werden.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent.
Alle im Zusammenhang mit dem Verfahren angegebenen pH-Werte und insbesondere auch die in den nachfolgenden Ausführungen im Zusammenhang mit dem Verfahrensschritt B) angegebenen pH-Werte sind „unter den Kultivierungsbedingungen” zu messen. Wenn also beispielsweise die Mikroorganismen im Verfahrensschritt A) oder im Verfahrensschritt B) bei 30°C kultiviert werden, ist auch der pH-Wert bei 30°C zu bestimmen.
In Verfahrensschritt A) werden die Zellen vorzugsweise bis zum Erreichen einer Konzentration an Biotrockenmasse von mindestens 30 g/l bezogen auf das Nährmedium vermehrt.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die freie Carbonsäure eine freie Ketocarbonsäure oder eine freie Hydroxycarbonsäure ist. Als Ketocarbonsäuren kommen insbesondere alpha-Ketocarbonsäuren in Frage, insbesondere alpha-Keto-Glutarsäure; in diesem Zusammenhang sind Hydroxycarbonsäuren bevorzugt, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, 2-Hydroxyisobuttersäure, 3-Hydroxyisobuttersäure, wobei 3-Hydroxyisobuttersäure besonders bevorzugt ist.
Als vorteilhaft im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar haben sich insbesondere die Zelle ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Yarrowia lipolytica H222, H222-27 und H222-27-11 herausgestellt.
H222 wird beschrieben in Barth & Weber, Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 1983, Genetic studies on the yeast Saccharomycopsis lipolytica. Inactivation and mutagenesis. und in Barth & Gaillardin, FEMS microbiology reviews 1996, Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica;
H222-27, auch bekannt als ZIMET 43728 und H422, wird in der DD227448 beschrieben;
H222-27-11, auch bekannt als ZIMET 43856, H355 und DSM 8068, wird in der DD267999 beschrieben.
Es ist dem Fachmann hinlänglich bekannt, dass mit Hilfe rekombinanter Gentechnik Produktausbeuten in biologischen Systemen verbessert werden können. Bevorzugt handelt es sich bei der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Hefezelle somit um eine gentechnisch veränderte Zelle.
Daher ist es erfindungsgemäß weiterhin bevorzugt, dass die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zelle gegenüber ihrem Wildtyp derart gentechnisch verändert wurde, dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag. Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Carbonsäure zu bilden vermag” betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine Carbonsäure, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindung, zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponente gebildet werden können.
Unter einem „Wildtyp” einer Zelle wird vorzugsweise eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie er natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp” fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter Verfahren verändert worden sind.
Die Art und Weise, wie die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte, gentechnisch veränderte Hefezelle derart gentechnisch verändert werden kann, dass sie mehr Carbonsäure als ihr Wildtyp zu bilden vermag, ist für den Fall der 3-Hydroxyisobuttersäure insbesondere in der PCT/EP2007/055394 beschrieben, auf deren Offenbarung hier explizit abgestellt wird. Die in der PCT/EP2007/055394 als erfindungemäß bevorzugt beschriebenen Zellen sind ebenfalls auf die vorliegende Erfindung übertragen bevorzugte im vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Zellen; in diesem Zusammenhang bedeutet „auf die vorliegende Erfindung übertragen”, dass die oben genannten Hefezellen mit den in der PCT/EP2007/055394 beschriebenen erfindungsgemäßen Merkmalen, wie beispielsweise erhöhten Enzymaktivitäten, zusätzlich versehen werden.
Für den Fall der 2-Hydroxyisobuttersäure werden im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt gentechnisch veränderte Hefezellen eingesetzt, die wie insbesondere in der PCT/EP2007/052830 und der DE 10 2008 002 715 , auf deren Offenbarung hier explizit abgestellt wird, beschrieben gentechnisch verändert wurden.
Weiterhin ist es in dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass Verfahrensschritt A) bei einem pH-Wert des Mediums von größer 4,5, vorzugsweise von größer 4,9, erfolgt. Insbesondere ist in diesem Zusammenhang ein pH-Wert-Bereich des Mediums von größer 4,5 bis kleiner gleich 7,9, insbesondere ein pH-Wert-Bereich des Mediums von grösser 4,9 bis kleiner gleich 7,0, bevorzugt.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass der pH-Wert des Mediums in Verfahrensschritt A) einen pH-Wert von 7,9 nicht übersteigt. Zwischen Verfahrensschritt A) und Verfahrensschritt B) wird das Nährmedium durch ein Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, aus der die Zellen die Carbonsäure als Substrat zu bilden vermögen, ersetzt.
Dies kann derart erfolgen, dass das Nährmedium durch das Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle ersetzt wird, aber auch derart vorgenommen werden, dass das Nährmedium durch Zusatz von Substanzen wie beispielsweise der Kohlestoffquelle und/oder durch Wegnahme oder nicht weitere Zufuhr von Substanzen, wie beispielsweise Stoppen etwaiger Gas-Einleitungen, Ausfällen von Nährmediumkomponenten, in das Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle überführt wird, wobei ein Ersetzen des Nährmediums durch beispielsweise Abziehen über Tangentialfiltration und Neuzufuhr des Mediums enthaltend die Kohlenstoffquelle oder durch Abzentrifugieren der Zellen und anschließendes Resuspendieren der Zellen in dem Medium enthaltend die Kohlenstoffquelle bevorzugt ist.
Die Kohlenstoffquelle kann in dem Verfahrensschritt B) des erfindungsgemäßen Verfahrens jegliche Kohlenstoffquelle sein, aus denen die Hefezelle in der Lage ist, die Carbonsäure zu bilden; dies sind beispielsweise Alkane, Aminosäuren, Alkohole, Fette, Öle und Zucker. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden insbesondere Kohlenstoffquellen ausgewählt aus der Gruppe umfassend, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus, Methanol, Glycerin, Saccharose, Glukose, Isobuttersäure, Valin, Leucin und Ketoisovaleriansäure eingesetzt.
Es kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft sein, wenn die erfindungswesentliche Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) direkt zu Beginn des Verfahrensschrittes B) eingeleitet wird. Dies kann etwa dadurch erfolgen, dass die Hefezellen von dem Nährmedium des Verfahrensschritts A) abgetrennt werden und direkt in einem Medium mit einem entsprechend niedrigen pH-Wert überführt werden, oder aber das Nährmedium des Verfahrensschrittes A) mit Hilfe einer Säure, insbesondere einer anorganischen Säure, auf den gewünschten pH-Wert eingestellt wird.
Es ist in diesem Zusammenhang bevorzugt, dass die pH-Wert-Einstellung in der Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) durch Eigenansäuerung erfolgt.
Die Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) wird gefolgt von mindestens einer weiteren Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) erhöht ist. Der pH-Wert des Mediums der Teilzeitperiode b) ist in diesem Zusammenhang bevorzugt um mindestens 0,2, insbesondere um mindestens 0,5 und ganz besonders um mindestens 0,8 pH-Einheiten erhöht, bezogen auf den tiefsten pH-Wert der Teilzeitperiode a). Bevorzugte pH-Wert-Bereiche des Mediums der Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B) sind somit 2,0 bis 5,5, bevorzugt 2,5 bis 4,0 und insbesondere 2,7 bis 3,8.
Es ist des Weiteren möglich, in Verfahrenschritt B) die vorbeschriebenen Teilzeitperioden mit unterschiedlichen pH-Werten mehrfach hintereinander durchzuführen, so dass sich über den zeitlichen Verlauf des Verfahrensschritte B) ein wellenförmiges pH-Profil ergibt.
Die Temperatur, bei der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann liegt sowohl für Verfahrensschritt A) als auch für Verfahrensschritt B) in einem Bereich von kurz oberhalb des Gefrierpunktes der die Zellen umgebenden Flüssigkeiten bis 50°C. Bevorzugte Temperaturen, insbesondere für Verfahrensschritt B) liegen in einem Bereich von 25°C bis 37°C.
Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) bei einer Temperatur in einem Bereich von 25°C bis 37°C durchgeführt wird.
In Verfahrensschritt B) kann es vorteilhaft sein, die Biomasse streng zu kontrollieren, um eine optimale Produktausbeute zu erhalten. Daher ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn die Konzentration an Biotrockenmasse in Verfahrensschritt B) in einem Bereich von 30 g/l bis 100 g/l bezogen auf die Kulturbrühe liegt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin eine oder mehrere Schritte zur Reinigung und Isolierung der Carbonsäuren enthalten. Es kann daher erfindungsgemäß vorteilhaft sein, wenn das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt C) Aufreinigung der Carbonsäure aus den Zellen und/oder dem Medium aus Verfahrensschritt B) beinhaltet.
Verfahrensschritt C) kann auch schon im Laufe von Verfahrensschritt B) erfolgen, um eine mögliche Produktinhibierung zu umgehen und/oder um die Anzahl der Aufreinigungsschritte insgesamt zu verringern.
Verfahren zu Aufreinigung von Carbonsäuren sind dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in US 5,464,760 , US 5,641,406 , US 6,630,603 , US 6,942,803 , US 6,280,985 , US 6,368,819 , US 5,132,456 , US 7,186,856 und US 5,210,296 beschrieben.
Geeignete Verfahrensschritte sind unter anderen Konzentrierung, Kristallisation, Ionenaustauschchromatographie, Umsalzung an festen oder flüssigen Ionenaustauschern mit nachfolgender thermischer Spaltung, Elektrodialyse, Extraktion mit organischen Lösemitteln und/oder flüssigen Reaktanden, mit reaktiven Lösungsmitteln und die Reinigung durch Veresterung der Carbonsäure mit geeigneten Alkoholen, nachfolgender Destillation des erhaltenen Esters und anschließender Hydrolyse des Esters zur freien Säure sowie Kombinationen dieser Schritte.
Eine Abtrennung der Zellen durch z. B. Filtration oder Zentrifugation vor Anwendung der oben genannten Verfahrensschritte ist in dem Falle vorteilhaft, dass die Carbonsäure aus dem Medium aufgereinigt wird, jedoch nicht zwingend erforderlich.
Die in Verfahrensschritt C) erhaltene aufgereinigte Carbonsäure kann vorteilhaft zu Folgeprodukten umgesetzt werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist somit die Verwendung der freien Carbonsäure erhalten durch erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Carbonsäuren, Carbonsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation. Insbesondere die Verwendung, bei der die freie Carbonsäuren ausgewählt ist aus 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure zur Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation, ist erfindungsgemäß bevorzugt.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung ist beispielsweise die Dehydratisierung von Hydroxycarbonsäuren zu ungesättigten Carbonsäuren.
Eine Reihe von Verfahren zur Dehydratisierung von Hydroxycarbonsäuren ist dem Fachmann bekannt, solche werden beispielsweise in der PCT/EP2007/055394 , US 3,666,805 und US 5,225,594 beschrieben
In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll.
Folgende Figuren sind Bestandteil der Offenbarung:
1: Einfluss des pH-Wertes auf den Anteil der freien Säure an 3HIB in Lösung
2: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion bei Fahren eines pH-Profils bis pH 2 und Supplementierung mit Ketoisovaleriansäure
3: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion bei Fahren eines pH-Profils und Supplementierung mit Ketoisovaleriansäure
Beispiele:
Beispiel 1 (erfindungsgemäß): Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat mit Shift auf pH 2
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 2,0 abgesenkt. In einem Zeitraum von 2,5 h wurde bei pH 2,0 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 0,498 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert.
Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: einer ersten Vorkultur auf Agarplatten, einer zweiten Vorkultur im Schüttelkolben und einem Seed-Fermenter.
Erste Vorkultur – Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf YPD-Agar (10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton, 20 g/l Dextrose), Kultivierung für 24 h bei 30°C
Zweite Vorkultur – Die zweite Vorkultur von Y. lipolytica H222-27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L-Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2–3 Impfösen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30°C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20%iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/l Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12–20 g/l vor.
Seed-Fermenter – Die Seed-Fermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Mineralsalzmedium 10%ig aus der 2. Vorkultur angeimpft und 24 h kultiviert. Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt: Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO₂: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5.
Produktionsfermenter – Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10%ig aus dem Seed-Fermenter angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%). Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat.
Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 2 durch Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25%igem NH₄OH.
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/l (NH₄)₂SO₄; 2 g/l KH₂PO₄; 1 g/l MgSO₄ × 7H₂O; 44 mg/l ZnSO₄ × 7H₂O; 10 mg/l FeSO₄ × 7H₂O; 50 μg/l Thiamin × HCl; 60 mg/l CaCl₂ × 6H₂O; 100–140 g/l Glycerin; Spurenelemente (1000fach) 1 ml/l. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H₃BO₃; 4 mg/100 ml CuSO₄ × 5H₂O; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnSO₄ × 4H₂O; 40 mg/100 ml Na₂MoO₄ × 2H₂O; 40 mg/100 ml ZnSO₄ × 7H₂O.

Nach 2,5 h Fermentation bei pH 2 waren 0,500 g/L 3 HIB synthetisiert worden, davon lagen 0,498 g/L als freie Säure vor. Von 20 h bis 40 h Fermentationszeit steigerten wir den pH-Wert langsam auf pH 3,8 durch Zugabe von Ammoniumwasser. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 2,7 g/L gebildet. Insgesamt lagen nach 40 h also 3,2 g/L 3 HIB – davon 2,8 g/L als freie Säure – vor. Von 40 h bis 70 h Fermentationszeit ließen wir den pH-Wert durch Eigenansäuerung auf pH 3 absinken. In diesem Zeitraum wurden zusätzlich 3,2 g/L 3-HIB synthetisiert. Von den nach 70 h vorliegenden 6,4 g/L 3HIB lagen 6,2 g/L als freie Säure vor, bei einem pH-Wert von pH 3. Bei einem für die meisten Fermentation üblichen neutralen pH-Wert von pH 7 hätte zu diesem Zeitpunkt der Anteil freier Säure 0,035 g/L betragen (s. 2 und Tab. 1). Tabelle 1: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion – insbesondere der Bildung freier Säure – bei Fahren eines pH-Profils

Zeit	pH-Wert	3HIB [g/L]			Produktivität
[h]		gebildet	kumuliert	freie Säure	[g/L/h]
18–20,5	2	0,5	0,5	0,498	0,20
20,5–25	2–3,8	1,9	2,4		0,42
25–40	3,8	1,0	3,2	2,8	0,06
40–47	3,8–3	0,8	4,0		0,11
47–70	3	2,4	6,4	6,2	0,10

Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß): Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure in Yarrowia lipolytica mit Ketoisovalerat als Substrat ohne pH-Shift auf pH 2
Als Produktionsstamm wurde die Hefe Yarrowia lipolytica gewählt. Im beschriebenen Beispiel wurde der pH-Wert während der Kultivierung durch Eigenansäuerung auf pH 3,8 abgesenkt. In einem Zeitraum von 47,3 h wurde bei pH 3,8–pH 4 in einem Volumen von 1 L Kulturbrühe 1,04 g/L 3HIB als freie Säure gebildet. Das Zielprodukt 3-Hydroxyisobuttersäure wurde durch Biotransformation aus Ketoisovalerat synthetisiert.
Die Kultivierungsbedingungen im Detail: Die Animpfschiene für die Fermentation im 2 L Maßstab bestand aus drei Stufen: zwei Vorkulturen auf Agarplatten und einer Vorkultur im Schüttelkolben.
Erste Vorkultur – Ausstrich aus Cryokultur von Y. lipolytica H222-27-11 auf Reader-Agar (3 g/l (NH₄)₂SO₄;
0,7 g/l MgSO₄ × 7H₂O; 1 g/l KH₂PO₄; 0,16 g/l K₂HPO₄; 0,5 g/l NaCl; 0,4 g/l Ca(NO₃)₂ × 4H₂O; 30 g/l Agar) und Kultivierung für 24 h bei 30°C
Zweite Vorkultur – Ausstrich von 2–3 Impfösen von Y. lipolytica H222-27-11 aus erster Vorkultur auf Mineralsalzmedium-Agar, Kultivierung für 24 h bei 30°C.
Dritte Vorkultur – Die dritte Vorkultur von Y. lipolytica H222-27-11 erfolgte als sterile Schüttelkultur in 1 L-Erlenmeyerkolben (mit Schikane, Weithalsausführung) mit je 100 ml Mineralsalzmedium. Als Inokulum wurden je 2–3 Impfösen der ersten Vorkultur verwendet. Die Kulturen wurden bei 30°C für 48 h auf einem Schüttler mit Inkubationshaube inkubiert. Die Schüttelfrequenz betrug 170 rpm. Zur Regulierung des pH-Wertes im Bereich pH 4,5 bis 5,5 wurde nach 24 h mit 20%iger NaOH nachgestellt. Als Kohlenstoffquelle wurde 80 g/l Glycerol eingesetzt. Nach spätestens 48 h wurde die Kultivierung wegen verstärkter Säurebildung beendet. Nach Abschluss der Kultivierung lag ein Restglycerolgehalt von 12–20 g/l vor.
Produktionsfermenter – Die Produktionsfermentation wurde in einem 2 L-Bioreaktor (Sartorius) durchgeführt. Dazu wurde 1 L Minimalmedium 10%ig aus der dritten Vorkultur angeimpft und 70 h kultiviert. Als Kohlenstoffquelle diente Rohglycerol (80%). Als Substrat für die Biotransformation zu 3HIB wurde eine Lösung aus Ketoisovalerat und Valin zudosiert. Es wurde sichergestellt, dass keine Limitierung von Ketoisovaleriansäure eintrat. Folgende Fermentationsparameter wurden eingestellt:
Rührerdrehzahl beim Start: 400 rpm; pO2: 20%; Temperatur: 30°C; pH während des Wachstums: 5,5 und mit Beginn der Produktbildung nach 16 h pH-Shift auf pH 3,5 durch Eigenansäuerung; pH-Regulierung mit 25%igem NH₄OH.
Die Kultivierung erfolgte in Mineralsalzmedium mit folgender Zusammensetzung: 6,17 g/l (NH₄)₂SO₄; 2 g/l KH₂PO₄; 1 g/l MgSO₄ × 7H₂O; 44 mg/l ZnSO₄ × 7H₂O; 10 mg/l FeSO₄ × 7H₂O; 50 μg/l Thiamin × HCl; 60 mg/l CaCl₂ × 6H₂O; 100–140 g/l Glycerin;
Spurenelemente (1000fach) 1 ml/l. Die Spurenelemente hatten folgende Zusammensetzung: 50 mg/100 ml H₃BO₃; 4 mg/100 ml CuSO₄ × 5H₂O; 10 mg/100 ml KI; 20 mg/100 ml MnSO₄ × 4H₂O; 40 mg/100 ml Na₂MoO₄ × 2H₂O; 40 mg/100 ml ZnSO₄ × 7H₂O.
Nach 47,3 h Fermentation bei pH 4 waren 1,28 g/L 3 HIB synthetisiert worden, davon lagen 1,04 g/L als freie Säure vor (s. 3 und Tab. 2). Tabelle 2: Fermentationsverlauf der 3HIB-Produktion – insbesondere der Bildung freier Säure – bei Fahren eines pH-Profils

Zeit pH-Wert 3HIB [g/L] Produktivität

[h] gebildet kumuliert freie Säure [g/L/h]

27,7–75 4,0 1,28 1,28 1,04 0,017
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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US 3666805 [0048]
US 5225594 [0048]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Barth & Weber, Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 1983, Genetic studies on the yeast Saccharomycopsis lipolytica. Inactivation and mutagenesis [0023]
Barth & Gaillardin, FEMS microbiology reviews 1996, Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica [0023]

Claims

Verfahren zur Herstellung freier Carbonsäuren umfassend die Verfahrensschritte A) das in Kontakt Bringen einer Hefezelle ausgewählt aus der Gruppe umfassend Yarrowia lipolytica, Candida ultilis und Saccharomyces cerevisiae mit einem Nährmedium, in welchem die Zelle sich vermehren lässt; B) das in Kontakt Bringen der Zellen aus Verfahrensschritt A) mit einem Medium enthaltend eine Kohlenstoffquelle, unter Bedingungen, bei denen die Zellen die Carbonsäure aus der Kohlenstoffquelle als Substrat zu bilden vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Teilzeitperiode a) des Verfahrensschrittes B) bei einem pH-Wert-Bereich des Mediums von 3,0 bis 1,0 durchgeführt wird, gefolgt von mindestens einer Teilzeitperiode b) des Verfahrensschrittes B), bei der der pH-Wert des Mediums im Vergleich zur Teilzeitperiode a) erhöht ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die freie Carbonsäure eine Hydroxycarbonsäure oder eine Ketocarbonsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydroxycarbonsäure ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend 2-Hydroxyisobuttersäure und 3-Hydroxyisobuttersäure.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Hefezelle ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Yarrowia lipolytica H222, H222-27 und H222-27-11.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt A) bei einem pH-Wert von grösser 4,5 erfolgt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffquelle ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Alkane, Aminosäuren, Alkohole, Fette, Öle, Zucker, insbesondere Methanol, Glycerin, Saccharose, Glukose, Isobuttersäure, Valin, Leucin und Ketoisovaleriansäure.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilzeitperiode a) direkt zu Beginn des Verfahrensschrittes B) eingeleitet wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Wert-Einstellung in der Teilzeitperiode a) durch Eigenansäuerung erfolgt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert des Mediums der Teilzeitperiode b) um mindestens 0,2 pH-Einheiten erhöht, bezogen auf den tiefsten pH-Wert der Teilzeitperiode a), ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert-Bereich des Mediums der Teilzeitperiode b) 2,0 bis 5,5 ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Verfahrensschritt B) bei einer Temperatur in einem Bereich von 25°C bis 37°C durchgeführt wird.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Biotrockenmasse in Verfahrensschritt B) in einem Bereich von 30 g/l bis 100 g/l bezogen auf die Kulturbrühe liegt.
Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt C) Aufreinigung der Carbonsäure aus den Zellen und/oder dem Medium aus Verfahrensschritt B) beinhaltet.
Verwendung der freien Carbonsäure erhalten durch mindestens ein Verfahren gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche zur Herstellung von ungesättigten Carbonsäuren, Carbonsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation.
Verwendung gemäß Anspruch 14 wobei die freie Carbonsäuren ausgewählt ist aus 2- oder 3-Hydroxyisobuttersäure zur Herstellung von Methacrylsäure, Methacrylsäureestern oder Polymere derselben durch Dehydratisierung sowie gegebenenfalls Veresterung und gegebenenfalls Polymerisation.