JP4711955B2 - 遺伝子組換え酵母及び遺伝子組換え酵母を用いた発酵方法 - Google Patents
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Description
この発明は、遺伝子組換え酵母に関する。
他の側面として、本発明は、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産する本来の遺伝子が欠失又は破壊された、遺伝子組換え酵母である。
更に他の側面として、本発明は、ペントース糖を含む発酵培地という発酵条件の下で、前述の側面のいずれかの細胞が培養される発酵方法である。
他の適切な宿主酵母細胞は、キシロースを細胞壁又は膜を横切って輸送する能力を有する。
本文で用いたように、"プロモーター"という術語は、構造遺伝子(一般的には1から1000bp、好ましくは1から500bp、特に1から100bp)の翻訳開始コードンの上流(即ち、5’側)に位置する非転写配列を表し、構造遺伝子の転写開始を制御する。同様に、"ターミネーター"という術語は構造遺伝子(一般的には1から1000bp、好ましくは1から500bp、特に1から100bp)の翻訳終結コードンの下流(即ち、3’側)に位置する非転写配列を表し、構造遺伝子の転写の終結を制御する。もし、ゲノム内での構造遺伝子の位置に対して、プロモーター及びターミネーターが(場合によっては)転写制御を行う位置にあるならば、"プロモーター"及び"ターミネーター"は構造遺伝子に"作用上連結"している。
異なる外因性のXI遺伝子が、異なったタイプのプロモーター、及び/又はターミネーターの制御下に置かれることは可能である。
プロモーター及び/又はターミネーターは特定のXK遺伝子に固有のものであってもよいし、このようなプロモーター及び/又はターミネーターに高い相同性を示すものでもよい。
このような遺伝子組換えにより、細胞環境はキシロースイソメラーゼ発現に有利な環境を作り出すので、もしある遺伝子が実際活性を有していたならば、その活性が細胞内の環境で抑制される可能性は低く、従って、細胞内で測定可能となる。
2.(1)と同様、(遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め)XIカセットは宿主細胞XR遺伝子の5'−及び3'−領域の間に位置する。XIカセットには、宿主細胞に固有なプロモーターがあってもよい。XIカセットには、ScCYC1又はScGAL10ターミネーターがあってもよい。
3.(1)、(2)と同様、(遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め)XKカセットは宿主細胞XR遺伝子の5'−及び3'−領域の間に位置する。XKカセットには、宿主細胞に固有のプロモーター又はScTEF1プロモーターがあってもよい。XIカセットはScCYC1又はScGAL10ターミネーターがあってもよい。
5.(4)と同様、(遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め)XIカセットは宿主XR遺伝子の5'−及び3'−領域の間に位置する。XIカセットには、宿主細胞に固有のプロモーターがあってもよい。XIカセットには、ScCYC1又はScGAL10ターミネーターがあってもよい。
6.(4)又は(5)と同様、(遺伝子に作動可能に連結したプロモーター及びターミネーターを含め)XKカセットは宿主細胞XR遺伝子の5'−及び3'−領域の間に位置する。XKカセットには、宿主細胞に固有のプロモーター又はScTEF1プロモーターがあってもよい。XIカセットには、ScCYC1又はScGAL10ターミネーターがあってもよい。
8.あるXIカセットには、K.marxianusプロモーター又はC.sonorensisプロモーターがあり、XIカセットは、マーカー発現カセットに先行するか、後から続く。K.marxianus又はC.sonorensisプロモーターは、PDC又はPGKプロモーターでもよい。XIカセットのターミネーターはK.marxianus、C.sonorensis、又はS.cerevisiaeターミネーターで良く、特にScCYC1又はScGAL10ターミネーターでもよい。マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含むヒグロマイシン、Ura3又はG418耐性発現カセットであってもよい。Ura3カセットはHisG−Ura3−HisGカセットでもよい。G418カセットには、ScPDC1プロモーター、及びScGAl10ターミネーターがあってもよい。XIカセットには、また(以下9で記載するように)XKカセット、XIカセットの上流又は下流、及びマーカー発現カセットの上流又は下流があってもよい。
マーカー発現カセットは、必要に応じてプロモーター及びターミネーターを含むヒグロマイシン、Ura3又はG418耐性発現カセットであってもよい。Ura3カセットはHisG−Ura3−HisGカセットでもよい。G418カセットには、ScPDC1プロモーター及び、ScGAl10ターミネーターがあってよい。
11.宿主細胞XDH遺伝子の上流(5'−)領域は、XIカセット、XKカセット、又は両者に先行し、その後、宿主XDH遺伝子の下流(3'−)領域が続く。このベクターには、XDH遺伝子の上流及び下流領域の間に他の構成要素があってもよい。
12.上記全てのプラスミドは、宿主細胞で活性な自己複製部位を有する。
キシロース イソメラーゼ遺伝子は、キシロース上での増殖能をもとにし選択を行うことで、上記のように働く。
特に、産生期に好ましい温度は約30−45℃である。細胞が組換えK.marxianusの場合、このバクテリアは比較的高温(40℃以上50℃まで、特に45℃まで)を許容する。他の好ましい細胞、C.sonorensisは約40℃までを許容する。この温度範囲では、産生力を損失することなく、発酵をこの様な高温(冷却コストを減らすことができる)で行える可能性がある。優れた高温許容の他の利点は、発酵が他の望ましくない微生物のコンタミを受けた場合、多くの場合、発酵培地を40℃又はそれ以上、特に45℃又はそれ以上で加熱すると、本発明の望みの細胞を失うことなく、コンタミした微生物を殺すことができる。
S.cerevisiaePGK1プロモーター(ScPGK1)の塩基配列は、配列番号1として表わされている。この配列は、登録プラスミド商標pBFY004の制限酵素断片として得た。又は、S.cerevisiaeクロモソームDNAを鋳型とし、配列番号1に基づいて設計したプライマーを用い、PCR増幅により得ることができた。
ScPDC1プロモーターの塩基配列は、配列番号5として表わされた。
G418耐性遺伝子は、プラスミドpPIC9K(Invitrogen,CA)を鋳型とし、配列番号8及び9と表わされているプライマー、Pfuポリメラーゼ(Stratagene,Madison,WI)を用い、PCR増幅により得ることができた。熱サイクル条件は、最初、反応混合物を95℃5分インキュベートした後、95℃30秒、49℃30秒、72℃2分を35サイクル行い、最後に72℃10分インキュベートした。PCR産物は、BamHI及びXbaIで消化し、821bp断片を単離し、pNC2(実施例1A,図1)の〜4303bpBamHI−XbaI断片と結合させた。でき上がったプラスミド(pVR22,図3)は、ScPGK1プロモーター及びScGAL10ターミネーターと作動可能に連結したG418耐性遺伝子を有する。
G418耐性遺伝子は,プラスミドpVR22(実施例1B,図3)を鋳型とし、配列番号8及び9に表わしたプライマー、Pfuポリメラーゼ(Stratagene,Madison,WI)を用い、PCR増幅により得ることができた。
熱サイクル条件は、最初、反応混合物を95℃5分インキュベートした後、95℃30秒、49℃30秒、72℃2分を35サイクル行い、最後に72℃10分インキュベートした。PCR産物を、BamHI及びXbaIで消化し、821bp断片を単離し、pNC4(実施例1A,図2)の〜4303bpBamHI−XbaI断片と結合させた。でき上がったプラスミドpVR29(図4)は、ScPDC1プロモーターとScGAL10ターミネーターと作動可能に連結したG418耐性遺伝子を有する。
K.marxianusPDC1(KmPDC1)遺伝子の上流領域に直接に隣接した1254bpDNA断片を、配列番号10及び11に表わしたプライマーと、プラスミドpSO21(U.S.特許出願2004/029256A1)を鋳型として用いてPCR増幅した。熱サイクル条件は、先ず、反応混合物を94℃で2分インキュベートし、94℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分を35サイクル行い、最後に72℃7分インキュベートした。PCR産物は、0.8%アガロースゲルで分離し、〜1254bp産物を単離した。PCR産物とpVR29プラスミド(実施例1C,図4)をKpnI及びSbfIで消化し、連結させpBH5a(図5)と名付けた〜6315bpのベクターを作成した。pBH5aプラスミドは、ScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーターと作動可能に連結したG418耐性遺伝子、及びKmPDC1遺伝子と直接に隣接した上流領域DNAに相同な〜1240bpDNA断片を含む。
pBH5bプラスミドはまた、ScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーターに作動可能に連結したG418耐性マーカーを含む。
配列番号14及び15に表わしたプライマーは、pYES6CTベクター(Invitrogen,CA)をもとに、マルチプルクローニング部位、ポリ−His標識及びS.cerevisiaeCYC1ターミネーター(ScCYC1)を含む塩基配列を増幅するために設計された。プライマーは産物にSbfI及びBsmBI部位を導入した。PCR条件は、PlatinumPfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用い、94℃1分、55℃1分、68℃1分を30サイクル後、68℃10分のインキュベーションを行った。PCR産物をカラムで精製し、TaqDNAポリメラーゼで72℃10分インキュベートし、TAクローニングの5’末端にアデニンヌクレオチドを付加した。次ぎに、507bp産物をTOPOII TAクローニングベクター(Invitrogen,CA)中にTAクローン化し、pVR73(図6)と命名した。このベクター内にポリHis−標識を有するために、ユニークなSbfI部位にクローン化された遺伝子では、このHis標識が、遺伝子から発現されたタンパク質に融合することになる。ポリHis標識によるこのタンパク質の標識化の結果、Ni−NTA(HRP)接合体(Quiagen,USA)を用いて、タンパク質の比較的迅速なWesternブロット検出及び、Niキレート樹脂とカラム(Invitrogen,CA)を用いて、発現した遺伝子産物の迅速な精製が可能となる。
プラスミドpVR73(実施例1E,図6)を酵素SbfI及びBsmBIで消化し、マルチクローニング部位、ポリ−His標識及びScCYC1ターミネーターを含む504bp断片を切り出した。ベクターpVR77を同じ酵素で消化し、KmPDC1上流、及び下流隣接領域、及びベクター骨格を含む〜4249bp断片を作成した。これら二つの断片を連結させ、ポリHis標識から184bp離れた位置にユニークなSbfI制限部位を有する〜4752bpプラスミド(pVR78,図6)を作成した。
この過程で大部分のKmPDC1下流隣接領域がプラスミドpVR78から除去された。
配列番号16及び17に表わしたプライマーを、プラスミドpVR78について、ポリHis標識からScCYC1ターミネーターまで全領域を増幅するために設計した。このプライマーもまた、ポリHis標識と3´SapI位置の直接上流領域に1個の5’SbfI部位を有する。PCRを標準的方法で行った。PCR条件は、94℃2分の最初のインキュベーション後、10サイクルの94℃30秒、63℃30秒及び68℃1分の反応を行った。その後、更に20サイクルの94℃30秒、68℃1分の反応を行った。最終段階は68℃8分であった。増幅反応はPlatinumPfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用いて行った。PCR産物を、SbfI及びSapI制限酵素で消化した。酵素5’SbfI及び3’SapIでプラスミドpVR78を消化して得た〜3.9kbp断片をPCR産物と結合させた。得られたプラスミドをpCM3(図7)と命名した。
ヒグロマイシンBに耐性を与えるE.coli hph遺伝子を、配列番号18,19に表わしたプライマー、鋳型としてプラスミドpRLMex30(Mach他、1994,Curr.Genet.25,567−570)を用いてPCR増幅した。hph遺伝子は同じプライマーを用い、鋳型としてE.coliクロモソームDNAを用いても得ることができる。熱サイクル条件は、PfuTurboDNAポリメラーゼ(Stratagene,Madison,WI)を用いて、30サイクルの94℃1分、56℃1分、72℃3分の後、最終的に72℃7分処理した。PCR産物を、0.8%アガロースゲル上で電気泳動して分離し、1026bp断片を単離した。1026bp断片をXbaI及びBamHIで消化し、ScPDC1プロモーターとScGAL10ターミネーターを含むpNC4(実施例1A,図2)のXbaI−BamHI断片に連結し、プラスミドpPS1(図8)を得た。
プラスミドpPS1をSphIで消化し、ScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーターの転写制御下にあるhph遺伝子を有する〜2.2kbp断片をSphIで消化したpCM3と結合した。得られたプラスミド(pCM9,図9)は、将来のキシロースイソメラーゼ遺伝子発現のためのKmPDC1プロモーター、ついで単一のSbfI部位、及びScCYC1ターミネーターを含む。更に加えて、この遺伝子発現のためのカセットは、酵母における形質転換の選択のために、ScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーターの転写制御下にあるhph遺伝子からなる〜2.2kbp断片に直接隣接して位置する。
PiromycesE2種キシロースイソメラーゼ(PXYLA)遺伝子の再構成に用いる方法は、Alberto Di Donato他、AnalyticalBiochemistry212,291−293(1993)"ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子とcDNAの合成法"より適用した。PAGEで精製したプライマーは、再構成が進行するように、遺伝子の中心から出発して順序づけた。プライマーセットは14−16bp重なるよう維持した。各プライマー長は60−70bpであった。遺伝子は17段階で再構成できた。
第2−17段階のサイクリングステップは、20サイクルの94℃1分、46℃1分、68℃2分(次のサイクルへ進む際更に5秒間追加される)であり、次いで4℃の貯蔵が続く。
再構成したPXYLA遺伝子(実施例2A)を含むプラスミドは、構築の最終段階で作成した〜1.314kbp断片をTOPOIIベクター(Invitrogen, CA)と結合することにより作成した。再構成したPXYLA遺伝子はGenbank配列と5塩基について異なる。それぞれの差異はマルチ部位特異的突然変異キット(Staratagen,CA)を用い、このプラスミドを鋳型として用いて修正した。3個のPAGE又はHPLCで精製した、配列番号54、55及び56と表わす5’リン酸化突然変異性プライマーを4種の誤りを修正するために用いた。熱サイクルパラメーターとしては、変性段階1分、アニーリング段階1分、その後伸長段階8分である。PCR段階で作られた親鎖を、熱サイクルの終了時に反応混合物に1μL DpnI酵素を加えて消化した。混合物を37℃1時間保温し、キットと共に提供されたXL10−GoldUltracompetentE.coli細胞を形質転換するのに用いた。混合物をLuria−Bertani+アンピシリン(LBA)を含むプレートに播き、37℃一晩インキュベートした。
マルチ部位特異的突然変異プロトコールを繰り返し、5番目の誤りを訂正した。PAGE又はHPLCで精製した、配列番号57及び55と表わした2個の5’リン酸化した突然変異性プライマーを用いた。2個の形質転換体は塩基配列決定され、PXYLA遺伝子のGenbank配列と100%相同性を示した。構築物の1つをpCM17(図10)と名付けた。再構成したPXYLA遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号58,59と表わした。
PXYLA遺伝子を、pCM17(実施例2B,図10)を鋳型とし、配列番号60,61で表わされるプライマーを用いてPCR増幅した。熱サイクル条件は、pfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用い35サイクルの94℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分、その後72℃8分の最終インキュベーションからなる。PCR産物をSbfIで消化し、1.0%アガロースゲル上の電気泳動で分離した。1319bp産物を単離し、pCM9をSbfIで消化して得た〜6829bp断片と連結し、〜8148bpプラスミドを構築した。実施例2Bに記載したと同じプロトコールに従い、配列番号62で表わす突然変異性プライマーを用いて、SbfIの直接上流に偶然に付加された停止コードンを取り外して、〜8148bpプラスミド(pCM14,図11)を作成した。
Alani等は、"複数箇所破壊された酵母株構築における、繰り返したUra3選択による遺伝子破壊方法"(Genetics,1987,116,541−545)において、遺伝子組込み方法、又は遺伝子破壊方法を記載している。この方法はウラシル要求性の酵母株、及びHisG−ScUra3−HisGリピーターカセットを用いる。このカセットは、HisGカセットが次の世代において、自己と再結合するという利点を用いて、遺伝子に導入する、又は遺伝子を破壊する選択マーカーとして用いられる。
このようにして、酵母細胞は、再結合の過程でScUra3遺伝子を失いScUra3遺伝子を失うことで、酵母株は同じカセットを用いたその後の形質転換のために、ウラシル要求性が回復する。HisG−ScUra3−HisGカセットは、pNADF11(NancyDasilva,UCIrvine、California)と名付けられたプラスミドに取り込まれ、NancyDasilvaより得ることができる。HisG−ScUra3−HisGカセットは、pNADF11プラスミドをBamHI及びEcoRI酵素で消化し、〜3.8kbp断片を、BamHI及びEcoRIで消化したプラスミドpPUC19(NewEnglandBiolabs,USA)に連結し、pNADF11から単離することができる。でき上がったプラスミドをpVR65(図19)と名付ける。
410bp断片のK.marxianusキシロースリダクターゼ(KmXYL1)の推測解読領域、及び約500bpのプロモーターは、Genolevures計画において、同様のK.marxianusの部分ゲノム配列決定された(Hemiascomycetous酵母のゲノム調査:12.Kuyveromyces marxianus var. marxianus,Bertrand Llorente,Alain Malpertuy,Gaelle Blandin,Francois Artiguenave,Patrick Wincker及びBernard Dujon, FEBS Letters 487(1)pp.71−75)。この配列、及び他の酵母キシロースリダクターゼコンセンサス配列から既知のいくつかの配列をもとに、プライマーが設計され、KmXYL1遺伝子の全配列及びプロモーターが単離された。ゲノムウオーキング法によりK.marxianus野生株よりKmXYL1遺伝子配列の上流及び下流配列を得た。ゲノムウオーカーキット(BD Bioscience,Paolo Alto、CA)を用いて、隣接上流、下流配列を得た。K.marxianusのゲノムDNAを、ゲノムウオーカーキット(Invitrogen、CA)からの制限酵素で消化した。断片で作られたゲノムライブラリーをPCR反応の鋳型として用いた。
キシロースリダクターゼ及び上流/下流隣接配列を得るために、5’末端及び3’末端ウオークするために、配列番号63及び64と表わすPCRプライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、ゲノムウオーカーキット(BD Biosciences,CA)からのプライマーAP1及びAP2にそってウオークを行った。このプライマーセットはこの遺伝子の上流〜2.5kbpを増幅した。この断片を配列決定すると、KmXYL1遺伝子の上流領域の最上流末端からのDNA配列であることが分かった。同様に、配列番号65及び66と表わすプライマーを用いて、ゲノムウオーカーキットからのプライマーAP1及びAP2にそってウオークを行った。これにより、KmXYL1遺伝子の下流の〜1.8kbp断片を増幅した。この断片の配列決定により、キシロースリダクターゼ遺伝子の下流領域の最下流末端からのDNA配列であることが分かった。
配列番号69及び70で表わすプライマーを、プラスミドpVR95(実施例4A,図13)の〜1.3kbp断片を増幅するために設計した。この断片には、遺伝子の〜300bp解読領域ばかりでなく、KmXYL1遺伝子のプロモーター領域も含まれる。これらのプライマーとpVR95(実施例4A,図13)の50ngプラスミドDNAを用いて、熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、PfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用い、30サイクルの94℃1分、53℃1分、68℃1分、そして最後に68℃8分のインキュベーションを行った。PCR産物を電気泳動分離後PstI消化し、同じくPstI消化したpVR29(実施例1C,図4)と連結した。この方法で得たプラスミドでは、pVR29ベクター中でKmXYL1遺伝子とプロモーター領域が正しい方向性を有することが証明された。プラスミドはpCM18(図14a)と名付けられた。
この断片には、KmXYL1遺伝子のターミネーターを越えた、下流領域がある。これらのプライマーと50ngのpVR95プラスミドDNAを用い熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、PfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用い、30サイクルの94℃1分、59℃1分、68℃1分、そして最後に68℃8分のインキュベーションを行った。配列番号73及び74で表わしたプライマーと、上記最初のPCR産物50ngを用いて、熱サイクル反応を行った。熱反応条件は、PfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用い、30サイクルの94℃1分、45℃1分、68℃1分、そして最後に68℃8分のインキュベーションを行った。第2の熱サイクル反応後のPCR産物を、電気泳動分離を行い、ApaI消化し、同じくApaI消化したプラスミドpCM18と連結し、ベクターpCM19(図14b)を作成した。プラスミドpCM19は、KmXYL1遺伝子の下流隣接領域とKmXYL1遺伝子の上流隣接領域を(〜300bpのこの遺伝子解読領域も共に)含むが、これらはScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下のG418からなるカセットにより分離されている。G418耐性遺伝子に対して、KmXYL1下流領域が正の方向性を有することは証明された。
K.marxianusUra3(KmUra3)遺伝子を、ゲノムDNAを鋳型とし、Genbank配列(寄託番号AF528508)に基づいて設計したプライマーを使い単離した。804bp断片は、pBluescriptベクター(Stratagene,Wisconsin)中にクローニングされ、pBSKura3Myra(図15)と標識した。
KmXYL1遺伝子の上流及び下流領域の間にG418耐性発現カセットを含み、上流、下流領域からなる〜5.2kbp断片は、pCM19をPvuIIで消化して得た。標準的電気穿孔法を用いて、この断片によりK.marxianusCD683株を形質転換した。形質転換細胞を回収し、10g/L酵母抽出物、20g/L酵母ペプトン、50g/Lグルコース(YPD)+50μg/mLG418を含むプレートに播き、37℃で48−96時間インキュベートした。YPD+50μg/mLG418を含むプレートに増殖した96形質転換体を、YPX[(10g/L酵母抽出物、20g/L酵母ペプトン+キシロース50g/L)+50μg/mLG418を含むプレート上でレプリカした。96形質転換体の中73転換体がYPX+50μg/mLG418を含むプレートでは増殖できず、キシロースを炭素源として用いることができないことを確認した。増殖できないことは、機能的なKmXYL1遺伝子が欠失し、相同的再結合によりG418カセットに置き換えられたことを示す。キシロースを炭素源として利用できないこれらの形質転換体をCD804と命名した。
分離型のバッフル付き振盪フラスコ(容量250ml)にCD683(実施例4C)株、及びCD804(実施例4D)株を接種した。フラスコを250rpmで振盪させ、35℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデクストローズを含む。18時間後、細胞を4000G5分で遠沈し、100mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、0.5ml破砕用緩衝液に懸濁させた。破砕用緩衝液は200mL中に、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0),1mMジチオスレイトール(DTT),40mgフェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)(500μLDMSOに溶解)、及び4種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche,CA)を含む。
細胞は機械的にガラスビーズ(Invitrogen CA)を用いて溶菌し、14,000G15分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール(Amersham,Bioscience)に従い、PD−10脱塩カラムを通した。XR酵素活性検定テスト溶液は、全量1mL中、100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0.2mM NADPH,0.5mMD−キシロースを含み、ここに様々な量の酵素溶液を加え、340nmの吸光度を測定した。使われたNADPH量がリダクターゼ酵素活性を示す。バックグラウンドとしてのNADPH消費量を決定するために、キシロースなしのブランク溶液を用いた。
Saccharomyces cerevisiaeは、American Type Culture Collection(ATCC寄託番号38626)から得、標準的条件で生育させた。S.cerevisiaeのゲノムDNAは、従来型の方法で単離した。PCDR増幅反応は、Pfxポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用いて行った。各反応液は、500ng濃度のS.cerevisiaeゲノムDNA,各0.2mM濃度の4dNTPs(dATP,dGTP,dCTP及びdTTPの各々)及び、1μMの配列番号81及び82で表わす増幅用プライマーからなる。サイクリングは最初のインキュベーション94℃10分、その後35サイクルの94℃15秒、55℃15秒、68℃90秒からなる。〜1.8kbp断片を従来型処方でゲルで単離し、TAクローニングベクター(Invitrogen、CA)にクローン化した。でき上がったプラスミド(pVR67,図16)を配列決定し、ScKXS1遺伝子配列が証明された。遺伝子は、Genbank(寄託番号X61377)の既知配列と優れた相同性を示した。
ScXKS1遺伝子の塩基配列を配列番号83と表わす。この遺伝子でコードされる酵素のアミノ酸配列を配列番号84で表わす。
S.cerevisiaeTEF1(ScTEF1)プロモーターは、pTEFZeo(Invitrogen,CA)ベクターよりクローン化された。配列番号85及び86と表わされたプライマーを用いて、ScTEF1プロモーターを増幅し、XbaI及びSstI制限部位を挿入した。PCR産物とpNC2(実施例1A,図1)プラスミドを、XbaI及びSstI酵素で消化し、連結して、プラスミドpVR52(図16)を作成した。
プラスミドpVR67(実施例5A,図16)を、XbaI及びBamHIで消化した。ScXKS1遺伝子を含む〜1.8kbp断片をゲルで精製した。プラスミドpVR52(実施例5B,図16)もまた、XbaI及びBamHIで消化し、得られた断片をpVR67の〜1.8kbp断片と連結し、プラスミドベクターpVR96(図16)を得た。このプラスミドは、ScTEF1プロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下にあるScXKS1遺伝子を有する。このベクターにおいて、ScXKS1遺伝子のATG開始部位はScTEF1プロモーター末端より130bp離れている。この距離を約70−73bpまで短縮するために、ScTEF1プロモーターをpTEFzeoベクターから正しい距離と制限部位を有して増幅するよう、プライマーを設計し、配列番号87及び88と表わした。pTEFzeo(Invitrogen,CA)を鋳型として用いた。熱サイクルは、Failsafe PCR System(Epicentre,Madison,WI)を用い、30サイクルの94℃30秒、57℃30秒、72℃30秒で行い、最後に72℃4分のインキュベーションを行った。PCR産物は0.8%アガロースゲルで分離し、460bp断片を単離した。第二のPCRにより、配列番号89及び90で表わすプライマーを用いてこの断片を増幅した。PCR産物をEcoRIで消化し、EcoRI消化のプラスミドpVR96(図16)と連結した。でき上がったプラスミド(pVR102,図17)は2個のScTEF1プロモーターを有し、第2のプロモーターはScXKS1遺伝子を駆動する。プロモーター末端と遺伝子のATG部位間の距離は正確に73bpであった。プラスミドpVR102をSphIで消化し、SphI消化したpPUC19(New England Biolabs,USA)と連結した。でき上がったプラスミド(pVR103、図18)は塩基配列決定され、ScTEFIプロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下のScXKSI遺伝子であることが証明された。
プラスミドpVR65(実施例3B,図19)をSphIで消化し、線型化したベクターの5’−リン酸末端を、製造会社のプロトコールに従い、エビアルカリホスファターゼ(Roche Diagnostics,USA)で脱リン酸化した。
プラスミドpVR103(実施例5C,図18)もSphIで消化し、ScTEF1プロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下にあるScXKS1遺伝子を有する3.5kbp断片を、線型化したpVR65断片と連結し、プラスミドpVR104(図19)を得た。
プラスミドpVR104(実施例5D、図19)から得た〜6.8kbpPvuII断片を使い、通常の電気穿孔法で、CD804株(実施例4D)を形質転換した。YPD培地で回復した形質転換細胞を、4時間後SCUraプレート(Qbiogene,CA)を蒔種し、37℃で48−72時間インキュベートした。72時間後にSCUraプレートに増殖した形質転換体を、新SCUraプレート上に再びすじ状に蒔種した。再蒔種した形質転換体はコロニーPCRでスクリーニングされた。
配列番号91及び93で表わすプライマーを、ScTEF1プロモーターとScXKS1遺伝子末端の間、〜2.6kbp産物を増幅するために設計した。配列番号92及び95で表わすプライマーは、ScXKS1遺伝子と断片の開始の間、〜1.7kbp産物を増幅するために設計された。これら2つのプライマーセットにより、ScXKS1遺伝子は、CD805株のクロモソームに組み込まれていることを確認した。
分離型のバッフル付き振盪フラスコ(容量250ml)にCD804(実施例4D)株及びCD805(実施例5E)株を接種した。フラスコを250rpmで振盪させ、35℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデクストローズを含む。16時間後、細胞を4000G5分で遠沈し、100mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、0.5ml破砕用緩衝液に再懸濁させた。破砕用緩衝液は、200mL中に100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0),1mMジチオスレイトール(DTT),40mgPMSF(500μL DMSOに溶解)、及び4種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche)を含む。細胞を機械的にガラスビーズ(Invitrogen CA)を用いて溶菌し、14,000G15分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール(Amersham,Bioscience)に従い、PD−10脱塩カラムを通した。10μLの抽出物を、30℃に保った80μLXuK混合物《全量100mLに対し、61mgのNa2ATP・3H2O,10.0mLの0.1M HEPES/KOH(pH7.5),1.2mLの0.1M MgCl2(16.0mLに希釈)に加え、さらに10μLの20mMキシルロースを含む》に加えた。ブランクとして水をキシロースに置き換えた。反応は2分間沸騰させて停止し、氷に移した。900μLのHek2(40mM HEPES/KOH(pH7.5)、10mM MgCl2,2.5mM PEP及び0.2mM NADH)を加え、14,000G10分遠心した。上清をスペクトロフォトメーターキュベットに移し、初期の340nm吸光度ベースラインを確立する。10μLのミオキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸塩デヒドロゲナーゼの1:1:1混合物を加え、最終的な吸光度を測定する。全タンパク質量は、BSAをスタンダードとして、新タンパク質定量試薬(Cysoskeleton#ADV01)を用いて決定した。CD804株に対するキシルロキナーゼ活性は、69.7+/−8.0mU/mgであるのに対し、CD805株に対する活性は、400.8+/−102.7mU/mgであり、CD805は、ScXKS1活性を過剰発現したことを示す。
K.marxianusキシリトールデヒドロゲナーゼ(KmXYL2)遺伝子のプロモーター領域を含む988bp断片を、配列番号96及び97で表わすプライマーを用い、ゲノムよりPCR増幅した。熱サイクル条件は、pfxDNAポリメラーゼ(Invitrogen,CA)を用いて、35サイクルの94℃30秒、52℃30秒、68℃1分後、最終インキュベーション68℃8分であった。産物をTOPOIIベクター(Invitrogen,CA)中にクローン化した。プラスミドpUC19(NewEnglandBiolabs,USA)をEcoRIで消化し、1.0%ゲルで分離した。2.686kbpバンドをpUC19プラスミドより単離し、TOPOIIプラスミドからEcoRI消化で外れた断片と連結し、〜3.674kbpプラスミドを作成し、pCM20と命名した。
このプラスミドは、ScPDC1プロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下にあるE.coli hph遺伝子により分離された、KmXYL1遺伝子の隣接した上流領域と下流領域を有する。
標準的電気穿孔法を用いて、CD805株の単一コロニーを、プラスミドpCM23より得た断片で形質転換させた。YPD培地内で回復した形質転換細胞を、4時間後、YPD+150μg/mLヒグロマイシンを含むプレートに蒔種し、48時間37℃でインキュベートした。48時間後YPD+150μg/mLヒグロマイシンを含むプレートに増殖した86形質転換体を、新しいYPD+150μg/mLヒグロマイシンを含むプレートに再蒔種した。配列番号104及び105と表わされるプライマーを用いて、形質転換体に固有のキシリトールデヒドロゲナーゼが存在するか否かを、PCRでスクリーニングを行った。熱サイクル条件は、Failsafe酵素(Epicentre,Wisconsin)を用いて、最初のサイクルは、94℃10分ではじまり、次ぎに35サイクルの94℃30秒、50℃30秒、72℃1分後、最終インキュベーション72℃8分であった。1064bpのPCR産物は、原型のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子であることを示した。15個の形質転換体は、期待した産物を作らず、これらの15個の形質転換体では、キシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が首尾良く欠失していることを示した。
分離型のバッフル付き振盪フラスコ(容量250ml)にCD805(実施例5E)株及びCD806(実施例6B)株を接種した。フラスコを250rpmで振盪させ、33℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデクストローズを含む。
16時間後、細胞を4000G5分で遠沈し、100mMリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、0.5ml破砕用緩衝液に懸濁させた。破砕用緩衝液は、200mL中に100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0),1mM DTT,40mg PMSF(500μL DMSOに溶解)、及び4種のプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche)を含む。細胞は、機械的にガラスビーズ(Invitrogen CA)を用いて溶菌し、14,000G15分遠心した。上清を取りだし、キットプロトコール(Amersham,Bioscience)に従い、PD−10脱塩カラムを通した。試料を100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)、0.2mM NADH及び20mMキシルロースを含む検定用溶液に加えた。吸収は340nmで行った。全タンパク質量は、BSAをスタンダードとして、新タンパク質定量試薬(Cysoskeleton#ADV01)を用いて決定した。CD805(実施例5E)株の酵素解析によると、酵素活性は14.5+/−1.6mU/mgであるのに対しCD806株の活性は0.0+/−0.1mU/mgであった。これらの結果はキシリトールデヒドロゲナーゼ酵素活性がCD806株では欠失していることを示す。
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのCD806株を、NaeIで消化したプラスミドpCM28で形質転換した。形質転換体は37℃で一晩生育させ、スクリーニングのために5枚の等しいSc−Uraプレート上に蒔種した。PXYLA遺伝子が在ることは、配列番号110及び111で表わす、プライマーを用いたPCRで証明した。得られた形質転換体(CD882と表す)には、再構成したPXYLA遺伝子が在り、ScXKS1遺伝子活性が過剰発現し、またKmXYL1及びKmXYL2遺伝子が欠失していた。
CD882からのタンパク質は、6Xポリ−His標識に結合するProbondNi2+キレート樹脂(Invitrogen,Carlsbad,CA、USA)を用いたカラムにより精製した。Ni−NTA−HRPと結合したプローブ(Qiagen,Valencia,CA,USA)を用いて、標識したタンパク質を直接検出した。精製過程で集めた分画のWestern解析により、CD882株にXIタンパク質が在ることが確認できた。酵素活性測定は、"Streptomyces rubiginosusキシロースイソメラーゼはSaccharomyces cerevisiae中で発現された場合、誤フォールディングされている"Gardonyl他2003、に記載されている方法により行われた。検討した結果、6Xポリ−His標識PXYLA遺伝子が、CD882株でWestern解析により、検出された同じ分画でキシロースイソメラーゼ活性が在ることが確認できた。
再構成されたPXYLA遺伝子(実施例2A)はpCM17(実施例2B,図10)を鋳型とし、配列番号112及び113で表わすプライマーを用いて、PCR増幅した。熱サイクル条件は、PfxDNAポリメラーゼを用いて、35サイクルの94℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分後、最終インキュベーション72℃8分であった。PCR産物はSbfIで消化し、1.0%アガロースゲル上の電気泳動で分離した。1319bp産物を単離し、SbfIで消化したプラスミドpCM9(実施例1I,図9)から得た6829bp断片と連結し、〜8148bpプラスミド(pCM29,図21)を得た。このプラスミドは、KmPCD1プロモーター及びScCYC1ターミネーターの制御下で、非機能的なポリ−His末尾を伴うPXYLA遺伝子及びE,coli hph発現カセットを有する。
標準的電気穿孔法を使い、pCM29を消化して得た3.192kbpPvuII/SphI断片を用いて、CD806株を形質転換した。YPD培地で回復した形質転換細胞を、6時間後、YPX+300μg/mlG418+150μg/mlヒグロマイシン(pH7.0)上に播種した。30℃で5日後、数百の小さなコロニーと一個の大きなコロニーが生育した。大きなコロニーをCD861と命名した。
CD861株上でゲノムウオーキングを行い、PXYLA遺伝子がどの様に組み込まれているか確認した。PXYLA遺伝子は、固有PDC遺伝子のプロモーターの直接上流領域に、1コピー以上組み込まれていることが分かった。1コピーは、約142bpの上流領域遺伝子及びScCYC1ターミネーターを有する、プラスミドpCM29に存在する〜1236bpKmPDC1プロモーターの制御下にあった。他のコピーは、このScCYC1ターミネーターの直接下流領域に在り、固有のKmPDC1プロモーター長とマッチする1026bpプロモーターを有していた。このプロモーターは、pCM29及び第一コピーのプロモーターと比較すると、上流領域遺伝子の142bp、及びさらに5’末端の68bpを欠いている。第2のコピーもまた、ScCYC1ターミネーターの制御下にあった。
この第2のScCYC1ターミネーターの直接下流に固有の、1026bpKmPDC1プロモーターがあり、固有のKmPDC1遺伝子が続く。
分離型のバッフル付き振盪フラスコ(容量250ml)にCD806(実施例6B)及びCD861(実施例8B)を接種した。フラスコは、250rpmで振盪させ、30℃でインキュベートし、一晩増殖させた。培地は、300μg/mLG418及び150μg/mLヒグロマイシンを補強した、20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデクストローズを含む。細胞はY−PER溶液(Piece−Rockford,IL)で溶菌し、PD−10カラム(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)を用いて脱塩した。検定用溶液は、1、0mL中に、100mM TES−NaOH, 250mMキシロース、10mM MgCl2,0.6mM NADH,1U SDH(Sigma)(pH7.0)を含み、100μLの細胞抽出液を加えた。キシロースイソメラーゼ活性は同じ検定用溶液よりキシロースを除いたブランクを用いて測定した。CD806株のキシロースイソメラーゼ活性は0であったが、CD861株のものは、1.07+/−0.21U/mg粗抽出物であった。このことは、CD861株は機能的なキシロースイソメラーゼ遺伝子を有することを証明する。
単一コロニーのCD861株を、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン及び100g/Lデキストロースを含む培地中に接種し、一晩増殖した。細胞を遠心で集菌し、10mLの100mMリン酸ナトリウム、1mM PMSF(pH7.0)で一回洗浄し、再び遠心した。
これについて、2mLのY−PER溶液を加え、穏やかに懸濁し、細胞溶液を室温で30分、時々かき回しながらインキュベートした。細胞を遠沈し、上清をPD−10カラム(Amersham,Biosciences)で脱塩した。酵素検定は実施例8Cで記載したように行ったが、ただ一点の違いは基質濃度を0.05−10mMキシロースと変えたことである。Km及びVmaxはMichaelis−Mentenプロットにより得たが、Vmaxが〜1.8であり、対応するKmが2.2mMキシロースであった。Lineweaver−Burkプロットにより、対応するVmaxが〜1.0であり、対応するKmが1.2mMキシロースであった。
CD861株は、既知のキシロースイソメラーゼ阻害剤である、様々な濃度のキシリトールを含んだキシロース培地中で増殖した。キシリトールレベルが0から0.25mMに増加すると、キシロースイソメラーゼ酵素のKm値は2倍になり、キシリトールレベルが0.50mMに増加すると、更に2倍となった。
単一コロニーのCD861を10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン及び100g/Lデキストロースを含む培地中に接種し、一晩増殖した。細胞を遠心で集菌し、10mLの100mMリン酸ナトリウム、1mM PMSF(pH7.0)で1度洗浄し、再び遠心した。これに対し、2mLのY−PER溶液を加え、穏やかに懸濁し、細胞溶液を室温で30分、時々かき回しながらインキュベートした。重複した検定溶液には、900μL中、100mM TES−NaOH,10mM MgCl2,0.6mM NADH,250mMキシロース及び1U SDHを加え、それぞれ5M乳酸(Sigma,USA)でpHをpH7.0,6.6,5.9,4.6,3.8に調整した。ここに100μLの酵素、又は、その希釈液を加え、最終容量を1mLとした。酵素活性は、実施例8Cに従い測定した。最適活性は、pH6.5であった。pH5.9において、タンパク質は最大活性の45%を保持していた。
単一コロニーのCD806,CD861及びCD882株を、300μg/mLG418及び300μg/mLヒグロマイシンを補強した、20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデキストロースを含む100mLの培地中に別々に接種し、一晩増殖した。
細胞乾燥重量を測定し、2g細胞乾燥重量(gcdw)当たりの適量の培地を遠心し、20g/L酵母ペプトン、10g/L酵母抽出物、50g/Lキシロース及び10mM MgCl2、pH7.0を含む50mLの培地に懸濁した。細胞は250mLのバッフル付き振盪フラスコに入れ、30℃,70rpmで振盪下に置いた。CD806株は唯一の産物として0.7g/Lキシリトールを産生した。CD882株は、測定しうる産物としては、0.4g/L酢酸塩の他に、3.8g/Lキシリトールを産生した。CD861株は、13.5g/Lエタノール、0.4g/Lキシリトール及び少量のグリセロール、酢酸塩、コハク酸塩(<2g/L,全)を産生した。
CD806,CD861,及びCD882の単一コロニーを、300μg/mLG418及び300μg/mLヒグロマイシンを補強した、20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン及び100g/Lデキストロースを含む100mLの培地中に別々に接種し、一晩増殖した。各株の一晩増殖液の50mLを遠心し、20g/L酵母ペプトン、10g/L酵母抽出物、50g/Lキシロース及び10mM MgCl2、pH7.0を含む25mLの産生培地に再懸濁した。1mLの細胞再懸濁液を50mL Falconチューブ中の45mLの産生培地に加え、最初のODを記載した(OD値については別表を参照)。この操作を何回か繰り返し、実験を通して充分な試料を取り込むようにした。チューブは、産生条件33℃、200rpmに保った。CD861株は21g/Lエタノールを産生し、この条件下での容積産生率0.3g/L−hrを示した。CD806株はキシロースを消費できなかった。CD861株とCD882株は、どちらも嫌気的産生を示した。
プラスミドpCM28(実施例3B,図12)を鋳型として用い、配列番号114及び115で表わすプライマーを用いて、PCRによって、隣接したHisGリピートを取り外しつつSphI部位を導入した。熱サイクル条件は、TaqDNAポリメラーゼ酵素(Quiagen,USA)を用い、94℃10分の最初のサイクル後、35サイクルの94℃30秒、45℃30秒、72℃1.4分後、最終インキュベーション72℃8分であった。得られたプラスミドをSphIで消化し、隣接したHisG繰り返しなしのScUra3遺伝子を有する〜1.45kbp断片を得た。
ScPGKプロモーター及びScGAL10ターミネーターの制御下のL.helveticus乳酸デヒドロゲナーゼ(LhLDH)遺伝子及びScPGKプロモーター及びScGAL10ターミネーターの制御下にあるG418耐性マーカー遺伝子、を有するプラスミド(図6のpVR39及びWO03/102152A1の実施例1Eと同一)をSphIで消化し、〜5.16kbp断片を作成した。この〜5.16kbp断片を上記の〜1.45kbp断片と連結し、〜6.61kbpプラスミド(pVR113,図22)を得た。
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのCD861株をプラスミドpVR113により形質転換した。4時間YPD中で回復した形質転換細胞を、ScUraプレートに蒔種した。1個の陽性の形質転換体(CD896株)が、LhLDH/ScUra3カセットに対するPCRスクリーニングにより選択された。この形質転換体は、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼプライマーにより陽性のPCR結果を示し、キシルロリダクターゼ及びキシリトールデヒドロゲナーゼプライマーによりネガティブな結果を示した。
単一コロニーのCD896株(実施例10B)を50mLのYPD培地(250mLバッフル付きフラスコ中、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン及び100g/Lグルコース)に蒔種し、16時間、37℃、250rpmで増殖させた。この培養液より、3gcdwを、50g/Lキシロース、23g/L CaCO3と共にYP(10g/L酵母抽出物20g/Lペプトン)を入れた振盪フラスコ(微好気的)中に接種し、及び250mLガラスボトル(嫌気的)に接種した。フラスコは42℃でインキュベートし、試料をランダムな間隔でHPLCのために、取り出した。微好気的条件でCD896株の発酵によって、39g/LタイターのL−乳酸が得られ、収率はキシロース消費量により77−79%であった。L−乳酸の体積的な産生性は、1g/L/hrであった、それに対し、初期のキシロース消費速度は1.0と1.4g/L/hrの間であった。CD896株のYP+50g/Lキシロース+23g/L炭酸カルシウム上で、嫌気的条件下での発酵により、最初の24時間に、10g/LL−乳酸を産生し、その後キシロース消費は失速した。
この実験は再構成されたPXYLA遺伝子の活性に及ぼすポリ−his標識の効果を調べるために設計された。5μgのpCM14(実施例3A,図11)をSphIで消化し、1.0%アガローズゲル上で電気泳動分離を行った。〜5889bp産物を単離し、プラスミドpVR113(実施例10A,図22)をSphIで消化して得られた〜1450bp断片と連結して、〜7339bpプラスミド(pCM31図23)を作成した。プラスミドpCM31は、ポリ−his末尾を伴うKmPDC1プロモーター及びScCYC1ターミネーターの制御下にあるPXYLA遺伝子及びScUra3発現カセットを有する。別個に、5μgのプラスミドpCM29(実施例8A,図21)をSphIで消化し、1.0%アガロースゲル上で電気泳動により分離した。〜5892bp産物を単離し、プラスミドpVR113をSphIで消化して得た1450bp断片と連結し、〜7342bpプラスミド(pVR118,図24)を作成した。プラスミドpVR118は、プラスミドpCM31と類似しているが、ポリ−his末端の発現を妨げる終結コードンを有している。
標準的電気穿孔法を用い、単一コロニーのK.marxianusCD806株(実施例6B)をプラスミドpCM31で形質転換した。形質転換体をYPD培地で回復させ、4時間後Sc−Uraプレート上に蒔種した。2個の形質転換体をPCR増幅し、再構成したPXYLA遺伝子(コード化したポリ−his標識を伴う)、及び過剰発現したScXKS1遺伝子を有することが証明され、またKmXYL1及びKmXYL2遺伝子の欠失が確認された。これら形質転換体の1つはCD929株と命名された。
標準的電気穿孔法を用い、K.marxianusCD806株をプラスミドpVR118により形質転換した。形質転換体は、PCRにより、再構成したPXYLA遺伝子(コード化したポリ−his標識を伴わず)、及び過剰発現したScXKS1遺伝子を有することが証明され、またKmXYL1及びKmXYL2遺伝子の欠失が確認され、CD931株と名付けられた。
CD931株のゲノムウオーキングにより、CD861(実施例8B)株に対して記載されたと同じ方法で、PXYLA遺伝子が2重に組み込まれていることが証明された。
CD929及びCD931(実施例11B)の単一コロニーを別々に、250mLバッフル付き振盪フラスコに入れた、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、70g/Lグルコース、300μg/mLG418+150μg/mlヒグロマイシンを含む100mLの培地に蒔種した。培養は一晩35℃、250rpmでインキュベートして行った。細胞は45mL産生培地(10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、50g/Lキシロース、100mM Tes−NaOH,10mM MgCl2,pH7.0)を入れた50mL Falconチューブに、0.2ODまで接種した。チューブは37℃、250rpmに置かれ、ランダム間隔でサンプリングされ、HPLCで分析された。CD929株は1.7g/L EtOHを産生し、1.1g/Lキシルロースを蓄積した。CD931株は15.2g/L EtOHを産生し、4.5g/Lキシルロースを蓄積した。両CD株の産生力を比較すると、キシロースイソメラーゼ遺伝子が、ポリ−his末尾を持たないとEtOH産生量はおよそ9倍になることを示す。同様に、ポリ−his末尾を欠くと、キシルルロース産生は4倍増加する。
982bpの5’隣接領域及び200bpの3’隣接領域と共にKmXYL2遺伝子が、配列番号116及び117と表わされるプライマーを用いて、野生型K.marxianus株のゲノムDNAから増幅された。これらのプライマーはSacII制限酵素部位を導入する。でき上がったPCR産物をSacIIで消化し、同様に消化した、エビアルカリリン酸−処理プラスミドpVR113(実施例10A,図22)と連結した。でき上がったプラスミドをpCM52(図25)と呼称する。配列番号118及び119で表わすプライマーを用いて、pCM52をスクリーニングした。増幅されたKmXYL2遺伝子は配列決定され、2つのエラー、1つはサイレントであり、他方はアミノ酸変化85V→Iを有していた。
プラスミドpCM52をPvuIIで消化し、標準的電気穿孔法を用いて、CD861(実施例8B)に形質導入した。形質転換体をSc−Uraプレートに蒔種し、37℃でインキュベートした。配列番号104及び105で表わすプライマーを用いて、KmXYL2遺伝子の解読領域を増幅し、配列番号120及び121で表わすプライマーを用いて、ScUra3遺伝子からなる領域から、5’隣接領域を通って、KmXYL2遺伝子の解読領域まで増幅した。両バンドが陽性で、KmXDH活性(XDH+形質転換体)を示す5つの形質転換体を振盪フラスコ解析用に取り出した。
XDH+形質転換体のKmXDH活性は、遺伝子に導入された2個のエラーは活性を破壊しないことを示した。5個のXDH+形質転換体の各々からの単一コロニーは、これらのコロニーをYPXプレート上の2回の増殖で得た。各コロニーをYPX培地(pH6.5)に接種し、35℃で,一晩インキュベートした。各々2gcdwを遠心で集菌し、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、50g/Lキシロース、10mg MgCl2及び7.5g/L CaCO3を含む50mlの培地に再懸濁した。フラスコは35℃,70rpm振盪で産生期に入った。CD861株(実施例8B)も同様に培養し、KmXYL2再組み込みの影響を調べた。
プラスミドpCM28を、別々にNaeIとPvuIIにより線型化し、標準的電気穿孔法によりCD861株に形質導入した。細胞をYPD培地で3時間回復後、Sc−Uraドロップアウト培地に蒔種した。32コロニーを2枚づつのプレート上に再蒔種した。
これらに対し、配列番号122及び123で表わすプライマーを用いたPCRスクリーニングを行い、ScXKS1遺伝子の解読領域を増幅した。バンドを示さなかった(ScXKS1遺伝子の欠除を意味する)6個のコロニーをYPD培地に一晩接種しScUra3遺伝子をループアウト(消失)させ、ループアウトが実際起こった細胞を選択するために、FOAプレートに蒔種した。発育したコロニーをYPD上に再蒔種し、単一の分離したコロニーを選択した。上記プライマーを用いて、各形質転換体から単一コロニーをスクリーニングし、PXYLA,KmXYL1及びKmXYL2遺伝子があるかどうか調べた。更に別なPCRスクリーニングを行い、ScXKS1カセットがプラスミドpCM28からのPXYLAカセットに置き換えられるという、二重交叉事象をスクリーニングした。分離した6コロニー全て、PXLA遺伝子陽性であり、KmXYL1,KmXYL2及びScXKS1遺伝子ネガティブであった。これらの一つをCD1065と名付け、振盪フラスコ検定に回した。
産生期を追って、CD861及びCD1065株からの細胞を取りだし、YPXプレートに蒔種し、嫌気的ジャーの中に置いた。両者とも同程度増殖した。
配列番号124及び125で表わすプライマーを用い、KmXYL1遺伝子を890bpの5’隣接領域及び414bpの3’隣接領域と共に野生型K.marxianus株のゲノムDNAから増幅した。これらのプライマーは、SacII制限部位を導入した。得られたPCR産物をSacIIで消化し、同様に消化した、エビアルカリリン酸―処理したプラスミドpVR113(実施例10A,図22)と連結した。得られたプラスミドを、pCM55(図26)と名付けた。配列番号118及び126で表わすプライマーを用いて、プラスミドpCM55をスクリーニングし、BstI及びSbfIを用いた制限酵素マッピングにより方向性を確認した。増幅したKmXYL1遺伝子を配列決定し、3カ所のエラー、一カ所はサイレントであり、他の箇所は71V→A,112Y→H及び302I→Vのアミノ酸変化を起こしていた。
これら5個のXR+形質転換体のエタノール収量は、18−33%で、CD861株の場合は51%であった。
産生開始時、及び産生開始67時間後、細胞を取りだし、溶菌し新タンパク質定量試薬(Cytoskeleton−USA)を用いてタンパク質定量を行った。100μLの細胞抽出希釈液を、37℃に保った、100mMリン酸ナトリウム、0.5MD−キシロース及び0.2mM NADPHを含む900μLの溶液に加えた。吸光度を追いかけKmXYL1活性を測定した。5個のXR+株は34−86mU/mgの範囲のXR活性を有している。これら5個のXR+形質転換体のKmXYL1活性から、遺伝子に導入されたエラーは活性を破壊しないことを示している。CD861株のKmXYL1活性は、約4mU/mgである。
これらの結果から、固有のXR活性は、これらの株が、上記の条件で、キシロースを発酵によりエタノールに変換する上で様々な影響を有することが分かる。
プラスミドpCM52(実施例12A,図25)で記載した方法と、KmXYL2遺伝子隣接領域が逆方向であること以外、同じ方法で、あるプラスミドを構築する。このプラスミドをpCM53と名付ける。プラスミドpCM53のKmXYL2遺伝子を配列決定し、4個のエラーがあることが分かった、即ち、3個はサイレントであり、他のエラーは260I→Vアミノ酸突然変異であった。
増幅したKmXYL1遺伝子を配列決定し、2個のエラーを見いだした、即ち1個はサイレントであり、他方は71V→Aへのアミノ酸変化であった。
Candida sonorensis(ATCC寄託番号32109)のゲノムDNAをWO03/049525に記載したように得た。WO03/049525に記載したCandida sonorensisラムダライブラリーの一部を、Pichia stipitisXYL2遺伝子(Kotter他、Curr.Genet,18:493−500)をプローブとしてスクリーニングを行った。XYL2遺伝子はRandomPrimedLabelingKit(BoehringerMannheim)を用い、32PdCTPで標識した。ハイブリダイゼーションは一晩、55℃,6XSSC,5XDehardt’s,0.5%SDS,100μg/mL変性サケ***DNAの溶液中で行った。ハイブリダイゼーション後フィルターは室温、5分、2XSSC溶液で洗浄し、繰り返し、その後55℃30分、2XSSC−0.1%SDS中で洗浄した。この結果ハイブリダイゼーションしたクローンはC.sonorensisキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子(CsXDH)を有していることが分かった。
プラスミドpMI281は、プラスミドpMI278(WO03/049525の図14に記載)をXbaIで切断し、得られた4976bp断片を環状化して得た。上記からの642bp断片を、プラスミドpMI281をSacI及びSalIで消化して得た4965bp断片に連結した。得られたプラスミドをpMI409(図28)と名付けた。
CsXDH遺伝子の3´領域を、配列番号137及び138で表わすプライマー、及び同じラムダライブラリークローンを鋳型として用いてPCR増幅した。PCR産物をNotI及びApaIで切断した。457bp断片をゲルから単離し、NotI及びApaIで消化したプラスミドpMI409から得た5551bp断片と連結した。得られたプラスミドをpMI410(図29)と名付けた。
キシロースリダクターゼ相同塩基配列を、配列番号139及び140で表わすオリゴヌクレオチド及びC.sonorensisのゲノムDNAを鋳型として、PCR増幅した。オリゴヌクレオチドは既知の菌類キシロースリダクターゼ及びアルドースリダクターゼに見いだされた保存配列をもとに設計した。700bpのPCR産物を標識し、ゲノムCsXRラムダクローンを、WO/03049525の記載したものに類似したゲノムライブラリーより単離する為のプローブとして用いた。
PXYLA遺伝子を、ATGより単一のAgeI部位まで、配列番号145及び146で表わすプライマー及びpCM29(実施例8A,図21)を鋳型として、PCR増幅した。PCR産物をAgeI及びKpnIで切断し、453bp断片をゲルで単離した。プラスミドpCM29をAgeIで切断した。8151bp断片をゲルにより単離し、KpnIで部分消化した。得られた6501bp断片をゲルにより単離し、453bpPCR断片と連結した。プラスミドをpMI400と名付けた。
PXYLA遺伝子は、C.sonorensisPGKプロモーター及びScGAL10ターミネーターの制御下にある。
ScXKS1遺伝子5’領域を、ATGより単一のBglII部位まで、配列番号147及び148で表わすプライマー及びpVR103(実施例5C,図18)を鋳型として、PCR増幅した。PCR産物を、NotI及びBglIIで切断し、267bp断片をゲルから単離した。プラスミドpVR103(実施例5C,図18)をNotI及びBglIIで切断した。4633bp断片を得て、267bpPCR断片と連結した。このプラスミドをpMI406と名付けた。プラスミドpMI403(実施例13C,図32)をEcoNIで切断し、Klenow酵素により相補末端を埋め、SalIで切断した。6505bp断片をゲルから単離した。プラスミドpMI271(WO03/049525の図7に記載)をBamHIで切断し、Klenow酵素を用いて相補末端を埋め、SalIで切断した。得られた1666bp断片をゲルで単離し、6505bp断片と連結した。得られたプラスミドをpMI423と名付けた。
WO03/049525に記載した方法に類似した化学的手法により、プラスミドpMI417(実施例13C,図33)、及びpMI425(実施例13D,図34)を用いて、C.sonorensisコロニーを形質転換した。形質転換細胞は、YPD+200μg/mlG418,又はYPD+200μg/mlヒグロマイシン及び
200μg/mlG418を含むプレート上に、蒔種した。PXYLA及びScXKS1プローブを用いたPCR解析の結果、各株について次の結果が得られた:
Cs/T−1株:1コピーのPXYLA及び1コピーのScXKS1,
Cs/T−25株:1コピーのPXYLA及び2コピーのScXKS1,
−p55−
Cs/T−51株:2コピーのPXYLA及び1コピーのScXKS1,
Cs/T−34株:2コピーのPXYLA及び2コピーのScXKS1。
プラスミドpMI417をSacI及びApaIで消化し、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、C.sonorensisコロニーを形質転換した。形質転換細胞を、YPD+200μg/mlG418上に蒔種した。PCR解析により、PXYLA遺伝子を有し、CsXRを欠失したコロニーを同定した。Southern解析により、Cs/417−206株は、単一コピーのPXYLA遺伝子を有するのに対し、Cs/417−214と表す株は、CsXR欠失に加えて、2コピーのPXYLA遺伝子を有する。Cs/417−201株は、2コピーのPXYLA遺伝子を有するがCsXR欠失はない。Cs/417−208株は、単一コピーのPXYLA遺伝子を有し、CsXR欠失はない。
プラスミドpMI425をPmeI及びPspOMIで消化し、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、Cs417−214株を形質転換した。形質転換細胞を、YPD+200μg/mLヒグロマイシン、又はYPD+200μg/mLヒグロマイシン+200μg/mLG418を含むプレート上に蒔種した。PCR及びSouthern解析により、ScXKS1遺伝子を有するコロニーを同定し、CsXDH遺伝子の欠失が生じているかどうか確認した。ある株は2コピーの再構成したPXYLA遺伝子と、1コピーのScXKS1遺伝子を有し、CsXR遺伝子を欠失していた、またCsXDH遺伝子を欠失している株をCs417−214/425Aと名付けた。ある株は2コピーの再構成したPXYLA遺伝子と、1コピーのScXKS1遺伝子を有し、CsXR遺伝子を欠失していた、しかしながらCsXDH遺伝子を欠失しおらず、Cs417−214/425Bと名付けた。
プラスミドpMI403を用いて、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、そこで246−27株と名付けた株に相当する、C.sonorensis突然変異株を形質転換した。
246−27株は機能的で、外因性の乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)遺伝子を有する。形質転換細胞はYPD+200μg/mlG418を含むプレート上に蒔種した。70mU/mgXI活性を有する株をC29/403−7と名付けた。この株はCsPGKプロモーター及びScGAL10ターミネーター制御下にあるPXYLA遺伝子を、見かけ上複数コピー有している。さらに、C29/403−7株は機能的乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。
プラスミドpMI425をSalI及びNotIで消化し、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、C29/403−7(実施例13H)を形質転換するために用いた。形質転換細胞を、YPD+200μg/mLヒグロマイシン又はYPD+200μg/mLヒグロマイシン+200μg/mLG418を含むプレート上に蒔種した。PCR及びSouthern解析により、PXYLA及びScSKS1遺伝子を有する形質転換体を同定し、集合的にC29/403−7/425と名付けた。
C29/403−7/425株は、機能的な乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を有する。
プラスミドpMI417(実施例13C,図33)をSacI及びApaIで消化し、これを用いて、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、そこで246−27株と名付けた株に相当する、C.sonorensis突然変異株を形質転換した。形質転換細胞を、YPD+200μg/mLG418を含むプレートに蒔種した。PCR解析により、PXYLA遺伝子を有し、CsXR欠失のあるコロニーを同定した。Southern解析により、C29/417−4と名付けた突然変異株は、1コピーのPXYLA遺伝子を有し、C29/417−9と名付けた突然変異株は2コピーのPXYLA遺伝子を有し、更に、CsXRを欠失していた。
プラスミドpMI425をPmeI及びApaIで消化し、これを用いて、WO03/049525に記載した方法と類似した化学的手法により、C29/417−9株(実施例13J)を形質転換した。形質転換細胞をYPD+200μg/mLヒグロマイシンを含むプレートに蒔種した。
PCR解析により、ScXKS1遺伝子を有し、CsXDHを欠失しているコロニーを同定した。CsXDHを欠失した、及び欠失しない形質転換体を、夫々C29/417−9/425−11、及びC29/417−9/425−9と名付ける。
次の表に振盪フラスコによる特徴付けに選んだ株を要約し、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ活性を報告する。
これらの試料のキシルロキナーゼ及びキシロースイソメラーゼ活性を、以下のように測定した:
試料(5−10mL)を遠心し、1度100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄した。洗浄後、試料をプロテアーゼ阻害剤(Complete Mini, EDTAなし、Roche)を含む、Y−PER酵母タンパク質抽出試薬(Pierce,Rockford,IL)に懸濁した。室温で20分インキュベーション後、細胞を4oC,10分間,13,000rpmで遠心した。上清試料を活性測定のために集めた。
タンパク質濃度はLowry法(Lowry,O.H.、Rosebrough,N.J.,Farr,A.L.及びRandall,R.J.(1951),フォリンフェノール試薬を用いたタンパク質測定、J.Biol.Chem.193:265−275)により決められた。牛血清アルブミン(Sigma)をタンパク質標準として用いた。
YPDプレートで生育した細胞を、250mLフラスコ中に入れた50mLのYP(10g/L酵母抽出物及び20g/Lペプトン)+5%グルコース+10mM MgCl2に接種し、一晩、30℃,250rpm振盪によりインキュベートした。XI,XK及びタンパク質検定のために5mL部分量取り出した。OD600を測定し、OD600=12相当量(4g/L細胞乾燥量に相当)(Cs/417−214/425A及びーBに対してはOD600=40)の細胞を50mLから遠心で集め、50mLのYP+5%キシロース+10mM MgCl2に懸濁した。再懸濁した細胞を1.2gCaCO3が入っている250mLフラスコに移した。培養物を30℃,100rpmでインキュベートした。HPLC(キシロース消費、及びエタノール、キシリトール、酢酸塩及びキシルロース産生の測定用)及びOD600測定の為の試料を毎日集めた。発酵はおよそ11日間続けられた。
このことは、これら微好気的条件では、過剰発現したXKをもたないXI+株に、キシルロースが蓄積されること、及び蓄積したキシルロース量は、XI活性レベルに依存することを示唆する。
YPDプレート上に増殖した細胞を、250mlフラスコに入れた、50mLのYP+5%グルコース+10mM MgCl2に接種し、一晩、30℃,250rpm下でインキュベートした。5mL部分量を取りだし、XI,XK及びタンパク質検定に用いた。OD600を測定し、50mLよりOD600=12(4g/L細胞乾燥量に相当)(Cs/417−214/425A及びーBに対してはOD600=40)相当量を遠心で集め、50mLのYP+5%キシロース+10mM MgCl2+24g/L CaCO3に懸濁した。培養物を水ロックでシールした100mL振盪フラスコに入れ、30C,100rpm振盪でインキュベートした。培養物から試料を取り出した。定期的にHPLC(キシロース消費、及びエタノール、キシリトール、酢酸塩及びキシルロース産生の測定用)及びOD600測定のための試料を集めた。培養を15日間続けた。
これら3種の株の各々について、乳酸塩産生についてもモニターしたこと以外は、実施例14Aに記載した一般的条件で、微好気的振盪フラスコによる培養を行った。
この微好気的条件において、246−27株及びC29/403−7株は、キシロースをおよそ0.5g/L/hrの速度で消費し、乳酸をおよそ0.4g/L/hrの速度で産生した。C29/403−7/425株は、この条件下で、C29/403−7株より、およそ10−15%多い乳酸、10−15%少ないキシリトールを産生した。C29/403−7株は、他の株よりも多いキシルロースを産生したので、このことはこの株ではキシロースイソメラーゼ活性があるために、キシルロースが蓄積したことを示唆する。
培養の最後に、各フラスコからの細胞は、YP+キシロース及び、YP+グルコースを含むプレートに蒔種し、9日間、嫌気的ジャーの中でインキュベートした。どの株も嫌気的には増殖しなかったが、全ての株はキシロース;グルコース培地で、好気的に増殖した。
これら3種の株の各々について、乳酸塩産生についてもモニターしたこと以外は、実施例14Bに記載した一般的条件で、嫌気的振盪フラスコによる培養を行った。
全て、キシロースをおよそ0.1g/L/hrの速度で消費した。246−27,C29/403−7,C29/403−7/425及びC29/417−9株は141時間後、夫々、乳酸を4.1,4.8,6.4及び3.0g/L、キシリトールを0.3,0.45,0.3及び0.3g/L及びキシルロースを0.3,1.45,0.9及び0.85g/L産生した。これらの条件下で、キシルロキナーゼ酵素の過剰発現は乳酸産生の改良をもたらした。キシロ−スイソメラーゼを過剰発現するが、キシルロキナーゼを過剰発現しない株は、キシルロースを蓄積し、キシロースイソメラーゼ遺伝子が活性であることを示す。
これら3種の株の各々について、実施例14Cに記載した一般的条件で、微好気的振盪フラスコによる培養を行った。培養は7日間連続した。
この微好気的条件下で、246−27株は、キシロースを、他の株より速く消費した。C29/417−4、−9、C20/417−425−9及び−11株は、およそ2−5g/L乳酸を7日後に産生し、その後25−35g/Lの残余のキシロースが残った。
C29/417−9/425−11株に乳酸産生能があることは、キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼ経路がこれらの株の中で働いていることを確かにした。C29/417−9−425−11株はキシロースを、C29/417−9/425−9株より僅かに速くキシロースを消費したばかりでなく、1−2g/Lキシリトールを蓄積した。
これら3種の株の各々について、実施例14Dに記載した一般的条件で、嫌気的振盪フラスコによる培養を行った。
C29/417−9,C29/417−9、1425−9、及びC29/417−9/425−11株は146時間後乳酸を4.4,6.2,24.4g/L産生した。キシロースに対する乳酸の収率は、これらの株に対し夫々、0.40,0.70,及び0.95g/gであった。C29/417−9/425−9又は11どちらの株についても、キシリトールの産生はなかったが、C29/417−9株は、2.7g/Lキシリトールを産生した。この条件下で、キシルロキナーゼ酵素の過剰発現は、改良された乳酸産生をもたらす。このことは、これらの株において、外因性キシロースイソメラーゼ及びキシルロキナーゼの過剰発現と結びついた、固有のキシロースリダクターゼ/キシリトールデヒドロゲナーゼ経路の破壊により、良好な乳酸産生が行われたことを示す。CsXR及びCsXDH遺伝子の両者の破壊により、嫌気的条件下では、最良の産生が行われた。
Cyllamyces aberensisDNA(牛から単離ffew1、U.K.)をGareth Wyn Griffith, Institute of Biological Sciences, University of Wales, Aberystwyth,CeredigionSY23 3DA, Great Britain.から得た。このDNAを鋳型とし、配列番号149で表わす、0.5μMセンスプライマー及び配列番号150で表わす、0.5μMアンチセンスプライマー、Phusion HF緩衝液、及び各々0.2mMのdNTPを用いて、PCR反応を行った。この構築において、遺伝子の5’末端配列に検出された、コード化された第1番目のメチオニンを開始メチオニンとし、フレームの一致した停止コードンを、SbfI制限酵素部位に加えて配置した。3分間の変性前に、2UのPhusionポリメラーゼ(Finnzymes Oy,Espoo,Finland)を加えた。反応は以下の35サイクルで行った:98℃10秒、45℃30秒及び、72℃1分で、サイクル後最後の伸長反応は72℃8分であった。1346bpのPCR産物を得て、TOPO TAクローニングキット(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用い、TOPOプラスミドと連結し、その後配列決定を行った。
K.marxianusゲノムDNAは、野生型K.marxianus株から以前記載したと同様の方法で得た。K.marxianus Ura3(KmURA3)遺伝子、約750bpのUra3プロモーター領域、及び約250bpのUra3ターミネーター領域を、Failsafe polymerase(Epicenter),鋳型としてのゲノムDNA及び配列番号153及び154で表わすプライマーを用いた標準的なプロトコールで単離した。PCR条件は、95℃5分、15サイクルの95℃30秒、55℃30秒、68℃2分、その後25サイクルの95℃30秒、68℃2.5分、最後に平滑末端生成サイクルとして68℃8分であった。得られた〜1.8kbPCR産物を、pCR−XL−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化し、証明のための配列決定を行った。得られたプラスミドを、pSO90と名付けた。クローン化したKmUra3遺伝子の塩基配列は、配列番号155に表わされる。プラスミドpSO90をSphIで消化し、〜1.8kbpKmURA3領域をゲルから単離し、同様に消化し、エビアルカリホスファターゼ処理した、プラスミドpCM9(実施例1I,図9)の〜4570bp断片と連結した。得られたプラスミド(pSO91,図35)は、KmURA3選択遺伝子、KmPDC1プロモーター、SbfI部位及びScCYC1ターミネーターを有する。
CD1103は、CaXYLA遺伝子、原型のKmURA3遺伝子、及び破壊したKmURA3遺伝子を有する。CD1106は、CaXYLA遺伝子及び破壊したKmURA3遺伝子を有する。
CD1103及びCD1106株を各々別に、100mL培地(20g/L酵母抽出物、10g/Lペプトン、100g/Lグルコース)を入れたバッフル付き振盪フラスコに接種し、35℃,250rpmで、一晩インキュベートした。〜14時間後細胞を集菌し、各株4g/L細胞乾燥重量を別の45mL酵母ペプトン、50g/L D−キシロース、7.5g/L CaCO3及び10mM MgCl2を含む50mlFalconねじ蓋付きチューブに別々に加えた。チューブを嫌気的に、65時間、30℃で,70rpm振盪培養行った。1103株は、9g/L以上のエタノールを産生し、1106株は、同時間に7g/L以上のエタノールを産生した。XI活性は生育期の細胞を取りだし、溶菌し、決定した。測定したXI活性は、1103及び1106株各々について、およそ83mU/mgであった。
Bacteroides thetaiotaomicronゲノムDNAをWashington University(St.Louis,MO)分子生物及び薬学教室より得た。BtXYLA遺伝子は、ゲノムDNAを鋳型とし、Pfxポリメラーゼ(Stratagene),及び配列番号160及び161で表わすプライマーを用い、標準的プロトコールで単離した。PCR条件は、95℃3分;15サイクルの95℃30秒、60℃30秒、68℃2分、その後20サイクルの95℃30秒、68℃2.5分、最終的に平滑端末生成サイクルとして68℃8分で終わった。得られた〜1.4kbPCR産物を、pCR−XL−TOPOベクター(Invitrogen)にクローン化し、証明のために配列決定した。得られたプラスミドを、pSO89(図37)と名付けた。クローン化したBtXYLA遺伝子の塩基配列及び予想アミノ酸配列は、夫々、配列番号162及び163に表わす。
pSO89プラスミドをSbfI消化し、〜1.4kbBtXYLA遺伝子をゲルより抽出し、同様に消化したプラスミドpSO91(実施例16A,図35)の6376bp断片と連結した。得られたプラスミド(pSO96,図38)はKmURA3選択遺伝子、KmPDC1プロモーター及びScCYC1ターミネーター制御下のBtXYLA遺伝子を有する。
CD806(実施例6B)に対応するK.marxianusコロニーを培養した。20mLの細胞を遠沈し、標準的電気穿孔法を用いて、プラスミドpSO96により形質転換した。プラスミドpSO96を、組み込み前に、AatII及びBsmBIで消化した。100μLの細胞をSc−Uraプレート上に蒔種し、コロニーができるまで37℃で増殖させた。コロニーを2回目のSc−Uraプレートに蒔種した。形質転換体について、配列番号156及び157で表わすプライマーを用いて、原型のKmURA3遺伝子が在るかPCRスクリーニングを行った。配列番号164及び165で表わすプライマーを用いて、BtXYLA停止コードン上流、及びScCYC1ターミネーターの直接内側の〜450bp領域が存在するかどうか、PCRスクリーニングを行った。固有のKmURA3及びBtXYLA遺伝子について陽性の形質転換体について、8個を選択し、夫々CD1089−1096と命名した。
単一コロニーのCD806及びCD1089−1096株を、別々に10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、及び100g/Lデキストロースを含む100mLの培地に接種した。細胞を30℃14時間増殖させ、その後細胞を集菌し、細胞乾燥重量を測定した。1.4g/L細胞乾燥重量を、各培養液から別々に、10g/L酵母抽出物、20g/Lペプトン、50g/L D−キシロース、7.5g/L CaCO3及び10mM MgCl2を含む50mLFalconチューブに加えた。これらの培養物を30℃,70rpmの振盪でインキュベートした。培地中の試料をおよそ24時間ごとに、HPLC分析のために、取りだした。72時間後、この嫌気的発酵による結果は以下の表のようになった。
低酸素キシロース培養の終わりに、CD1089−1096株を、YPXプレートに蒔種し、2日間嫌気的チャンバーの中に置いた。CD1095を除いて、全ての株はこの条件下で嫌気的増殖を示し、CD1089及びCD1092株は、最大の嫌気的増殖を示した。
CD804,CD805及びCD806株を別々に、50μg/mlG418を補強した50mLのYPDを入れた250mlバッフル付き振盪フラスコに、YPD寒天プレートより、OD600が0.1位になるまで接種し、16時間、33℃,250rpmの条件で生育させた。少量のグルコースが各フラスコ残っていること、及び細胞が結果的に対数増殖期に入ったことを判断した後、各株から0.5g/L細胞乾燥重量相当量を遠心により集菌し、別々に、50g/L D−キシロースを補強した47.5mLYPが入っている250mLバッフル付き振盪フラスコに再懸濁した。2.5mLグルコースイソメラーゼ(GensweetSGI;Genencor Inc.,CA)(キシロースイソメラーゼとしても知られている)を振盪フラスコに加え、培養を33℃,70rpmで行った。対照として、各CD804,805及び806株から0.5g/L細胞乾燥重量相当を別々に、グルコースイソメラーゼは除き、50g/L D−キシロースを補強した50mL YPを入れた250mLバッフル付き振盪フラスコに再懸濁した。これらの振盪フラスコを33℃,70rpmでインキュベートした。試料を様々な時間間隔で取りだし、細胞をフィルターで除いた。培養上清を、キシロース、キシリトール及びエタノールについてHPLC法により分析した。
KmPDC1プロモーター、PXYLA遺伝子及びScCYC1ターミネーターを含むカセットを、配列番号166及び167で表わすプライマーを用いて、プラスミドpCM29(実施例8A,図21)を鋳型とし、PCR増幅した。これらのプライマーはPacI及びMluI制限部位を取り込むように設計された。熱サイクル条件は、9最初に4℃2分のインキュベーション後、30サイクルの94℃30秒、50℃30秒、及び70℃3分であった。その後、最後のインキュベーションは70℃8分であった。
産物は上記制限酵素で消化し、得られた2,804kbp断片を、同様に消化したプラスミドpSO57(図39)(pKD1自己複製部位を有する)と連結し、プラスミドpCM48(図40)を得た。形質転換体を、EcoRI及びSbfIを用いて制限酵素マッピングを行い、夫々を配列決定した。全PXYLA解読領域は配列決定され、形質転換体と、プラスミドpCM29の間で、同一であることを証明した。
10mLの一晩の培養物を遠心で集菌し、酵素活性のために使った。4個の形質転換体のキシロースイソメラーゼ活性は456から531mU/mgの範囲であった。
Claims (6)
- ゲノム及び機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であって、該遺伝子組換え酵母細胞が、Kluyveromyces又はCandida属であり、該外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子は該酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結し、更に、キシロースからキシリトールへの変換を触媒する酵素を産生する固有の機能的キシロースリダクターゼ遺伝子が欠失又は破壊され、固有のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が欠失又は破壊され、前記酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結した機能的外因性キシルロキナーゼ(xylulokinase)遺伝子を有することを特徴とする遺伝子組換え酵母細胞。
- 機能的固有のキシリトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失又は破壊された請求項1に記載の遺伝子組換え酵母細胞。
- 機能的外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をゲノムに更に組み込んだ請求項1又は2に記載の遺伝子組換え酵母細胞であって、該外因性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が該酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結していることを特徴とする遺伝子組換え酵母細胞。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞をペントース糖を含む発酵培地で発酵条件下で培養することから成る発酵方法。
- ゲノムに組み込んだ機能的外因性キシロースイソメラーゼ遺伝子を有する遺伝子組換え酵母細胞であって、該遺伝子組換え酵母細胞が、Kluyveromyces又はCandida属であり、少なくとも100mU/mgのキシルロキナーゼ活性を有し、キシリトールデヒドロゲナーゼ活性を2mU/mg以下に減少させ、キシロースリダクターゼ活性を10mU/mg以下に減少させた遺伝子組換え酵母細胞。
- 前記酵母細胞内で機能的なプロモーター及びターミネーター配列と作動可能に連結した機能的外因性キシルロキナーゼ(xylulokinase)遺伝子を有する請求項5に記載の遺伝子組換え酵母細胞。
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