BRPI0607026B1 - Processos para redução do teor de proteína e preservação do teor de polissacarídeo capsular em um caldo de lisado celular de streptococcus pneumoniae complexo antes da purificação - Google Patents
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Abstract
separação de contaminantes de polissacarídeo de streptococcus pneumoniae através de manipulação de ph. a presente invenção refere-se a um processo para redução do teor de proteína e preservação do teor polissacarideo capsular em um caldo de lisato streptococcus pneumoniae celular complexo antes de purificação. utilização de redução de ph após lise celular resultou em um polissacarideo purificado que vai de encontro consistentemente á especificação para proteína e maiores rendimentos de recuperação do polissacarídeo durante o processo de purificação.
Description
[0001] A presente invenção refere-se a métodos para remoção deproteína solúvel em excesso de lisados celulares de sorotipos de Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) usados na produção de polissacarídeos pneumocócicos.
[0002] O polissacarídeo capsular para cada sorotipo de S.pneumoniae utilizado para produtos de vacina é produzido através de crescimento do organismo em um meio líquido complexo. A população do organismo é, frequentemente, trocado de um frasco de cultura para garrafas de cultura e passada através de um ou mais fermentadores de cultura para aumento de volume até que os volumes de fermentação de produção em escala sejam atingidos. O final do ciclo de crescimento pode ser determinado por um de vários meios, ao ponto no qual as células são submetidas à lise através da adição de um detergente o qual auxilia na decomposição da parede celular e libera a autolisina, a qual causa lise celular quando as células atingem a fase estacionária. O caldo de lisado é, então, coletado para processamento a jusante (purificação). Essa purificação inclui várias etapas de cromatografia em coluna e diafiltração para recuperar o polissacarídeo capsular que circunda as células bacterianas. O polissacarídeo, quando conjugado com uma proteína de elevado peso molecular, tal como CRM197, e formulado em uma vacina contendo conjugados de múltiplos sorotipos, ajuda a conferir imunidade (ao S. pneumoniae) quando injetado na população alvo tal como, por exemplo, bebês e crianças jovens.
[0003] Especificações foram apresentadas para o teor de proteína no polissacarídeo purificado de cada sorotipo para reduzir o risco de eventos adversos da vacina. Por exemplo, na vacina de conjugado pneumocócico 7-valente (7vPnC) atualmente comercializada (Prevnar®), a especificação para o teor de proteína no polissacarídeo do sorotipo 4 purificado é de não mais do que 3% e para o polissacarídeo do sorotipo 6B purificado é de não mais do que 2%, em uma base em peso seco.
[0004] Em alguns casos, foi provado ser difícil remover a proteínaresidual que ainda está presente após todo o processo de purificação. Esforços feitos para se dirigir a essa questão através de alterações no processamento por purificação do lisado de células têm obtido sucesso apenas moderado.
[0005] Portanto, foi decidido atacar essa questão no lado amontante do processo. As proteínas contaminantes chave foram determinadas como sendo críticas para crescimento e integridade celular. Portanto, as opções restantes disponíveis para reduzir a proteína total consistiam em alteração das condições de crescimento e/ou coleta.
[0006] O processo de fermentação é razoavelmente objetivo. Ascélulas (cultura) são expandidas em garrafas de meios baseados em soja, então, passadas através de um ou dois fermentadores de cultura e, finalmente, passadas para um fermentador de produção em escala. Em cada etapa, a temperatura e pH são intimamente monitorados, com o pH sendo controlado através da adição de um material de base (carbonato de sódio a 20%). Quando o crescimento atinge um determinado ponto, a operação é terminada através da introdução de um detergente, tal como deoxicolato de sódio (DOC), o qual inicia um processo de lise celular. Após um período de manutenção, o pH do caldo de lisado é ajustado para 6,6 para precipitar os complexos de deoxicolato e membrana celular. Esse material é mantido até o processamento através de centrifugação e filtração poder ser realizado para remover os sólidos.
[0007] Muito da proteína, contudo, permanece solubilizada nolisado clarificado, fazendo com que o teor de proteína no polissacarídeo purificado exceda a especificação. Assim, existe uma necessidade de reduzir os níveis de proteína solúvel em vários sorotipos pneumocócicos durante o processo de fermentação ou purificação.
[0008] A presente invenção preenche essa necessidade através defornecimento de um processo para redução do teor de proteína e preservação do teor de polissacarídeo capsular em um caldo de lisado de Streptococcus pneumoniae celular complexo antes de purificação. Esse processo compreende as etapas de:(a) crescimento de um sorotipo selecionado de S. pneumoniae em um meio baseado em soja, o qual inclui:(i) inoculação de um primeiro recipiente contendo o meio baseado em soja com estoque de cultura do sorotipo selecionado e incubação do primeiro recipiente até que os requisitos de crescimento sejam reunidos e(ii) inoculação de um segundo recipiente contendo o meio baseado em soja com a cultura da etapa (i) enquanto se mantém um pH e temperatura estáveis no segundo recipiente e(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucléicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e(f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
[0009] Sorotipos de S. pneumoniae exemplificativos selecionadospara essa modalidade da invenção são 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F e 19A. Em uma modalidade particular da invenção e dependendo do sorotipo que está sendo crescido na etapa (a), o pH de fermentação na etapa (a) é mantido através de uma alimentação de base de hidróxido de sódio, carbonato de sódio ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o pH na etapa (d) é diminuído para entre 4,5 e 5,5. Em ainda outra modalidade, o detergente é deoxicolato de sódio.
[00010] A invenção também se refere a um processo para redução do teor de proteína e preservação do polissacarídeo capsular em um caldo de lisado de Streptococcus pneumoniae celular complexo antes de purificação. O processo compreende as etapas de:(a) expansão, em volumes crescentes a partir de um recipiente inicial para um recipiente de produção em escala em um meio baseado em soja, de um sorotipo de S. pneumoniae selecionado e manutenção de um pH e temperatura estáveis durante crescimento celular;(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucléicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e(f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
[00011] Sorotipos de S. pneumoniae exemplificativos selecionados para essa modalidade da invenção são 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F e 19A. Em uma modalidade particular da invenção e dependendo do sorotipo que está sendo crescido na etapa (a), o pH de fermentação na etapa (a) é mantido através de uma alimentação de base de hidróxido de sódio, carbonato de sódio ou uma combinação dos mesmos. Em outra modalidade, o pH na etapa (d) é diminuído para entre 4,5 e 5,5. Em ainda outra modalidade, o detergente é deoxicolato de sódio.
[00012] Em ainda outra modalidade, onde o sorotipo é o sorotipo 5 ou 19A, o meio baseado em soja é suplementado com bicarbonato de sódio.
[00013] A presente invenção permite a remoção de grandes quantidades de proteína contaminante em excesso do lisado celular, desse modo, deixando um produto mais claro (Caldo Isento de Células ou CFB) para purificação, o qual geralmente obterá maiores recuperações de polissacarídeo e rendimentos totais de polissacarídeo do que era possível usando o método de fermentação e recuperação anterior.
[00014] A figura 1 é um gel de SDS-PAGE mostrando a diminuição significativa na proteína solúvel em gramas por litro de lisado à medida que o pH é diminuído com ácido acético para S. pneumoniae Tipo 4. Os componentes de 39 kDa e 48 kDa são proteínas da superfície da parede celular. O rendimento de polissacarídeo também é mostrado.
[00015] A figura 2 é um gráfico dos resultados para S. pneumoniae Tipo 6B de ajuste do pH para um pH de 5, mostrando a redução de proteína, conforme determinado através de SDS-PAGE e o rendimento de polissacarídeo (Ps), conforme determinado através de HPLC-SEC com um detector de índice refrativo IR.
[00016] A figura 3 é um gráfico dos resultados para S. pneumoniaeTipo 1 de ajuste do pH para um pH de 5, mostrando a redução de proteína, conforme determinado através de SDS-PAGE e o rendimento de polissacarídeo, conforme determinado através de HPLC-SEC com um detector de IR.
[00017] A figura 4 é um gráfico dos resultados para S. pneumoniae Tipo 5 de ajuste do pH para um pH de 4,1, mostrando a redução de proteína, conforme determinado através de SDS-PAGE e o rendimento de polissacarídeo, conforme determinado através de HPLC-SEC com um detector de IR.
[00018] A figura 5 é um gráfico dos resultados para S. pneumoniae Tipo 6A de ajuste do pH para um pH de 4,5 de duas corridas diferentes de fermentação, mostrando a redução de proteína, conforme determinado através de SDS-PAGE e o rendimento de polissacarídeo (Ps), conforme determinado através de HPLC-SEC com um detector de IR.
[00019] A figura 6 é um gráfico dos resultados para S. pneumoniae Tipo 7F de ajuste do pH para um pH de 4,8, mostrando a redução de proteína, conforme determinado através de SDS-PAGE e o rendimento de polissacarídeo, conforme determinado através de HPLC-SEC com um detector de IR.
[00020] Streptococcus pneumoniae são cocos Gram-positivos em formato de lança que são usualmente observados em pares (diplococos), mas também em cadeias curtas ou como células simples. Eles crescem rapidamente sobre lâminas de ágar com sangue com colônias brilhantes e mostram alfa hemólise, a menos que cresçam anaerobicamente, onde eles mostram beta hemólise. Eles são sensíveis a sais biliares que podem decompor a parede celular com a presença da enzima própria de células, autolisina. O organismo é um anaeróbio aerotolerante e é exigente, pelo fato de que ele tem requisitos nutricionais complexos.
[00021] As células da maioria dos sorotipos pneumocócicos têm uma cápsula a qual é um revestimento de polissacarídeo que envolve cada célula. Essa cápsula é um determinante da virulência em seres humanos porque ela interfere com a fagocitose, impedindo que anticorpos ataquem as células bacterianas. Existem atualmente 90 sorotipos capsulares identificados, com 23 sorotipos responsáveis por cerca de 90% da doença invasiva. O revestimento de polissacarídeo como uma vacina pode conferir um grau razoável de imunidade (ao S. pneumoniae) em indivíduos com sistemas imunes desenvolvidos ou não deficientes, mas uma proteína conjugada com um polissacarídeo permite uma resposta imune em bebês e idosos que estão em maior risco de infecções pneumocócicas. É importante ser capaz de separar esse polissacarídeo capsular das bactérias submetidas à lise (mortas) e remover tantos restos celulares quanto possível. Conforme descrito aqui, essa remoção é realizada em uma série de alterações do processo de fermentação.
[00022] Três principais alterações que foram grandemente aperfeiçoadas no processamento a jusante são como segue: (1) alteração da alimentação de base de fermentação de carbonato de sódio para hidróxido de sódio onde possível; (2) manutenção de agitação no fermentador durante o intervalo de manutenção com deoxicolato; e (3) diminuição do pH após a manutenção do lisado em deoxicolato para menos do que 5,5.
[00023] A descoberta inicial foi de que, através de diminuição do pH para menos de 5,5, de 50-90% da proteína solúvel indesejável puderam ser removidos do lisado de células antes de processamento a jusante (purificação). Embora isso seja uma intensificação de processo muito importante, o uso de grandes volumes de carbonato de sódio para manter o pH de ponto de ajuste durante as operações de fermentação causou um grave problema de espumação quando o pH foi ajustado para 5,0 com ácido acético. Também observou-se que um pH estável era difícil de manter após ajuste em virtude das múltiplas formas de carbonato que existem em solução. Isso levou a buscar alimentações de base alternativas que não criariam um desenvolvimento de carbonato no caldo de fermentação. Hidróxido de sódio foi selecionado porque ele já foi usado para ajustar o pH do meio e garrafas de cultura antes de inoculação. Estudos com fermentações de até 100 L indicaram que essa era uma alternativa viável, com apenas uma redução mínima no crescimento, baseado na densidade óptica (OD). Essa base também resolveu o problema de espumação. Outras bases além de hidróxido de sódio podem ser usadas e bicarbonato de sódio pode ser usado como um suplemento, onde é determinado que o organismo requer alguma forma de carbonato para manter o crescimento tal como, por exemplo, com os sorotipos 5 e 19A. Se carbonato de sódio é usado como a alimentação de base primária, tal como para o sorotipo 19A, então, o ajuste de pH pós-lisado (para um pH de menos de 5,5) requer uma adição de ácido controlada lenta multi-horas para evitar espumação.
[00024] Finalmente, baseado em observação laboratorial, foi determinado que, se a manutenção em deoxicolato era processada sem agitação (conforme em um protocolo anterior), um precipitado semelhante a gel assentaria sobre as paredes do fermentador e sonda de pH. Isso criou leituras de pH in situ não confiáveis quando o pH foi ajustado. A etapa de agitação impediu a formação desse precipitado e permitiu que a integridade da sonda de pH fosse mantida.
[00025] Assim, na invenção presentemente reivindicada, os sorotipos de Streptococcus pneumoniae selecionados são expandidos, em volumes crescentes, de frascos de cultura iniciais em um meio estéril composto, por exemplo, de um produto baseado em soja digerido com enzima, cloreto de sódio, fosfato de potássio monobásico, cloreto de cálcio e um aminoácido selecionado. Dextrose com sulfato de magnésio são usados como a fonte de carbono para sustentar o crescimento no meio líquido. O meio pode também ser suplementado com outros aditivos, conforme requerido pelo sorotipo ou processo específico. A cultura começa em um primeiro recipiente, tal como garrafas de cultura, o qual, após um intervalo de crescimento em uma incubadora baseada em convecção, é usado para inocular um segundo recipiente, tal como um fermentador de cultura o qual, por sua vez, pode ser usado para inocular, se desejado, pelo menos um recipiente progressivamente maior, tal como um fermentador de produção, até que produção em escala seja atingida. Em uma modalidade, um sorotipo de S. pneumoniae selecionado é expandido, em volumes crescentes, de frascos de cultura iniciais para garrafas de cultura para um fermentador de 20 L para um fermentador de 200 L para um fermentador de produção de 2000 L. Os parâmetros de crescimento são intimamente monitorados com relação à densidade óptica, temperatura e pH de forma a determinar quando transferir a cultura para a próxima escala de fermentação e também quando terminar a operação em batelada.
[00026] Quando as bactérias entram em fase estacionária, as células no fermentador de produção são forçadas à lise através da adição de um detergente, tal como um detergente aniônico ou catiônico. Exemplos representativos de tais detergentes incluem deoxicolato de sódio, N- lauril sarcosina, ácido cenodeoxicólico sódico e saponinas. Após agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar morte celular completa, por exemplo, durante um tempo entre 8 e 24 horas e uma temperatura entre 7°C e 13°C, a segunda fase do processo é reduzir o pH do lisado celular para um pH de menos de 5,5 com uma solução ácida, tal como ácido acético a 50%. A redução real de pH varia com o sorotipo, com a finalidade de ser capaz de estar abaixo da especificação para a proteína purificada final em uma base consistente requerida para um processo de produto robusto. Em uma modalidade particular da invenção, pH é diminuído para entre 4,5 e menos de 5,5.
[00027] A etapa de redução de pH causa um "salting out" (precipitação) de proteínas anteriormente solúveis. Isso é um efeito químico bem conhecido sobre proteínas uma vez que elas atingem seus pontos isoelétricos. O que torna essa etapa única na presente invenção é que ela está sendo usada como uma etapa de purificação em um caldo de lisado celular altamente complexo. O caldo é definido como "complexo" porque ele contém componentes do meio, DNA, proteínas, polissacarídeos, RNA e outros restos celulares.
[00028] Além de ácido acético, também foi mostrado que o processo reivindicado funciona com ácido sulfúrico, ácidos fosfóricos e funcionaria com eficiências variadas após a série de Hofmeister da qual esses ácidos são uma parte. A série de Hofmeister é a classificação de vários ânions e cátions e sua capacidade de precipitar misturas de proteínas. A concentração final desses compostos (na série de Hofmeister) em solução determina a solubilidade final das várias proteínas.
[00029] Após um período de manutenção, sem agitação, que é suficiente para permitir assentamento do precipitado e, desse modo, auxiliar no processo de centrifugação contínuo tal como, por exemplo, entre 12 e 24 horas em uma temperatura entre 15°C e 25°C, uma porção significativa das proteínas anteriormente solúveis (e provavelmente alguns dos outros componentes contaminantes anteriormente solúveis) se separa da solução como um precipitado sólido com pouca perda ou degradação do produto de polissacarídeo, o qual permanece em solução.
[00030] Essa solução com o precipitado é, então, processada através de uma centrífuga contínua ou, alternativamente, através de centrifugação padrão em garrafa. O sobrenadante que contém o polissacarídeo é coletado e passado através de uma filtração de partícula e mícron antes de ser transferido para concentração e purificação a jusante.
[00031] Os resultados de uso do processo da presente invenção são representados nas figuras. A figura 1 mostra um gel de SDS-PAGE representativo da redução de proteína observada usando ácido acético para reduzir o pH de 6,8 para 5,0 sobre o caldo de lisado celular para o sorotipo 4 de S. pneumoniae. A raia mais à esquerda é um marcador de peso molecular usado como uma referência para peso de proteína. A Raia 1 de Amostra ("C") é um controle que não teve o pH ajustado. Os números mostram o valor aproximado (g/L em caldo submetido à lise) das duas principais bandas contaminantes de proteína (48kDa e 39kDa) e também a proteína total na raia toda. Também mostrado é o rendimento de polissacarídeo total contido em uma alíquota da amostra submetida à análise por HPLC-SEC. As raias 2-8 mostram a mesma informação sobre amostras com pH ajustado. As raias 9-11 são padrões de BSA usados para determinar os rendimentos de proteína através de análise por regressão linear básica. A análise de Ps não foi feita sobre a amostra com pH de 6,8. Nesse sorotipo em particular, houve alguma perda moderada de polissacarídeo (Ps), mas em uma taxa muito menor do que a perda de proteína através de redução de pH.
[00032] A figura 2 é um gráfico plotado ilustrando a redução de proteína no lisado celular de sorotipo 6B de S. pneumoniae junto com a estabilidade de rendimento de polissacarídeo quando o pH do lisado celular foi diminuído para 5,0. Nenhuma perda de polissacarídeo foi observada com esse sorotipo. Em contraste, proteína total foi reduzida em mais da metade.
[00033] A figura 3 é um gráfico plotado ilustrando a redução de proteína no lisado celular de sorotipo 1 de S. pneumoniae junto com a estabilidade de rendimento de polissacarídeo quando o pH do lisado celular foi diminuído para 5,0. Quase nenhuma alteração na concentração de polissacarídeo foi observada. Em contraste, proteína total foi reduzida em mais de 90%.
[00034] A figura 4 é um gráfico plotado ilustrando a redução de proteína no lisado celular de sorotipo 5 de S. pneumoniae junto com a estabilidade de rendimento de polissacarídeo quando o pH do lisado celular foi diminuído para 4,1. Quase nenhuma alteração na concentração de polissacarídeo foi observada até um pH muito baixo, o qual foi atribuído a um efeito de diluição em virtude da quantidade de ácido adicionada. Em contraste, proteína total foi reduzida em mais de 75% em um pH de 4,5.
[00035] A figura 5 é um gráfico plotado de duas diferentes operações de fermentação ilustrando a redução de proteína no lisado celular de sorotipo 6A de S. pneumoniae junto com a estabilidade de rendimento de polissacarídeo quando o pH do lisado celular foi diminuído para 4,5. Quase nenhuma alteração na concentração de polissacarídeo foi observada. Esse gráfico também mostra que as concentrações de polissacarídeo foram mantidas, enquanto que as concentrações de proteína foram reduzidas quando NaOH foi usado ao invés de Na2CO3.
[00036] A figura 6 é um gráfico plotado ilustrando a redução de proteína no lisado celular de sorotipo 7F de S. pneumoniae junto com a estabilidade de rendimento de polissacarídeo quando o pH do lisado celular foi diminuído para 4,8. Quase nenhuma alteração na concentração de polissacarídeo foi observada. Em contraste, proteína total foi reduzida em mais de 80% em um pH de 4,8.
[00037] A Tabela 1 abaixo é representativa de algumas das reduções de proteína e ganhos de polissacarídeo a partir dos polissacarídeo purificados finais após o processo da presente invenção ser utilizado. Tabela 1Concentração de Proteína e Rendimento de Polissacarídeo para VáriosSorotipos de S. pneumoniae*Processo de fermentação mostrou uma redução de proteína de 80% do material de lisado DOC, mas uma remoção adicional de proteína não foi tão eficiente durante o processo de purificação.
[00038] As alterações no processo de fermentação esboçadas acima serviram para reduzir grandemente o teor de proteína do caldo de lisado antes de processamento por purificação. Isso permitiu que o produto purificado fosse de encontro à especificação de proteína sem modificação significativa do processo de purificação atual pararecuperação de polissacarídeo. Um benefício inesperado dessas alterações foi um aperfeiçoamento no rendimento total depolissacarídeo, quando de purificação, de 25-100%, a despeito de um crescimento ligeiramente menor, conforme determinado através da OD. Esse é um aperfeiçoamento robusto do processo de fermentação/purificação que pode intensificar grandemente a produção de polissacarídeos pneumocócicos.
[00039] A descrição descreve em geral a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida através de referência aos exemplos específicos a seguir. Esses exemplos são descritos unicamente para fins de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção.EXEMPLOSExemplo 1Redução de Proteína no Lisado Celular de Sorotipos 1, 6A e 7F de S. pneumoniaePreparo de Bancos de Células Mestre e de Trabalho
[00040] Sorotipo 1 de S. pneumoniae foi obtido da American Type Culture Collection, ATCC, cepa 6301. Sorotipos 6A e 7F de S. pneumoniae foram obtidos do Dr. Gerald Shiftman da State University of New York. Várias gerações de estoques de cultura foram criadas de forma a expandir a cepa e remover componentes de origem animal (gerações F1, F2 e F3). Duas gerações adicionais de estoques de cultura foram produzidas. A primeira geração adicional foi feita a partir de um frasco F3 e a geração subsequente foi feita a partir de um frasco da primeira geração adicional. Frascos de cultura foram armazenados congelados (< -70°C) com glicerol sintético como um crio-conservante. Além dos frascos congelados, frascos liofilizados foram preparados para a geração F4. Para preparo do banco de células, todas as culturas foram crescidas em um meio baseado em soja. Antes de congelamento, as células foram concentradas através de centrifugação, meio consumido foi removido e as péletes de células foram ressuspensas em meio fresco contendo um crio-conservante, tal como glicerol sintético. Fermentação e Recuperação
[00041] Culturas do banco de células de trabalho foram usadas para inocular garrafas de cultura contendo um meio baseado em soja (Tabela 2). As garrafas foram incubadas a 36°C ± 2°C sem agitação até que os requisitos de crescimento fossem reunidos. Uma garrafa de cultura foi usada para inocular um fermentador de cultura contendo o meio baseado em soja. Um pH de cerca de 7 foi mantido com NaOH a 3N. Após a densidade óptica-alvo ter sido atingida, o fermentador de cultura foi usado para inocular o fermentador de produção contendo o meio baseado em soja. O pH foi mantido com NaOH a 3N. A fermentação foi terminada após cessar o crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de deoxicolato de sódio a 12% estéril foi adicionada à cultura para obter uma concentração de 0,12% - 0,13% no caldo, para submeter as células bacterianas a lise e liberar o polissacarídeo célula-associado. Após lise, os conteúdos do fermentador foram agitados durante um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7°C e 13°C, para assegurar que lise celular completa e liberação de polissacarídeo tinham ocorrido. Agitação durante esse período de manutenção impediu o sedimento de lisado de assentar nas paredes do fermentador e sonda de pH, desse modo, permitindo que a integridade da sonda de pH fosse mantida. Em seguida, o pH do caldo de cultura submetido à lise foi ajustado para um pH de aproximadamente 5,0 com ácido acético a 50%. Após um tempo de manutenção sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura entre 15°C e 25°C, uma porção significativa das proteínas anteriormente solúveis se separou da solução como um precipitado sólido com pouca perda ou degradação do polissacarídeo, o qual permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi, então, clarificada através de centrifugação em fluxo contínuo, seguido por filtração profunda e microfiltração em 0,45 μm.
[00042] Em uma escala menor, o processo descrito acima também resultou em redução significativa da proteína total para os sorotipos 4 e 6B (figuras 1 e 2), o que indica que o processo funcionará para esses dois sorotipos em uma escala maior. (Sorotipos 4 e 6B de S. pneumoniae também foram obtidos do Dr. Gerald Shiffman da State University of New York). Tabela 2Composição do Meio Baseado em SojaExemplo 2Redução de Proteína no Lisado Celular de Sorotipo 5 de S. pneumoniae
[00043] O sorotipo 5 de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da State University of New York, Brooklyn, New York. Para preparo do sistema de banco de células vide Exemplo 1.Fermentação e Recuperação
[00044] Culturas do banco de células de trabalho foram usadas para inocular garrafas de cultura contendo um meio baseado em soja (Tabela 2), meio o qual foi suplementado com uma solução estéril de NaHCO3 em uma concentração de 10 mM. As garrafas foram incubadas a 360C ± 2°C sem agitação até que os requisitos de crescimento fossem reunidos. Uma garrafa de cultura foi usada para inocular um fermentador de cultura contendo o meio baseado em soja com uma concentração de NaHCO3 de 10 mM. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com NaOH a 3N. Após a densidade óptica-alvo ter sido atingida, o fermentador de cultura foi usado para inocular o fermentador de produção contendo o meio baseado em soja com uma concentração de NaHCO3de 10 mM no meio. O pH foi mantido com NaOH a 3N. A fermentação foi terminada após cessar o crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de deoxicolato de sódio a 12% estéril foi adicionada à cultura para obter uma concentração de 0,12% - 0,13% no caldo, para submeter as células bacterianas a lise e liberar o polissacarídeo célula-associado. Após lise, os conteúdos do fermentador foram agitados durante um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas em uma temperatura entre 7°C e 13°C, para assegurar que lise celular completa e liberação de polissacarídeo tinham ocorrido. Agitação durante esse período de manutenção impediu o sedimento de lisado de assentar nas paredes do fermentador e sonda de pH, desse modo, permitindo que a integridade da sonda de pH fosse mantida. Em seguida, o pH do caldo de cultura submetido à lise foi ajustado para um pH de aproximadamente 4,8 com ácido acético a 50%. Após um tempo de manutenção sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas em uma temperatura entre 15°C e 25°C, uma porção significativa das proteínas anteriormente solúveis se separou da solução como um precipitado sólido com pouca perda ou degradação do polissacarídeo, o qual permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi, então, clarificada através de centrifugação em fluxo contínuo, seguido por filtração profunda e microfiltração em 0,45 μm.
[00045] Deve ser compreendido que a discussão e exemplos precedentes representam meramente uma descrição detalhada de determinadas modalidades. Portanto, será evidente para aqueles versados na técnica que várias modificações e equivalentes podem ser feitos sem se desviar do espírito e escopo da invenção.
Claims (8)
1.Processo para redução do teor de proteína e preservação do teor de polissacarídeo capsular em um caldo de lisado celular de Streptococcus pneumoniae complexo antes da purificação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) expansão, em volumes crescentes a partir de um recipiente inicial para um recipiente de produção em escala em um meio baseado em soja, de um sorotipo de S. pneumoniae selecionado e manutenção de um pH e temperatura estáveis durante crescimento celular;(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucleicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e(f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sorotipo de S. pneumoniae selecionado é 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F ou 19A.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH na etapa (a) é mantido através de uma alimentação de base de hidróxido de sódio, carbonato de sódio ou uma combinação dos mesmos.
4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) expansão, em volumes crescentes a partir de um recipiente inicial para um recipiente de produção em escala em um meio baseado em soja, de um sorotipo de S. pneumoniae selecionado do grupo consistindo nos sorotipos 1, 4, 6A, 6B e 7F e manutenção de um pH e temperatura estáveis durante crescimento celular; o pH sendo mantido com hidróxido de sódio;(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucleicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e(f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) expansão, em volumes crescentes, do sorotipo 5 de S. pneumoniae, a partir de um recipiente inicial para um recipiente de produção em escala em um meio baseado em soja suplementado com bicarbonato de sódio e manutenção de um pH e temperatura estáveis durante crescimento celular; o pH sendo mantido com hidróxido de sódio;(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucleicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e(f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) expansão, em volumes crescentes, do sorotipo 19A de S. pneumoniae, a partir de um recipiente inicial para um recipiente de produção em escala em um meio baseado em soja suplementado com bicarbonato de sódio e manutenção de um pH e temperatura estáveis durante crescimento celular, o pH sendo mantido com carbonato de sódio;(b) lise, com um detergente, das células bacterianas produzidas na etapa (a), desse modo, produzindo um lisado contendo proteínas solúveis, restos de células, ácidos nucleicos e polissacarídeo;(c) agitação do lisado celular durante um tempo suficiente para assegurar lise completa e liberação do polissacarídeo;(d) diminuição do pH do lisado celular para menos de 5,5 para precipitar o detergente e a maioria das proteínas solúveis;(e) manutenção da solução e precipitado formados na etapa (d) sem agitação durante um tempo suficiente para permitir assentamento do precipitado; e (f) processamento da solução e precipitado através de centrifugação e/ou filtração, pelo que o polissacarídeo capsular na solução é preservado e a proteína solúvel é efetivamente reduzida.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 e 6, caracterizado pelo fato de que o detergente é deoxicolato de sódio.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 e 6, caracterizado pelo fato de que o pH na etapa (d) é diminuído para entre 4,5 e menos de 5,5.
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