CN102093963B - 富含磷壁酸的肺炎链球菌的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肺炎链球菌的培养方法。本发明的富含磷壁酸的肺炎链球菌的培养方法，在液体培养基中添加氯化胆碱，并对培养工艺进行了优化，获得的肺炎链球菌菌体富含磷壁酸，特别适合作为提取肺炎链球菌C多糖的材料。

Description

富含磷壁酸的肺炎链球菌的培养方法

技术领域

本发明涉及病原微生物的培养，尤其涉及肺炎链球菌的培养方法。

背景技术

肺炎链球菌(S.pneumoniae)，属于芽胞杆菌纲乳杆菌目链球菌科链球菌属，是一种革兰阳性球菌，菌体呈矛头状，多成双排列，宽端相对，尖端向外。在痰液、脓汁、肺组织病变中亦可呈单个或短链状。肺炎链球菌无鞭毛，无芽胞，在机体内或含血清的培养基中能形成荚膜，荚膜需特殊染色才可见。

肺炎链球菌经常寄居于正常人的鼻咽腔中，多数不致病或致病力弱，仅少数有致病力。作为一种条件致病菌，肺炎链球菌通常形成带菌状态，当机体免疫力下降时，尤在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺炎链球菌肺部感染。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，约占细菌性肺炎的80％。肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、脑膜炎和败血症等。

肺炎链球菌的抗原主要包括：

1、荚膜多糖抗原：是一类型特异性多糖抗原，根据荚膜多糖的不同，肺炎链球菌可区分为约90多个血清型。荚膜多糖抗原可以诱导人体产生特异性抗体，对同型感染有保护作用。针对肺炎链球菌的荚膜多糖疫苗、荚膜多糖-蛋白偶联疫苗均已广泛使用。

2.菌体抗原

(1)C多糖：一种特异性多糖，存在于肺炎链球菌胞壁中，为各型菌株所共有。在Ca²⁺存在时，肺炎链球菌C多糖可为血清中一种称为C反应蛋白(C reactiveprotein；CRP)的球蛋白所沉淀。C多糖在人体内可诱导产生高滴度抗体水平，但该抗体却并没有保护性。

(2)M蛋白：是一种型特异抗原。

C多糖是由重复单位组成的细胞壁磷壁酸，为肺炎链球菌的共同抗原，存在于所有血清型肺炎链球菌的细胞壁中。在荚膜多糖疫苗、荚膜多糖-蛋白偶联疫苗生产过程中，分离纯化的荚膜多糖不可避免的混杂有C多糖。为了精确定量疫苗中荚膜多糖的含量，需要对荚膜多糖中混杂的C多糖进行检测。

在荚膜多糖疫苗效力评价方面，人体内存在的抗C多糖抗体常常干扰对荚膜多糖抗体的定量测定，例如用ELISA方法测定的抗荚膜多糖抗体数值偏高。经改进的ELISA检测方法，需要在测定前先用C多糖对血清样本中的C多糖抗体进行吸附，以得出更加准确的实验结果。

一般认为，C多糖由2-8个重复单位组成，每个重复单位由五个单糖结构构成，包括一个葡萄糖、一个2-乙酰胺-4-氨基-2，4，6-三脱氧半乳糖(AAT)、两个半乳糖胺和一个5-磷酸核糖醇，重复单位之间通过磷酯键相连。在两个半乳糖胺残基上连接有磷酸胆碱集团，是C多糖的显著特征。不同的研究者报道的C多糖结构不完全相同，主要差异在于重复单位中磷酸胆碱的数量以及乙酰化程度。这种差异可能与肺炎链球菌的种类、菌体培养方法、C多糖的提取方法等多种因素有关。

本领域迫切需要结构完整的C多糖样品和/或对照品，用于肺炎链球菌多糖疫苗或结合疫苗的质量控制以及相关检测试剂的生产。因此，建立质量可控、重复性好、适合大规模生产的肺炎链球菌培养、C多糖分离纯化工艺具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种富含磷壁酸的肺炎链球菌的培养方法，该方法培养的富含磷壁酸的肺炎链球菌用于C多糖样品和/或对照品的制备。

本发明提供了一种肺炎链球菌的培养方法，在特征是在培养基中添加氯化胆碱。

在一个优选的方案中，培养基中添加的氯化胆碱的浓度2.5～200ug/ml；优选的，氯化胆碱浓度为5～150ug/ml；更优选的，氯化胆碱浓度为20～80ug/ml；最优选的，氯化胆碱浓度为40～80ug/ml。

本发明的肺炎链球菌的培养方法，所用的培养基为商品TSB培养基；优选的，TSB培养基在接种前补加1.0％葡萄糖。

本发明所用的培养基还可以是自制复合培养基，所述的自制复合培养基包含氯化钠0.25％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.041％、氯化钙0.001％、蛋白胨1.0％、酵母浸出粉0.5％、葡萄糖1.0％。

本发明的肺炎链球菌的培养方法，肺炎链球菌的培养为两级或三级扩大培养，每级培养接种后在37℃、CO₂孵箱培养4～8小时；更优选的，肺炎链球菌的培养为三级扩大培养，第一级、第二级培养接种后培养4～8小时，第三级培养在接种后培养6小时。

本发明的肺炎链球菌的培养方法，肺炎链球菌菌株为粗造型肺炎链球菌突变体；优选的肺炎链球菌菌株选自CSR SCS2 Clone1、R6A、R36A或RSC-2；更优选的，肺炎链球菌菌株为CSR SCS2 Clone1菌株。

本发明的肺炎链球菌培养方法，获得的肺炎链球菌生长状态好，磷壁酸含量高，易于大规模生产。用该培养方法获得的肺炎链球菌提取的C多糖，结构完整，磷含量、氨基己糖含量、糖醛酸含量等关键指标与参比C多糖(丹麦血清研究所提供)接近，适合作为肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗生产中C多糖检测的对照品，也可用于评价肺炎链球菌多糖疫苗、蛋白结合疫苗的检测试剂。

具体实施方式

菌株

常用于纯化制备C-Ps的肺炎链球菌菌株包括CSR SCS2 Clone1、R6A、R36A、RSC-2等。本发明采用的肺炎链球菌菌株为CSR SCS2 Clone1，为一株II型肺炎链球菌的荚膜突变株，因失去荚膜成为粗糙型(有荚膜则为光滑型)。也有研究报道称在其细胞表面包裹有一层C多糖“荚膜”层。使用CSR SCS2Clone1菌株在C多糖的分离纯化中不受荚膜多糖的干扰，所以被多数研究者采用，例如Schiffman，G.et al，(1971)Capsulation of Pneumococcus with soluble cellwall-like polysaccharide.J.Exp.Med.134，600-617.以及

U.B.S.et al，(1984)C-polysaccharide in a pneumococcal vaccine.Acta Pathol.Microbiol.Immunol.Scand.Sect.C 92：351-356。

肺炎链球菌的鉴别

(1)形态学观察

典型的肺炎链球菌为革兰染色阳性球菌，直径约1μm。常呈双排列。菌体成矛头状，宽端相对，尖端向外。在液体培养中可呈单个或短链状。有毒株在体内形成荚膜。普通染色时荚膜不着色，表现为菌体周围透明环。无鞭毛。不形成芽胞。菌体衰老时，或由于自溶酶(autolysin)的产生将细菌裂解后，可呈现革兰染色阴性。

(2)糖，醇生化反应

肺炎链球菌可以在以乳糖、棉子糖或菊糖为碳源的培养基上生长，不能在以甘露醇或山梨醇为碳源的培养基上生长，常用于肺炎链球菌的鉴别。

(3)奥普托欣敏感试验

奥普托欣(Optochin，盐酸乙基氢化羟基奎宁)对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成，而对其它链球菌则无此作用。常用于肺炎链球菌的鉴别。

(4)胆汁溶菌试验

胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是由于胆汁降低细胞膜表面的张力，使细胞膜破损或使菌体裂解；或者是由于胆汁激活了肺炎链球菌自溶酶，加速了肺炎链球菌本身自溶过程，促使细菌发生自溶。主要用于肺炎链球菌与甲型链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。

培养基

本发明采用的固体血琼脂培养基为含8％绵羊血的琼脂培养基，可制作成斜面或平板，为青岛海博生物技术有限公司产品。

本发明采用的液体培养基主要为两种，主要成分及来源如下：

(1)复合液体培养基成份：所述的复合培养基包含氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、蛋白胨、酵母浸出粉、葡萄糖，具体配比见下表。临用前配制，分装后8磅30分钟高压灭菌，小三角瓶200ml，大三角瓶600ml，大立瓶9.5L(1％葡萄糖在接种时补加)。

表1复合培养基组分配比

试剂	含量(克/100毫升)
		NaCl	0.25
磷酸二氢钾	0.1
		磷酸氢二钾	0.3
硫酸镁	0.041
		氯化钙	0.001

蛋白胨	1.0
		酵母粉	0.5
葡萄糖	1.0

(2)TSB液体培养基成份：全称Tryptic soy Broth，胰蛋白胨大豆肉汤培养基，简称TSB培养基，为德国MERCK公司产品。临用前将成品TSB培养基按3％的比例配置成液体培养基，用7.5mol/L NaOH溶液调pH8.0左右，分装后8磅30分钟高压灭菌，小三角瓶200ml，大三角瓶600ml，大立瓶9.5L。接种时补加50％葡萄糖使终浓度为1％。

C多糖对照品

本发明采用的C多糖对照品为从丹麦血清研究所(STATENS SERUMINSTITUT)的Cell Wall Polysaccharide(pneumococcal CWPS)，货号为KCWPS3。

C多糖生化指标检测

(1)核酸含量测定

用蒸馏水溶解C-Ps(浓度为1mg/ml)，用蒸馏水作空白对照，于分光光度计260nm处扫描，按公式：C＝ABS₂₆₀×5计算样品中核酸的含量。

(2)蛋白含量测定

采用Lowrry法：将C-Ps用蒸馏水溶解为1mg/ml。以人血清白蛋白为标准蛋白，制作工作曲线。取待测样品1ml测定C-Ps溶液中残余蛋白的含量。

(3)氨基己糖含量测定

二氨基苯甲醛显色法：以氨基葡萄糖作标准制作工作曲线，显色液以530nm波长比色。取1ml待测样品测定氨基己糖含量。

(4)糖醛酸含量测定

咔唑-乙醇溶液显色法：以葡萄糖醛酸作标准，显色液以530nm波长比色，制作工作曲线。取待测样品1ml，测定其糖醛酸含量

(5)磷含量测定

磷含量测定(参照《中国药典》2005版附录36)：以磷酸二氢钾为标准，制作工作曲线(测定步骤同样品)。精确吸取适量预先溶解好的C-Ps溶(1mg/ml)，加4ml硫酸并加热使其碳化，加2ml高氯酸消化，立即加入2ml蒸馏水，加0.04mol/L钼酸铵溶液0.4ml混匀，加入还原剂(亚硫酸氢钠，亚硫酸钠，1-氨基-2-萘酚-4-磺酸)0.2ml，加水2ml混匀，于820nm处比色。

本发明所采用其他试剂：

革兰氏染液为本室自制；氯化胆碱购于上海希美化学有限公司；奥普托欣为杭州天和微生物试剂有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯试剂。

实施例1、CSR SCS2 Clone1菌株的鉴别1.1菌种鉴定

1.1形态学观察

用接种环刮取血琼脂培养基上生长良好的CSR SCS2 clone1菌落于载玻片上，滴加一滴盐水，用接种环涂布均匀，在煤气灯上微热固定；或者加一滴液体培养的CSR SCS2 clone1菌液于载玻片上，在煤气灯上微热固定。使用革兰氏染色法进行染色，在光学显微镜(油镜头，100x)下观察细菌形态。

CSR SCS2 clone 1菌株在血琼脂培养基上生长良好，菌体细小，呈球形，菌落呈灰色扁平状，周围有草绿色a溶血环，固体血琼脂斜面培养的细菌多成双排列，液体培养基培养的细菌多成短链状排列。

1.2糖，醇生化反应

(1)糖，醇发酵培养基

蛋白胨                            10g

氯化钠                            5g

溴甲酚紫(0.004％)                 6ml

乳糖/棉子糖/菊糖/甘露糖/山梨醇    0.5g

蒸馏水                            1000ml

(2)培养基配置

取蛋白胨和氯化钠加入水中，加热溶解，用2.5mol/LNaOH调节pH，使灭菌后为7.3±0.1，加入溴甲酚紫震荡混匀。分装于五个小三角瓶中，每瓶100ml。每瓶加入一种糖或醇，混匀后分装于小管中，加盖，116℃灭菌30分钟.

(3)发酵试验

用接种环刮取羊血琼脂斜面上生长良好的CSR SCS2 clone 1菌落，分别接种盛有含乳糖或棉子糖或菊糖或甘露醇或山梨醇的发酵培养基的小管中，手摇震荡混匀，置于37℃、CO2培养箱中静止培养。24-48小时之后观察小管中培养基颜色变化情况。

糖、醇生化反应特征结果见下表：

表1肺炎链球菌菌株CSR SCS2 clone 1的生化反应结果

1.3奥普托欣敏感试验

用接种环刮取羊血琼脂斜面上生长良好的CSR SCS2 clone 1菌落，均匀涂布于血琼脂平板上，用镊子取一张含5μg奥普托欣纸片放于涂布区域中央，置二氧化碳孵箱、37℃孵育18-24h，观察结果。

奥普托欣能明显抑制CSR SCS2 clone 1肺炎链球菌的生长，形成明显的抑菌圈。实验测得抑菌圈直径为14mm。

1.4胆汁溶菌试验

用接种环刮取羊血琼脂斜面上生长良好的CSR SCS2 clone 1菌落接种于液体培养基中，培养8-9小时之后，取2支中管，分装9ml被检菌培养物。然后分别加入10％去氧胆酸钠溶液和生理盐水(对照管)1ml，摇匀后置35℃水浴10～30min，观察结果。

脱氧胆酸钠可以促使细菌发生自溶。35℃水浴10～30min分钟之后，加脱氧胆酸钠的培养物变透明，而对照管仍呈混浊状。

上述1.1～1.4项鉴别试验结果与文献报道的结果一致。

实施例2、CSR SCS2 Clone1扩大培养条件的优化

2.1培养基的选择

(1)复合培养基培养肺炎链球菌

细菌第一代先接种至固体培养基-羊血琼脂培养基表面，37℃恒温CO₂孵箱培养八小时之后用接种环刮取菌落传代，重新接种至新的固体培养基表面，划线；37℃恒温CO₂孵箱培养8小时后用接种环刮取菌落接种于小三角瓶200ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温CO₂孵箱培养8小时后将小三角瓶中的菌液接种于大三角瓶600ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温CO₂孵箱培养8小时后将菌液接种至大立瓶10000ml液体培养基中，补加50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖；37℃恒温孵房摇床震荡培养4小时后，于超净工作台上用7.5mol/L NaOH溶液将大立瓶中菌液的pH值调至8.5左右，培养基补50％的葡萄糖，使终浓度到1％的葡萄糖。操作结束后将立瓶放置孵房的摇床上继续震荡培养。约3小时左右收获菌液。用分光光度计于600nm测定收获菌液的OD值。

(2)TSB培养基肺炎链球菌

具体操作与自制培养基过程相同。

依据细菌生长状况，比较自制培养基与商品TSB培养基中细菌的生长情况。结果发现细菌在两种培养基中的生长状况基本相同，最终得到菌液的菌浓度无明显差异。涂片镜检细菌形态，在两种培养基中生长的细菌形态之间也无显著差异。具体生长情况见表2所示。

表2不同培养基培养的菌体密度

2.2最适培养时间的确定

具体操作与2.1自制培养基培养部分相同，区别仅在于将肺炎链球菌CSRSCS clone1接种至大立瓶后，37℃恒温孵房摇床震荡培养6h，7h，8h，9h。培养所得的菌液取少许，加入终浓度为1％的甲醛杀菌3h。用分光光度计在600nm检测菌液OD值，结果见表3；同时对获得的细菌涂片进行镜检，以确定细菌的最佳培养时间。

表3不同孵育时间的菌体密度(600nm的OD值)

结果显示菌液在6h时，细菌CSR SCS2 clone1形态为典型的链状肺炎链球菌，即链球菌状。同时也存在少量椭圆形的双球菌；当细菌生长至7h时，细菌形态并没有发生明显的变化，但是细菌的链长开始变短；细菌生长至8h涂片镜检发现较多的为双球菌，几乎不存在链状结构。同时也出现了许多单个球菌；当培养时间达9h时，镜检中已观察不到链状结构存在，双球菌也很少，几乎全部为单个球菌，而且视野中出现了大量的细胞碎片。从OD直也可以看出，当培养时间超过6h后菌液的OD值开始下降。说明该细菌振荡培养的最佳时间约为6h，超过该时间，肺炎链球菌的生长已经由稳定期进入衰退期。

实施例3、培养基中氯化胆碱的最适浓度

液体培养基中加入终浓度为0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，150μg/ml，200μg/ml的氯化胆碱。具体操作与2.1自制培养基培养部分相同，区别仅在于将肺炎链球菌CSR SCS clone1接种至大立瓶后，37℃恒温孵房摇床震荡培养6h。培养所得的菌液取少许，加入终浓度为1％的甲醛杀菌3h。用分光光度计在600nm检测收获菌液OD值，具体见表4。

离心收获菌体，将菌体溶于适量的生理盐水中，于600nm测OD值。用生理盐水稀释菌液，使菌液的浓度约为25亿，OD值在2.50左右即可。稀释好的菌液加入终浓度为0.2％的DOC，于2-8℃搅拌裂解。裂解3h后，调pH5.0，离心弃去沉淀收获上清液。调上清液的pH值在6.5左右，测量上清液体积，加入3M CaCl₂使终浓度为0.5M，搅拌均匀后调pH7.0；测量溶液体积，加入95％酒精使终浓度达30％；搅拌均匀，2-8℃放置3h后离心，收获上清液。所得上清液调pH5.0后测量体积，加入95％酒精使终浓度为75％，2-8℃放置过夜后离心收获沉淀。将收获的沉淀溶于蒸馏水中(20000ml培养液所获得的沉淀加蒸馏水约500ml)，测量多糖水溶液体积，加入DOC使终浓度为0.5％，搅拌均匀后调pH3.0，离心收获上清液。用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤浓缩所得上清液，冻干即可得精制多糖。

分别测定以上各组试验制备的C多糖的蛋白质和核酸杂质含量，分别测定以上各组试验制备的C多糖的氨基己糖、磷、糖醛酸含量，具体结果见表4。

表4多糖特异成分的百分含量与氯化胆碱浓度的相关性

a：参比C多糖，各成分百分含量为三次检测的平均值

结果显示C多糖磷含量与培养基中氯化胆碱浓度明显相关，与当培养基中氯化胆碱浓度＜40μg/ml时，随着胆碱浓度的增加，C-Ps多糖中磷的含量也随之增加，由此可以推测培养基中加入胆碱之后有可能促使细菌细胞壁中磷脂酰胆碱的合成。但是当氯化胆碱的浓度＞40μg/ml后，随着胆碱浓度的增加，细菌生长状况及多糖化学检测检测指标都未发生明显变化。

Claims (3)

1.一种肺炎链球菌的培养方法，其特征在于，(1)肺炎链球菌菌种选用CSRSCS2 Clone1菌株；(2)液体培养基选用自制培养基，所述的自制培养基包含氯化钠0.25％、磷酸二氢钠0.1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁0.041％、氯化钙0.001％、蛋白胨1.0％、酵母浸出粉0.5％、葡萄糖1.0％；(3)培养步骤为两级或三级扩大培养，每级培养接种后在37℃、CO₂孵箱培养4～8小时。

2.如权利要求1的培养方法，其特征在于，肺炎链球菌的培养为三级扩大培养，第一级、第二级培养接种后培养4～8小时，第三级培养在接种后培养6小时。

3.如权利要求1的培养方法，其特征在于，在肺炎链球菌液体培养基中加入终浓度为40～80ug/ml的氯化胆碱。