BRPI0509827B1 - nanopartículas pegiladas para transporte de moléculas biologicamente ativas, composição farmacêutica, liofilizato constituindo nanopartículas pegiladas e processo de preparação de nanopartículas pegiladas - Google Patents

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Krassimira Pavlova Yoncheva
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Abstract

NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PAPA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, LIOFILIZATO CONSTITUINDO NANOPARTÍCULAS PEGILADAS E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS, se refere a nanopartículas formando um polímero biodegradável, preferencialmente o éter de metil vinil e o copolímero anidrido maléico (PVM/MA) e um glicol de polietileno ou derivativos deste; estas nanopartículas são fáceis de produzir e fornecem excelentes características de bioadesão, dimensão e potencial zeta, sendo portanto adequadas para administração de moléculas ativas; a seleção do tipo de glicol de polietileno usado em sua produção permite modular apropriadamente as características destas nanopartículas, que podem ser usadas de forma vantajosa de acordo com o tipo de droga a ser transportada e/ou método de administração da formulação farmacêutica; a pegilação é realizada através da simples incubação por um curto período de tempo das duas macromoléculas em questão, sem precisar fazer uso de solventes orgânicos com alta toxicidade nem dos longos e trabalhosos processos de síntese orgânica; além disso, o processo de pegilação pode ser associado ao processo de encapsulamento de moléculas biologicamente ativas.

Description

[0001] A invenção se refere a nanopartícuias pegilatadas com bases em um polímero biodegradável e um polietilenoglicol, com processo para fabricação desses com formulações que os contêm e seu uso como sistemas de administração de drogas.
[0002] Nos últimos anos as nanopartícuias de polímero biodegradável têm sido propostas como novos sistemas de administração de droga. Um dos recursos mais importantes que elas oferecem é a liberação controlada de drogas incorporadas. Isto resulta em grande eficácia terapêutica, fornece uma administração mais confortável para o paciente e permite a prevenção de overdose. Além disso, podem ser incluídas drogas com diferentes recursos físico- químicos, permitindo a melhoria de sua estabilidade em fluidos biológicos. Este fato é muito importante no caso de antígenos, proteínas e macromoléculas em geral. Além do que, devido à sua pequena dimensão, as nanopartícuias são adequadas para a administração de drogas através de várias vias, tais como, oralmente, parenteralmente e ocularmente (Kreuter, Adv. Drug Del. Rev., 7 (1991) 71-86; Gref et al., Science, 263 (1994) 1600-1603; Zimmer and Kreuter, Adv. Drug Del. Rev., 16 (1995) 61-73).
[0003] A administração oral é a via mais conveniente e popular para a administração de drogas. Entretanto, a biodisponibilidade de uma determinada molécula ativa depende (i) das características da molécula da droga e da forma farmacêutica e (ii) das condições fisiológicas presentes no trato gastrointestinal, tais como, a presença de enzimas proteoliticas, movimentos peristálticos e o metabolismo pré-sistêmico. Sistemas coloidais, tais como nanoparticulas têm sido propostos para superar alguns destes obstáculos. Estes transportadores possuem essencialmente uma grande superfície especifica através da qual é facilitada sua interação com o suporte biológico (mucosa gastrointestinal). 0 controle da liberação da droga também permite prolongar o tempo do efeito das moléculas com baixa meia-vida biológica. Por outro lado, as nanoparticulas podem ser entendidas através das células de ligação de Peyer e pelos foliculos do tecido linfóide (Hodges et al., J. Drug Target., 3 (1995) 57-60; Florence, Pharm. Res., 14 (1997) 259-266) . Este fenômeno permite direcionar a droga no caminho linfático e no caso de vacinas, facilita sua apresentação de antigeno. Entretanto, as nanoparticulas convencionais possuem várias desvantagens importantes com relação ao seu uso através de administração oral: (i) certa instabilidade em fluidos gastrointestinais, (ii) um baixo grau de absorção intestinal e (iii) tropismo ou adesão não- especifico na mucosa gastrointestinal.
[0004] A administração parenteral de nanoparticulas fornece liberação sistêmica controlada, que é adequada para drogas com (i) baixa biodisponibilidade oral, (ii) curta meia-vida do plasma biológico e (iii) estabilidade limitada. Uma outra vantagem significativa das nanoparticulas parenterais é a possibilidade de concentração da droga em um determinado órgão. Entretanto, as nanoparticulas são rapidamente reconhecidas, entendidas e eliminadas da circulação sangüinea por macrófagos do sistema fagócito mononuclear (MPS) após sua administração intravenosa. Este fenômeno limita sua operação na liberação controlada bem como a possibilidade de concentração da droga em outros tecidos que não o MPS.
[0005] A administração oftálmica dos sistemas de liberação controlada apresenta vantagens significativas para o tratamento de doenças oculares, embora também possa ser obtido um efeito sistêmico. Entretanto, a administração ocular está associada à rápida eliminação da formulação a partir da área pré-corneal em virtude da drenagem na direção do duto nasolacrimal e diluição lacrimal. Estes processos dão origem ao fato de que uma porcentagem muito baixa da droga administrada pode penetrar na córnea e alcançar os tecidos intraoculares (menor que 5%). Esta drenagem é responsável pela ocorrência de efeitos sistêmicos após a administração da formulação através desta via. Diversos estudos têm demonstrado que o uso de nanoparticulas permite o aumento da quantidade de drogas na conjuntiva e o aumento de sua biodisponibilidade comparada com as formas oftálmicas convencionais, tais como, soluções e ungüentos (Gurny et al., J. Controlled Rei., 6 (1987) 367-373; Deshpande et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 15 (1998) 381-420). Sistemas coloidais podem ser administrados como gotas simples evitando problemas de visão devido à sua baixa viscosidade. A freqüência de uso pode ser reduzida em função da liberação sustentada da droga a partir da matriz de nanoparticulas. Entretanto, as nanoparticulas também apresentam uma rápida eliminação do lado da absorção.
[0006] Portanto, apesar das nanoparticulas serem potencialmente úteis para os vários métodos de administração mencionados anteriormente, ainda há problemas que tornam seu uso dificil. A modificação das características da matriz de polimero, bem como de sua superfície, pode fornecer a solução para alguns dos problemas descritos acima.
[0007] A partir deste ponto de vista, a associação ou revestimento das nanopartículas com polímeros adequados pode alterar suas características fisico-quimicas, podendo modificar indiretamente sua distribuição e interação com o meio biológico. Uma estratégia possivel é o polietilenoglicol (PEG) vinculado a nanopartículas, conhecido como pegilaçâo ou obtenção de nanopartículas ocultas.
[0008] Com relação ao seu uso através de administração oral, a associação de polietilenoglicóis a nanopartículas convencionais permite protegê-las contra o ataque enzimático nos fluidos digestivos. Isto ocorre devido ao potencial dos polietilenoglicóis rejeitar proteínas (Gref et al., Science, 263 (1994) 1600 - 1603) . Esta estratégia também permitiria a minimização de sua interação com o múcico e outras proteínas presentes no lúmen. Uma estratégia similar foi aplicada ao desenvolvimento de nanopartículas para uso ocular. Fresta et al. observou um aumento significativo da absorção ocular de aciclovir após sua administração em nanoesferas poli (alcilcianoacrilato) revestidas com polietilenoglicol (Fresta et al., J. Pharm. Sei., 90 (2001) 288 - 297). Este fenômeno é explicado através de uma grande interação das nanopartículas revestidas com o epitélio corneai.
[0009] Várias nanoparticulas revestidas com polietilenoglicol administrado por via intravenosa têm demonstrado circulação prolongada (Gref et al., Science, 263 (1994) 1600-1603; Stolnik et al., Pharm. Res., 11 (1994) 1800-1808; Bazile et al. , J. Pharm. Sci., 84 (1995) 493- 498). Nanoparticulas poli(láctico) (PLA) revestidas com polietilenoglicol possuem uma meia-vida de plasma muito mais longa (th = 6 h) do que quando são revestidas com albumina ou poloxamer (th = 2-3 minutos) (Verrecchia et al. , J. Controlled Rei., 36 (1995) 49-61). A presença de cadeias de polietilenoglicol hidrofilicas na superfície de nanoparticulas reduz significativamente sua interação com as proteínas do sangue (conhecidas como opsoninas). Estas proteínas promovem fagocitoses formando uma "ponte" entre as partículas e os fagócitos (Frank &Fries, Immunol. Today, 12 (1991) 322-326). Entretanto, as propriedades hidrofilicas dos polietilenoglicóis não são os únicos fatores importantes, fornecendo também eficiente resistência à opsonização. Outros polímeros hidrofilicos, tal como, álcool polivinil têm demonstrado uma baixa capacidade de proteção contra opsonização das nanoparticulas (Leroux et al., Life Sci., 57 (1995) 695-703). Portanto, a estabilização esférica fornecida pela pegilação também seria em virtude de outras propriedades fisico-quimicas, tais como, a alta flexibilidade das cadeias de PEG e uma formação estrutural especifica (Mosquiera et al. , Biomaterials, 22 (2001) 2967- 2979) .
[0010] A principal desvantagem desta nova estratégia é a estabilidade da associação dos polietilenoglicóis na superfície das nanoparticulas (Peracchia et al., Life Sci., 61 (1997) 749-761). Sabe-se que a capacidade do polietilenoglicol rejeitar proteínas depende da configuração, da carga, da dimensão e da flexibilidade das cadeias (Torchillin, J. Microencaps., 15 (1998) 1-19). 0 processo para modificação da superficie das nanoparticulas é realizado principalmente por absorção fisica (Stolnik et al. , Adv. Drug Del. Rev., 16 (1995) 195- 214) ou por vinculação covalente (De Jaeghere et al., J. Drug Target., 8 (2000) 143-153). Entretanto, a desvantagem da absorção simples é a rápida perda do revestimento em função da instabilidade da interação. Dado que a vinculação covalente é preferível, mais nanoparticulas pegilatadas foram preparadas usando copolimeros de polietilenoglicol com ácido láctico ou glicólico. Entretanto, o processo de copolimerização requer o uso de vários catalisadores e condições químicas especificas (Beletsi et al. , Int. J. Pharm., 182 (1999) 187-197). Além disso, os resíduos do solvente orgânico tóxico usado na sintese orgânica (cloreto de metileno, tolueno etc.), pode ser problemático.
[0011] Portanto, ainda é necessário obter nanoparticulas que sejam estáveis na administração oral, mantenham o revestimento hidrofilico e tenham boas características bioadesivas e especificidade no trato gastrintestinal. Para que sejam eficazes, elas devem ser não-tóxicas, biodegradáveis e fáceis de produzir.
[0012] O objeto da presente invenção é oferecer nanoparticulas que resolvam os inconvenientes mencionados acima, isto é, elas têm estabilidade e especificidade na administração oral, boas características bioadesivas para interação com mucosas, são capazes de transportar uma ampla faixa de moléculas ativas, liberam a molécula ativa de forma controlada e impedem sua eliminação do sistema sangüineo, especialmente quando elas são administradas parenteralmente.
[0013] Foi observado que nanopartículas formadas por um polimero biodegradável e polietilenoglicol resolvem estes problemas. Foi descoberto em especial que as nanopartículas formadas por um éter de metil polivinil, anidrido maléico e copolimero de polietilenoglicol são fáceis de produzir e fornecem excelentes características de bioadesão, dimensão e potencial zeta, o que as torna adequadas para a administração de moléculas ativas. Além disso, descobriu-se que a seleção do tipo de polietilenoglicol usado para produzi-las permite modular adequadamente os recursos destas nanopartículas, que podem ser usados de forma vantajosa de acordo com o tipo de droga a ser transportado e/ou método de administração da formulação farmacêutica.
[0014] Portanto, num primeiro aspecto a invenção diz respeito a nanopartículas pegilatadas para transporte de moléculas biologicamente ativas compondo um polimero biodegradável e um polietilenoglicol ou derivativos destes. Numa variante, o polimero biodegradável é um copolimero de éter de metil vinil e anidrido maléico (PVM/MA).
[0015] O polietilenoglicol preferivelmente possui um peso molecular situado entre 400 e 35.000 Da. O polialcilenoglicol fornece bons resultados quando selecionado a partir do grupo de polietilenoglicóis, polipolipropilenoglicóis, copolimeros de bloco ou aleatórios incluindo os dois tipos de unidades, misturas deste ou derivativos destes. Pelo menos um grupo hidroxila terminal do polietilenoglicol é opcionalmente substituído, preferivelmente por um alcoxilo, acrilato, metacrilato, alcil, amino, fosfato, isotiocianato, sulfidril, mercapto ou grupo sulfato.
[0016] Numa variante da invenção, a relação de peso entre o polietilenoglicol e o polimero biodegradável é de 1:2-6, preferivelmente de 1:2-4, mais preferivelmente cerca de 1:4.
[0017] As nanoparticulas pegilatadas da invenção podem incorporar uma molécula ativa, tais como, proteínas, peptideos, DNA, RNA, nucleosideos, nucleotideos, oligonucleotideos ou polinucleotideos. Em termos de sua atividade, elas podem ser um agente antitumor ou um antigeno para tumores ou um agente protetor do sistema nervoso central ou um glucocorticóide ou um antigeno para vacinação ou um alérgeno para imunoterapia, entre outros.
[0018] Por outro aspecto, a invenção diz respeito a uma composição farmacêutica formada por nanoparticulas pegilatadas conforme descrito acima. Numa variante, a formulação é para administração oral. Em outra variante, é para administração parenteral ou para administração através da mucosa (por exemplo, mucosa oftálmica).
[0019] Portanto, as nanoparticulas pegilatadas da invenção podem ser usadas na fabricação de um medicamento, podendo estar opcionalmente na forma liofilizada.
[0020] Num outro aspecto, a invenção refere- se a um processo para preparação das nanoparticulas pegilatadas descritas, abrangendo a etapa de incubação simultânea do polimero e do polietilenoglicol em um solvente orgânico, antes da dissolução do polimero através de uma solução hidroalcoólica. Numa variante, a concentração do polimero biodegradável está compreendida entre 0,001 e 10% w/v e a concentração do polietilenoglicol entre 0,001 e 5% w/v. A relação das fases orgânica/solução hidroalcoólica está situada opcionalmente na faixa entre 1/1-1/10.
[0021] O processo pode ainda abranger etapas adicionais para eliminação de solventes orgânicos e/ou purificação, bem como etapas para estabilização de nanoparticulas pegilatadas por meio do uso de agentes de ligação cruzada. A molécula biologicamente ativa pode ser incorporada na etapa de incubação simultânea do polimero e do polietilenoglicol em um solvente orgânico ou pode ser incorporada subseqüentemente na suspensão aquosa das nanoparticulas já formadas de modo que sua associação possa ocorrer. A Figura 1 mostra fotografias de microscopia por transmissão de elétrons (TEM) dos diferentes tipos de nanoparticulas - (a) NP; (b) PEG NP; (c) mPEG NP; (d) DAE- PEG NP; (e) DAP-PEG NP. A escala representa 150 nm; A Figura 2 mostra a associação do PEG 2000 (mg/mg) de acordo com o processo usado: incubação simultânea do PEG e PVM/MA na fase orgânica (OP) ou a incubação de nanoparticulas com a solução aquosa (AP) do PEG; A Figura 3 mostra o efeito do tipo de polietilenoglicol na porcentagem de PVM/MA convertido em nanoparticulas (PVM/MA-e) e no rendimento do processo; A Figura 4 mostra espectros de ressonância magnética nuclear das nanopartículas pegilatadas com PEG 2000 (superior) e do PEG 2000 livre (inferior) . A imagem amplificada do pico em 4,58 ppm (prótons do grupo hidroxila) está mostrada no box; A Figura 5 mostra detalhes dos espectros de ressonância magnética nuclear (a) de nanopartículas pegilatadas com PEG 2000 e (b) do PEG 2000 livre, dissolvidas em DMSO (5 mg em 0,5 ml); A Figura 6 mostra detalhes dos espectros de ressonância magnética nuclear (a) de nanopartículas pegilatadas com DAP-PEG 2000 e (b) de DAP-PEG 2000 livre, dissolvidas em DMSO (5 mg em 0,5 ml); A Figura 7 mostra detalhes dos espectros de ressonância magnética nuclear (a) de nanopartículas pegilatadas com DAE-PEG 2000 e (b) de DAE-PEG 2000 livre, dissolvidas em DMSO (5 mg em 0,5 ml); A Figura 8 mostra estruturas propostas para as diferentes nanopartículas pegilatadas a partir dos dados de ressonância magnética nuclear e os valores do potencial zeta - a) PEG-NP; b) mPEG-NP; c) DAE-PEG-NP; d) DAP-PEG-NP; A Figura 9 mostra a distribuição das nanopartículas pegilatadas no trato gastrintestinal após sua administração oral em taxas: (a) PEG-NP, (b) mPEG-NP, (c) DAE-PEG-NP e (d) DAP-PEG-NP. O eixo-x representa a quantidade de nanopartículas aderidas (NP) (mg); o eixo-y mostra as diferentes partes do trato (St: estômago; II, 12, 13, 14: partes intestinais; Ce: Ceco; o eixo-z representa o tempo após a administração (horas); A Figura 10 mostra as curvas de bioadesão (NP, mg) das diferentes nanoparticulas pegilatadas no trato gastrintestinal inteiro após a administração oral de uma única dose de 10 mg. t: tempo em horas; A Figura 11 mostra imagens de microscopia por fluorescência de uma parte do ileo 2 horas após a administração oral de 10 mg de nanoparticulas pegilatadas com PEG 2000 (PEG-NP) . a) ileo villi: as setas mostram o compartimento apical do epitélio; b) células epiteliais: as setas mostram a fluorescência entre os enterócitos. A escala representa 20 |lm; A Figura 12 mostra imagens de microscopia óptica do segmento ileo 2 horas após a administração oral de 10 mg de nanoparticulas pegilatadas com PEG 2000 (PEG-NP). a) vista geral (ampliação de 135) e b) detalhe aumentado (ampliação de 530). L: lúmen; E: enterócitos; GC: células de geração de muco; setas escuras: núcleo enterócito; setas brancas: capilares de sangue na submucosa; e A Figura 13 mostra a localização do PEG-NP em um fragmento de Peyer do ileo, duas horas após a administração oral de lOmg de nanoparticulas. a) vista geral do fragmento de Peyer (ampliação de 135); b) detalhe aumentado (ampliação de 530); PP - fragmento de Peyer; FAE - foliculo - epitélio associado; setas escuras: células de cúpula do fragmento de Peyer onde as nanoparticulas estariam incluídas.
[0022] Surpreendentemente foi descoberto que a modificação e o revestimento de nanoparticulas de um polímero biodegradável, tal como, o copolimero de éter de metil vinil e o anidrido maléico (PVM/MA) com diferentes polietilenoglicóis, permite a obtenção de nanoparticulas com características físico-químicas, bioadesão e especificidade na administração oral, transformando-as em sistemas muito interessantes como transportadores de droga especiais. Os recursos destas nanoparticulas podem ser modulados de forma vantajosa de acordo com o tipo de polietilenoglicol usado e o processo de preparação. As nanoparticulas pegilatadas da invenção podem prolongar o tempo de residência na mucosa após sua administração oral ou ocular. Estas nanoparticulas são interessantes para a administração de drogas com janelas de absorção estreitas e, portanto, melhoram sua biodisponibilidade. Estas nanoparticulas também são vetores adequados para drogas com elevada toxicidade (por exemplo, drogas citostáticas) uma vez que permitem um aumento no tempo de circulação do plasma do sistema, durante o qual a droga é liberada gradualmente de maneira controlada. Por outro lado, as nanoparticulas pegilatadas podem impedir o reconhecimento e a eliminação por meio de células do sistema fagócito mononuclear (MPS), proporcionando uma circulação prolongada das drogas após sua administração intravenosa.
[0023] O termo "nanoparticulas" é usado para designar esferas ou formas similares com uma dimensão menor que 1,0 micrômetro, preferivelmente na faixa de 10 a 900 nanometres.
[0024] Como mencionado acima, por um aspecto a invenção se refere a nanoparticulas pegilatadas formadas a partir de um polímero biodegradável. Podem ser usados polímeros biodegradáveis conhecidos de última geração que dão origem à formação de nanoparticulas. Estes polímeros incluem, entre outros, ácidos poliidroxílicos, tais como, ácidos polilácticos e poliglicólicos e copolímeros destes (por exemplo, PLGA), polianidridos, poliésteres e polissacarídeos, por exemplo, quitosan. 0 termo "biodegradável" nesta descrição refere-se a polímeros que se dissolvem ou degradam num periodo de tempo aceitável para a aplicação desejada, neste caso terapia in vivo, uma vez que eles estão expostos a uma solução fisiológica de pH 6-9 e uma temperatura situada entre 25°C e 40°C.
[0025] Numa variante da invenção, o copolimero de éter de metil vinil e anidrido maléico na forma de anidrido (PVM/MA ou Gantrez AN) é usado como polimero biodegradável. Ele preferivelmente possui um peso molecular situado entre 100 e 2400 KDa, mais preferivelmente entre 200 e 2000 KDa. Numa variante da invenção, é preferido um copolimero PVM/MA com um peso molecular entre 180 e 250 KDa.
[0026] Este copolimero é vantajoso por ser largamente usado na tecnologia farmacêutica em virtude de sua baixa toxicidade (LD 50 = 8-9 g/kg oralmente) e excelente biocompatibilidade. Ele também é fácil de obter em termos de quantidade e preço. Este polimero pode reagir com diferentes substâncias hidrofilicas devido a seus grupos anidridos sem ter que recorrer a reagentes orgânicos usuais (derivativos de glutaraldeido e carbodiimido) tendo uma toxicidade significativa (Arbos et al., J. Controlled Rei., 83 (2002) 321 - 330) . O polimero é insolúvel em um meio aquoso, mas o grupo anidrido de Gantrez AN hidroliza, dando origem a grupos carboxilicos. A dissolução é lenta e depende das condições em que ocorre. Devido à biodisponibilidade dos grupos funcionais em PVM/MA, a vinculação covalente de moléculas com grupos nucleofilicos, tais como, hidroxilas (- OH) ou aminas (NH2) , ocorre através da simples incubação em um meio aquoso.
[0027] Nanoparticulas não-pegilatadas deste copolimero e sua preparação estão descritas no WO 02 / 069938 pertencente ao mesmo pretendente, e o conteúdo desta aplicação totalmente incorporado neste por referência. As nanoparticulas do copolimero de éter de metil vinil e anidrido maléico são facilmente preparadas dissolvendo o polímero através da adição em uma solução orgânica deste num primeiro solvente polar (miscivel com uma solução do polimero) e subseqüentemente adicionando um segundo liquido não-solvente, neste caso uma solução hidroalcoólica. Um agente de ligação cruzada pode ser acrescentado opcionalmente. A seguir está descrita a obtenção de nanoparticulas pegilatadas deste polimero, sendo estas muito fáceis de obter.
[0028] Na descrição presente, o termo "polietilenoglicol" é entendido como sendo de qualquer polimero hidrofilico solúvel em água contendo grupos de éter ligados através de 2 ou 3 átomos de carbono, opcionalmente ramificados por grupos de alcileno. Portanto, esta definição inclui polietilenoglicóis, polipropilenoglicóis ramificados ou não-ramifiçados e também copolimeros de bloco ou aleatórios incluindo os dois tipos de unidades. O termo também inclui derivativos dos grupos de hidroxila terminal, que podem ser modificados (1 ou ambas as extremidades) a fim de introduzir o alcoxilo, acrilato, metacrilato, alcil, amino, fosfato, isotiocianato, sulfidril, mercapto e os grupos de sulfato. O polietilenoglicol ou polipropilenoglicóis pode ter substituintes nos grupos alcilenos. Se estiverem presentes, tais substituintes são preferivelmente os grupos alcil.
[0029] Polietilenoglicóis são polímeros hidrossolúveis que foram aprovados para a administração oral, parenteral e tópica de drogas (FDA). Polietilenoglicóis são produzidos por meio de polimerização do óxido de etileno (EO) ou óxido de propileno (PO) na presença de água, Monoetilenoglicol ou dietilenoglicol como iniciadores de reação num meio alcalino (1, 2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxide Polymers and Copolymers" in Encyclopedia of Polymer Science and Engineering] -Polimeros Epóxidos: Polimeros de Óxido de Etileno e Copolimeros na Enciclopédia de Ciência e Engenharia de Polimeros; Mark, H.F. (Ed.), John Wiley and Sons Inc., 1986, pp. 225-273). Assim que alcançado o peso molecular desejado (geralmente controlado por meio de medições de viscosidade no processo), a reação de polimerização termina neutralizando o catalisador com um ácido (ácido láctico, ácido acético ou semelhante). O resultado é um polimero linear que apresenta uma estrutura muito simples: HO - (CH2-CH2-O)n - H onde (n) é o número de monômeros ou unidades de EO. As unidades contêm grupos de propileno alternadamente.
[0030] Embora tecnicamente todos estes produtos devam ser chamados poli (oxialcilenos), produtos com pesos moleculares médios (ou massa molecular) entre 200 e 35.000 são conhecidos como polietilenoglicóis (PEGs). Este termo polietilenoglicol normalmente é utilizado para indicar a influência significativa dos grupos terminais hidroxila nas propriedades fisico-quimicas destas moléculas. O termo PEG normalmente é usado em combinação com um valor numérico. Na indústria farmacêutica o número indica o peso molecular médio, ao passo que na indústria de cosméticos o número que acompanha as letras PEG se refere às unidades EO polimerizadas que formam a molécula (Hand book of Pharmaceutical Excipients, Rowev R.C., Sheskey P. J., Weller P.J. (Eds.), 4th Edition [4a Edição], Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical Association, London, UK, [Imprensa Farmacêutica e Associação Farmacêutica Americana, Londres, Reino Unido], 2003). Os PEGs estão incluídos em várias farmacopéias, embora a nomenclatura seja diferente (International Harmonisation: Polyethylene glycol [Harmonização Internacional: polietilenoglicol] (PEG): Pharmeuropa 1999, 11, 612-614). De acordo com o Handbook of Pharmaceutical Excipients (4th Edition [4a Edição]), 2003 Editado por R.C. Rowe, P.J. Sheskey e P.J. Weller Publicado pela Imprensa Farmacêutica (Londres, Reino Unido) e Associação Farmacêutica Americana (Washington, EUA), polioxietilenoglicóis também são referidos como polietilenoglicóis, macrogols, macrogol ou PEG. A Farmacopéia Britânica usa polietilenoglicóis e macrogols, o Ph Eur polietilenoglicóis e o macrogol, enquanto que a farmacopéia americana (USP) usa o(s) polietilenoglicol.
[0031] PEGs com peso molecular menor que 400 são líquidos não-voláteis em temperatura ambiente. O PEG 600 apresenta um ponto de fusão situado entre 17 e 22°C, ao passo que PEGs com pesos moleculares médios situados entre 800 e 2000 são materiais pastosos com baixos pontos de fusão. Acima de um peso molecular superior a 3000, os PEGs são sólidos e comercialmente disponíveis até o PEG 35000. Por outro lado, enquanto o ponto de fusão dos PEGs aumenta quando o peso molecular aumenta, o ponto de ebulição aumenta até um valor máximo de 60 °C. Igualmente, quando o peso molecular aumenta, sua solubilidade aquosa reduz. Em qualquer caso para o PEG 35000, pode ser dissolvido em água uma quantidade próxima a 50% m/m.
[0032] A partir de um ponto de vista toxicológico, os PEGs são considerados não-tóxicos e não- imunogênicos (Hermansky S.J et al., Food Chem. Toxic., 1995, 33, 139-140; Final Report on the Safety Assessment of PEGs [Relatório Final sobre Avaliação de Segurança de PEGs]: J.A. C. T., 1993, 12, 429-457; Polyethylene glycol [polietilenoglicol], 21 GER 172.820, FDA). A admissão diária permissivel definida pela OMS é para um peso de 10 mg/kg (Polyethylene glycols; Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives; World Health Organisation, Geneva; Technical Report Series [polietilenoglicóis; Relatório Vinte e Três do Comitê da Junta de Especialistas da FAO/OMS sobre Aditivos de Alimento; Organização Mundial de Saúde, Genebra; Série de Relatório Técnico] 1980, 648, 17-18).
[0033] Os derivativos do polietilenoglicol têm vantagens que são similares aos PEGs tradicionais, tais como, sua solubilidade aquosa, inatividade fisiológica, baixa toxicidade e estabilidade sob condições muito diferentes. Estes derivativos incluem produtos muito diferentes e são caracterizados pelo grupo funcional substituindo a hidroxila, tais como, -NH2 (entre aqueles mais reativos), fenol, aldeido, isotiocianato, grupos-SH, etc. Podem ser indicados os seguintes entre os derivativos do polietilenoglicol que podem ser usados na invenção: Ésteres de polioxietileno: PEG monometil éter monosucinimidil sucinato éster; PEG monometil éter monocarboximetil éter; PEG adipato; PEG distearato; PEG monoestearato; PEG hidroxiestearato; PEG dilaurato; PEG dioleato, PEG monooleato, PEG monoricinoleato; PEG de ésteres de óleo de coco. - Éteres de alcil polioxietileno: PEG monometil éter ou metoxi PEG (mPEG); PEG dimetil éter. - Outros: Poli (tereftalato de etilenoglicol); derivativos de polioxietileno e ésteres de sorbita e ácidos gordurosos; óxido de etileno e copolimeros de óxido de propileno; óxido de etileno com copolimeros de acrilamida. PEG derivativos: 0, O'-Bis-(2-aminoetil)polietilenoglicol (DAE-PEG 2000); O, O '-Bis-(2-aminopropil) polipropilenoglicol - polietilenoglicol - polipropilenoglicol.
[0034] Numa variante da invenção, o polietilenoglicol não é ramificado e não possui grupos hidroxila substitutos. Nesta variante, os polietilenoglicóis usados preferivelmente apresentam um peso molecular entre 400 e 35.000 Da. Foi descoberto que quando o peso molecular é menor que 400 Da, a pegilação não ocorre eficientemente. Portanto, numa variante preferível da invenção, o polietilenoglicol usado na fabricação de nanoparticulas pegilatadas tem um peso molecular igual ou maior que 400, mais preferivelmente igual ou maior que 1000, valores entre 1500 e 10.000 são especialmente preferidos, preferivelmente entre 2000 e 5000 KDa.
[0035] Portanto, numa variante da invenção, é usado o polietilenoglicol 2000 (PEG 2000) . A quantidade de PEG 2000 com relação ao polímero é preferivelmente de 1:2-6, valores próximos a uma relação 1:4 fornecem bons resultados. Por exemplo, cerca de 0,25 mg de PEG 2000/mg polímero fornece pegilaçâo eficiente. Neste caso, a quantidade associada às nanopartículas é de aproximadamente 55,0 microgramas por mg de nanopartícula. Estas nanopartículas são caracterizadas por apresentar uma forma esférica e uma dimensão próxima a 300 nm.
[0036] Em outra variante da invenção, o polietilenoglicol usado na fabricação de nanopartículas pegilatadas possui um grupo hidroxila terminal bloqueado, por exemplo, através de um derivativo de éter metil. Isto reduz sua hidrofilia e pode também alterar a estrutura da nanopartícula. Neste caso, uma grande porcentagem de cadeias de polietilenoglicol seria incluída dentro dela e somente uma pequena parte desta estaria localizada na superfície das nanopartículas. Esta particularidade nos permite modular os recursos das nanopartículas por meio do bloqueio dos grupos de hidroxila ou introduzindo outros grupos funcionais conforme descrito abaixo. No caso de m-PEG, que está dentro das nanopartículas, sua função seria mudar a liberação da droga modificando a porosidade da matriz polimérica.
[0037] É usado éter de metil polietilenoglicol 2000 (mPEG 2000) numa variante preferida. A quantidade de mPEG 2000 com relação ao polímero é preferivelmente de 1:2-6, valores próximos a uma relação 1:4 fornecem bons resultados, por exemplo, cerca de 0,25 mg de mPEG 2000/mg polímero. Neste caso, a quantidade associada às nanopartículas é de 35,5 microgramas por mg de nanopartícula. Estas nanopartículas são caracterizadas por apresentar uma forma esférica e uma dimensão próxima a 300nm.
[0038] Numa outra variante da invenção, o polietilenoglicol usado tem grupos funcionais terminais diferentes do grupo hidroxila, tais como, grupos amino. Estes grupos amino por sua vez podem ser substituídos e apresentar grupos funcionais. Numa variante preferida, os grupos amino são -Nft. Foi observado gue com estes grupos, a administração oral das nanoparticulas se acumula em certos segmentos do trato intestinal, o que permite uma administração especifica.
[0039] Portanto, numa variante, o polietilenoglicol usado na fabricação de nanoparticulas pegilatadas é o O,O-bis (2-aminoetil) polietilenoglicol 2000 (DAE-PEG 2000) . Neste caso, a estrutura da nanoparticula pegilatada ainda assim não é a estrutura tipo "pincel" porque as cadeias seriam combinadas nas duas extremidades, dando origem a uma forma tipo "loop". A quantidade de DAE- PEG com relação ao polimero é preferivelmente menor que 1:4. Numa variante preferida, ela é igual ou menor que 0,25 mg DAE-PEG 2000/mg polimero. Neste caso, a quantidade associada às nanoparticulas é de aproximadamente 90,6 microgramas por mg nanoparticula. Estas nanoparticulas são caracterizadas por apresentar uma forma esférica e uma dimensão próxima a 500nm.
[0040] Numa outra variante, o polietilenoglicol usado na preparação de nanoparticulas pegilatadas possui grupos amino e ramificações no grupo alcil. Foi descoberto que com estes substituintes a tendência é formar uma estrutura do tipo pincel, com uma das extremidades dentro da nanoparticula e a outra no lado de fora.
[0041] Portanto, se o polietilenoglicol usado for o O,O'-bis (2-aminopropil) polipropilenoglicol polietilenoglicol - polipropilenoglicol 2000 (DAP-PEG 2000), as nanoparticulas são caracterizadas por apresentar uma forma esférica e uma dimensão próxima a 360 nm. Neste caso, a guantidade de DAP-PEG com relação ao polimero é preferivelmente igual ou menor que 0,25 mg DAP-PEG 2000/mg polimero, a quantidade associada às nanoparticulas é de 67,6 microgramas por mg nanoparticula.
[0042] As estruturas quimicas de alguns dos polialcilenoglicóis correspondentes aos grupos mencionados anteriormente com diferentes tipos de grupos funcionais, são fornecidas abaixo de forma ilustrativa: a) H (OCH2CH2) nOH b) H3C (OCH2CH2) nOH C) H2N (CH2CH2O) nCH2CH2NH2 d) H2NCHCH3CH2 (OCHCH3CH2) (OCH2CH2) n (OCH2CHCH3 ) NH2 Exemplos específicos seriam: a) polietilenoglicol 400, 1000 ou 2000 (PEG 400, PEG 1000 ou PEG 2000); b) éter metil de polietilenoglicol 2000 (mPEG 2000); c) O, O -Bis-(2-aminoetil) polietilenoglicol 2000 (DAE-PEG 2000); d) O, O -Bis-(2-aminopropil) polipropilenoglicol-polietile- noglicol-polipropilenoglicol (DAP-PEG 2000);
[0043] Como pode ser visto do precedente, que é confirmado pelos exemplos, a seleção do tipo de polietilenoglicol permite modular à vontade os recursos do sistema que é gerado. O uso de misturas de diferentes tipos de polietilenoglicóis acrescenta um fator de variabilidade adicional. Do ponto de vista prático, isto é importante para a adaptação e seleção do sistema mais adequado para cada molécula ativa e para cada método de administração.
[0044] O processo de preparação do polimero biodegradável e das nanoparticulas de polietilenoglicol, preferivelmente copolimero de éter de metil vinil e anidrido maléico (PVM/MA) e polietilenoglicol, está baseado no método de deslocamento de solvente descrito em WO 02/069 938 por exemplo.
[0045] Numa variante da invenção, as nanoparticulas pegilatadas são preparadas através de dois processos diferentes: (i) incubação simultânea de dois polímeros (por exemplo, PVM/MA e PEG) na fase orgânica e (ii) incubação de nanoparticulas de polimero biodegradável com uma solução aquosa do polietilenoglicol. Estes processos são válidos para preparação de nanoparticulas PVM/MA com a associação de PEG em sua superfície. A primeira variante (incubação simultânea dos polímeros) é preferida porque fornece um bom grau de associação do PEG.
[0046] O primeiro processo inclui a dissolução simultânea do polimero biodegradável e do polietilenoglicol em um solvente orgânico, como acetona por exemplo. A incubação da mistura é realizada sob agitação na temperatura ambiente por um determinado periodo de tempo. A concentração do polimero biodegradável é situada preferivelmente entre 0,001 e 10% w/v e a concentração do polietilenoglicol ou de um derivativo deste, está entre 0,001 e 5% w/v.
[0047] Opcionalmente é acrescentado a esta solução um certo volume de um solvente polar miscivel com a solução de polímeros, tal como etanol por exemplo.
[0048] Um agente de ligação cruzada também pode ser usado opcionalmente para melhorar a estabilidade das nanopartículas, conforme descrito em WO 02/069938. Entre os agentes de ligação cruzada que podem ser usados estão as moléculas diaminatadas (por exemplo, 1, 3 diaminopropano), polissacarídeos ou sacarídeos simples, proteínas e geralmente qualquer molécula que apresente grupos funcionais capazes de reagir com os grupos anidrido Gantrez. No processo da invenção, a ligação cruzada não é necessária quando os PEGs são adicionados uma vez que isto ocorre simultaneamente. Deve ser adicionada uma quantidade muito pequena dos produtos indicados se desejada a ligação cruzada destes.
[0049] Finalmente, é acrescentado um volume semelhante de um segundo líquido não-solvente, preferivelmente uma solução hidroalcoólica. Numa variante é utilizada água com classificação farmacêutica (água purificada do WFI, de acordo com a aplicação). A relação da fase orgânica/solução hidroalcoólica é preferivelmente situada na faixa de 1/1 - 1/10. As nanopartículas são formadas instantaneamente no meio com a aparência de uma suspensão láctea.
[0050] Os solventes orgânicos são removidos por meio de qualquer processo adequado, tal como, evaporação sob pressão reduzida, as nanopartículas permanecem em uma suspensão aquosa estável.
[0051] As nanopartículas são purificadas por meios convencionais, tais como, centrifugação, ultracentrifugação, filtração tangencial ou evaporação, incluindo o uso de um aspirador.
[0052] Finalmente, se desejado elas podem ser liofilizadas para seu armazenamento e conservação por longo prazo. Podem ser usados agentes crioprotetores comuns, tais como, sacarina ou manitol para facilitar a liofilização, preferivelmente numa concentração situada entre 0,1 e 10% por peso.
[0053] O segundo processo inclui a dissolução do polimero biodegradável em um solvente orgânico tal como acetona. Subseqüentemente é adicionado a esta solução um determinado volume da solução hidroalcoólica, tal como, etanol e, finalmente, acrescenta-se um volume de água similar. As nanoparticulas se formam instantaneamente no meio com a aparência de uma suspensão láctea. Os solventes orgânicos são removidos conforme descrito no processo anterior, por exemplo, por evaporação sob pressão reduzida, as nanoparticulas permanecem em uma suspensão aquosa estável. Em seguida as nanoparticulas são incubadas em uma solução aquosa a base de polietilenoglicol. A incubação é realizada com agitação por um determinado periodo de tempo. As nanoparticulas são subseqüentemente purificadas por centrifugação e, finalmente, são liofilizadas usando o mesmo processo descrito acima.
[0054] A invenção também visa composições farmacêuticas formando as nanoparticulas pegilatadas descritas e opcionalmente uma molécula ativa. As preparações farmacêuticas adequadas são aquelas conhecidas por uma pessoa especializada em formulações enterais, preferivelmente formulações orais e parenterais, tal como infusões e formulações tópicas, tal como formulações oftálmicas. As formulações deverão abranger os excipientes adequados para cada formulação. Por exemplo, no caso de formulações orais na forma de comprimido ou cápsula, serão incluídos aglutinantes, agentes desintegrantes, agentes lubrificantes, agentes de enchimento, revestimento entérico, etc. se necessário. As formulações orais são preparadas convencionalmente misturando a granulação seca ou úmida e incorporando as nanopartículas pegilatadas da invenção.
[0055] Num aspecto da invenção, as nanopartículas pegilatadas são administradas por uma via que fornece acesso a uma mucosa do organismo (incluindo administração oral, retal, nasal, vaginal e ocular).
[0056] Quando as nanopartículas pegilatadas são administradas parenteralmente, elas são usadas para modificar a distribuição da molécula biologicamente ativa associada e/ou das nanopartículas convencionais. No caso de formulações parenterais, são usadas suspensões estéreis ou um liofilizado das nanopartículas e um transportador de reconstituição, tal como, uma solução salina fisiológica. Excipientes, tais como, agentes de criopreservação, soluções de regulação de pH e surfatantes podem ser incorporados se necessário.
[0057] As nanopartículas pegilatadas descritas e suas formulações podem ser usadas como uma base para a administração de moléculas biologicamente ativas. Uma molécula ativa é entendida como qualquer composto quimico administrado para um paciente, preferivelmente um ser humano, para propósitos profilácticos ou terapêuticos. Naturalmente o termo também inclui compostos macromoleculares, tais como, proteínas, peptideos, ácidos nucleicos, etc. As nanoparticulas pegilatadas são usadas para modificar a distribuição da molécula biologicamente ativa associada.
[0058] Numa variante, a molécula ativa é proveniente do grupo formado por DNA, RNA, nucleosideos, nucleotideos, oligonucleotideos ou polinucleotideos. Numa outra variante, a molécula ativa vem dos grupos de proteina ou peptideo.
[0059] Podem ser incorporadas moléculas ativas dos grupos formados por agentes antitumores ou agentes antigênicos para tumores, dos grupos formados por agentes protetores do sistema nervoso central ou glucocorticóides, etc. Alternativamente, a molécula ativa é um antigeno para vacinação ou um alérgeno para imunoterapia.
[0060] Numa variante da invenção, as nanoparticulas pegilatadas também podem ser usadas como adjuvantes de vacina.
[0061] A incorporação da droga às nanoparticulas da invenção pode ser realizada conforme descrito em WO 02/069938, através da incorporação à solução de polimero antes da formação da nanoparticula ou adicionando-a subseqüentemente na suspensão aquosa das nanoparticulas já formadas. Por exemplo, e dependendo da natureza da droga, pode ser usado o seguinte processo: a) Drogas hidrofóbicas: adição à fase orgânica (acetona) e incubação/solubilização combinada com PVMMA e PEG por um periodo de tempo variável (até 1 hora) com agitação (agitação mecânica, magnética ou ultra-sônica). b) Drogas hidrofilicas: adição à fase orgânica (acetona) e incubação associada com PVMMA e PEG por um periodo de tempo variável (até 1 hora) com agitação (agitação mecânica, magnética ou ultra-sônica) até a obtenção de uma suspensão de acetona fina. Este processo foi usado com êxito para encapsular um modelo de proteína (ovalbumina, proteina de aproximadamente 44 KDa). A incorporação foi eficaz, permitindo encapsulamento elevado do modelo de proteina. c) Drogas hidrofilicas: Adição na fase aquosa para incubar com as nanoparticulas pré-formadas (este é o caso usado para encapsular dois marcadores fluorescentes usados nos exemplos: FITC e RBITC).
[0062] A invenção está descrita abaixo por meio de vários exemplos não-limitantes e ilustrativos. EXEMPLOS
[0063] Foram usadas várias técnicas para a caracterização fisico-quimica das novas nanoparticulas. A dimensão e o potencial zeta das nanoparticulas são determinados através de um aparelho Zetamaster (Malvern, Reino Unido) . O formato das nanoparticulas pode ser observado através de microscopia por transmissão de elétrons (Zeiss, Alemanha) após a marcação das amostras com ácido fosfotúngstico. Exemplo 1: Preparação de nanoparticulas pegilatadas com polietilenoglicol 2000 (PEG - NP) Foram testados dois processos: -mistura de dois polímeros na fase orgânica -revestimento das nanoparticulas pré-formadas com PEG
[0064] Os rendimentos do processo de fabricação de nanoparticulas pegilatadas são obtidos por meio da determinação de seu peso ao final do processo e após sua liofilização. Os rendimentos de fabricação são expressos em porcentagens, calculados com relação à massa inicial do PVM/MA-copolimero e do polietilenoglicol. A quantidade de polietilenoglicol associada às nanopartículas é determinada por colorimetria (Labsystems iEMS Reader MF) , sendo calculada como uma diferença entre a quantidade inicial usada e a quantidade encontrada nos superflutuantes obtida durante a preparação das nanopartículas. 1.1. Associação do polietilenoglicol ao copolimero de éter de metil vinil e anidrido maléico na fase orgânica
[0065] Este processo é realizado através da incubação simultânea do PVM/MA e PEG 2000 na fase orgânica.
[0066] Para isso, 100 mg do PVM/MA são dissolvidos em 5 ml do solvente orgânico (acetona). Depois é acrescentado PEG 2000 a esta solução (10 - 50 mg). A mistura é deixada reagir através de agitação magnética por 1 hora. Então 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta fase. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos são removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão das nanopartículas formadas. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3k30, Alemanha). Os superflutuantes são coletados para avaliações analíticas, ao passo que o residue é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v) . A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA)
[0067] As nanopartículas obtidas possuem uma forma esférica parecida com as nanopartículas convencionais (Figura 1 b) . As propriedades destas nanoparticulas pegilatadas estão incluídas na Tabela 1. A associação do PEG 2000 às nanoparticulas provoca um aumento na polidispersão da população. Foi observado que com um aumento na quantidade de polietilenoglicol (relação 1:2), o tamanho e especialmente a polidispersão tornam-se muito altos. As observações do potencial de superfície das nanoparticulas mostram valores negativos inferiores para as nanoparticulas pegilatadas. Estes resultados sugerem a presença de cadeias de polietilenoglicol na superfície das nanoparticulas. Finalmente, deve ser indicado que com relações de PEG 2000 : PVM/MA menores que 1:4 w/w, a quantidade de PEG associado às nanoparticulas é mantida constante e próxima de 50 |lg/mg. Tabela 1. Influência da quantidade de PEG 2000 nas características físico-químicas das nanoparticulas. Os dados expressam a mídia ± S.D. (n=3).
Figure img0001
* Quantidade de PEG 2000 associado às nanoparticulas (expresso como |ig PEG/mg nanoparticulas) de acordo com o método colorimétrico. 1.2. Associação do polietilenoglicol a nanoparticulas pré- formadas
[0068] 100 mg de PVM/MA são dissolvidos em 5 ml do solvente orgânico (acetona) . Em seguida, 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta solução através de agitação. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Depois a suspensão da nanoparticula é evaporada sob pressão reduzida até que ambos os solventes sejam eliminados. 0 volume da nanossuspensão aquosa é ajustado com água para 5 ml e 5 ml de uma solução aquosa contendo entre 10 - 25 mg de PEG 2000 são acrescentados. A incubação das nanoparticulas na fase de polietilenoglicol é realizada através de agitação magnética por 1 hora. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes são removidos e o residuo é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v). A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA) .
[0069] A quantidade de polietilenoglicol associada às nanoparticulas é determinada pelo método colorimétrico indicado previamente. Os resultados mostram que por este processo, a quantidade de PEG associada às nanoparticulas é consideravelmente menor que através do processo descrito no Exemplo 1.1 (incubação na fase orgânica) (Figura 2) . A razão deste resultado é a alta afinidade do polietilenoglicol para água, portanto, não é obtida uma associação efetiva com os grupos carboxilicos vindo das hidrólises do copolimero nas partículas pré- formadas. Pode ser concluído que o método de obtenção de nanoparticulas pegilatadas por incubação simultânea do copolimero e do polietilenoglicol numa fase orgânica é mais eficiente que o simples revestimento das nanoparticulas pré- formadas com PEG. 1.3. Influência do peso molecular do PEG nas características físico-químicas das nanoparticulas pegilatadas
[0070] O processo é realizado através da incubação simultânea de PVM/MA e do polietilenoglicol desejado (PEG 400, PEG 1000 ou PEG 2000) conforme descrito no Exemplo 1.1.
[0071] Para isso, 100 mg de PVM/MA são dissolvidos em 5 ml do solvente orgânico (acetona) . Em seguida, 25 mg do PEG (400, 1000 ou 2000) são acrescentados. A mistura é deixada reagir através de agitação magnética por 1 hora. Depois, 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta fase. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos são removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão da nanoparticula. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes são removidos e o residue é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v) . A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA) .
[0072] As quantidades de PEG (400, 1000 ou 2000) e mPEG 2000 (Exemplo 2) são determinadas mediante avaliação colorimétrica. Para isso, 15 p.1 de uma solução de iodo (10 mg/ml de iodo; 20 mg/ml de iodeto de potássio) são acrescentados a 1 ml dos superflutuantes obtidos durante a etapa de purificação da nanoparticula. A absorbância do complexo obtido entre o PEG (ou mPEG) e o iodo é observada através de colorimetria em À, 540 nm (Sims &Snape, Anal. Biochem., 107 (1980) 60-63).
[0073] A Tabela 2 mostra a influência do peso molecular do PEG nas características fisico-quimicas das nanoparticulas obtidas. Devido a estes resultados, pode ser concluído que polietilenoglicóis de baixo peso molecular não são adequados para pegilação destas nanoparticulas. No caso do PEG 400, que é liquido, a associação não pode ser obtida e no caso do PEG 1000, a associação é muito baixa. Estes resultados também são confirmados a partir do estudo da carga superficial das partículas. O potencial zeta das nanoparticulas modificadas com PEG 400 ou PEG 1000 é sempre mais negativo que aquele de partículas pegilatadas com PEG 2000, sendo parecido com aquele de partículas não- revestidas. Pode ser concluído que a pegilação com PEG 2000 é muito mais eficiente. Tabela 2. Influência do peso molecular do PEG nas características físico-químicas das nanoparticulas pegilatadas (relação PEG/PVM-MA = 0,25). Os dados expressam a média ± S.D. (n=3).
Figure img0002
* NP – nanopartículas não tratadas com PEG ** ND – não detectável 1Determinação da quantidade de PEG associada às nanopartículas por ressonância nuclear magnética (método descrito no Exemplo 5). Exemplo 2: Preparação de nanopartículas pegilatadas com éter de metil de polietilenoglicol 2000 (mPEG-NP)
[0074] Este processo é realizado através de incubação simultânea do PVM/MA e mPEG em uma fase orgânica.
[0075] Para isso, 100 mg de copolimero PVM/MA são dissolvidos em 5 ml do solvente orgânico (acetona). Em seguida, uma quantidade do mPEG 2000 é acrescentada a esta solução (10 - 50 mg) . A mistura é deixada reagir através de agitação magnética por 1 hora. Depois, 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta fase. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos são removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão da nanoparticula. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes são removidos e o residue é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v). A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA).
[0076] A Figura 1 (c) mostra que as nanoparticulas revestidas com mPEG 2000 possuem uma forma esférica e a superfície parece ser uniforme. A Tabela 3 mostra o nivel de associação do mPEG 2000 nas nanoparticulas e sua influência na dimensão, polidispersão e carga superficial das nanoparticulas. Os resultados mostram que com um aumento na quantidade inicial do mPEG 2000, a porcentagem associada às nanoparticulas aumenta levemente.
[0077] A presença do mPEG aumenta a polidispersão da população de nanoparticulas, especialmente numa alta concentração (relação mPEG/PVM-MA maior que 0,25) . Por outro lado, a carga negativa das nanoparticulas reduz quando a quantidade do mPEG usado aumenta. Entretanto, os desvios consideráveis observados quando são usadas altas quantidades do mPEG sugerem que a distribuição superficial das cadeias de mPEG 2000 não é homogênea. Tabela 3. Influência da quantidade do mPEG 2000 nas características fisico-quimicas das nanopartículas. Os dados expressam a média ± S.D. (n=3).
Figure img0003
* Quantidade de mPEG 2000 associado às nanopartículas (expresso como |lg mPEG/mg nanopartículas) de acordo com o método colorimétrico. Exemplo 3: Preparação de nanopartículas pegilatadas com O,O'-Bis-(2- aminoetil) polietilenoglicol 2000 (DAE-PEG-NP)
[0078] Este processo é realizado através de incubação simultânea do PVM/MA e DAE-PEG 2000 em uma fase orgânica.
[0079] Para isso, uma determinada quantidade de DAE-PEG (5, 10, 25 ou 35 mg) é dissolvida em 5 ml do solvente orgânico (acetona). Em seguida, 100 mg de PVM/MA são acrescentados a esta solução através de agitação magnética. A mistura resultante é deixada reagir através de agitação magnética por 1 hora. 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta fase orgânica através de agitação. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos são removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão da nanoparticula. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes são removidos e o residue é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v) . A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA).
[0080] A quantidade do DAE-PEG e do DAP-PEG (exemplo 4) é determinada após a adição do reagente Micro BOA™ Protein Assay Reagent Kit (Pierce, EUA) aos superflutuantes obtidos da etapa de purificação da nanoparticula. Este reagente é capaz de interagir com os grupos amino destes polietilenoglicóis dando origem a um complexo colorido. Para isso, 150 |11 do reagente são acrescentados ao mesmo volume do superflutuante. A absorbância é determinada por colorimetria em À. 570 nm após incubação por duas horas em 37°C.
[0081] A Figura 1 (d) mostra que as nanopartículas revestidas com DAE-PEG 2000 possuem uma forma esférica. A Tabela 4 mostra o nivel de associação do DAE-PEG 2000 e sua influência na dimensão, polidispersão e carga superfície das nanopartículas. Os resultados mostram que aumentando a quantidade de DAE-PEG 2000 (de 5 para 35 mg) , aumenta a quantidade do excipiente ligado às nanopartículas. Entretanto, quando a quantidade do DAE-PEG 2000 usado é maior que 25 mg, as nanopartículas não são formadas.
[0082] Ao analisar o tamanho, observa-se que o aumento do grau de associação produz nanopartículas com um tamanho maior e grande polidispersão. Portanto, quando produzidas nanopartículas DAE-PEG com 25 mg, as partículas resultantes apresentam um tamanho maior que 500 nm e muito alta polidispersão. Por outro lado, é observado uma redução na carga superficial negativa das nanoparticulas revestidas em comparação com aquelas não-revestidas. Estes dados sugerem que as cadeias DAE-PEG 2000 estão presentes na superfície das nanoparticulas. Tabela 4. Influência da quantidade de DAE-PEG nas características fisico-quimicas das nanoparticulas. Os dados expressam a média ± S.D. (n=3).
Figure img0004
* Quantidade de DAE-PEG 2000 associado às nanoparticulas (expresso como |lg DAE-PEG / mg nanoparticulas) de acordo com o método colorimétrico. Exemplo 4: Preparação de nanoparticulas pegilatadas com O,O'-Bis-(2- aminopropil)- polipropilenoglicol - polietilenoglicol polipropilenoglicol 2000 (DAP-PEG-NP)
[0083] Este processo é realizado através da incubação simultânea do PVM/MA e DAP-PEG 2000 em uma fase orgânica.
[0084] Para isso, uma certa quantidade do DAP-PEG 2000 (10 - 50 mg) é dissolvida em 5 ml do solvente orgânico (acetona). Em seguida, 100 mg do copolimero éter de metil vinil e anidrido maléico são acrescentados a esta solução com agitação magnética. A mistura resultante é deixada reagir com agitação magnética por 1 hora. Em seguida, 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada são acrescentados a esta fase através de agitação. A mistura resultante é deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos são removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão da nanoparticula. A suspensão é submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes são removidos e o residuo é suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v). A suspensão da nanoparticula é finalmente congelada e liofilizada em um aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA) .
[0085] A Figura 1 (e) mostra que as nanopartículas revestidas com DAP-PEG 2000 possuem uma forma esférica e uma superfície uniforme. A Tabela 5 mostra as características gerais destas nanopartículas. Os resultados mostram que aumentando a quantidade de DAP-PEG 2000, aumenta sua quantidade associada às nanopartículas. Entretanto, quando a quantidade do DAP-PEG 2000 usado é maior que 35 mg, as nanopartículas não são formadas.
[0086] Observa-se que o aumento do grau de associação produz nanopartículas com um tamanho maior e também grande polidispersão. As observações do potencial zeta mostram uma redução significativa dos valores negativos obtidos para nanopartículas revestidas (valores próximos a zero) . Estes resultados sugerem que as cadeias do DAP-PEG 2000 estão preferivelmente localizadas na superfície das nanopartículas. Tabela 5. Influência da quantidade de DAP-PEG 2000 nas características fisico-quimicas das nanopartículas. Os dados expressam a média ± S.D. (n=3).
Figure img0005
* Quantidade de DAP-PEG 2000 associado às nanoparticulas (expresso como |ig DAP-PEG / mg nanopartículas) de acordo com o método colorimétrico. ** ND - não detectável Exemplo 5: Estudo do rendimento do processo e da estrutura das nanopartículas pegilatadas
[0087] A Figura 3 mostra a influência do tipo de polietilenoglicol na porcentagem de PVM/MA transformada em nanopartículas e no rendimento total do processo. Em geral, a porcentagem de copolimero transformado em nanopartículas é próxima de 73%. Observa-se que quando as nanopartículas são modificadas com PEG ou mPEG, a porcentagem de PVM/MA transformada em partículas não é modificada significativamente. Entretanto, a pegilação de nanoparticula com DAE-PEG ou DAP-PEG reduz o rendimento do processo.
[0088] A associação de polietilenoglicol a nanopartículas é confirmada pelo método de análise de elemento (Leco CHN-900, EUA). De acordo com esta técnica, eles podem apresentar alterações em sua composição de oxigênio, hidrogênio ou nitrogênio quando associados a outros componentes (por exemplo: PEG).
[0089] A Tabela 6 inclui a composição dos elementos C, H, O e N dos diferentes tipos de nanopartículas pegilatadas. Comparadas com as nanopartículas convencionais (NP), todas as nanoparticulas pegilatadas apresentam um aumento na porcentagem de hidrogênio (H) e uma redução relativa no seu conteúdo de oxigênio. Por outro lado, o DAE- PEG-NP e o DAP-PEG-NP mostram a presença de nitrogênio, o gue não é observado em nanoparticulas não-modifiçadas. Tabela 6. Comparação entre as porcentagens de elemento das nanoparticulas pegilatadas e partículas não-modifiçadas (NP) .
Figure img0006
[0090] A localização dos polietilenoglicóis (dentro ou na superfície das nanoparticulas) é analisada através de ressonância nuclear magnética (1H-NMR) (Bruker 400 Ultrashield™, Alemanha) após a dissolução de 5 mg das nanoparticulas pegilatadas em 0,5 ml de sulfóxido dimetil deuteratado. Os espectros das nanoparticulas pegilatadas com PEG e mPEG são obtidos após a aplicação de 6400 varreduras, ao passo que os espectros de DAE-PEG-NP e DAP-PEG-NP após 12800 varreduras. Os espectros mostram o pico de hidrogênio típico das unidades de polietileno (em 3,51 ppm, -OCH2CH2-) e os picos de hidrogênio dos grupos hidroxila (no caso de PEG e mPEG) ou os picos de hidrogênio dos grupos amino do DAE-PEG e do DAP-PEG (em 4,58 ppm) (Figura 4). É calculada uma relação dos valores das áreas destes dois picos nos espectros das partículas pegilatadas e nos espectros dos polietilenoglicóis livres. Os valores destas relações podem fornecer informações para localização das cadeias do polietilenoglicol nas nanoparticulas pegilatadas.
[0091] Observa-se que o pico de hidrogênio do grupo hidroxila (4,58 ppm) aparece no espectro das nanopartículas pegilatadas com PEG 2000 (Figura 5a). A Tabela 7 mostra a área dos dois picos mencionados anteriormente (em 3,51 ppm e 4,58 ppm) e as relações entre eles para PEG-NP e PEG livre. É calculado que a relação entre estes dois picos para nanopartículas é aproximadamente duas vezes maior que para o PEG 2000 livre. No caso destas nanopartículas, estes dados indicam que a proporção dos grupos hidroxila é duas vezes menor, portanto, pode-se concluir que um número significativo destes grupos funcionais (que não aparece no espectro) está anexado aos grupos anidrido do copolimero. De acordo com estas observações, uma pequena parte das cadeias do PEG 2000 estaria incluida dentro das nanopartículas, enquanto que a maioria das cadeias do PEG estaria disposta na superfície deste. Este fato confirma os dados do potencial zeta mostrados na Tabela 1.
[0092] A Tabela 7 mostra os dados referentes às áreas dos dois picos para m-PEG - NP e mPEG 2000 livre. Observa-se que a relação entre os dois picos das nanopartículas pegilatadas e do mPEG 2000 é similar (177 vs. 217) . Estes resultados mostram que a proporção do grupo hidroxila de mPEG nos dois casos (nanopartículas e mPEG livre) é semelhante e que uma pequena porcentagem reage com os grupos anidrido do copolimero. Pode-se concluir que a estrutura destas partículas é diferente daquela do PEG-NP. Neste caso, uma grande porcentagem das cadeias mPEG estaria incluida dentro e apenas uma pequena parte desta estaria localizada na superfície das nanopartículas. Portanto, a distribuição superficial das cadeias de mPEG não é homogênea, o que é consistente com os grandes desvios observados na análise do potencial zeta destas partículas (Tabela 3). Tabela 7. Análise dos espectros do PEG 2000 e das nanopartículas pegilatadas com PEG 2000 através do método de ressonância nuclear magnética (H-NMR).
Figure img0007
[0093] A Tabela 8 mostra os dados referentes às áreas de pico de DAP-PEG-NP e DAP-PEG 2000 livre. No espectro de DAP-PEG 2000, há dois sinais correspondentes aos hidrogénios de dois grupos amina diferentes localizados nas extremidades de sua cadeia: um par em δ = 4,55 ppm e um outro em δ = 4,45 ppm (Figura 6 b) . Observa-se que no espectro das nanopartículas pegilatadas com DAP-PEG 2000, não há hidrogênio destes grupos amina (Figura 6a), o que indica que todos os grupos amina deste tipo de polietilenoglicol reagem com os grupos anidrido do polimero que forma as nanopartículas. Além disso, as cadeias do DAP- PEG estariam anexadas na superfície das nanopartículas nas extremidades dos dois grupos amina e o revestimento superficial estaria completo. Isto seria suportado pelos valores do potencial zeta (próximos a zero) destas partículas (Tabela 5). Tabela 8. Análise dos espectros de DAP-PEG 2000 e das nanopartículas pegilatadas (DAP-PEG - NP) através do método de ressonância nuclear magnética (H-NMR).
Figure img0008
[0094] No caso de DAE-PEG 2000, não é possível calcular a mesma relação entre os dois picos porque o pico em 4,58 ppm apresenta uma intensidade muito baixa e baixa resolução (independente da concentração e do número de varreduras realizado) (Figura 7 b). De qualquer maneira, pode-se observar que este pico aparece no espectro das nanopartículas bem como no espectro do DAE-PEG 2000. Portanto, pode-se concluir que parte das cadeias de DAE-PEG estaria incluída dentro das partículas. Entretanto, a maior parte dela estaria localizada apenas na superfície anexa à extremidade da cadeia deste polietilenoglicol.
[0095] Com relação a estes dados, pode-se concluir que as nanopartículas pegilatadas têm uma estrutura diferente. A estrutura proposta para as diferentes formulações está mostrada na Figura 8. Certos polietilenoglicóis, tais como, PEG 2000, DAE-PEG e DAP-PEG, modificam a superfície das nanopartículas desenvolvidas. No caso de PEG-NP e DAE-PEG-NP, o revestimento daria origem a uma estrutura tipo "pincel" (Figura 8 a e c), enquanto que, no caso do DAP-PEG, as cadeias seriam ligadas nas duas extremidades dando origem a uma formação tipo "loop"(Figura 8 d) . O único caso em que não se observa modificação da superfície da nanoparticula é quando se utiliza o mPEG 2000. mPEG seria encontrado na maior parte dentro das nanoparticulas (Figura 8 b). Exemplo 6: Estudo das características bioadesivas das nanoparticulas pegilatadas no trato gastrintestinal de ratos
[0096] Este estudo foi realizado de acordo com as regulamentações do Comitê de Ética da Universidade de Navarra em conformidade com as leis européias sobre experimentações com animais (86/609/EU).
[0097] As nanoparticulas pegilatadas usadas nesta análise foram marcadas fluorescentemente com isotiocianato de rodamina B. Para isso, as nanoparticulas são formadas por meio de incubação simultânea do PVM/MA e dos diferentes tipos de polietilenoglicóis (de acordo com o processo apresentado nos Exemplos 1.1, 2, 3 e 4) . Em seguida, 10 ml de etanol e 10 ml de água destilada foram acrescentados a esta fase com agitação. A mistura resultante foi deixada homogenizar durante 5 minutos. Os solventes orgânicos foram removidos por evaporação sob pressão reduzida (Buchi R-144, Suiça), concentrando a suspensão da nanoparticula. O volume da nanossuspensão aquosa foi ajustado com água para 9 ml e adicionado 1 ml de uma solução aquosa de isotiocianato de rodamina B (1,25 mg/ml). A incubação das nanoparticulas com o marcador fluorescente é realizada com agitação durante 5 minutos. Depois a suspensão de nanoparticula fluorescentemente modificada foi submetida à purificação por centrifugação (20 minutos em 17000 rpm, duas vezes) (Sigma 3K30, Alemanha). Os superflutuantes foram removidos e o residue suspenso novamente em uma solução aquosa de sacarina (5% w/v). A suspensão da nanoparticula foi finalmente congelada e liofilizada num aparelho Genesis 12EL (Virtis, EUA).
[0098] A Tabela 9 inclui as características das formulações usadas nesta análise e marcadas fluorescentemente com isotiocianato de rodamina B. Tabela 9. Características fisico-quimicas das nanopartículas consideradas no estudo de bioadesão. Média ± SD (n=3).
Figure img0009
* Quantidade de polietilenoglicol associado às nanopartículas (|lg PEG/mg nanopartículas). ** A quantidade de isotiocianato de rodamina B ligado às nanopartículas (expresso em |ig/mg nanopartículas) é determinada através de colorimetria em 540 nm.
[0099] As nanopartículas obtidas (10 mg) são administradas oralmente nos ratos machos (tipo Wistar, peso de 220, 0 g) após sua dispersão em 1 ml de água. Após a administração oral, os animais são sacrificados através de deslocamento cervical em diferentes horários: 0.5, 1, 3 e 8 horas. A cavidade abdominal é aberta e o trato gastrintestinal extraido. A área é dividida nas seguintes partes anatômicas: estômago, intestino delgado e ceco. Cada segmento é aberto longitudinalmente através do mesentério, sendo depois lavado com uma mistura tampão de fosfato salino (pH = 7,4; 0,15 M) para remoção da fração de nanoparticula não-aderida. Além disso, cada segmento é cortado em porções com comprimento de 2 cm digerido por 24 horas com 1 ml de hidróxido de sódio 3M (Arbos et al. , Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136). Em seguida, a rodamina é removida com 2 ml de metanol e as amostras são centrifugadas durante 10 minutos a 4000 rpm. Os superf lutuantes (1 ml) são diluidos com 3 ml de água e a quantidade de rodamina é determinada por meio de espectroscopia por fluorescência em Zθx = 540 nm e Àem = 580 nm (GENios, Áustria). A fração de nanoparticulas aderida à mucosa pode ser estimada de acordo com este processo.
[00100] A distribuição especifica de nanoparticulas pegilatadas nas diferentes partes do trato gastrintestinal está mostrada na Figura 9. Todas as formulações exibiram uma adesão inicial significativa à mucosa do estômago. A porcentagem da dose aderida a este órgão 30 minutos após sua administração está situada entre 13% para PEG-NP e 9% para DAP-PEG-NP. Todas as formulações de nanoparticula pegilatada também apresentaram uma certa afinidade para a porção I3 do intestino delgado; entretanto, PEG-NP e DAE-PEG-NP foram as formulações mais eficientes 3 horas após a administração para manutenção das quantidades aderidas ao intestino delgado, próximo de 20% da dose. Finalmente, o pico de nanoparticulas aderidas 8 horas após a administração foi encontrado na última porção do intestino delgado (para PEG-NP) ou no ceco (para mPEG-NP e DAP-PEG- NP) . Uma fração relativamente significativa (próximo de 10%) das nanoparticulas aderidas à mucosa poderia ainda ser quantificada no caso do PEG-NP e DAP-PEG-NP. Em conclusão, pode-se afirmar que as nanoparticulas revestidas com PEG 2000 e mPEG 2000 apresentam uma distribuição muito homogênea e são disseminadas em todas as partes do trato em 8 horas (Figura 9 a e b). As nanoparticulas pegilatadas com DAE-PEG estão preferivelmente aderidas nas porções intermediárias do intestino delgado (Figura 9 c) , ao passo que as nanopartículas modificadas com DAP-PEG 2000 estão acumuladas principalmente nas regiões periféricas do trato intestinal (Figura 9 d) . Estes resultados significam que as nanopartículas neste desenvolvidas podem fornecer uma liberação de droga especifica.
[00101] Parâmetros de bioadesão (Arbos et al., Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136) : A curva de adesão de cada formulação foi obtida representando a fração aderida das nanopartículas pegilatadas na mucosa gastrintestinal dos ratos através do tempo. Foram calculados os seguintes parâmetros de bioadesão a partir desta curva: AUCadh, kadh e MRTadh. kadh representa a taxa de eliminação da fração aderida e foi calculada com a ajuda do programa WinNonlin versão 1.5 (Scientific Consulting, Inc.). AUCadh, ou área embaixo da curva de representação da fração aderida através do tempo (expressa na forma de quantidade do marcador aderido com relação ao tempo) foi avaliada pelo método trapezoidal para tz (o último ponto de amostragem) e permite a quantificação da intensidade do fenômeno bioadesivo. Finalmente, MRTadh é o tempo de residência médio da fração aderida das nanopartículas, que permite a avaliação da duração relativa das interações adesivas, usando o último ponto de amostragem como limite.
[00102] A Figura 10 mostra os perfis bioadesivos das nanopartículas pegilatadas no trato gastrintestinal completo em 8 horas. Todas as nanopartículas pegilatadas apresentam perfis bioadesivos que são diferentes do perfil de partículas não-modifiçadas (NP). A bioadesão máxima para NP ocorre 30 minutos após sua administração oral e diminui rapidamente depois disso. Ao contrário, as nanopartículas pegilatadas geralmente têm menos capacidade inicial para desenvolver interações bioadesivas. Entretanto, a capacidade adesiva é mantida durante pelo menos 3 horas. Portanto, 3 horas após sua administração, a quantidade de nanopartículas aderidas à mucosa gastrintestinal está situada entre 25% da dose administrada para PEG-NP e 16% para DAP-PEG-NP, em todos os casos maior que o controle (NP). Por outro lado, o perfil obtido para PEG-NP é particularmente interessante. Estas nanopartículas exibem adesão máxima de 1 hora após sua administração (cerca de 32% da dose) e 3 horas após sua administração, os niveis das partículas aderidas à mucosa são semelhantes aos niveis iniciais. No caso de nanopartículas pegilatadas restantes, sua adesão inicial é mantida por pelo menos 3 horas.
[00103] Os parâmetros bioadesivos podem fornecer mais detalhes com relação às propriedades adesivas das nanopartículas (Tabela 10). Como exposto anteriormente, a capacidade inicial das nanopartículas pegilatadas interagir com a mucosa (Qma:/) é mais baixa em comparação com as partículas não-revestidas (NP) . Entretanto, a área de bioadesão embaixo da curva (AUCadh) das nanopartículas pegilatadas é superior; isto significa que a intensidade adesiva é grande. Este fenômeno é observado particularmente no caso do PEG-NP, onde AUCadh é 1,6 vezes maior que para NP. Além disso, todas as formulações de nanoparticula pegilatada têm um grau mais baixo de eliminação da fração aderida (kadh) e um tempo de residência maior (MRTadh) em comparação com as partículas não-revestidas. Portanto, DAP-PEG-NP apresenta uma eliminação mais lenta da fração aderida em relação às partículas convencionais, sugerindo um potencial bioadesivo de longa duração destas nanoparticulas. Observa-se que todas as nanoparticulas pegilatadas exibem um longo tempo de residência (MRTadh) no trato gastrintestinal. Com relação ao tempo de residência médio da fração aderida (MRTadh) , é particularmente interessante que todas as nanoparticulas pegilatadas mostram um tempo de residência médio significativamente maior que NP. Portanto, estas nanoparticulas apresentam tempos de residência situados entre 17 e 48 minutos maiores que as partículas convencionais. Tabela 10. Parâmetros de bioadesão das nanoparticulas pegilatadas calculados de acordo com sua distribuição no trato gastrintestinal completo através do tempo.
Figure img0010
Exemplo 7: Visualização das nanoparticulas pegilatadas na mucosa gastrintestinal.
[00104] As nanoparticulas pegilatadas são visualizadas na mucosa gastrintestinal por meio de fluorescência e microscopia óptica. Para isso, as nanoparticulas pegilatadas foram marcadas com moléculas fluorescentes, tais como, isotiocianato de rodamina B (RBITC) e isotiocianato fluorescente (FITC). Após a administração oral em ratos, diferentes porções do intestino são coletadas e lavadas com mistura tampão de fosfato salino (pH = 7,4; 0,15M), conforme descrito acima.
[00105] No primeiro caso, os segmentos do intestino (contendo as nanopartículas marcadas com RBITC) são fixados no meio Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura, Holanda) e congelados através de gelo seco e 2-metil butano. O segmento é então cortado em seções de 5 |lm em um criostato (Leica, Alemanha) em baixa temperatura (-22°C). As seções obtidas são colocadas em uma lâmina revestida com poli-L-lisina (Sigma, Espanha) e observadas sob um microscópio fluorescente (Olympus CH-40, Japão).
[00106] Por outro lado, os segmentos intestinais (contendo nanopartículas marcadas com FITC) são fixados em uma solução de formalina (4%) por 24 horas. Após a fixação, os tecidos são incluídos em parafina e depois cortados em seções de 3 |lm. Estas seções são colocadas em uma lâmina revestida com Vectabond (Vector Labs, EUA) . Em seguida, as seções obtidas são deparafinizadas, reidratadas e a peroxidase endógena é bloqueada através da adição de uma solução de peróxido de hidrogênio (3%) por 10 minutos. Depois os suportes são lavados com água destilada (5 min) , colocados em tampão de citrato (pH = 6,0; 0,01M), aquecidos em um microondas (15 minutos na potência máxima e 15 minutos na potência minima), lavados com água e finalmente com tampão salino Tris (TBS) (pH = 7,36; NaCl 0,5M; 0,05M). Para evitar marcação não-especifica, as seções são incubadas com soro de cabra normal (1:20, DAKO, EUA) sob temperatura ambiente durante 30 minutos e depois com o anti-soro especifico (1:100 monoclonal anti-FITC, M0878, DAKO, EUA) em 4 °C por 24 horas. Após a lavagem com o tampão salino Tris (TBS), as amostras são incubadas com o anticorpo secundário Ig anti-rato de cabra acoplado ao Dextrano marcado com peroxidase (temperatura ambiente, 30 minutos). As amostras são lavadas com o tampão TBS e a atividade de peroxidase é desenvolvida com uma solução de diaminobenzidina. As seções são fracamente contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas em DPX. As amostras são finalmente visualizadas sob um microscópio óptico (Nicon Eclipse E 800M, Japão).
[00107] A Figura 11 mostra a presença do PEG- NP nas células epiteliais do intestino delgado. As partículas geralmente estão localizadas no compartimento apical das células (Figura 11 a) , embora certas frações que penetraram entre as células do epitélio intestinal possam ser observadas (Figura 11 b).
[00108] A penetração intensiva das nanopartículas nos enterócitos pode ser observada através de microscopia óptica (Figura 12) . Como na microscopia fluorescente, é observada a distribuição no compartimento apical das células. Por outro lado, a Figura 12 b também mostra uma distribuição no compartimento basolateral. Observa-se que alguns núcleos das células incluem o marcador ou nanopartículas marcadas, o que permite supor que o uso destas nanopartículas pode ser interessante para promover a distribuição aos núcleos das diferentes moléculas biologicamente ativas.
[00109] Finalmente, a Figura 13 mostra a distribuição destes sistemas em células do fragmento de Peyer. A observação de que estas nanopartículas parecem estar concentradas na área conhecida como "cúpula" do fragmento de Peyer é particularmente interessante. A cúpula é caracterizada por ser a área onde se acumulam as células do sistema monócito-macrófago. Isto permite assegurar interesse destas nanopartículas pegilatadas para desenvolvimento de vacinas orais e em imunoterapia.

Claims (21)

1. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", caracterizadas por serem formadas por um polimero biodegradável e um polietilenoglicol ou derivativos destes; o polimero biodegradável ser ainda, um copolimero de éter de metil vinil e anidrido maleico (PVM/MA); o copolimero possuir um peso molecular localizado entre 180 e 250 kDa; e o glicol de polietileno ser selecionado a partir do grupo formado por Polietilenoglicol 2000, mPEG 2000 (éter de metil glicol de polietileno), DAE-PEG 2000 (O,O-bis-(2-aminoetil)- polietilenoglicol) e o DAP-PEG 2000 (O,O-bis (2-aminopropil) propilenoglicol-polietilenoglicol-polipropilenoglicol.
2. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por a relação de peso entre o polietilenoglicol e o polímero biodegradável ser de 1:2- 6, de preferência 1:2-4, mais preferivelmente cerca de 1:4.
3. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizadas por compreenderem uma proteína ou peptídeo como molécula ativa.
4. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas por compreenderem um composto selecionado a partir do grupo formado por DNA, RNA, nucleósidos, nucleotídeos, oligonucleotídeos ou polinucleotídeos como molécula ativa.
5. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por compreenderem um agente antitumoral ou um antigeno para tumores como molécula ativa.
6. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadas por compreenderem um agente protetor do sistema nervoso central ou um glicocorticoide como molécula ativa.
7. "NANOPART ÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadas por compreenderem um antigeno para vacinação ou um alérgeno para imunoterapia como molécula ativa.
8. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", caracterizada por compreender as nanoparticulas pegiladas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, juntas com um excipiente, transportador ou adjuvante.
9. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por ser administrada por uma via que fornece acesso a uma mucosa do organismo, de preferência oralmente, retalmente, nasalmente, vaginalmente ou ocularmente.
10. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser para administração oral.
11. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser para administração oftálmica.
12. "NANOPARTÍCULAS PEGILADAS PARA TRANSPORTE DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas por serem usadas na fabricação de um medicamento.
13. "LIOFILIZADO CONSTITUINDO NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", caracterizado por compreender nanopartículas pegiladas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
14. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", em específico, as nanopartículas pegiladas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender as etapas de: i) incubação simultânea do polímero biodegradável (0,001 - 10% p/v) e do polietilenoglicol ou um dos derivados (0,001 - 5 % p/v) em um solvente orgânico; ii) incubação realizada sob agitação por um determinado período de tempo; iii) adição de solução hidroalcoólica numa relação fase orgânica/solução hidroalcoólica de 1/1 a 1/10; iv) remoção do solvente orgânico por evaporação ou outro processo adequado; v) purificação e vi) liofilização.
15. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS" de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a concentração do polímero biodegradável estar situada entre 0,001 e 10% p/v e a concentração do polietilenoglicol entre 0,001 e 5% p/v.
16. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 e 15, caracterizado por a relação da fase orgânica/solução hidroalcoólica estar compreendida na faixa entre 1/1 e 1/10.
17. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado por compreender etapas adicionais para remoção de solventes orgânicos e/ou purificação.
18. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a molécula ativa ser adicionada na etapa de incubação simultânea do polimero e do polietilenoglicol em um solvente orgânico.
19. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a molécula ativa ser adicionada na suspensão aquosa das nanoparticulas já formadas.
20. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado por compreender uma etapa de liofilização adicional, opcionalmente na presença de um agente crioprotetor, de preferência sacarina ou manitol.
21. "PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS PEGILADAS", de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 20, caracterizado por o polímero biodegradável ser o copolímero de éter de metil vinil e anidrido maléico (PVM/MA), de preferência com um peso molecular situado entre 100 e 2400 kDa.
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