ES2333659T3 - Nanoparticulas pegiladas. - Google Patents
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Abstract
Nanopartículas que comprenden un polímero biodegradable, preferentemente el copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) , y un polietilenglicol o derivados de éste. Estas nanopartículas son fáciles de producir, y dan excelentes características de bioadhesion, tamaño y potencial zeta que las hace adecuadas para la administración de moléculas activas. La selección del tipo de polietilenglicol utilizado en su producción permite modular convenientemente las características de estas nanopartículas lo cual puede ser aprovechado ventajosamente según el tipo de fármaco a transportar y/o el modo de administración de la formulación farmacéutica. La pegilación se realiza por incubación simple durante un corto periodo de tiempo de las dos macromoléculas en cuestión, sin necesidad de tener que recurrir al uso de disolventes orgánicos de elevada toxicidad, ni procedimientos de síntesis orgánica largos y penosos. Además, el proceso de pegilación se puede asociar al procedimiento de encapsulación de la molécula biológicamente activa.
Description
Nanopartículas pegiladas.
La invención se relaciona con nanopartículas
pegiladas a base de un polímero biodegradable y un polietilenglicol,
con procedimientos para su fabricación, con formulaciones que los
contienen y su utilización como sistema de administración de
fármacos.
En los últimos años las nanopartículas
poliméricas biodegradables han sido propuestas como nuevos sistemas
de administración de fármacos. Una de las características más
importantes que ofrecen es la liberación controlada del fármaco
incorporado. Esto conduce a una mayor eficacia terapéutica,
proporciona una administración más cómoda para el paciente y
permite evitar la sobredosificación. Además, fármacos con distintas
características fisicoquímicas pueden ser incluidos permitiendo
mejorar su estabilidad en los fluidos biológicos. Este hecho es de
gran importancia en el caso de antígenos, proteínas y macromoléculas
en general. Además, debido a su pequeño tamaño, las nanopartículas
son adecuadas para la administración de fármacos por distintas vías
como oral, parenteral y ocular (Kreuter, Adv. Drug Del. Rev., 7
(1991) 71-86; Gref et al, Science, 263 (1994)
1600-1603; Zimmer and Kreuter, Adv. Drug Del. Rev.,
16 (1995) 61-73).
La vía oral es la ruta más conveniente y popular
para la administración de fármacos. Sin embargo, la
biodisponibilidad de una determinada molécula activa depende (i) de
las características de la molécula del fármaco y de la forma
farmacéutica y (ii) de las condiciones fisiológicas presentes en el
tracto gastrointestinal, como la presencia de enzimas
proteolíticas, los movimientos peristálticos y el metabolismo
presistémico. Los sistemas coloidales, como las nanopartículas, han
sido propuestos para superar algunos de estos obstáculos. En
principio, estos transportadores poseen una gran superficie
específica con lo que su interacción con el soporte biológico (la
mucosa gastrointestinal) está facilitada. Igualmente, el control de
la liberación del fármaco, permite prolongar en el tiempo el efecto
de moléculas con semi-vidas biológicas bajas. Por
otra parte, las nanopartículas pueden ser captadas por las células
de las placas de Peyer y por los folículos de tejido linfoide
(Hodges et al, J. Drug Target., 3 (1995)
57-60; Florence, Pharm. Res., 14 (1997)
259-266). Este fenómeno permite direccionar el
fármaco hacia la vía linfática y, en el caso de vacunas, facilitar
su presentación antigénica. Sin embargo, las nanopartículas
convencionales presentan algunas desventajas importantes con
respecto a su uso por vía oral: (i) cierta inestabilidad en los
líquidos gastrointestinales, (ii) un bajo grado de absorción
intestinal y (iii) un tropismo o adhesión no especifica en la
mucosa gastrointes-
tinal.
tinal.
La administración parenteral de nanopartículas
proporciona una liberación sistémica controlada que es adecuada
para fármacos con (i) baja biodisponibilidad oral, (ii) corta
semi-vida biológica en plasma y (iii) estabilidad
limitada. Otra ventaja importante de las nanopartículas parenterales
es la oportunidad de concentrar el fármaco en un determinado
órgano. Sin embargo, las nanopartículas son reconocidas, capturadas
y eliminas rápidamente de la circulación sanguínea por los
macrófagos del sistema fagocítico mononuclear (MPS) tras su
administración intravenosa. Este fenómeno limita su función en
liberación controlada así como la posibilidad de concentrar el
fármaco en tejidos distintos al MPS.
La administración oftálmica de sistemas de
liberación controlada presenta importantes ventajas para el
tratamiento de enfermedades oculares, aunque un efecto sistémico
también puede ser obtenido. Sin embargo, la ruta ocular está
asociada a la rápida eliminación de la formulación del área
precorneal debido al drenaje hacia el conducto
naso-lacrimal y a la dilución lacrimal. Estos
procesos dan lugar a que un porcentaje muy bajo del fármaco
administrado pueda penetrar a través de córnea y alcanzar los
tejidos intraoculares (menos del 5%). Este drenaje es el
responsable de la aparición de efectos sistémicos al administrar la
formulación por esta vía. Numerosos estudios han demostrado que el
uso de nanopartículas permite incrementar la cantidad de fármaco en
la conjuntiva y aumentar su biodisponibilidad, comparado con formas
oftálmicas convencionales como soluciones y pomadas (Gurny et
al, J. Controlled Rel., 6 (1987) 367-373;
Deshpande et al, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 15
(1998) 381-420). Los sistemas coloidales se pueden
administrar como simples gotas, evitando problemas de visión
debido a su baja viscosidad. La frecuencia de uso puede ser reducida
debido a la liberación sostenida del fármaco desde la matriz de las
nanopartículas. Sin embargo, las nanopartículas también muestran una
rápida eliminación desde el sitio de absorción.
Por lo tanto, aunque las nanopartículas son
potencialmente útiles para los distintos modos de administración
mencionados anteriormente, aún persisten problemas que dificultan su
uso. La modificación de las características de la matriz
polimérica, así como de su superficie puede proporcionar la solución
a alguno de los problemas descritos arriba.
Desde este punto de vista, la asociación o el
recubriendo de las nanopartículas con polímeros convenientes puede
modificar sus características fisicoquímicas e, indirectamente, su
distribución e interacción con el medio biológico. Una posible
estrategia es la unión de polietilenglicol (PEG) a las
nanopartículas, conocido como pegilación u obtención de
nanopartículas furtivas.
Con respecto a su uso por vía oral, la
asociación de polietilenglicoles a las nanopartículas convencionales
permite protegerlas contra el ataque enzimático en los líquidos
digestivos. Esto es debido al potencial de polietilenglicoles para
rechazar las proteínas (Gref et al, Science, 263 (1994)
1600-1603). Igualmente, esta estrategia permitiría
minimizar su interacción con la mucina y otras proteínas presentes
en el lumen. Una estrategia similar ha sido aplicada al desarrollo
de las nanopartículas para uso ocular. Fresta y colaboradores
observaron un aumento significativo de la absorción ocular de
aciclovir tras su administración en nanoesferas de
poli(alquilcianoacrilatos) recubiertas con polietilenglicol
(Fresta et al, J. Pharm. Sci., 90 (2001)
288-297). Este fenómeno se explica por una mayor
interacción de las nanopartículas recubiertas con el epitelio
córneo.
Por vía intravenosa, distintas nanopartículas
recubiertas con polietilenglicol han demostrado una circulación
prolongada (Gref et al, Science, 263 (1994)
1600-1603; Stolnik et al, Pharm. Res., 11
(1994) 1800-1808; Bazile et al, J. Pharm.
Sci., 84 (1995) 493-498 ). Nanopartículas de
poli(lactico) (PLA) recubiertas con polietilenglicol tienen
una semi-vida plasmática mucho mayor (t½ = 6 h) que
cuando se recubren con albúmina o poloxamer (t½ =
2-3 minutos) (Verrecchia et al, J. Controlled
Rel., 36 (1995) 49-61). La presencia de las cadenas
hidrofílicas de polietilenglicol en la superficie de las
nanopartículas reduce significativamente su interacción con
proteínas sanguíneas (conocidas como opsoninas). Estas proteínas
promueven la fagocitosis formando un "puente" entre las
partículas y los fagocitos (Frank & Fries, Immunol. Today, 12
(1991) 322-326). Sin embargo, las propiedades
hidrofílicas de los polietilenglicoles no son el único factor
importante que proporciona una resistencia eficiente frente a la
opsonización. Otros polímeros hidrofílicos, como el polivinil
alcohol, han demostrado una baja capacidad protectora frente a la
opsonización de las nanopartículas (Leroux et al, Life Sci.,
57 (1995) 695-703). Por lo tanto, la estabilización
estérica proporcionada por la pegilación sería también debida a
otras propiedades fisicoquímicas, como la alta flexibilidad de las
cadenas del PEG y a una conformación estructural específica
(Mosquiera et al, Biomaterials, 22 (2001)
2967-2979).
La dificultad principal de esta nueva estrategia
es la estabilidad de la asociación de polietilenglicoles a la
superficie de las nanopartículas (Peracchia et al, Life Sci.,
61 (1997) 749-761). Se sabe que la capacidad del
polietilenglicol para rechazar las proteínas depende de la
configuración, de la carga, de la longitud y de la flexibilidad de
las cadenas (Torchillin, J. Microencaps., 15 (1998)
1-19). El procedimiento para la modificación de la
superficie de las nanopartículas se realiza principalmente por
adsorción física (Stolnik et al, Adv. Drug Del. Rev., 16
(1995) 195-214) o por unión covalente (De Jaeghere
et al, J. Drug Target., 8 (2000) 143-153).
Sin embargo, la desventaja de la adsorción simple es la rápida
perdida del recubrimiento debido a la inestabilidad de la
interacción. Puesto que la unión covalente es preferible, la mayoría
de las nanopartículas pegiladas han sido preparadas usando
copolímeros de polietilenglicol con acido lactico o glicolico. Sin
embargo, el proceso de la copolimerización requiere el uso de varios
catalizadores y de condiciones químicas específicas (Beletsi et
al, Int. J. Pharm., 182 (1999) 187-197). Además,
los residuos de disolventes orgánicos tóxicos, utilizados en la
síntesis orgánica (cloruro de metileno, tolueno etc.), pueden ser
problemáticos.
Por lo tanto aún subsiste la necesidad de
obtener nanopartículas que sean estables en administración oral,
que mantengan el recubrimiento hidrofílico y que presenten buenas
características bioadhesivas y especificidad en el tracto
gastrointestinal. Para ser efectivas deben ser poco tóxicas,
biodegradables y de fácil producción.
El objeto de la presente invención es
proporcionar nanopartículas que solucionen los problemas mencionados
anteriormente, es decir que tengan estabilidad y especificidad en
administración oral, que tengan buenas características bioadhesivas
para interacción con mucosas, que sean capaces de transportar un
amplio rango de moléculas activas, que liberen la molécula activa
de forma controlada y que eviten su eliminación del sistema
sanguíneo, especialmente cuando son administradas por vía
parenteral.
Se ha encontrado que nanopartículas formadas por
un polímero biodegradable y polietilenglicol resuelven estos
problemas. Especialmente se ha encontrado que nanopartículas
formadas por un copolímero de polivinil metil éter y anhidrido
maleico y polietilenglicol son fáciles de producir, y dan
excelentes características de bioadhesion, tamaño y potencial zeta
que las hace adecuadas para la administración de moléculas activas.
Además se ha encontrado que la selección del tipo de
polietilenglicol utilizado en su producción permite modular
convenientemente las características de estas nanopartículas lo cual
puede ser aprovechado ventajosamente según el tipo de fármaco a
transportar y/o el modo de administración de la formulación
farmacéutica.
Por lo tanto, en un primer aspecto la invención
se relaciona con pegiladas para el transporte de moléculas
biológicamente activas que comprenden un polímero biodegradable y un
polietilenglicol o sus derivados. En una variante el polímero
biodegradable es un copolímero de metil vinil éter y anhídrido
maleico (PVM/MA).
El polietilenglicol tiene de forma preferente un
peso molecular comprendido entre 400 y 35.000 Da. El
polialquilenglicol da buenos resultados cuando se selecciona del
grupo de polietilenglicoles, polipropilenglicoles, copolimeros
bloque o al azar que incluyen los dos tipos de unidades, sus mezclas
o sus derivados. Opcionalmente al menos un grupo hidroxilo terminal
del polietilenglicol está substituido, preferentemente con un grupo
alcoxi, acrilatos, metacrilatos, alquilo, amino, fosfato,
isotiocianato, sulfhidrilo, mercapto o sulfato.
En una variante de la invención la relación en
peso entre el el polietilenglicol y el polímero biodegradable es de
1:2-6, preferentemente de 1:2-4, más
preferentemente alrededor de 1:4.
Las nanopartículas pegiladas de la invención
pueden llevar incorporada una molécula activa como por ejemplo
proteinas, péptidos, ADNs, ARNs, nucleosidos, nucleotidos,
oligonucleotidos o polinucleotidos. En cuanto a su actividad, puede
ser un agente antitumoral o un antigeno para tumores, o bien un
protector del sistema nervioso central o un glucocorticoide, o bien
un antígeno para vacunación o un alergeno para inmunoterapia, entre
otros.
En otro aspecto la invención se relaciona con
una composición farmacéutica que comprende nanopartículas pegiladas
como se acaban de describir. En una variante la formulación es para
administración oral. En otra es para administración parenteral o
para administración a través de mucosas (por ejemplo oftálmica).
Por lo tanto, las nanopartículas pegiladas de la
invención se pueden utilizar en la fabricación de un medicamento.
Opcionalmente puede estar en forma de liofilizado.
En otro aspecto la invención se relaciona con un
procedimiento de preparación de las nanopartículas pegiladas que se
describen y que comprende la etapa de incubación simultánea del
polímero y el polietilenglicol en un disolvente orgánico, previa a
la desolvatación del polímero con una solución hidroalcohólica. En
una variante la concentración del polímero biodegradable está
comprendida entre 0,001 y 10% p/v y la del polietilenglicol entre
0,001 y 5% p/v. Opcionalmente la relación fase orgánica/solución
hidroalcohólica está compredida en el rango entre
1/1-1/10.
El procedimiento puede comprender además etapas
adicionales de eliminación de los disolventes orgánicos y/o
purificación, así como etapas de estabilización de las
nanopartículas pegiladas mediante el uso de agentes reticulantes.
La molécula biológicamente activa se puede incorporar a la etapa de
incubación simultánea del polímero y el polietilenglicol en un
disolvente orgánico, o bien posteriormente a la suspensión acuosa de
las nanopartículas ya formadas para que se produzca su
asociación.
Figura 1. Fotografías de microscopía electrónica
de transmisión (TEM) de los diferentes tipos de nanopartículas - (a)
NP; (b) PEG NP; (c) mPEG NP; (d) DAE-PEG NP; (e)
DAP-PEG NP. La escala presenta 150 nm.
Figura 2. Asociación del PEG 2000 (mg/mg) en
función del procedimiento utilizado: incubación simultánea de PEG y
PVM/MA en la fase orgánica (FO) o incubación de nanopartículas con
la solución acuosa (FA) del PEG.
Figura 3. Influencia del tipo de
polietilenglicol en el porcentaje de PVM/MA transformado en
nanopartículas (PVM/MA-e) y en el rendimiento del
proceso.
Figura 4. Espectros de resonancia magnética
nuclear de las nanopartículas pegiladas con PEG 2000 (arriba) y de
PEG 2000 libre (bajo). En el cuadro se muestra la imagen aumentada
del pico a 4,58 ppm (protones del grupo hidroxilo).
Figura 5. Detalles de los espectros de
resonancia magnética nuclear (a) de las nanopartículas pegiladas con
PEG 2000 y (b) de PEG 2000 libre, disueltas en DMSO (5 mg en 0,5
ml).
Figura 6. Detalles de los espectros de
resonancia magnética nuclear (a) de las nanopartículas pegiladas con
DAP-PEG 2000 y (b) del DAP-PEG 2000
libre, disueltas en DMSO (5 mg en 0,5 ml).
Figura 7. Detalles de los espectros de
resonancia magnética nuclear (a) de las nanopartículas pegiladas con
DAE-PEG 2000 y (b) del DAE-PEG 2000
libre, disueltas en DMSO (5 mg en 0,5 ml).
Figura 8. Estructuras propuestas para las
diferentes nanopartículas pegiladas a partir de los datos de
resonancia magnética nuclear y de los valores de potencial zeta -
a) PEG-NP; b) mPEG-NP; c)
DAE-PEG-NP; d)
DAP-PEG-NP.
Figura 9. Distribución de las nanopartículas
pegiladas en el tracto gastrointestinal tras su administración oral
en ratas: (a) PEG-NP, (b) mPEG-NP,
(c) DAE-PEG-NP y (d)
DAP-PEG-NP. Eje - x representa la
cantidad de nanopartículas (NP) adheridas (mg); Eje - y presenta
las distintas porciones del tracto (Est: estómago; I1, I2, I3, I4:
porciones intestinales; Ce: ciego); Eje - z representa el tiempo
después de la administración (horas).
Figura 10. Curvas de bioadhesión (NP, mg) de las
diferentes nanopartículas pegiladas en el tracto gastrointestinal
entero, tras la administración oral de una única dosis de 10 mg. t:
tiempo en horas
Figura 11. Imágenes de microscopía de
fluorescencia de una porción de íleo 2 horas después da la
administración oral de 10 mg de nanopartículas pegiladas con PEG
2000 (PEG-NP). a) villi de íleo: flechas muestran el
compartimento apical del epitelio; b) células del epitelio: flechas
muestran la fluorescencia entre los enterocitos. La escala presenta
20 \mum.
Figura 12. Imágenes de microscopía óptica del
segmento de íleo 2 horas después de la administración oral de 10 mg
de nanopartículas pegiladas con PEG 2000 (PEG-NP).
a) vista general (ampliación de 135) y b) detalle aumentado
(ampliación de 530). L: lumen; E: enterocitos; GC: células
productoras de mucus; flechas oscuras: núcleos de enterocitos;
flechas blancas: capilares sanguíneos en la submucosa.
Figura 13. Localización de
PEG-NP en una placa de Peyer de íleo, dos horas
después de la administración oral de 10 mg de las nanopartículas.
a) vista general de la placa de Peyer (ampliación de 135); b)
detalle aumentado (ampliación de 530); PP - placa de Peyer; FAE -
follicle-associated epithelium; flechas oscuras:
células del domo de la placa de Peyer donde estarían incluidas las
nanopartículas.
Sorprendentemente, se ha encontrado que la
modificación y recubrimiento de las nanopartículas de un polímero
biodegradable como el copolímero de metil vinil éter y anhídrido
maleico (PVM/MA) con diferentes polietilenglicoles permite la
obtención de nanopartículas con características fisicoquímicas, de
bioadhesion y de especificidad en administración oral que las
convierte en sistemas de gran interés como transportadores
especiales de fármacos. Las características de estas nanopartículas
se pueden modular ventajosamente según el tipo de polietilenglicol
utilizado y el procedimiento de preparación. Las nanopartículas
pegiladas de la invención pueden prolongar el tiempo de residencia
en la mucosa tras su administración oral u ocular. Estas
nanopartículas tienen interés para administración de fármacos con
ventanas estrechas de absorción y así mejorar su biodisponibilidad.
Igualmente, estas nanopartículas son vectores convenientes para
fármacos con elevada toxicidad (por ejemplo, citostáticos) al
permitir un aumento del tiempo de circulación plasmática del
sistema, durante el cual, se va liberando el fármaco de forma
controlada. Por otra parte, las nanopartículas pegiladas pueden
evitar el reconocimiento y la eliminación mediante las células de
sistema fagocitico mononuclear (MPS), proporcionando una circulación
prolongada de fármacos tras su administración intravenosa.
El término "nanopartículas" se utiliza para
designar esferas o formas similares con un tamaño inferior a 1,0
micrómetro, preferentemente del orden de 10 a 900 nanometros.
Como se menciona más arriba en un aspecto la
invención se relaciona con nanopartículas pegiladas formadas a
partir de un polímero biodegradable que es un copolímero de metil
vinil éter y anhídrido maleico. Se pueden utilizar polímeros
biodegradables conocidos del estado de la técnica y que dan lugar a
la formación de nanopartículas. Entre estos polímeros tenemos entre
otros los polihidroxiácidos como ácido poliláctico, poliglicólico y
copolímeros de éstos (por ejemplo PLGA), polianhidridos,
poliésteres y polisacáridos como por ejemplo el quitosano. El
término "biodegradable" se refiere en esta descripción a
polímeros que se disuelven o degradan en un periodo de tiempo que
es aceptable para la aplicación deseada, en este caso terapia in
vivo, una vez que se exponen a una solución fisiológica de pH
6-9 y temperatura comprendida entre 25ºC y 40ºC.
De acuerdo con la invención se utiliza como
polímero biodegradable el copolímero de metil vinil éter y anhídrido
maleico en forma anhidrido (PVM/MA o Gantrez AN). Preferentemente
tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2400 KDa, más
preferentemente entre 200 y 2000 KDa. En una variante de la
invención se prefiere un copolímero de PVM/MA con un peso molecular
entre 180 y 250 KDa.
Este copolímero es ventajoso ya que se utiliza
ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su baja toxicidad
(DL 50 = 8-9 g/kg por vía oral) y excelente
biocompatibilidad. Además es de fácil obtención, tanto por la
cantidad como su precio. Este polímero puede reaccionar con
distintas sustancias hidrofílicas, debida a sus grupos anhídridos,
sin tener que recurrir a los reactivos orgánicos usuales
(glutaraldehido y derivados de carbodiimida) que poseen una
toxicidad importante (Arbos et al, J. Controlled Rel., 83
(2002) 321-330). En un medio acuoso, el polímero es
insoluble, pero el grupo anhidrido del Gantrez AN se hidroliza dando
lugar a la obtención de grupos carboxílicos. La disolución es lenta
y depende de las condiciones en que se produce. Debido a la
disponibilidad de grupos funcionales en PVM/MA, la unión covalente
de moléculas con grupos nucleofílicos, como hidroxilos (-OH) ó
aminas (-NH_{2}) tiene lugar por simple incubación en un medio
acuoso.
Nanopartículas no pegiladas de este copolímero y
su preparación se describen en WO 02/069938 del mismo solicitante,
el contenido de esta solicitud se incorpora en su totalidad a la
presente por referencia. Las nanopartículas de copolímero de metil
vinil éter y anhídrido maleico se preparan fácilmente por
desolvatación del polímero, mediante la adición, a una solución
orgánica del mismo, de un primer disolvente polar (miscible con una
disolución del polímero) y posterior adición de un segundo líquido
no disolvente, en este caso una solución hidroalcohólica.
Opcionalmente se puede adicionar un agente reticulante. La obtención
de nanopartículas pegiladas de este polimero se describe más
adelante y se ha encontrado que son de muy fácil obtención.
En la presente descripción con el término
"polietilenglicol" se entiende cualquier polímero hidrofílico
soluble en agua que contiene grupos éter unidos por grupos
alquilénico de 2 ó 3 carbonos, opcionalmente ramificados. Así esta
definición incluye polietilenglicoles, polipropilenglicoles,
ramificados o no, y también copolimeros bloque o al azar que
incluyen los dos tipos de unidades. El término también incluye
derivados sobre los grupos hidroxilo terminales, que pueden estar
modificados (1 ó los dos de los extremos) para introducir grupos
alcoxi, acrilatos, metacrilatos, alquilo, amino, fosfato,
isotiocianato, sulfhidrilo, mercapto, sulfato. El polietilenglicol
o polipropilenglicol puede presentar sustituyentes sobre los grupos
alquileno. De forma preferente estos sustituyentes, si están
presentes, son grupos alquilo.
Los polietilenglicoles son polímeros solubles en
agua que han sido aprobados para la administración de fármacos por
vía oral, parenteral y tópica (FDA). Los polietilenglicoles se
fabrican por polimerización del óxido de etileno (EO) o de
propileno (OP) en presencia de agua, monoetilenglicol o
dietilenglicol como iniciadores de la reacción, en medio alcalino
("1,2-Epoxide Polymers: Ethylene Oxyde Polymers
and Copolymers" in Encyclopedia of Polymer Science and
Engineering; Mark, H.F. (Ed.), Jonh Wiley and Sons Inc., 1986, pp.
225-273). Cuando se alcanza el peso molecular
deseado (controlado generalmente mediante medidas en proceso de la
viscosidad) la reacción de polimerización se termina por
neutralización del catalizador con un ácido (ácido láctico, ácido
acético u otros). El resultado es un polímero lineal de estructura
muy simple:
HO-(CH_{2}-CH_{2}-O)_{n}-H
Donde (n) es el número de unidades
o monómeros de EO. Alternativamente las unidades contienen grupos
propi-
leno.
leno.
Aunque técnicamente todos estos productos
deberían llamarse poli(oxialquilenos), los productos con
pesos moleculares (o masa molecular) medios entre 200 y 35.000 son
conocidos como polietilenglicoles (PEGs). Este término de
polietilenglicol es normalmente usado para indicar la influencia
significativa de los grupos terminales hidroxilos en las
propiedades fisico-químicas de estas moléculas. El
término PEG suele ser utilizado en combinación con un valor
numérico. Dentro de la industria farmacéutica, el número indica el
peso molecular medio, mientras que en la industria cosmética el
número que acompaña a las letras PEG se refiere a las unidades de EO
polimerizadas y que forman la molécula (Hand book of Pharmaceutical
Excipientes, Rowev R.C., Sheskey P. J., Weller P.J. (Eds.),
4^{th} Edition, Pharmaceutical Press and American Pharmaceutical
Association, London, UK, 2003). Los PEGs están recogidos en las
distintas farmacopeas, aunque la nomenclatura difiere (International
Harmonisation: Polyethylene glycol (PEG): Pharmeuropa 1999, 11,
612-614). Según el Handbook of Pharmaceutical
Excipients (Fourth Edition), 2003 Edited by R.C. Rowe, P.J. Sheskey
and P.J. Weller Published by the Pharmaceutical Press (London, UK)
and the American Pharmaceutical Association (Washington, USA) los
polioxietilenglicoles también se denominan polietilenglicoles,
macrogoles, macrogola o PEG. La British Pharmacopeia usa
polietilenglicoles y Macrogols, la Ph Eur polietilenglicoles y
Macrogola mientras que la farmacopea americana (USP): Polyethylene
glycol(s).
Los PEGs con peso molecular inferior a 400 son
líquidos no volátiles a temperatura ambiente. PEG 600 muestra un
punto de fusión comprendido entre 17 y 22ºC, mientras que los PEGs
con pesos moleculares medios comprendidos entre 800 y 2000 son
materiales pastosos con bajos puntos de fusión. Por encima de un
peso molecular superior a 3000, los PEGs son sólidos y,
comercialmente, se puede encontrar hasta PEG 35000. Por otra parte,
aunque el punto de fusión de los PEGs aumenta al aumentar el peso
molecular, el punto de ebullición aumenta hasta un valor máximo de
60ºC. Igualmente, al aumentar el peso molecular, disminuye su
solubilidad acuosa. De todas formas, para PEG 35000, se puede
disolver en agua una cantidad cercana al 50% m/m.
Desde un punto de vista toxicológico, los PEGs
son considerados como poco tóxicos y poco inmunógenos (Hermansky
S.J et al., Food Chem. Toxic., 1995, 33,
139-140; Final Report on the Safety Assessment of
PEGs: J.A. C. T., 1993, 12, 429-457; Polyethylene
glycol, 21 CFR 172.820, FDA). La ingesta diaria admisible, definida
por la WHO, es de 10 mg/kg peso corporal (Polyethylene glycols;
Twenty-third report of the Joint FAO/WHO Expert
Comittee on Food Additives; World Health Organisation, Geneva;
Technical Report Series 1980, 648, 17-18).
Los derivados de polietilenglicol presentan
ventajas similares a los PEGs tradicionales como su solubilidad
acuosa, inactividad fisiológica, baja toxicidad y estabilidad bajo
condiciones muy diversas. Estos derivados incluyen productos muy
variados y se caracterizan por el grupo funcional que sustituye al
hidroxilo, tal como grupos-NH2 (de los más
reactivos), fenoles, aldehidos, isotiocianatos, -SH, etc. Entre los
derivados de polietilenglicol que se pueden utilizar en la
invención cabe destacar:
- -
- Polioxietilen ésteres: PEG monometileter monosuccinimidil succinato ester; PEG monometil eter monocarboximetil eter; PEG adipato; PEG diestearato; PEG monoestearato; PEG hidroxiestearato; PEG dilaurato; PEG dioleato, PEG monooleato, PEG monoricinooleato; PEG de ésteres de aceite de coco.
- -
- Polioxietilen alquil eteres: PEG monometil eter o metoxi PEG (mPEG); PEG dimetileter.
- -
- Otros: Poli(etilenglicol tereftalato); derivados de polioxietilen y esteres de sorbitano y ácidos grasos; copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno; copolímeros de óxido de etileno con acrilamida.
- -
- Derivados de PEGs: O,O'-Bis-(2-aminoetil) polietilenglicol (DAE-PEG 2000); O,O'-Bis-(2-aminopropil)polipropilenglicol-polietilenglicol-polipropilenglicol.
En una variante de la invención el
polietilenglicol no está ramificado y no tiene los grupos hidroxilo
sustituidos. En esta variante los polietilenglicoles utilizados
tienen preferentemente un peso molecular entre 400 y 35.000 Da.
Cuando el peso molecular es inferior a 400 Da hemos visto que no se
produce la pegilación de forma eficiente. Por lo tanto en una
variante preferida de la invención el polietilenglicol utilizado en
la fabricación de las nanopartículas pegiladas tiene un peso
molecular igual o superior a 400, más preferentemente igual o
superior a 1000, especialmente preferidos son valores entre 1500 y
10.000, preferentemente entre 2000 y 5000 KDa.
Así, en una variante de la invención se utiliza
polietilenglicol 2000 (PEG 2000). De forma preferente la cantidad
de PEG 2000 respecto al polímero es de 1:2-6,
valores cercanos a una relación de 1:4 dan buenos resultados. Por
ejemplo aproximadamente 0,25 mg PEG 2000/mg polímero da una
pegilación eficiente. En este caso la cantidad asociada a las
nanopartículas es de aproximadamente 55,0 microgramos por mg
nanopartícula. Estas nanopartículas se caracterizan por tener forma
esférica y un tamaño cercano a los 300 nm.
En otra variante de la invención el
polietilenglicol utilizado en la fabricación de las nanopartículas
pegiladas presenta un grupo hidroxilo terminal bloqueado, por
ejemplo mediante un derivado de éter metílico. Esto reduce su
hidrofilia e incluso puede cambiar la estructura de la
nanopartícula. En este caso, un porcentaje mayor de las cadenas de
polietilenglicol estaría incluido en el interior, y solamente una
pequeña parte de las mismas se localizaría en la superficie de las
nanopartículas. Esta particularidad nos permite modular las
características de las nanopartículas mediante el bloqueo de los
grupos hidroxilo o bien la introducción de otros grupos funcionales
commo se decribe más adelante. En el caso de m-PEG,
que está en el interior de las nanopartículas, su función sería la
de modificar la liberación del fármaco modificando la porosidad de
la matriz polimérica.
En una variante preferida se utiliza es el éter
metílico de polietilenglicol 2000 (mPEG 2000). De forma preferente
la cantidad de mPEG 2000 respecto al polímero es de
1:2-6, valores cercanos a una relación de 1:4 dan
buenos resultados. Por ejemplo aproximadamente 0,25 mg mPEG 2000/mg
polímero. En este caso la cantidad asociada a las nanopartículas
es de 35,5 microgramos por mg nanopartícula. Estas nanopartículas se
caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 300
nm.
En otra variante de la invención el
polietilenglicol utilizado presenta grupos funcionales terminales
diferentes al hidroxilo, como grupos amino. Estos grupos amino a
su vez pueden estar sustituidos y presentar grupos funcionales. En
una variante preferida los grupos amino son -NH_{2}. Se ha visto
que con estos grupos, la administración oral de las nanopartículas
se acumulan sobre ciertos segmentos del tracto intestinal, lo que
permite una administración específica.
Así, en una variante el polietilenglicol
utilizado en la fabricación de las nanopartículas pegiladas es el
O,O-bis-(2-aminoetil)polietilenglicol
2000 (DAE-PEG 2000). En este caso se cree que la
estructura de la nanopartícula pegilada no es del tipo
"cepillo", ya que las cadenas se unirían por los dos extremos
dando lugar a una conformación de tipo "lazo". La cantidad de
DAE-PEG respecto al polímero es preferentemente
inferior a 1:4. En una variante preferida es igual o inferior a
0,25 mg DAE-PEG 2000/mg polímero. En este caso la
cantidad asociada a las nanopartículas es de aproximadamente 90,6
microgramos por mg nanopartícula. Estas nanopartículas se
caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 500
nm.
En otra variante el polietilenglicol que se
utiliza en la preparación de las nanopartículas pegiladas presenta
grupos amino y ramificaciones en los grupo alquilo. Hemos comprobado
que con estos sustituyentes la tendencia es a formar una estructura
de tipo cepillo, con uno de los extremos en el interior de la
nanopartícula y el otro en el exterior.
Así, si el polietilenglicol utilizado es el
O,O'-bis-(2-aminopropil)
polipropilenglicol-polietilenglicol-polipropilenglicol
2000 (DAP-PEG 2000) las nanopartículas se
caracterizan por tener forma esférica y un tamaño cercano a los 360
nm. En este caso la cantidad de DAP-PEG respecto al
polímero es preferentemente igual o inferior a 0,25 mg
DAP-PEG 2000/mg polímero), la cantidad asociada a
las nanopartículas es de 67,6 microgramos por mg nanopartícula.
A continuación se dan de forma ilustrativa las
estructuras químicas de algunos polialquilenglicoles
correspondientes a los grupos anteriormente mencionados con
distintos tipos de grupos funcionales:
Ejemplos concretos serían:
- a)
- polietilenglicol 400, 1000 o 2000 (PEG 400, PEG 1000 o PEG 2000);
- b)
- éter metilico de polietilenglicol 2000 (mPEG 2000);
- c)
- O,O'- Bis-(2-aminoetil) polietilenglicol 2000 (DAE-PEG 2000);
- d)
- O,O'-Bis-(2-aminopropil) polipropilenglicol-polietilenglicol-polipropilenglicol (DAP-PEG 2000);
Como resulta de lo descrito anteriormente, que
viene confirmado por los ejemplos, la selección del tipo de
polietilenglicol permite modular a voluntad las características del
sistema que se genera. El uso de mezclas de polietilenglicoles de
diferentes tipos añade un factor más de variabilidad. Desde el punto
de vista práctico esto es importante para adaptar y seleccionar el
sistema más adecuado para cada molécula activa y para cada modo de
administración.
El proceso de preparación de las nanopartículas
de polimero biodegradable y polietilenglicol, preferentemente del
copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) y
polietilenglicol, está basado en el método de desplazamiento del
disolvente, descrito por ejemplo en WO 02/069 938.
En una variante de la invención las
nanopartículas pegiladas se preparan por dos procedimientos
distintos: (i) incubación simultánea de los dos polímeros (por
ejemplo PVM/MA y PEG) en la fase orgánica e (ii) incubación de las
nanopartículas de polímero biodegradable con una solución acuosa del
polietilenglicol. Estos procedimientos son válidos para la
preparación de nanopartículas de PVM/MA con asociación de PEG a su
superficie. La primera variante (incubación simultánea de
polímeros) se prefiere ya que da un mayor grado de asociación del
PEG.
El primer procedimiento incluye la disolución
simultánea del polímero biodegradable y el polietilenglicol en un
disolvente orgánico como por ejemplo la acetona. La incubación de la
mezcla se realiza bajo agitación a temperatura ambiente durante un
determinado periodo de tiempo. Preferentemente la concentración del
polímero biodegradable está comprendida entre 0,001 y 10% p/v y la
del polietilenglicol o uno de sus derivados entre 0,001 y 5%
p/v.
Opcionalmente, se adiciona sobre esta solución,
un volumen determinado de un disolvente polar miscible con la
disolución de los polímeros como por ejemplo el etanol.
También de forma opcional se puede utilizar un
agente reticulante para mejorar la estabilidad de las
nanopartículas, tal como se describe en WO 02/069938. Entre los
agentes reticulantes que se pueden utilizar están las moleculas
diaminadas (por ejemplo 1,3 diaminopropano), polisacáridos o
sacáridos simples, proteínas, y en general cualquier molécula que
presente grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos
anhídrido del Gantrez. En el procedimiento de la invención, al
añadir PEGs, no hace falta reticular pues esto tiene lugar de forma
simultánea. Si desea reticularse debe añadirse una cantidad muy
pequeña de cualquiera de los productos indicados.
Finalmente, se añade un volumen similar de un
segundo líquido no disolvente, preferentemente una solución
hidroalcohólica. En una variante se utiliza agua de calidad
farmacéutica (agua purificada u agua p.i, según la aplicación).
Preferentemente la relación fase orgánica/solución hidroalcohólica
está comprendida en el rango entre 1/1-1/10. Las
nanopartículas se forman instantáneamente en el medio, bajo
apariencia de suspensión lechosa.
Los disolventes orgánicos son eliminados por
cualquier procedimiento adecuado tal como evaporación a presión
reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa
estable.
Las nanopartículas se purifican por medios
convencionales como la centrifugación, ultracentrifugación,
filtración tangencial, o evaporación, incluyendo la utilización de
vacío.
Finalmente si se desea se pueden liofilizar para
su almacenaje y conservación a largo término. Para facilitar la
liofilización se pueden utilizar agentes crioprotectores habituales
como la sacarosa o el manitol, de forma preferente a una
concentración comprendida entre el 0.1 y el 10% en peso.
El segundo procedimiento incluye la disolución
del polímero biodegradable en un disolvente orgánico como acetona.
Posteriormente, se adiciona sobre esta solución, un volumen
determinado de solución hidroalcohólica como etanol y finalmente,
un volumen similar de agua. Las nanopartículas se forman
instantáneamente en el medio, bajo apariencia de suspensión
lechosa. Los disolventes orgánicos son eliminados como se describe
en el procedimiento anterior, por ejemplo por evaporación a presión
reducida, quedando las nanopartículas en una suspensión acuosa
estable. Entonces, las nanopartículas se incuban en una solución
acuosa del polietilenglicol. La incubación se realiza bajo
agitación durante un periodo determinado de tiempo. Posteriormente,
las nanopartículas se purifican por centrifugación y finalmente se
liofilizan siguiendo los mismos procedimientos descritos
anteriormente.
La invención también se dirige a composiciones
farmacéuticas que comprenden las nanopartículas pegiladas descritas
y opcionalmente una molécula activa. Preparaciones farmacéuticas
adecuadas son las conocidas del experto en la materia para
formulaciones enterales, preferentemente orales, parenterales como
infusiones y tópicas como la oftálmica. Las formulaciones
comprenderán los excipientes adecuados para cada formulación. Por
ejemplo, en el caso de formulaciones orales en forma de tabletas o
cápsulas se incluirán si es necesario agentes aglutinantes,
desintegrantes, lubricantes, agentes de carga, recubrimiento
entérico, etc. Las formulaciones orales se preparan de forma
convencional por mezclado, granulación en seco o húmedo e
incorporando las nanopartículas pegiladas de la invención.
En un aspecto de la invención las nanopartículas
pegiladas son administradas por una vía que de acceso a alguna
mucosa del organismo (incluyendo la vía oral, rectal, nasal, vaginal
y ocular).
Cuando son administradas por vía parenteral las
nanopartículas pegiladas se utilizan para modificar la distribución
de la molécula biológicamente activa asociada y/o de las
nanopartículas convencionales. En el caso de formulaciones
parenterales se utiliza suspensiones estériles o bien un liofilizado
de las nanopartículas y un vehículo de reconstitución como una
solución salina fisiológica. Pueden incorporar excipientes como
agentes criopreservantes, soluciones reguladoras de pH,
isotonizantes, y tensioactivos, si es necesario.
Las nanopartículas pegiladas descritas y sus
formulaciones sirven como base para la administración de moléculas
biológicamente activas. Se entiende por molécula activa cualquier
compuesto quimico que se administra a un sujeto, preferentemente
humano con fines profilácticos o terapéuticos. Por supuesto también
incluye compuestos macromoleculares como proteinas, péptidos,
ácidos nucleicos, etc. Las nanopartículas pegiladas se utilizan
para modificar la distribución de la molécula biológicamente activa
asociada.
En una variante la molécula activa es de los
grupos de ADNs, ARNs, nucleosidos, nucleotidos, oligonucleotidos o
polinucleotidos. En otra variante la molécula activa es de los
grupos de las proteínas o peptidos.
Se puede incorporar moléculas activas de de los
grupos de agentes antitumorales o antigenos para tumores, de los
grupos de protectores del sistema nervioso central o
glucocorticoides, etc. Alternativamente la molécula activa es un
antígeno para vacunación o un alergeno para inmunoterapia.
En una variante de la invención las
nanopartículas pegiladas se pueden utilizar también como adyuvantes
de vacunas.
La incorporación del fármaco a las
nanopartículas de la invención se puede hacer tal como se describe
en WO 02/069938, por incorporación a la solución de polímeros antes
de la formación de nanopartículas, o bien posteriormente
adicionarlo a la suspensión acuosa de las nanopartículas ya
formadas. Por ejemplo, y dependiendo de la naturaleza del fármaco,
se puede proceder del siguiente modo:
- a)
- Fármacos hidrofóbicos: adición en la fase orgánica (acetona) e incubación/solubilización conjunta con PVMMA y PEG durante un periodo de tiempo variable (hasta 1 hora) bajo agitación (agitador mecánico, magnético o ultrasonidos).
- b)
- Fármacos hidrofílicos: adición en la fase orgánica (acetona) e incubación conjunta con PVMMA y PEG durante un periodo de tiempo variable (hasta 1 hora) bajo agitación (agitador mecánico, magnético o ultrasonidos) hasta obtener una suspensión fina en acetona. Este procedimiento ha sido utilizado con éxito para encapsular una proteina modelo (la ovalbúmina, proteina de unos 44 kDa). La incorporación fue eficiente permitiendo una encapsulación elevada de la proteina modelo.
- c)
- Farmacos hidrofílicos: Adición en la fase acuosa para incubar con las nanopartículas preformadas (es el caso utilizado para encapsular los dos marcadores fluorescentes utilizados en los ejemplos: FITC y RBITC).
La invención se describe a continuación mediante
unos ejemplos que no son limitativos de la invención, sino
ilustrativos.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la caracterización fisicoquímica de las
nuevas nanopartículas se han utilizado distintas técnicas. El
tamaño y el potencial zeta de las nanopartículas se determina en un
aparato Zetamaster (Malvern, Reino Unido). La forma de las
nanopartículas se observa por microscopía electrónica de transmisión
(Zeiss, Alemania) tras marcar las muestras con el ácido
fosfotúngstico.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se han ensayado dos procedimientos:
- -
- mezcla de los dos polímeros en la fase orgánica
- -
- recubrimiento de las nanopartículas preformadas con PEG
Los rendimientos del proceso de fabricación de
las nanopartículas pegiladas se obtienen mediante la determinación
de su peso al final del proceso y tras su liofilización. Los
rendimientos de fabricación se expresan en porcentaje, calculado
respecto a la masa inicial del PVM/MA-copolímero y
de polietilenglicol. La cantidad de polietilenglicol asociado a las
nanopartículas se determina por colorimetría (Labsystems iEMS Reader
MF), y se calcula como una diferencia entre la cantidad inicial
usada y la cantidad encontrada en los sobrenadantes obtenidos
durante preparación de nanopartículas.
Este procedimiento se realiza por incubación
simultánea de PVM/MA y PEG 2000 en la fase orgánica.
Para ello, 100 mg de PVM/MA se disuelven en 5 ml
de disolvente orgánico (acetona). Posteriormente, se añade PEG 2000
a esta disolución (10 - 50 mg). La mezcla se deja reaccionar bajo
agitación magnética durante 1 hora. Posteriormente, sobre esta fase
se adicionan 10 ml de etanol y 10 ml de agua destilada. La mezcla
resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes
orgánicos se eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas que se forman. La suspensión se somete a
purificación por centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces)
(Sigma 3K30, Alemania). Los sobrenadantes se recogen para las
valoraciones analíticas mientras que el residuo se resuspende en una
solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la suspensión de
nanopartículas se congela y se liofiliza en un aparato Genesis
12EL (Virtis, USA).
Las nanopartículas obtenidas tienen una forma
esférica similar a las nanopartículas convencionales (Figura 1 b).
Las propiedades de estas nanopartículas pegiladas están recogidas en
la Tabla 1. La asociación de PEG 2000 a las nanopartículas provoca
un aumento en la polidispersión de la población. Se observó que con
un aumento en la cantidad de polietilenglicol (relación 1:2), el
tamaño y especialmente la polidispersión llegan a ser
extremadamente altos. Las observaciones de potencial superficial de
las nanopartículas muestran valores negativos más bajos para las
nanopartículas pegiladas. Estos resultados sugieren la presencia de
las cadenas de polietilenglicol en la superficie de las
nanopartículas. Por último, indicar que con relaciones PEG 2000:
PVM/MA inferiores a 1:4 p/p, la cantidad de PEG asociada a las
nanopartículas se mantiene constante y cercana a 50 \mug/mg.
100 mg de PVM/MA se disuelven en 5 ml de
disolvente orgánico (acetona). Posteriormente, sobre esta solución
bajo agitación, se adicionan 10 ml de etanol y 10 ml de agua
destilada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5
minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas se evapora bajo
presión reducida hasta que se eliminan ambos disolventes. El
volumen de nanosuspensión acuosa se ajusta con agua a 5 ml y se
añaden 5 ml de una solución acuosa conteniendo entre
10-25 mg de PEG 2000. La incubación de las
nanopartículas en la fase de polietilenglicol se realiza bajo
agitación magnética durante 1 hora. La suspensión se somete a
purificación por centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces)
(Sigma 3K30, Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo
se resuspende en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v).
Finalmente, la suspensión de nanopartículas se congela y se
liofiliza en un aparato Genesis 12EL (Virtis, USA).
La cantidad de polietilenglicol asociada a las
nanopartículas se determina por el método colorimétrico indicado
anteriormente. Los resultados muestran que, por este procedimiento,
la cantidad de PEG asociada a las nanopartículas es sensiblemente
más baja que por el procedimiento descrito en el ejemplo 1.1
(incubación en la fase orgánica) (Figura 2). La razón que explica
este resultado está en la gran afinidad del polietilenglicol por el
agua, por lo que no se alcanza una asociación eficaz con los grupos
carboxilicos procedentes de la hidrólisis del copolímero en las
partículas preformadas. Se puede concluir, que el método de
obtención de nanopartículas pegiladas por incubación simultánea del
copolímero y del polietilenglicol en una fase orgánica es más
eficiente que el simple recubrimiento de las nanopartículas
preformadas con PEG.
El procedimiento se realiza por incubación
simultánea de PVM/MA y el polietilenglicol deseado (PEG 400, PEG
1000 o PEG 2000) tal como se describe en el ejemplo 1.1.
Para ello, 100 mg de PVM/MA se disuelven en 5 ml
de disolvente orgánico (acetona). Posteriormente, se adicionan 25
mg de PEG (400, 1000 o 2000). La mezcla se deja reaccionar bajo
agitación magnética durante 1 hora. Posteriormente, sobre esta fase
se adicionan 10 ml de etanol y 10 ml de agua destilada. La mezcla
resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes
orgánicos se eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas. La suspensión se somete a purificación por
centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces) (Sigma 3K30,
Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende
en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la
suspensión de nanopartículas se congela y se liofiliza en un
aparato Genesis 12EL (Virtis, USA).
Las cantidades de PEG (400, 1000 o 2000) y mPEG
2000 (ejemplo 2) se determinan por valoración colorimetrica. Para
ello, 15 \mul de una solución de iodo (10 mg/ml de iodo; 20 mg/ml
de ioduro potásico) se añaden a 1 ml de los sobrenadantes obtenidos
durante la etapa de purificación de las nanopartículas. La
absorbancia del complejo obtenido entre PEG (o mPEG) y el yodo se
observa por colorimetría a una \lambda de 540 nm (Sims &
Snape, Anal. Biochem., 107 (1980) 60-63).
La Tabla 2 muestra la influencia del peso
molécular del PEG en las características fisicoquímicas de las
nanopartículas obtenidas. Debido a estos resultados se puede
concluir que los polietilenglicoles con bajo peso molecular no son
convenientes para la pegilación de estas nanopartículas. En el caso
de PEG 400, que es líquido, no se puede alcanzar asociación, y en
el caso de PEG 1000, la asociación es muy baja. Estos resultados se
confirman también desde el estudio de la carga superficial de las
partículas. El potencial zeta de las nanopartículas modificadas con
PEG 400 o PEG 1000 es siempre mas negativo que el de las partículas
pegiladas con PEG 2000, y es parecido al de las partículas
no-recubiertas. Se puede concluir que pegilación con
PEG 2000 es mucho más eficiente.
Ejemplo
2
Este procedimiento se realiza por incubación
simultánea de PVM/MA y mPEG en una fase orgánica.
Para ello, 100 mg del copolímero PVM/MA se
disuelven en 5 ml de disolvente orgánico (acetona). Posteriormente,
se adiciona una cantidad de mPEG 2000 a esta disolución (10 - 50
mg). La mezcla se deja reaccionar bajo agitación magnética durante
1 hora. Posteriormente, sobre esta fase se adicionan 10 ml de etanol
y 10 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja
homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes orgánicos se
eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas. La suspensión se somete a purificación por
centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces) (Sigma 3K30,
Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende
en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la
suspensión de nanopartículas se congela y se liofiliza en un
aparato Genesis 12EL (Virtis, USA).
La Figura 1(c) muestra que las
nanopartículas recubiertas con mPEG 2000 poseen una forma esférica y
la superficie parece ser lisa. La Tabla 3 muestra el nivel de la
asociación de mPEG 2000 a las nanopartículas y su influencia en el
tamaño, la polidispersión y la carga superficial de las
nanopartículas. Los resultados muestran que con un aumento en la
cantidad inicial de mPEG 2000, el porcentaje asociado a las
nanopartículas se incrementa ligeramente.
La presencia de mPEG aumenta la polidispersión
de la población de nanopartículas, especialmente a concentración
alta (relación mPEG/PVM-MA superior a 0,25). Por
otra parte, la carga negativa de las nanopartículas disminuye al
aumentar la cantidad de mPEG utilizado. Sin embargo, las grandes
desviaciones observadas, cuando se utilizan altas cantidades de
mPEG, sugieren que la distribución superficial de las cadenas de
mPEG 2000 no es homogénea.
Ejemplo
3
Este procedimiento se realiza por incubación
simultánea de PVM/MA y DAE-PEG 2000 en una fase
orgánica.
Para ello, una determinada cantidad de
DAE-PEG (5, 10, 25 o 35 mg) se disuelve en 5 ml de
disolvente orgánico (acetona). Posteriormente, sobre esta solución,
y bajo agitación magnética, se adicionan 100 mg de PVM/MA. La
mezcla resultante se deja reaccionar bajo agitación magnética
durante 1 hora. Sobre esta fase orgánica, se adicionan bajo
agitación 10 ml de etanol y 10 ml de agua destilada. La mezcla
resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes
orgánicos se eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas. La suspensión se somete a purificación por
centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces) (Sigma 3K30,
Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende
en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la
suspensión de nanopartículas se congela y se liofiliza en un
aparato Genesis 12EL (Virtis, USA).
La cantidad de DAE-PEG y de
DAP-PEG (ejemplo 4) se determina tras adición del
reactivo Micro BCA^{TM} Protein Assay Reagent Kit (Pierce,
E.E.U.U.) a los sobrenadantes obtenidos durante la etapa de
purificación de las nanopartículas. Este reactivo es capaz de
interaccionar con los grupos amino de estos polietilenglicoles dando
un complejo coloreado. Para ello, 150 \mul de reactivo se añaden
al mismo volumen de sobrenadante. Tras incubación durante dos horas
a 37ºC, la absorbancia se determina por colorimetría a una \lambda
de 570 nm.
La Figura 1 (d) muestra que las nanopartículas
recubiertas con DAE-PEG 2000 poseen una forma
esférica. La Tabla 4 muestra el nivel de la asociación de
DAE-PEG 2000 y su influencia en el tamaño, la
polidispersión y la carga superficial de las nanopartículas. Los
resultados muestran que al aumentar la cantidad de
DAE-PEG 2000 (desde 5 a 35 mg), va aumentado la
cantidad de excipiente unida a las nanopartículas. Sin embargo,
cuando la cantidad de DAE-PEG 2000 utilizada es
superior a 25 mg, las nanopartículas no se forman.
Analizando el tamaño, se observa como al
aumentar el grado de asociación se producen nanopartículas con un
tamaño más grande y polidispersión mayor. Así, cuando las
nanopartículas de DAE-PEG se producen con 25 mg,
las partículas resultantes presentan un tamaño superior a 500 nm y
una polidispersión muy elevada. Por otra parte, se observa una
reducción en la carga superficial negativa de las nanopartículas
recubiertas en comparación a las nanopartículas
no-recubiertas. Estos datos sugieren que las cadenas
de DAE-PEG 2000 se encuentran presentes en la
superficie de las nanopartículas.
Ejemplo
4
Este procedimiento se realiza por incubación
simultánea de PVM/MA y DAP-PEG 2000 en una fase
orgánica.
Para ello, una cantidad determinada de
DAP-PEG 2000 (10-50 mg) se disuelve
en 5 ml de disolvente orgánico (acetona). Posteriormente, sobre
esta solución, y bajo agitación magnética, se adicionan 100 mg del
copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico. La mezcla
resultante se deja reaccionar bajo agitación magnética durante 1
hora. Posteriormente, sobre esta fase se adicionan bajo agitación 10
ml de etanol y 10 ml de agua destilada. La mezcla resultante se
deja homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes orgánicos se
eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas. La suspensión se somete a purificación por
centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces) (Sigma 3K30,
Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende
en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la
suspensión de nanopartículas se congela y se liofiliza en un
aparato Genesis 12EL (Virtis, USA).
La Figura 1 (e) muestra que las nanopartículas
recubiertas con DAP-PEG 2000 poseen una forma
esférica y una superficie lisa. La Tabla 5 presenta las
características generales de estas nanopartículas. Los resultados
muestran que al aumentar la cantidad de DAP-PEG
2000, aumenta su cantidad unida a las nanopartículas. Sin embargo,
cuando la cantidad de DAP-PEG 2000 utilizada es
superior a 35 mg, las nanopartículas no se forman.
Se observa que el aumentar en grado de
asociación produce nanopartículas con un tamaño más grande y,
también, mayor polidispersión. Las observaciones del potencial zeta
muestran una reducción significativa de los valores negativos
obtenidos para las nanopartículas recubiertas (valores cercanos a
cero). Estos resultados sugieren que las cadenas de
DAP-PEG 2000 se localizan preferentemente en la
superficie de las nanopartículas.
Ejemplo
5
La Figura 3 muestra la influencia del tipo de
polietilenglicol en el porcentaje de PVM/MA transformado en
nanopartículas, y en el rendimiento total del proceso. En general el
porcentaje del copolímero transformado en nanopartículas es cercano
al 73%. Se observa que cuando las nanopartículas se modifican con
PEG o mPEG, el porcentaje del PVM/MA transformado en partículas no
se modifica de manera significativa. Sin embargo, la pegilación de
nanopartículas con DAE-PEG o DAP-PEG
disminuye el rendimiento del proceso.
La asociación de los polietilenglicoles a las
nanopartículas se confirma por el método de análisis elemental
(Leco CHN-900, E.E.U.U.). De acuerdo con esta
técnica, se pueden mostrar cambios en su composición en oxigeno,
hidrógeno o nitrógeno al asociarse a otros componentes (por ejemplo:
PEG).
La Tabla 6 recoge la composición elemental en C,
H, O y N de los diferentes tipos de nanopartículas pegiladas.
Comparando con las nanopartículas convencionales (NP), todas las
nanopartículas pegiladas muestran un incremento en el porcentaje de
hidrógeno (H) y una disminución relativa en su contenido en oxigeno.
Por otra parte, DAE-PEG NP y
DAP-PEG NP muestran presencia de nitrógeno, que no
se observa en las nanopartículas no-modificadas.
La localización de los polietilenglicoles (en el
interior o en la superficie de las nanopartículas) se analiza por
resonancia magnética nuclear (^{1}H-RMN) (Bruker
400 Ultrashield ^{TM}, Alemania) tras disolver 5 mg de
nanopartículas pegiladas en 0,5 ml de dimetilsulfóxido deuterado.
Los espectros de nanopartículas pegiladas con PEG y mPEG se
obtienen tras aplicar 6400 barridos, mientras que los de
DAE-PEG-NP y
DAP-PEG-NP tras 12800 barridos. En
los espectros se observa el pico típico de hidrógeno de las unidades
de polietileno (a 3,51 ppm, -OCH_{2}CH_{2}-) y los picos de
hidrógeno de los grupos hidroxilos (en el caso de PEG y mPEG), o los
picos de hidrógeno de los grupos aminos de DAE-PEG y
de DAP-PEG (a 4,58 ppm) (Figura 4).
Se calcula una relación entre los valores de
áreas de estos dos picos en los espectros de las partículas
pegiladas y en los espectros de los polietilenglicoles libres. Los
valores de estas relaciones pueden dar información para la
localización de las cadenas de polietilenglicoles en las
nanopartículas pegiladas.
Se observa que el pico de hidrógeno del grupo
hidroxilo (4,58 ppm) aparece en el espectro de las nanopartículas
pegiladas con PEG 2000 (Figura 5 a). La Tabla 7 recoge el área de
los dos picos referidos anteriormente (a 3,51 ppm y a 4,58 ppm) y
las relaciones entre ellos para PEG-NP y PEG libre.
Se calcula que la relación entre estos dos picos para
nanopartículas es aproximadamente dos veces mayor que para el PEG
2000 libre. Estos datos significan que, en el caso de estas
nanopartículas, la proporción de grupos hidroxilos es dos veces
menor, por lo que se puede concluir que un número significativo de
estos grupos funcionales (que no aparecen en el espectro) están
unidos a los grupos anhídridos del copolímero. De acuerdo con estas
observaciones, una pequeña parte de las cadenas de PEG 2000 estaría
incluida en el interior de las nanopartículas, mientras, la mayor
parte de las cadenas de PEG se establecería en la superficie de las
mismas. Este hecho corrobora los datos de potencial zeta mostrados
en la Tabla 1.
La Tabla 7 presenta los datos referentes a las
áreas de los dos picos para m-PEG - NP y mPEG 2000
libre. Se observa que la relación entre los dos picos para las
nanopartículas pegiladas y mPEG 2000 es similar (177 vs. 217).
Estos resultados muestran que la proporción de grupo hidroxilo de
mPEG en los dos casos (nanopartículas y mPEG libre) es parecido y
que un porcentaje pequeño reacciona con los grupos anhidrido del
copolímero. Se puede concluir que la estructura de estas partículas
es diferente a la de PEG-NP. En este caso, un
porcentaje mayor de las cadenas de mPEG estaría incluido en el
interior, y solamente una pequeña parte de las mismas se
localizaría en la superficie de las nanopartículas. Por ello, la
distribución superficial de las cadenas de mPEG no es homogénea, lo
cual esta de acuerdo con las grandes desviaciones observadas en el
análisis del potencial zeta de estas partículas (Tabla 3).
La Tabla 8 recoge los datos referentes a las
áreas de los picos para DAP-PEG-NP y
DAP-PEG 2000 libre. En el espectro de
DAP-PEG 2000 existen dos señales correspondientes a
hidrógenos de los dos diferentes grupos amino situados en los
extremos de su cadena: un doblete a \delta=4,55 ppm y otro a
\delta=4,45 ppm (Figura 6 b). Se observa que en el espectro de
nanopartículas pegiladas con DAP-PEG 2000 no aparece
ningún hidrógeno de estos grupos amino (Figura 6 a), lo cual indica
que todos los grupos amino de este tipo de polietilenglicol
reaccionan con los grupos anhidridos del polímero formador de las
nanopartículas. Además, las cadenas de DAP-PEG
estarían unidas a la superficie de las nanopartículas por los dos
extremos grupos amino y el recubrimiento superficial sería total.
Esto estaría apoyado por los valores del potencial zeta (cercanos a
cero) de estas partículas (Tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
En el caso de DAE-PEG 2000 no es
posible calcular la misma relación entre los dos picos, porque el
pico a 4,58 ppm tiene una muy baja intensidad y baja resolución
(independiente de la concentración y del numero de barridos
realizados) (Figura 7 b). De todas formas, se puede observar que
este pico aparece en el espectro de las nanopartículas así como en
el espectro del DAE-PEG 2000. Por ello, se puede
concluir, que una parte de las cadenas de DAE-PEG
estaría incluida en el interior de las partículas. Sin embargo, la
mayor parte se localizaria en la superficie unida solamente por el
un extremo de la cadena de este polietilenglicol.
Con respecto de estos datos, se puede concluir
que las nanopartículas pegiladas poseen una estructura distinta. La
estructura propuesta para las diferentes formulaciones se muestra en
la Figura 8. Ciertos polietilenglicoles como PEG 2000,
DAE-PEG y DAP-PEG, modifican la
superficie de las nanopartículas desarrolladas. En el caso de
PEG-NP y DAE-PEG-NP,
el recubrimiento daría lugar a una estructura tipo "cepillo"
(Figura 8 a y c), mientras que en caso de DAP-PEG,
las cadenas se unirían por los dos extremos dando lugar a una
conformación de tipo "lazo" (Figura 8 d). El único caso donde
no se observa modificación de la superficie de nanopartículas es
cuando se utiliza mPEG 2000. El mPEG se encontraría mayoritariamente
en el interior de las nanopartículas (Figura 8 b).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Este estudio se realizó de acuerdo con las
regulaciones del Comité Etico responsable de la Universidad de
Navarra en línea con la legislación europea sobre las experiencias
con animales (86/609/EU).
Las nanopartículas pegiladas utilizadas en este
ensayo se marcan fluorescentemente con rodamina B isotiocianato.
Para ello, las nanopartículas se forman mediante una incubación
simultanea de PVM/MA y los distintos tipos de polietilenglicoles
(de acuerdo del procedimiento en ejemplos 1.1, 2, 3 y 4).
Posteriormente, sobre esta fase se adicionan bajo agitación 10 ml
de etanol y 10 ml de agua destilada. La mezcla resultante se deja
homogeneizar durante 5 minutos. Los disolventes orgánicos se
eliminan por evaporación a presión reducida (Buchi
R-144, Switzerland), concentrando la suspensión de
nanopartículas. El volumen de nanosuspensión acuosa se ajusta con
agua a 9 ml y se añade 1 ml de una solución acuosa de rodamina B
isotiocianato (1,25 mg/ml). La incubación de las nanopartículas con
el marcador fluorescente se realiza bajo agitación durante 5
minutos. Posteriormente, la suspensión de nanopartículas
fluorescentemente modificadas se somete a purificación por
centrifugación (20 minutos a 17000 rpm, dos veces) (Sigma 3K30,
Alemania). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende
en una solución acuosa de sacarosa (5% p/v). Finalmente, la
suspensión de nanopartículas se congela y se liofiliza en un
aparato Genesis 12EL (Virtis,
USA).
USA).
\newpage
La Tabla 9 recoge las características de las
formulaciones utilizadas en este ensayo y marcadas fluorescentemente
con rodamina B isotiocianato.
Las nanopartículas obtenidas (10 mg) se
administran por vía oral a ratas macho (tipo Wistar, peso 220,0 g)
tras su dispersión en 1 ml de agua. Tras la administración oral, los
animales son sacrificados por dislocación cervical a diferentes
tiempos: 0,5, 1, 3 y 8 horas. Se abre la cavidad abdominal y se
extrae el tracto gastrointestinal. La zona se divide en las
siguientes porciones anatómicas: estómago, intestino delgado y
ciego. Cada segmento se abre longitudinalmente a través del
mesenterio y se lava con tampón fosfato salino (pH=7,4; 0,15 M),
para eliminar la fracción de nanopartículas no adheridas. Además,
cada segmento se corta en porciones de una longitud de 2 cm que se
digieren durante 24 horas con 1 ml de hidróxido sódico 3M (Arbos
et al, Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136).
Posteriormente, la rodamina se extrae con 2 ml de metanol y las
muestras se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm. Los
sobrenadantes (1 ml) se diluyen con 3 ml de agua y la cantidad de
rodamina se determine mediante espectrofluorimetria a
\lambda_{ex} = 540 nm y \lambda_{em} = 580 nm (GENios,
Austria). De acuerdo con este procedimiento se puede estimar la
fracción de las nanopartículas adheridas a la mucosa.
La distribución específica de las nanopartículas
pegiladas en las distintas partes de tracto gastrointestinal se
muestra en la Figura 9. Todas las formulaciones presentaron una
adhesión inicial importante por la mucosa del estómago. El
porcentaje de dosis adherida a este órgano, 30 minutos después de su
administración, variaba entre el 13% para PEG-NP y
el 9% para DAP-PEG-NP. Igualmente,
todas las formulaciones de nanopartículas pegiladas mostraron una
cierta afinidad por la porción I_{3} del intestino delgado; sin
embargo, 3 h después de la administración, PEG-NP y
DAE-PEG-NP se revelaron como las
formulaciones mas eficientes para mantener cantidades adheridas al
intestino delgado, cercanas al 20% de la dosis. Finalmente, 8 h
después de la administración, el pico de nanopartículas adheridas
se encontraba en la ultima porción del intestino delgado (para
PEG-NP) o en el ciego (para mPEG-NP
y DAP-PEG-NP). En el caso de
PEG-NP y DAP-PEG-NP,
todavía se podía cuantificar una fracción relativamente importante
(cercano al 10%) de nanopartículas adheridas a la mucosa. Como
conclusión, se puede afirmar que las nanopartículas recubiertas con
PEG 2000 y mPEG 2000 muestran una distribución muy homogénea y se
diseminan sobre todas las partes del tracto durante 8 horas (Figura
9 a y b). Las nanopartículas pegiladas con DAE-PEG
se adhieren preferiblemente en las porciones intermedias del
intestino delgado (Figura 9 c), mientras que las nanopartículas
modificadas con DAP-PEG 2000 se acumulan
principalmente en las regiones distales del tracto intestinal
(Figura 9 d). Estos resultados significan que, las nanopartículas
desarrolladas aquí pueden proporcionar una liberación específica
de
fármacos.
fármacos.
Parámetros de bioadhesión (Arbos et
al., Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136): La
curva de adhesión de cada formulación se obtuvo al representar la
fracción adherida de las nanopartículas pegiladas en la mucosa
gastrointestinal de ratas frente al tiempo. A partir de esta curva
se estimaron los siguientes parámetros de bioadhesión: AUC_{adh},
k_{adh} y MRT_{adh}. k_{adh} representa la velocidad de
eliminación de la fracción adherida y se calculó con ayuda del
programa WinNonlin version 1.5 (Scientific Consulting, Inc.).
AUC_{adh} o área bajo la curva de representar la fracción
adherida frente al tiempo (expresada en forma de cantidad de
marcador adherido con respecto al tiempo), se evaluó por el método
de trapecios hasta t_{z} (el último punto de muestreo), y permite
cuantificar la intensidad del fenómeno bioadhesivo. Finalmente,
MRT_{adh} es el tiempo medio de residencia de la fracción
adherida de nanopartículas y permite evaluar la duración relativa de
las interacciones adhesivas, tomando como límite el último punto de
muestreo.
La Figura 10 presenta los perfiles bioadhesivos
de las nanopartículas pegiladas en el tracto gastrointestinal
entero durante 8 horas. Todas las nanopartículas pegiladas exhiben
perfiles bioadhesivos distintos al perfil de las partículas
no-modificadas (NP). La bioadhesión máxima de NP
aparece 30 minutos después de su administración oral y disminuye
rápidamente después. Por el contrario, las nanopartículas pegiladas
tienen, en general, una menor capacidad inicial para desarrollar
interacciones bioadhesivas. Sin embargo, la capacidad adhesiva se
mantiene durante al menos 3 horas. Así, 3 h después de su
administración, la cantidad de nanopartículas adheridas a la mucosa
gastrointestinal varía entre el 25% de la dosis administrada, para
PEG-NP, y el 16% para
DAP-PEG-NP. En todos los casos
superior al control (NP). Por otra parte, es particularmente
interesante el perfil obtenido para PEG-NP. Estas
nanopartículas muestran un máximo de adhesión 1 hora después de su
administración (aproximadamente 32% de la dosis) y, 3 horas después
su administración, los niveles de partículas adheridas a la mucosa
son similares a los iniciales. En el caso del resto de
nanopartículas pegiladas, su adhesión inicial se mantiene durante
al menos 3 horas.
Los parámetros bioadhesivos pueden dar más
detalles acerca da las propiedades adhesivas de las nanopartículas
(Tabla 10). Como se he dicho anteriormente, la capacidad inicial de
las nanopartículas pegiladas para interaccionar con la mucosa
(Q_{max}) es más baja que para las partículas
no-recubiertas (NP). Sin embargo, el área bajo de
la curva de la bioadhesión (AUC_{adh}) de las nanopartículas
pegiladas es más alto; esto significa que la intensidad adhesiva es
superior. Este fenómeno se constata especialmente en el caso de
PEG-NP, donde AUC_{adh} es
1,6-veces mayor que para NP. Además, todas las
formulaciones de nanopartículas pegiladas tienen un grado de
eliminación de la fracción adherida (k_{adh}) más bajo y un tiempo
de residencia más largo (MRT_{adh}) en comparación con las
partículas no-recubiertas. Así, las
DAP-PEG-NP muestran una eliminación
de la fracción adherida más lenta que para las partículas
convencionales, sugiriendo el potencial bioadhesivo duradero de
estas nanopartículas. Se observa que todas nanopartículas pegiladas
muestran una residencia larga (MRT_{adh}) en el tracto
gastrointestinal. Con respecto al tiempo de residencia medio de la
fracción adherida (MRT_{adh}), es particularmente interesante que
todas las nanopartículas pegiladas presentan un tiempo medio de
residencia significativamente mayor que NP. Así, estas
nanopartículas presentan tiempos de residencia comprendidos entre 17
y 48 minutos mayores que las convencionales.
Ejemplo
7
La visualización de las nanopartículas pegiladas
en la mucosa gastrointestinal se observa por microscopía de
fluorescencia y óptica. Para ello, las nanopartículas pegiladas se
marcaron con moléculas fluorescentes como rodamina B isotiocianato
(RBITC) y fluoresceina isotiocianato (FITC). Tras la administración
oral a ratas, distintas porciones del intestino se recojen y lavan
con tampón fosfato salino (pH=7,4; 0,15M), tal como se ha descrito
arriba.
En el primer caso, los segmentos del intestino
(conteniendo las nanopartículas marcadas con RBITC) se fijan en
medio Tissue-Tek® O.C.T. (Sakura, Holanda) y se
congelan mediante hielo seco y 2-metilbutano.
Posteriormente, los segmentos se cortan en secciones de 5 \mum en
un criostato (Leica, Alemania) a baja temperatura (-22ºC). Las
secciones obtenidas se montan en un portaobjeto recubierto con
poli-L-lisina (Sigma, España) y se
observan en microscopio de fluorescencia (Olympus
CH-40, Japon).
Por otra parte, los segmentos intestinales
(conteniendo nanopartículas marcadas con FITC) se fijan en una
solución de formalina (4%) durante 24 horas. Tras la fijación, los
tejidos se incluyen en parafina y, posteriormente, se cortan en
secciones de 3 \mum. Estas secciones se montan en portaobjetos
recubiertos con Vectabond (Vector Labs, E.E.U.U.). Entonces, las
secciones obtenidas se desparafinan, rehidratan y se bloquea la
peroxidasa endógena mediante la adición de una solución de peróxido
de hidrógeno (3%) durante 10 minutos. Después, los soportes se
lavan con agua destilada (5 min), se colocan en tampón citrato
(pH=6,0; 0,01M), se calientan al microondas (15 min a máxima
potencia y 15 min a mínima potencia), se lavan con agua y,
finalmente, con tampón Tris salino (TBS) (pH=7,36; NaCl 0,5M;
0,05M). Para evitar el marcaje no específico, las secciones se
incuban con suero normal de cabra (1:20, DAKO, E.E.U.U.) a
temperatura ambiente durante 30 minutos y después con el antisuero
específico (1:100 anti-FITC monoclonal, M0878, DAKO,
E.E.U.U.) a 4ºC durante 24 horas. Tras lavar con tampón Tris salino
(TBS), las muestras se incuban con anticuerpo secundario, Ig
de cabra anti-ratón acoplado a dextrano marcado con
peroxidasa (temperatura ambiente, 30 min). Las muestras se lavan
con tampón TBS y la actividad de la peroxidasa se revela con una
solución de diaminobencidina. Las secciones se contrastan
débilmente con hematoxilina, se deshidratan y se montan en DPX.
Finalmente, las muestras se visualizan en un microscopio óptico
(Nicon Eclipse E 800M, Japon).
La Figura 11 muestra la presencia de
PEG-NP en las células del epitelio del intestino
delgado. Generalmente, las partículas se localizan en el
compartimento apical de las células (Figura 11 a), aunque también se
pueden observar ciertas fracciones que han penetrado entre las
células del epitelio intestinal (Figura 11b).
Por microscopía óptica (Figura 12) se puede
observar una intensiva penetración de las nanopartículas en los
enterocitos. Al igual que con microscopía de fluorescencia, se
observa una distribución en el compartimento apical de las células.
Por otra parte, la Figura 12 b, también muestra una distribución en
el compartimento basolateral. Se observa que algunos núcleos de las
células incluyen el marcador o nanopartículas marcadas, permitiendo
suponer que el uso de estas nanopartículas puede ser interesante
para promover la llegada al núcleo de distintas moléculas
biológicamente activas.
Finalmente, la Figura 13 muestra la distribución
de estos sistemas en las placas de Peyer. Particularmente
interesante es el hecho de constatar que estas nanopartículas
parecen concentrarse en la zona conocida como "domo" de la
placa de Peyer. El domo se caracteriza por ser la zona donde se
acumulan células del sistema monocito-macrofágico.
Esto permite afirmar el interés de estas nanopartículas pegiladas
par el desarrollo de vacunas orales y en inmunoterapia.
Claims (26)
1. Nanopartículas pegiladas para el transporte
de moléculas biológicamente activas que comprenden un polímero
biodegradable y un polietilenglicol o sus derivados,
caracterizadas porque el polímero biodegradable es un
copolímero de metil vinil éter y anhídrido de ácido maleico
(PVM/MA).
2. Nanopartículas según la reivindicación 1
donde el copolímero PVM/MA tiene un peso molecular comprendido
entre 100 y 2400 KDa, más preferentemente entre 200 y 2000 KDa,
especialmente preferido entre 180 y 250 KDa.
3. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el polietilenglicol o sus
derivados tiene un peso molecular comprendido entre 400 y 35.000
Da.
4. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el polietilenglicol se selecciona
del grupo de polietilenglicoles, polipropilenglicoles, copolimeros
bloque o al azar que incluyen los dos tipos de unidades, sus
mezclas o sus derivados.
5. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el polietilenglicol presenta al
menos un grupo hidroxilo terminal modificado, preferentemente con un
grupo alcoxi, acrilato, metacrilato, alquilo, amino, fosfato,
isotiocianato, sulfhidrilo, mercapto o sulfato.
6. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde el polialquilenglicol se
selecciona del grupo formado por polietilenglicol 2000, éter
metílico de polietilenglicol 2000,
O,O'-bis-(2-aminoetil)polietilenglicol
2000, O,O'-bis-(2-aminopropil)
propilenglicol-polietilenglicol-polipropilenglicol
2000 o sus mezclas.
7. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores donde la relación en peso entre el
polietilenglicol y el polímero biodegradable es de
1:2-6, preferentemente de 1:2-4, más
preferentemente alrededor de 1:4.
8. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprenden como molécula activa
una proteína o un péptido.
9. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprenden como molécula activa un
compuesto seleccionado del grupo formado por ADN, ARN, nucleósidos,
nucleótidos, oligonucleótidos o polinucleótidos.
10. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprenden como molécula activa un
agente antitumorales o un antígeno para tumores.
11. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprenden como molécula activa un
agente protector del sistema nervioso central o un
glucocorticoide.
12. Nanopartículas según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprenden como molécula activa un
antígeno para vacunación o un alergeno para inmunoterapia.
13. Una composición farmacéutica que comprende
nanopartículas pegiladas según cualquiera de las reivindicaciones
1-12 junto con un excipiente, vehículo o
adjuvante.
14. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 13 para administración por una vía que de acceso a
alguna mucosa del organismo, preferentemente la vía oral, rectal,
nasal, vaginal u ocular.
15. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 14 para administración oral.
16. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 14 para administración oftálmica.
17. Uso de las nanopartículas según cualquiera
de las reivindicaciones 1-12 en la fabricación de un
medicamento.
18. Un liofilizado que comprende nanopartículas
pegiladas según cualquiera de las reivindicaciones
1-12.
19. Procedimiento de preparación de las
nanopartículas pegiladas según cualquiera de las reivindicaciones
1-12 que comprende la etapa de incubación simultánea
del polímero y el polietilenglicol en un disolvente orgánico,
previa a la desolvatación del polímero con una solución
hidroalcohólica.
20. Procedimiento según la reivindicación 19
caracterizado porque la concentración del polímero
biodegradable está comprendida entre 0,001 y 10% p/v y la del
polialquilenglicol entre 0,001 y 5% p/v.
21. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19 o 20 caracterizado porque la relación
fase orgánica/solución hidroalcohólica está comprendida en el
intervalo entre 1/1-1/10.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19-21 caracterizado porque
comprende etapas adicionales de eliminación de los disolventes
orgánicos y/o purificación.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19-22 caracterizado porque
la molécula activa se añade en la etapa de incubación simultánea
del polímero y el polietilenglicol en un disolvente orgánico.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19-22 caracterizado porque
la molécula activa se añade a la suspensión acuosa de las
nanopartículas ya formadas.
25. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19-24 caracterizado porque
comprende una etapa adicional de liofilización, opcionalmente en
presencia de un agente crioprotector, preferentemente sacarosa o
manitol.
26. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 19-25 donde el copolímero PVM/MA
tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2400 kDa.
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