BR112021016556A2 - Composição, suplemento alimentar, uso de microalga e uso de suplemento alimentar - Google Patents

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Abstract

composição, suplemento alimentar, uso de microalga e uso de suplemento alimentar. a presente invenção refere-se a uma composição que compreende pelo menos 50 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, pelo menos 10 mg/g de uma ou mais xantofilas, pelo menos 1 mg/g de um ou mais esteróis e pelo menos 2 µg/g de um ou mais ficoprostanos e suas aplicações, particularmente como suplemento alimentar na prevenção do surgimento de distúrbios cognitivos.

Description

“COMPOSIÇÃO, SUPLEMENTO ALIMENTAR, USO DE MICROALGA E USO DE SUPLEMENTO ALIMENTAR”
[001] A presente invenção refere-se a uma composição, bem como um suplemento alimentar com base em ácidos graxos e xantofilas, e suas aplicações, particularmente para evitar o surgimento de distúrbios cognitivos em seres humanos ou animais.
[002] Processos cognitivos são definidos como o conjunto das funções cerebrais que permitem a obtenção, processamento, memorização e uso de dados originários do ambiente, a fim de maximizar as vantagens e minimizar os inconvenientes das restrições externas. Os processos cognitivos são, portanto, implementados durante fases que envolvem o raciocínio (que gera o planejamento, organização e julgamento), percepção, reconhecimento, linguagem, emoções, memória e aprendizado.
[003] Distúrbios cognitivos leves ou fragilidades cognitivas são definidos como alterações das funções cognitivas sem demência. Do ponto de vista clínico, esses distúrbios são associados a uma avaliação 0,5 no contexto de determinação por meio do teste CDR (Sistema de Determinação Computadorizada de Pesquisa de Drogas Cognitivas).
[004] Dentre esses distúrbios cognitivos, declínio cognitivo relativo à idade e alterações cognitivas induzidas por tensão pré-natal são dois fenômenos que poderão intervir ao longo de toda a vida do indivíduo.
[005] O declínio cognitivo relativo à idade é definido como redução não patológica das funções cognitivas, tais como a velocidade de processamento de informações, capacidade de atenção e especialmente a chamada memória de trabalho (ou de curto prazo). Esses processos resultam de modificações fisiológicas normais diretamente relacionadas à idade. A idade do início desse declínio ainda é controversa, mas, considerando a aceleração do envelhecimento da população mundial, com mais de 20% da população mundial com mais de 60 anos e esse percentual atingindo mais de 30% em 2050, declínios cognitivos relativos à idade encontram-se entre os principais problemas das próximas décadas, em nível global e especificamente nos países desenvolvidos, nos quais prejudicarão consideravelmente a economia (menos autonomia para os mais idosos) e as políticas públicas.
[006] No lado oposto da pirâmide de idades, os distúrbios cognitivos podem prejudicar crianças e bebês após tensão pré-natal. De fato, há vários anos, a influência da tensão durante certos períodos da gravidez sobre o desenvolvimento cognitivo do feto vem sendo estudada em seres humanos e em animais. Em animais, principalmente em ratos, demonstrou-se, desta forma, que a tensão pré-natal da mãe ocasionaria prole com memória de longo prazo alterada.
[007] Consequentemente, estímulos negativos intensos (tensão) podem induzir alterações ou reduções não patológicas das funções cognitivas de crianças jovens, manifestadas por hiperatividade, déficit de memória e atenção, atraso de linguagem, temperamento mais difícil e alterações comportamentais mais gerais, tais como comportamento ansioso, o que revela atraso do desenvolvimento neurológico e redução das capacidades cognitivas.
[008] Um dos mecanismos presumidos de expressão da tensão pré-natal em distúrbios cognitivos é baseado no contato do feto com grandes doses dos chamados hormônios da tensão, pertencentes à família dos corticosteroides, tais como cortisol. Cortisol, entretanto, atravessa a barreira da placenta e, a partir de determinada concentração, os mecanismos de proteção do feto contra os corticoides secretados pela mãe são saturados, de forma a colocar o feto em contato com doses altamente consideráveis de cortisol, que aparentemente possui efeito negativo sobre o desenvolvimento cognitivo. Foram desenvolvidas outras premissas complementares que explicam a relação entre a tensão pré-natal e os distúrbios cognitivos da criança.
[009] O conceito de tensão pode ser definido segundo perspectivas diferentes, tais como a abordagem biológica: a tensão é, portanto, uma série de reações metabólicas, seguindo-se a um ou mais fatores exógenos, que induzem alterações fisiológicas ou psicológicas (medo, angústia) do organismo. O conceito de tensão e seus impactos, entretanto, são muito específicos para cada indivíduo e a reação do indivíduo à tensão também é definida do ponto de vista psicológico. Considerando, portanto, que um evento causa tensão apenas a posteriori, seja devido a uma reação específica para cada indivíduo ou porque ele pode objetivamente causar tensão, é difícil agir sobre as fontes da tensão pré-natal. Além disso, a gravidez induz alterações hormonais e psicológicas que aumentam a sensibilidade da gestante a todos os eventos propensos a causar impactos ao bem estar do feto.
[0010] A abordagem rigorosamente terapêutica de tensão ou ansiedade, por via medicamentosa, é perigosa no caso de mulheres grávidas: diversos psicotrópicos para tratamento de distúrbios psicológicos ou ansiedade possuem efeitos teratogênicos com efeitos prejudiciais diretos sobre o feto.
Isso exige determinação caso a caso e essa abordagem é utilizada apenas no caso de distúrbios psicológicos clínicos em gestantes e não no caso das chamadas tensões subjetivas.
[0011] Existe, portanto, um grande problema relativo à descoberta de soluções contra as consequências da tensão pré-natal sobre distúrbios cognitivos em crianças e jovens.
[0012] Diferentes estudos demonstraram o interesse de suplementações nutricionais dos chamados ácidos graxos essenciais, mas também de carotenos e particularmente xantofilas, e mesmo da combinação dos mencionados ácidos graxos e dos mencionados carotenos, para evitar ou pelo menos limitar o declínio das funções cognitivas. Suplementos alimentares ou medicamentos foram desenvolvidos, gerando resultados encorajadores.
[0013] É, portanto, conhecida, de acordo com o documento WO 2013/032333A1, uma composição com base em ácidos graxos do tipo ômega 3, particularmente ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido docosa-hexaenoico (DHA), astaxantina e glicerofosfolipídios, que é recomendada para prevenção ou tratamento de diferentes distúrbios, particularmente distúrbios cognitivos. Os mencionados ingredientes estão presentes nesta composição na forma de extratos de microalgas; em uma variante de preparação preferida, eles são obtidos por meio da formulação de dois extratos originários de duas algas diferentes. A origem natural dos componentes da composição é um enorme benefício. A necessidade de composições mais eficazes, entretanto, ainda existe, particularmente com relação às questões mencionadas acima. É ainda importante fornecer métodos de preparação dessas composições que sejam simples e reproduzíveis.
[0014] A presente invenção fornece uma solução com composição que compreende um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3 e uma ou mais xantofilas, bem como um ou mais compostos da família de esteróis e um ou mais ficoprostanos. Comprovadamente, a combinação de pelo menos um esterol e pelo menos um ficoprostano com pelo menos um ácido graxo do tipo ômega 3 e pelo menos uma xantofila aumenta significativamente a eficácia da composição na prevenção do surgimento de distúrbios cognitivos relativos à idade, mas também contra os distúrbios associados à tensão pré-natal.
[0015] A composição de acordo com a presente invenção compreende: - pelo menos 50 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3; - pelo menos 10 mg/g de uma ou mais xantofilas; - pelo menos 1 mg/g de um ou mais esteróis; e
- pelo menos 2 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
[0016] Em indicação primária, a composição de acordo com a presente invenção pode ser utilizada como suplemento alimentar. Além disso, a presente invenção refere-se a um suplemento alimentar que compreende pelo menos 50 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, pelo menos 10 mg/g de uma ou mais xantofilas, pelo menos 1 mg/g de um ou mais esteróis e pelo menos 2 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
[0017] A presente invenção possui a vantagem essencial de que todos os componentes ou ingredientes indicados acima podem ser obtidos de uma fonte natural e, particularmente, podem ser extraídos de uma ou mais microalgas, preferencialmente de uma única microalga. Naturalmente, o(s) componente(s) ou ingrediente(s) da composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção pode(m) ter origem não natural e ser fornecido(s) na forma de produtos fabricados por meio de síntese química.
[0018] Antes de descrever a presente invenção com mais detalhes, são definidos alguns termos utilizados no presente.
[0019] O termo “compreende” na expressão “a composição compreende” ou “o suplemento alimentar compreende” indica que a composição ou o suplemento pode incorporar qualquer componente adicional ou outros, não especificamente mencionados, em qualquer forma ou de qualquer origem. Ele também cobre uma composição ou complemento que conteria apenas os componentes relacionados e, consequentemente, a composição ou o suplemento consistiria dos componentes mencionados.
[0020] Suplemento alimentar é definido como um ou mais alimentos cujo propósito é o de complementar a alimentação normal de seres humanos ou animais e que constitui(em) uma fonte concentrada de nutrientes ou outras substâncias que possuem efeito nutricional ou fisiológico, isoladamente ou em combinação; ele é geralmente disponível na forma de doses, ou seja, formas de embalagem tais como cápsulas de gel, pastilhas, comprimidos, pílulas e outras formas similares, bem como embalagens de pó, ampolas de líquido, ampolas equipadas com gotejador e outras formas similares de preparações em pó ou líquidas destinadas a serem tomadas em unidades medidas em quantidade pequena.
[0021] Ácido(s) graxo(s) do tipo ômega 3 são uma família de ácidos graxos insaturados cuja cadeia de hidrocarbonetos contém 4 a 36 átomos de carbono, geralmente 14 a 36 átomos de carbono e cuja ligação dupla ou primeira ligação dupla, contada a partir do grupo metila terminal da cadeia, encontra-se sobre a terceira ligação carbono-carbono. A(s) insaturação(ões) pode(m) ser do tipo cis ou trans, independentemente entre si.
Os ácidos mais representativos são ácido alfa-linolênico (ALA), ácido eicosapentaenoico (EPA) e ácido docosa-hexaenoico (DHA), mas a designação “ácidos graxos do tipo ômega 3” não é restrita a estes. Além disso, particularmente quando o(s) ácido(s) graxo(s) for(em) de origem natural, ele(s) pode(m) ser extraído(s) de algas e encontrar-se na forma de moléculas livres, mas também em forma derivada, tal como forma esterificada, como em forma mono, di ou triesterificada, ou em misturas dessas formas.
[0022] Por xantofilas, são definidas as moléculas pertencentes aos carotenoides que incluem um ou mais átomos de oxigênio, tais como astaxantina, cantaxantina, vaucheriaxantina, luteína, zeaxantina, diadinoxantina, neoxantina, loroxantina, sifonoxantina, diatoxantina, violaxantina, dinoxantina, flavoxantina, α-criptoxantina, β-criptoxantina e fucoxantina. Particularmente, quando a(s) xantofila(s) for(em) de origem natural, ela(s) pode(m) ser extraída(s) de algas e apresentar-se na forma de moléculas livres, mas também em forma derivada, tal como forma esterificada de mono ou multiésteres, ou em misturas dessas formas.
[0023] Esteróis são uma família de lipídios bem conhecidos que contêm um núcleo de esterano cuja terceira posição de carbono conduz um grupo hidroxila, que pode ser modificado, por exemplo, por um grupo acetila.
Eles incluem esteróis naturais ou fitoesteróis e são agrupados no presente sob o termo ficoesteróis. Sem limitações, como exemplos de fitoesteróis, pode-se mencionar 24-metileno colesterol, β-sitoesterol, fucoesterol, isofucoesterol, saringoesterol, acetato de oxocolesterol, crinosterol e, mais especificamente, brassicasterol, estigmasterol e campesterol.
[0024] Por ficoprostanos, deve-se compreender uma família de lipídios estruturalmente do tipo prostaglandina, de origem natural, resultantes de oxidações não diretamente enzimáticas dos ácidos graxos naturalmente presentes na biomassa das microalgas. Esses compostos são particularmente selecionados a partir de fitoprostanos, isoprostanos e neuroprostanos, dependendo do ácido graxo que sofreu oxidação. Esses compostos podem, portanto, originar-se de ácidos graxos tais como ácido α-linolênico (ALA), ácido araquidônico (ARA), ácido eicosapentaenoico (EPA) ou ácido docosa- hexaenoico (DHA). Os fitoprostanos são principalmente derivados de ALA e podem ser selecionados a partir de 9-epi-9F1t-FitoP, ent-16-epi-16-F1t-FitoP, 9-F1t-FitoP, ent-16B1t-FitoP, ent-9L1t-FitoP e 16(RS)-16-A1t-FitoP. Os isoprostanos são principalmente derivados de ARA e EPA e podem ser selecionados a partir de 15-E2t-IsoP, 15-F2t-IsoP, 15-epi-15-F2t-IsoP, 5-F2t- IsoP e 8(RS)-8-F3t-IsoP. Os neuroprostanos são principalmente derivados de DHA e podem ser selecionados a partir de 4-F3t-NeuroP, 10-F4t-NeuroP, 10- epi-10-F4t-NeuroP, 4(RS)-4-F4t-NeuroP, 14(RS)-14-F4t-NeuroP e 20(R)-20- F4t-NeuroP.
[0025] Por meio de triglicerídeos de cadeia média (MCT), deverão ser compreendidos ésteres de glicerol e ácidos graxos saturados, cuja cadeia de hidrocarbonetos contém 6 a 12 átomos de carbono. Eles estão naturalmente presentes em óleo de palma de coco, tais como óleo de coco, óleo de semente de palma e óleo de palma, mas podem ser obtidos de outras graxas ou óleos.
[0026] A presente invenção é descrita a seguir com mais detalhes e são reveladas suas variantes.
[0027] Convenientemente, uma composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção apresenta as características a seguir, consideradas separadamente ou em qualquer uma ou mais de suas combinações.
[0028] Ela compreende 50 a 250 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 50 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 20 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 100 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
[0029] Ela compreende 50 a 200 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 30 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 8 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 50 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
[0030] Ela compreende 50 a 170 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 25 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 6 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 40 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
[0031] Convenientemente, a composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção contém adicionalmente pelo menos um óleo como veículo ou suporte para facilitar a expressão dos ingredientes ativos.
Observou-se, surpreendentemente, que a produção de uma composição ou suplemento alimentar é facilitada quando esse óleo for selecionado a partir de triglicerídeos com cadeia média (MCT). Particularmente, quando os ingredientes ativos forem obtidos do mesmo extrato de microalgas, observou- se homogeneização ideal nesse óleo. Segundo uma variante, os triglicerídeos com cadeia média (MCT) são de origem natural e fornecidos por um óleo selecionado a partir de óleo de palma de coco, óleo de semente de palma e óleo de palma; eles podem também ser obtidos ou derivados desse óleo.
[0032] Formulações preferidas de uma composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção são apresentadas a seguir, em que essas realizações podem naturalmente ser combinadas: - o ou pelo menos um ácido graxo do tipo ômega 3 é selecionado a partir de ácido estearidônico (SDA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosa-hexaenoico (DHA) e suas misturas; - a ou pelo menos uma das xantofilas é fucoxantina; - o ou pelo menos um dos esteróis é selecionado a partir de fitoesteróis; e - o ou pelo menos um dos ficoprostanos é selecionado a partir de fitoprostanos, isoprostanos e neuroprostanos.
[0033] Uma composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção pode compreender qualquer aditivo que permita aprimorar particularmente a sua conservação, aparência, sabor ou formulação. Um ou mais aditivos, tais como os selecionados a partir de agentes conservantes, corantes, aromatizantes, agentes de desintegração, agentes lubrificantes, agentes de revestimento ou de encapsulação podem, portanto, ser incorporados.
[0034] Uma aplicação importante de uma composição de acordo com a presente invenção é nutracêutica; essa composição ou suplemento alimentar conforme definido acima encontra-se, portanto, convenientemente na forma de cápsulas de gel, cápsulas, comprimidos, pastilhas ou pó solto.
Preferencialmente, ela é embalada em doses que possuem peso unitário de 1 mg a 1 g. Geralmente, o produto galênico da composição ou do suplemento será adaptado para o indivíduo considerado e dependendo particularmente se é destinado a crianças ou adultos.
[0035] Uma composição ou suplemento alimentar de acordo com a presente invenção pode ser utilizada para evitar o surgimento de distúrbios cognitivos relativos à idade não patológicos ou distúrbios cognitivos não patológicos em crianças ou jovens adultos que foram submetidos a tensão pré- natal. Na prevenção de distúrbios cognitivos relativos à idade, a ingestão diária poderá ser de 2 a 5 mg/kg de peso do corpo. Na prevenção de distúrbios cognitivos em crianças ou jovens adultos submetidos a tensão pré-natal, a ingestão diária pode ser de 0,05 a 0,1 mg/kg de peso do corpo. Observou-se que existe efeito mesmo para ingestões diárias muito pequenas, desde que a duração do tratamento seja proporcionalmente estendida.
[0036] A presente invenção também se refere ao uso de microalgas na preparação de suplementos alimentícios conforme definido anteriormente. Uma ou mais microalgas preferidas são selecionadas a partir de qualquer um dos táxons a seguir: Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae e Phaeodactylaceae. Convenientemente, a microalga é Tisochrysis lutea ou Phaeodactylum tricornutum. Essas microalgas serão selecionadas porque a extração apropriada gera um extrato cuja composição atende à definição de composição de acordo com a presente invenção. Como exemplo, esse extrato pode compreender a fração de ácidos graxos a seguir: os ácidos graxos, expressos em percentuais em peso com relação ao total do extrato, encontram-se na forma de ácidos graxos livres de 4 a 55%, na forma de monoacil glicerol de 0,5 a 10%, na forma de diacil glicerol de 0,4 a 15% e na forma de triacil glicerol de 2 a 55%. Esses ácidos graxos encontram-se na faixa de 5 a 20% (m/m) dos ácidos graxos da série ômega 3 e de 0,5 a 5% dos ácidos graxos da série ômega 6. Mais especificamente, os ácidos graxos são particularmente ALA (ácido α-linolênico) de 0,5 a 10%, SDA (ácido estearidônico) de 0,5 a 10%, EPA (ácido eicosapentaenoico) de 0,05 a 20% e DHA (ácido docosa-hexaenoico) de 0,1 a 10%.
[0037] Conforme indicado anteriormente, um dos interesses da composição ou suplemento alimentar reside no método de sua preparação,
especificamente na origem natural dos seus componentes, todos os quais podem ser obtidos a partir de uma única microalga. Dependendo da microalga utilizada, a formulação da composição pode ser obtida diretamente com o extrato. Se não for este o caso, o extrato será diluído para obter as concentrações necessárias de acordo com a presente invenção. A presente invenção não se limita, entretanto, a esta realização e, portanto, pode-se considerar que apenas uma parte dos componentes é de origem natural e as outras são obtidas por meio de síntese química e/ou que os componentes de origem natural não são gerados da mesma fonte; eles não são produzidos, por exemplo, com a mesma alga.
[0038] A medição e o ajuste das concentrações dos ingredientes ativos em um extrato e, na composição ou suplemento alimentar obtido, são conduzidos utilizando métodos analíticos que se enquadram no conhecimento geral dos técnicos no assunto.
[0039] Um método de produção de composições ou suplementos alimentares a partir de culturas de microalgas é descrito com mais detalhes a seguir.
[0040] Segundo uma variante da presente invenção, os mencionados organismos são microalgas, tais como as pertencentes aos táxons Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae e Phaeodactylaceae. Esses micro-organismos capazes de fotossíntese podem ser estritamente autotróficos, mixotróficos ou transitoriamente heterotróficos.
Esses organismos podem ser coletados em ambiente natural ou preferencialmente cultivados.
[0041] Por extrato, indica-se uma fração da biomassa derivada dos organismos com capacidade de fotossíntese obtidos por meio de um método que permite a obtenção, direta ou indireta, de composições de acordo com a presente invenção. Esses extratos possuem composição, expressa em percentual em peso com relação ao total do extrato, de 5 a 30% de proteínas, 20 a 80% de lipídios, 0,1 a 2% de esteróis e 0,1 a 20% de clorofila.
[0042] Mais especificamente, a parte lipofílica que compõe o extrato, expressa em percentual em peso com relação ao total do extrato, é constituída de 15 a 45% de ácidos graxos saturados, 5 a 20% de ácidos graxos póli-insaturados, 1 a 20% de xantofilas e 0,0002 a 0,007% de ficoprostano.
[0043] Para fins de produção do extrato de acordo com a presente invenção, as células consistem convenientemente de células de microalgas da espécie Tisochrysis lutea da família Isochrysidaceae ou células de microalgas da espécie Phaedactylum tricornutum da família Phaeodactylaceae, produzidas por meio de autotrofia de carbono.
MÉTODO DE PRODUÇÃO DAS MICROALGAS
[0044] As microalgas são idealmente cultivadas de forma controlada em sistemas adaptados, tais como pistas de corrida, lagoas abertas ou preferencialmente em sistemas fechados, como fotobiorreatores. Os fotobiorreatores utilizados podem ser de qualquer tipo existente, tais como fotobiorreatores tubulares horizontais, verticais como os chamados sistemas de “paredes de painéis verdes”, fotobiorreatores planos ou em forma de coluna.
Preferencialmente, a produção da biomassa será realizada dentro de um sistema de cultivo fechado, por meio de autotrofia de impacto zero sobre terras aráveis.
[0045] A produção da biomassa é realizada de acordo com práticas de administração de cultivos em bateladas, bateladas alimentadas, contínuos, semicontínuos, turbidostáticos ou quimiostáticos.
OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DE MICROALGAS
[0046] Os extratos derivados desses micro-organismos são preferencialmente obtidos após concentração da biomassa por meio de eliminação, no todo ou em parte, de água utilizando processos físicos ou químicos, tais como centrifugação, filtragem, floculação e sedimentação, acoplados ou não a etapas de secagem por liofilização, secagem a vácuo, secagem em tambor, atomização ou qualquer outro processo que permita a redução do teor de água da biomassa. De forma complementar a essas etapas, podem ser implementados processos de lise celular, tais como aplicação de pressão, fluxo elétrico, forças de cisalhamento, uso de enzimas ou quaisquer outros processos que permitam a desestruturação dos tecidos, órgãos, células ou organelas.
[0047] Os compostos de interesse da biomassa são extraídos de acordo com um processo do tipo de extração de sólidos-líquidos, que pode utilizar fluidos hipercríticos ou fluidos subcríticos e pode envolver cotratamentos conduzidos paralela ou sequencialmente, tais como micro-ondas, ultrassom, pressão e enzimas. Os solventes utilizados, puros ou em mistura, podem consistir de acetona, hexano, acetato de etila, metiltetra-hidrofurano, heptano, metanol, óleos naturais ou ramificados, etanol ou qualquer outro solvente que permita a extração dos compostos hidrofóbicos e anfifílicos, no todo ou em parte.
[0048] O solvente ou a mistura de solventes é separada da biomassa residual após extração por meio dos processos de centrifugação, filtragem e pode ser concentrada em seguida, ou o solvente pode ser eliminado, por meio de métodos tais como evaporação a vácuo ou qualquer outro método que permita a evaporação seletiva do solvente considerado. O extrato obtido dessa forma possui natureza lipofílica e inclui, ao mesmo tempo, moléculas anfifílicas.
FORMULAÇÃO COMO SUPLEMENTO ALIMENTAR
[0049] A formulação do extrato é realizada com matrizes compatíveis, permitindo sua dissolução para obter uma solução homogênea com a concentração desejada de extrato, tais como óleos vegetais como óleo de oliva, óleo de canola, óleo de linhaça, óleo de girassol, óleo de semente de uva, óleo de palma e preferencialmente óleos MCT, compostos até cerca de 70% em peso de uma mistura de ácido caprílico e ácido cáprico, preferencialmente selecionados a partir de óleo de coco ou óleo de palma, suplementados por moléculas que permitam o aumento da estabilidade, tais como antioxidantes sintéticos ou naturais. As taxas de incorporação em peso das matrizes/aditivos para obter o suplemento podem atingir 95% em peso com relação ao peso do suplemento alimentar e são geralmente de 15 a 80%, preferencialmente 35 a 45%.
[0050] O extrato, mas preferencialmente a composição formulada ou o suplemento obtido, pode ser formulado na forma de cápsulas moles ou pode ser formulado na forma de pó, por meio de qualquer método que permita a microencapsulação da solução aquosa, envolvendo ou não um suporte ou matriz que permita ou não sua capacidade de dispersão homogênea dentro de uma solução polar potável.
[0051] O extrato ou suplemento pode ser utilizado isoladamente ou como ingrediente dentro de complementação alimentar.
[0052] Os diferentes objetos da presente invenção são ilustrados abaixo e suas vantagens são definidas nos exemplos a seguir, com referência às figuras abaixo: - a Fig. 1 é uma representação dos efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a atividade locomotora, em que o diagrama do lado esquerdo ilustra os efeitos sobre os déficits de alternância espontânea e o diagrama do lado direito ilustra os efeitos sobre a atividade locomotora; - a Fig. 2 é uma representação dos efeitos sobre os déficits de aprendizado induzidos pelo D-Gal de acordo com o teste MWM;
- a Fig. 3 é uma representação dos efeitos do suplemento e de DHA sobre os déficits de aprendizado induzidos pela D-Galactose;
- a Fig. 4 é uma representação dos efeitos sobre os déficits de prevenção passiva induzidos por D-galactose em camundongos, com os efeitos sobre a latência de inibição ilustrados no diagrama do lado esquerdo e sobre a latência de passagem ilustrados no diagrama do lado direito, medidos durante o período de retenção;
- a Fig. 5 é uma representação dos efeitos do suplemento e de DHA sobre a peroxidação de lipídios induzida pela D-Galactose;
- a Fig. 6 é uma representação dos efeitos do suplemento e de DHA sobre a expressão de TNF-α no córtex e no plasma induzida pela D-
galactose, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito;
- a Fig. 7 é uma representação dos efeitos do suplemento e de DHA sobre a expressão de IL-6 no córtex (diagrama do lado esquerdo) e no plasma (diagrama do lado direito) induzida pela D-galactose;
- a Fig. 8 é uma representação do efeito do suplemento sobre a ansiedade, no teste de locomoção no centro do espaço de teste, dia
DAP46;
- a Fig. 9 é uma representação do efeito do suplemento sobre a memória de reconhecimento, no teste de reconhecimento de um objeto, dia DAP47;
- a Fig. 10 é uma representação do efeito do suplemento sobre a memória de reconhecimento, no teste de reconhecimento de um objeto novo;
- a Fig. 11 é uma representação dos efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a atividade locomotora, em que o diagrama do lado esquerdo ilustra os efeitos sobre os déficits de alternância espontânea e o diagrama do lado direito ilustra os efeitos sobre a atividade locomotora; - a Fig. 12 é uma representação dos efeitos sobre os déficits de aprendizado induzidos pelo D-Gal de acordo com o teste MWM; - a Fig. 13 é uma representação dos efeitos do suplemento sobre os déficits de aprendizado induzidos pela D-Galactose; - a Fig. 14 é uma representação dos efeitos sobre os déficits de prevenção passiva induzidos por D-galactose em camundongos, com os efeitos sobre a latência de inibição ilustrados no diagrama do lado esquerdo e sobre a latência de passagem ilustrada no diagrama do lado direito, medidos durante o período de retenção; - a Fig. 15 é uma representação dos efeitos do suplemento sobre a peroxidação de lipídios induzida pela D-Galactose; - a Fig. 16 é uma representação dos efeitos do suplemento sobre a expressão de TNF-α no córtex e no plasma induzida pela D-galactose, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito; e - a Fig. 17 é uma representação dos efeitos do suplemento sobre a expressão de IL-6 no córtex (diagrama do lado esquerdo) e no plasma (diagrama do lado direito) induzida pela D-galactose.
EXEMPLO 1
FORMULAÇÃO DE EXTRATO QUE CONTÉM OS COMPONENTES DE COMPOSIÇÕES DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[0053] É obtido um extrato de acordo com qualquer um dos métodos descritos acima da microalga Phaeodactylum tricornutum.
[0054] Ele é insolúvel em água e altamente viscoso, evitando manipulação à temperatura ambiente.
[0055] O extrato e o óleo de palma são mantidos à temperatura ambiente (25 ± 1 °C) por 24 horas antes da preparação. O extrato é transferido para um tubo de centrifugação que contém o óleo, de forma que a massa líquida final da mistura seja de cerca de 5 g e a proporção em massa seja tal que o extrato consiste de 25% da massa líquida geral da mistura. A mistura é agitada por um minuto, utilizando um chamado dispositivo de mistura por turbilhão. A agitação é repetida por três vezes para cada mistura. É obtida uma mistura homogênea.
EXEMPLO 2
TESTE DE EXTRATO NATURAL DA MICROALGA TISOCHRYSIS LUTEA NO CONTEXTO DO MODELO IN VIVO SOBRE A ATENUAÇÃO DOS DÉFICITS INDUZIDOS PELO DECLÍNIO COGNITIVO RELATIVO À IDADE
[0056] O suplemento alimentar de acordo com a presente invenção é preparado com um extrato de Tisochrysis lutea compreende, em mg/g: - ácidos graxos do tipo ômega 3 (ALA, SDA, EPA e DHA): 152,6 ± 14,4; - fucoxantina: 20,0 ± 4,0; - esteróis: 4,9 ± 0,8; e - ficoprostano: 0,035 ± 0,007.
[0057] O suplemento é obtido por meio da adição de óleo de coco em proporção de 360 mg ± 10 mg/g ao mencionado extrato.
[0058] O suplemento é incorporado a bolinhos de acordo com três formulações diferentes, de forma que as concentrações finais de DHA nesses lotes de bolinhos sejam iguais a 0,5, 1,5 e 3,0% (p/p).
[0059] Um extrato oleoso comercial de microalgas que compreende, como fração de gordura, somente 77% (p/p) de ácidos graxos DHA (p/p) 3% (p/p) de EPA também é testado; ele é ainda incorporado a um lote de bolinhos, de forma que a concentração final de DHA nesse lote de bolinhos seja igual a 3,1% (p/p).
[0060] Um lote de bolinhos adicional é formulado apenas com o óleo de coco, de forma que a concentração de veículo seja equivalente à dos outros lotes, ou seja, 0,01% (p/p).
[0061] Os cinco lotes de bolinhos obtidos desta forma são indicados conforme descrito na Tabela 1 abaixo.
TABELA 1 Bolinhos formulados Referência DHA em % (p/p) Óleo de coco A1 0 Suplemento A2 0,5 Suplemento A3 1,5 Suplemento A4 3,0 Extrato oleoso comercial A5 3,1
[0062] O modelo in vivo considerado é o modelo de D-Galactose aplicado a camundongos que é adaptado ao estudo do declínio cognitivo relativo à idade. De fato, esse modelo imita as numerosas características moleculares e comportamentais do envelhecimento cerebral em modelos de roedores.
[0063] D-Galactose é administrada por via subcutânea em proporção diária de 150 mg/kg de peso úmido de camundongos e o suplemento alimentar acima é incorporado a grânulos, de acordo com o esquema a seguir: - do dia -14 ao dia 51, o suplemento é administrado por meio de incorporação a grânulos alimentícios; - do dia 1 ao dia 51, a D-Galactose é administrada por via subcutânea, cinco dias por semana; e - do dia 43 ao 51, três testes comportamentais diferentes são utilizados para monitorar os efeitos dos compostos de teste.
[0064] A eficácia do suplemento é determinada de acordo com os parâmetros a seguir: aprimoramento dos déficits de aprendizado (memória de trabalho espacial: alternância espontânea no labirinto Y de acordo com o teste de labirinto Y; memória espacial do chamado teste de “Labirinto de Água Morris” e memória contextual de longo prazo no teste de prevenção passiva), taxa de peroxidação de lipídios (LPO) no hipocampo e efeito sobre os marcadores da neuroinflamação IL6 e TNFα.
[0065] Aprimoramento dos déficits de aprendizado: - no dia 43, todos os animais foram testados para determinar o desempenho de alternância espontânea no teste de labirinto Y (YM), por meio de um índice de memória de trabalho espacial; - do dia 44 ao dia 49, todos os animais foram testados para determinar a memória espacial no teste de Labirinto de Água Morris (MWM), por meio de um índice de memória espacial; - do dia 44 ao dia 49, todos os animais são testados por meio do teste MWM para determinar a memória de trabalho espacial; - nos dias 50 e 51, a memória contextual de longo prazo dos animais é determinada utilizando-se o processo de prevenção passiva escalonado (STPA), por meio de sessões de treinamento e retenção, respectivamente; e - nos dias 50 e 51, todos os animais são testados para a tarefa de STPA.
[0066] Taxa de peroxidação de lipídios (LPO) no hipocampo e efeito sobre os marcadores da neuroinflamação IL6 e TNFα:
[0067] No 51º dia, após os testes comportamentais, os animais sofreram eutanásia.
[0068] Para todos os animais, o sangue do tronco é coletado e centrifugado para recuperação de plasma e o cérebro é rapidamente retirado. O hipocampo e o córtex são dissecados, o hipocampo é utilizado em seguida para determinar as taxas de peroxidação de lipídios por meio de um método colorimétrico; o córtex semifrontal e o plasma são utilizados para determinar o nível dos biomarcadores inflamatórios interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
[0069] A quantificação das taxas de peroxidação de lipídios (LPO) foi conduzida de acordo com o procedimento modificado e adaptado de Hermes-Lima et al. Este método mede a capacidade dos lipídios peroxidados do cérebro para oxidar um complexo de óxido ferroso e laranja de xilenol, identificada na presença de hidroperóxido de cumeno (HPC). O nível de peroxidação de lipídios é determinado em equivalentes de HPC de acordo com a fórmula: HPCE = A5801/A5802 x [HPC (nmol)] e expresso em equivalentes de HPC por peso de tecido úmido e percentual em comparação com os dados obtidos para o grupo controle (D- Galactose + veículo).
[0070] Os teores de IL6 e TNFα são quantificados por meio de testes ELISA com os kits a seguir: - para quantificação de IL6: ThermoScientifique, EM2IL6; e - para quantificação de TNFα: ThermoScientifique, EMTNFA.
[0071] Para todos os testes, o córtex é homogeneizado após descongelamento em tampão de 50 mM Tris-150 mM NaCl, pH 7,5, e sonicado por 20 s. Após a centrifugação (16.100 g por 15 min, 4 °C), sobrenadante ou plasma é utilizado para os testes ELISA de acordo com as instruções do fabricante dos testes ELISA. Para cada teste, a absorção é lida a 450 nm e a concentração da amostra é calculada utilizando-se a curva padrão. Os resultados são expressos em pg de marcador por mg de tecido úmido.
[0072] Todos os valores, exceto pelas latências de prevenção passiva, são expressos na forma de média mais ou menos o desvio padrão da medição. Análises estatísticas são realizadas separadamente para cada composto, utilizando ANOVA unidirecional (valor F), seguido por um teste de múltiplas comparações post-hoc de Dunnett. As latências de prevenção passiva não seguem distribuição gaussiana, pois os tempos limite superiores são fixos. Elas são analisadas, portanto, utilizando ANOVA não paramétrico Kruskal-Wallis (valor H), seguido por teste de múltiplas comparações de Dunn.
Valores p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos.
[0073] Os testes são realizados sobre 60 camundongos machos, distribuídos em 6 grupos de 10 camundongos, dentre os quais o grupo 1 é o grupo controle negativo e os grupos 2-6 são os grupos controle positivos: - o grupo 1 é o grupo ao qual é administrada uma solução salina subcutânea no lugar de D-Galactose e bolinhos A1; - o grupo 2 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos A1; - o grupo 3 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos A2; - o grupo 4 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos A3; - o grupo 5 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos A4; e - o grupo 6 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos A5.
[0074] O cálculo da dose diária equivalente humana, a partir da dose diária testada em camundongos, é definido conforme segue pela FDA (Guidance, 2005): a dose diária em seres humanos expressa em mg/kg de peso do corpo (HED humana) é igual à dose diária no animal expressa em mg/kg de peso do corpo (HED de animal) multiplicada pela razão entre o fator de segurança (Km de animal) no animal considerado e o fator de segurança para seres humanos (Km humano). Km humano é igual a 37 e Km de camundongos é igual a 3.
EFEITOS SOBRE A MEMÓRIA ESPACIAL NO TESTE DE ALTERNÂNCIA ESPONTÂNEA DE LABIRINTO Y
[0075] Os resultados são representados na Figura 1, em que o primeiro diagrama (à esquerda) ilustra os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre os déficits de alternância espontânea e o segundo diagrama (à direita) ilustra os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a atividade locomotora.
[0076] Na Figura 1: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; * p<0,05, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,0001 vs. o grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[0077] Observa-se que o tratamento com D-Galactose alterou significativamente a memória de trabalho espacial, em comparação com os camundongos tratados com solução salina.
[0078] O suplemento A2 não demonstrou efeito sobre o comportamento de alternância. O suplemento A3 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose. O suplemento A4 atenuou, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0079] O tratamento com DHA isoladamente (de acordo com A5) reduziu de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Gal.
[0080] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa dos déficits) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente (muito significativo e atenuação parcial dos déficits) e para a mesma dose de DHA.
EFEITOS SOBRE OS DÉFICITS DE APRENDIZADO INDUZIDOS PELO D-GAL DE ACORDO COM O TESTE MWM:
[0081] Os resultados são apresentados na Figura 2.
[0082] Na Figura 2: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ## p<0,01, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de comparação múltipla de Bonferroni após ANOVA bidirecional.
[0083] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente o aprendizado espacial, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[0084] O suplemento A2 não demonstrou efeito sobre o comportamento de alternância.
[0085] O suplemento A3 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0086] O suplemento A4 atenuou, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0087] O DHA isolado de acordo com A5 reduziu de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[0088] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção na dose A4 possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa dos déficits) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente (muito significativo e atenuação parcial dos déficits) e para uma mesma dose de DHA.
EFEITOS DO SUPLEMENTO E DE DHA SOBRE OS DÉFICITS DE APRENDIZADO INDUZIDOS PELA D-GALACTOSE
[0089] Os resultados são apresentados na Figura 3.
[0090] Na Figura 3: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo do grupo; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo/Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de comparação múltipla de Bonferroni após ANOVA bidirecional.
[0091] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente o aprendizado espacial, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[0092] O suplemento A2 não demonstrou efeito sobre o comportamento de alternância.
[0093] O suplemento A3 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0094] O suplemento A4 atenuou, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0095] O tratamento com DHA isoladamente de acordo com A5 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[0096] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção na dose A4 possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa dos déficits) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente (muito significativo e atenuação parcial dos déficits) e para uma mesma dose de DHA. Além disso, o tratamento preventivo com o suplemento na dose A3 possui efeito idêntico (muito significativo e atenuação parcial dos déficits) ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é duas vezes mais concentrado em DHA.
EFEITOS SOBRE OS DÉFICITS DE PREVENÇÃO PASSIVA INDUZIDOS POR D-GALACTOSE EM CAMUNDONGOS
[0097] Os resultados são representados na Figura 4, com os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a latência de inibição ilustrados no diagrama do lado esquerdo e sobre a latência de passagem ilustrados no diagrama do lado direito, medidos durante o período de retenção.
[0098] Na Figura 4: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[0099] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente a memória de trabalho contextual de longo prazo, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00100] O suplemento A2 não demonstrou efeito sobre a memória contextual de longo prazo.
[00101] O suplemento A3 permitiu a atenuação dos déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose de forma não significativa.
[00102] O suplemento A4 atenuou, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[00103] O tratamento com DHA isoladamente (de acordo com A5) permitiu a atenuação dos déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose de forma não significativa.
[00104] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção na dose A4 possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa dos déficits) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente (atenuação não significativa dos déficits) e para a mesma dose de DHA. Além disso, o tratamento preventivo com o suplemento na dose A3 possui efeito idêntico (atenuação não significativa dos déficits) ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é duas vezes mais concentrado em DHA.
EFEITOS DO SUPLEMENTO E DE DHA SOBRE A PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDIOS INDUZIDA PELA D-GALACTOSE
[00105] Os resultados são apresentados na Figura 5.
[00106] Na Figura 5: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; ** p<0,01, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ## p<0,01, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00107] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente a tensão oxidativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00108] O suplemento A2 não demonstrou efeito sobre a peroxidação de lipídios induzida pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[00109] O suplemento A3 reduziu de forma muito significativa, mas parcial, a tensão oxidativa induzida pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[00110] O suplemento A4 reduziu, de forma muito significativa e completa, a tensão oxidativa induzida pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[00111] O tratamento com DHA isoladamente de acordo com A5 não demonstrou efeito sobre a tensão oxidativa induzida pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[00112] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção na dose A4 possui efeito positivo superior (atenuação muito significativa e completa da tensão oxidativa)
em comparação com o tratamento com DHA isoladamente e para uma mesma dose de DHA.
EFEITOS DO SUPLEMENTO E DO DHA SOBRE A EXPRESSÃO INDUZIDA DE TNF-Α NO CÓRTEX E NO PLASMA PELA D-GALACTOSE
[00113] Os resultados são representados na Figura 6, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito.
[00114] Na Figura 6: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00115] A intoxicação crônica com D-Galactose aumentou TNF-α no córtex e no plasma de forma significativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00116] Os suplementos A2 e A3 reduziram, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Galactose no córtex e no plasma.
[00117] O suplemento A4 reduziu, de forma muito significativa e completa, o nível de TNF-α no córtex e no plasma.
[00118] O tratamento com DHA isoladamente de acordo com A5 reduziu, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Galactose no córtex e no plasma.
[00119] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento HI (A4) possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa do aumento de TNF-α no córtex e no plasma) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente e para uma mesma dose de DHA. Além disso, os tratamentos preventivos com o suplemento nas doses A2 e A3 possuem efeitos no caso do córtex e do plasma que são idênticos (atenuações muito significativas dos aumentos) ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é, respectivamente, seis e duas vezes mais concentrado em DHA, em comparação com os tratamentos preventivos com o suplemento nas doses A2 e A3, respectivamente.
EFEITOS DO SUPLEMENTO E DO DHA SOBRE A EXPRESSÃO INDUZIDA DE IL-6 NO CÓRTEX E NO PLASMA PELA D-GALACTOSE
[00120] Os resultados são representados na Figura 7, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito.
[00121] Na Figura 7: BAIXO, dose baixa do suplemento (A2); MED, dose média do suplemento (A3); ALTO, dose alta do suplemento (A4); N é de 9 a 10, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00122] A intoxicação crônica com D-Galactose aumentou a IL-6 no córtex e no plasma de forma significativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00123] O suplemento com baixa dosagem (A2) não demonstrou efeito sobre a concentração de IL-6 induzida pela intoxicação com D- Galactose.
[00124] O suplemento em dose média (A3) reduziu, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento do teor de IL-6 induzido pela intoxicação crônica com D-Galactose no córtex e no plasma.
[00125] O suplemento em alta dose (A4) reduziu, de forma muito significativa e completa, o teor de IL-6 no córtex e no plasma, induzido pela intoxicação crônica com D-Galactose no córtex e no plasma.
[00126] O tratamento com DHA isoladamente de acordo com A5 reduziu, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento da taxa de IL-6 no córtex e no plasma, induzido pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[00127] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento HI de acordo com A4 possui efeito positivo superior (muito significativo e atenuação completa do aumento de IL-6 no córtex e no plasma) em comparação com o tratamento com DHA isoladamente (muito significativo e atenuação parcial do aumento de IL-6 no córtex e no plasma) e para a mesma dose de DHA. Além disso, o tratamento preventivo com o suplemento na dose A3 possui efeito no caso do córtex idêntico (atenuação não significativa dos déficits) ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é duas vezes mais concentrado em DHA.
CONCLUINDO
[00128] A intoxicação crônica com D-Galactose induziu muito significativamente a alteração da memória de trabalho espacial, da memória contextual de longo prazo e prejudicou o aprendizado espacial. As alterações comportamentais também estão relacionadas a alterações bioquímicas em termos de aumento da tensão oxidativa e indução de processos neuroinflamatórios.
[00129] O tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção é dependente da dose e atenuou, de forma muito significativa e completa, no caso da dose mais forte testada (o suplemento D4), os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose em termos de alteração comportamental, aumento da tensão oxidativa e ativação de processos neuroinflamatórios.
[00130] O tratamento com DHA isoladamente (A5), em dose equivalente de DHA em comparação com o tratamento com o suplemento HI, reduziu de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose em termos de alteração comportamental, aumento da tensão oxidativa e ativação de processos neuroinflamatórios.
[00131] Surpreendentemente, o tratamento preventivo com o suplemento é significativamente mais eficaz em dose equivalente de DHA que o tratamento preventivo com DHA isoladamente, com relação à atenuação do declínio cognitivo relativo à idade em um modelo murino causado por intoxicação crônica com D-Galactose. Além disso, o tratamento preventivo pelo suplemento, para doses de DHA duas vezes mais baixas, possui efeitos positivos idênticos ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é duas vezes mais concentrado em DHA, no caso de redução da tensão oxidativa medida no córtex (IL-6 e TNF-α), no plasma (TNF-α), no caso da memória contextual de longo prazo e no caso de aprendizado espacial. Além disso, o tratamento preventivo com o suplemento possui efeitos positivos idênticos ao tratamento com DHA isoladamente, enquanto este último é seis vezes mais concentrado em DHA, no caso de redução da tensão oxidativa medida no córtex (IL-6 e TNF-α) e no plasma (TNF-α).
[00132] Aplicando-se a fórmula de cálculo da dose diária equivalente em seres humanos, portanto, tratamento preventivo do declínio cognitivo relativo à idade pode ser definido com a ingestão diária de 2 a 5 mg de suplemento/kg de peso do corpo.
EXEMPLO 3
TESTE DE EXTRATO DA MICROALGA TISOCHRYSIS LUTEA EM FÊMEAS DE RATOS JOVENS QUE SOFREM DE TENSÃO PRÉ-NATAL
[00133] Neste exemplo, é estudada a resolução dos déficits cognitivos, comportamento ansioso e alteração da memória de reconhecimento, induzidos em fêmeas jovens de ratos após tensão pré-natal da sua ancestralidade, por meio da administração de um suplemento com base em extrato da microalga Tisochrysis lutea correspondente ao utilizado no Exemplo 2.
MATERIAL E MÉTODOS
[00134] O modelo utilizado neste exemplo é um modelo reconhecido de indução de tensão pré-natal em ratos por meio de imobilização da fêmea grávida em um cilindro sob severa iluminação.
[00135] Fêmeas grávidas de ratos foram atribuídas aleatoriamente a grupos de tensão pré-natal (SP) ou grupos controle (NS), colocadas individualmente em gaiolas de criação de plástico e tiveram acesso à vontade a alimentos e água, exceto durante o tempo de testes comportamentais. As condições no interior das gaiolas são as seguintes: fotoperíodo com ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro (luz acesa às 7 horas da manhã), em uma sala com temperatura constante (21 °C) e umidade constante (50%).
[00136] O procedimento de tensão pré-natal foi realizado conforme descrito por Meunier et al (2004). As imobilizações das fêmeas de ratos foram objeto de um procedimento de restrição semialeatório. Os animais foram colocados e retidos em cilindros transparentes de acrílico (20 cm de comprimento, 7 cm de diâmetro) sob luz brilhante pelo período total de 90 minutos por dia, por quatro dias consecutivos. Para que a tensão seja a mais imprevisível possível, o período de imobilização forçada de 90 minutos foi administrado conforme segue: uma única fase de 90 minutos, duas fases de 45 minutos espaçadas por quatro horas, duas fases de 60 e 30 minutos espaçadas por quatro horas ou três fases de 30 minutos espaçadas por quatro e uma hora, em diferentes horas do dia.
[00137] Mães controle também foram manipuladas, mas nunca foram colocadas nos cilindros de contenção.
[00138] Permitiu-se que as fêmeas de ratos tratadas se liberassem naturalmente da armadilha dos cilindros de contenção no dia 1 após o nascimento (DAP1).
[00139] As ninhadas foram desmamadas em DAP21. Os ratos foram separados das mães, identificados de acordo com seu gênero,
pesados e os ratos do mesmo gênero foram distribuídos em gaiolas (3 ratos por gaiola). Os ratos jovens na mesma gaiola originaram-se de diferentes ninhadas, a fim de evitar qualquer possível efeito relacionado com a ninhada.
[00140] As condições no interior das gaiolas são as seguintes: fotoperíodo com ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro (luz acesa às 7 horas), em uma sala com temperatura (21 °C) e umidade (50%) constante, com acesso a alimentos e água à vontade, exceto durante o tempo de testes comportamentais.
[00141] Em todas as gaiolas, os animais receberam o mesmo tratamento. Os animais foram testados aleatoriamente e em duplo cego.
[00142] Quarenta e oito (48) fêmeas de ratos foram utilizadas e agrupadas em quatro grupos de animais, constituídos conforme segue: - o grupo 1 é composto por 12 fêmeas de ratos sem tratamento, ou seja, cuja ancestralidade não foi submetida a tensão pré- natal, que recebem apenas 200 µl da solução veículo por dia (referência: NS/Veículo); este grupo é, portanto, o grupo controle; - o grupo 2 é composto por 12 fêmeas de ratos sem tratamento, ou seja, cuja ancestralidade não foi submetida a tensão pré- natal, que recebem 200 µl do suplemento por dia (referência: NS/Suplemento); - o grupo 3 é composto por 12 fêmeas de ratos cuja ancestralidade não foi submetida a tensão pré-natal, que recebem 200 µl da solução veículo por dia (referência: SP/Veículo); e - o grupo 4 é composto por 12 fêmeas de ratos cuja ancestralidade foi submetida a tensão pré-natal, que recebem 200 µl do suplemento por dia (referência: SP/Suplemento).
[00143] A eficácia do suplemento foi determinada em seis semanas após o nascimento.
[00144] O suplemento (uma dose) foi administrado por meio de alimentação forçada uma vez por dia, cinco dias por semana. As administrações foram iniciadas após o desmame, ou seja, após o dia 25 após o parto (DAP) e duraram até DAP46.
[00145] A ingestão diária foi de 25,7 mg de suplemento por kg de peso do corpo do rato.
[00146] Os animais foram submetidos a testes comportamentais durante o período entre os dias DAP46 e DAP48, ou seja, fora do período de tratamento com o veículo ou o suplemento. Os efeitos que são observados durante os testes comportamentais serão devidos, portanto, ao tratamento com natureza preventiva.
[00147] Os testes comportamentais são divididos em uma sessão de determinação da ansiedade e duas sessões de reconhecimento de objetos. As sessões são definidas conforme segue: - Sessão 1, DAP46: os ratos foram colocados individualmente em um espaço aberto quadrado (50 cm x 50 cm x 50 cm x 50 cm) de acrílico azul com piso equipado com diodos emissores de luz infravermelha. Os ratos foram habituados ao espaço de teste durante uma sessão de dez minutos e seus deslocamentos foram capturados por uma câmera de infravermelho e analisados utilizando o software Ethovision® (Noldus). A atividade foi analisada em função da distância total percorrida (m) e de acordo com o percentual de presença na área central de 25 cm x 25 cm definida pelo software. Esses dados referem-se à intensidade do comportamento ansioso (38).
- Sessão 2, DAP47: dois objetos idênticos (tubo Eppendorf de plástico de 50 ml) foram colocados em locais determinados
(sobre duas extremidades opostas da área central). Cada rato foi colocado dentro do espaço de teste e a atividade exploratória foi registrada durante uma sessão de dez minutos. A atividade foi analisada em termos de número de contatos com os objetos e duração dos contatos.
- Sessão 3, DAP48: o objeto da sessão 2 foi substituído por um novo objeto (uma tampa de garrafa feita de plástico), cuja forma, textura e coloração diferem do objeto familiar. Cada rato foi substituído no espaço de teste e a atividade exploratória foi registrada ao longo de uma sessão de dez minutos. A atividade foi objeto de análise similar à descrita na Sessão 2.
[00148] O índice de exploração preferencial foi calculado como a razão entre o número (ou duração) de contatos com o objeto da Sessão 2 e o número total (ou duração) de contatos com os dois objetos.
[00149] Todos os valores são expressos na forma de média mais ou menos o desvio padrão da medição. Análises estatísticas são realizadas separadamente para cada composto, utilizando ANOVA unidirecional (valor F), seguido por um teste de múltiplas comparações post-hoc de Dunnett.
[00150] O cálculo da dose diária equivalente humana, a partir da dose diária testada em ratos, é definido conforme segue pela FDA (Guidance, 2005): a dose diária em seres humanos expressa em mg/kg de peso do corpo (HED humana) é igual à dose diária no animal expressa em mg/kg de peso do corpo (HED de animal) multiplicada pela razão entre o fator de segurança (Km de animal) no animal considerado e o fator de segurança para seres humanos (Km humano). Km humano é igual a 37 e Km de ratos é igual a 6.
[00151] Os resultados são apresentados a seguir.
LOCOMOÇÃO NO CENTRO DO ESPAÇO DE TESTE , DIA DAP46; EFEITO DO
SUPLEMENTO SOBRE A ANSIEDADE
[00152] Os resultados são apresentados na Figura 8.
[00153] Na Figura 8: efeitos do tratamento sobre a ansiedade.
N=12; *** p<0,0001 com relação ao grupo tratado NS/veículo; #### p<0,0001 com relação ao grupo tratado SP/veículo; teste de Dunnett.
[00154] O grupo SP/veículo, correspondente aos indivíduos submetidos a tensão pré-natal e tratados preventivamente com o veículo isolado, apresenta percentual de deslocamentos significativamente muito mais alto no interior da área periférica do espaço de teste aberto em comparação com o grupo NS/veículo (o grupo que não foi submetido a tensão pré-natal).
[00155] O grupo SP/suplemento, correspondente aos indivíduos submetidos a tensão pré-natal e tratados preventivamente com o suplemento, apresenta percentual de deslocamentos significativamente muito mais baixo no interior da área periférica do espaço de teste aberto em comparação com o grupo SP/veículo (o grupo que foi submetido a tensão pré-natal e não foi tratado com o suplemento). Além disso, o percentual de deslocamentos do grupo SP/suplemento é equivalente ao do grupo controle NS/veículo.
[00156] Taxa de deslocamentos dos indivíduos na área periférica do espaço de teste aberto que é mais alta que a modalidade controle demonstra comportamento ansioso [63], por meio de um mecanismo de proteção baseado na busca de fronteiras que limitam as áreas descobertas e a serem monitoradas.
[00157] A tensão pré-natal (SP) induziu, portanto, comportamento ansioso muito significativo.
[00158] Surpreendentemente, o suplemento atenuou, de forma muito significativa e completa, o comportamento ansioso induzido pela tensão pré-natal.
TESTE DE RECONHECIMENTO, DIA DAP47; EFEITO DO SUPLEMENTO SOBRE A
MEMÓRIA DE RECONHECIMENTO NO RECONHECIMENTO DE OBJETOS
[00159] Os resultados são apresentados na Figura 9.
[00160] Durante essa sessão, o mesmo objeto é exibido duas vezes para os indivíduos.
[00161] Nenhum efeito estatístico entre os grupos foi medido para esse parâmetro.
[00162] Os indivíduos de todos os grupos interagiram de forma equivalente, portanto, quando colocados em contato com objetos idênticos e suas interações, tanto em termos de frequência quanto de duração, são distribuídas igualmente entre os dois objetos (50%).
TESTE DE RECONHECIMENTO, DIA DAP48 (NOVO OBJETO); EFEITO DO SUPLEMENTO
SOBRE A MEMÓRIA DE RECONHECIMENTO PARA O TESTE DE RECONHECIMENTO DE NOVOS OBJETOS
[00163] Os resultados são apresentados na Figura 10.
[00164] Na Figura 10: N=12; *** p<0,0001 com relação ao grupo tratado NS/veículo; ### p<0,0001 com relação ao grupo tratado SP/veículo; teste de Dunnett.
[00165] Durante essa sessão, dois objetos diferentes são exibidos para os indivíduos, uma vez cada um: um dos objetos corresponde ao objeto exibido durante a sessão 2 e o outro objeto é um novo objeto.
[00166] O grupo SP/veículo, correspondente aos indivíduos submetidos a tensão pré-natal e tratados preventivamente com o veículo isolado, apresenta percentual de interações, tanto em termos de frequência quanto de duração, com o novo objeto exibido que é significativamente mais baixo em comparação com o grupo NS/veículo (o grupo que não foi submetido a tensão pré-natal). Esse percentual é igual ao da Sessão 2 obtido para todos os grupos. Os indivíduos do grupo SP/veículo possuem, portanto, o mesmo número de interações com o objeto antigo e com o objeto novo e, portanto, os indivíduos desse grupo não reconhecem o objeto antigo exibido durante a Sessão 2.
[00167] Por outro lado, o grupo SP/suplemento correspondente aos indivíduos submetidos a tensão pré-natal e tratados preventivamente com o suplemento apresenta percentual de interações, tanto em termos de frequência quanto de duração, com o novo objeto exibido que é significativamente muito mais alto em comparação com o grupo PS/veículo (o grupo controle negativo). Esse percentual é superior ao da Sessão 2 obtido para todos os grupos. Os indivíduos do grupo SP/suplemento possuem menos interações com o objeto antigo que com o objeto novo e, portanto, os indivíduos desse grupo reconhecem o objeto antigo exibido durante a Sessão
2. Além disso, os indivíduos do grupo SP/suplemento possuem um percentual de interações, tanto em termos de frequência como de duração, com o objeto novo exibido que é equivalente aos dos grupos NS/veículo e NS/suplemento.
[00168] A tensão pré-natal (SP) induziu, portanto, déficits de memória de reconhecimento muito consideráveis no caso do objeto novo.
[00169] Surpreendentemente, o suplemento permitiu atenuação muito significativa e completa dos déficits de memória de reconhecimento induzidos pela tensão pré-natal.
CONCLUINDO
[00170] O tratamento com suplemento atenuou significativa e completamente o comportamento ansioso, bem como os déficits de memória de reconhecimento induzidos pela tensão pré-natal.
[00171] A tensão pré-natal praticada nesse experimento induz significativamente o comportamento ansioso e altera muito significativamente a memória de reconhecimento em fêmeas jovens de ratos.
[00172] Aplicando-se a fórmula de cálculo da dose diária equivalente em seres humanos, portanto, tratamento preventivo que atenua os distúrbios cognitivos causados por tensão pré-natal pode ser definido com a ingestão diária de 0,05 a 0,1 mg de suplemento/kg de peso do corpo.
EXEMPLO 4
TESTE DE EXTRATO NATURAL DA MICROALGA PHAEODACTYLUM TRICORNUTUM NO CONTEXTO DO MODELO IN VIVO SOBRE A ATENUAÇÃO DOS DÉFICITS INDUZIDOS PELO DECLÍNIO COGNITIVO RELATIVO À IDADE
[00173] O suplemento alimentar de acordo com a presente invenção é preparado com um extrato de Phaeodactylum tricornutum que compreende, em mg/g: - ácidos graxos do tipo ômega 3 (ALA, SDA, EPA e DHA): 66,6 ± 11,5; - fucoxantina: 20,0 ± 4,0; - esteróis: 3,0 ± 0,6; e - ficoprostano: 0,0025 ± 0,0005.
[00174] O suplemento é obtido por meio da adição de óleo de coco em proporção de 410 mg ± 20 mg/g ao mencionado extrato.
[00175] O suplemento é incorporado a bolinhos de acordo com quatro formulações diferentes, de forma que as quantidades incorporadas do suplemento nos diferentes lotes de bolinhos correspondam a doses diárias equivalentes para seres humanos conforme descrito na Tabela 2 e, por meio de diluição da composição descrita abaixo em óleo de coco com massa final igual para todas as formulações.
[00176] O cálculo da dose diária equivalente humana, a partir da dose diária testada em camundongos, é definido conforme segue pela FDA (Guidance, 2005): a dose diária em seres humanos expressa em mg/kg de peso do corpo (HED humana) é igual à dose diária no animal expressa em mg/kg de peso do corpo (HED de animal) multiplicada pela razão entre o fator de segurança (Km de animal) no animal considerado e o fator de segurança para seres humanos (Km humano). Km humano é igual a 37 e Km de camundongos é igual a 3.
[00177] Um lote de bolinhos adicional é formulado apenas com o óleo de coco, de forma que a concentração de veículo seja equivalente à dos outros lotes, ou seja, 0,01% (p/p).
[00178] Os cinco lotes de bolinhos obtidos desta forma são indicados conforme descrito na Tabela 2 abaixo.
TABELA 2 Dose de suplemento equivalente para seres humanos Bolinhos formulados Referência (mg de suplemento/kg de massa do corpo/dia) Óleo de coco (veículo) 0 Veículo Suplemento 1,7 D1 Suplemento 3,3 D2 Suplemento 4,2 D3 Suplemento 5,3 D4
[00179] O modelo in vivo considerado é o modelo de D-Galactose aplicado a camundongos que é adaptado ao estudo do declínio cognitivo relativo à idade. De fato, esse modelo imita as numerosas características moleculares e comportamentais do envelhecimento cerebral em modelos de roedores.
[00180] D-Galactose é administrada por via subcutânea em proporção diária de 150 mg/kg de peso úmido de camundongos e o suplemento alimentar acima é incorporado a grânulos, de acordo com o padrão a seguir: - do dia -28 ao dia 51, o suplemento é administrado por meio de incorporação a grânulos alimentares; - do dia 1 ao dia 51, a D-Galactose é administrada por via subcutânea, cinco dias por semana; e - do dia 43 ao 51, três testes comportamentais diferentes são utilizados para monitorar os efeitos dos compostos de teste.
[00181] A eficácia do suplemento é determinada de acordo com os parâmetros a seguir: aprimoramento dos déficits de aprendizado (memória de trabalho espacial: alternância espontânea no labirinto Y de acordo com o teste de labirinto Y; memória espacial do chamado teste de “Labirinto de Água Morris” e memória contextual de longo prazo no teste de prevenção passiva), taxa de peroxidação de lipídios (LPO) no hipocampo e efeito sobre os marcadores de neuroinflamação IL6 e TNFα.
APRIMORAMENTO DOS DÉFICITS DE APRENDIZADO - no dia 43, todos os animais foram testados para determinar o desempenho de alternância espontâneo no teste de labirinto Y (YM), por meio de um índice de memória de trabalho espacial; - do dia 44 ao dia 49, todos os animais foram testados para determinar a memória espacial no teste de Labirinto de Água Morris (MWM), por meio de um índice de memória espacial; - do dia 44 ao dia 49, todos os animais são testados por meio do teste MWM para determinar a memória de trabalho espacial; e - nos dias 50 e 51, a memória contextual de longo prazo dos animais é determinada utilizando-se o processo de prevenção passiva escalonada (STPA), por meio de sessões de treinamento e retenção, respectivamente.
TAXA DE PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDIOS (LPO) NO HIPOCAMPO E EFEITO SOBRE OS MARCADORES DA NEUROINFLAMAÇÃO IL6 E TNFα:
[00182] No 51º dia, após os testes comportamentais, os animais sofreram eutanásia.
[00183] Para todos os animais, sangue do tronco é coletado e centrifugado para recuperação de plasma e o cérebro é rapidamente retirado.
O hipocampo e o córtex são dissecados, o hipocampo é utilizado em seguida para determinar as taxas de peroxidação de lipídios por meio de um método colorimétrico; o córtex semifrontal e o plasma são utilizados para determinar o nível dos biomarcadores inflamatórios interleucina 6 (IL-6) e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α).
[00184] A quantificação das taxas de peroxidação de lipídios (LPO) foi conduzida de acordo com o procedimento modificado e adaptado de Hermes-Lima et al. Esse método mede a capacidade dos lipídios peroxidados do cérebro de oxidar um complexo de óxido ferroso e laranja de xilenol, revelado na presença de hidroperóxido de cumeno (HPC). O nível de peroxidação de lipídios é determinado em equivalentes de HPC de acordo com a fórmula: HPCE = A5801/A5802 x [HPC (nmol)] e expresso em equivalentes de HPC por peso de tecido úmido e percentual em comparação com os dados obtidos para o grupo controle (D- Galactose + veículo).
[00185] Os teores de IL6 e TNFα são quantificados por meio de testes ELISA com os kits a seguir: - para quantificação de IL6: ThermoScientifique, EM2IL6; e - para quantificação de TNFα: ThermoScientifique, EMTNFA.
[00186] Para todos os testes, o córtex é homogeneizado após descongelamento em tampão de 50 mM Tris-150 mM NaCl, pH 7,5, e sonicado por 20 s. Após a centrifugação (16.100 g por 15 min, 4 °C), sobrenadante ou plasma é utilizado para os testes ELISA de acordo com as instruções do fabricante dos testes ELISA. Para cada teste, a absorção é lida a 450 nm e a concentração da amostra é calculada utilizando-se a curva padrão. Os resultados são expressos em pg de marcador por mg de tecido úmido.
[00187] Todos os valores, exceto pelas latências de prevenção passiva, são expressos na forma de média mais ou menos o desvio padrão da medição. Análises estatísticas são realizadas separadamente para cada composto, utilizando ANOVA unidirecional (valor F), seguido por um teste de múltiplas comparações post-hoc de Dunnett. As latências de prevenção passiva não seguem distribuição gaussiana, pois os tempos limite superiores são fixos. Elas são analisadas, portanto, utilizando ANOVA não paramétrico Kruskal-Wallis (valor H), seguido por teste de múltiplas comparações de Dunn.
Valores p < 0,05 são considerados estatisticamente significativos.
[00188] Os testes são realizados sobre 72 camundongos machos, distribuídos em 6 grupos de 12 camundongos, dentre os quais o grupo 1 é o grupo controle negativo e os grupos 2-6 são os grupos controle positivos: - o grupo 1 é o grupo ao qual é administrada uma solução salina subcutânea no lugar de D-Galactose e bolinhos B1; - o grupo 2 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos B1; - o grupo 3 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos B2; - o grupo 4 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos B3; - o grupo 5 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos B4; e - o grupo 6 é o grupo ao qual são administrados D-Galactose e bolinhos B5.
EFEITOS SOBRE A MEMÓRIA ESPACIAL NO TESTE DE ALTERNÂNCIA ESPONTÂNEA LABIRINTO Y
[00189] Os resultados são representados na Figura 11, em que o primeiro diagrama (à esquerda) ilustra os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre os déficits de alternância espontâneas e o segundo diagrama (à direita) ilustra os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a atividade locomotora.
[00190] Na Figura 11: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; * p<0,05, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, # p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,0001 vs. o grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00191] Observa-se que o tratamento com D-Galactose alterou significativamente a memória de trabalho espacial, em comparação com os camundongos tratados com a solução salina.
[00192] O suplemento D1 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose. Os suplementos D2, D3 e D4 atenuaram, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
EFEITOS SOBRE OS DÉFICITS DE APRENDIZADO INDUZIDOS PELO D-GAL DE ACORDO COM O TESTE MWM
[00193] Os resultados são apresentados na Figura 12.
[00194] Na Figura 12: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ##
p<0,01, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de múltiplas comparações de Bonferroni após ANOVA bidirecional.
[00195] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente o aprendizado espacial, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00196] O suplemento A1 atenuou de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose.
[00197] Os suplementos D2, D3 e D4 atenuaram, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose.
EFEITOS DO SUPLEMENTO SOBRE OS DÉFICITS DE APRENDIZADO INDUZIDOS PELA D- GALACTOSE
[00198] Os resultados são apresentados na Figura 13.
[00199] Na Figura 13: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo/Veículo; ### p<0,0001 vs. grupo D- GAL 150/grupo Veículo; teste de múltiplas comparações de Bonferroni após ANOVA bidirecional. “T”, o tempo decorrido no quadrante alvo; “O”, o tempo médio decorrido nos outros três quadrantes.
[00200] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente o aprendizado espacial, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00201] Os suplementos D1 e D2 atenuaram de forma muito significativa, mas parcial, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[00202] Os suplementos D3 e D4 atenuaram, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[00203] Efeitos sobre os déficits de prevenção passiva induzidos por D-Galactose em camundongos:
[00204] Os resultados são representados na Figura 14, com os efeitos do suplemento de acordo com a presente invenção sobre a latência de inibição ilustrados no diagrama do lado esquerdo e sobre a latência de passagem ilustrados no diagrama do lado direito, medidos durante o período de retenção.
[00205] Na Figura 14: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00206] A intoxicação crônica com D-Galactose alterou consideravelmente a memória de trabalho contextual de longo prazo, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00207] O suplemento D1 não demonstrou efeito sobre a memória contextual de longo prazo.
[00208] Os suplementos D2, D3 e D4 atenuaram, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D- Galactose.
EFEITOS DO SUPLEMENTO SOBRE A PEROXIDAÇÃO DE LIPÍDIOS INDUZIDA PELA D- GALACTOSE
[00209] Os resultados são apresentados na Figura 15.
[00210] Na Figura 15: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; ** p<0,01, *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ## p<0,01, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00211] A intoxicação crônica com D-Galactose aumentou consideravelmente a tensão oxidativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00212] O suplemento D1 reduziu de forma muito significativa, mas parcial, a tensão oxidativa induzida pela intoxicação crônica com D- Galactose.
[00213] Os suplementos D2, D3 e D4 reduziram, de forma muito significativa e completa, a tensão oxidativa induzida pela intoxicação crônica com D-Galactose.
EFEITOS DO SUPLEMENTO SOBRE A EXPRESSÃO INDUZIDA DE TNF-Α NO CÓRTEX E NO PLASMA PELA D-GALACTOSE
[00214] Os resultados são representados na Figura 16, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito.
[00215] Na Figura 16: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00216] A intoxicação crônica com D-Galactose aumentou o TNF- α no córtex e no plasma de forma significativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00217] O suplemento D1 reduziu, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro e no plasma.
[00218] O suplemento D2 reduziu, de forma muito significativa e completa, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro, mas parcialmente no plasma.
[00219] O suplemento D3 reduziu, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro e completamente no plasma.
[00220] O suplemento D4 reduziu, de forma muito significativa e completa, o aumento de TNF-α induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro e no plasma.
EFEITOS DO SUPLEMENTO SOBRE A EXPRESSÃO INDUZIDA DE IL-6 NO CÓRTEX E NO PLASMA PELA D-GALACTOSE
[00221] Os resultados são representados na Figura 17, com o efeito sobre o córtex no diagrama do lado esquerdo e o efeito sobre o plasma no diagrama do lado direito.
[00222] Na Figura 17: sol. salina/veículo corresponde ao controle negativo (o grupo que não foi tratado com D-galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); DGal 150/Veículo corresponde ao controle positivo (o grupo que foi tratado com D-Galactose e alimentado com os bolinhos formulados com o veículo, óleo de coco); D1, D2, D3 e D4 em doses crescentes do suplemento; N é de 11 a 12, dependendo dos grupos; *** p<0,0001 vs. solução salina/grupo Veículo, ### p<0,0001 vs. grupo D-GAL 150/grupo Veículo; teste de Dunnett.
[00223] A intoxicação crônica com D-Galactose aumentou a IL-6 no córtex e no plasma de forma significativa, em comparação com o grupo controle negativo (solução salina/veículo).
[00224] Os suplementos D1 e D2 reduziram, de forma muito significativa, mas parcial, o aumento de IL-6 induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro e no plasma.
[00225] Os suplementos D3 e D4 reduziram, de forma muito significativa e completa, o aumento de IL-6 induzido pela intoxicação crônica com D-Gal no cérebro e no plasma.
CONCLUINDO
[00226] A intoxicação crônica com D-Galactose induziu muito significativamente alteração da memória de trabalho espacial, da memória contextual de longo prazo e prejudicou o aprendizado espacial. As alterações comportamentais também estão relacionadas a alterações bioquímicas manifestadas em aumento da tensão oxidativa e indução de processos neuroinflamatórios.
[00227] O tratamento preventivo com o suplemento de acordo com a presente invenção é dependente da dose e atenuou, de forma muito significativa e completa, no caso da dose mais forte testada (o suplemento D4), os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose em termos de alteração comportamental, aumento da tensão oxidativa e ativação de processos neuroinflamatórios. Nos casos de doses inferiores intermediárias (os suplementos D2 e D3), o suplemento de acordo com a presente invenção atenuou, de forma muito significativa e completa, os déficits induzidos pela intoxicação crônica com D-Galactose em termos de memória de trabalho espacial, aumento da tensão oxidativa e ativação de processos neuroinflamatórios.
[00228] Aplicando-se a fórmula de cálculo da dose diária equivalente em seres humanos, portanto, tratamento preventivo do declínio cognitivo relativo à idade pode ser definido com a ingestão diária de 1,7 a 5,3 mg de suplemento/kg de peso do corpo.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. COMPOSIÇÃO caracterizada por compreender pelo menos 50 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, pelo menos 10 mg/g de uma ou mais xantofilas, pelo menos 1 mg/g de um ou mais esteróis e pelo menos 2 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
2. COMPOSIÇÃO de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender 50 a 250 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 50 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 20 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 100 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
3. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por compreender 50 a 200 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 30 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 8 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 50 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
4. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender 50 a 170 mg/g de um ou mais ácidos graxos do tipo ômega 3, 10 a 25 mg/g de uma ou mais xantofilas, 1 a 6 mg/g de um ou mais esteróis e 2 a 40 µg/g de um ou mais ficoprostanos.
5. SUPLEMENTO ALIMENTAR caracterizada por compreender uma composição conforme definido em qualquer das reivindicações 1 a 4 e pelo menos um óleo selecionado a partir de triglicerídeos de cadeia média (MCT).
6. SUPLEMENTO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos triglicerídeos de cadeia média (MCT) serem selecionados a partir de óleo de coco e óleo de palma.
7. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 ou 6, caracterizado por um ou pelo menos um dos ácidos graxos do tipo ômega 3 ser selecionado a partir de ácido estearidônico (SDA), ácido eicosapentaenoico
(EPA), ácido docosa-hexaenoico (DHA) e suas misturas.
8. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 e 7 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7, caracterizado por uma ou pelo menos uma das xantofilas ser fucoxantina.
9. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, 7 ou 8 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 8, caracterizado por um ou pelo menos um dos esteróis ser selecionado a partir de fitoesteróis.
10. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 9 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 9, caracterizado por um ou pelo menos um dos ficoprostanos ser selecionado a partir de fitoprostanos, isoprostanos e neuroprostanos.
11. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 10 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 10, caracterizado por compreender adicionalmente pelo menos um aditivo selecionado a partir de agentes conservantes, corantes, aromatizantes, agentes de desintegração, agentes lubrificantes, agentes de revestimentos ou de encapsulação.
12. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 11 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 11, caracterizado por apresentar-se na forma de cápsulas de gel, cápsulas, comprimidos, pastilhas ou pó solto.
13. COMPOSIÇÃO de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 12 ou suplemento alimentar de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 12, caracterizado por ser embalado em doses que contêm peso unitário de 10 mg a 1 g.
14. USO DE MICROALGA selecionada a partir de qualquer um dos táxons Pinguiophyceae, Chrysophyceae, Bacillariophyceae, Mamiellophyceae, Prymnesiophyceae, Haptophyceae, Coccolithophyceae, Isochrysidaceae e Phaeodactylaceae, para preparar uma composição conforme definindo em qualquer das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 13 ou suplemento alimentar conforme definido em qualquer das reivindicações 5 a
13.
15. USO de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pela mencionada microalga ser Tisochrysis lutea ou Phaeodactylum tricornutum.
16. USO DE SUPLEMENTO ALIMENTAR conforme definido em qualquer das reivindicações 5 a 13, caracterizada por ser para evitar o surgimento de distúrbios cognitivos relativos à idade, definidos como redução não patológica das funções cognitivas, ou distúrbios cognitivos em crianças ou jovens adultos que foram submetidos a tensão pré-natal indutora de distúrbios não patológicos, tais como hiperatividade, déficit de atenção e memória, atrasos de linguagem e comportamento ansioso.
17. USO DE SUPLEMENTO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 16, para evitar o surgimento de distúrbios cognitivos relativos à idade, definidos como redução não patológica das funções cognitivas, caracterizado pela ingestão diária ser de 2 a 5 mg de extrato/kg de peso do corpo.
18. USO DE SUPLEMENTO ALIMENTAR de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por ser para evitar o surgimento de distúrbios cognitivos em crianças ou jovens adultos que foram submetidos a tensão pré- natal indutora de distúrbios não patológicos, tais como hiperatividade, déficit de atenção e memória, atrasos de linguagem e comportamento ansioso, caracterizado pela ingestão diária ser de 0,05 a 0,1 mg de extrato/kg de peso do corpo.
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