KR20140052580A - 해조류에서 추출한 후코잔틴을 포함하는 신경보호용 조성물 - Google Patents

해조류에서 추출한 후코잔틴을 포함하는 신경보호용 조성물 Download PDF

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KR20140052580A
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Abstract

본 발명은 해조류, 특히 미역 귀에서 추출한 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 해조류 추출물을 포함하는 기능성 식품 및 제약 조성물은 신경보호 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 독성이 없으므로 이를 요하는 식품, 또는 의약으로 효율적으로 사용될 가능성이 매우 높다.

Description

해조류에서 추출한 후코잔틴을 포함하는 신경보호용 조성물{Neuroprotective Composition for Comprising Algae Extract Fucoxanthin}
본 발명은 해조류, 특히 미역 귀에서 추출한 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 제약 조성물에 관한 것이다.
인간수명의 증가에 따라 삶의 질 향상에 대한 욕구 또한 증가하고 있다. 이에 따라서 화학적 방법을 통해 개발된 제품들이 이용되어 왔지만 이들이 가지고 있는 장시간 사용으로 인한 문제점, 부작용 등의 문제로 약효와 안정성이 보장된 천연물 유래 신약 개발에 대한 관심의 증대로 나타나고 있다. 천연물을 이용한 생약 혹은 기능성 제품은 근래에 전 세계의 대부분 국가들에서 고대부터 전해지고 있는 전통요법에 대한 신뢰를 얻으면서 점차 사용량과 범위가 증가하고 있다. 이와 관련하여 전통의 생약제제나 기타 동식물 혹은 미생물로부터 활성물질을 분리, 규명하여 이들을 토대로 의약품, 향장품, 기타 산업적 소재를 연구개발하려는 시도들이 지속적으로 증가하고 있다.
선진국에서는 이미 1960년대부터 신물질 및 유용물질의 중요한 원천으로서 해양생물을 인식하고 많은 연구투자를 하여 왔다. 더욱이 오랜 기간 천연물의 보고이었던 육지생물로부터 유용물질의 개발이 근래에 한계를 나타내며, 점차 정체되는 경향을 나타냄에 따라 해양생물의 중요성이 더욱 부각되어 집중적인 연구를 하고 있으며 엄청난 성과를 얻고 있다. 많은 연구들을 통해서 기술적인 측면에서는 관련분야인 육상천연물에 근접하고 있으며 천연물을 활용하는 생화학, 생물유기화학, 유기합성화학 등의 분야에서도 해양천연물을 대상으로 하여 이루어진 연구결과가 무수히 보고되는 실정이다. 미국, 일본 등에서는 21세기 생물 산업을 주도할 핵심 분야의 하나로서 해양생물의 대사물질을 인정하고 막대한 연구투자를 하고 있다. 최근 중국, 인도, 칠레 등 개발도상국에서도 해양천연물에 대한 연구가 점차 활발하여지고 있으며 기술적으로 우수한 연구결과가 상당 수 보고되고 있다.
해양생물 중에서 녹조류 (Chlorophyta), 갈조류 (Phaeophyta), 홍조류 (Rhodophyta)를 비롯한 해조류들은 1970년대부터 주로 탐색되어 왔으며 acetogenins, oxylipins,polyphenyl ethers, terpenoids, steroids, nucleosides 등 2,500 여 물질이 보고된바 있으며, polysaccharides나 haloperoxidase 등 고분자물질도 다수 알려져 있다. 이들 중에서 상당수는 강력한 항균, 항암, 항바이러스, 효소활성저해 등의 생리활성을 나타내어 curacin A, 등은 의약품으로 개발되기 위한 임상단계에 진입해 있다. 해조류 천연물의 미백, 보습, 항산화 등의 활성을 이용하여 최근에는 프랑스, 일본 등을 중심으로 해조류 추출물이나 분획이 기능성 향장품의 활성성분으로 널리 활용되고 있다. 한편 국내에서는 해조류를 비롯한 다양한 생물이 근해에 서식함에도 불구하고 천연물연구의 대상이 육지의 식물과 미생물에 집중되어 있어서 이 분야의 연구가 미미한 실정이다. 그러나 최근 제주도에서 서식하는 갈조류인 감태로부터 강력한 항산화 활성을 나타내는 씨놀을 분리하여 최근 국내의 대학과 연구소를 중심으로 이 분야의 연구가 점차 활성화되고 있으나, 아직 대체적인 수준은 활성물질의 탐색에 머물러 있다.
해양천연물연구의 발전은 국내의 천연물 및 생물소재연구의 기술수준의 향상과 더불어 연구대상의 확대측면에서도 매우 중요하다. 또한 유용 해양천연물 및 이를 생산하는 생물소재에 대한 연구는 신물질의 개발뿐만 아니라 국내의 정밀화학과 생명공학의 기반기술의 균형적인 발전 측면에서 중요하며 날로 가열되고 있는 국가 간의 생물자원의 개발경쟁에 있어서 기술력의 중요성을 고려할 때 이 분야의 연구는 대단히 시급하다고 볼 수 있다.
특허문헌 1: 공개특허공보 제10-2002-0062892호(2002.07.31)
본 발명자들은 우리나라 연안의 해조류를 대상으로 새로운 기능성 성분을 개발하고자 예의 연구한 결과, 후술하는 바의 해조류인 미역귀에서 추출된 후코잔틴이 신경보호 작용을 가짐을 발견함으로써 이것이 관련 건강 기능성 식품, 또는 제약 조성물로 효율적으로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 해조류, 특히 미역귀에서 추출한 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 제약 및 건강 보조식품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명이 해결하려는 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 해조류 추출물을 포함하는 기능성 식품 및 제약 조성물은 신경보호 효과가 뛰어날 뿐만 아니라 독성이 없으므로 이를 요하는 식품, 또는 의약으로 효율적으로 사용될 가능성이 매우 높다.
도 1은 미역귀에서 분리한 활성 성분의 HPLC 크로마토그램.
도 2는 미역귀에서 분리한 성분의 UV-vis 스펙트럼.
도 3은 미역귀에서 분리한 성분의 HPLC-API-MS 스펙트럼.
도 4는 미역귀에서 분리한 성분의 13C-NMR 스펙트럼.
도 5는 미역귀에서 분리한 성분의 1H-NMR 스펙트럼.
도 6은 미역귀에서 분리한 all-trans-후코잔틴의 화학 구조.
도 7은 SH-SY5Y에서 세포 생존능에 미치는 (A) 후코잔틴 및 (B) 6-OHDA의 영향을 나타내는 그라프도.
도 8은 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA-유도 세포독성에 미치는 후코잔틴의 보호 효과를 나타내는 그라프도.
도 9는 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA-유도 ROS 발생에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
도 10은 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 6-OHDA-유도 감소에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
도 11은 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA-매개 세포내 Ca2+증가에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
도 12는 SH-SY5Y 세포에서 세포사멸 핵 형태학에서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
도 12는 세포 사멸 단백질의 발현 레벨에 있어서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
도 13은 소포체 스트레스-관련 단백질의 발현 레벨에 있어서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도.
본 발명은, 일면에 있어서, 해조류, 특히 미역귀에서 추출한 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 제약 및 건강 보조식품 조성물을 제공한다.
상기 신경보호용 제약 및 건강 보조식품 조성물은 후술하는 시험예의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 신경보호를 요하는 질환, 특히 노화-관련 신경퇴화, 노화-관련 인지 감퇴 및 노화-관련 기억력 손상을 예방, 완화 또는 치료할 수 있다. 이것은 또한 인간에서, 바람직하게는 노인에서 기억력, 주의력 및 경계력을 향상시키기 위한 물질로 작용한다.
본 발명의 신경보호용 제약 및 건강 보조식품 제품은 포유동물, 특히 사람, 가장 바람직하게는 노인에서 노화 과정과 관련된 결핍증이나, 산화 대사 과정이 역할을 하는 신경 퇴화성 질환, 예를 들어 헌팅톤무도병(Huntington's chorea), 알쯔하이머(Alzheimer) 병, 노인성 치매, 피크(Pick), 병, 코르사코프(Korsakoff) 병, 올리브교소뇌위축, 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨 병, 다운 증후군, 글루타르 에시데미아(glutaric acidaemia), 간질, 경련 상태, 다경색 치매, 인지 장애 비 치매(CIND), 및 바이러스 감염 유도된 신경 퇴화, 특히 신경-AIDS 포위 치매, 인식 곤란, 진행성 구어장애, 운동실조, HIV 감염에 의한 신경장애 및 근 장애, 뇌 손상, 척추 손상, 말초신경 손상 또는 뇌 염증을 포함한 질환을 경감, 완화 또는 치료하는데 치료학적으로 유용할 수 있다.
본 발명의 신경보호용 제약 또는 건강 보조식품 제품은 노화 과정에 따른 대사결핍 및 스트레스로부터 뉴런을 보호하고, 저산소증 또는 허혈 예후로 인한 노화 관련 뉴런 손상, 세포내 칼슘 과잉부하로 인한 노화 관련 뉴런 손상, L-글루타메이트에 의해 유도된 노화 관련 뉴런 손상 예후, 산화 스트레스에 기인한 노화 관련 뉴런 손상의 예후를 예방, 방해, 완화 및/또는 치료하기 위한 물질로서 사용될 수 있다.
본 발명의 신경보호용 제약 또는 건강 보조식품 제품은 노화 관련 신경퇴화의 예후를 방지, 방해 및/또는 완화하고, 세포 스트레스에 기인한 신경 세포 치사, 신경퇴화 및 중독을 방지하며, 노화 과정 동안 정상적인 뉴런 세포구축을 유지하고 보존하며, 시냅스 작용 및 시냅스 밀도를 지지하고 및/또는 향상시키며, 시냅스 유연성 및 시냅스 밀도의 노화 관련 감퇴 예후를 방지, 방해 및/또는 완화하며, 주의력 및 기억력과 관련된 뇌 메카니즘을 활성화하며, 인지 작용 감퇴를 방지, 방해 및/또는 개선하며, 주의력 결핍을 예방, 방해 및/또는 개선하며, 노화 과정과 관련된 경계력 감소를 방지, 방해 및/또는 개선하며, 또 장기간 기억력 및 과정 기억력 뿐만 아니라 학습 능력, 주의력 및 경계력을 지지, 유지 및/또는 개선하고 또 노화 과정 동안 정신 건강을 보존/지지하는데 특히 유용하다.
본 발명에 따른 신경보호용 제약 및 건강 보조 식품 조성물의 유효성분으로 함유되는 해조류 유래의 후코잔틴 추출물은 약학적으로 허용가능한 결합제(예, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스), 붕해제(예, 카복시메틸셀룰로오스칼슘, 전분글리콜산나트륨), 희석제(예, 옥수수전분, 유당, 콩기름, 결정셀룰로오스, 만니톨), 활택제(예, 스테아린산 마그네슘, 탈크), 감미제(예, 백당, 과당, 솔비톨, 아스파탐), 안정제(카복시메틸셀룰로오스나트륨, 알파 또는 베타 싸이클로덱스트린, 비타민 C, 구연산, 백납), 보존료(예, 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 안식향산나트륨) 및 향료(예, 에틸바닐린, 마스킹후레바, 멘톨후라보노, 허브향)와 혼합하여 정제, 캅셀제, 연질캅셀제, 액제, 연고제 또는 주사제와 같은 약학적 제제로 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 또는 건강보조식품 조성물은 경구제 또는 비경구제의 형태로 투여하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 제약 또는 건강 보조식품 조성물의 복용량은, 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 개인의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 1 mg ∼ 2000 ㎎/㎏이다. 물론 복용량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 범위 보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.
본 발명에 따른 건강 보조식품 조성물은 원하는 조성물의 형태에 따라 통상의 보조제 또는 첨가제, 또는 감미료, 예를 들면 감초, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다.
이들은 본 발명의 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.
음료수는, 예를 들면, 상기 해조류의 메탄올 추출물을 0.01~20 중량%으로 넣고, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~2 중량% 등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 기능성 음료수로 제조할 수 있다.
<후코잔틴의 급성독성실험>
6 내지 7주령 된 비설치류 비글견을 대상으로 본 발명의 후코잔틴을 투여하여 24시간 내의 개체사망율을 조사하였으며, 이때 암컷은 6 내지 8㎏인 개체를, 수컷은 7 내지 9㎏인 개체를 각각 8마리 사용하였다. 그 결과, 5g/kg 까지 죽은 개체가 발생하지 않아, 본 발명의 후코잔틴은 kg당 5g까지도 급성독성을 관찰할 수 없을 만큼 안전하므로, 신경보호용 제약 조성물로 생체내에 안전하게 투여할 수 있다.
<유효량>
본 발명에 있어서의 약제학적 조성물 중 유효성분인 후코잔틴 추출물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 증상, 투여방법 또는 예방목적에 따라, 체중 kg 당 1 내지 2,000 ㎎을 일일 1회 내지 3회 분복할 수 있다. 특이 증상을 나타내는 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수도 있다.
<실시예>
이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 후코잔틴(Fucoxanthin)의 분리 및 정제
1-1. 시료조제
미역 귀는 2012년 2월경에 제주도 해안지역에서 채취한 것을 사용하였다. 채취한 시료는 증류수로 2회 세척한 다음 동결건조한 후 40 메쉬 이하로 분쇄하여 -20℃의 냉동실에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.
1-2. 사용기기
UV-가시화 분광기(visible spectrophotometer)는 Jasco사의 JP/J-500 A와 용매로서 아세톤을 사용하였다. HPLC는 Sycam S2100 용매 전달 시스템(solvent delivary system), S5200 샘플 주입기(sample injector), S3210 다이오드 어레이 검출기(DAD) 및 Sunfire C18 (30cm x 4.6mm) 칼럼을 사용하였다. HPLC 조건으로 용출용매는 메탄올 : 아세트산 혼합액(80:20, v/v) (A액)과 메탄올 : 아세톤 혼합액 (60:40, v/v) (B액)을 사용하여 구배 모드(gradient mode)로 분석하였으며 분리된 성분은 430 nm에서 검출하였다. 기울기 용리 조건은 95% A/5% B(0 분), 0% A/100% B (20 분), 0% A/100% B (20 분), 95% A/5% B (4 분)으로 하였다. 1H-NMR (600 MHz) 및 13-NMR (125 MHz)은 JEOLLTD, FNM-ECA 600(Japan) 사제 모델을 사용하였으며 용매는 DMSO-d6, 내부표준 물질은 트리메틸실란(TMS)를 사용하였다. HPLC-MS는 Agilents 제품(USA)를 사용하여 분석하였다.
1-3. 후코잔틴의 추출
동결건조 미역 귀 분말 200g에 아세톤-메탄올(7:3, v/v) 혼합액 1,000 mL를 가한 다음 실온에서 24시간 동안 교반한 후 글래스 필터로 여과하였다. 여과 잔사는 위에서와 동일한 방법으로 한번 더 추출한 다음 여과하였다. 여과액은 합하여 40℃에서 회전 증발기로 감압 농축하여 추출물 8.8 g을 얻었다.
이어서 추출물에 n-헥산 200 mL와 90% 메탄올 용액을 200 mL를 가하고 격렬히 혼합한 다음 층이 분리될 때까지 방치하여 90% 메탄올 층만을 취하였다. 90% 메탄올 층에 증류수를 가하여 70% 메탄올 용액이 되도록 한다음 n-헥산 (100mL x 3회)으로 녹색 색소를 추출하여 제거하고 70% 메탄올 층은 감압 농축하여 색소를 함유하는 분획을 얻었다.
1-4. 분리 및 정제
색소를 함유하는 분획은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 즉 150 g의 실리카 겔(70∼230 메쉬, Merck Co. Germany)을 n-헥산:아세톤(70:30, v/v)에 현탁시켜 컬럼(3.5 x 40 cm)에 충진한 후 위에서와 같이 얻어진 색소를 함유하는 분획을 소량의 n-헥산:아세톤(70:30, v/v)에 용해시킨 다음 칼럼에 로딩하였다.
칼럼은 n-헥산 : 아세톤 75:25, 70:30, 60:40 및 50:50 혼합액 각각 500 mL씩으로 용출하였다. 용출액은 분획 수집기(fraction collector)를 사용하여 20 ml씩 분취한 다음 전개용매로서 아세톤:메탄올 (70:30, v/v) 혼합액을 사용하여 TLC를 실시한 후 동일한 Rf 값을 가지는 성분만을 모아 감압 농축하여 적갈색의 분말 105 mg을 얻었으며 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 미역귀에서 분리한 활성 성분의 HPLC 크로마토그램이다. 분리된 성분의 HPLC에 의한 순도는 도 1에서와 같이 98.0% 이상이었다.
1-5. 후코잔틴의 구조 동정
분리된 성분의 UV-가시화 스펙트럼(visible spectrum)은 도 2에 나타내었다. 도 2는 미역귀에서 분리한 성분의 UV-vis 스펙트럼이다. 도 2에서와 같이 446.5 nm에서 최대 흡수파장(λmax)을 나타내었고, LC-API-MS(positive mode)에 의한 분자 이온은 도 3에서와 같이 각각〔M〕+,〔M+H〕+, 〔M+2H〕+로 예측되는 m/z 659, 660 및 661이 검출되어 분자량은 659인 것을 알 수 있다. 도 3은 미역귀에서 분리한 성분의 HPLC-API-MS 스펙트럼이고, 도 4는 미역귀에서 분리한 성분의 13C-NMR 스펙트럼이며, 도 5는 미역귀에서 분리한 성분의 1H-NMR 스펙트럼이다.
또한 분리한 성분은 도 4의 13C-NMR 및 도 5의 1H-NMR 스펙트럼에서 분자내에 1개의 아세틸 기, 1개의 공액 케톤 기, 2개의 4급 다른자리 디메틸기, 2개의 4급 다른자리 산소 메틸기, 4개의 올레핀 메틸기 및 알렌기를 지니고 있는 폴리엔 계열 화합물인 것으로 추정되었으며, 표 1에 나타낸 바와 같이 13C-NMR, DEPT 및 1H-NMR spectrum의 해석 및 문헌상에 보고된 데이터(참조 문헌: Yan, X., Chuta, Y., Suzuki, M. and Nagata, T. (1999) Fucoxanthin as the major antioxidant in Hijikia fusiformis. Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(3), 605-607.; Heo, S. J., Ko, S. C., Kang, S. M., Kang, H. S., Kim, J. P., Kim, S. H., Lee, K. W., Cho, M. G. and Jeon, Y. J. (2008) Cytoprotective effect of fucoxanthin isolated from brown algae Sargassum siliquastrum against H2O2-induced cell damage. Eur. Food Res. Technol., 228, 145-151; Kim, S. M., Shang, Y. F. and Um, B. H. (2011) A preparative method for isolation of fucoxanthin from Eisenia bicylis by centrifugal partition chromatigraphy. Phytochemical Analysis, 22, 322-329.; 및 Kim, S. M., Jung, Y. J., Kwon, O. N., Cha, K. H., Um, B. H., Chung, D. and Pan. C. H. (2012) A potential commercial source of fucoxanthin extracted from the microalgae Phaeodactylum tricornutum. Appl. Biochem. Biotechnol., 166, 1843-1855.)와 비교한 결과 이 화합물은 도 6에서와 같이 갈조류의 특징적인 색소성분인 all-trans-후코잔틴인 것으로 확인되었다. 도 6은 미역귀에서 분리한 all-trans-후코잔틴의 구조이고, 표 1은 미역 귀에서 분리한 활성성분의 13C-NMR 및 1H-NMR 데이터이다.
Carbon
No		 13C-NMR
(ppm)		 DEPT 1H-NMR (ppm)
(J = Hz)
1 35.92 C
2 48.65 CH2 1.52 (1H, m)
3 62.26 CH 3.70 (1H, m)
4 42.45 CH2
5 66.05 C
6 66.94 C
7 40.98 CH2 3.80 (1H, d, J = 18.54)
8 198.47 C
9 134.35 C
10 139.84 CH 7.38 (1H, d, J = 10.98)
11 124.62 CH 6.65 (1H, m)
12 145.23 CH 6.86 (1H, m)
13 136.14 C
14 136.72 CH 6.5 (1H, d. J = 11.76)
15 130.40 CH 6.67 (1H, m)
16 28.18 CH3 0.95 (3H, s)
17 25.06 CH3 0.84 (3H, s)
18 21.23 CH3 1.21 (3H, s)
19 12.12 CH3 1.99 (3H, s)
20 13.07 CH3 2.03 (3H, s)
1' 35.40 C
2' 46.33 CH2 1.99 (1H, m)
3' 68.08 CH 5.25 (1H, m)
4' 45.98 CH2 1.52 (1H, m)
5' 71.37 C
6' 117.70 C
7' 202.19 C
8' 102.62 CH 6.10 (3H, s)
9' 133.13 C
10' 128.67 CH 6.20 (1H, d, J = 11.20)
11' 126.53 CH 6.66 (1H, m)
12' 137.17 CH 6.38 (1H, d, J = 14.86)
13' 138.16 C
14' 132.74 CH 6.35 (1H, d, J = 11.56)
15' 133.30 CH 6.76 (1H, t, J = 12.74, 12.74)
16' 31.07 CH3 1.10 (3H, s)
17' 29.32 CH3 1.33 (1H, s)
18' 32.46 CH3 1.41 (3H, s)
19' 14.32 CH3 1.86 (1H, s)
20' 13.30 CH3 2.00 (1H, s)
21' 170.31 C
22' 21.64 CH3 2.09 (1H, s)
실시예 2: 제약학적 제제
제형의 형태(정제)
실시예 1-4의 후코잔틴 분말 20 mg
락토오스 80 mg
전분 17 mg
스테아르산 마그네슘 3 mg
결정성 셀룰로오스 10 mg
본 발명의 한 실시 형태는 그 예를 상기에 나타낸 정제의 유효 성분으로써 상기 피브린분해효소의 용도이다. 정제는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 한 바람직한 실시형태는 통상의 장용성 피복(예를 들면, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스 프탈레이트), 당코팅 또는 피막 코팅을 갖는 정제 또는 연질캅셀 형태이다.
실시예 3: 음료수의 제조
실시예 1-4에서 얻은 후코잔틴 추출물 5g, 구연산 20g, 아스파탐 17 g을 첨가한 후 나머지를 정제수로 첨가하여 음료수 10 리터를 제조하여 저온 살균하였다. 결과적으로 본 발명 음료수는 종래의 음료수 제품과 입안 감촉, 맛 그리고 종합평가 면에서 양호한 반응을 얻었다.
시험예 1: 동물세포배양
인간 신경아세포종 세포주(Human neuroblastoma cell line) SH-SY5Y는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 분양받아 사용하였다. DMEM/F12 혼합물 내에 10% 태아 송아지 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가되어져 있는 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며, 72시간을 주기로 배지를 교체하였다. 또한 세포 밀도가 80%에 이르렀을 때 트립신-EDTA를 처리하여 계대 배양하였다.
시험예 2: 세포 생존율 분석
세포 생존율(cell viability) 변화를 측정하기 위해 MTT assay를 이용하였다. SH-SY5Y 세포는 1 X 104 cell/well로 96 웰 플레이트에 종배양(seeding)한 후 24시간 동안 5% CO2 인큐베이터에 배양하였다. 세포에 각 농도별로 처리한 후 24시간 동안 배양한다. 배양 후, 배지를 제거하고 5 mg/ml 농도로 녹인 MTT ([3-(4,5-dimethylthizol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 용액 10 ㎕ 씩 첨가하고 다시 4 시간 동안 37℃에서 배양한 후 각 웰 당 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 처리하여 형성된 크리스탈 포마잔을 녹인다. 이후 흡광도를 마이크로플레이트 판독기(ELISA reader, molecular device, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하게 된다. 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
후코잔틴이 SH-SY5Y 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 농도별로 처리한 결과는 도 7A에 나타낸 바와 같다. 도 7A는 SH-SY5Y에서 세포 생존능에 미치는 (A) 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도이다.
24시간 동안 처리한 결과, 5μM까지는 세포 생존율에 변화가 없었지만 10μM부터 세포 생존율이 10% 이상 감소함을 확인하였다.
시험예 3: LDH 측정
후코잔틴의 세포 보호효과를 측정하기 위한 방법으로 LDH(lactate dehydrogenase) 방출 에세이를 실시하였다. SH-SY5Y 세포를 1 x 104 cells/well로 96 웰 플레이트에 분주하여 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 후코잔틴을 세포 주에 2시간 동안 전처리하였다. 처리 후, 6-OHDA를 처리하여 24시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-웰 플레이트에 100 μl씩 분주하였다. 이 배양액에 LDH 시약을 100 μl씩 첨가하여 상온에서 25분간 반응시켰다. 반응 시킨 뒤 정지액(stop solution)인 1 N HCl을 100 μl씩 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA 판독기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 살아남은 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 제거한 후, 0.1% Triton X-100용액을 50 μl 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 진탕(shaking)시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH 시약 50 μl를 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조군과 비교한 값을 나타내었다.
산화적 스트레스에 의한 세포 사멸을 유도하기 위해 6-OHDA의 적정 농도를 정하기 위해 SH-SY5Y 세포에 6-OHDA를 농도별 (0~70μM) 로 24시간 동안 처리한 결과는 도 1B에 나타낸 바와 같다. 도 7B는 SH-SY5Y에서 세포 생존능에 미치는 (B) 6-OHDA의 영향을 나타내는 그라프도이다. 농도가 증가할수록 세포 생존율은 감소하였으며 50μM에서는 세포 생존율이 60%로 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서 세포 사멸을 유도하기 위한 6-OHDA의 적정 농도는 50μM로 하여 사용하였다.
시험예 4: 획스트(Hoechst) 33342 염색
세포의 핵의 형태변화를 측정하기 위해 Hoechst 33342를 이용하여 세포의 핵을 염색시키고 관찰하였다. 6 웰 플레이트에 1 x 105 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 2시간 동안 전처리 한 후, 6-OHDA를 24시간 동안 처리하였다. PBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드를 처리하여 15분 동안 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 10 μg/ml Hoechst 33342로 상온에서 15분 동안 염색하였다. 염색 후 PBS로 세척하고 현미경 하에서 관찰하였다.
이러한 조건에서 후코잔틴이 6-OHDA에 의해 유도된 산화적 스트레스 상태에서 SH-SY5Y 세포에 대한 보호효과를 나타내는지를 알아보기 위해 후코잔틴을 2시간 전처리 한 후 50μM의 6-OHDA을 24시간 동안 처리한 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다. 도 8은 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA-유도 세포독성에 미치는 후코잔틴의 보호 효과를 나타내는 그라프도. (A) MTT 에세이, (B) LDH 에세이.
먼저 후코잔틴이 6-OHDA에 의해 유도되는 SH-SY5Y 세포의 생존율 감소를 억제시키는 지를 알아보기 위해 MTT 에세이 방법을 이용하여 6-OHDA을 처리한 세포와 후코잔틴이 전처리된 세포의 생존율을 비교하였다(도 8A). 6-OHDA만 처리된 세포의 생존율은 60%이하로 감소되었지만, 후코잔틴을 2시간 동안 전처리하였을 때 후코잔틴의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 5μM에서는 80%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 동일한 조건하에서 6-OHDA에 의한 세포사멸 발생 정도를 측정하기 위하여 세포 사멸과정 중에 세포 밖으로 배출되는 효소중 하나인 LDH(lactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정하였다. 측정한 결과는 도 8B와 같다. 정상 세포에 비해 6-OHDA가 처리된 세포에서는 약 50% 정도로 LDH 방출 양이 증가됨을 확인할 수 있었다. 후코잔틴이 처리 된 세포에서는 농도가 증가할수록 LDH의 방출양이 감소됨을 확인할 수 있었으며 5μM에서는 약 20%정도로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과들은 후코잔틴이 6-OHDA에 의한 SH-SY5Y 신경세포의 손상을 억제한다는 것을 나타내고 있다.
시험예 5: 세포내 활성산소 측정
세포 내 활성산소(ROS) 측정은 2',7'-DCFH-DA(dichlorofluoroescein diacetate)가 세포 내로 투과된 후 아세틸기가 유리된 2',7'-DCFH(dichlorofluoroescin)의 형태에서 ROS와 반응하여 형광 물질을 생성하는 성질을 이용하였다. SH-SY5Y 세포를 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well cell이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 후코잔틴을 2시간 동안 전처리한 다음 6-OHDA를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 제거하고 10 μM DCFH-DA로 다시 30분간 처리한 후 플루오로세인 마이크로플레이트 판독기 (fluorescence microplate reader)를 이용하여 여기(excitation) 485 nm, 방출(emission) 535nm에서 형광을 측정하였다.
DCFH-DA는 세포내 DCFH로 전환되며 세포 내에 축적되어 세포내 존재하는 ROS와 반응하여 형광물질로 전환된다. 도 9는 후코잔틴을 2시간 전처리한 후 6-OHDA를 처리하였을 때, SH-SY5Y 세포 내의 ROS 생성에 미치는 영향을 DCFHDA를 이용하여 측정한 결과이다. 6-OHDA를 처리한 세포에서는 대조구 (100%)에 비하여 약 300%로 ROS가 증가하였지만 후코잔틴을 처리한 결과, 농도가 증가할수록 세포내 ROS의 생성을 감소시켰다. 이 결과는 후코잔틴이 6-OHDA에 의해 유도된 ROS에 의한 신경세포 사멸에 대해 보호 작용이 있음을 나타내고 있다.
시험예 6: 세포내 미토콘드리아의 막 전위 변화 측정
미토콘드리아의 막전위(membrane potential)의 변화를 조사하기 위하여 로다민(Rhodamine) 123을 이용하였다. SH-SY5Y 세포를 96 웰 플레이트에 1 x 104 cells/well cell이 되도록 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 후코잔틴을 2시간 동안 전처리한 다음 6-OHDA를 24시간 동안 처리하였다. 배지를 제거하고 로다민 123 (5 μg/ml)을 배지에 희석하여 처리한 후 20분간 반응 시킨 후 플루오레신 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다(여기: 485 nm, 방출 546 nm).
세포내 산화적 스트레스의 증가는 미토콘드리아의 막전위를 변화시키고 치토크롬(cytochrome) c의 방출량도 증가시킨다. 후코잔틴을 2시간 전처리한 후 미토콘드리아의 막 전위(MMP)의 변화에 미치는 영향을 로다민 123을 이용하여 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10은 SH-SY5Y 세포에서 미토콘드리아 막 전위의 6-OHDA-유도 감소에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도이다. 6-OHDA를 처리한 세포에서는 대조구 (100%)에 비하여 약 60%정도로 MMP가 감소하였지만, 후코잔틴을 처리한 결과, 처리 농도가 증가할수록 MMP가 증가하였으며, 5μM에서는 80%이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 후코잔틴이 6-OHDA에 의해 일어나는 미토콘드리아 박 전위의 감소를 억제시킨다는 것을 나타내고 있다.
시험예 7: 세포내 칼슘 농도 측정
세포 내 칼슘 이온의 축적을 측정하기 위하여 형광 프로브 Fluo-3AM을 이용하였다. 세포를 수확하기 전에 5 μM Flu-3AM을 처리하여 37℃에서 30분 배양한다. 배양한 세포는 PBS (pH 7.4)로 세척하여 1% 트립신-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확하고, 다시 PBS로 세척하여 플루오레신 플레이트 판독기를 이용하여 측정하였다(여기: 488 nm, 방출 526 nm). 세포내 산화적 스트레스의 증가는 미토콘드리아 내에 존재하는 Ca 이온들이 세포질 내로 방출시켜 세포 사멸을 유도시킨다. 세포질 내 Ca이온의 농도 변화를 측정한 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11은 SH-SY5Y 세포에서 6-OHDA-매개 세포내 Ca2+ 증가에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도이다. 6-OHDA를 처리한 세포에서는 대조구 (100%)에 비하여 약 220%정도로 Ca이온의 농도가 증가하였지만, 후코잔틴을 처리한 결과, 처리 농도가 증가할수록 Ca이온의 농도는 감소하였으며, 5 μM에서는 약 120%까지 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 후코잔틴이 6-OHDA에 의해 생성된 Ca 이온들이 세포질 내로 방출을 억제시킨다는 것을 나타내고 있다.
시험예 8: 웨스턴 블롯 분석
8-1: SH-SY5Y 세포주를 PBS로 2회 씻어준 후 셀 스크래퍼(cell scraper)를 이용하여 세포를 회수한다. 세포에 Ripa 완충액(프로테아제 억제제 칵테일을 포함)를 넣어준 후 4℃에서 30분간 반응시킨 뒤 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 원심분리한 후 생성된 상층액을 실험에 이용한다. 분리된 단백질은 BCA 단백질 에세이를 이용하여 정량하였다. 또한 단백질 정량은 소혈청 알부민(BSA, bovine serum albumin)을 이용하여 단백질 표준곡선을 작성하여 이를 기초로 하여 이용하여 단백질을 정량화하였다. 정량된 단백질은 SDS-PAGE를 수행한 후 쿠마시 염색을 통하여 정량된 결과를 분석하였다.
8-2: SDS-PAGE
분리된 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 정량화된 단백질을 분석할 뿐만 아니라 웨스턴 블롯팅을 수행하기 위하여 수행하였다. 전기영동은 9%의 분리 겔과 5% 스택킹 겔로 이루어진 SDS-PAGE 겔 상에서 진행하였다. 단백질과 5 x SDS 시료 완충액(60mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM β-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)을 혼합하여 100℃에서 5분간 중탕한 후 단백질 마커(Cambrex Co.)와 함께 전기영동을 수행하였다. 전기영동된 겔은 쿠마시 블릴리언트 블루(CBB) R 250으로 염색하고 탈염색 완충액으로 탈색시킴으로써 단백질 정량화를 확인하였다.
8-3: 웨스턴 블롯팅
전기 영동후 SDS-PAGE 겔을 100V에서 90분간 PVDF 멤브레인에 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유(TBST: 10mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.5% Tween-20, 2.5mM MgCl2) 용액으로 2시간 상온에서 블록킹(blocking)하고 TBST 로 5분씩 3회 씻어냈다. 일차 Ab를 4℃에서 12시간 동안 처리하고 TBST로 15분씩 4번 씻어낸 다음 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)가 공액되어 있는 2차 Ab를 상온에서 2시간 처리하고 동일한 방법으로 씻어주었다. 이 후 강화된 케모루미네스(ECL)을 이용하여 X-ray 필름에 감광시킨 후 단백질의 발현 여부를 측정하였다.
8-4: 핵의 형태학적 변화
세포사멸의 형태학적 특징 중 하나인 핵의 형태 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 이적으로 결합하는 Hoechst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 현미경으로 관찰하고, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12는 SH-SY5Y 세포에서 세포사멸 핵 형태학에서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도이다. 정상 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타냈지만 6-OHDA에 의한 산화적 스트레스가 유도된 세포의 핵은 핵의 농축(condensation)과 DNA 분획화(fragmentation)가 핵에 나타나는 것을 확인하였다. 후코잔틴이 병용 처리된 세포에서는 핵의 농축(condensation) 현상과 DNA 분획화(fragmentation)가 감소됨을 현미경을 통하여 확인하였다. 이러한 결과는 6-OHDA에 의한 세포의 독성이 세포사멸 유도하며, 후코잔틴은 6-OHDA에 의한 손상으로부터 신경세포를 보호하는 효과를 나타냄을 의미한다.
8-5: 세포사멸 관련 인자 발현에 미치는 영향
6-OHDA에 의해 유도되는 세포사멸 관련 인자들의 발현에서 후코잔틴의 발현 변화 여부를 확인하고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 도 13은 세포 사멸 단백질의 발현 레벨에 있어서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 Fucoxanthin의 영향을 나타내는 그라프도이다. 6-OHDA에 의해 사멸 유도 인자인 Bak, caspase-3의 발현이 증가하였다. 그러나 후코잔틴 전처리에 의해서는 발현이 감소함을 확인하였으나 이와는 반대로 사멸 억제인 Bcl-2는 6-OHDA에 의해 발현이 억제되었으나 후코잔틴 전처리에 의해 발현 감소가 억제됨을 확인하였다(도 13 참조). 또한 6-OHDA에 의한 산화적 스트레스는 소포체 스트레스를 유도하여 세포내 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 소포체 스트레스와 관련된 인자들의 발현 변화를 확인한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14는 소포체 스트레스-관련 단백질의 발현 레벨에 있어서 6-OHDA-유도 변화에 미치는 후코잔틴의 영향을 나타내는 그라프도이다. 6-OHDA에 의해 소포체 스트레스 증가시 나타나는 인자들의 발현이 증가하였지만 후코잔틴 전처리에 의해 발현 감소가 억제됨을 확인하였다(도 14 참조). 이 결과는 6-OHDA에 의해 일어나는 capase-3와 관련된 세포사멸과정과 소포체 스트레스를 억제시켜 세포사멸을 억제하여 신경세포를 보호한다는 것을 의미한다.

Claims (5)

  1. 하기 화학식의 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 제약 조성물.
    Figure pat00001
  2. 제1항에 있어서, 노화 과정과 관련된 대사 결함 및 스트레스로부터 뉴런을 보호하기 위한 것인 제약 조성물.
  3. 하기 화학식의 후코잔틴을 유효 성분으로 포함하는 신경보호용 건강 보조 식품 조성물.
    Figure pat00002
  4. 제3항에 있어서, 노화 과정과 관련된 대사 결함 및 스트레스로부터 뉴런을 보호하기 위한 것인 건강 보조 식품 조성물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 조성물이 경구제, 파우치제, 드링크제, 음료수의 형태로 제공되는 것인 건강 보조 식품 조성물.
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CN113924001A (zh) * 2019-02-22 2022-01-11 米克罗皮公司 食品补充剂

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