BR112021015466A2 - Materiais e métodos para tratar uma doença neurodegenerativa - Google Patents

Abstract

materiais e métodos para tratar uma doença neurodegenerativa. são descritos no presente documento materiais e métodos para o tratamento de doenças neurodegenerativas por meio da administração de uma combinação de fenofibrato e kaempferol.

Description

“MATERIAIS E MÉTODOS PARA TRATAR UMA DOENÇA NEURODEGENERATIVA” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001]O presente pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido de pa- tente provisório dos EUA no. 62/801.271, depositado em 5 de fevereiro de 2019, in- corporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO DE APOIO GOVERNAMENTAL

[002]Esta invenção foi feita com o apoio do governo sob W81XWH-14-1-0123 concedido pela US Army Medical Research Acquisition Activity (USAMRAA). O go- verno tem certos direitos sobre a invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003]A presente divulgação se refere a métodos de tratamento de uma doença neurodegenerativa em um sujeito em necessidade dos mesmos.

ANTECEDENTES

[004]As doenças neurodegenerativas podem ser esporádicas ou familiares e as ocorrências aumentam com o envelhecimento. Assim, à medida que aumenta o tempo médio de vida da população, aumenta a ocorrência de doenças neurodegene- rativas. Prevê-se que até um em cada quatro americanos desenvolverá uma afecção neurodegenerativa durante a vida. Geralmente, no entanto, os mecanismos subjacen- tes que causam as afecções não são bem compreendidos e poucas opções de trata- mento eficazes estão disponíveis para prevenir ou tratar doenças neurodegenerativas.

[005]As afecções neurodegenerativas apresentam vários graus de neuroinfla- mação. Além disso, constatou-se que esses distúrbios incluem disfunção ou desregu- lação de mitocôndrias, incluindo aquela do regulador mitocondrial mestre, coativador- 1 alfa (PGC-1α) do receptor gama ativado por proliferador de peroxissoma (PPARγ).

As isoformas de receptor ativado por proliferador de peroxissoma (PPAR) (por exem- plo, α, β/δ, γ) e, em particular, PPARα e PPAR-γ, demonstraram ser neuroprotetoras principalmente por meio de efeitos anti-inflamatórios, função mitocondrial aumentada e indução de genes antioxidantes neuroprotetores em modelos animais de AD, PD, HD e ALS, bem como em lesão cerebral traumática (TBI) [1 a 6]. PGC-1α é um coati- vador transcricional que se associa e regula os PPARs e induz genes envolvidos na biogênese mitocondrial e respiração celular, entre outros [7]. Essas atividades regula- tórias de PGC-1α são reduzidas nos cérebros de sujeitos com as afecções neurode- generativas, tais como PD, AD e ALS [8 a 10].

SUMÁRIO

[006]Em um aspecto, é descrito no presente documento um método para tra- tar uma doença neurodegenerativa em um sujeito que compreende a administração de fenofibrato e kaempferol a um sujeito em necessidade dos mesmos. O fenofibrato e o kempferol podem ser administrados concomitantemente ou sequencialmente.

[007]Em outro aspecto, é descrito no presente documento um método para prevenir/reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato em ácido fenofí- brico e, assim, aumentar os níveis de fenofibrato em um sujeito, que compreende a administração de uma combinação de fenofibrato e kaempferol em uma razão molar suficiente para reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato. Em algu- mas modalidades, os níveis de fenofibrato são aumentados no cérebro e/ou órgãos viscerais do sujeito.

[008]Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem ainda a administração de um padrão de cuidado terapêutico ao sujeito.

Padrão de cuidado terapêutico exemplificativo para o tratamento de uma doença neu- rodegenerativa inclui, mas sem limitação, o padrão de cuidado terapêutico é um pre- cursor de dopamina, agonista de dopamina, um agente anticolinérgico, um inibidor de monoamina oxidase, um inibidor de COMT, amantadina, rivastigmina, um antagonista de NMDA, um inibidor de colinesterase, riluzol, um agente antipsicótico, um antide- pressivo ou tetrabenazina e derivados dos mesmos.

[009]Em algumas modalidades, o método compreende determinar se o sujeito que recebe o tratamento tem um nível reduzido de expressão de PGC-1α em compa- ração com um sujeito de controle.

[010]Em algumas modalidades, o fenofibrato e o kaempferol são administra- dos em uma razão molar fixa. Por exemplo, em algumas modalidades, a razão molar de fenofibrato para kaempferol é 1,2:1, 2:1, 3:1 ou 4:1. Em algumas modalidades, a razão molar de fenofibrato para kaempferol é de 3:1.

[011]Em algumas modalidades, a administração do fenofibrato e kempferol aumenta os níveis de fenofibrato no cérebro em comparação com o tratamento com fenofibrato sozinho; reduz os níveis de agentes de estresse oxidativo no cérebro ou sistema nervoso central e/ou reduz os níveis de inflamação no cérebro ou sistema nervoso central.

[012]Em algumas modalidades, o sujeito foi diagnosticado com uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o sujeito está em risco de desenvolver uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doença neurodegenerativa em estágio inicial. Doenças neurodegenerativas exemplificativas incluem, mas sem limitação, doença neurodegenerativa é a doença de Parkinson, sín- drome de Parkinson-plus, demência familiar, demência vascular, doença de Alzhei- mer, doença de Huntington, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, com- prometimento cognitivo leve, demência frontotemporal, neurodegeneração da retina, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) e lesão cerebral traumática (TBI). Em algumas modalidades, a síndrome de Parkinson-plus é atrofia de múltiplos sistemas (MSA), paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corticobasal (CBD).

[013]Em outro aspecto, é descrito no presente documento um método para induzir a expressão de PGC-1α em uma célula neural ou uma célula progenitora neu- ral, que compreende o contato de uma célula neural ou uma célula progenitora neural com fenofibrato e kaempferol. Em algumas modalidades, a etapa de contato é in vivo.

Em algumas modalidades, a indução de PGC-1α é independente de PPARα. Em al- gumas modalidades, a célula neural é um neurônio (por exemplo, um neurônio dopa- minérgico ou um neurônio de cortes, corpo estriado ou medula espinhal de um sujeito).

Em algumas modalidades, a célula neural é uma célula glial ou astrócito.

[014]Em qualquer um dos métodos descritos no presente documento, a admi- nistração do fenofibrato e kaempferol é neuroprotetora. Em algumas modalidades, a neuroproteção compreende aumentar a atividade ou o número de células neuronais na região negra do cérebro e/ou reduzir a perda de terminais positivos no corpo estri- ado.

[015]Em algumas modalidades, o kaempferol é de uma fonte natural (por exemplo, uma planta ou extrato de planta que compreende kaempferol). Em algumas modalidades, a fonte ou extrato natural é o chá verde.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[016] As Figuras 1A a 1F mostram que o fenofibrato inibe a inflamação induzida por LPS em astrócitos primários derivados de camundongos KO heterozigó- ticos PGC-1α WT e PGC-1α. Astrócitos primários derivados de camundongos KO he- terozigóticos PGC-1α WT (PGC-1 α +/+) (A-C) e PGC-1α (PGC-1α +/-) (D-F) foram tratados com fenofibrato a 5, 10 e 20 μM durante a noite seguido por LPS por 1 hora.

O RNA total foi isolado e a expressão dos genes de IL-1β (A, D), TNF-α (B, E) e PGC- 1α (C, F) foi determinada por RT-PCR. Na microglia primária de PGC-1α WT, o trata- mento com LPS aumentou os níveis de IL-1β e TNF-α, e o tratamento com fenofibrato a 20 μM reduziu significativamente a expressão de IL-1β induzida por LPS (60%) (A), mas não alterou a expressão de TNF-α (B) ou PGC-1α (C). Na microglia primária KO heterozigótica de PGC-1α, o tratamento com LPS aumentou os níveis de IL-1β e TNF- α, e o tratamento com fenofibrato reduziu significativamente a expressão de IL-1β in- duzida por LPS (55%) (D), mas não alterou a expressão de TNF-α (E). O tratamento com fenofibrato a 10 e 20 μM aumentou significativamente a expressão de PGC-1α

(1,5 vezes) (F). ***p < 0,01, LPS vs. DMSO; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, LPS + feno vs. LPS, ANOVA com análise post hoc de Student-Newman-Keuls.

[017]Figuras 2A a 2E. O PPARα não é necessário para a anti-inflamação me- diada por fenofibrato em astrócitos primários de camundongo. O RNA total e a prote- ína foram coletados. A expressão do gene de PPARα foi determinada por qRT-PCR (Figura 2A) e a expressão da proteína foi determinada por análise de Western blot (Figura 2B). Em seguida, 10 nM de siRNA de PPARα foram usados para os experi- mentos subsequentes. (Figuras 2C a 2E) Astrócitos primários foram tratados com 10 nM de siRNA de PPARα ou siRNA embaralhado por 30 horas seguido por 20 μM de fenofibrato por mais 18 horas. Em seguida, as células foram tratadas com 0,1 ng/ml de LPS durante 1 hora. O RNA total foi extraído para a expressão do gene de PPARα (Figura 2C), IL-1β (Figura 2D), TNFα (Figura 2E). *p < 0,05, **, p < 0,01, ANOVA unidirecional seguida de teste de múltiplas comparações de Bonferroni.

[018]Figuras 3A a 3E. O fenofibrato é rapidamente convertido em ácido feno- fíbrico após a administração oral em camundongos C57/BL virgens. Administrou-se fenofibrato (100 mg/kg) por via oral a camundongos C57/BL e amostras de cérebro, fígado e plasma foram coletadas após 2, 4, 6, 8 horas. Os níveis de ácido fenofíbrico no córtex (Figura 3A), mesencéfalo (negro) (Figura 3B), corpo estriado (Figura 3C), fígado (Figura 3D) e plasma (Figura 3E) foram determinados usando espectrometria de massa. Os níveis de ácido fenofíbrico estavam elevados após 2 a 4 horas de ad- ministração de fenofibrato em todos os tecidos cerebrais e amostras de plasma testa- dos. Dados expressos como média ± SEM.

[019]Figura 4. A expressão de gene de IL-1β em resposta ao insulto de LPS é inibida por fenofibrato e NÃO por ácido fenofíbrico em células BV2. As células BV2 foram incubadas com ácido fenofíbrico (FA), controle negativo DMSO e controle posi- tivo fenofibrato (Feno) por 18 horas seguido por 1 hora de tratamento com LPS a 0,1 ng/ml. Em seguida, o RNA total foi isolado para análise por qRT-PCR de gene de IL-

1β. A exposição a LPS elevou a expressão de mRNA de IL-1β em 6 vezes. O trata- mento com ácido fenofíbrico a 5, 10, 20 μM falhou em reduzir os níveis elevados de IL-1β, mas o tratamento com fenofibrato (20 μM) reduziu significativamente os níveis de IL-1β em 80%. ** p < 0,01, LPS + Feno vs. ANOVA de LPS com análise post hoc de Student-Newman-Keuls.

[020]Figuras 5A a 5D. Kaempferol inibe especificamente hCES1b recombi- nante para prevenir a hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico. Diferentes concen- trações de fenofibrato foram adicionadas à mistura de ensaio contendo hCES1b re- combinante (0,05 mg/ml), pré-incubado com uma das oito concentrações de kaempfe- rol (de 0 a 50 μM) por 2 minutos em tampão Tris-Cl 100 mm (pH 7,4) a 37 °C, para iniciar a reação de 10 minutos. A reação foi interrompida, o sobrenadante coletado e o nível de ácido fenofíbrico foi determinado por LC-MS/MS. Os valores de Ki foram calculados e o tipo de inibição foi determinado ajustando-se os dados aos modelos de inibição de enzima: modelos competitivos (Figura 5A), não competitivos (Figura 5B), descompetitivos (Figura 5C) e mistos (Figura 5D). As amostras foram analisadas em duplicata e representadas como valores médios.

[021]Figuras 6A a 6D. Kaempferol evita a hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico em microssomos hepáticos humanos agrupados (HLM). Diferentes con- centrações de fenofibrato foram adicionadas à mistura de ensaio contendo HLM (1 mg/ml), pré-incubado com uma das oito concentrações de kaempferol (de 0 a 50 μM) por 2 minutos em tampão Tris-Cl 100 mm (pH 7,4) a 37 °C, para iniciar a reação de 10 minutos. A reação foi interrompida, o sobrenadante coletado e o nível de ácido fenofíbrico foi determinado por LC-MS/MS. Os valores de Ki foram calculados e o tipo de inibição foi determinado ajustando-se os dados aos modelos de inibição de enzima: modelos competitivos (Figura 6A), não competitivos (Figura 6B), descompetitivos (Fi- gura 6C) e mistos (Figura 6D). As amostras foram analisadas em duplicata e repre- sentadas como valores médios.

[022]Figuras 7A e 7B. A coentrega de fenofibrato e kaempferol (Composto X) exerceu efeito anti-inflamatório sinérgico sobre as células BV2. As células BV2 foram incubadas com 20 μM de fenofibrato e/ou 10 ou 20 μM de kaempferol por 18 horas e depois expostas a 0,1 ng/ml de LPS por 1 hora. Os lisados celulares foram coletados e o RNA foi isolado para a expressão dos genes de IL-1β (Figura 7A) e PGC-1α (Fi- gura 7B) por RT-PCR. (A) A exposição a LPS aumentou os níveis de mRNA de IL-1β (em 5 vezes) e o tratamento com fenofibrato a 20 μM reduziu esse aumento induzido por LPS na expressão de IL-1β em 70%. A coentrega de fenofibrato e kaempferol aumentou sinergicamente esse efeito anti-inflamatório e aboliu completamente o au- mento induzido por LPS na expressão de IL-1β. O tratamento com kaempferol sozinho (10, 20 μM) reduziu o aumento induzido por LPS na expressão de IL-1β em 60% (10 μM) e 85% (20 μM). (Figura 7B) O tratamento com fenofibrato a 20 μM aumentou a expressão de PGC-1α em 2 vezes. No entanto, a coadministração de fenofibrato (20 μM) e kaempferol (10, 20 μM) suprimiu a regulação positiva de PGC-1α. O tratamento com kaempferol sozinho (10, 20 μM) não aumentou a expressão de PGC-1α em cé- lulas BV2. *** p < 0,001, ** p < 0,01, * p < 0,05 em comparação com o controle DMSO; ### p < 0,001, em comparação com o tratamento com LPS; $$$p < 0,001, em compara- ção com o tratamento apenas com fenofibrato pelo teste t de Student.

[023]Figuras 8A e 8B. Curvas padrão de hidrólise de fenofibrato em ácido fe- nofíbrico por hCES1b recombinante (Figura 8A) e HLM (Figura 8B). Diferentes con- centrações de fenofibrato foram adicionadas à mistura de ensaio contendo hCES1b recombinante (0,05 mg/ml) (Figura 9A) ou microssomos hepáticos humanos agrupa- dos (1 mg/ml) (Figura 9B) em tampão Tris-Cl 100 mm (pH 7,4) a 37 °C para iniciar a reação de 10 minutos. A reação foi interrompida, o sobrenadante coletado e o nível de ácido fenofíbrico foi determinado por LC-MS/MS. A curva padrão foi plotada e os valores de Km e Vmax foram calculados. As amostras foram analisadas em duplicata e representadas como valores médios.

[024]Figuras 9A e 9B. A coentrega de kaempferol aumenta os níveis de fe- nofibrato cerebral in vivo em camundongos C57/BL virgens. Níveis de fenofibrato ce- rebral (Figura 9A) e ácido fenofíbrico (Figura 9B) em camundongos coadministrados com fenofibrato e kaempferol ou apenas fenofibrato. Os camundongos foram pré-tra- tados com veículo para o grupo “somente feno” ou kaempferol (50 mg/kg) para o grupo “feno + K” por 2 dias por gavagem oral. No dia 3, camundongos do grupo “somente feno” foram administrados com fenofibrato (100 mg/kg), enquanto os camundongos do grupo “feno + K” foram coadministrados com fenofibrato (100 mg/kg) e kaempferol (50 mg/kg). Os camundongos foram sacrificados em 0, 1, 2, 4, 8, 12, 24 horas (n = 4 por ponto de tempo) após o tratamento e o cérebro foi coletado. Os níveis de fenofi- brato e ácido fenofíbrico no cérebro foram determinados por LC-MS/MS. (Figura 9A) Os níveis de fenofibrato no grupo “feno + K” após 1 hora de gavagem oral foram sig- nificativamente maiores (aproximadamente 4 vezes) em comparação com o grupo “apenas feno”. O grupo “Feno + K” manteve níveis mais elevados de fenofibrato em comparação com o grupo “somente feno” até 8 horas após a administração oral. (Fi- gura 9B) Os níveis de ácido fenofíbrico no grupo “feno + K” após 1 hora de gavagem oral foram significativamente maiores (aproximadamente 2 vezes) em comparação com o grupo “somente feno”. O grupo “Feno + K” manteve níveis mais elevados de ácido fenofíbrico em comparação com o grupo “somente feno” até 12 horas após a administração oral. Os dados são representados como média ± SEM. **p < 0,01, *p < 0,05, teste t de Student comparado ao ponto de tempo de 0 hora.

[025]Figuras 10A a 10I. A coentrega de kaempferol com fenofibrato protege os neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos após a intoxica- ção por MPTP. Os camundongos C57BL receberam injeção ip de MPTP de 5 dias (30 mg/kg) ou solução salina seguida por tratamento com fármaco ip de 14 dias. O painel superior (Figuras 10A a 10H) são as imagens coradas com TH representativas das seções negras no controle de solução salina, MPTP e MPTP mais grupos de trata- mento com fenofibrato e/ou kaempferol. O painel inferior (Figura 10I) mostra a quan- tificação estereológica de neurônios positivos para TH na substância negra. O trata- mento subcrônico com MPTP (30 mg/kg) induziu perda significativa de neurônios do- paminérgicos na substância negra (Figura 10B) quando comparado com camundon- gos tratados com solução salina (Figura 10A). O tratamento com fenofibrato (150 e 200 mg/kg) impediu a perda induzida por MPTP de neurônios negros (Figuras 10C, 10F). A coadministração de fenofibrato (150 mg/kg) com kaempferol (50 mg/kg) au- mentou ligeiramente o efeito neuroprotetor (Figura 10D, 10I). Os dados são represen- tados como a média ± SEM. Grupo A: solução salina + solução salina (n = 6), Grupo B: MPTP + solução salina (n = 5), Grupo C: MPTP + Feno150mg/kg (n = 7), Grupo D: MPTP + Feno150mg/kg + K50mg/kg (n = 7), Grupo E: MPTP + Feno150mg/kg + K100mg/kg (n = 7), Grupo F: MPTP + Feno200mg/kg (n = 5), Grupo G: MPTP + Feno200mg/kg + K50mg/kg (n = 7), Grupo H: MPTP + Feno200mg/kg + K100mg/kg (n = 7). ****p < 0,0001, *p <0,05, teste t de Student não pareado, em comparação com o Grupo B: MPTP + solução salina.

[026]Figuras 11A a 11I. A coentrega de kaempferol com fenofibrato protege os neuritos dopaminérgicos no corpo estriado de camundongos após a intoxicação por MPTP. Os camundongos C57BL receberam injeção ip de MPTP de 5 dias (30 mg/kg) ou solução salina seguida por tratamento com fármaco por 14 dias. O painel superior são as imagens coradas com TH representativas das seções do estriado nos grupos de tratamento com controle de solução salina, MPTP e MPTP mais fenofi- brato/composto X. O painel inferior mostra a quantificação de densidade óptica de TH no corpo estriado com o uso do software Image J. O tratamento subcrônico com MPTP (30 mg/kg) induziu perda significativa de neuritos dopaminérgicos estriatais (Figura 14B) quando comparado com camundongos tratados com solução salina (Figura 11A). O tratamento com fenofibrato (150 e 200 mg/kg) impediu a perda induzida por

MPTP de neuritos estriatais (Figuras 11C, 11F). A coadministração de fenofibrato (150 mg/kg) com kaempferol (50 mg/kg) potencializou o efeito neuroprotetor (Figuras 11D, 11I). Os dados são representados como a média ± SEM. Grupo A: solução salina + solução salina (n = 6), Grupo B: MPTP + solução salina (n = 5), Grupo C: MPTP + Feno150mg/kg (n = 7), Grupo D: MPTP + Feno150mg/kg + K50mg/kg (n = 7), Grupo E: MPTP + Feno150mg/kg + K100mg/kg (n = 7), Grupo F: MPTP + Feno200mg/kg (n = 5), Grupo G: MPTP + Feno200mg/kg + K50mg/kg (n = 7), Grupo H: MPTP + Feno200mg/kg + K100mg/kg (n = 7). ****p < 0,0001, *p, 0,05, teste t de Student não pareado, em comparação com o Grupo B: MPTP + solução salina.

[027]Figuras 12A a 12C. O chá verde e as alcaparras são fontes naturais al- ternativas de kaempferol e seus derivados. (Figura 12A) Quantificação TQ-MS de ka- empferol em diferentes marcas de extrato de alcaparra e extrato de chá verde. Os extratos de alcaparras (160 a 505 ng/ml/g) mostraram maiores quantidades de ka- empferol “livre” em comparação com os extratos de chá verde (14 a 50 ng/ml/g). A análise qualitativa de QTOF de derivados de kaempferol (conjugados com moléculas complexas) em diferentes marcas de (Figura 12B) extrato de alcaparra e (Figura 12C) extratos de chá verde. Extratos de chá verde (5 × 107 - 1,2 × 108 de AU) mostraram maiores quantidades de derivados de kaempferol em comparação com o extrato de alcaparra (4 × 106 - 7 × 106 de AU), indicando o extrato de chá verde como uma boa fonte de derivados de composto X. Os dados são expressos como média ± SEM.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[028]A presente divulgação fornece um método para tratar doenças neurode- generativas e para induzir a expressão de PGC-1α em uma célula neural ou uma cé- lula progenitora neural, que compreende a administração de uma combinação de fe- nofibrato e kaempferol em uma razão molar eficaz para o tratamento de doenças neu- rodegenerativas e sintomas das mesmas. Os inventores constataram surpreendente- mente que a administração de fenofibrato e kaempferol nas razões molares citadas é mais eficaz do que o tratamento com qualquer um dos agentes isoladamente e pode reduzir a quantidade de cada agente necessária para a eficácia, fornecendo assim um efeito sinérgico desconhecido.

[029]A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e cientí- ficos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente en- tendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção per- tence. As referências a seguir fornecem a uma pessoa versada uma definição geral de muitos dos termos usados nesta invenção: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5ª ED., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

[030]Cada publicação, pedido de patente, patente e outra referência citada no presente documento é incorporada a título de referência em sua totalidade, na medida em que não seja inconsistente com a presente divulgação.

[031]Verifica-se aqui que, conforme usado neste relatório descritivo e nas rei- vindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o/a” incluem referência no plural, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[032]Conforme usado neste documento, os termos a seguir têm os significa- dos atribuídos aos mesmos, a menos que especificado de outra forma.

DEFINIÇÕES:

[033]Os termos “células neurais” ou “população de células neurais”, conforme usados neste documento, incluem ambos os neurônios (incluindo neurônios dopami- nérgicos) e células gliais (astrócitos, oligodendrócitos, células de Schwann e micro- glia). Opcionalmente, a célula neural ou população de células neurais compreende células do sistema nervoso central.

[034]O termo “célula progenitora neural”, conforme usado no presente docu- mento, refere-se a uma célula-tronco que se diferencia em uma célula neural.

[035]O termo “controle” significa um valor de um sujeito sem a doença neuro- degenerativa ou um valor de controle conhecido exemplificativo de uma população de sujeitos sem a doença neurodegenerativa, ou com níveis basais ou de sujeito saudá- vel de um biomarcador, tal como a proteína PGC1α. Em alguns casos, conforme des- crito acima, um valor de controle pode ser do mesmo sujeito antes do início de uma doença neurodegenerativa ou antes do início da terapia para a mesma.

[036]Os termos “tratar”, “tratando” e “tratamento” se referem a um método para reduzir ou retardar um ou mais efeitos ou sintomas de uma doença neurodegenera- tiva. O sujeito pode ser diagnosticado com a doença. O tratamento também pode se referir a um método de redução da patologia subjacente, em vez de apenas dos sin- tomas. O efeito da administração ao sujeito pode ter o efeito de, mas sem limitação, reduzir um ou mais sintomas da doença ou distúrbio neurodegenerativo, uma redução na gravidade da doença ou lesão neurológica, a ablação completa da doença ou lesão neurológica, ou um atraso no início ou agravamento de um ou mais sintomas. Por exemplo, um método divulgado é considerado um tratamento se houver uma redução de cerca de 10% em um ou mais sintomas da doença em um sujeito quando compa- rado ao sujeito antes do tratamento ou quando comparado a um sujeito de controle ou valor de controle. Assim, a redução pode ser de cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de redução entre eles.

[037]O termo “prevenir”, “prevenindo” ou “prevenção” significa um método para impossibilitar, retardar, evitar, prevenir, adiar, parar ou dificultar o início, incidên- cia, gravidade ou recorrência da doença neurodegenerativa ou um ou mais sintomas da mesma. Por exemplo, o método divulgado é considerado uma prevenção se houver uma redução ou atraso no início, incidência, gravidade ou recorrência de neurodege-

neração ou um ou mais sintomas de neurodegeneração (por exemplo, tremor, fra- queza, perda de memória, rigidez, espasticidade, atrofia) em um sujeito suscetível à neurodegeneração em comparação com sujeitos de controle suscetíveis à neurode- generação que não receberam fenofibrato em combinação com kaempferol. O método divulgado também é considerado uma prevenção se houver uma redução ou atraso no início, incidência, gravidade ou recorrência de neurodegeneração ou um ou mais sintomas de neurodegeneração em um sujeito suscetível à neurodegeneração após receber fenofibrato ou análogo do mesmo com kaempferol em comparação com a progressão do sujeito antes de receber o tratamento. Assim, a redução ou o atraso no início, incidência, gravidade ou recorrência de neurodegeneração pode ser de cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% ou qualquer quantidade de redução entre eles.

[038]O termo “sujeito”, conforme usado neste documento, significa um indiví- duo. De preferência, o sujeito é um mamífero, tal como um primata e, mais preferen- cialmente, um ser humano. Primatas não humanos também são sujeitos. O termo su- jeito inclui animais domesticados, tais como gatos, cães, etc., animais de criação (por exemplo, gado, cavalos, porcos, carneiros, cabras, etc.) e animais de laboratório (por exemplo, furão, chinchila, camundongo, coelho, rato, gerbo, porquinho-da-índia, etc.).

Assim, os usos veterinários e as formulações médicas são contemplados no presente documento.

[039]A presente divulgação é baseada na constatação de que uma combina- ção de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol em uma razão molar fixa pode tratar sintomas associados a uma doença neurodegenerativa em um sujeito. O fenofi- brato é rapidamente hidrolisado in vivo durante uma primeira passagem pelo fígado, metabolizado pelas enzimas carboxilesterase em ácido fenofíbrico. O ácido fenofíbrico é relatado como a porção ativa que fornece propriedades de redução de lipídio de fenofibrato oral. As propriedades neuroprotetoras e anti-inflamatórias de fenofibrato são atribuídas ao próprio fenofibrato, e não ao seu metabólito, o ácido fenofíbrico (con- sultar Exemplo 6). O uso de fenofibato para tratar doenças neurodegenerativas foi descrito anteriormente na publicação de patente US nº 2016/0220523, cuja divulgação é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade. A pre- sente divulgação identifica o efeito surpreendente da combinação de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol para prevenir o (ou reduzir a taxa do) metabolismo de fenofibrato em ácido fenofíbrico, aumentando assim os níveis de fenofibrato no cérebro de camundongo (consultar Exemplo 7).

[040]Em um aspecto, é descrito no presente documento um método de trata- mento de uma doença neurogenerativa em um sujeito que compreende a administra- ção de fenofibrato ou análogo do mesmo e kempferol a um sujeito em necessidade dos mesmos. O fenofibrato ou análogo do mesmo e o kaempferol são administrados de preferência em uma razão molar fixa. Em algumas modalidades, a razão molar de fenofibrato ou análogo do mesmo para kaempferol é 1,5:1, 2:1, 3:1 ou 4:1.

[041]Em algumas modalidades, a administração de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol aumenta os níveis de fenofibrato no cérebro em comparação com o tratamento com fenofibrato sozinho; reduz os níveis de agentes de estresse oxidativo no cérebro ou no sistema nervoso central; e/ou reduz os níveis de inflamação no cérebro ou sistema nervoso central.

[042]Em algumas modalidades, o sujeito está em risco de desenvolver uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, o sujeito foi diagnosticado com uma doença neurodegenerativa. Aquele versado na técnica sabe como diagnosticar um sujeito com ou em risco de desenvolver uma doença neurodegenerativa. Por exemplo, um ou mais dos seguintes testes podem ser usados: um teste genético (por exemplo, identificação de uma mutação no gene TDP-43) ou análise familiar (por exemplo, histórico familiar), imageamento do sistema nervoso central (por exemplo,

imageamento por ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons), tes- tes clínicos ou comportamentais (por exemplo, avaliações de fraqueza muscular, tre- mor, tônus muscular, habilidades motoras ou memória) ou testes de laboratório.

[043]A doença neurodegenerativa pode ser uma doença neurodegenerativa em estágio inicial. Em algumas modalidades, a doença neurodegenerativa é a doença de Parkinson, síndrome de Parkinson-plus, demência familiar, demência vascular, do- ença de Alzheimer, doença de Huntington, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, demência frontotemporal, neurodegenera- ção da retina, esclerose lateral amiotrófica (ALS) ou lesão cerebral traumática (TBI).

Em algumas modalidades, a síndrome de Parkinson-plus é atrofia de múltiplos siste- mas (MSA), paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corticobasal (CBD).

[044]Também é descrito aqui um método para prevenir/reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato em ácido fenofíbrico, que compreende adminis- trar fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol em uma razão molar suficiente para reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato.

[045]Em outro aspecto, é descrito no presente documento um método de in- dução de expressão de PGC-1α em uma célula neural ou células progenitoras neurais que compreendem o contato da célula com fenofibrato ou análogo do mesmo ou ka- empferol. A etapa de contato pode ser realizada in vivo ou in vitro. Em algumas mo- dalidades, a célula neural é um neurônio. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio dopaminérgico. Em algumas modalidades, o neurônio é um neurônio no cór- tex, corpo estriado ou medula espinhal de um sujeito. Em algumas modalidades, a célula neural é uma célula glial ou astrócito.

DOENÇAS NEURODEGENERATIVAS

[046]Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem administrar fenofibrato e kaempferol a um sujeito que foi diagnosticado com uma doença neurodegenerativa. Em algumas modalidades, os métodos aqui des- critos compreendem a administração de fenofibrato e kaempferol a um sujeito que está em risco de desenvolver uma doença neurodegenerativa. Em algumas modali- dades, o sujeito tem uma doença neurodegenerativa em estágio inicial.

[047]Doenças neurodegenerativas exemplificativas incluem, mas sem limita- ção, doença de Parkinson, síndrome de Parkinson-plus, demência familiar, demência vascular, doença de Alzheimer, doença de Huntington, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, demência frontotemporal, neu- rodegeneração da retina, esclerose lateral amiotrófica (ALS) e lesão cerebral traumá- tica (TBI). Em algumas modalidades, a síndrome de Parkinson-plus é atrofia de múlti- plos sistemas (MSA), paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corti- cobasal (CBD).

[048]A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por neurodegeneração crô- nica e progressiva. A neurodegeneração na DA envolve sinaptotoxicidade precoce, distúrbios de neurotransmissores, acúmulo de depósitos extracelulares de β-amiloide (Aβ) e neurofibrilas intracelulares, e gliose e, em estágios posteriores, perda de neu- rônios e atrofia cerebral associada (Danysz et al., Br J Pharmacol. 167:324–352, 2012). Os primeiros estudos indicaram que os peptídeos Aβ podem ter a capacidade de aumentar a toxicidade de glutamato em culturas de células corticais cerebrais hu- manas (Mattson et al., J Neurosci. 12:376–389, 1992; Li et al., J Neurosci.

31(18):6627-38, 2011).

[049]Em algumas modalidades, o sujeito tem doença de Alzheimer pré-clínica ou incipiente. O termo “doença de Alzheimer incipiente”, conforme usado no presente documento, se refere a estágios da doença de Alzheimer que são menos graves e/ou têm um início mais precoce do que a doença branda a moderada. O termo “doença de Alzheimer incipiente” inclui doença pré-clínica (também conhecida como, e referida aqui como, prodrômica), bem como doença pré-clínica (que inclui doença assintomá- tica, bem como doença pré-sintomática). Os critérios de diagnóstico usados para ava- liar que tipo de doença de Alzheimer uma patente tem podem ser determinados usando os critérios publicados em The Lancet Neurology, 2007, volume 6, edição 8, páginas 734 a 746; e The Lancet Neurology, 2010, volume 9, edição 11, páginas 1.118 a 1.127, cujas divulgações são aqui incorporadas a título de referência em sua totali- dade.

[050]É contemplado no presente documento que a administração de um fe- nofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol como aqui descrito em combinação ali- vie ou trate um ou mais sintomas associados a uma doença neurodegenerativa. Tais sintomas incluem, mas sem limitação, uma ou mais habilidades motoras, função cog- nitiva, distonia, coreia, sintomas psiquiátricos tais como depressão, atrofias cerebrais e estriatais e disfunção neuronal.

[051]É contemplado que a administração resulte em uma progressão mais lenta da pontuação motora total em comparação com um sujeito que não está rece- bendo o tratamento aqui descrito. Em algumas modalidades, a progressão mais lenta é um resultado na melhoria de uma ou mais pontuações motoras selecionadas a partir do grupo que consiste em subpontuação de coreia, subpontuação de equilíbrio e mar- cha, subpontuação de movimentos manuais, subpontuação de movimento ocular, subpontuação de distonia máxima e avaliação de bradicinesia.

[052]Geralmente, a PD é diagnosticada por um histórico neurológico e exame clínico para os sintomas cardinais da doença de Parkinson (tremor de repouso, bradi- cinesa e rigidez). Os indivíduos também podem ser avaliados quanto à instabilidade postural e início unilateral. Em alguns casos, um médico pode usar a Escala Unificada de Classificação da Doença de Parkinson (UPDRS) ou a versão revisada da UPDRS da Sociedade de Distúrbios do Movimento (Goetz et al., Mov Disord. janeiro de

2007;22(1):41-7). A UPDRS modificada usa uma estrutura de quatro escalas com su- bescalas da seguinte forma: (1) experiências não motoras de vida diária (13 itens), (2) experiências motoras de vida diária (13 itens), (3) exame motor (18 itens) e (4) com- plicações motoras (6 itens). Cada subescala agora tem 0 a 4 classificações, onde 0 = normal, 1 = leve, 2 = brando, 3 = moderado e 4 = grave. Os médicos também podem usar os critérios desenvolvidos pelos Critérios de Diagnóstico Clínico do Banco de Cérebro da Sociedade da Doença de Parkinson do Reino Unido (Hughes A J, Daniel S E, Kilfor L, Lees A J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disea- ses. A clinic-pathological study of 100 cases. JNNP 1992; 55:181-184).

[053]A doença de Huntington é frequentemente definida ou caracterizada pelo início dos sintomas e progressão do declínio da função motora e neurológica. A HD pode ser dividida em cinco estágios: os pacientes com HD inicial (estágios 1 e 2) têm preocupações crescentes sobre questões cognitivas e essas preocupações permane- cem constantes durante a HD moderada/intermediária (estágios 3 e 4). Pacientes com HD em estágio terminal ou avançado (estágio 5) têm falta de capacidade cognitiva (Ho et al., Clin Genet. Set 2011;80(3):235 a 239).

[054]A progressão dos estágios pode ser observada da seguinte forma: está- gio inicial (estágio 1), em que a pessoa é diagnosticada com DH e pode funcionar plenamente tanto em casa quanto no trabalho. Estágio intermediário inicial (estágio 2), a pessoa permanece empregável, mas em uma capacidade inferior e é capaz de gerenciar suas tarefas diárias com algumas dificuldades. Estágio intermediário tardio (estágio 3), a pessoa não pode mais trabalhar e/ou gerenciar as responsabilidades domésticas e. precisa de ajuda ou supervisão para lidar com assuntos financeiros di- ários e outros assuntos diários. Pacientes em estágio avançado inicial (estágio 4) não são mais independentes nas atividades diárias, mas ainda podem viver em casa sus- tentados por sua família ou carreira profissional. No estágio avançado (estágio 5), a pessoa necessita de suporte completo nas atividades diárias e geralmente são neces- sários cuidados profissionais de enfermagem. Os pacientes com DH geralmente mor- rem cerca de 15 a 20 anos após o aparecimento dos primeiros sintomas.

[055]Indícios de um declínio mais lento em sintomas da doença de Huntington são medidos usando a mudança da linha de base em um ou mais dos seguintes pa- râmetros: usando testes padronizados para (i) avaliação funcional (por exemplo, ca- pacidade funcional total da UHDRS , LPAS, escala de independência); (ii) avaliação neuropsicológica (por exemplo, avaliação cognitiva da UHDRS, escala de classifica- ção de demência de Mattis, teste de sequência alfanumérica A e B, teste de cancela- mento de figuras, teste de aprendizagem verbal de Hopkins, teste de velocidade de articulação); (iii) avaliação psiquiátrica (avaliação comportamental da UHDRS, escala de classificação de depressão de Montgomery e Asberg) e (iv) avaliação cognitiva (por exemplo, Dementia Outcomes Measurement Suite (DOMS) (conjunto de medição de resultados de demência)).

FENOFIBRATO

[056]O fenofibrato é um composto de fibrato, anteriormente usado no trata- mento de hiperlipidemias endógenas, hipercolesterolemias e hipertrigliceridemias. A preparação de fenofibrato é divulgada na pat. dos EUA no. 4.058.552, cuja divulgação é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade. O ácido fenofíbrico é o metabólito ativo de fenofibrato. O fenofibrato não é solúvel em água, o que limita sua absorção no trato gastrointestinal (GI). Formulações e estratégias alter- nativas têm sido utilizadas para superar esse problema. Consultar as pat. nos. US

4.800.079 e 4.895.726 (fenofibrato micronizado); patente no. US 6.277.405 (fenofi- brato micronizado em um comprimido ou sob a forma de grânulos dentro de uma cáp- sula); patente no. US 6.074.670 (a liberação imediata de fenofibrato micronizado em um estado sólido; patente no. US 5.880.148 (combinação de fenofibrato e vitamina E); patente no. US 5.827.536 (monoetil éter de dietilenoglicol (DGME) como solubilizante para fenofibrato); e patente nº US 5.545.628 (a combinação de fenofibrato com um ou mais glicerídeos poliglicolisados), todas as quais são incorporadas ao presente docu- mento a título de referência em sua totalidade. Inúmeros outros derivados, análogos e formulações são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, ou- tros ésteres de ácidos p-carbonilfenoxi-isobutíricos, conforme descrito na pat. dos EUA no. 4.058.552, que é incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade, podem ser usados. Os análogos de fenofibrato incluem aqueles definidos na pat. dos EUA no. 4.800.079. A título de exemplo, o gemfibrozil pode ser usado nos métodos divulgados no presente documento.

[057]O fenofibrato é opcionalmente dissolvido em um solvente ou solubilizante adequado. O fenofibrato é conhecido por ser solúvel em muitos solubilizantes diferen- tes, incluindo, por exemplo, tensoativos aniônicos (por exemplo, SDS) e não iônicos (por exemplo, Triton X-100), agentes complexantes (N-metil pirrolidona). As formula- ções líquidas e semissólidas com biodisponibilidade melhorada para administração oral de fenofibrato ou derivados de fenofibrato são descritas na publicação do pedido de Patente internacional nº WO 2004/002458, que é incorporado ao presente docu- mento a título de referência em sua totalidade.

KAEMPFEROL

[058]Kaempferol (3,5,7-tri-hidróxi-2-(4-hidroxifenil)-4H-1-benzopiran-4-ona), um flavonoide natural encontrado em muitas plantas comestíveis (por exemplo, chá, brócolis, repolho, couve, feijão, endívia, alho-poró, tomate, morangos e uvas) e possui uma variedade de características farmacológicas, incluindo propriedades antioxidan- tes, anti-inflamatórias, neuroprotetoras, antiaterogênicas e anticâncer [19, 20].

[059]Evidências de investigações in vitro e in vivo sugerem que o kaempferol pode fornecer potencial como um candidato terapêutico para a doença de Alzheimer (DA). Kaempferol previne toxicidade induzida por β-amiloide e efeitos de agregação in vitro em neurônios corticais de camundongos, neuroblastoma PC12 e células de câncer de mama humano T47D [21-23]. Da mesma forma, uma mistura de flavonóis das folhas de Ginkgo, contendo quercetina, kaempferol e isorhamnetina, estimulou a via de sinalização de BDNF e reduziu o acúmulo de β-amiloide em neurônios isolados de um modelo de camundongo AD transgênico duplo (TgAPPswe/PS1e9). Estudos in vivo nesses camundongos transgênicos duplos confirmaram a expressão aumentada de BDNF após a administração de flavonóis, correlacionando-se com a função cogni- tiva melhorada [24]. Também notou-se que kaempferol inibe o estresse oxidativo, eleva a atividade de superóxido dismutase (SOD) no hipocampo e melhora as capa- cidades de aprendizagem e memória em camundongos com deficiência de memória induzida por D-galactose [25]. O pré-tratamento com kaempferol ou produtos con- tendo kaempferol fornece proteção contra neurotoxicidade dopaminérgica em mode- los animais de PD com MPTP, 6-OHDA ou rotenona neurotóxica [26-29].

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

[060]Em algumas modalidades, o fenofibrato ou análogo do mesmo e o ka- empferol são formulados em uma ou mais composições com um carreador, excipiente ou diluente adequado. Em algumas modalidades, o fenofibrato ou análogo do mesmo e o kaempferol são formulados na mesma composição. Em modalidades alternativas, o fenofibrato ou análogo do mesmo e o kaempferol são formulados em composições separadas. Em algumas modalidades, o fenofibrato ou análogo do mesmo e o ka- empferol são administrados concomitantemente (opcionalmente nas mesmas ou em diferentes composições). Em algumas modalidades, o fenofibrato ou análogo do mesmo e o kaempferol são administrados sequencialmente.

[061]O termo carreador significa um composto, composição, substância ou estrutura que, quando em combinação com um composto ou composição, auxilia ou facilita a preparação, armazenamento, administração, entrega, eficácia, seletividade ou qualquer outra característica do composto ou composição para o seu uso ou pro- pósito pretendido. Por exemplo, um carreador pode ser selecionado para minimizar qualquer degradação do ingrediente ativo e para minimizar quaisquer efeitos colate- rais adversos no sujeito. Esses carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem carreadores farmacêuticos biocompatíveis estéreis, incluindo, mas sem limitação, so- lução salina, solução salina tamponada, fluido espinhal cerebral artificial, dextrose e água.

[062]Carreador abrange qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, es- tabilizador, solubilizante, lipídio ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. A escolha de um carreador para uso em uma compo- sição dependerá da via de administração pretendida para a composição. A preparação de carreadores farmaceuticamente aceitáveis e formulações que contêm esses mate- riais é descrita em, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 21ª Edição, ed. University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadel- phia Pa., 2005. Exemplos de carreadores fisiologicamente aceitáveis incluem tam- pões, tais como tampões de fosfato, tampão de citrato e tampões com outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso mole- cular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissaca- rídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelan- tes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tal como manitol ou sorbitol; contraíons forma- dores de sal, tais como sódio; e/ou tensoativos não iônicos, tal como TWEEN® (ICI, Inc.; Bridgewater, N.J.), polietilenoglicol (PEG) e PLURONICS™ (BASF; Florham Park, N.J.).

[063]Dependendo do modo de administração pretendido, a composição far- macêutica pode estar sob a forma de formas farmacêuticas sólidas, semissólidas ou líquidas, tais como, por exemplo, comprimidos, supositórios, pílulas, cápsulas, pós, líquidos, aerossóis ou suspensões, preferencialmente em forma farmacêutica unitária adequada para administração única de uma dosagem precisa. As composições inclui- rão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto (ou compostos) descrito (ou descritos) no presente documento ou seus derivados em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável e, além disso, podem incluir outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, carreadores ou diluentes. Por farmaceuticamente aceitável entende-se um material que não é biologicamente ou de outra forma inde- sejável, que pode ser administrado a um indivíduo juntamente com o composto sele- cionado sem causar efeitos biológicos inaceitáveis ou interagir de forma deletéria com os outros componentes da composição farmacêutica em que está contido. As compo- sições contendo fenofibrato ou análogo do mesmo e/ou kaempferol descritos no pre- sente documento ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou pró-fármacos dos mesmos adequados para injeção parenteral podem compreender soluções aquosas ou não aquosas estéreis fisiologicamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emulsões e pós estéreis para reconstituição em soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Exem- plos de carreadores, diluentes, solventes ou veículos aquosos e não aquosos ade- quados incluem água, etanol, polióis (propilenoglicol, polietilenoglicol, glicerol e simi- lares), misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais (tais como azeite) e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido, no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

[064]As composições descritas no presente documento também podem con- ter adjuvantes, tais como agentes conservantes, umectantes, emulsificantes e dispen- sadores. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser promovida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e similares, também podem ser incluídos. A absorção prolongada da forma farmacêu-

tica injetável pode ser obtida pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exem- plo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[065]As formas farmacêuticas sólidas para administração oral dos compostos descritos no presente documento ou seus sais ou pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas far- macêuticas sólidas, os compostos descritos no presente documento ou seus deriva- dos são misturados com pelo menos um excipiente (ou carreador) usual inerte, tal como citrato de sódio ou fosfato dicálcico ou (a) cargas ou extensores, tais como, por exemplo, amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico, (b) aglutinantes, como, por exemplo, carboximetilcelulose, alignatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sa- carose e acácia, (c) umectantes, como, por exemplo, glicerol, (d) agentes desintegran- tes, como, por exemplo, ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos complexos e carbonato de sódio, (e) retardantes de solução, como, por exemplo, parafina, (f) aceleradores de absorção, como, por exem- plo, compostos de amônio quaternário, (g) agentes umectantes, como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol, (h) adsorventes, como, por exemplo, cau- lim e bentonita, e (i) lubrificantes, como, por exemplo, talco, estearato de cálcio, este- arato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, ou misturas dos mesmos. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas farmacêuticas tam- bém podem compreender agentes tamponantes.

[066]As composições sólidas de um tipo similar também podem ser emprega- das como cargas em cápsulas de gelatina preenchidas duras e macias usando tais excipientes, como lactose ou açúcar do leite, bem como polietilenoglicois de alto peso molecular e similares.

[067]As formas farmacêuticas sólidas, tais como comprimidos, drágeas, cáp- sulas, pílulas e grânulos, podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos e outros conhecidos na técnica. Elas podem conter agentes opacificantes e também podem ser de tal composição que liberem o com- posto ou compostos ativos em uma determinada parte do trato intestinal de forma retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Os compostos ativos também podem estar sob a forma microencapsulada, se apropriado, com um ou mais dos excipientes acima men- cionados.

[068]As formas farmacêuticas líquidas para administração oral de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol ou seus sais ou pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceutica- mente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas farmacêuticas líquidas po- dem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como, por exemplo, álcool etí- lico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos, em particular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de gérmen de milho, azeite, óleo de rícino, óleo de gergelim, glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos graxos de sorbitano, ou misturas dessas substâncias e similares.

[069]Além de tais diluentes inertes, a composição também pode incluir agen- tes adicionais, tais como agentes umectantes, emulsificantes, suspensores, edulco- rantes, aromatizantes ou perfumantes.

[070]As suspensões, além dos compostos ativos, podem conter agentes adi- cionais, tais como, por exemplo, álcoois isoestearílicos etoxilados, ésteres de polioxi- etileno sorbitol e sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, ben- tonita, ágar-ágar e tragacanto, ou misturas dessas substâncias, e similares.

[071]As composições dos compostos aqui descritos ou seus sais ou pró-fár- macos farmaceuticamente aceitáveis para administrações retais são, opcionalmente,

supositórios, que podem ser preparados misturando-se os compostos com excipien- tes ou carreadores não irritantes adequados, tal como manteiga de cacau, polietileno- glicol ou uma cera de supositório, que são sólidos a temperaturas normais, mas líqui- dos em temperatura corporal e, portanto, derretem no reto ou na cavidade vaginal e liberam o componente ativo.

[072]Fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol podem ser administra- dos a uma célula neural ou célula progenitora neural de várias maneiras, incluindo, por exemplo, ex vivo, in vitro e in vivo. A administração in vivo pode ser dirigida a células neurais do sistema nervoso central ou periférico. Assim, o contato in vivo pode ser útil se o sujeito tiver ou estiver em risco de desenvolver níveis reduzidos de PGC- 1α no sistema nervoso central. Em algumas modalidades, o fenofibrato e o kaempferol são administrados por administração intracerebroventricular (ICV).

[073]O contato in vitro pode ser desejado, por exemplo, no tratamento de cé- lulas para transplante. As células neurais podem ser explantes do sistema nervoso do mesmo sujeito ou de um sujeito diferente, podem ser derivadas de células-tronco ou podem ser derivadas de uma linhagem celular. As células neurais podem ser deriva- das de uma célula não neural que é desdiferenciada e, em seguida, levada a se dife- renciar em uma linhagem de células neurais. Essa célula pode ser uma célula-tronco pluripotente induzida. Como o fenofibrato atravessa a barreira hematoencefálica, uma célula neural no sistema nervoso central pode entrar em contato com o fenofibrato por uma administração sistêmica do fenofibrato ao sujeito. O fenofibrato pode ser admi- nistrado por via intratecal, por exemplo, por injeção local, por uma bomba ou por um implante de liberação lenta.

[074]A dosagem habitual de fenofibrato para adultos é de três cápsulas de gelatina por dia, cada uma contendo 100 mg de fenofibrato. Um versado na técnica pode selecionar uma dosagem ou regime de dosagem selecionando uma quantidade eficaz do fenofibrato. Essa quantidade eficaz inclui uma quantidade que induz a ex- pressão de PGC-1α em células neurais, uma quantidade que tem propriedades anti- inflamatórias, uma quantidade que reduz um ou mais efeitos de estresse oxidativo.

Além disso, a quantidade eficaz de fenofibrato aumenta os níveis de AMPK fosforilada, aumenta o número mitocondrial e aumenta a viabilidade celular. Contempla-se que a administração de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol em combinação re- duza a dose eficaz de fenofibrato ou análogo do mesmo necessária em um sujeito em comparação com a administração de fenofibrato ou análogo do mesmo sozinho.

[075]Opcionalmente, o fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol são administrados diariamente.

[076]O termo “quantidade eficaz”, conforme usado no presente documento, é definido como qualquer quantidade suficiente para produzir uma resposta fisiológica desejada. A título de exemplo, a dosagem sistêmica do fenofibrato ou análogo do mesmo e kemopferol pode ser de 1 a 1.000 mg diários, incluindo, por exemplo, 300 a 400 mg diários (administrados, por exemplo, em 1 a 5 doses). Um versado na técnica ajusta a dosagem conforme descrito abaixo com base nas características específicas do inibidor, do sujeito que o recebe, do modo de administração, tipo e gravidade da doença a ser tratada ou prevenida e similares. Além disso, a duração do tratamento pode ser de dias, semanas, meses, anos ou pelo tempo de vida do sujeito. Por exem- plo, a administração a um sujeito com ou em risco de desenvolver uma doença neu- rodegenerativa pode ser pelo menos diariamente (por exemplo, uma, duas, três vezes por dia), dia sim, dia não, duas vezes por semana, semanalmente, a cada duas se- manas, a cada três semanas, a cada 4 semanas, a cada 6 semanas, a cada 2 meses, a cada 3 meses ou a cada 6 meses, por semanas, meses ou anos, desde que o efeito seja sustentado e os efeitos colaterais sejam controláveis.

[077]Quantidades e esquemas eficazes para a administração de fenofibrato ou análogo do mesmo e kaempferol podem ser determinados empiricamente, e fazer tais determinações está dentro da habilidade da técnica. As faixas de dosagem para administração são aqueles grandes o suficiente para produzir o efeito desejado no qual um ou mais sintomas da doença ou distúrbio são afetados (por exemplo, reduzi- dos ou retardados). A dosagem não deve ser tão grande a ponto de causar efeitos colaterais adversos significativos, tais como reações cruzadas indesejadas, morte ce- lular e similares. Geralmente, a dosagem variará com o tipo de doença neurodegene- rativa, espécie, idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do sujeito, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e gravidade da afecção particular e pode ser determinada por uma pessoa versada na técnica. A do- sagem pode ser ajustada pelo médico individual em caso de quaisquer contraindica- ções. As dosagens podem variar e podem ser administradas em uma ou mais doses diárias.

TERAPIA COMBINADA

[078]Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento compreendem ainda a administração de uma substância terapêutica padrão de cui- dado para o tratamento de uma doença neurodegenerativa. Conforme usado neste documento, o termo “padrão de cuidado” se refere a um tratamento que é geralmente aceito pelos médicos para um determinado tipo de paciente diagnosticado com um tipo de enfermidade. Em algumas modalidades, a substância terapêutica padrão de cuidado é levodopa, um agonista de dopamina, um agente anticolinérgico, um inibidor de monoamina oxidase, um inibidor de COMT, amantadina, rivastigmina, um antago- nista de NMDA, um inibidor de colinesterase, riluzol, um agente antipsicótico, um an- tidepressivo ou tetrabenazina.

[079]Em algumas modalidades, a terapia de combinação que emprega fenofi- brato ou análogo do mesmo e kaempferol aqui descritos pode preceder ou seguir a administração de substância(s) terapêutica(s) padrão de cuidado adicional(is) em in-

tervalos que variam de minutos a semanas a meses. Por exemplo, modalidades se- paradas são administradas dentro de cerca de 24 horas uma da outra, por exemplo, dentro de cerca de 6 a 12 horas uma da outra, ou dentro de cerca de 1 a 2 horas uma da outra, ou dentro de cerca de 10 a 30 minutos uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período para o tratamento significativamente, onde vá- rios dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 semanas) transcorrem entre as respectivas administrações de diferentes modalidades. Trata- mentos repetidos com um ou ambos os agentes/terapias da terapia de combinação são especificamente contemplados.

MONITORAMENTO DE EFICÁCIA DE TERAPIA

[080]Os métodos para medir a indução e a atividade de PGC-1α são conheci- dos na técnica e são fornecidos no Exemplo 1 abaixo. Consultar, por exemplo, Ruiz et al. (2012) A cardiac-specific robotized cellular assay identified families of human ligands as inducers of PGC-1α expression and mitochondrial biogenesis PLoS One: 7: e46753. Os níveis de PGC-1α podem ser avaliados diretamente usando, por exem- plo, um anticorpo para PGC-1α ou outros meios de detecção. A atividade de PGC-1α pode ser detectada, incluindo, a título de exemplo, avaliando-se a modulação de fun- ção mitocondrial, por exemplo, o metabolismo oxidativo e pode ser avaliada pela de- tecção da atividade ou expressão de um gene mitocondrial, por exemplo, LDH-2, ATP5j ou similares.

[081]São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Esses e outros mate- riais são divulgados neste documento, e entende-se que quando combinações, sub- conjuntos, interações, grupos, etc. desses materiais são divulgados, embora a refe- rência específica de cada uma das várias combinações e permutações individuais e coletivas desses compostos possa não ser explicitamente divulgada, cada uma é es- pecificamente contemplada e descrita no presente documento. Por exemplo, se um método for divulgado e discutido e uma série de modificações que podem ser feitas em uma série de moléculas incluindo no método forem discutidas, cada combinação e permutação do método e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas a menos que seja especificamente indicado o contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destas também é especificamente con- templado(a) e divulgado(a). Esse conceito se aplica a todos os aspectos desta divul- gação, incluindo, mas sem limitação, etapas em métodos usando as composições di- vulgadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser rea- lizadas, entende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas de método específicas ou combinação de etapas de método dos métodos divulgados, e que cada combinação ou subconjunto de combinações são especificamente contemplados e devem ser considerados divulgados.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 - FENOFIBRATO INIBE A INFLAMAÇÃO INDUZIDA POR LIPOPOLISSACARÍDEO (LPS) EM ASTRÓCITOS PRIMÁRIOS DERIVADOS DE PGC-1α WT (PGC-1α+/+) E CAMUNDONGOS NOCAUTE PGC-1α HETEROZIGÓTICOS (PGC-1α+/−)

[082]Astrócitos primários de camundongos heterozigóticos pós-natais foram isolados e cultivados e camundongos do tipo selvagem foram obtidos através da cria- ção desses camundongos nocaute heterozigóticos. Os astrócitos foram tratados com fenofibrato em várias concentrações durante a noite, seguido por 0,1 ng/ml de LPS por 1 hora. O RNA total foi isolado e a expressão gênica de citocinas pró-inflamatórias, IL-1β e TNF-α, determinada por RT-PCR. Os resultados mostram que o fenofibrato exerceu efeitos de proteção anti-inflamatória em astrócitos primários WT (PGC-1a+/+)

e heterozigóticos (PGC-1a+/-) (Figura 1). Esses dados sugerem que, embora o fenofi- brato seja ativo em ambos os tipos de astrócitos, ele é mais ativo nos astrócitos que carregam uma única cópia do Ppargc1a. Isso também pode ter implicações para do- enças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer (DA), doença de Parkin- son (DP) e esclerose lateral amiotrófica (ALS), onde os níveis de PGC-1α são patolo- gicamente reduzidos.

EXEMPLO 2 - PPARα NÃO É NECESSÁRIO PARA EFEITOS ANTI-

INFLAMATÓRIOS MEDIADOS POR FENOFIBRATO EM ASTRÓCITOS PRIMÁRIOS DE CAMUNDONGO.

[083]O exemplo a seguir demonstra que os efeitos anti-inflamatórios media- dos por fenofibrato não foram suprimidos em astrócitos primários de camundongo após silenciamento de expressão de PPARα por siRNA.

[084]Diferentes concentrações de siRNA de PPARα foram adicionadas a as- trócitos primários de camundongo por 48 horas. RNA total e proteína foram coletados.

A expressão de gene de PPARα foi determinada por qRT-PCR (Figura 2A) e a ex- pressão de proteína foi determinada por análise de Western blot (Figura 2B). Em se- guida, 10 nM de siRNA de PPARα foram usados para os experimentos subsequentes.

(Figuras 2C a 2E) Astrócitos primários foram tratados com 10 nM de siRNA de PPARα ou siRNA embaralhado por 30 horas seguido por 20 μM de fenofibrato por mais 18 horas. Em seguida, as células foram tratadas com 0,1 ng/ml de LPS durante 1 hora.

O RNA total foi extraído para a expressão do gene de PPARα (Figura 2C), IL-1β (Fi- gura 2D), TNFα (Figura 2E). Os resultados indicam que o fenofibrato mediou os efeitos anti-inflamatórios de uma maneira independente de PPARα nas duas principais popu- lações de células neurogliais.

EXEMPLO 3 - O FENOFIBRATO SOFRE UMA RÁPIDA HIDRÓLISE DE

PRIMEIRA PASSAGEM EM ÁCIDO FENOFÍBRICO IN VIVO

[085]Relata-se que, após a administração oral, o fenofibrato é rapidamente convertido em ácido fenofíbrico, o metabólito ativo e o ligante PPARα envolvidos na promoção da atividade anti-hiperlipidêmica [17, 18]. A farmacocinética de fenofibrato foi medida no cérebro, fígado e plasma dos camundongos que receberam uma dose oral de 100 mg/kg de fenofibrato. A maior parte do fenofibrato foi metabolizada no fígado em ácido fenofíbrico; com apenas uma pequena porção do ácido fenofíbrico entrando na corrente sanguínea e no cérebro (Figura 3).

EXEMPLO 4 - AS PROPRIEDADES ANTI-INFLAMATÓRIAS SÃO MEDIADAS POR FENOFIBRATO E NÃO POR ÁCIDO FENOFÍBRICO, SEU METABÓLITO DE PRIMEIRA PASSAGEM, EM CÉLULAS BV2

[086]O fenofibrato é rapidamente hidrolisado in vivo durante uma primeira pas- sagem pelo fígado, metabolizado pelas enzimas carboxilesterase em ácido fenofí- brico. O ácido fenofíbrico é relatado como a porção ativa que fornece propriedades de redução de lipídio de fenofibrato oral. Se as propriedades neuroprotetoras de fenofi- brato são dependentes da molécula original ou de seu metabólito primário não foi pre- viamente definido. Essa tem sido uma grande desvantagem na busca atual de terapia com fenofibrato como tratamento de doenças neurodegenerativas. Como o pró-fár- maco fenofibrato foi usado para todos os ensaios in vitro anteriores, também foi ava- liado se o ácido fenofíbrico pode exercer igualmente efeito anti-inflamatório. Para tes- tar isso, as células BV2 foram tratadas com ácido fenofíbrico (FA) em diferentes con- centrações (0, 5, 10 e 20 μM) ou fenofibrato 20 μM por 18 horas, seguido por uma exposição de LPS de uma hora. O RNA total da célula BV2 foi extraído para a expres- são de gene de IL-1β através da análise qRT-PCR. Surpreendentemente, constatou- se que o ácido fenofíbrico não inibiu a expressão de IL-1β em qualquer concentração, enquanto o fenofibrato a 20 μM exerce um efeito anti-inflamatório robusto (Figura 4).

Esses resultados revelaram que o fenofibrato, e não o ácido fenofíbrico, mediou os efeitos anti-inflamatórios observados em experimentos anteriores.

EXEMPLO 5 - KAEMPFEROL EVITA A HIDRÓLISE DE FENOFIBRATO EM

ÁCIDO FENOFÍBRICO POR MEIO DE INIBIÇÃO DE CARBOXILESTERASE ESTERASE (hCES1b) IN VITRO

[087]O potencial de kaempferol como um inibidor de esterase de ocorrência natural foi explorado, eficaz na redução da hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico no fígado. As carboxilesterases humanas (CESs) pertencem à superfamília de serina esterase e são classificadas em cinco grupos CES (1-5). As subfamílias CES1 e CES2 são as participantes mais importantes na hidrólise de uma variedade de xenobióticos e fármacos em seres humanos. A CES1 humana é altamente expressa no fígado e contribui predominantemente para as atividades intrínsecas de hidrolase/esterase. A isoforma de CES1 humana também é encontrada em níveis baixos no intestino del- gado, macrófagos, epitélios pulmonares, coração e testículos. A CES1A humana é ainda classificada em duas isoformas: hCES1b (também referida como CES1A1) e hCES1c. Estudos sugerem que hCES1b é a principal isoforma (do tipo selvagem) fun- cionando no fígado humano, importante para a hidrólise de substratos contendo liga- ções de éster/tioéster/amida, incluindo fenofibrato. Assim, em uma série de estudos, a potência de kaempferol para inibir especificamente a capacidade de hidrólise medi- ada por CES1b humana recombinante de fenofibrato em ácido fenofíbrico foi estudada usando um ensaio de inibição enzimática. Em seguida, foi avaliada a propriedade ge- ral de inibição de esterase do kaempferol em outras esterases hepáticas usando mi- crossomos hepáticos humanos agrupados (HLM).

[088]Determinação dos valores de Km e Vmax: primeiro, a constante de Mi- chaelis-Menten (Km), a concentração de substrato na qual a metade da velocidade máxima é observada e os valores de Vmax (a taxa máxima da reação) foram determi- nados para a hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico usando hCES1b ou HLM no seguinte ensaio de enzima. Procedimento de ensaio: misturas de incubação contendo tampão Tris-Cl a 100 mM (pH 7,4) e hCES1b recombinante (0,05 mg/ml) ou HLM agrupado (1 mg/ml) foram aquecidas a 37 °C. Diferentes concentrações de fenofibrato foram adicionadas para iniciar o ensaio de 10 minutos. As reações foram interrompi- das pela adição de uma solução de parada contendo um padrão interno. As amostras foram centrifugadas para precipitar a proteína enquanto o sobrenadante era coletado para determinação de ácido fenofíbrico usando análise de espectrometria de massa em tandem com cromatografia líquida (LC-MS/MS). As curvas padrão para a hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico por hCES1b recombinante (Figura 5A) ou HLM (Figura 5B) foram plotadas. Os valores de Km e Vmax foram calculados ajustando-se os dados aos modelos de cinética enzimática (Tabela 1).

TABELA 1. VALORES DE Km e Vmax PARA A HIDRÓLISE DE

FENOFIBRATO EM ÁCIDO FENOFÍBRICO USANDO A MATRIZ RECOMBINANTE hCES1b e HLM.

Com- Km Vmax Produto Matriz posto (µM) (nmol/min/mg) Fe- Ácido fe- hCES1b 6,04 28,3 nofibrato nofíbrico HLM 5,40 96,3

[089]Determinação da constante de inibição (Ki) para kaempferol: em seguida, a constante de inibição (Ki, a concentração necessária para produzir metade da inibi- ção máxima) de kaempferol na prevenção da hidrólise de fenofibrato em ácido fenofí- brico por hCES1b (Figuras 6A a 6D) ou HLM (Figuras 7A a 7D) foi determinada. Mis- turas de incubação contendo tampão Tris-Cl a 100 mM (pH 7,4), hCES1b recombi- nante (0,05 mg/ml) ou microssomos hepáticos humanos agrupados (1 mg/ml) e 8 con- centrações de kaempferol ou um inibidor de controle positivo (bis(4-nitrofenil)-fosfato, BNP) foram pré-incubados durante 2 minutos a 37 °C. Fenofibrato foi, então, adicio- nado para iniciar a reação de 10 minutos (concentrações finais: 0,1 × Km, 0,3 × Km, 1 × Km, 3 × Km, 6 × Km e 10 × Km). As reações foram interrompidas pela adição de uma solução de parada contendo um padrão interno. As amostras foram centrifugadas para precipitar a proteína e o sobrenadante foi coletado para análise LC-MS/MS. O ácido fenofíbrico foi quantificado por meio de curvas padrão. Os valores de Ki foram calculados e o tipo de inibição foi determinado ajustando-se os dados a modelos de inibição enzimática específicos (Tabela 2). Kaempferol inibiu especificamente a ativi- dade de hidrolase de hCES1b, com um valor de Ki baixo de 36,2 μM, enquanto inibia o HLM agrupado com um valor de Ki mais alto de 110 μM, calculado usando um mo- delo de inibição competitivo.

[090]TABELA 2. Valores Ki de kaempferol para inibir a hidrólise de fenofibrato em ácido fenofíbrico usando a matriz recombinante hCES1b e HLM. BNP-bis(4- nitrofenil)-fosfato - controle positivo.

[091]Essas constatações acima sugerem, portanto, que o kaempferol inibe especificamente a atividade de hidrolase de hCES1b, uma importante enzima envol- vida na hidrólise de fenofibrato no fígado humano. Assim, o kaempferol é um candi- dato potencial para uso em combinação com fenofibrato, para inibir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato em ácido fenofíbrico e, assim, aumentar o potencial do fenofibrato para a biodisponibilidade no SNC.

EXEMPLO 6 - A COENTREGA DE FENOFIBRATO E KAEMPFEROL EXERCE EFEITOS ANTI-INFLAMATÓRIOS SINÉRGICOS EM CÉLULAS BV2

[092]Dado que as propriedades anti-inflamatórias parecem ser mediadas pelo pró-fármaco, fenofibrato, e não pelo seu metabólito ativo, o ácido fenofíbrico, tentou- se aumentar a expressão de PGC-1α no SNC aumentando a biodisponibilidade do fenofibrato. Contemplou-se que o aumento dos níveis de fenofibrato no SNC levaria a um efeito neuroprotetor mediado por PGC-1α mais robusto. O exemplo a seguir for- nece um método para aumentar os níveis de fenofibrato no SNC por meio da inibição da hidrólise de primeira passagem de fenofibrato em ácido fenofíbrico pela carboxi- lesterase no fígado.

[093]O efeito anti-inflamatório de coentrega de fenofibrato com kaempferol em células BV2 foi avaliado. 20 μM de fenofibrato e/ou 10 ou 20 μM de kaempferol foram adicionados às células BV2 por 18 horas, seguido por 1 hora de exposição a LPS. Os lisados celulares foram coletados para determinação da expressão de gene de IL-1β e PGC-1α através de qRT-PCR. O tratamento com kaempferol sozinho inibiu a ex- pressão de IL-1β (Figura 7A), suportando as propriedades anti-inflamatórias relatadas

[20]. A coentrega de fenofibrato e kaempferol exerceu um efeito anti-inflamatório adi- tivo, se não sinérgico (Figura 7A), sugerindo que a terapia combinada pode ser eficaz em doenças com níveis subjacentes de neuroinflamação. Pareceu, no entanto, que o kaempferol reprimiu ligeiramente a regulação positiva do gene de PGC-1α mediada por fenofibrato quando este foi entregue em altas doses (Figura 7B).

EXEMPLO 7 - A CO-ENTREGA DE FENOFIBRATO E KAEMPFEROL

AUMENTOU OS NÍVEIS DE FENOFIBRATO CEREBRAL IN VIVO EM CAMUNDONGOS

[094]Em seguida, a capacidade de kaempferol de aumentar os níveis de fe- nofibrato cerebral in vivo foi avaliada em camundongos C57/BL virgens. Camundon- gos C57/BL6 foram divididos em dois grupos: grupo A (n = 28) e grupo B (n = 28).

Camundongos C57/BL6 no grupo A foram pré-tratados por 2 dias com kaempferol (50 mg/kg) e no dia 3 receberam a combinação de kaempferol (50 mg/kg) e fenofibrato (100 mg/kg). Os camundongos do grupo B receberam veículo por 2 dias e no dia 3 receberam fenofibrato (100 mg/kg) apenas. Todas as administrações dos fármacos foram realizadas por gavagem oral. Os camundongos foram subsequentemente sa- crificados em sete pontos de tempo diferentes após a administração (ou administra- ções) de fármaco, em 0, 1, 2, 4, 8, 12 e 24 horas, respectivamente. O tecido cerebral foi coletado, imediatamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C até a análise. O tecido cerebral congelado foi homogeneizado em uma mistura de metanol:água (20:80), centrifugado para precipitar as proteínas e o sobrenadante, co- letado para determinação dos níveis quantitativos de fenofibrato e ácido fenofíbrico através de LC-MS/MS. A coentrega de kaempferol com fenofibrato aumentou os níveis de fenofibrato (Figura 9A) e ácido fenofíbrico (Figura 9B) cerebrais no ponto de tempo de 1 hora, quando seus níveis parecem atingir o pico. Os níveis de fenofibrato e ácido fenofíbrico foram mantidos em concentrações mais altas por pelo menos 4-8 (F e FA, respectivamente) horas em camundongos que receberam fenofibrato e kaempferol em comparação com aqueles que receberam apenas fenofibrato. Esses resultados murinos in vivo sugerem que a administração de kaempferol pode ser usada para aumentar os níveis de fenofibrato no cérebro.

EXEMPLO 8 - COENTREGA DE FENOFIBRATO E NEUROPROTEÇÃO

POTENCIALIZADA POR KAEMPFEROL EM MODELO DE CAMUNDONGO COM MPTP DA DOENÇA DE PARKINSON (PD)

[095]Os efeitos neuroprotetores de coentrega de kaempferol e fenofibrato fo- ram estudados em um modelo de camundongo de PD. Às 13 semanas de idade, os camundongos C57/BL6 foram tratados com MPTP (30 mg/kg) ou solução salina (i.p.) por cinco dias consecutivos, seguido por 14 dias de tratamento com solução salina i.p.

ou fenofibrato i.p. e/ou kaempferol. Os camundongos C57/BL6 foram divididos em oito grupos de 8 animais por grupo; Grupo A: tratamento com solução salina + solução salina; Grupo B: tratamento com MPTP + solução salina; Grupo C: MPTP + 150 mg/kg de fenofibrato; Grupo D: tratamento com MPTP + 150 mg/kg de fenofibrato e 50 mg/kg de kaempferol; Grupo E: tratamento com MPTP + 150 mg/kg de fenofibrato e 100 mg/kg de kaempferol; Grupo F: MPTP + 200 mg/kg de fenofibrato; Grupo G: trata- mento com MPTP + 200 mg/kg de fenofibrato e 50 mg/kg de kaempferol; Grupo H: tratamento com MPTP + 200 mg/kg de fenofibrato e 100 mg/kg de kaempferol. No final de tratamento, esses animais foram sacrificados, perfundidos com paraformalde- ído (PFA) e as seções do cérebro coradas com tirosina hidroxilase (TH) para análise imunohistoquímica. Observou-se que o tratamento subcrônico com MPTP de 5 dias (30 mg/kg) induziu perda significativa de neurônios dopaminérgicos na substância ne- gra (Figura 10B), com perda de neurita associada no corpo estriado (Figura 11B) quando comparado a camundongos tratados com solução salina (Figuras 10A, 11A).

O tratamento subsequente com fenofibrato (150 e 200 mg/kg) evitou a perda induzida por MPTP de neurônios negros (Figuras 10C, 10F) e neuritos do corpo estriado (Figu- ras 11C, 11F), confirmando as constatações anteriores. A coadministração de fenofi- brato (150 mg/kg) com kaempferol (50 mg/kg) aumentou o efeito neuroprotetor (Figu- ras 10D, 11D) em comparação com o tratamento com fenofibrato sozinho, indicando que o kaempferol atua aditivamente para prevenir a neurotoxicidade induzida por MPTP. A coadministração de uma dose muito elevada de fenofibrato, no entanto, jun- tamente com uma dose elevada de kaempferol (100 mg/kg) não mostrou uma melho- ria na neuroproteção (Figura 10I, 11I), indicando que esses dois fármacos devem ser entregues em uma razão de massa fixa para provocar neuroproteção máxima.

EXEMPLO 9 - CHÁ VERDE E ALCAPARRAS SÃO FONTES NATURAIS

POTENCIAIS DE KAEMPFEROL E SEUS DERIVADOS

[096]A coadministração de kaempferol com fenofibrato como uma terapia neu- roprotetora para tratar pacientes em risco ou que sofrem de distúrbios neurodegene- rativos e lesão cerebral traumática é especificamente contemplada. Kaempferol tem atividade intrínseca como anti-inflamatório e pode ser formulado separadamente como nutracêutico. Portanto, a quantidade relativa de kaempferol em fontes naturais con- tendo a molécula, tais como alcaparras e chá verde, foi investigada usando análise de triplo quadrupolo-MS (TQ-MS). Cinco marcas diferentes de alcaparras (Mezzetta, IPS, Napoleon, Isola, Fanti) e três marcas de chá verde (Bigelow, Lipton, Tetley) que foram adquiridas em uma loja de varejo local. As alcaparras foram extraídas com MeOH:água (1:1) por 24 horas à temperatura ambiente, enquanto o chá verde foi ex- traído em água fervente por três minutos. Os resultados de TQ-MS mostraram que maiores quantidades de kaempferol “livre” estavam presentes no extrato de alcaparra (160 a 505 ng/ml/g) em comparação com o extrato de chá verde (14 a 50 ng/ml/g) (Figura 15A). Por outro lado, a análise qualitativa de MS de tempo de voo quadrupolo (QTOF) (por m/z) dos dois extratos mostrou níveis mais elevados em 1 a 2 ordens de magnitude de derivados de kaempferol contidos no extrato de chá verde (5 × 107 a 1,2 × 108 de AU) em comparação com o extrato de alcaparra (4 × 106 a 7 × 106 de AU) (Figuras 12B, 12C). O TQ-MS fornece apenas a quantidade de kaempferol “livre” e não os derivados de kaempferol contidos (conjugados com moléculas complexas), sendo o último determinado por análise qualitativa de MS de QTOF. No geral, os re- sultados sugerem que o extrato de chá verde contém grandes quantidades de deriva- dos de kaempferol que podem fornecer uma fonte alternativa para essa molécula.

[097]As publicações citadas neste documento e os materiais para os quais são citadas são aqui especificamente incorporados por referência em sua totalidade.

Várias modalidades foram descritas. No entanto, será entendido que várias modifica- ções podem ser feitas. Consequentemente, outras modalidades são abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.

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22.Ono, K., et al., Potent anti-amyloidogenic and fibril-destabilizing effects of polyphenols in vitro: implications for the prevention and therapeutics of Alzheimer's disease. J Neurochem, 2003. 87(1): p. 172-81.

23.Choi, S.M., et al., Effects of Flavonoid Compounds on beta-amyloid-pep- tide-induced Neuronal Death in Cultured Mouse Cortical Neurons. Chonnam Med J,

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24.Hou, Y., et al., Anti-depressant natural flavonols modulate BDNF and beta amyloid in neurons and hippocampus of double TgAD mice. Neuropharmacology,

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25.Lei, Y., et al., In vivo investigation on the potential of galangin, kaempferol and myricetin for protection of D-galactose-induced cognitive impairment. Food Chem,

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26.Ablat, N., et al., Neuroprotective Effects of a Standardized Flavonoid Ex- tract from Safflower against a Rotenone-Induced Rat Model of Parkinson's Disease.

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27.Ren, R., et al., Neuroprotective Effects of A Standardized Flavonoid Extract of Safflower Against Neurotoxin-Induced Cellular and Animal Models of Parkinson's Disease. Sci Rep, 2016. 6: p. 22135.

28.Li, S. and X.P. Pu, Neuroprotective effect of kaempferol against a 1-methyl- 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced mouse model of Parkinson's disease. Biol Pharm Bull, 2011. 34(8): p. 1291-6.

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Claims (34)

REIVINDICAÇÕES

1. Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para o tratamento de uma doença neurodegenerativa em um sujeito que compreende administrar fenofibrato e kaempferol a um sujeito em necessidade do mesmo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito foi diagnosticado com uma doença neurodegenerativa.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito está em risco de desenvolver uma doença neurodegenerativa.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma doença neurodegenerativa em estágio inicial.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença neurodegenerativa é doença de Parkinson, síndrome de Parkinson-plus, demência familiar, demência vascular, doença de Alzheimer, doença de Huntington, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, demência frontotemporal, neurodegeneração retinal, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) ou lesão cerebral traumática (TBI).

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a síndrome de Parkinson-plus é selecionada a partir do grupo que consiste em atrofia de múltiplos sistemas (MSA), paralisia supranuclear progressiva (PSP) e degeneração corticobasal (CBD).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o fenofibrato e o kaempferol são administrados concomitantemente.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o fenofibrato e o kaempferol são administrados sequencialmente.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administrar um produto terapêutico padrão ao sujeito.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o produto terapêutico padrão é um precursor de dopamina, agonista de dopamina, um agente anticolinérgico, um inibidor de monoamina oxidase, um inibidor de COMT, amantadina, rivastigmina, um antagonista de NMDA, um inibidor de colinesterase, riluzol, um agente antipsicótico, um antidepressivo ou tetrabenazina e seus derivados.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda determinar que o sujeito tem um nível reduzido de expressão de PGC-1α em comparação com um sujeito de controle.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o fenofibrato e o kaempferol são administrados em uma razão molar fixa.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a razão molar entre fenofibrato e kaempferol é 1,5:1, 2:1, 3:1 ou 4:1.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração aumenta os níveis de fenofibrato no cérebro em comparação com o tratamento com fenofibrato sozinho.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que os níveis são aumentados por pelo menos 2 a 4 horas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração reduz os níveis de agentes de estresse oxidativo no cérebro ou no sistema nervoso central.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração reduz os níveis de inflamação no cérebro ou no sistema nervoso central.

18. Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para prevenir/reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato em ácido fenofíbrico e, assim, aumentar os níveis de fenofibrato em um sujeito, que compreende administrar uma combinação de fenofibrato e kaempferol em uma razão molar suficiente para reduzir o metabolismo de primeira passagem de fenofibrato.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma doença neurodegenerativa.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença neurodegenerativa é doença de Parkinson, síndrome de Parkinson- plus, demência familiar, demência vascular, doença de Alzheimer, doença de Huntington, esclerose múltipla, demência com corpos de Lewy, comprometimento cognitivo leve, demência frontotemporal, neurodegeneração retinal, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) ou lesão cerebral traumática.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a síndrome de Parkinson-plus é atrofia de múltiplos sistemas (MSA), paralisia supranuclear progressiva (PSP) ou degeneração corticobasal (CBD).

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administrar um produto terapêutico padrão ao sujeito.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o tratamento terapêutico padrão é levodopa, um agonista de dopamina, um agente anticolinérgico, um inibidor de monoamina oxidase, um inibidor de COMT, amantadina, rivastigmina, um antagonista de NMDA, um inibidor de colinesterase, riluzol, um agente antipsicótico, um antidepressivo ou tetrabenazina e seus derivados.

24. Método CARACTERIZADO pelo fato de que é para induzir a expressão de PGC-1α em uma célula neural ou uma célula progenitora neural, que compreende colocar uma célula neural ou uma célula progenitora neural em contato com fenofibrato e kaempferol.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa de colocar em contato é in vivo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a indução de PGC-1α é independente de PPARα.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula neural é um neurônio.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o neurônio é um neurônio dopaminérgico.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o neurônio é de um córtex, corpo estriado ou medula espinhal de um sujeito.

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula neural é uma célula glial ou astrócito.

31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a administração é neuroprotetora.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a neuroproteção compreende aumentar a atividade ou o número de células neuronais na região nigral do cérebro e/ou reduzir a perda de terminais positivos no corpo estriado.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o Kaempferol é de uma fonte natural.

33. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte natural é uma planta ou extrato vegetal que compreende kaempferol.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a fonte ou extrato natural é chá verde, alcaparras, couve, chá, brócolis, repolho,

feijão, endívia, alho-poró, tomate, morangos ou uvas.