CN115429788B

CN115429788B - 一种治疗脱髓鞘疾病的药物及应用

Info

Publication number: CN115429788B
Application number: CN202211303009.0A
Authority: CN
Inventors: 程晓东; 王元花; 马金昀; 丁桂清
Original assignee: Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Shanghai University of TCM
Current assignee: Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Shanghai University of TCM
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-11-21
Anticipated expiration: 2042-10-24
Also published as: CN115429788A

Abstract

本发明涉及一种治疗脱髓鞘疾病的药物，由山奈酚组成。本发明经实验证实，山奈酚对EAE小鼠有很好的预防和治疗效果，可以显著缓解EAE小鼠的神经功能障碍，减缓EAE小鼠体重下降的趋势，降低疾病神经功能评分，并延迟发病时间。山奈酚在40mg/kg/d给药浓度时能明显减轻EAE小鼠的脊髓炎性浸润，抑制EAE小鼠中枢神经***的髓鞘脱失。本发明为山奈酚开辟了新的用途，为临床治疗中枢神经***脱髓鞘疾病提供新的候选药物。

Description

一种治疗脱髓鞘疾病的药物及应用

技术领域

本发明涉及中医药研究开发利用领域，具体地说，是一种治疗脱髓鞘疾病的药物及应用。

背景技术

脱髓鞘疾病(Demyelinating Disease)是一种神经***疾病，是髓鞘形成障碍或遭到破坏，所导致的疾病的统称。脱髓鞘疾病可以分为中枢神经***脱髓鞘疾病(最多见，其中以多发性硬化、视神经脊髓炎谱系疾病为代表)、周围神经***脱髓鞘疾病，以及中枢和周围神经***联合脱髓鞘疾病。

多发性硬化(Multiple sclerosis，MS)是中枢神经***的自身免疫性脱髓鞘疾病。在全球范围内，约有200多万人罹患该病，主要临床表现是运动障碍，视力、味觉、嗅觉、认知和精神障碍，共济失调等，具有高致残率和高复发率的特点，严重影响患者的生活质量，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。MS发病机制尚不清楚，且当前没有彻底治愈该疾病的特效药物，临床上多采用格列吡啶、富马酸二甲酯、β干扰素和激素等药物缓解疾病的进展和复发，但是存在药物耐受和毒、副作用大等缺点。

中医药在治疗MS疾病方面具有资源丰富，疗效显著，毒、副作用小、价格低廉等独特优势，从中医药角度寻求有效治疗MS疾病的药物和疗法获得愈来愈多的国内外学者的关注。山奈酚(Kaempferol，Kae)是黄酮类化合物，广泛存在于多种蔬菜、水果以及中草药等植物中，最近研究发现山奈酚作为一种常见且安全的膳食补充剂，具有抗炎、抗癌、抗抑郁、抗惊厥和保护脑缺血损伤等作用。

为了寻求新的治疗中枢神经***脱髓鞘疾病的药物，本发明以山奈酚为研究对象，观察山奈酚对MS疾病的治疗效果，采用MS的经典动物模型--EAE小鼠进行实验研究，发现山奈酚对EAE脱髓鞘小鼠有很好的预防和治疗效果，显著改善其神经功能障碍，减轻中枢炎性浸润，抑制脱髓鞘。

目前尚未见山奈酚作为治疗中枢神经***脱髓鞘疾病的药物的相关研究和报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗脱髓鞘疾病的药物。

本发明的另一目的是，提供一种上述药物的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗脱髓鞘疾病的药物，所述的药物山奈酚是一种天然黄酮类化合物，其结构式(Ⅰ)所示。

优选地，所述药物为胶囊剂、片剂、粉剂、注射液或外用剂。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述的药物在制备预防/治疗脱髓鞘疾病药物中的应用。

优选地，所述的脱髓鞘疾病为中枢神经***脱髓鞘疾病，采用的脱髓鞘疾病动物模型是EAE。

优选地，所述的中枢神经***脱髓鞘疾病为多发性硬化疾病。

优选地，所述山奈酚在制备改善EAE小鼠的神经功能障碍、抑制中枢神经***炎性浸润和髓鞘脱失药物中的用途。

本发明优点在于：

1、山奈酚对EAE小鼠有很好的预防和治疗效果，可以显著缓解EAE小鼠的神经功能障碍，减缓EAE小鼠体重下降的趋势，降低疾病神经功能评分，并延迟了发病时间。山奈酚在40mg/kg/d给药浓度时能明显减轻EAE小鼠的脊髓炎性浸润，抑制EAE小鼠中枢神经***的髓鞘脱失。

2、本发明为山奈酚开辟了新的用途，为临床治疗中枢神经***脱髓鞘疾病提供新的候选药物。

附图说明

附图1是成功构建EAE小鼠模型；

附图2是实验各组小鼠的神经功能评分；

附图3是实验各组小鼠的体重变化；

附图4是实验各组小鼠的脊髓HE染色；

附图5是实验各组小鼠的脊髓LFB染色。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1山奈酚对EAE脱髓鞘小鼠的作用

1.实验材料

1.1动物

健康雌性C57BL/6小鼠24只，6周龄，体重18～20g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，SPF级环境(恒温25±2℃，恒湿40％～50％)喂养。

1.2试剂

山奈酚、生理盐水、百日咳毒素、完全弗氏佐剂、结核分枝杆菌H37Ra、MOG35-55、4％多聚甲醛。

1.3仪器

电动组织匀浆器(上海净信实业发展有限公司)、漩涡振荡仪(海门其林贝尔仪器公司)、电子天平(上海舜宇恒平仪器公司)。

2.实验过程

2.1EAE模型乳化试剂的准备

MOG35-55溶于PBS缓冲液，配置终浓度为2mg/ml，在完全弗氏佐剂(CFA)中加入结核分枝杆菌H37Ra至终浓度4mg/ml，将MOG35-55溶液与CFA按1：1体积比进行乳化，采用电动组织匀浆器调至100W超声60分钟，冰上操作，超声1分钟，停止1分钟，防止温度过高影响试剂活性，待充分乳化后将乳化剂滴在水面，乳化剂聚集而不会分散，既为乳化成功。

2.2百日咳毒素(PTX)的配置

将0.2mg/mlPTX用PBS缓冲液稀释至300ng/ml。

2.3C57BL/6小鼠免疫方法

在免疫当日(Day0)异氟烷麻醉小鼠，于小鼠脊柱头颈部和后背分两点注射MOG35-55乳化剂各100μl。即MOG35-55200μg/只，腹腔注射PTX溶液200μl，即PTX 200ng/只，并观察小鼠麻醉后苏醒状态是否良好；在免疫后第2天(Day2)再次腹腔注射PTX 200ng/只。

2.4分组和给药方式

实验前将6周龄的小鼠称重，随机抽取小鼠，分配到各组，设为正常组8只，EAE组8只，山奈酚给药组8只，适应性喂养1周。正常组不进行干预，正常喂养；EAE组是自免疫当天开始用生理盐水灌胃0.2ml/只；山奈酚组是在免疫前7日起开始给药，每只小鼠按照40mg/kg/d的标准灌胃，直至实验结束。

3.一般情况观察

3.1体重检测

自免疫当日(Day0)起，每日对实验各组小鼠进行称量，并记录小鼠体重的变化，直至免疫后30天(Day30)。

3.2疾病神经功能评分

从免疫当日起对实验小鼠进行一般情况监测，记录神经功能评分，评分标准根据国际通用的5级评分进行评分：

①0分无异常表现；

②0.5分部分尾部瘫痪；

③1分尾部完全瘫痪；

④2分后肢轻度瘫痪或步态不稳；

⑤3分后肢完全瘫痪；

⑥3.5分双后肢完全瘫痪，前肢轻度瘫痪；

⑦4分四肢完全瘫痪；

⑧4.5分濒死状态；

⑨5分死亡。

4.结果

4.1EAE小鼠发病典型症状

通过前期预实验掌握了构建成熟稳定的EAE小鼠模型方法。EAE组小鼠发病起始于造模后第11天，发病高峰出现于造模后第17天，17天后病情逐渐进入缓解期，EAE小鼠最高临床症状评分为4分，在整个实验过程中未出现小鼠死亡，EAE小鼠的发病率为100％(图1)。

4.2山奈酚对EAE小鼠的神经功能评和分体重的影响

与EAE组相比，山奈酚组小鼠的发病起始及发病高峰时间均有所延迟，分别为第14天和第20天，临床症状评分显著降低，山奈酚对于缓解EAE小鼠的临床症状具有一定预防和治疗作用(图2)。在EAE模型诱导后，各组小鼠的体重均有所下降，免疫后第4天起体重逐渐缓慢上升；EAE组小鼠临近发病期体重开始出现显著下降，并且随病情加重而持续减轻，山奈酚干预显著减缓了EAE小鼠的体重下降趋势(图3)。

实施例2：山奈酚对EAE脱髓鞘小鼠中枢神经***的作用

1.材料和方法

1.1试剂

生理盐水、多聚甲醛、异氟烷、苏木精、伊红、LFB染色液、二甲苯、各种浓度梯度的乙醇、碳酸锂溶液、中性树胶。

1.2仪器

精密鼓风干燥箱(上海博迅医疗生物仪器公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯)、石蜡包埋机、石蜡切片机(德国Leica公司)、水浴锅(上海精宏实验设备公司)。

1.3动物取材：

在免疫后30天结束实验，异氟烷口鼻吸入进行麻醉，小鼠进行固定，打开小鼠胸腔，暴露出心脏，剪开心包膜，用穿刺针快速从左心室***，动脉夹固定针尖，灌注少量生理盐水，待右心房逐渐膨胀时，剪开右心耳排液，继续灌注生理盐水30毫升，直至肝脏变白，换4％多聚甲醛灌注，直至小鼠尾巴***，四肢强直，表明固定成功。停止灌注，剪开小鼠的枕顶部皮肤，剥离颅骨，完整取出大脑，剥离小鼠的脊柱(腰膨大部位)，PBS清洗后，放入多聚甲醛中浸泡24h，准备包埋、切片，进行后续实验。

1.4HE染色方法：

①将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2h；

②脱蜡：脱蜡二甲苯I、II各10分钟，提前准备好盖玻片；

③覆水：100％(I、II)、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟×3。

④苏木精染色5分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

⑤5％乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅成为蓝色。

⑥伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗。

⑦脱水：70％、80％、90％、100％乙醇各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右。

⑧滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。

1.5LFB髓鞘染色方法：

①选好片子，放60℃烘箱2h，使石蜡融化。

②脱蜡至95％乙醇：二甲苯I 30分钟→二甲苯II 30分钟→二甲苯III 30分钟→无水乙醇I 2分钟→无水乙醇II 2分钟→95％乙醇2分钟；

③LFB染色：在0.1％LFB染色液中过夜室温孵育16h；

④洗片：第二天取出片子→95％乙醇稍浸洗→纯水中稍浸洗；

⑤分化：0.05％的碳酸锂溶液进行分化，10s左右，放入70％乙醇稍浸洗，显微镜下观察脑灰质和白质能清晰辨别，灰质接近于透明色，白质是蓝绿色，停止分化，纯水稍浸洗；

⑥脱水、透明：80％乙醇2分钟→90％乙醇2分钟→无水乙醇I 2分钟→无水乙醇II2分钟→二甲苯I 2分钟→二甲苯II 2分钟

⑦滴上中性树胶，封片。用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡，晾干后倒置显微镜进行拍照。

2.结果

2.1山奈酚抑制EAE脱髓鞘小鼠的炎性浸润

HE染色显示，正常组小鼠的腰膨大部位细胞结构清晰，排列整齐，细胞间隙分明，无水肿、无炎性浸润、细胞坏死的等现象；EAE小鼠腰膨大部位损伤明显，细胞排列紊乱，炎性细胞大量浸润，核质界限不明，染色质固缩或聚集严重；与EAE组相比，山奈酚组小鼠的腰膨大损伤得到明显缓解，细胞排列整齐，细胞间隙分明，无炎性细胞浸润，染色质固缩或聚集严重等现象(图4)。

2.2山奈酚抑制EAE小鼠的髓鞘脱失

LFB染色显示髓鞘被染成蓝色(因说明书中图片呈现灰色，以此说明)，正常小鼠的髓鞘组织结构完整，分布均匀，无髓鞘脱失；EAE小鼠脊髓可见大小不等的片状髓鞘脱失区域，白质中的空泡样脱髓鞘改变尤为明显；山奈酚给药组小鼠的髓鞘比较完整，质地均匀，髓鞘脱失程度明显得到抑制(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.山奈酚在制备预防/治疗中枢神经***脱髓鞘疾病药物中的用途，其特征在于，所述的中枢神经***脱髓鞘疾病为多发性硬化疾病。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述山奈酚还可用于制备改善EAE小鼠的神经功能障碍、抑制中枢神经***炎性浸润和髓鞘脱失药物。