BR112020008201A2 - substituição-alvo de receptores de células t endógenos - Google Patents

substituição-alvo de receptores de células t endógenos Download PDF

Info

Publication number
BR112020008201A2
BR112020008201A2 BR112020008201-5A BR112020008201A BR112020008201A2 BR 112020008201 A2 BR112020008201 A2 BR 112020008201A2 BR 112020008201 A BR112020008201 A BR 112020008201A BR 112020008201 A2 BR112020008201 A2 BR 112020008201A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cell
tcr
heterologous
chain
nucleic acid
Prior art date
Application number
BR112020008201-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Theodore Lee ROTH
Eric SHIFRUT
Alexander Marson
Cristina Puig SAUS
Antoni Ribas
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of BR112020008201A2 publication Critical patent/BR112020008201A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos e composições para a edição do genoma de uma célula T humana. Em algumas modalidades, uma cadeia de receptor de célula T (TCR)-ß heteróloga e uma cadeia de TCR-a heteróloga são inseridos no éxon 1 de um gene constante de subunidade de TCR no genoma da célula T.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “SUBSTITUIÇÃO-ALVO DE RECEPTORES DE CÉLULAS T ENDÓGENOS”.
PEDIDO RELACIONADO A ANTERIOR
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. nº. 62/578.153 depositado em 27 de outubro de 2017, o qual é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] As células T constituem o tipo de célula mais ativamente estudado dentro do campo crescente de terapêutica celular adotiva. As células T interagem especificamente com o alvo de seu receptor de célula T (TCR), permitindo respostas altamente específicas com efeitos colaterais mínimos. Essas respostas altamente eficazes e específicas podem ser projetadas para novos antígenos e alvos mediante a inserção de um novo receptor com a especificidade desejada em uma célula T. No entanto, o desenvolvimento de tipos inteiramente novos de receptores leva muito tempo, é caro e não tira vantagem do fato que, através do desenvolvimento do repertorio de células T endógenas, o corpo produz naturalmente TCRs que se ligam a quase todo alvo antigênico possível. A capacidade de obter células T humanas e de substituir o seu TOR endógeno por um TCR que tem uma especificidade desejada do antígeno pode ser transformadora no desenvolvimento e na aplicação de terapias de células T adotivas.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[003] A presente descrição refere-se a composições e métodos para a edição do genoma de uma célula T humana. Os autores da presente invenção descobriram que um TCR heterólogo pode ser inserido em uma região-alvo no genoma de uma célula T, de maneira tal que o TOR heterólogo fica sob o controle de um promotor endógeno de TCR. Os métodos e as composições providos no presente documento podem ser usados para substituir um TOR endógeno em uma célula T humana por um TCR heterólogo que tem uma especificidade de antígeno desejada. Em algumas modalidades, a região-alvo no genoma de uma célula T é o lócus nativo do receptor de célula T.
[004] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método de edição do genoma de uma célula T humana. Em algumas modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante de subunidade de receptor de células T (TOR) na célula T humana, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma primeira cadeia de subunidade de TOR heteróloga, em que a cadeia de subunidade de TOR compreende a região variável e a região constante de subunidade de TCR; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR endógena, em que, se a subunidade de TCR endógena for um subunidade de TCR-alfa (TCR- a), a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR heteróloga-beta (TCR-B) e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga, e em que, se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-B, a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga, e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga. Em algumas modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR alfa (TRAC) na célula T humana, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal
C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena.
[005] Em algumas modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante de subunidade de TCR-beta (TRBC) na célula T humana, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma cadeia de TCR-a heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena.
[006] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido mediante a introdução de um vetor viral que compreende o ácido nucleico na célula T. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido mediante a introdução de um vetor não viral que compreende o ácido nucleico na célula T. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma nuclease alvo que cliva uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR-a (TRAC) para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é incorporada no sítio de inserção pelo reparo dirigido por homologia (HDR). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma nuclease alvo que cliva uma região- alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR-B (TRBC) para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é incorporada no sítio de inserção pelo reparo dirigido por homologia
(HDR). Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' do ácido nucleico compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a região-alvo. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' do ácido nucleico compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção. Em algumas modalidades, a nuclease alvo introduz uma ruptura de cordão duplo no sítio de inserção. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um ácido nucleico de cordão duplo ou de cordão simples. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é introduzido na célula como um modelo de DNA de cordão duplo ou de cordão simples. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um ácido nucleico linear.
[007] Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo autoclivável e o segundo peptídeo autoclivável são o mesmo ou peptídeos 2A virais diferentes.
[008] Em algumas modalidades, a nuclease alvo é selecionada do grupo que consiste em um domínio de nuclease guiado pelo RNA, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) e uma megaTAL. Em algumas modalidades, a nuclease guiada pelo RNA é uma nuclease Cpf1 ou uma nuclease Cas9, e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo no éxon 1 de TRAC. Em algumas modalidades, a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9, o RNA guia e o ácido nucleico são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)-complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9 e o RNA guia; e (ii) o modelo de DNA.
[009] Em algumas modalidades, a razão molar entre a RNP e o modelo de DNA no complexo é de cerca de 3:1 a cerca de 100:1. Em algumas modalidades, o complexo do RNP-modelo de DNA é formado ao incubar a RNP com o modelo de DNA por cerca de dez a cerca de trinta minutos, a uma temperatura de cerca de 20ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, o complexo de RNP-modelo de DNA e a célula são misturados antes da introdução do complexo de RNP-modelo de DNA na célula. Em algumas modalidades, o complexo de RNP-modelo de DNA compreende pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes contêm RNAs guias estruturalmente diferentes. Em algumas modalidades, cada um dos complexos de RNP estruturalmente diferentes compreende uma nickase Cas9, e em que os RNAs guias estruturalmente diferentes hibridizam a cordões opostos da região-alvo.
[0010] Em algumas modalidades, a introdução compreende a eletroporação. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é introduzido em uma população de cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T. Em alguns exemplos, a nuclease alvo e o modelo de DNA são introduzidos em uma população de cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T. Em algumas — modalidades, pelo menos dois modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células. Em algumas modalidades, pelo menos dois modelos de DNA estruturalmente diferentes são modelos não virais. Em algumas modalidades, cada um de pelo menos dois modelos de DNA estruturalmente diferentes codifica uma combinação singular de uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno e de uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T reguladora, uma célula T efetora, ou uma célula T virgem. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T efetora, e em que a célula T efetora é uma célula CD8+ T. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T efetora, e em que a célula T efetora é uma célula CD4+ T. Em algumas modalidades, a célula T efetora é uma célula CD4+CD8+ T.
[0011] Em algumas modalidades, o método também compreende o cultivo de células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR-B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno. Em algumas modalidades, o método também compreende o cultivo de células T modificadas sob condições eficazes para expandir a população de células modificadas. Em algumas modalidades, o método também compreende a purificação de células T que expressam o receptor de células T específico de antígeno.
[0012] Em algumas modalidades, a presente invenção provê um método de edição do genoma de célula T humana, o qual compreende: (a) a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR alfa(TRAC) na célula T humana de uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma cadeia de TOCR- a heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno; e (iii) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade endógena de TOR alfa; e (b) a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR beta (TRBC) na célula T humana de uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma cadeia de TCR-B heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno; e (ili) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade de TCR beta endógena.
[0013] Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda sequências de ácidos nucleicos são inseridas mediante a introdução de um vetor viral que compreende o primeiro e/ou o segundo ácidos nucleicos às células T. Em algumas modalidades, a primeira e/ou a segunda sequências de ácidos nucleicos são inseridas mediante a introdução de um vetor não viral que compreende o primeiro e/ou o segundo ácidos nucleicos à células T. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são inseridos na célula T mediante a introdução de (a) uma ou mais nucleases alvo que criam um primeiro sítio de inserção no éxon 1 de um TRAC e um segundo sítio de inserção no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR beta (TRBC); e (b) a primeira sequência de ácidos nucleicos; e (c) a segunda sequência de ácidos nucleicos, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é inserida no primeiro sítio de inserção no éxon 1 de TRAC e a segunda sequência de ácidos nucleicos é inserida no segundo sítio de inserção no éxon | de TRBC pelo reparo dirigido por homologia (HDR). Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um modelo de DNA de cordão duplo ou de cordão simples. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um modelo de DNA linear.
[0014] Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' da primeira sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' da primeira sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam o primeiro sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRAC. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' da segunda sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a região-alvo no éxon 1 do gene de TRBC. Em algumas modalidades, a extremidade 5' e a extremidade 3' da segunda sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a segunda inserção no éxon 1 do gene de TRBC.
[0015] Em algumas modalidades, uma ou mais nucleases alvo introduzem uma ruptura de cordão duplo no primeiro e segundo sítios de inserção. Em algumas modalidades, o primeiro peptídeo autoclivável e o segundo peptídeo autoclivável são o mesmo ou peptídeos 2A virais diferentes. Em algumas modalidades, uma ou mais nucleases alvo são selecionadas do grupo que consiste em um domínio de nuclease guiado pelo RNA, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), um nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou uma megaTAL.
[0016] Em algumas modalidades, a nuclease guiada pelo RNA é uma nuclease Cpf1 ou uma nuclease Cas9 e em que o método também compreende a introdução na célula de um primeiro RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 de TRAC, e um segundo RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 de TRBC. Em algumas modalidades, a nuclease Cpf1i ou a nuclease Cas9, o primeiro RNA guia e o primeiro ácido nucleico são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)- complexo de modelo de DNA, em que o complexo do RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9 e primeiro RNA guia; e (ii) o primeiro modelo de DNA. Em algumas modalidades, a nuclease Cpfi ou a nuclease Cas9, o segundo RNA guia e o segundo ácido nucleico são introduzidos na célula como um complexo de RNP-modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende uma nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9 e o segundo RNA guia; e (ii) o segundo modelo de DNA.
[0017] Em algumas modalidades, a razão molar entre a RNP e o modelo de DNA no complexo é de cerca de 3:1 a cerca de 100:1. Em algumas modalidades, o complexo de RNP-modelo de DNA é formado ao incubar a RNP com o modelo de DNA por cerca de dez a cerca de trinta minutos, a uma temperatura de cerca de 20ºC a 25ºC. Em algumas modalidades, o complexo de RNP-modelo de DNA compreende pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes. Em algumas modalidades, cada um dos complexos de RNP estruturalmente diferentes compreende uma nickase Cas9, e em que os RNAs guias estruturalmente diferentes hibridizam a cordões opostos da região-alvo. Em algumas modalidades, a introdução compreende a eletroporação.
[0018] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são introduzidos em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T. Em algumas modalidades, uma ou mais nucleases alvo e o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são introduzidos em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T. Em algumas modalidades, pelo menos dois primeiros modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células. Em algumas modalidades, pelo menos dois primeiros modelos de DNA estruturalmente diferentes compreendem regiões variáveis diferentes de uma cadeia de TCR-a de um receptor de células T específico de antígeno. Em algumas modalidades, pelo menos dois segundos modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células. Em algumas modalidades, pelo menos dois segundos modelos de DNA estruturalmente diferentes compreendem regiões variáveis diferentes de uma cadeia de TCR-B de um receptor de células T específico de antígeno.
[0019] Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T reguladora, uma célula T efetora, ou uma célula T virgem. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T efetora, em que a célula T efetora é uma célula CD8+ T. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T efetora, em que a célula T efetora é uma célula CD4+ T. Em algumas modalidades, a célula T efetora é uma célula CD4+CD8+T.
[0020] Em algumas modalidades, o método também compreende o cultivo das células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR-B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno. Em algumas modalidades, o método também compreende o cultivo das células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR-B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno. Em algumas modalidades, o método também compreende o cultivo de células T modificadas sob condições eficazes para expandir a população de células modificadas. Em algumas modalidades, o método também compreende a purificação das células T que expressam o receptor de células T específico de antígeno.
[0021] Em outras modalidades, a presente invenção provê uma célula T modificada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de receptor de célula T (TCR)-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR alfa endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC.
[0022] Em algumas modalidades, a presente invenção também provê uma célula T modificada que compreende: a) uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (1) uma primeira sequência autoclivável, (ii) a região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga, e (ili) uma porção do terminal N da cadeia de TCR-a endógena; e b) uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência autoclivável, (ii) a região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga, e (iii) uma porção do terminal N da cadeia de TCR-B endógena, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC e a segunda sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRBC.
[0023] Em algumas modalidades, a presente invenção também provê um método de tratamento do câncer em um indivíduo humano, o qual compreende: a) a obtenção de células T do indivíduo; b) a modificação das células T para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno específico de tumor no indivíduo; e c) a administração das células T modificadas ao indivíduo.
[0024] Mediante o uso dos métodos e das composições descritos no presente documento para modificar células T para expressar uma cadeia de TCR-a heteróloga e uma cadeia de TCR-B heteróloga, também é possível editar uma célula T gama delta (yô5) humana. Por exemplo, em algumas modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade gama do receptor de célula T (TRGC) na célula T humana, de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N do TCR-a endógeno.
[0025] Em outras modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade gama do receptor de célula T (TRGC) na célula T humana, de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total; e (v) um códon de parada, de maneira tal que, com a inserção do ácido nucleico, os ácidos nucleicos que codificam as sequências de TCR-B e de TCR-a heterólogas ficam sob o controle do promotor de TOCR-y endógeno.
[0026] Em outras modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade gama do receptor de célula T (TRGC) na célula T humana, de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-5 heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-y heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-y endógena. Também é provido um método de edição do genoma de uma célula T humana, o qual compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene de TRAC na célula T humana, de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR+y heteróloga; (ili) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-5 heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena. Em outras modalidades, o método compreende a inserção em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade gama do receptor de célula T (TRAC) na célula T humana, de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de
TCR-y, heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma cadeia de TOCR-3 heteróloga de comprimento total; e (v) um códon de parada, de maneira tal que, com a inserção do ácido nucleico, as sequências de TOCR-5 e TCR-y heterólogas ficam sob o controle do promotor de TOR-a endógeno.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] O presente pedido de patente inclui as figuras a seguir. As figuras se prestam a ilustrar determinadas modalidades e/ou características das composições e dos métodos, e a suplementar qualquer(quaisquer) descrição(ões) das composições e dos métodos. As figuras não limitam o âmbito das composições e dos métodos, a menos que a descrição escrita indique expressamente que é esse o caso.
[0028] A Figura 1a é uma ilustração esquemática que mostra a inserção de um modelo de DNA não viral simples que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma sequência de peptídeos autocliváveis T2A; (ii) uma região de comprimento total (isto é, região variável e região constante) de uma cadeia de TCR-B heteróloga (NYESO-B); (iii) uma sequência de peptídeos autocliváveis P2A; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga (NYESO-a); e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR alfa endógena em uma célula T através do reparo dirigido por homologia. Depois da inserção do modelo de DNA no éxon 1 do gene de TRAC através do reparo dirigido por homologia, o modelo de DNA foi transcrito e traduzido para produzir uma cadeia de comprimento total de NYESO-RB e uma cadeia de comprimento total de NYESO-a que forma um TCR específico de antígeno que reconhece o neoantígeno de melanoma NY-ESO-1.
[0029] A Figura 1b é uma ilustração esquemática que mostra a inserção de um único modelo de DNA não viral no lócus de TOR-B
(TRBC1 ou TRBC2). O modelo compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma sequência de peptídeos autocliváveis T2A; (ii) (isto é, região variável e região constante) uma cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total (NYESO-a); (iii) uma sequência de peptídeos autocliváveis P2A; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga (NYESO-B); e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR beta endógena em uma célula T através do reparo dirigido por homologia.
[0030] A Figura 2 é um diagrama esquemático que mostra a substituição simultânea de cadeias de receptores de células Ta e células T B endógenas mediante a inserção de (a) um modelo de DNA não viral que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (1) uma sequência de peptídeos autoclivável de PÀ, (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-a de um receptor de células T específico de antígeno (NYESO-g); e (iii) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade de TCR-a endógena; e (b) um modelo de DNA que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma sequência de peptídeos autocliváveis T2A, (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B de um receptor de células T específico de antígeno; e (iii) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade de TCR-B endógena.
[0031] A Figura 3a é uma ilustração esquemática que mostra a inserção de uma cadeia de TCR-B e uma cadeia de TOR-a heterólogas em células T para formar uma biblioteca policlonal de receptores de células T. Múltiplos modelos de DNA diferentes, por exemplo, modelos de DNA não virais, contendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma cadeia de receptor de célula T (TCR)-B heteróloga (por exemplo, região variável e região constante) de comprimento total; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR alfa heteróloga, foram eletroporadas simultaneamente para produzir uma população de células T com um repertório de células T sintéticas de sequências de TCR desejadas.
[0032] A Figura 3b é um diagrama esquemático que mostra o desenho de um repertório de células T de sequências de TCR previamente conhecidas, ou de repertórios naturais em populações de células T endógenas de interesse, por exemplo, de um indivíduo. Por exemplo, os TCRs pode ser, mas sem ficar a eles limitados, TORs expressos por linfócitos infiltrados em tumor, TORs expressos por células T autoreativas em sítios de doença autoimune ou TCRs de células T responsivas a patógenos.
[0033] A Figura 4a mostra a análise FACS de células CD4* e CD8* T eletroporadas com um NYESO TCR heterólogo. As células CD4+ e CD8+ T de dois doadores de sangue humanos saudáveis foram eletroporadas com um construto não viral que compreende NYESO-a heterólogo e um NYESO-B heterólogo, tal como descrito no presente documento. Quatro dias após a eletroporação, as células foram manchadas com um MHC-dextrâmero fluorescentemente etiquetado que contém o peptídeo reconhecido pelo TCR específico de NYESO integrado.
[0034] A Figura 4b mostra a análise FACS de células de CD8+ T eletroporadas com um NYESO TCR heterólogo. As células CD8+ T dos doadores de sangue humanos saudáveis foram eletroporadas com um construto de DNA não viral que compreende e um NYESO-a heterólogo e um NYESO-f heterólogo, tal como descrito no presente documento. Quatro dias após a eletroporação, as células foram manchadas com um MHC-dextrâmero fluorescentemente etiquetado que contém o peptídeo reconhecido pelo TCR específico de NYESO integrado.
[0035] A Figura 5 é uma análise FACS de células CD8+ eletroporadas com um NYESO TCR heterólogo. As células foram tratadas tal como nas Figuras 3 e 4, com a adição de tingimento para a expressão de TCR (com um anticorpo que liga todos os TCORs humanos potenciais) versus tingimento específico do antígeno com o NYESO MHC-dextrâmero. Na maior parte das células T não havia uma substituição dirigida por homologia do TOR endógeno, o TCR endógeno foi submetido a knock out devido ao corte pelo éxon 1 gRNA de TRAC e a introdução de mutações de deleção de pequena inserção (indéis) pela união de extremidade não homóloga. Tal como esperado, quase todas as células NYESO positivas também eram positivas para a expressão de TCR.
[0036] A Figura 6a mostra que as células T humanas primárias que contêm NYESO TCR matam as células de câncer tal como em um ensaio de mortandade de células in vitro.
[0037] A Figura 6b mostra os resultados de um único ponto do tempo de um ensaio de mortandade de células in vitro ao usar células T humanas que contêm um NYESO TCR heterólogo.
[0038] As Figuras 7a-f mostram a funcionalidade in vivo de células T com substituição de TCR não viral. (a) Diagrama de um modelo de xenoenxerto de tumor específico de antígeno humano in vivo. (b) Dois dias depois da transferência de 5 x 10º células T não viralmente focalizadas em massa (-10% de TCR + NYESO-1+, -10% de TCR + NYESO-1- , e -80% de TCR - NYESO-1-), NYESO-1+ células T não viralmente editadas acumuladas de preferência no tumor versus o baço. N = 5 camundongos para cada um de quatro doadores de células T humanas. (c) Dez dias depois da transferência de 5 x 10º células T etiquetadas com CFSE não viralmente visadas em massa, células NYESO-1 TCR+ T mostraram uma maior proliferação do que as células TCR- ou TCR + NYESO-1- T, e mostraram uma maior proliferação
(baixo CFSE) no tumor do que no baço. Dez dias depois da transferência, as células TOCR- e TOR + NY-ESO- T eram difíceis de encontrar no tumor. (d) Trilhas de volume de tumor longitudinais individuais para os dados resumidos na Figura 8f. (e, f) Nestes experimentos, dezessete dias depois da transferência das células T (d), células de TCR não viralmente substituídas pareceram mostrar uma expressão maior de NIESO-1 TCR e uma menor expressão de marcadores de exaustão. A transferência de ambas as células lentiviralmente transduzidas e não viralmente substituídas por TOR mostrou reduções significativas na carga de tumor no dia 24. Neste modelo experimental, a substituição de TCR não viral mostrou mais reduções comparadas à transdução lentiviral (Figura 8f).
[0039] A Figura 8a mostra a produção de citocina específica de antígeno e a desgranulação em células CD8+ T com uma substituição de TCR.
[0040] A Figura 8b mostra a mortandade de células-alvo específicas de antígeno por células CD8+ T com uma substituição de TCR.
[0041] A Figura 8c é um diagrama esquemático de um modelo de xenoenxerto de camundongo do tumor.
[0042] A Figura 8d mostra a escalabilidade da substituição não viral de TCR endógeno para a terapia de célula adotiva.
[0043] A Figura 8e mostra a localização in vivo preferencial de células NY-ESO-1 TCR+ T em um tumor.
[0044] A Figura 8f mostra o crescimento do tumor depois da transferência adotiva de NY-ESO-1 TCR+ não viralmente ou lentiviralmente modificado ou do veículo sozinho (solução salina). N= 2 (a, b) doadores saudáveis independentes com desvio médio e padrão de triplicatas técnicas (a, b). (e, f) n= 6 (d) ou n= 2 doadores saudáveis independentes em 5 (e) ou 7 camundongos (f) com desvio médio e padrão (d-f). ** P <0,01,*** P <0,001,**** P <0,0001 (Two Way ANOVA com o teste de múltiplas comparações de Holm-Sidak).
[0045] A Figura 9a mostra a análise de desemparelhamento de TOR após a aplicação retroviral ou a substituição de TCR não viral de um TCR específico de NY-ESO-1 em células CD4+ ou CD8+ T ligadas. À substituição de TOR não viral resulta em menos desemparelhamento de TCR em comparação à aplicação retroviral de um TCR. Com a introdução viral do novo TCR, uma célula infectada irá expressar potencialmente pelo menos quatro TCRs diferentes (novo TOR-a + novo TCR-B; novo TOR-a + TOCR-B endógeno; TCR-a endógeno e novo TCR- B; TOR-a endógeno + TCR-B endógeno). O tingimento para a cadeia beta específica no novo TCR introduzido (VB13.1) junto com o multímero de MHC-peptídeo (NYESO) pode prover uma estimativa ligeira de desemparelhamento de TCR ao distinguir entre as células que expressaram predominantemente o TCR introduzido (VB13.1+ NYESO+; novo TCR-a + novo TCR-B) versus aquelas que expressaram predominantemente um dos TCRs desemparelhados potenciais (VB13.1+ NYESO-; TCR-a endógeno + novo TCR-B).
[0046] As Figuras 9b e 9c mostram a substituição de TOR mediante a focalização em um novo TCR inteiro em TRAC (Figura 9b, também possível com um knockout multiplexado de TCR-B), um novo TCR inteiro em TRBC1/2 (Figura 9c), ou a substituição multiplexada com um novo TCR-a em TRAC e um novo TCR-B em TRBC1/2.
[0047] A Figura 9d mostra que a produção de citocina funcional foi observada seletivamente depois da exposição do antígeno em células CDA4+ T ligadas, de modo similar às células CD8+ T ligadas (Figura 8a).
[0048] A Figura 9e mostra que a substituição de TCR não viral foi observada de modo consistente quatro dias depois da eletroporação em células CD8+ e CD4+ T através de uma coorte de seis doadores de sangue saudáveis.
[0049] A Figura 9f mostra que em uma segunda coorte de seis doadores de sangue saudáveis adicionais, 100 milhões de células T de cada doador foram eletroporados com o modelo HDR de substituição de NY-ESO-1 TCR e gRNA/Cas9 no alvo (Figura 8d). A porcentagem das células CD4+ e CD8+ T que eram NY-ESO-1 TCR+ era consistente por dez dias de expansão depois da eletroporação.
[0050] A Figura 9g mostra que, nos 10 dias de expansão depois da focalização no genoma não viral, as células CD8+ T mostraram uma ligeira vantagem proliferativa em relação às células CD4+ T.
[0051] A Figura 9h mostra os resultados da coincubação das linhagens de células de melanoma indicadas com as populações de células T classificadas indicadas a uma razão de 1:5 entre as células T e as células de câncer. Em 72 horas após a coincubação, a porcentagem de confluência de células de câncer foi gravada com microscopia automatizada (onde RFP nuclear marca as células de câncer). As células T que expressam TCR específico de antígeno de NY-ESO-1, tanto pela transdução retroviral quanto pela substituição de TCR endógeno de knock-in não viral mostraram uma intensa mortandade de células-alvo somente nas linhagens de células de câncer alvo que expressam NY-ESO-1 e o alelo | MHC da classe HLA- A*0201.
[0052] A Figura 9i mostra que resultados do uso de uma matriz de gRNAs no alvo e fora do alvo e de modelos de HDR no alvo/fora do alvo para a mortandade de células-alvo da linhagem de células de câncer NY-ESO-1+ HLA-A*0201+ A375 (o gRNA fora do alvo e HDRT eram específicos para o knock-in da proteína da fusão de RAB11A-GFP). Somente as células com ambos o gRNA no alvo, bem como o modelo de HDR no alvo, demonstraram uma mortandade de células-alvo.
[0053] A Figura 9j mostra que as células NY-ESO-1+ TCR+ classificadas de uma população editada de células T em massa (RNA no alvo, modelo de HDR no alvo) mostraram um forte efeito da resposta à dose para a mortandade de células de câncer alvo. Dentro de 48 horas, razões de 2:1 ou mais entre as células T e as células de câncer mostraram uma mortandade quase completa das células de câncer alvo. Por 144 horas, as razões entre as células T e as célula de câncer menores do que 1:16 mostraram uma evidência de forte mortandade das células-alvo.
[0054] A Figura 9k mostra que a mortandade de células-alvo por células T com substituição de TCR não viral era devida especificamente à população de células TCR+ que reconhecem NY-ESO-1 observada por citometria de fluxo após a substituição de TCR não viral. Começando com a população de células T editada em massa (que tinha sido eletroporada com o gRNA fora do alvo e o modelo de HDR), foram classificadas em separado três populações de células: as células NY- ESO-1 + TOCR+ (TCR não viralmente substituído), as células NY-ESO- 1- TOR- (knockout de TCR) (cinza), e as células NY-ESO-1- TOR+ (aquelas que retiveram seu TCR nativo mas não tiveram o TCR de knock-in específico de NY-ESO). Somente a população de NY-ESO-1+ TCR+ demonstrou uma mortandade de células-alvo (razão de 4:1 entre as células T e as células de câncer). Um doador representativo de n = 2 (a, d) ou n = 3 (b, c) doadores saudáveis independentes com desvio médio e padrão de triplicatas técnicas (d). Os desvios médio e padrão de n = 6 doadores saudáveis independentes (e, f) ou de quatro replicatas técnicas para n = 2 doadores saudáveis independentes (i-k) são mostrados. Valores médios e individuais para n = 2 doadores saudáveis independentes (h). Definições
[0055] Tal como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as forma no singular "um", "uma" e "o/a" incluem a referência no plural a menos que o contexto dite claramente de alguma outra maneira.
[0056] O termo "ácido nucleico" ou "nucleotídeo" refere-se aos ácidos desoxirribonucleicos (DNA) ou aos ácidos ribonucleicos (RNA) e aos polímeros dos mesmos na forma tanto de cordão simples quanto de cordão duplo. A menos que seja limitado especificamente, o termo abrange os ácidos nucleicos que contêm análogos conhecidos dos nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação similares àquelas do ácido nucleico de referência e metabolizados de uma maneira similar àquela dos nucleotídeos naturais. A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, uma sequência particular de ácidos nucleicos também engloba implicitamente variantes conservado- ramente modificadas dos mesmos (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs, e sequências complementares assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser obtidas mediante a geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por base mista e/ou resíduos de desóxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0057] O termo "gene" pode se referir ao segmento de DNA envolvido na produção ou na codificação de uma cadeia de polipeptídeo. Ele pode incluir regiões que precedem e que sucedem a região de codificação (líder e seguidor), bem como sequências intermediárias (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons). Alternativamente, o termo "gene" pode se referir ao segmento de DNA envolvido na produção ou na codificação de um RNA não traduzido, tal como um rRNA, um tRNA, um RNA guia (por exemplo, um único RNA guia), ou um micro RNA.
[0058] "Tratamento" refere-se a qualquer indício de sucesso no tratamento ou na melhora ou na prevenção da doença, da condição ou do distúrbio, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo tal como o enfraquecimento; a remissão; a diminuição dos sintomas, ou tornar a condição da doença mais tolerável ao paciente; retardamento da taxa de degeneração ou declínio; ou tornar o ponto final da degeneração menos debilitante.
[0059] Um "promotor" é definido como uma ou mais sequências de controle de ácido nucleico que dirigem a transcrição de um ácido nucleico. Tal como usado no presente documento, um promotor inclui sequências de ácidos nucleicos necessárias perto do sítio de início da transcrição, tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase Il, um elemento TATA. Um promotor também inclui opcionalmente os elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ficar localizados tanto quanto vários milhares de pares base do sítio de início da transcrição.
[0060] Um ácido nucleico é "ligado operavelmente" quando ele é colocado em uma relação funcional com uma outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, um promotor ou um intensificador são ligados operavelmente a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo é ligado operavelmente a uma sequência de codificação se for posicionado para facilitar a tradução.
[0061] "Polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína't são usados intercambiavelmente no presente documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácido. Tal como usado no presente documento, os termos englobam cadeias de aminoácido de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácido são ligados por ligações de peptídeos covalentes.
[0062] Tal como usado no presente documento, o termo "complementar" ou "complementaridade" referese a um emparelhamento base específico entre nucleotídeos ou ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, por exemplo, e sem nenhuma limitação, é descrito o emparelhamento base entre um RNA guia e uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC. Os nucleotídeos complementares são, de modo geral, A e de T(ou Ae U) e Ge C. Os RNAs guias descritos no presente documento podem compreender sequências, por exemplo, a sequência-alvo de DNA, que são perfeitamente complementares ou substancialmente complementares (por exemplo, contendo 1 a 4 descompatibilidades) a uma sequência genômica no éxon 1 do gene de TRAC em uma célula T.
[0063] Tal como usado por todo o documento, indivíduo refere-se a um indivíduo. Por exemplo, o indivíduo é um mamífero, tal como um primata, e mais especificamente um ser humano. O termo não denota uma idade particular ou sexo. Desse modo, pretende-se que indivíduos adultos e recém-nascidos, tanto do sexo masculino quanto do sexo feminino, sejam cobertos. Tal como usado no presente documento, o paciente ou o indivíduo podem ser usados intercambiavelmente e podem se referir a um indivíduo afligdido com uma doença ou um distúrbio.
[0064] O sistema "CRISPR/Cas'" refere-se a uma ampla classe de sistemas bacterianos para a defesa contra ácido nucleico estranho. Os sistemas CRISPR/Cas são encontrados em uma ampla gama de organismos eubaterianos e archeais. Os sistemas CRISPR/Cas incluem o tipo |, e os subtipos || e Ill. Os sistemas CRISPR/Cas do tipo Il do tipo selvagem utilizam um nuclease mediada por RNA, por exemplo, Cas9, no complexo com o RNA guia e ativador para reconhecer e clivar o ácido nucleico estranho. Os RNAs guias que têm a atividade de um RNA guia e de um RNA ativador também são conhecidos no estado da técnica. Em alguns casos, tais RNAs guias de dupla atividade são indicados como RNA guia simples (sagRNA).
[0065] Os homólogos de Cas9 são encontrados em uma ampla variedade de eubactérias incluindo, mas sem ficar limitados às bactérias dos grupos taxonômicos a seguir: Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes-Chlorobi, Chlamydiae-Verrucomicrobia, Chlroflexi, Cyanobacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes e Thermotogae. Uma proteína Cas9 exemplificadora é a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes. Outras proteínas Cas9 e seus homólogos são descritos, por exemplo, em Chylinksi, et al., RNA Biol. 01 de maio de 2013; 10(5): 726 —737; Nat. Rev. Microbiol. Junho de 2011; 9(6): 467- 477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 24 de setembro de 2013; 110(39): 15644-9; Sampson et al., Nature. 09 de maio de 2013; 497(7448):254-7; e Jinek, et al., Science. 17 de agosto de 2012; 337(6096):816-21. As variantes de qualquer uma das nucleases Cas9 providas no presente documento podem ser otimizadas para uma atividade eficiente ou uma estabilidade realçada na célula hospedeira. Desse modo, as nucleases Cas9 geneticamente projetadas também são contempladas.
[0066] Tal como usado no presente documento, o termo "Cas9" refere-se a uma nuclease mediada por RNA (por exemplo, de origem bacteriana ou archeal, ou derivada da mesma). As nucleases mediadas por RNA exemplificadoras incluem as proteínas Cas9 acima e os seus homólogos. Outras nucleases mediadas por RNA incluem Cpf1 (vide, por exemplo, Zetsche et al., Cell, volume 163, 3º edição, p 759—771, 22 de outubro de 2015) e os seus homólogos. Similarmente, tal como usado no presente documento, o termo "complexo de ribonucleopro- teína Cas9" e outros do gênero refere-se a um complexo entre a proteína Cas9 e um crRNA (por exemplo, o RNA guia ou o RNA guia simples), a proteína Cas9 e um crRNA trans-ativador (tracrRNA), a proteína Cas9 e um RNA guia, ou uma combinação destes (por exemplo, um complexo que contém a proteína Cas9, um tracrRNA, e um RNA guia crRNA). Deve ser compreendido que, em algumas das modalidades descritas no presente documento, uma nuclease Cas9 pode ser substituída por uma nuclease Cpf1.
[0067] Tal como usado no presente documento, o termo "edição" no contexto da edição de um genoma de uma célula refere-se à indução de uma mudança estrutural na sequência do genoma em uma região genômica alvo. Por exemplo, a edição pode assumir a forma da introdução de uma sequência de nucleotídeos no genoma da célula. À sequência de nucleotídeos pode para codificar um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo. Tal edição poder ser executada, por exemplo, mediante a indução de uma ruptura de cordão duplo dentro uma região genômica alvo, ou um par de clivagens hidrolíticas de cordão simples opostas e flanqueando a região genômica alvo. Os métodos para a indução de rupturas de cordões simples ou duplos dentro de uma região genômica alvo incluem o uso de um domínio de nuclease Cas9, ou um derivado da mesma, e um RNA guia, ou par de RNAs guias, dirigido à região genômica alvo.
[0068] Tal como usado no presente documento, o termo "introdução" no contexto de introdução de um ácido nucleico ou um complexo que compreende um ácido nucleico, por exemplo, um complexo de RNP-modelo de DNA, refere-se à translocação da sequência de ácidos nucleicos ou complexo de RNP-modelo de DNA de fora de uma célula para dentro da célula. Em alguns casos, a introdução refere-se à translocação do ácido nucleico ou do complexo de fora da célula para dentro do núcleo da célula. Vários métodos de tal translocação são contemplados, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, a eletroporação, o contato com nanofios ou nanotubos, a internalização mediada por receptor, a translocação através de peptídeos penetradores de célula, a translocação mediada por lipossoma, e outros ainda.
[0069] Tal como usado no presente documento, o termo "heterólogo" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos ou um polipeptídeo não encontrado naturalmente em uma célula T humana. À expressão "sequência heteróloga" refere-se a uma sequência não encontrada normalmente em uma determinada célula T na natureza. Dessa maneira, uma sequência de nucleotídeo ou proteína heteróloga pode ser: (a) estranha à sua célula hospedeira (isto é, é exógena à célula); (b) encontrada naturalmente na célula hospedeira (isto é, endógena), mas presente em uma quantidade não natural na célula (isto é, em uma quantidade maior ou menor do que aquela encontrada naturalmente na célula hospedeira); ou (c) encontrada naturalmente na célula hospedeira, mas posicionada fora de seu lócus natural.
[0070] Tal como usado no presente documento, o termo "primária" no contexto de uma célula primária é uma célula que não é transformada nem imortalizada. Tais célula primárias podem ser cultivadas, sub- cultivadas, ou passadas um número limitado de vezes (por exemplo, cultivadas O, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 vezes). Em alguns casos, as células primárias são adaptadas a condições de cultura in vitro. Em alguns casos, as células primárias são isoladas de um organismo, de um sistema, de um órgão ou de um tecido, opcionalmente classificadas, e utilizadas diretamente sem cultivo ou sub-cultivo. Em alguns casos, as células primárias são estimuladas, ativadas ou diferenciadas. Por exemplo, as células T primárias podem ser ativadas por meio de contato com (por exemplo, cultivo na presença de) agonistas de CD3, CD28, IL-2, IFN-y, ou uma combinação destes.
[0071] Tal como usado no presente documento, a expressão "célula T" refere-se a uma célula linfoide que expressa uma molécula de receptor de célula T. As células T incluem células T alfa beta (ab) humanas e células T gama delta (y5) humanas. As células T incluem, mas sem ficar a elas limitadas, células T virgens, células T estimuladas,
células T primárias (por exemplo, não cultivadas), células T cultivadas, células T imortalizadas, células T adjuvantes, células T citotóxicas, células T de memória, células T reguladoras, células T assassinas naturais, combinações destas, ou subpopulações das mesmas. As células T podem ser CD4+, CD8+, ou CD4+ e CD8+. As células T podem ser células adjuvantes, por exemplo, células adjuvantes do tipo Tn1, TH2, TH3, TH9, TH17 ou TFH. As células T podem ser células T citotóxicas. As células T reguladoras podem ser FOXP3* ou FOXP3:. As células T podem ser células T alfa/beta ou células T gama/delta. Em alguns casos, a célula T é uma célula CD4*CD25"'CD127" T reguladora. Em alguns casos, a célula T é uma célula T reguladora selecionada do grupo que consiste em células T do tipo 1 reguladoras (Tr1), TH3, CD8+CD28-, Treg17 e Qa-1 restringidas, ou uma combinação ou uma subpopulação das mesmas. Em alguns casos, a célula T é uma célula FOXP3+ T. Em alguns casos, a célula T é uma célula CD4*CD25ºCD127"'T efetora. Em alguns casos, a célula T é uma célula CD4*CD25ºCD127"'CD45RA"'CD45RO:" T virgem. Uma célula T pode ser uma célula T recombinante que é manipulada geneticamente. Em alguns casos, a célula T recombinante tem um receptor de célula T recombinantes (por exemplo, heterólogo).
[0072] Tal como usado no presente documento, a expressão "receptor TOR" é um heterodímero que consiste em duas cadeias de subunidades de TCR, (por exemplo, TCR-a e TCR-B, TOR-5, TOR-y) que atua na ativação de células T em resposta a um antígeno. Quando expresso em uma célula T, cada cadeia de subunidade de TCR do receptor de TCR contém uma região constante que ancora a cadeia de subunidade de TOR na membrana da célula e uma região variável que atua no reconhecimento e ligação do antígeno, por exemplo, quando uma primeira cadeia de subunidade de TCR (por exemplo, TCR-a) e uma segunda forma de cadeia de subunidade de TCR (por exemplo,
TCR-B) formam um receptor de TOR heterodimérico.
[0073] Tal como usado no presente documento, a expressão "união de extremidade não homóloga", ou NHEJ, refere-se a um processo celular em que as extremidades cortadas ou entalhadas de um cordão de DNA são ligadas diretamente sem a necessidade de um ácido nucleico de modelo homólogo. NHEJ pode conduzir à adição, à deleção, à substituição, ou a uma combinação destas, de um ou mais nucleotídeos no sítio de reparo.
[0074] Tal como usado no presente documento, a expressão "reparo dirigido por homologia", ou HDR, refere-se a um processo celular em que as extremidades cortadas ou entalhadas de um cordão de DNA são reparadas pela polimerização de um ácido nucleico de modelo homólogo. Desse modo, a sequência original é substituída pela sequência de modelo. O ácido nucleico de modelo homólogo pode ser provido por sequências homólogas em outra parte no genoma (cromatídeos irmãos, cromossomas homólogos, ou regiões repetidas no mesmo cromossoma ou em cromossomas diferentes). Alternativa- mente, um ácido nucleico de modelo exógeno pode ser introduzido para obter uma mudança induzida por HDR específica da sequência no sítio alvo. Desta maneira, mutações específicas podem ser introduzidas no sítio cortado.
[0075] Tal como usado no presente documento, um modelo de DNA de cordão simples ou um modelo de DNA de cordão duplo referem-se a um oligonucleotídeo de DNA que pode ser usado por uma célula como um modelo para editar o genoma da célula T, por exemplo, por HDR. De modo geral, o modelo de DNA de cordão simples ou um modelo de DNA de cordão duplo têm pelo menos uma região de homologia a um sítio alvo. Em alguns casos, o modelo de DNA de cordão simples ou o modelo de DNA de cordão duplo têm duas regiões homólogas, por exemplo, uma extremidade 5' e uma extremidade 3', flanqueando uma região que contém uma sequência heteróloga a ser inserida em um sítio cortado ou de inserção-alvo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0076] A descrição a seguir recita vários aspectos e modalidades das presentes composições e métodos. Nenhuma modalidade particular se presta a definir o âmbito das composições e métodos. Ao invés disto, as modalidades fornecem meramente exemplos não limitadores de várias composições e métodos que são pelo menos incluídos dentro do âmbito das composições e métodos divulgados. A descrição deve ser lida na perspectiva de um elemento normalmente versado no estado da técnica; portanto, a informação bem conhecida do elemento versado na técnica não é necessariamente incluída.
[0077] No presente documento são providos as composições e os métodos para a edição do genoma de uma célula T humana. Os autores da presente invenção descobriram que um TCR heterólogo pode ser inserido em uma região-alvo no genoma de uma célula T, de maneira tal que o TCR heterólogo fica sob o controle de um promotor de TOR endógeno. Os métodos e as composições providos no presente documento podem ser usados na produção de células T modificadas que têm uma especificidade de antígeno desejada. Essas células T modificadas podem ser usadas, por exemplo, no tratamento do câncer, de doença autoimune ou infecção em um indivíduo.
[0078] Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de uma cadeia de TOR-B heteróloga e uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga é inserida no éxon 1 do gene de TRAC no genoma da célula T. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de uma cadeia de TOCR-a heteróloga e uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga é inserida no éxon 1 do gene de TRBC, por exemplo, no éxon 1 de TRBC1 ou TRBC2, no genoma da célula T. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é inserida através do reparo dirigido por homologia ou tal como descrito de alguma outra maneira no presente documento.
[0079] Em algumas modalidades, (a) uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga de um receptor da célula T; e (b) uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de uma cadeia de TCR- B heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno são inseridas do éxon 1 do gene de TRAC e no éxon 1 do gene de TRBC, respectivamente. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é inserida através do reparo dirigido por homologia ou tal como descrito de alguma outra maneira no presente documento. Métodos de Produção de Células T Humanas Modificadas
[0080] Os métodos para a edição do genoma de uma célula T incluem um método de edição do genoma de uma célula T humana que compreende a inserção de uma sequência ou um construto de ácidos nucleicos em uma região-alvo no éxon | de um gene constante de subunidade de receptor de célula T (TCR) na célula T humana. O construto de ácido nucleico codifica sequencialmente, do terminal N ao terminal C uma primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga, em que a cadeia de subunidade de TCR compreende a região variável e a região constante da cadeia de subunidade de TCR, e uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga. O construto também codifica um primeiro peptídeo autoclivável que precede a região variável da primeira cadeia de subunidade de TOR heteróloga, e um segundo peptídeo autoclivável entre a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga. Em alguns métodos, se a subunidade de TOR endógena for uma subunidade de TCR-alfa (TCR-a), a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TOR heteróloga-beta (TCR-B) e a segunda cadeia de subunidade de TOR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga. Em alguns métodos, se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-B, a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga.
[0081] Em algumas modalidades, o construto ou a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR é um construto ou uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia de subunidade de TCR, isto é, um ácido nucleico que codifica a região variável e a região constante da cadeia de subunidade de TCR, por exemplo, uma cadeia de subunidade de TCR de comprimento total. Em alguns exemplos, o ácido nucleico codifica uma cadeia de subunidade de TCR-a, TOR-B, TORy ou TOR-5 de comprimento total. Em alguns exemplos, o construto ou a sequência de ácidos nucleicos codifica uma primeira cadeia de subunidade de TOR heteróloga (por exemplo, uma cadeia de subunidade de TCR de comprimento total) e uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga. Em alguns exemplos, a primeira e a segunda cadeias de subunidade de TCR heterólogas são diferentes. Em alguns exemplos, o construto de ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga de comprimento total e uma região variável de uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga. Em outros exemplos, o construto de ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga de comprimento total e uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga.
[0082] Os métodos para a edição do genoma de uma célula T incluem um método de edição do genoma de uma célula T humana que compreende a inserção de uma sequência ou um construto de ácido nucleico em uma região-alvo no éxon 1 do gene da subunidade de TCR- a (TRAC) na célula T humana.
Em algumas modalidades, a região-alvo fica no éxon 1 do domínio constante do gene de TRAC.
Em outras modalidades, a região-alvo fica no éxon 1, no éxon 2 ou no éxon 3, antes do início da sequência que codifica o domínio de transmembrana de TCR-a.
O construto de ácido nucleico codifica sequencialmente, do terminal N ao terminal C, uma região variável de uma cadeia de receptor de célula T (TCR-B) heteróloga, seguida por uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga.
O construto também codifica um primeiro peptídeo autoclivável que precede a região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga, e um segundo peptídeo autoclivável entre a região variável da cadeia de TCR-B heteróloga e a região variável da cadeia de TCR-a heteróloga.
O construto também codifica uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena depois da região variável da cadeia de TCR-a heteróloga.
Dependendo do sítio de inserção no gene de TRAC, o tamanho do ácido nucleico que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena pode variar.
O tamanho do ácido nucleico que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena irá depender do número de nucleotídeos na sequência de ácido nucleico de TRAC endógena entre o começo do éxon 1 de TRAC e o sítio de inserção alvo.
Vide, por exemplo, a Figura 1a, onde nucleotídeos que codificam o terminal N da subunidade de TCR-a endógena foram incluídos no construto porque o número de nucleotídeos entre o começo do éxon 1 de TRAC e o sítio de inserção era igual a 25 nucleotídeos.
Similarmente, se o número de nucleotídeos entre o começo do éxon 1 de TRAC e o sítio de inserção ficar entre menos de ou mais de 25 nucleotídeos, um ácido nucleico de menos de ou mais de 25 nucleotídeos que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena pode estar no construto.
Em alguns exemplos, o construto de ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, uma primeira sequência de peptídeos autoclivável, (isto é, região variável e região constante) uma cadeia de subunidade de TCR- B heteróloga (por exemplo, uma cadeia de subunidade de TCR-B de comprimento total), uma segunda sequência de peptídeos autoclivável, uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga e uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena. Os construtos exemplificadores incluem aqueles indicados na Figura 1a.
[0083] Os métodos para a edição do genoma de uma célula T também incluem um método de edição do genoma de uma célula T humana que compreende a inserção de uma sequência ou construto de alvo em uma região da sequência de ácidos nucleicos no éxon 1 de um gene da subunidade de TCR-B (TRBC) na célula T humana. Em algumas modalidades, a região-alvo fica no éxon 1 de TRBC1 ou no gene de TRBC2. O construto de ácido nucleico codifica sequen- cialmente, do terminal N ao terminal C, uma região variável de um cadeia de receptor de célula T (TCR)-a heteróloga, seguida por uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga. O construto também codifica um primeiro peptídeo autoclivável que precede a região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga, e um segundo peptídeo autoclivável entre a região variável da cadeia de TCR-a heteróloga e a região variável da cadeia de TCR-B heteróloga. O construto também codifica uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena depois da região variável da cadeia de TCR-B heteróloga. Dependendo do sítio de inserção de TRBC1 ou TRBC2, o tamanho do ácido nucleico que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena pode variar. O tamanho do ácido nucleico que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena irá depender do número de nucleotídeos na sequência de ácido nucleico de TRBC endógena entre o começo do éxon 1 de TRBC1 ou de TRBC2 TRBC e do sítio de inserção alvo. Vide, por exemplo, a Figura 1b, onde 25 nucleotídeos que codificam o terminal N da subunidade de TCR-B endógena foram incluídos no construto porque o número de nucleotídeos entre o começo do éxon 1 de TRBC e o sítio de inserção era igual a 25 nucleotídeos. Similarmente, se o número de nucleotídeos entre o começo do éxon 1 de TRBC1 ou de TRBC? e o sítio de inserção ficar entre menos de ou mais de 25 nucleotídeos, um ácido nucleico de menos de ou mais de 25 nucleotídeos que codifica a porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena pode estar no construto. Em alguns exemplos, o construto de ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, um primeiro peptídeo autoclivável (isto é, região variável e região constante) uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga (por exemplo, uma cadeia de subunidade de TCR-a de comprimento total), um segundo peptídeo autoclivável, uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga e uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena. Os construtos exemplificadores incluem aqueles indicados na Figura 1b.
[0084] Os exemplos de peptídeos autocliváveis incluem, mas sem ficar a eles limitados, peptídeos 2A virais autocliváveis, por exemplo, um peptídeo de teschovirus-1 de suíno (P2A), um peptídeo de vírus de Thosea assigna (T2A), um peptídeo de vírus de rinite A equina (E2A), ou um peptídeo de vírus da doença do pé e boca (F2A). Os peptídeos 2A autocliváveis permitem a expressão de múltiplos produtos de genes de um único construto. (Vide, por exemplo, Chng et al. "Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells", MAbs 7(2): 403-412 (2015)). Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos autocliváveis são os mesmos. Em outras modalidades, o primeiro e o segundo peptídeos autocliváveis são diferentes.
[0085] Com a inserção, o construto que codificam o primeiro peptídeo autoclivável, a cadeia de TOCR-B heteróloga de comprimento total, o segundo peptídeo autoclivável, a região variável da cadeia de TCR-a e a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena, nessa ordem, ficam sob o controle do promotor de TCR-a endógeno e dos elementos reguladores de TCR-a. Uma vez que o construto é incorporado no genoma da célula T e sob o controle do promotor de TCR-a endógeno, as células T podem ser cultivadas sob condições que permitem a transcrição do construto inserido em uma única sequência de mRNA que codifica um polipeptídeo de fusão. O polipeptídeo da fusão compreende o primeiro peptídeo autoclivável, a cadeia de TOR-B heteróloga de comprimento total, o segundo peptídeo autoclivável, a cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total, e a porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena, nessa ordem.
[0086] Similarmente, com a inserção em TRBC1 ou TRBC2, o construto que codifica o primeiro peptídeo autoclivável, a cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total, o segundo peptídeo autoclivável, a região variável da cadeia de TCR-B e a porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena, nessa ordem, fica sob o controle do promotor de TCR-B endógeno e dos elementos reguladores de TCR-B. Uma vez que o construto é incorporado no genoma da célula T e sob o controle do promotor de TCR-B endógeno, as células T podem ser cultivadas sob condições que permitem a transcrição do construto inserido em uma única sequência de MRNA que codifica um polipeptídeo de fusão. O polipeptídeo de fusão compreende o primeiro peptídeo autoclivável, a cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total, o segundo peptídeo autoclivável, a cadeia de TCR-B heteróloga de comprimento total e a porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena, nessa ordem.
[0087] Com a inserção do construto no éxon 1 do gene de TRAC, os éxons restantes do gene de TRAC (éxons 2 e 3) são emendados junto com o éxon 1 na sequência final do MRNA. A tradução dessa sequência de mMRNA resulta em uma expressão de uma proteína que autocliva em três sequências de polipeptídeos separadas, ou seja, um peptídeo de região variável endógena inativo que não possui um domínio de transmembrana, (que pode ser, por exemplo, degradado no reticulum endoplásmico ou secretado depois da tradução), uma cadeia de TCR-B específica de antígeno heteróloga de comprimento total e uma cadeia de TCR- a específica de antígeno heteróloga de comprimento cheio (vide a Figura 1a). A cadeia de TOR-B específica de antígeno de comprimento total e a cadeia de TCR-a específica de antígeno de comprimento total formam um TCR com uma especificidade de antígeno desejada.
[0088] Similarmente, com a inserção do construto no éxon 1 do gene TRBC1/2, os éxons restantes do gene TRBC1/2 (éxons 2 a 4) são emendados junto com o éxon 1 na sequência de mMRNA final. A tradução desta sequência de mMRNA resulta em uma expressão de uma proteína que autocliva em três sequências de polipeptídeos separadas, ou seja, um peptídeo da região variável endógena inativo que não possui um domínio de transmembrana (que pode ser, por exemplo, degradado no reticulum endoplásmico ou secretado depois da tradução), uma cadeia de TCR-B específica de antígeno heteróloga de comprimento total, e uma cadeia de TCR-a específica de antígeno heteróloga de comprimento total. A cadeia de TCR-B específica de antígeno heteróloga de comprimento total e a cadeia de TCR-a específica de antígeno heteróloga de comprimento total formam um TCR com especificidade de antígeno desejada.
[0089] Alternativamente, uma sequência de codificação de cadeia de TCR-a heteróloga, por exemplo, uma sequência que codificam a região variável de uma cadeia de TCR-a e uma sequência de codificação de cadeia de TCR-B heteróloga, por exemplo, uma sequência que codifica a região variável de uma cadeia de TOR-B, são inseridas no genoma de uma célula T, em que a cadeia de TCR-a heteróloga é inserida no éxon 1 do gene de TRAC e a cadeia de TCR- B heteróloga é inserida no éxon 1 do gene de TRBC. Em algumas modalidades, uma primeira sequência ou construto de ácido nucleico que codifica uma cadeia TCR-a heteróloga e uma segunda sequência ou construto de ácido nucleico que codifica uma cadeia de TCR-B heteróloga são usadas para inserir a cadeia de TCR-a heteróloga no éxon 1 do gene de TRAC e a cadeia de TCR-B heteróloga no éxon 1 do gene de TRBC, respectivamente.
[0090] Nos métodos que usam um primeiro e um segundo construtos de ácido nucleico, a região-alvo para a inserção do ácido nucleico que codifica uma cadeia de TCR-a heteróloga fica no éxon 1 do gene de TRAC. Em algumas modalidades, a região-alvo para a inserção do ácido nucleico que codifica uma cadeia de TCR-B heteróloga fica a jusante do promotor de TRBC1 ou de TRBC2 endógeno e localizada no éxon 1 do gene de TRBC1 ou de TRBC 2. O primeiro ácido nucleico codifica sequencialmente, do terminal N ao terminal C, um primeiro peptídeo autoclivável, seguido pela cadeia de TCR-a heteróloga, seguida por uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena. O segundo construto de ácido nucleico codifica sequencialmente, do terminal N ao terminal C, um segundo peptídeo autoclivável, seguido por um ácido nucleico que codifica uma cadeia de TOR-B heteróloga, seguida por uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena. Os construtos exemplificadores incluem aqueles indicados na Figura 2.
[0091] Com a inserção, o primeiro construto que codifica o primeiro peptídeo autoclivável e a cadeia de TOCR-a heteróloga, nessa ordem, fica sob o controle do promotor de TCR-a endógeno e dos elementos reguladores de TCR-a. O segundo construto que codifica o segundo peptídeo autoclivável e a cadeia de TCR-B heteróloga, nessa ordem, fica sob o controle do promotor de TCR-B endógeno e dos elementos reguladores de TCR-B. Uma vez que os construtos são incorporados no genoma da célula T e sob o controle dos promotores de TCR-a e TOR- B endógenos, as células T são cultivadas sob condições que permitem a transcrição do primeiro construto e do segundo construto em sequências de mMRNA separadas. Com a inserção do primeiro construto no éxon 1 do gene de TRAC, os outros éxons do gene de TRAC (éxons 2 e 3) são emendados junto com o éxon 1 em uma sequência de MRNA final que codifica a cadeia de TCR-a heteróloga de comprimento total. Similarmente, com a inserção do segundo construto no éxon 1 do gene de TRBC, os outros éxons do gene de TRBC (éxons 2 e 3) são emendados junto com o éxon | em uma sequência de mMRNA que codifica a cadeia de TCR-B heteróloga de comprimento total.
[0092] A tradução da sequência de mMRNA que codifica o primeiro peptídeo autoclivável e a cadeia de TOR-a heteróloga de comprimento total resulta na expressão de um peptídeo de região variável endógena inativo que não possui um domínio de transmembrana (que pode ser, por exemplo, degradado no reticulum endoplásmico ou secretado depois da tradução), e uma cadeia TOCR-a específica de antígeno heteróloga de comprimento total. A tradução da sequência de MRNA que codifica o segundo peptídeo autoclivável e a cadeia de TOCR-B heteróloga de comprimento total resulta na expressão de um peptídeo de região variável endógena inativo que não possui um domínio de transmembrana (que pode ser, por exemplo, degradado no reticulum endoplásmico ou secretado depois da tradução), e uma cadeia de TOCR- B específica de antígeno heteróloga de comprimento total. A cadeia de TCR-B específica de antígeno heteróloga de comprimento total e a cadeia de TCR-a específica de antígeno heteróloga de comprimento total formam um TCR com a especificidade de antígeno desejada.
[0093] Nos métodos providos no presente documento, a região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga compreende os alelos variável (V), de diversidade (D) e de união (J). Nos métodos providos no presente documento, a região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga compreende os alelos V e J. Vide, por exemplo, Kuby, J., Immunology, 7º Ed., W.H. Freeman & Co., New York (2013).
[0094] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é inserida no genoma da célula T mediante a introdução de um vetor, por exemplo, um vetor viral, que compreende o ácido nucleico. Os exemplos de vetores virais incluem, mas sem ficar a eles limitados, vetores virais adenoassociados (AAV), vetores retrovirais ou vetores lentivirais. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral é um vetor lentiviral com déficit de integrase.
[0095] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos é inserida no genoma da célula T através da aplicação não viral. Nos métodos de aplicação não viral, o ácido nucleico pode ser DNA nu, ou em um plasmídeo ou vetor não viral.
[0096] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma nuclease alvo que cliva uma região-alvo no éxon 1 de um gene de TRAC para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é incorporada no sítio de inserção por HDR. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma nuclease alvo que cliva uma região-alvo no éxon 1 de um gene de TRBC para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é incorporada no sítio de inserção por HDR.
[0097] Em algumas modalidades, o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo do éxon 1 do gene de TRAC. Em algumas modalidades, o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo do éxon 1 do gene de TRBC.
[0098] Nas modalidades que usam a primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos para inserir a cadeia de TCR-a heteróloga e a cadeia de TCR-B heteróloga no éxon 1 do gene de TRAC e no éxon 1 do gene de TRBC, respectivamente, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são introduzidos na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma ou mais nucleases alvo que criam um primeiro sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRAC e um segundo sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRBC; (b) a primeira sequência de ácidos nucleicos; e (c) a segunda sequência de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo do éxon 1 o gene de TRAC e um RNA guia que hibridiza especificamente à região- alvo do éxon 1 do gene de TRBC.
[0099] Em algumas modalidades, cada uma dentre as extremidades 5' e 3' da sequência de ácidos nucleicos compreende sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam uma região-alvo no genoma de uma célula T, por exemplo, uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC ou uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRBC. Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que é homóloga a uma sequência genômica tem cerca de 50 a 300 nucleotídeos de comprimento. Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que é homóloga a uma sequência genômica, ou uma porção da mesma, é pelo menos 80%, 90%, 95% complementar à sequência genômica. Em algumas modalidades, as extremidades 5' e 3' fins sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas em um sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRAC. Em algumas modalidades, as extremidades 5' e 3' da sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam um sítio de inserção no éxon 1 de um gene de TRBC.
[00100] Em alguns casos, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um modelo de DNA linear. Em alguns casos, a sequência de ácidos nucleicos é introduzida na célula como um modelo de DNA de cordão duplo. Em alguns casos, o modelo de DNA é um modelo de DNA de cordão simples. Em alguns casos, o modelo de DNA de cordão simples é um modelo de cordão simples de DNA puro. Tal como usado no presente documento, "cordão de DNA de cordão simples puro" refere-se ao DNA de cordão simples que não possui substancialmente o outro cordão ou cordão oposto do DNA. Por "não possui substancialmente" entenda-se que o DNA de cordão simples puro não possui pelo menos 100 vezes mais de um cordão do que um outro cordão do DNA. Em alguns casos, o modelo de DNA é um plasmídeo ou um mini círculo de cordão duplo ou de cordão simples.
[00101] Em algumas modalidades, a nuclease alvo é selecionada do grupo que consiste em um domínio de nuclease guiado pelo RNA, uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) e uma megaTAL (vide, por exemplo, Merkert and Martin de "Site-Specific Genome Engineering in Human Pluripotent Stem Cells", Int. J. Mol. Sci. 18(7): 1000 (2016)) Em algumas modalidades, a nuclease guiada pelo RNA é uma nuclease Cas9 e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no genoma da célula T, por exemplo, uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC. Em outras modalidades, a nuclease guiada pelo RNA é uma nuclease Cas9 e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRBC.
[00102] Tal como usado em todo o documento, uma sequência de RNA guia (gRNA) é uma sequência que interage com uma nuclease específica de sítio ou alvo e se liga especificamente a ou hibridiza um ácido nucleico alvo dentro do genoma de uma célula, de maneira tal que o gRNA e a nuclease alvo ficam colocalizados no ácido nucleico alvo no genoma da célula. Cada gRNA inclui uma sequência focada no DNA ou uma sequência de protoespaçador de cerca de 10 a 50 nucleotídeos de comprimento que se liga especificamente a ou hibridiza uma sequência de DNA alvo no genoma. Por exemplo, a sequência focalizada no DNA tem cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45,46, 47, 48, 49, ou 50 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o gRNA compreende uma sequência de crRNA e uma sequência de crRNA de transativação (tracrRNA). Em algumas modalidades, o gRNA não compreende uma sequência de tracrRNA.
[00103] De modo geral, a sequência focada no DNA é projetada para complementar (por exemplo, complementar perfeitamente) ou complementar substancialmente a sequência de DNA alvo. Em alguns casos, a sequência focada no DNA pode incorporar bases incertas ou degeneradas para ligar múltiplos elementos genéticos. Em alguns casos, os 19 nucleotídeos na extremidade 3' ou 5' da região de ligação são perfeitamente complementares ao elemento ou elementos genéticos alvo. Em alguns casos, a região de ligação pode ser alterada de modo a aumentar a estabilidade. Por exemplo, nucleotídeos não naturais podem ser incorporados para aumentar a resistência do RNA à degradação. Em alguns casos, a região de ligação pode ser alterada ou projetada de modo a evitar ou reduzir a formação de estrutura secundária na região de ligação. Em alguns casos, a região de ligação pode ser projetada para otimizar o teor de G-C. Em alguns casos, o teor de G-C fica de preferência entre cerca de 40% e cerca de 60% (por exemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%). Em algumas modalidades, a proteína Cas9 pode estar em uma forma de endonuclease ativa, de maneira tal que, quando ligada ao ácido nucleico alvo como parte de um complexo com um RNA guia ou parte de um complexo com um modelo de DNA, uma ruptura de cordão duplo é introduzida no ácido nucleico alvo. Nos métodos providos no presente documento, um polipeptídeo Cas9 ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo Cas9 podem ser introduzidos na célula T. A ruptura de cordão duplo pode ser reparada por HDR para inserir o modelo de DNA no genoma da célula T. Várias nucleases Cas9 podem ser utilizadas nos métodos descritos no presente documento. Por exemplo, pode ser utilizada uma nuclease Cas9 que requer um motif adjacente a protoespaçador de NGG (PAM) imediatamente em 3' da região-alvo pelo RNA guia. Tais nucleases Cas9 podem ser focadas em uma região do éxon 1 de TRAC ou do éxon 1 de TRBC que contém uma sequência de NGG. Como um outro exemplo, as proteínas Cas9 com requisito de motif de PAM ortogonal podem ser usadas para focar as sequências que não têm uma sequência de PAM NGG adjacente. As proteínas Cas9 exemplificadoras com especificidades de sequência de PAM ortogonais incluem, mas sem fica a elas limitadas, aquelas descritas em Esvelt et al., Nature Methods 10: 1116-1121 (2013).
[00104] Em alguns casos, a proteína Cas9 é uma nickase, de maneira tal que, quando ligada ao ácido nucleico alvo como parte de um complexo com um RNA da guia, uma ruptura de cordão simples ou entalhe é introduzida no ácido nucleico alvo. Um par de nickases Cas9, cada uma delas ligada a um RNA guia estruturalmente diferente, pode ser focada em dois sítios proximais de uma região genômica alvo e desse modo introduzir um par de rupturas de cordão simples proximal na região genômica alvo, por exemplo, o éxon 1 de um gene de TRAC ou o éxon 1 de um gene de TRBC. Os pares de nickase podem conferir uma especificidade realçada porque os efeitos fora do alvo irão provavelmente resultar em cordões simples, que são geralmente fixados sem lesão por mecanismos de reparo de excisão base. As nickases Cas9 exemplificadoras incluem as nucleases Cas9 que têm uma mutação de D10A ou H840A (vide, por exemplo, Ran et al. "Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity", Cell 154(6): 1380-1389 (2013)).
[00105] Em algumas modalidades, a nuclease Cas9, o RNA guia e a sequência de ácidos nucleicos são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)-complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cas9 e o RNA guia; e (ii) o modelo de DNA que codifica uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma cadeia de TOCR-a heteróloga, em que o modelo de DNA é inserido no éxon 1 do gene de TRAC através de HDR. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9, o RNA guia e a sequência de ácidos nucleicos são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)- complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cas9 e o RNA guia; e (ii) o modelo de DNA que codifica uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma cadeia de TOCR-a heteróloga, em que o modelo do DNA é inserido no éxon 1 do gene de TRBC através de HDR.
[00106] Em algumas modalidades, onde construtos separados são usados para inserir uma cadeia de TCR-a heteróloga no éxon 1 do gene de TRAC em uma célula T, e uma cadeia de TCR-B heteróloga no éxon 1 do gene de TRBC em uma célula T, (a) um primeiro complexo de (RNP)-modelo de DNA, em que o primeiro complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) uma primeira RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cas9 e um primeiro RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC; e (ii) um modelo de DNA que codifica uma subunidade de TCR-a heteróloga; e (b) um segundo complexo de (RNP)-complexo de DNA, em que o segundo complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) uma segunda RNP, em que a segunda RNP compreende o nuclease Cas9 e o segundo RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 do gene de TRBC; e (ii) um modelo de DNA que codifica uma subunidade de TCR-B heteróloga são inseridos na célula. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 no primeiro complexo de RNP-modelo de DNA e a nuclease Cas9 no segundo complexo de RNP-modelo de DNA são a mesma. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 no primeiro complexo de RNP-modelo de DNA e a nuclease Cas9 no segundo complexo de RNP-modelo de DNA são diferentes.
[00107] Em algumas modalidades, a razão molar entre a RNP e o modelo de DNA pode ser de cerca de 3:1 a cerca de 100:1. Por exemplo, a razão molar pode ser de cerca de 5:1 a 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 15:1, de 5:1 a cerca de 20:1; de 5:1 a cerca de 25:1; de cerca de 8:1 a cerca de 12:1; de cerca de 8:1 a cerca de 15:1, de cerca de 8:1 a cerca de 20:1, ou de cerca de 8:1 a cerca de 25:1.
[00108] Em algumas modalidades, o modelo do DNA no complexo de RNP-modelo de DNA fica a uma concentração de cerca de 2,5 pM a cerca de 25 pM. Em algumas modalidades, a quantidade de modelo de DNA é de cerca de 1 ug a cerca de 10 ug.
[00109] Em alguns casos, o complexo de RNP-modelo de DNA é formado mediante a incubação da RNP com o modelo de DNA por menos de cerca de um minuto a cerca de trinta minutos, a uma temperatura de cerca de 20ºC a cerca de 25ºC. Em algumas modalidades, o complexo de RNP-modelo de DNA e a célula são misturados antes de introduzir o complexo de RNP-modelo de DNA na célula.
[00110] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos ou o complexo de RNP-modelo de DNA são introduzidos nas células T por meio de eletroporação. Os métodos, as composições e os dispositivos para a eletroporação de células para introduzir um complexo de RNP-modelo de DNA podem incluir aqueles descritos nos exemplos no presente documento. Os métodos, as composições e os dispositivos adicionais ou alternativos para a eletroporação de células para introduzir um complexo de RNP-modelo de DNA podem incluir aqueles descritos no documento de patente WO/2006/001614 ou em Kim, J.A. et al. Biosens. Bioelectron. 23. 1353-1360 (2008). Os métodos, as composições e os dispositivos adicionais ou alternativos para a eletroporação de células para introduzir um complexo de RNP- modelo de DNA podem incluir aqueles descritos nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. nº. 2006/0094095; 2005/0064596; ou 2006/0087522. Os métodos, as composições e os dispositivos adicionais ou alternativos para a eletroporação de células para introduzir um complexo de RNP-modelo de DNA podem incluir aqueles descritos em Li, L.H. et al. Cancer Res. Treat. 1, 341—350 (2002); nas Patentes U.S. nº: 6.773.669; 7.186.559; 7.771.984; 7.991.559; 6485961; 7029916; e nas Publicações de Pedidos de Patente U.S. nº: 2014/0017213; e 2012/0088842. Os métodos, as composições, e os dispositivos adicionais ou alternativos para a eletroporação de células para introduzir um complexo de RNP-modelo de DNA podem incluir aqueles descritos em Geng, T. et al. J. Control Release 144, 91-100 (2010); e Wang, J., et al. Lab Chip 10, 2057-2061 (2010).
[00111] Em algumas modalidades, uma pluralidade de complexos de RNP-modelo de DNA que compreendem pelo menos dois complexos de RNP-modelo de DNA estruturalmente diferentes é introduzida em uma célula. Tal como usado em todo o texto, o termo "pluralidade"
refere-se a dois ou mais. Em algumas modalidades, pelo menos dois complexos de RNP-modelo de DNA estruturalmente diferentes contêm RNAs guias estruturalmente diferentes. Em algumas modalidades em que pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes contêm RNAs guias estruturalmente diferentes, cada um dos complexos de RNP estruturalmente diferentes compreende uma nickase Cas9, e os RNAs guias estruturalmente diferentes hibridiza aos cordões opostos da região-alvo.
[00112] Em algumas modalidades, pelo menos dois ácidos nucleicos estruturalmente diferentes que codificam uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga são introduzidos no éxon 1 do gene de TRAC em uma população de células T. Desta maneira, uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos, em que cada sequência de ácidos nucleicos codifica uma combinação singular de uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma cadeia de TCR-a heteróloga, pode ser introduzida em uma população de células T. Cada uma das sequências de ácidos nucleicos pode ser introduzida na célula como parte de um complexo de RNP- modelo de DNA.
[00113] Por exemplo, uma nuclease alvo pode ser complexada com uma pluralidade (por exemplo, 2, 3, 4, 5, ou mais, por exemplo, 2 a 10, a 100, 20 a 100) de modelos de DNA singulares que codificam uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga. A pluralidade de complexos pode ser simultaneamente introduzida em uma população de células T para inserir um único modelo de DNA que codifica uma combinação singular de uma variável região de uma cadeia de TCR-B heteróloga e uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga no éxon 1 do gene de TRAC em células T individuais. Embora cada célula T adquira somente um único modelo de DNA, através da população de células, muitos dos modelos de DNA estruturalmente diferentes singulares serão integrados nas células T para criar uma biblioteca de sequências de TCR heterólogas.
[00114] Em algumas modalidades onde construtos separados são usados para inserir uma cadeia de TOR-a heteróloga no éxon 1 do gene de TRAC e uma cadeia de TCR-B heteróloga no éxon 1 do gene de TRBC, uma primeira nuclease alvo pode ser complexada com uma pluralidade de modelos de DNA singulares que codificam uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga para formar uma pluralidade de primeiros complexos de RNP-modelo de DNA, e uma segunda nuclease alvo pode ser complexada com uma pluralidade de modelos de DNA singulares que codificam uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga para formar uma pluralidade de segundos complexos de RNP-modelo de DNA. A primeira e a segunda pluralidade de complexos podem ser simultaneamente introduzidas em uma população de células T para criar uma biblioteca de sequências de TOR heterólogas.
[00115] O repertório de células T heterólogas pode ser projetado e gerado a partir de sequências de TOR previamente conhecidas, assim como de repertórios naturais encontrados em populações de células T endógenas de interesse. Por exemplo, as sequências de TOR podem ser sequências de TCR obtidas de linfócitos de infiltração de tumor, células T autoreativas em sítios de doença autoimune ou células T responsivas a patógenos.
[00116] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos ou o complexo de RNP-modelo de DNA são introduzidos em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 106 células T. Por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos ou o complexo do RNP-modelo de DNA podem ser introduzidos em cerca de 1 x 10º a cerca de 5 x 10º células T, em cerca de 1 x 10º a cerca de 1 x 108º células T, em cerca de 1 x 105 a cerca de
1,5 x 10º células T, em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T, em cerca de 1 x 10º a cerca de 1,5 x 106 células T, ou em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T.
[00117] Nos métodos e nas composições providos no presente documento, as células T humanas podem ser células T primárias. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula T reguladora, uma célula T efetora, ou uma célula T virgem. Em algumas modalidades, a célula T efetora é uma célula CD8+ T. Em algumas modalidades, a célula T é uma célula CD4+CD8+ T. As populações de qualquer uma das células modificadas por qualquer um dos métodos descritos no presente documento também são providas. A célula pode ser in vitro, ex vivo ou in vivo. Em alguns casos, as células T são removidas de um indivíduo, modificadas ao usar qualquer um dos métodos descritos no presente documento, e administradas ao paciente.
[00118] Em algumas modalidades, as células T modificadas são cultivadas sob condições que permitem a expressão da cadeia de TOCR- B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo. Em outras modalidades, as células T são cultivadas sob condições eficazes para expandir a população de células modificadas. Em algumas modalidades, as células T que expressam o receptor de células T específico de antígeno são purificadas. Composições
[00119] Também são providas células T humanas produzidas por qualquer um dos métodos providos no presente documento. As populações das células T humanas produzidas por qualquer um dos métodos providos no presente documento também são providas. Também é provida uma pluralidade de células T humanas, em que o genoma de pelo menos 20%, 30% no, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais das células compreendem uma inserção alvo de um ácido nucleico heterólogo, em que o ácido nucleico é inserido no éxon 1 de TRAC ou no éxon 1 de TRBC. Em algumas modalidades, as células T são células T reguladoras, células T efetoras, ou células T virgem. Em algumas modalidades, as células T efetoras são células CD8+ T. Em algumas modalidades, as células T efetoras são células CD4+CD8+ T.
[00120] Também é provida uma célula T que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga, em que a cadeia de subunidade de TOR compreende a região constante e a região variável da cadeia de subunidade de TCR, (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR endógena, em que, se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-alfa (TCR-a), a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TOR heteróloga-beta (TCR-B) e a segunda cadeia de subunidade de TOR heteróloga é uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga, e em que se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-f, a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável, (ii) uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga, (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga, e (v) uma porção do terminal N da cadeia da subunidade de TCR-a endógena. Em alguns exemplos, o ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável, (ii) uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga, (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável, (iv) uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga, and (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena.
[00121] “Também é provida uma célula T modificada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC. Em alguns exemplos, o ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis, uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga (por exemplo, de comprimento total), uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis e uma região variável de uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga.
[00122] “Também é provida uma célula T modificada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRBC. Em outros exemplos, o ácido nucleico codifica, do terminal N ao terminal C, uma primeira sequência de peptídeos autoclivável, uma cadeia da subunidade de TCR-a heteróloga (por exemplo, de comprimento total), uma segunda sequência de peptídeos autoclivável e uma região variável de uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga.
[00123] Também é provida uma célula T modificada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autoclivável; (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autoclivável; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-y endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do éxon 1 do gene de TRGC.
[00124] Também é provida uma célula T modificada que compreende: a) uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência autoclivável, (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga, e (ill) uma porção do terminal N da cadeia de TCR-a endógena; e b) uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência autoclivável, (ii) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga, e (ili) uma porção do terminal N da cadeia de TCR-B endógena, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC e a segunda sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRBC. Métodos de Tratamento
[00125] “Qualquer um dos métodos e das composições descritos no presente documento pode ser usado no tratamento ou na prevenção de uma doença (por exemplo, câncer, uma doença infecciosa, uma doença autoimune, rejeição ao transplante, doença de enxerto versus hospedeiro ou um outro distúrbio inflamatório em um indivíduo). Nos métodos de tratamento providos no presente documento, uma sequência de ácidos nucleicos que compreende a cadeia de TOCR-a ou a cadeia de TOCR-B de um TCR em um indivíduo que tem, por exemplo, câncer, uma doença infecciosa, uma doença autoimune, o potencial para a rejeição ao transplante, a doença de enxerto versus hospedeiro ou um outro distúrbio inflamatório, pode ser obtida a partir das células T no indivíduo. Por exemplo, os linfócitos de infiltração de tumor, as células T em sítios autoimunes ou de linfócitos responsivos a patógenos podem ser isolados do indivíduo para obter uma sequência de ácidos nucleicos que compreende a cadeia de TCR-a ou a cadeia de TOR-B de um TCR. Em algumas modalidades, as sequências de TCR monoclonal ou policlonal identificadas das amostras de pacientes podem ser usadas. Por exemplo, repertórios de TOR de tumor ou de sítios inflamados podem ser obtidos e as células com essas especificidades de antígeno podem ser produzidas mediante a síntese das sequências de TCR e o uso das mesmas como modelos de DNA. Alternativamente, as sequências podem ser amplificadas, por exemplo, PCR-amplificadas, de clones/células simples do indivíduo, e as sequências amplificadas podem ser usadas como modelos de DNA. Uma vez que as sequências de cadeia de TOR-B e de TOR-a de TORs sejam são obtidas, essas sequências podem ser inseridas em uma população de células T em ou do indivíduo para substituir o TOR endógeno de células T no indivíduo por um TCR heterólogo de especificidade de antígeno desejada. Em algumas modalidades, uma população de células T modificadas pode ser administrada ao indivíduo para tratar a doença. Vide, por exemplo, a Figura 3B.
[00126] No presente documento é provido um método de tratamento do câncer em um indivíduo humano, o qual compreende: a modificação das células T do indivíduo ao usar qualquer um dos métodos descritos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno, em que o receptor de células T reconhece um antígeno específico de tumor no indivíduo.
[00127] Em algumas modalidades, o câncer a ser tratado é selecionado de um câncer cuja origem é a célula B, o câncer da mama,
o câncer gástrico, o neuroblastoma, o osteosarcoma, o câncer do pulmão, o câncer do cólon, o câncer mieloide crônico, a leucemia (por exemplo, a leucemia mieloide aguda, a leucemia llinfocítica crônica (CLL) ou a leucemia linfocítica aguda (ALL)), o câncer da próstata, o câncer do cólon, o carcinoma de célula renal, o câncer do fígado, o câncer do rim, o câncer do ovário, o câncer do estômago, o câncer testicular, o rabdomiosarcoma, e o linfoma de Hodgkin. Em algumas modalidades, o câncer cuja origem é a célula B é selecionado do grupo que consiste em leucemia linfoblástica aguda de linhagem B, leucemia linfocítica crônica de célula B, e o linfoma que não de Hodgkin de célula B.
[00128] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento descritos no presente documento, por exemplo, o tratamento do câncer, de doença infecciosa ou de um distúrbio autoimune, as células T são modificadas in vivo. Alguns dos construtos descritos no presente documento são aplicados ao paciente in vivo. Vide, por exemplo, a Patente U.S. nº. 9737604 e Zhang et al. "Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery of CRISPR/Cas9 for tumor therapy", NPG Asia Materials Volume 9, página e441 (2017).
[00129] Em algumas modalidades, o método de tratamento do câncer em um indivíduo humano compreende: a) a obtenção de células T do indivíduo; b) a modificação das células T ao usar qualquer um dos métodos providos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno específico de tumor no indivíduo; e c) a administração das célula T modificadas ao indivíduo. Tal como usado em todo o texto, a expressão "antígeno específico de tumor" refere-se a um antígeno que é singular às células de câncer ou é expresso de modo mais abundante em células de câncer do que em células não Cancerosas.
[00130] No presente documento também é provido um método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo humano, o qual compreende: a modificação das células T do indivíduo ao usar qualquer um dos métodos descritos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno associado com o distúrbio autoimune.
[00131] Em algumas modalidades, o método de tratamento de uma doença autoimune em um indivíduo humano compreende: a) a obtenção das células T do indivíduo; b) a modificação das células T ao usar qualquer um dos métodos providos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno associado com o distúrbio autoimune no indivíduo; e c) a administração das células T modificadas ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células T são células T reguladoras.
[00132] No presente documento também é provido um método de tratamento de uma infecção em um indivíduo humano, o qual compreende: a modificação das células T do indivíduo ao usar qualquer um dos métodos descritos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno associado com a infecção no indivíduo.
[00133] Em algumas modalidades, o método de tratamento de uma infecção em um indivíduo humano compreende: a) a obtenção de células T do indivíduo; b) a modificação das células T ao usar qualquer um dos métodos providos no presente documento para expressar um receptor de células T específico de antígeno heterólogo, em que o receptor de células T reconhece um antígeno associado com a infecção no indivíduo; e c) a administração das células T modificadas ao indivíduo.
[00134] Qualquer um dos métodos de tratamento providos no presente documento também pode compreender a expansão da população de células T antes que o TOR endógeno seja substituído por um TCR heterólogo. Qualquer um dos métodos de tratamento providos no presente documento também pode compreender a expansão da população de células T depois que o TCR endógeno é substituído por um TCR heterólogo e antes da administração ao indivíduo.
[00135] São divulgados os materiais, as composições e os componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados na preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados no presente documento, e deve ser compreendido que, quando são divulgadas as combinações, os subconjuntos, as interações, os grupos, etc., destes materiais que, embora a referência específica de cada uma de várias combinações e permutações individuais e coletivas destes compostos não possa ser divulgada explicitamente, cada um deles é especificamente contemplado e descrito no presente documento. Por exemplo, se um método for divulgado e discutido e um número de modificações que podem ser feitas em uma ou mais molécula inclusive no método for discutido, toda e cada combinação e permutação do método, e as modificações que são possíveis, são contempladas especificamente a menos que esteja indicado especificamente d alguma outra maneira. Do mesmo modo, qualquer subconjunto ou combinação destes também são especificamente contemplados e divulgados. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta invenção incluindo, mas sem qualquer limitação, etapas nos métodos ao usar as composições divulgadas. Desse modo, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser executadas, deve ser compreendido que cada uma destas etapas adicionais pode ser executada com quaisquer etapas específicas do método ou combinação de etapas de método dos métodos divulgados, e que cada tal combinação ou subconjunto de combinações são especificamente contemplados e devem ser considerados como divulgados.
[00136] As publicações citadas no presente documento e o material para as quais elas são citadas são incorporadas no presente documento especificamente a título de referência em suas totalidades.
EXEMPLOS
[00137] Os exemplos a seguir são fornecidos apenas a título de ilustração e não de limitação. Os elementos versados no estado da técnica irão reconhecer de imediato uma variedade de parâmetros não críticos que podem ser mudados ou modificados de modo a obter essencialmente resultados idênticos ou similares. Isolamento de Células T Humanas Primárias Para Focalização em Gene
[00138] CélulasT humanas primárias foram isoladas de doadores humanos saudáveis de amostras frescas de sangue integral, de resíduos de câmaras de leucoredução após Trima Apheresis (Blood Centers of the Pacific), ou de produtos da leucaferese (StemCell). Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas das amostras de sangue integral por meio de centrifugação Ficoll ao usar tubos SepMate (STEMCELL, de acordo com as instruções do fabricante). As células T foram isoladas das PBMCs de todas as fontes de células por meio de seleção negativa magnética ao usar Kit de Isolamento de Células T Humanas EasySep T (STEMCELL, de acordo com as instruções do fabricante). A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, as células T isoladas foram estimuladas e usadas diretamente (frescas) Quando células congeladas foram usadas, as células T previamente isoladas que tinham sido congeladas no meio de congelamento Bambanker (Bulldog Bio) de acordo com as instruções do fabricante foram descongeladas, cultivadas em um meio sem estimulação por 1 dia, e estimuladas então e manipuladas tal como descrito para amostras recentemente isoladas. Os doadores de sangue humano saudáveis fresco foram consentidos sob o protocolo aprovado pelo UCSF Committee on Human Research (CHR). As amostras de pacientes para a edição do gene foram obtidas sob um protocolo aprovado pela Yale Internal Review Board (IRB). Cultura de Células T Primárias
[00139] A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, células T a granel foram cultivadas no meio XVivo'""y 15 (STEMCELL) com soro bobino fetal a 5%, 50 mM de 2-mercaptoetanol e 10 mM de N- Acetil L-cistina. Um meio livre de soro (meio de expansão de células T ImmunoCult XF, STEMCELL) sem aditivos, bem como RPMI + 10% FBS, foram usados nos experimentos indicados (Figura 15). Imediatamente depois do isolamento, as células T foram estimuladas por 2 dias com dinagrânulos magnéticos anti-humanos CD3/CD28 (ThermoFisher) a uma concentração de células de 1:1, junto com um coquetel de citocina de IL-2 a 200 U/ml (UCSF Pharmacy), IL-7 a 5 ng/ml (ThermofFisher), e IL-15 a 5 ng/ml (Life Tech). Depois da eletroporação, as células T foram cultivadas no meio com o IL-2 a 500 U/ml. Durante toda a cultura, as células T foram mantidas a uma densidade aproximada de 1 milhão de células por ml! do meio. A cada 2 a 3 dias após a eletroporação, um meio adicional foi adicionado, junto com IL-2 fresco adicional, para elevar a concentração final até 500 U/ml, e as células foram transferidas a vasos de cultura maiores conforme necessário para manter uma densidade de 1 milhão de células. Produção de RNP
[00140] As RNPs foram produzidas por meio de anelamento de um gRNA de dois componentes a Cas9, tal como descrito previamente
(Schumann et al. PNAS 112: 10437-10442 (2015); e Hultquist et al. Cell Rep. 17: 1438-1452 (2016))). Em resumo, os crRNAs e os tracr»RNAs foram sintetizados quimicamente (Dharmacon, IDT), e Cas9-NLS, D10A-NLS ou dCas9-NLS recombinante foram produzidos de maneira recombinante e purificados (QB3 Macrolab). O RNA liofilizado foi ressuspenso em Tris-HCL (pH 7,4) com 150 mM de KCI a uma concentração de 160 uM, e foi armazenado em alíquotas a -80ºC. As alíquotas de crRNA e de tracrRNA foram descongeladas, misturadas a 1:1 em volume, e incubadas a 37ºC por 30 minutos para formar uma solução de 80 UM de gRNA. Cas9 recombinante e variantes, armazenados a 40 uM em 20 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM de KCl, glicerol a 10%, 1 mM de DTT, foram misturados então a 1:1 em volume com 80 uM de gRNA (razão molar entre gRNA e Cas9 de 2:1) a 37ºC por 15 minutos para formar uma RNP a 20 uM. As RNPs foram em geral eletroporadas imediatamente depois da complexação. Produção de dsDNA HDRT
[00141] Sequências de DNA HDRT de cordão duplo foram geradas a partir dos produtos de PCR. As novas sequências de HDR foram construídas ao usar Gibson Assemblies para colocar a sequência de modelo de HDR, que consiste em braços de homologia (geralmente sintetizados como gBlocks de IDT) e a inserção desejada (tal como GFP) em um vetor de clonagem para a confirmação da sequência e a futura propagação. Estes plasmídeos foram usados como modelos para a amplificação de PCR de elevado rendimento (polimerase Kapa Hotstart). Os âmplicons de PCR (dsDNA HDRT) foram purificados com SPRI (1,0 X) e eluídos em um volume final de 3 ul de H2O por 100 ul da reação de PCR de entrada. As concentrações de HDRTs foram analisadas por meio de nanogotas com uma diluição de 1:20. O tamanho de HDRT amplificado foi confirmado por eletroforese de gel em um gel de agarose a 1,0%.
Produção de ssDNA HDRT por Digestão de Exonuclease
[00142] Para produzir ssSDNA longo como doadores de HDR, o DNA de interesse foi amplificado através de PCR ao usar um primer de PCR não modificado regular e um segundo primer de PCR fosforilado. O cordão de DNA que será amplificado ao usar o primer forforilado será o cordão que será degradado ao usar este método. Isto permite que qualquer um prepare um DNA de sentido de cordão simples ou de antissentido de cordão simples ao usar o respectivo primer de PCR fosforilado. Para produzir o cordão de ssDNA de interesse, o cordão fosforilado do produto de PCR foi degradado através do tratamento subsequente com duas enzimas, Strandase Mix A e Strandase Mix B, por 5 minutos (por 1kb) a 37ºC, respectivamente. As enzimas foram desativadas por uma incubação de minutos a 80ºC. Os modelos resultantes de ssDNA HDR foram purificados com SPRI (1,0 X) e eluídos em H2O. Um protocolo mais detalhado para o Guide-it'" Long SSDNA Production System (Takara Bio USA, Inc. & 632644) pode ser encontrado no Web site do fabricante. Produção de ssDNA HDRT por Síntese Reversa
[00143] “Doadores de ssDNA foram sintetizados por meio de transcrição reversa de um intermediário do RNA, seguido pela hidrólise do cordão de RNA no produto híbrido resultante de RNA:DNA, tal como descrito em Leonetti et al. http:/AMww.biorxiv.org/content/early/2017/08/21/178905). Em resumo, o doador desejado de HDR foi primeiramente clonado a jusante de um promotor T7 e a sequência de doador de T7-HDR foi amplificada por PCR. O RNA foi sintetizado por meio de transcrição in vitro ao usar HiScribe T7 RNA polimerase (New England Biolabs) e submetido à transcrição reversa ao usar TGIRT-III (InNGex). Depois da transcrição reversa, NaOH e EDTA foram adicionados a 0,2 M e 0,1 M, respectivamente, e a hidrólise do RNA foi realizada a 95ºC por 10 minutos. A reação foi extinguida com HCl, o produto final do ssDNA foi purificado ao usar grânulos magnéticos Ampure
XP (Beckman Coulter) e eluído em H2O livre de RNAse estéril. A qualidade do ssDNA foi analisada por eletroforese capilar (Bioanalyzer, Agilent). Eletroporação de Células T Primárias
[00144] Os modelos de RNPs e de HDR foram submetidos à eletroporação 2 dias após a estimulação inicial das células T. As células T foram colhidas de seus vasos de cultura e dinagrânulos CD3/CD28 magnéticos foram removidos ao colocar as células em um ímã por 2 minutos. Imediatamente antes da eletroporação, as células sem grânulos foram centrifugadas por 10 minutos a 90Xg, aspiradas e ressuspensas em tampão de eletroporação Lonza P3 a 20 ul por milhão de células. Para a edição ideal, um milhão de células T foram eletroporadas por poço ao usar um sistema do eletroporação de 96 poços Lonza 4D o código de pulso EH115. As concentrações alternadas de 200.000 células até 2 milhões de células por poço exibiram eficiências mais baixas. Tampões de eletroporação alternativos foram usados tal como indicado, mas tiveram os ajustes de pulso ideais diferentes (EO155 para o tampão OMEM). A menos que esteja indicado de alguma outra maneira, 2,5 ul de RNPs (50 pmols no total) foram eletroporados, junto com 2 ul do modelo de HDR a 2 ug/ul (4 ug de Modelo de HDR no total).
[00145] Para os experimentos com 96 poços, os HDRTs foram primeiramente separados em alíquotas em poços de uma placa de fundo em forma de V de polipropileno. As RNPs foram então adicionadas aos HDRTs e colocados para incubar em conjunto à temperatura ambiente por pelo menos 30 segundos. Finalmente, as células ressuspensas em tampão de eletroporação foram adicionadas, misturadas rapidamente por meio de pipeta com HDRT e RNP, e 24 ul do volume total (células + RNP + HDRT) foram transferidos a uma placa de cubeta de eletroporação de 96 poços. Imediatamente depois da eletroporação, 80 ul de meio previamente aquecido (sem citocinas)
foram adicionados a cada poço, e as células foram colocadas em repouso por 15 minutos a 37ºC em uma incubadora de cultura de células enquanto permaneceram nas cubetas de eletroporação. Depois de 15 minutos, as células foram movidas para os vasos de cultura finais. Substituição Não Viral de Receptor de Células T Endógeno por um Único Modelo de HDR
[00146] Ambas as cadeias de TCR-a e de TCR-B podem ser submetidas a knock in simultaneamente em uma única rodada multiplexada de edição (Figura 2). Isto é similar à estratégia de focalização de objetivos na Figura 1a e na Figura 1b, exceto pelo fato que em ambos os loci constantes de TOR-a e de TCD-B somente as regiões variáveis do TCR específico de antígeno são inseridas. Isto tem a vantagem que ambos reduzem o tamanho total das inserções (de uma inserção de 1,5 kbp a duas inserções de 500 bp), mas também significa que qualquer célula T que expressa ambas as cadeias do TCR específico de antígeno desejado terão ambas as suas cadeias de TCR- a e de TOCR-B endógenas previamente recombinadas na condição de knock out, impedindo o emparelhamento potencialmente indesejável de uma cadeia de TCR-a específica de antígeno inserida com uma cadeia de TCR-B endógena, por exemplo. Substituição de TCR Endógeno por uma Biblioteca Policlonal de Receptores de Células T
[00147] Uma vez que o gRNA e os braços de homologia são os mesmos para a substituição do TCR endógeno por qualquer nova sequência de TCR heteróloga desejada, múltiplos modelos de DNA diferentes que contêm uma variedade de TCRs desejados podem ser eletroporados simultaneamente. Embora qualquer célula T específica adquire somente um único TCR da variedade de TCRs desejados, muitos dos modelos de DNA de TCR serão integrados através da população de células eletroporadas, criando desse modo um repertório de células T sintéticas de sequências desejadas (Figura 3a).
[00148] Um repertório de células T sintéticas pode ser projetado e gerado a partir de sequências de TCR previamente conhecidas ou de repertórios naturais encontrados em populações de células T endógenas de interesse (Figura 3b). Alguns exemplos incluem os TOCRs expressos por linfócitos de infiltração de tumor (a ser inseridos em uma nova população de células CD8+ ou CD4+ T efetoras), os TCRs expressos por células T autoreativas em sítios de doença autoimune (a ser inseridos em uma população de células T reguladoras), ou os TORs de células T responsivas a patógenos (inseridas em células CD8+ ou CD4+ T efetoras). Substituição Não Viral de Receptor de Células T Endógenos por um Único Modelo de HDR
[00149] O lócusgenômico do receptor de célula T é extremamente complicado, com uma ampla variedade de alelos variáveis (denominados alelos V e J para a cadeia de TCR-a e alelos V, De J para a cadeia de TOCR-B) que são submetidos ao rearranjo de gene somático durante o desenvolvimento de células T a fim de produzir um receptor de células T funcional. Importante para a diversidade do repertório de TOR, mas desafiador para a edição genômica alvo no lócus de TCR (tanto knock-outs quanto Kknock-ins), essas sequências recombinadas são diferentes através da população policlonal de células T. Para as aplicações de focalização, para ambas as cadeias de TCR- a e de TOR-B, há um domínio constante no terminal C da proteína que é compartilhado por todas as células T, independente do fato se os segmentos V-J ou V-D-J foram rearranjados. O lócus de TCR-B tem duas regiões constantes (TRBC1 e TRBC2) que podem ser focalizadas tal como mostrado na Figura 1b. Esta sequência constante (éxons constantes, etiquetados como Éxon 1, Éxon 2, etc., de TRAC ou TRBC) permite que um único conjunto de reagentes alvo genômico (sistema
CRISPR/Cas9 neste pedido de patente, isto é, uma única sequência de gRNA) seja usado para modificar cada célula T independente de qual TCR rearranjado eles expressam.
[00150] Ao usar os métodos indicados acima, um modelo de DNA que codifica um TCR heterólogo que se liga especificamente a um antígeno de tumor foi produzido e usado para substituir um TCR endógeno em uma célula T humana. O modelo de reparo dirigido por homologia (tanto o dsDNA produzido por PCR quanto o ssSDNA produzido por uma variedade de métodos descritos no presente documento) usado para substituir o TCR endógeno tem um comprimento de —2,1 kb, incluindo os braços de homologia em 5' e 3' (-300 bp) que são homólogos às sequências genômica que flanqueiam o Sítio cortado de gRNA (Figura 1a). Entre esses braços de homologia há uma sequência de —1,5 kb que foi inserida no sítio cortado de gRNA pelo reparo dirigido por homologia. Esta sequência inserida começa com um elemento multicistrônico (um peptídeo de autoexcisão de T2A), seguida pela sequência de comprimento total da cadeia de TOCR-B do receptor de células T específico de antígeno desejado (neste exemplo, um TCR específico para o neoantígeno de melanoma NY-ESO-1). Um segundo elemento multicistrônico (um peptídeo de autoexcisão de P2A) segue a cadeia de TCR-B, e separa a mesma (alelos V e J recombinados) da sequência variável da cadeia de TOR-a específica de antígeno desejada. Somente a região variável da cadeia de TOR-a e a sequência do éxon 1 de TRAC antes (da extremidade 5') do sítio cortado de gRNA foram inseridas, uma vez que os éxons de TRAC restantes foram emendados uns aos outros na sequência final de mMRNA. O modelo de DNA foi introduzido nas células T como parte de um complexo de RNP: modelo de DNA tal como descrito acima.
[00151] A transcrição nas células com HDR bem sucedido resultou em um mRNA policistrônico que codifica ambos TCR-B e TCR-a. Esta estratégia de focalização resultou em três cadeias peptídicas: (1) um peptídeo de região variável endógena restante que não possui uma passagem de transmembrana (e desse modo não deve ser expresso na superfície da célula) e foi degradado no reticulum endoplásmico ou secretado depois da transcrição; (2) a cadeia de TOR-B específica de antígeno desejada de comprimento total; e (3) a cadeia de TCR-a específica de antígeno desejada de comprimento total. O resultado foi uma célula T que expressou ambas as cadeias de um TCR específico de antígeno desejado sob o controle do promotor de TOR endógeno. Ambas as cadeias foram expressas pela célula T para formar um TOR heterólogo que reconheceu especificamente o neoantígeno de NY- ESO-1 melanoma.
[00152] Tal como mostrado na Figura 4a, quatro dias depois da eletroporação do construto descrito acima, as células CD4+ e CD8+ T de dois doadores de sangue humano saudáveis foram manchadas com um MHC-dextrâmero etiquetado de maneira fluorescente que contém o peptídeo reconhecido pelo TCR específico de NY-ESO-1 integrado (NYESO). A Figura 4b é um segundo experimento que mostra resultados similares em outros doadores humanos saudáveis, desse modo demonstrando a robustez e a reproducibilidade da substituição de TCR endógeno não viral.
[00153] A substituição de TOR também foi realizada no lócus de TCR-B com uma estratégia similar à focalização de TOCR-a, embora o lócus de B seja mais complexo uma vez que há duas regiões constantes (TRBC1 e TRBC2) que são altamente homólogas uma em relação à outra. Um modelo de HDR inseriu um novo TCR-a de comprimento total e as regiões de VDJ de um novo TCR-B na extremidade 5' do primeiro éxon de TRBC1 ao usar um gRNA que foca em uma sequência encontrada em ambos TRBC1 e TRBC2. Devido à similaridade de sequência entre as regiões genômicas de TRBC1 e TRBC?2, o braço de homologia em 3' desse construto também era quase perfeitamente homólogo à região equivalente em TRBC2, ao passo que o braço de homologia em 5' tinha uma homologia igual a -85% em relação à região genômica TRBC2 nos 150 bps mais próximos do sítio de inserção. À inserção desse modo provavelmente predomina em TRBC1, mas também poderia ser possível em TRBC2 ou com uma deleção intermediária entre TRBC1 e TRBC2. Os gRNAs que cortam especificamente em TRBC1 ou TRBC2 também podem ser usados em vez do gRNA que foca em ambos.
[00154] AFigura 9a mostra a análise do desemparelhamento depois da aplicação retroviral ou da substituição de TOR não viral de um TOR específico de NY-ESO-1 TCR em células CD4+ ou CD8+ T conectadas. A substituição de TCR não viral resulta em menos desemparelhamento de TCR em comparação à aplicação retroviral de um TCR. A substituição multiplexada do TOR, com um novo domínio VJ de TOCR-a focado em TRAC e um novo domínio VDJ de TCR-B focado em TRBC1 também era possível e pode apresentar uma estratégia para reduzir ainda mais o desemparelhamento de TCR (Figuras 9b-c). Substituição de TCR por Tingimento com Dextrâmero e TCR
[00155] Células CD4+ e CD8+ T de dois doadores de sangue humano saudáveis foram submetidas à eletroporação com um único construto tal como descrito acima. Quatro dias após a eletroporação, foi realizado o tingimento para a expressão de TOR (com um anticorpo que liga todos os TORs humanos potenciais) versus o tingimento específico de antígeno com NYESO MHC-dextrâmero. Na maior parte das células T não há a substituição dirigida por homologia do TOR endógeno (Figura 5), o TOR endógeno sofre knock out devido ao corte pelo gRNA do éxon 1 de TRAC e a introdução de pequenos indéis por meio de união de extremidade não homóloga. Tal como esperado, quase todas as células NYESO positivas também são positivas para a expressão de TCR.
Mortandade de Células de Câncer In Vitro por Células T Humanas Primárias de Knock-in de TCR
[00156] Um ensaio da mortandade de células de câncer in vitro demonstrou a capacidade funcional da mortandade de células de knock- in de TOR. Tal como descrito acima, a sequência de 1G4 (específica de NYESO) TCR foi inserida no lócus de TOCR-a endógeno em células CD3+ T primárias de doadores humanos saudáveis. No 7º dia após a eletroporação, as células foram manchadas com um dextrâmero fluorescente de peptídeo de NYESO-MHC e as células de NYESO+ foram classificadas por meio da classificação de células ativada de modo fluorescente para obter uma população pura. Essa população também foi cultivada em condições de cultura de célula T padrão (meio e I1L-2) por mais cinco dias. Doze dias após a eletroporação, as células T classificadas com seu TCR endógeno substituído por 1G4 TCR foram cocultivada com uma linhagem de células de câncer que apresenta o antígeno NYESO em sua MHC (células A375, derivadas de um melanoma, e expressando de modo endógeno o antígeno NYESO bem como MHC-A?2, o alelo de MHC reconhecido pelo 1G4 TCR). A cada 12 horas, o número de células de câncer foi contado pelas imagens fluorescentes quantitativas (as células A375 expressam uma proteína fluorescente vermelha, permitindo que elas sejam contadas especificamente em separado das células T). As contagens fluorescentes foram automatizadas ao usar um microscópio fluorescente automatizado Incucyte. As culturas foram semeadas com
3.000 células de câncer, e a razão indicada de células 1G4+ T (vide a Figura 4a). Nas células T editadas de dois doadores humanos saudáveis, a dose robusta e a mortandade dependente do tempo das células de câncer alvo foram observadas, indicando a funcionalidade das células 1G4 TCR T de knock-in. A porcentagem de mortandade das células de câncer foi determinada ao dividir o número de células de câncer vivas em um determinado poço pelo número de células de câncer vivas nos poços de controle que não tinham nenhuma célula T presente. Elevadas razões (-10:1) entre as células T e as células de câncer exibiram uma mortandade rápida (< 24 horas) de quase todas as células de câncer, mas razões até mesmo muito baixas (-0,1:1) entre as células T e as células de câncer exibiram uma mortandade robusta com tempo adicional na cultura (vide a Figura 6a).
[00157] A mortandade de câncer in vitro por células 1G4 TCR T de knock-in em um único ponto no tempo foi demonstrada (vide a Figura 6b). Os dados resumidos foram tirados de um único ponto no tempo nos ensaios de mortandade de células descritos acima (36 horas após a coincubação). As células de NYESO dextrâmero+ (1G4+) T foram classificadas como descritas acima, para gerar uma população 1G4 positiva de 100%, que fosse diluída então com as células de dextrâmero- de NYESO (1G4-) T do mesmo doador para obter as porcentagens indicadas de células T com tingimento de NYESO+ (10%, 1% ou 0%). Cada uma destas populações foi então cocultivada com as células de câncer em um ensaio de mortandade de câncer in vitro, tal como descrito acima, a uma razão entre 8 células T e 1 célula de câncer (que resulta em razões de 8:1, 0,8:1, 0,08:1 e 0:1 entre células 1G4+ T e células de câncer para as populações de células de 100%, 10%, 1% e 0% de células NYESO+ T, respectivamente). Como um controle positivo para a mortandade de células de câncer, as células de um doador saudável adicional foram transduzidas com um lentivírus que integra aleatoriamente um cassete de expressão de 1G4 TCR no genoma das células T (deve ser observado que, neste caso, o TCR é aleatoriamente integrado e expresso, ao contrário das células 1G4 TCR T de knock-in onde o 1G4 TCR substitui o lócus de TOR endógeno, de modo que é expresso fora do promotor de TCR endógeno e nocauteia simultaneamente o TCR endógeno). Células T lentiviralmente transduzidas deste doador adicional foram classificadas similarmente para obter uma população de 100% de 1G4+ cocultivadas similarmente com a linhagem de células de câncer alvo A375 a uma razão de 8:1 entre as células T e as células de câncer.
Modelo de Tumor Sólido de Camundongo In Vivo
[00158] Todos os experimentos de camundongos foram comple- tados de acordo com um protocolo do UCSF Institutional Animal Care and Use Committee. Camundongos machos NOD/SCID/IL-2Ry-null (NSG) de 8 a 12 semanas de idade (Jackson Laboratory) foram usados para todos os experimentos. Os camundongos foram semeados com os tumores através de injeção subcutânea em um flanco direito raspado de 1 x 10º células de melanoma humano A375 (ATCC CRL-1619). No sétimo dia após a semeadura do tumor, o tamanho do tumor foi avaliado e os camundongos com volumes de tumor entre 15 e 30 mm? foram atribuídos aleatoriamente a grupos de tratamento experimentais e de controle. Os números indicados de células T foram ressuspensos em 100 ul de RPMI livre de soro e injetados retro-orbitalmente. Para experimentos de dimensionamento do tumor, o comprimento e a largura do tumor foram medidos ao usar calibres eletrônicos, e o volume foi calculado como v = 1/6 * mr * comprimento * largura * (comprimento + largura) / 2. O investigador foi cegado ao grupo de tratamento experimental durante as medidas do dimensionamento. Uma população de células T editada em massa (5 x 10º) ou uma população de NY-ESO- 1 TCR+ classificada (3 x 108) foi transferida tal como indicado nas figuras e nas legendas. Para as transferências de células T editadas em massa, as células lentiviralmente editadas tinham geralmente uma porcentagem mais elevada de células NY-ESO-1 positivas, de modo que as células infectadas com simulacro foram adicionadas para normalizar a porcentagem do total de células NY-ESO-1+ T para se igualar àquele da população em massa das células T não viralmente editadas (-10% de NY-ESO-1+). Para as transferências de células T classificadas, as células NY-ESO-1+ T foram classificadas por FACS oito dias após a eletroporação, expandidas por mais dois dias, e congeladas (meio de congelamento Bambanker, Bulldog Bio). As células T humanas não viralmente ou lentiviralmente modificadas foram então descongeladas e colocadas em repouso em um meio durante toda a noite antes da transferência adotiva. Para a análise de fluxo citométrico das células T adotivamente transferidas, suspensões de uma só célula dos tumores e dos baços foram produzidas pela dissociação mecânica do tecido através de um filtro de 70 um. Todos os experimentos animais foram executados em conformidade com os regulamentos éticos correspondentes por um protocolo da IACUC aprovado (UCSF), incluindo um limite de tamanho do tumor de 2,0 cm em qualquer dimensão.
Funcionalidade In Vivo de Células T com Substituição de TOR Não Viral
[00159] Um modelo de xenoenxerto de tumor específico de antígeno humano foi usado (Figura 7a) para avaliar a funcionalidade in vivo de células T com uma substituição de TOR não viral. Camundongos NSG de 8 a 12 semanas de idade foram semeados com 1 x 10º células A375 (linhagem de células de melanoma humano; NY-ESO-1 antígeno+ e HLA-A*0201+) subcutaneamente em um flanco raspado. Células T humanas primárias editadas para expressar um TCR específico de antígeno NY-ESO-1 foram geradas (tanto através de transdução lentiviral quanto de substituição de TOR não viral), expandidas por 10 dias após a transdução ou a eletroporação, e congeladas. Foi usada uma população editada em massa foi usada (Figuras 7b-c) ou então uma população classificada de NY-ESO-1 TCR+ (Figuras 7d-f). No sétimo dia após a semeadura de tumor, as células T foram descongeladas e transferidas de maneira adotiva através de injeção
7U73 retro-orbital.
Tal como mostrado na Figura 7B, dois dias depois da transferência de 5 x 10º células T não viralmente focalizadas em massa (-10% TCR+ NYESO-1+ (vermelho) -10% TCR+ NYESO-1- (alaranjado), e -80% TCR- NYESO-1- (verde), vide a Figura 7b), as células T não viralmente deitadas de NY-ESO-1+ acumularam de preferência no tumor versus o baço. n = 5 camundongos para cada um de quatro doadores humanos de célula T.
Dez dias depois da transferência de 5 x 10º células T etiquetadas com CFSE não viralmente focalizadas em massa, as células NYESO-1 TCR+ exibiram uma proliferação maior do que as células TOR- ou TCOR+YNYESO-1- T, e exibiram uma proliferação maior (CFSE baixo) no tumor do que no baço (Figura 7c). No décimo dia após a transferência, as células TCR- e TCR+H+NYESO- T eram difíceis de encontrar no tumor (Figura 7d). À Figura 7d mostra trilhas longitudinais de volume do tumor para os dados resumidos na Figura 8f. 3 x 10º células NY-ESO-1 TCR+ T classificadas geradas pela transdução lentiviral ou pela substituição de TCR não viral foram transferidas no sétimo dia após a semeadura do tumor e comparadas às injeções de veículo somente até 24 dias após a semeadura do tumor.
Deve ser observado que os mesmos dados para os dados de controle do veículo são mostrados para cada doador na comparação com a aplicação lentiviral (acima) e a substituição de TOR não viral (abaixo). Nesses experimentos (Figuras 7e-f), dezessete dias após a transferência das células T, as células não viralmente substituídas com TCR pareceram mostrar uma expressão maior de NY- ESO-1 TCR e uma expressão menor de marcadores de exaustão.
À transferência de ambas as células lentiviralmente transduzidas e substituídas com TCR não viral exibiu reduções significativas na carga de tumor no dia 24. Neste modelo experimental, a substituição de TOR não viral revelou outras reduções em comparação à transdução lentiviral (Figura 8f). n = 4 (Figura 7b), n = 2 (Figura 7d-f), ou (Figura 7c) n=1 doadores saudáveis independentes em 5 (Figuras 7b, 7c) ou 7 camundongos (Figuras 7d-f) por doador com desvio médio (Figuras 7b, Te, 7f) e padrão (Figura 7b). Função Específica de Antígeno de Tumor
[00160] A função específica de antígeno de tumor de células T humanas alvo também foi avaliada. Quando as células T alvo foram cocultivadas com duas linhagens diferentes de células de melanoma de NY-ESO-1+, M257 e M407, as células T modificadas produziram robusta e especificamente IFN-y e TFN-a e induziram a desgranulação de células T (medida pela expressão de superfície de CD107a (Figura 8a). A produção e a desgranulação de citocina ocorreram somente quando as células NY-ESO-1 TCR T foram expostas às linhagens de células que expressam o alelo MCH da classe | de HLA-A*0201 apropriado requerido para apresentar o peptídeo NY-ESO-1 cognato. À resposta de ambas as células CD8+ e CD4+ T era consistente através dos doadores saudáveis, e era comparável à resposta de células T do mesmo doador saudável em que o NY-ESO-1 TCR foi transduzido pelo gama retrovírus e expresso de maneira heteróloga ao usar um promotor viral (Figura 8a e Figura 9d). As células NY-ESO-1 TCR T de knock-in mataram rapidamente as células de câncer alvo M257-HLA-A*0201 in vitro a taxas similares às células T de controle positivo transduzidas retroviralmente (Figura 8b). A mortandade era seletiva para as células- alvo que expressam o antígeno NY-ESO-1 e o alelo HLA-A*0201, consistente através de doadores, e dependente das células T que são modificadas ao usar ambos o gRNA correto e o modelo de HDR (Figuras 9h-k).
[00161] Finalmente, foi confirmado que a focalização de genoma não viral pode ser usada para a geração de células NY-ESO-1 TCR em escala e que essas células têm uma função antitumour in vivo (Figura 8c e Figura 7a). Dado que a eficiência de knock-in era menor com à focalização não viral do que com modelos de AAV dimensionalmente comparáveis, se os números suficientes de células NY-ESO-1 positivas para terapias de células adotivas fossem assegurados. 100 milhões de células T de seis doadores saudáveis que, dez dias após a expansão resultaram em uma média de 385 milhões de células NY-ESO-1 TOR T por doador (Figura 8d). As células NY-ESO-1 TCR T de knock-in de preferência ficaram localizadas em, persistiram em, e proliferaram no tumor e não no baço, similar às células T lentiviralmente transduzidas de controle positivo (Figura 8e e Figuras 7b-f). A transferência adotiva de células NY-ESO-1 TCR T classificadas também reduziu a carga de tumor nos animais tratados (Figura 8f).

Claims (104)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula T humana primária, caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um gene heterólogo não viralmente inserido em pelo menos uma região-alvo de um ou ambos de: um gene constante de subunidade alfa de receptor de células T endógeno (TRAC), e um gene constante de subunidade beta de receptor de células T endógeno (TRBC), em que pelo menos um gene heterólogo compreende pelo menos um de: (1) uma região variável de um gene heterólogo de cadeia alfa (TCR-a) de receptor de células T heterólogo e (2) uma região variável de um gene beta de cadeia beta (TCR-B)de receptor de células T heterólogo.
2. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula T não compreende um vetor viral para introduzir pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos à célula T.
3. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos tem um tamanho de pelo menos 1,5 kb.
4. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos tem um tamanho de pelo menos 500 bp.
5. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região-alvo fica no éxon 1, 2 ou 3 de TRAC.
6. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a região-alvo fica no éxon 1, 2 ou 3 de
TRBC.
7. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula T é uma célula CD8+ T ou uma célula CD4+T.
8. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene heterólogo compreende pelo menos uma de: (1) a) a região variável ou b) a região variável e a região constante do gene de cadeia alfa (TCR-a) de receptor de células T heterólogo e (2) a) região variável ou b) a região variável e a região constante do gene de cadeia beta (TCR-B) de receptor de células T heterólogo.
9. Célula T de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que pelo menos um gene heterólogo compreende cada uma de: (1) a) a região variável ou b) a região variável e a região constante do gene de cadeia alfa (TCR-a) de receptor de células T heterólogo e (2) a) a região variável ou b) a região variável e a região constante do gene de cadeia beta (TCR-B) de receptor de células T heterólogo.
10. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a célula T compreende cada uma de (1) a) a região variável ou b) a região variável e região constante do gene de cadeia de TOCR-a heteróloga e (2) a) a região variável ou b) a região variável e a região constante do gene de cadeia de TCR- B heterólogo.
11. Célula T de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que, com a expressão, a cadeia de TCR-a heteróloga e a cadeia de TCR-B heteróloga formam um receptor de células de T (TOR) específico de antígeno.
12. Célula T de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o gene de cadeia de TOCR-a heteróloga e o gene de cadeia de TCR-B heteróloga são ligados operavelmente por uma sequência de ligantes, e opcionalmente a sequência de ligantes é uma sequência de ligantes cliváveis ou um elemento multicistrônico.
13. Célula T de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o gene de cadeia de TCR-a heteróloga e o gene de cadeia TCR-B heteróloga são inseridos em TRAC.
14. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a expressão de pelo menos um gene heterólogo é dirigida por um promotor endógeno.
15. Célula T de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a expressão de um ou ambos dentre TRAC endógeno e TRBC endógeno é reduzida na célula em relação a uma célula T de controle, em que a célula T de controle é uma célula T humana primária que não possui a inserção não viral.
16. População de células T, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de células T humanas primárias como definidas na reivindicação 1, em que o genoma de pelo menos 20% da população compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos.
17. Célula T humana primária, caracterizada pelo fato de que compreende: pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um gene heterólogo inserido em pelo menos uma região-alvo de um ou ambos: um gene constante de subunidade alfa de receptor de células T endógeno (TRAC), e um gene constante de subunidade beta de receptor de células T endógeno (TRBC), em que pelo menos um gene heterólogo compreende pelo menos uma de: (1) uma região variável de um gene de cadeia alfa (TCR- a) de receptor de células T heterólogo e (2) uma região variável de um gene de cadeia beta (TCR-B) de receptor de células T heterólogo, e em que a célula T não compreende um vetor viral para introduzir pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos na célula T.
18. Método de edição do genoma de uma célula T humana primária, caracterizado pelo fato de que compreende: a inserção não viral de pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um gene heterólogo em pelo menos uma região-alvo de um ou ambos: TRAC endógeno e TRBC endógeno, em que pelo menos um gene heterólogo compreende pelo menos uma de: (1) uma região variável de um gene de cadeia de TCR- a heterólogo (2) uma região variável de um gene de cadeia de TCR-B heterólogo.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é uma sequência de ácidos nucleicos de cordão duplo ou de cordão simples, e em que a sequência de ácidos nucleicos é inserida mediante a introdução da sequência de ácidos nucleicos na célula T.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é inserida na célula T mediante a introdução na célula T de (a) uma nuclease alvo que cliva a região-alvo de TRAC e/ou TRBC para criar pelo menos um sítio de inserção no genoma da célula T; e (bj a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é inserida em pelo menos um sítio de inserção por meio de reparo dirigido por homologia (HDR).
21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5' e a extremidade 3' da sequência de ácidos nucleicos compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a região-alvo.
22. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5' e a extremidade 3' da sequência de ácidos nucleicos compreende sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômica que flanqueiam o sítio de inserção.
23. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a nuclease alvo introduz uma ruptura de cordão duplo no sítio de inserção.
24. Método de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é um modelo de DNA de cordão simples e/ou um modelo de DNA linear.
25. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a nuclease alvo é selecionada do grupo que consiste em um domínio de nucleasse guiado por RNA, uma nucleasse efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) e uma megaTAL.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cpfl ou uma nuclease Cas9 e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo de TRAC ou de TRBC.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a nuclease Cpfl ou a nuclease Cas9, o RNA guia e o ácido nucleico são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)-complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cpfl ou a nuclease Cas9 e o RNA guia; e (ii) o modelo de DNA.
28. Método de tratamento do câncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
a. a obtenção de uma célula T que compreende pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que compreende pelo menos um gene heterólogo não viralmente inserido em pelo menos uma região- alvo de um ou ambos de: um gene constante de subunidade alfa de receptor de células T endógeno (TRAC) e um gene constante de subunidade beta de receptor de células T endógeno (TRBC), em que pelo menos um gene heterólogo compreende pelo menos uma de: (1) uma região variável de um gene de cadeia alfa (TCR-a) de receptor de células T heterólogo e (2) uma região variável de um gene de cadeia beta (TCR-B) de receptor de células T heterólogo; e b. a administração da célula T ao indivíduo.
29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula T expressa cada um dos genes heterólogos, que forma um receptor de células T específico de antígeno (TOR) que reconhece um antígeno específico de tumor.
30. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula T não compreende um vetor viral para introduzir pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos na célula T.
31. Método de edição do genoma de uma célula humana de T, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante de subunidade de receptor de células T (TCR) na célula T humana, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (1) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga, em que a cadeia da subunidade de TOR compreende a região variável e a região constante da subunidade de TCR; (ii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TOR endógena, em que, se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-alfa (TCR-a), a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-beta (TCR-B) heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga, e em que se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-B, a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TOCR-a heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que uma sequência de ácidos nucleicos codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de TCR-B heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-a endógena, é inserida no éxon 1 de um gene constante da subunidade de TCR-alfa (TRAC) na célula T humana.
33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que uma sequência de ácidos nucleicos codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de TCR-a heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis;
(iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena, é inserida no éxon 1 de um gene constante de subunidade de TCR-beta (TRBC) na célula T humana.
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é uma sequência de ácidos nucleicos de cordão duplo ou de cordão simples, em que a sequência de ácidos nucleicos é inserida mediante a introdução da sequência de ácidos nucleicos na célula T.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é inserido mediante a introdução de um vetor viral que compreende o ácido nucleico na célula T.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31, 32, 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de: (a) uma nuclease alvo que cliva a região-alvo no éxon 1 do gene de TRAC para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é inserida no sítio de inserção por meio de reparo dirigido por homologia (HDR).
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31, 33, 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é inserido na célula T mediante a introdução na célula T de: (a) uma nuclease alvo que cliva a região-alvo no éxon 1 do gene de TRBC para criar um sítio de inserção no genoma da célula T; e (b) a sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de ácidos nucleicos é inserida no sítio da inserção por meio de reparo dirigido por homologia (HDR).
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 37, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5' e a extremidade 3' da sequência de ácidos nucleicos compreende sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a região-alvo.
39. Método de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a extremidade 5' e a extremidade 3' da sequência de ácidos nucleicos compreende sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam o sítio de inserção.
40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 39, caracterizado pelo fato de que a nuclease alvo introduz uma ruptura de cordão duplo no sítio de inserção.
41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é um modelo de DNA de cordão simples.
42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 41, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos é um modelo de DNA linear.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 42, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo autoclivável e o segundo peptídeo autoclivável são o mesmo ou peptídeos 2A virais diferentes.
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a 43, caracterizado pelo fato de que a nuclease alvo é selecionada do grupo que consiste em um domínio de nucleasse guiado por RNA, uma nucleasse efetora do tipo transcrição ativadora (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) e uma megaTAL.
45. Método de acordo com a reivindicação 44,
caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cpf1 ou uma nuclease Cas9 e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo no éxon 1 de TRAC.
46. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cpf1 ou uma nuclease Cas9 e o método também compreende a introdução na célula de um RNA guia que hibridiza especificamente à região-alvo no éxon 1 de TRBC.
47. Método de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9, o RNA guia e o ácido nucleico são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)-complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9 e o RNA guia; e (ii) o modelo de DNA.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a razão molar entre a RNP e o modelo do DNA no complexo é de cerca de 3:1 a cerca de 100:1.
49. Método de acordo com a reivindicação 47 ou 48, caracterizado pelo fato de que o complexo de RNP-modelo de DNA é formado mediante a incubação da RNP com o modelo de DNA por cerca de dez a cerca de trinta minutos, a uma temperatura de cerca de 20ºC a 25ºC.
50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 47 a 49, caracterizado pelo fato de que o complexo de RNP-modelo de DNA e a célula são misturados antes da introdução do complexo de RNP-modelo de DNA na célula.
51. Método de acordo com a reivindicação qualquer uma das reivindicações 47 a 50, caracterizado pelo fato de que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes.
52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente — complexos — diferentes contêm RNAs guias estruturalmente diferentes.
53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que cada um dos complexos de RNP estruturalmente diferentes compreende uma nickase Cas9, e em que os RNAs guias estruturalmente diferentes hibridizam aos cordões opostos da região-alvo.
54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 53, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende a eletroporação.
55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 54, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico ou o complexo de RNP-modelo de DNA é introduzido em uma população de cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 106 células T.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células.
57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que cada um de pelo menos dois modelos de DNA estruturalmente diferentes codifica uma combinação singular de uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno e uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 27, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T reguladora, uma célula T efetora, ou uma célula T virgem.
59. Método de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T efetora, e em que a célula T efetora é uma célula CD8 + T ou uma célula CD4+.
60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula T efetora é uma célula CD4 + CD8 +T.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 60, caracterizado pelo fato de que também compreende o cultivo das células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR-B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno.
62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o cultivo das células T modificadas sob condições eficazes para expandir a população de células modificadas.
63. Método de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que também compreende a purificação das células T que expressam o receptor de células T específico de antígeno.
64. Célula T modificada, caracterizada pelo fato de que é produzida por qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações 31 a 63.
65. Célula T modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (1) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga, (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR endógena, em que, se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-alfa (TCR-a), a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-beta heteróloga (TCR-B) e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-a heteróloga, e em que se a subunidade de TCR endógena for uma subunidade de TCR-B, a primeira cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TOCR-a heteróloga e a segunda cadeia de subunidade de TCR heteróloga é uma cadeia de subunidade de TCR-B heteróloga.
66. Célula T modificada de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que que a sequência de ácidos nucleicos codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de receptor de células T (TCR)-B; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-a heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR alfa heteróloga, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC.
67. Célula T modificada de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de receptor de células T (TCR)-a heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma porção do terminal N da subunidade de TCR-B endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRBC1 ou TRBC?2.
68. Célula T modificada, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma região variável de uma cadeia de receptor de células T (TCR)-a heteróloga; (iii) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (iv) uma região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; e (v) uma porção do terminal N da subunidade de TCR beta endógena, em que a sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRBC.
69. Método de edição do genoma de uma célula T, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a introdução em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade alfa de TOR (TRAC) na célula T humana de uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de TCR-a heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno; e (ili) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade alfa de TCR endógena; e (b) a introdução em uma região-alvo no éxon 1 de um gene constante da subunidade beta de TOR (TRBC) na célula T humana de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C.
(i) uma segunda sequência de peptídeos autocliváveis; (ii) uma cadeia de TCR-B heteróloga de um receptor de células T específico de antígeno; e (iii) uma porção do terminal N do éxon 1 da subunidade beta de TCR endógena.
70. Método de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que a primeira e/ou segunda sequência de ácidos nucleicos é um ácido nucleico de cordão duplo ou de cordão simples, e em que o primeiro e/ou o segundo ácido nucleico é inserido mediante a introdução do primeiro e/ou segundo ácido nucleico na célula T.
71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira e/ou segunda sequência de ácidos nucleicos é inserida mediante a introdução de um vetor viral que compreende o primeiro e/ou o segundo ácido nucleico na célula T.
72. Método de acordo com a reivindicação 70 ou 71, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos são inseridos na célula T mediante a introdução na célula T de: (a) uma ou mais nucleases alvo que criam um primeiro sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRAC e um segundo sítio de inserção no éxon 1 do gene de TRBC; (b) a primeira sequência de ácidos nucleicos; e (c) a segunda sequência de ácidos nucleicos.
73. Método de acordo com a reivindicação qualquer uma das reivindicações 69 a 72, caracterizado pelo fato de que as extremidades 5' e 3' da primeira sequência de ácidos nucleicos compreende sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a primeira região-alvo no éxon 1 de TRAC.
74. Método de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que as extremidades 5' e 3' do segundo modelo de DNA compreendem sequências de nucleotídeos que são homólogas às sequências genômicas que flanqueiam a segunda região- alvo no éxon 1 de TRBC.
75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 74, caracterizado pelo fato de que uma ou mais nucleases alvo introduzem uma ruptura de cordão duplo no primeiro e segundo sítios de inserção.
76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 75, caracterizado pelo fato de que a primeira e/ou segunda sequência de ácidos nucleicos é um modelo de DNA de cordão simples.
77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 76, caracterizado pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo ácido nucleico é um modelo de DNA linear.
78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 77, caracterizado pelo fato de que o primeiro peptídeo autoclivável e o segundo peptídeo autoclivável são o mesmo ou peptídeos 2A virais diferentes.
79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 78, caracterizado pelo fato de que uma ou mais nucleases alvo são selecionadas do grupo que consiste em um domínio de nucleasse guiado pelo RNA, uma nucleasse efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou uma megaTAL.
80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a nucleasse guiada por RNA é uma nuclease Cpfi ou uma nuclease Cas9, e em que o método também compreende a introdução na célula de um primeiro RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 de TRAC, e um segundo RNA guia que hibridiza especificamente a uma região-alvo no éxon 1 de TRBC.
81. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9, o primeiro RNA guia e a sequência de ácidos nucleicos são introduzidos na célula como um complexo de ribonucleoproteína (RNP)-complexo de modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende uma nuclease Cas9 ou uma nuclease Cpf1, e o primeiro RNA guia; e (ii) o primeiro modelo de DNA.
82. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9, o segundo RNA guia e a segunda sequência de ácidos nucleicos são introduzidos na célula como um complexo de RNP-modelo de DNA, em que o complexo de RNP-modelo de DNA compreende: (i) a RNP, em que a RNP compreende a nuclease Cpf1 ou a nuclease Cas9 e o segundo RNA guia; e (ii) o segundo modelo de DNA.
83. Método de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que a razão molar entre a RNP e o modelo do DNA no complexo é de cerca de 3:1 a cerca de 100:1.
84. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 83, caracterizado pelo fato de que o complexo de RNP-modelo de DNA é formado mediante a incubação da RNP com o modelo de DNA por cerca de dez a cerca de trinta minutos, a uma temperatura de cerca de 20ºC a cerca de 25ºC.
85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 81 a 84, caracterizado pelo fato de que o complexo de
RNP-modelo de DNA compreende pelo menos dois complexos de RNP estruturalmente diferentes.
86. Método de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que cada um dos complexos de RNP estruturalmente diferentes compreende uma nickase Cas9, e em que RNAs guias estruturalmente diferentes hibridizam aos cordões opostos da região-alvo.
87. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 86, caracterizado pelo fato de que a introdução compreende a eletroporação.
88. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 87, caracterizado pelo fato de que a(s) sequência(s) de ácidos nucleicos ou o(s) complexo(s) de RNP:modelo de DNA são introduzidos em cerca de 1 x 10º a cerca de 2 x 10º células T.
89. Método de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois primeiros modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células.
90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois primeiros modelos de DNA estruturalmente diferentes compreendem regiões variáveis diferentes de uma cadeia de TCR-a de um receptor de células T específico de antígeno.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois segundos modelos de DNA estruturalmente diferentes são introduzidos nas células.
92. Método de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois segundos modelos de DNA estruturalmente diferentes compreendem regiões variáveis diferentes de uma cadeia de TCR-B de um receptor de células T específico de antígeno.
93. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 92, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T reguladora, uma célula T efetora, ou uma célula T virgem.
94. Método de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a célula T é uma célula T efetora, e em que a célula T efetora é uma célula CD8 + T ou uma célula CD4+ T.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a célula T efetora é uma célula CD4+ CD8+T.
96. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 69 a 95, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o cultivo das células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR-B heteróloga e da cadeia de TCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno.
97. Método de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o cultivo das células T sob condições que permitem a expressão da cadeia de TCR- B heteróloga e da cadeia de TOCR-a heteróloga para formar um receptor de células T específico de antígeno.
98. Método de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o cultivo das células T modificadas sob condições eficazes para expandir a população de células modificadas.
99. Método de acordo com a reivindicação 97 ou 98, caracterizado pelo fato de que também compreende a purificação das células T que expressam o receptor de células T específico de antígeno.
100. CélulaT modificada, caracterizada pelo fato de que é produzida por qualquer um dos métodos como definidos nas reivindicações 69 a 99.
101. CélulaT modificada, caracterizada pelo fato de que compreende: a) uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência autoclivável; (ii) a região variável de uma cadeia de TOCR-a heteróloga; e (ili) uma porção do terminal N da cadeia de TOR-a endógena; e b) uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica, do terminal N ao terminal C, (i) uma primeira sequência autoclivável; (ii) a região variável de uma cadeia de TCR-B heteróloga; e (ili) uma porção do terminal N da cadeia de TCR-B endógena, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é integrada no éxon 1 do gene de TRAC e a segunda sequência nucleico é integrada no éxon 1 do gene de TRBC.
102. Método de tratamento do câncer em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende: a) a modificação das células T do indivíduo ao usar o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 63 ou 69 a 99 para expressar um receptor de células T específico de antígeno, em que o receptor de células T reconhece um antígeno específico de tumor no indivíduo.
103. Método de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que as células T do indivíduo são modificadas in vivo.
104. Método de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que compreende a) a obtenção de células T do indivíduo; b) a modificação das células T ao usar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 63 ou 69 a 99 para expressar um receptor de células T específico de antígeno, em que o receptor de células T reconhece um antígeno específico de tumor no indivíduo; e c) a administração das células T modificadas ao indivíduo.
BR112020008201-5A 2017-10-27 2018-10-29 substituição-alvo de receptores de células t endógenos BR112020008201A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762578153P 2017-10-27 2017-10-27
US62/578,153 2017-10-27
PCT/US2018/058026 WO2019084552A1 (en) 2017-10-27 2018-10-29 TARGETED REPLACEMENT OF ENDOGENIC T CELL RECEPTORS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020008201A2 true BR112020008201A2 (pt) 2020-10-06

Family

ID=66247037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020008201-5A BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2018-10-29 substituição-alvo de receptores de células t endógenos

Country Status (13)

Country Link
US (5) US11033584B2 (pt)
EP (1) EP3700924A4 (pt)
JP (2) JP7101419B2 (pt)
KR (2) KR102503130B1 (pt)
CN (1) CN111655719A (pt)
AU (2) AU2018355587B2 (pt)
BR (1) BR112020008201A2 (pt)
CA (1) CA3080415A1 (pt)
EA (1) EA202091056A1 (pt)
IL (2) IL274179B2 (pt)
MX (1) MX2020004325A (pt)
SG (1) SG11202003798TA (pt)
WO (1) WO2019084552A1 (pt)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2020-10-06 The Regents Of The University Of California substituição-alvo de receptores de células t endógenos
AU2018357861A1 (en) 2017-10-30 2020-06-11 Adoc Ssf, Llc Primary cell gene editing
AU2019248644A1 (en) 2018-04-02 2020-10-22 Adoc Ssf, Llc Peptide-MHC compacts
WO2019226998A1 (en) * 2018-05-25 2019-11-28 The Regents Of The University Of California Genetic engineering of endogenous proteins
AU2020221229A1 (en) 2019-02-12 2021-09-02 Adoc Ssf, Llc Compositions and methods for identification of antigen specific T cells
AU2020325225A1 (en) * 2019-08-05 2022-03-24 Cartherics Pty. Ltd. Immune cells expressing modified cell receptors and methods of making
EP3808765A1 (en) * 2019-10-14 2021-04-21 ETH Zurich Cell line for tcr discovery and engineering and methods of use thereof
JPWO2021095847A1 (pt) * 2019-11-14 2021-05-20
WO2021183884A1 (en) * 2020-03-13 2021-09-16 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modifying a target nucleic acid
CA3188371A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 Felipe Bedoya Vector-free process for manufacture of engineered immune cells
EP4221725A1 (en) * 2020-10-02 2023-08-09 The Regents Of The University Of California Dna constructs for improved t cell immunotherapy of cancer
WO2023154968A2 (en) * 2022-02-14 2023-08-17 The Regents Of The University Of California Dna constructs for improved t cell immunotherapy
WO2024059618A2 (en) 2022-09-13 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
WO2024059824A2 (en) 2022-09-16 2024-03-21 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells with combination gene perturbations

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
CA2407695C (en) 2000-04-28 2015-03-31 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for binding an exogenous molecule to cellular chromatin
GB0124391D0 (en) 2001-10-11 2001-11-28 Gene Expression Technologies L Control of gene expression
US20050136040A1 (en) 2001-10-11 2005-06-23 Imperial College Innovations Limited Control of gene expression using a complex of an oligonucleotide and a regulatory peptide
AU2003218382B2 (en) 2002-03-21 2007-12-13 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
ITMI20030821A1 (it) 2003-04-18 2004-10-19 Internat Ct For Genetic En Gineering And Polipeptidi chimerici e loro uso.
KR20060054196A (ko) 2003-06-10 2006-05-22 주식회사 툴젠 전달가능한 ｄｎａ-결합 단백질
US8133733B2 (en) 2003-10-24 2012-03-13 Gencia Corporation Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues
US20070254291A1 (en) 2004-06-14 2007-11-01 Xiaoxia Cui Gene Targeting in Eukaryotic Cells by Group II Intron Ribonucleoprotein Particles
US10022457B2 (en) 2005-08-05 2018-07-17 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization and enhance function of cells
PL2325332T3 (pl) 2005-08-26 2013-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Zastosowanie genów związanych z CRISPR (genów CAS)
CN105296527B (zh) 2006-08-11 2020-11-27 陶氏益农公司 锌指核酸酶介导的同源重组
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US9221886B2 (en) 2009-04-28 2015-12-29 President And Fellows Of Harvard College Supercharged proteins for cell penetration
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
US8956828B2 (en) * 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
US8771985B2 (en) 2010-04-26 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases
US8876458B2 (en) 2011-01-25 2014-11-04 United Technologies Corporation Blade outer air seal assembly and support
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
US20130236504A1 (en) 2012-03-06 2013-09-12 Medical University Of South Carolina Delivery System for Enhancing Drug Efficacy
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
CN105441440B (zh) 2012-10-23 2020-12-15 基因工具股份有限公司 包含特异于靶dna的向导rna和cas蛋白质编码核酸或cas蛋白质的用于切割靶dna的组合物及其用途
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
EP2931899A1 (en) 2012-12-12 2015-10-21 The Broad Institute, Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions, methods, knock out libraries and applications thereof
EP4234696A3 (en) 2012-12-12 2023-09-06 The Broad Institute Inc. Crispr-cas component systems, methods and compositions for sequence manipulation
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
RU2766685C2 (ru) 2012-12-17 2022-03-15 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
CN112301024A (zh) 2013-03-15 2021-02-02 通用医疗公司 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性
CN105452483B (zh) * 2013-03-15 2019-01-11 适应生物技术公司 复杂基因集合中的独特标记的重排适应性免疫受体基因
WO2014153470A2 (en) * 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
US20160053274A1 (en) 2013-04-02 2016-02-25 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
US9890393B2 (en) * 2013-05-29 2018-02-13 Cellectis Methods for engineering T cells for immunotherapy by using RNA-guided CAS nuclease system
US9737604B2 (en) 2013-09-06 2017-08-22 President And Fellows Of Harvard College Use of cationic lipids to deliver CAS9
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
CA2926094C (en) 2013-10-17 2024-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering
WO2015073867A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Engineering neural stem cells using homologous recombination
AU2014361781B2 (en) 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
WO2015089486A2 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
MX2016007327A (es) 2013-12-12 2017-03-06 Broad Inst Inc Suministro, uso y aplicaciones terapeuticas de sistemas y composiciones crispr-cas para dirigirlos a trastornos y enfermedades usando componentes para suministro de particulas.
JP2016539653A (ja) 2013-12-13 2016-12-22 セレクティス 微小藻類のゲノム操作のためのＣａｓ９ヌクレアーゼプラットフォーム
MX2016009771A (es) 2014-01-31 2016-11-14 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para la produccion y administracion de acido nucleico.
WO2015115903A1 (en) 2014-02-03 2015-08-06 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Site-specific dna break-induced genome editing using engineered nucleases
EP3800248A3 (en) 2014-04-18 2021-08-04 Editas Medicine, Inc. Crispr-cas-related methods, compositions and components for cancer immunotherapy
US10570418B2 (en) 2014-09-02 2020-02-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification
BR112017005245A2 (pt) * 2014-09-19 2017-12-12 Regeneron Pharma animal não humano geneticamente modificado, métodos para produzir célula t, hibridoma de célula t, um ácido nucleico, um anticorpo específico, uma célula humana, um animal não humano geneticamente modificado e para induzir uma resposta imunológica, célula, hibridoma de célula t, ácido nucleico, anticorpo específico, receptor de antígeno quimérico, embrião não humano, locus de um receptor de antígeno quimérico, e, composição de ácidos nucleicos.
WO2016049251A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 The Broad Institute Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for modeling mutations in leukocytes
CN113930455A (zh) 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
JP6879910B2 (ja) 2014-10-31 2021-06-02 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃａｒｔ細胞における遺伝子発現の改変およびその使用
WO2016097751A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 The University Of Bath Method of cas9 mediated genome engineering
CN114642735A (zh) 2015-01-21 2022-06-21 菲泽尔克斯公司 用于将治疗剂和诊断剂递送到细胞中的方法、组合物和***
JP6886404B2 (ja) 2015-01-30 2021-06-16 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 初代造血細胞におけるタンパク質送達
WO2016135559A2 (en) 2015-02-23 2016-09-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of human genetic diseases including hemoglobinopathies
WO2016172359A2 (en) 2015-04-24 2016-10-27 The Regents Of The University Of California Systems for detecting, monitoring or treating diseases or conditions using engineered cells and methods for making and using them
CA2986060A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Valerie Odegard Composition and methods for regulating inhibitory interactions in genetically engineered cells
JP2018518181A (ja) 2015-06-17 2018-07-12 ザ ユーエービー リサーチ ファンデーション 血液細胞系列の細胞に機能的ポリペプチドを導入するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体
WO2016205703A1 (en) 2015-06-17 2016-12-22 The Uab Research Foundation Crispr/cas9 complex for genomic editing
US20170000743A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Delivery of Gene Editing Tools Using Polymeric Vesicles
CN108024544B (zh) 2015-07-13 2022-04-29 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于核酸酶介导的基因组工程化的递送方法及组合物
US9512446B1 (en) 2015-08-28 2016-12-06 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases
WO2017035659A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 The Hospital For Sick Children Method and compositions for removing duplicated copy number variations (cnvs) for genetic disorders and related uses
EP3347374A1 (en) * 2015-09-09 2018-07-18 Immune Design Corp. Ny-eso-1 specific tcrs and methods of use thereof
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
WO2017058751A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 North Carolina State University Methods and compositions for sequence specific antimicrobials
DK3359660T3 (en) * 2015-10-05 2020-02-17 Prec Biosciences Inc Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene
JP6816133B2 (ja) * 2015-10-05 2021-01-20 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． 改変ヒトｔ細胞受容体アルファ定常領域遺伝子を含む遺伝子改変細胞
EP3365269A4 (en) 2015-10-19 2019-06-19 The Methodist Hospital DISTRIBUTION, BY MEMBRANE DEFORMATION, FROM CRISPR-CAS9 TO DIFFICULT CELLS TO BE TRANSFERRED
WO2017070056A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for high throughput single cell genetic manipulation
WO2017070429A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Regents Of The University Of Minnesota Methods involving editing polynucleotides that encode t cell receptor
AU2016349504B2 (en) 2015-11-04 2023-02-09 Fate Therapeutics, Inc. Genomic engineering of pluripotent cells
CA3005968A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 The Regents Of The University Of California Tracking and manipulating cellular rna via nuclear delivery of crispr/cas9
JP7128741B2 (ja) * 2015-12-18 2022-08-31 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｔ細胞受容体の標的化破壊
US11827899B2 (en) 2015-12-30 2023-11-28 Avectas Limited Vector-free delivery of gene editing proteins and compositions to cells and tissues
WO2017156484A1 (en) * 2016-03-11 2017-09-14 Bluebird Bio, Inc. Genome edited immune effector cells
WO2017177137A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptor t cell compositions
CN109121413A (zh) 2016-04-14 2019-01-01 弗莱德哈钦森癌症研究中心 使用靶向核酸纳米载体编程治疗性细胞的组合物和方法
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
KR20240000616A (ko) * 2016-04-15 2024-01-02 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 유전자이식 t 세포 및 키메라 항원 수용체 t 세포 조성물 및 관련 방법
WO2017189336A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for genomic editing
EP4166660A1 (en) 2016-04-29 2023-04-19 BASF Plant Science Company GmbH Improved methods for modification of target nucleic acids using fused guide rna - donor molecules
US20190136224A1 (en) 2016-05-31 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Hydrodynamically Controlled Electric Fields for High Throughput Transformation & High Throughput Parallel Transformation Platform
WO2017220527A1 (en) 2016-06-20 2017-12-28 Glycotope Gmbh Means and methods for modifying multiple alleles
US20200283743A1 (en) 2016-08-17 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
WO2018039084A1 (en) 2016-08-20 2018-03-01 The Regents Of The University Of California High-throughput system and method for the temporary permeablization of cells
EP3526235A4 (en) 2016-10-12 2021-03-10 Feldan Bio Inc. RATIONALLY DESIGNED SYNTHETIC PEPTIDE SHUTTLE ACTIVE INGREDIENTS FOR ADMINISTRATION OF POLYPEPTIDE FREIGHT FROM AN EXTRACELLULAR ROOM TO THE CYTOSOL AND / OR THE CORE OF AN EUCARYOTIC TARGET CELL, USES TOGETHER THEREFORE, AND KITS IN THE PROCEDURE
WO2018073393A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Tal-effector nuclease (talen) -modified allogenic cells suitable for therapy
WO2018073391A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy
CA3041554A1 (en) 2016-11-18 2018-05-24 Christopher Bradley Massively multiplexed homologous template repair for whole-genome replacement
CN110582302A (zh) 2016-12-14 2019-12-17 利甘达尔股份有限公司 用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法
AU2017388874A1 (en) 2016-12-30 2019-07-18 Berkeley Lights, Inc. Methods for selection and generation of genome edited T cells
CA3067382A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 The Regents Of The University Of California Targeted non-viral dna insertions
BR112020008201A2 (pt) 2017-10-27 2020-10-06 The Regents Of The University Of California substituição-alvo de receptores de células t endógenos
AU2018357861A1 (en) * 2017-10-30 2020-06-11 Adoc Ssf, Llc Primary cell gene editing

Also Published As

Publication number Publication date
JP7101419B2 (ja) 2022-07-15
KR20230034416A (ko) 2023-03-09
IL274179B1 (en) 2023-10-01
JP2021500889A (ja) 2021-01-14
EP3700924A1 (en) 2020-09-02
US11331346B2 (en) 2022-05-17
SG11202003798TA (en) 2020-05-28
US11083753B1 (en) 2021-08-10
AU2018355587A1 (en) 2020-06-18
US20210353678A1 (en) 2021-11-18
JP2022137112A (ja) 2022-09-21
KR20200088348A (ko) 2020-07-22
MX2020004325A (es) 2020-11-09
EA202091056A1 (ru) 2020-09-17
CA3080415A1 (en) 2019-05-02
EP3700924A4 (en) 2021-11-03
IL305485A (en) 2023-10-01
US20210228631A1 (en) 2021-07-29
WO2019084552A1 (en) 2019-05-02
US11590171B2 (en) 2023-02-28
US20220241336A1 (en) 2022-08-04
IL274179A (en) 2020-06-30
KR102503130B1 (ko) 2023-02-24
US20230310502A1 (en) 2023-10-05
US11033584B2 (en) 2021-06-15
IL274179B2 (en) 2024-02-01
AU2018355587B2 (en) 2023-02-02
AU2023202582A1 (en) 2023-05-18
CN111655719A (zh) 2020-09-11
US20200000851A1 (en) 2020-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11331346B2 (en) Targeted replacement of endogenous T cell receptors
JP2018518182A (ja) ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体
US11760983B2 (en) Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
CN112040986A (zh) 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
JP2020501612A (ja) 増大したｈＡＴファミリートランスポゾン媒介遺伝子導入ならびに関連する組成物、システムおよび方法
CN112040987A (zh) 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
JP2022519595A (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子標的の組み合わせ
US20210130817A1 (en) Gene Editing System and Gene Editing Method
AU2021216418A1 (en) Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes
US11278570B2 (en) Enhanced hAT family transposon-mediated gene transfer and associated compositions, systems, and methods
WO2020160489A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
Mueller et al. CRISPR-mediated insertion of a chimeric antigen receptor produces nonviral T cell products capable of inducing solid tumor regression
Mueller et al. Production and characterization of virus-free, CRISPR-CAR T cells capable of inducing solid tumor regression
WO2022266538A2 (en) Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06G Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B12B Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette]