JP2018518182A - ゲノム編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ９複合体 - Google Patents

Abstract

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びその使用方法を本明細書に提供する。本明細書に提供する複合体を使用する方法は、改変の効率を増加させ、細胞生存率を増加させる及び／または細胞におけるＨＤＲ対ＮＨＥＪの比率を増加させる。これらの複合体及び方法は、治療目的のために使用して、例えば、細胞内の突然変異を矯正することができ、ここで、突然変異は、疾患または障害に関連する。本明細書に記載の複合体では、組換え部位特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、任意の細菌種由来のＣａｓタンパク質またはその機能的断片であることができる。【選択図】図１０

Description

本出願は、２０１５年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／１８１，１３８号、及び２０１５年１２月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／２６６，３１６号の利益を主張し、これらは両方ともそれらの全体がこの参照により本明細書に組み込まれる。

規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）システム（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム）は、哺乳類細胞における所望のゲノム部位での遺伝子編集のために使用される。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ゲノム内の標的部位にハイブリッド形成するガイドＲＮＡと複合体化することによりゲノム部位を標的とする。これにより、ゲノムＤＮＡの非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向性修復（ＨＤＲ）のいずれかを二本鎖または一本鎖ＤＮＡ修復鋳型を介して開始する二本鎖切断がもたらされる。しかしながら、ＨＤＲを介したゲノム部位の修復は非効率的である。

細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体または細胞の集団を本明細書に提供する。複合体は、突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。複合体は、ガイドＲＮＡの第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼをさらに含む。複合体は、ターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）も含む。

細胞または細胞の集団におけるターゲットＤＮＡの部位特異的改変の方法も提供する。該方法は、細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体を導入することを含み、複合体は、細胞へと相同配向性修復（ＨＤＲ）及びｓｓＯＤＮのターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入される。該方法は、矯正された細胞における高い細胞生存率をさらに提供する。

対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法をさらに提供する。該方法は、対象から得られた細胞の集団へと、ヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異を矯正するための複合体を、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入して、ヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異を矯正すること、及びその矯正された細胞を対象へと移植することを含む。

図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ患者誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化がＳＣＩＤ表現型を再現することを示す。図１Ａ及び１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ ｉＰＳＣ（対照）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）を、ＯＰ９間質細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、その後、ＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞分化は、対照と比較して欠如していた；ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングルポジティブ（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞は検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列の特定中の初期事象を制御する重要な遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。ＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して示される。 図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ患者誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化がＳＣＩＤ表現型を再現することを示す。図１Ａ及び１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ ｉＰＳＣ（対照）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）を、ＯＰ９間質細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、その後、ＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞分化は、対照と比較して欠如していた；ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングルポジティブ（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞は検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列の特定中の初期事象を制御する重要な遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。ＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して示される。 図１Ａ〜１Ｃは、ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ患者誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化がＳＣＩＤ表現型を再現することを示す。図１Ａ及び１Ｂは、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ ｉＰＳＣ（対照）及びＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）を、ＯＰ９間質細胞上でＣＤ３４＋細胞へと分化させ、その後、ＯＰ９−ＤＬ４単層上でＴ細胞へと分化させた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣからのＴ細胞分化は、対照と比較して欠如していた；ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングルポジティブ（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞は検出されなかった（図１Ｂ）。図１Ｃは、Ｔ細胞系列の特定中の初期事象を制御する重要な遺伝子の転写物に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。ＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して示される。 ＢＣＬ２が、ＪＡＫ３欠損、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ由来細胞においてＴ細胞発達異常を部分的に救助することを示す。ＪＡＫ３欠損、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のアポトーシスを、ＪＡＫ３ ＷＴ対照と比較して示す。アネキシンＶ陽性細胞を、Ｔ細胞誘導１０日目（ＴＤ１０）及び１７日目（ＴＤ１７）で分析した。４つの独立した実験を、対照ＪＡＫ３ ＷＴ細胞（対照）を用いて行い、５つの独立した実験を、ＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）を用いて行った。^＊Ｐ＜０．００５。 ＢＣＬ２が、ＪＡＫ３欠損、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ由来細胞においてＴ細胞発達異常を部分的に救助することを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ（対照）及びＪＡＫ３欠損細胞（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）からの２つの株（１及び２）における抗アポトーシス性ＢＣＬ２及びアポトーシス促進性ＢＡＸ発現に関するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイの結果を示す。ＮＤ、決定されず（有意でないＪＡＫ３ ｑＰＣＲシグナルのため）。ＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ発現に対して示される。 ＢＣＬ２が、ＪＡＫ３欠損、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ由来細胞においてＴ細胞発達異常を部分的に救助することを示す。ＮＫ（ＣＤ１６＋５６＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋）発生及びＤＰ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）からＳＰ（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）Ｔ細胞成熟に及ぼす効果を評価するためにＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルスで形質導入されたＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞のフローサイトメトリーを示す。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおいてＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ突然変異の矯正を向上したことを示す。ＪＡＫ３遺伝子座において二本鎖切断を誘導するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するゲノム改変のための戦略及び相同配向性修復のための鋳型を示す。上のライン、ＪＡＫ３遺伝子の構造。白四角、エクソン。アスタリスク、Ｃ１８３７Ｔ突然変異。矢印、ガイドＲＮＡ。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおいてＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ突然変異の矯正を向上したことを示す。上は、相同組換えを実証するＰＣＲ分析を示す；５’及び３’分析のためのプライマーを示す。（左下）ＪＡＫ３ ＷＴ（対照）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）、及び矯正された（ＪＡＫ３矯正）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３ ｍＲＮＡ発現を実証するＲＴ−ＰＣＲ分析。（右下）ＪＡＫ３ ＷＴ（対照）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ）、及び矯正された（ＪＡＫ３矯正）Ｔ細胞におけるＪＡＫ３タンパク質発現を実証するウェスタンブロット分析。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおいてＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ突然変異の矯正を向上したことを示す。ガイドＲＮＡのターゲティング効率の概要を提示する。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が、患者特異的ｉＰＳＣにおいてＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ突然変異の矯正を向上したことを示す。親ＪＡＫ３ ｉＰＳＣ（左）、ヘテロ接合性矯正（中央）及びホモ接合性矯正ｉＰＳＣ（右）からのＰＣＲアンプリコンのサンガーシーケンシング。２つのヘテロ接合性クローンは、ｇＲＮＡ２＋野生型Ｃａｓ９を用いて矯正され、ホモ接合性クローンは、ｇＲＮＡ１＋ｇＲＮＡ２＋ニッカーゼＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）を用いて矯正された。 ＪＡＫ３矯正患者ｉＰＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化が、成熟Ｔ細胞の表現型の及び機能的特徴を有するＴ細胞を産生することを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ（対照、ｎ＝３）、ＪＡＫ３欠損（ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ、ｎ＝５）及びＪＡＫ３矯正（ＪＡＫ３矯正、ｎ＝６）Ｔ細胞におけるＴ細胞発達マーカーの発現を示す。細胞を、指定の抗体で染色し、フローサイトメトリーによりＴ細胞誘導１４日目、２１日目、２８日目及び３５日目（ＴＤ１４、２１、２８及び３５）で分析した。 ＪＡＫ３矯正患者ｉＰＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化が、成熟Ｔ細胞の表現型の及び機能的特徴を有するＴ細胞を産生することを示す。ＪＡＫ３矯正Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβ分析を示す。非常に多様なレパートリーのＴＣＲ Ｖβを、矯正されたＳＣＩＤ患者ｉＰＳＣに由来するＴ細胞において表す。 ＪＡＫ３矯正患者ｉＰＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化が、成熟Ｔ細胞の表現型の及び機能的特徴を有するＴ細胞を産生することを示す。ＪＡＫ３矯正Ｔ細胞におけるＴ細胞活性化を実証するフローサイトメトリーを示す。ＪＡＫ３ ＷＴ（対照）及びＪＡＫ３矯正ｉＰＳＣに由来するＴ細胞を、抗ＣＤ３／２８ビーズで３日間刺激してから活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９を分析した。データは、ＣＤ３＋集団でゲートした。 図５Ａ〜５Ｃは、ヒト骨髄間質細胞（ｈＭＳＣ）との共培養によるｈｉＰＳＣからのＣＤ３４＋ＨＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を示す。ヒトｉＰＳＣを、ｈＭＳＣ上で１８日間培養してから、造血マーカー、ＣＤ３４及びＣＤ４３について分析した（図Ａ）。ＣＤ３４＋細胞を、ビーズ上で精製し、Ｔ細胞（図Ｂ）、赤血球系細胞及び骨髄系細胞（図Ｃ）へと分化させた。Ｔ細胞を生成するために、精製ＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４細胞上に３〜４週間プレーティングした。骨髄系細胞及び赤血球系細胞を生成するためのＣＦＣアッセイのために、精製ＣＤ３４＋細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４クラシック培地にプレーティングした。これらのデータは、ｈｉＰＳＣが、ｈＭＳＣ上での共培養の後に、多能性ＨＳＣへと効率的に分化することができることを実証した。 図６Ａ〜６Ｃは、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞をｈＭＳＣ−ＤＬ４と培養することによるＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を示す。ＣＤ７＋Ｔ祖先細胞を生成するために、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を、ｈＭＳＣ−ＤＬ４上で３〜４週間にわたって共培養した（図６Ａ）。図６ＡからのＣＤ７＋細胞を磁性ビーズ上で精製し、ＯＰ９−ＤＬ４上で共培養したとき、完全成熟ＣＤ４＋／ＣＤ８＋／ＣＤ３＋／ＴＣＲ−αβ＋細胞が、１０日以内に産生された（図Ｂ及びＣ）。これらのデータは、ｈｉＰＳＣがＣＤ７＋リンパ球の祖先へとｈＭＳＣ−ＤＬ４上での共培養後に効率的に分化することができることを実証する。 ｈｉＰＳＣからのγδＴ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成を示す。ヒトｉＰＳＣを、２Ａ−ＧＦＰ ｃＤＮＡ断片と連結する予め再編成したヒトＶ γδ１ ｃＤＮＡを有するレンチウイルスベクターで形質導入した。ＯＰ９と１８日間共培養した後、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を磁性ビーズ上で精製した。これらの細胞を、その後、ＯＰ９−ＤＬ４細胞上にＴ細胞分化のためにプレーティングした。細胞を３２日目に回収し、Ｔ細胞表面マーカーをＦＡＣＳにより分析した。ＧＦＰ＋集団は、Ｖδ１−２Ａ−ＧＦＰレンチウイルス形質導入細胞を表す。これらのＧＦＰ陽性細胞は高い割合（％）で、Ｖδ１（６６％）を発現した。ＧＦＰ陰性細胞は低い割合（％）でＶδ１（１％）を発現した。これらの結果は、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＶδ Ｔ細胞を、遺伝子改変したｉＰＳＣから効率的に産生することができることを実証する。腫瘍抗原に対して特異的な組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＶδ Ｔ細胞の産生は、多くのタイプの癌に対して強力な細胞療法を提供する。 ガイドＲＮＡ、改変Ｃａｓ９及び一本鎖オリゴヌクレオチドドナー配列（ｓｓＯＤＮ）を含む矯正複合体が、鎌状赤血球突然変異を矯正することができることを示す。複合体を鎌状ｉＰＳＣへとヌクレオポレーションにより導入し、２日後、ゲノムＤＮＡをデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し、配列決定した。６５％を超える細胞が、少なくとも１つの矯正された遺伝子を含有した。結果を以下のように確認した。矯正複合体の導入の２日後、細胞を培養皿にプレーティングし、４３の個別のｉＰＳＣコロニーを単離した。ゲノムＤＮＡを、これらのコロニーから単離し、ベータ−グロブリン遺伝子を配列決定した。６５パーセントのコロニーが少なくとも１つの矯正されたベータ−グロブリン遺伝子を含有した（ＳがＡに矯正された）。 鎌状赤血球矯正複合体（ｇＲＮＡ−改変組換えＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）の患者初代骨髄ＣＤ３４＋細胞への導入が、鎌状赤血球突然変異を矯正することができることを示す。１２日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の後、ＤＮＡをデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し、配列決定した。おおよそ等量のｂｅｔａＡ及びｂｅｔａＳ ｍＲＮＡが観察された。 図９の矯正された鎌状赤血球患者ＣＤ３４＋細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した赤血球細胞の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルであって、約１：３のＨｂＡ（正常ヘモグロビン）対ＨｂＳ（鎌状赤血球突然変異を有するヘモグロビン）比率を示しており、これは、鎌状化を阻害し、鎌状赤血球貧血症を処置するのに十分である。 操作された正荷電Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ（ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ）が、ヒト患者ｉＰＳＣにおいて鎌状突然変異を効率的に矯正することを示す。野生型Ｃａｓ９（Ｃａｓ９ＷＴ）ＲＮＰ及び８つの操作された正荷電（ＥｐｃＣａｓ９）ＲＮＰを、矯正ｓｓＯＤＮとともにヒト鎌状ｉＰＳＣへと同時にヌクレオポレートした。プールした細胞における鎌状矯正効率を、サンガーシーケンシングによりヌクレオフェクションの２日後に決定した。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 ヒト鎌状ｉＰＳＣ集団におけるオンターゲット改変のディープシーケンシングの結果を示す。Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ、Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ、または４つのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートしたヒト鎌状ｉＰＳＣのオンターゲットディープシーケンシング分析を示す。黒いバーは、矯正された塩基を示し、黒いバーの下のスペースは、鎌状赤血球突然変異を示す。陰性対照及びｓｓＯＤＮ単独は両方とも鎌状赤血球突然変異のみを示す。すべてのｉＰＳＣ試料は、鎌状突然変異の近くにＳＮＰも含有する（右手側のカラム）。 ＴＡＴ−ＣＡｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ ＲＮＰが、オンターゲット挿入欠失を抑制することを示す。ヒト鎌状ｉＰＳＣを、矯正ｓｓＯＤＮを伴う（＋ｓｓＯＤＮ）または伴わない（−ｓｓＯＤＮ）Ｃａｓ９ＷＴ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ ＲＮＰでヌクレオポレートした。挿入欠失及び矯正効率を、サンガーシーケンシングによりヌクレオポレーションの２日後に分析した。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰがヒト鎌状ｉＰＳＣにおいてオンターゲット挿入欠失を抑制することを示す。ヒト鎌状ｉＰＳＣを、矯正ｓｓＯＤＮを伴うまたは伴わないＣａｓ９ＷＴ及び５つのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰでヌクレオポレートした。挿入欠失及び矯正効率を、サンガーシーケンシングによりヌクレオポレーションの２日後に分析した。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰが、ヒト鎌状ｉＰＳＣにおけるヌクレオポレーション後の細胞生存を向上させることを示す。ヒト鎌状ｉＰＳＣを、矯正ｓｓＯＤＮを伴うまたは伴わないＣａｓ９ＷＴ ＲＮＰ及び７つのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰでヌクレオポレートした。細胞生存を、光顕微鏡検査によりヌクレオフェクションの２日後に評価した。 図１６Ａ及び１６Ｂは、ヒトｉＰＳＣにおける鎌状矯正のためのｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ比率を示す。矯正ｓｓＯＤＮ及びＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ／Ｔ２ ＲＮＰを、０、０．２、０．５、１．０、１．１５、１．３５、１．５及び２．０のモル比で鎌状赤血球患者ｉＰＳＣへとヌクレオポレートした。（１：１．３５のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ：Ｔ２ ｇＲＮＡモル比はこれらの実験に関して固定された。例えば、下のグラフにおけるｒ＝０．５値は、０．５のｓｓＯＤＮ：１．０のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ：１．３５のＴ２ ｇＲＮＡである）。ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰのヌクレオポレーションの４８時間後に、鎌状矯正を、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（図１６Ａ）及びサンガーシーケンシング（図１６Ｂ）により定量した。矯正率（％）（ｂｅｔａＡ／ｂｅｔａＳ対立遺伝子×１００）を、ｒ（ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ）に対してプロットした。破線のＳ時曲線を、データ点に当てはめた。（Ｂ）矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 ヒトｉＰＳＣにおける鎌状矯正のためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ比率を示す。１．１５または１．３５のｓｓＯＤＮモル比を伴う１：１．１５、１：１．３５及び１：１．５０のＣａｓ９−３６ＧＦＰ：ｓｇＲＮＡモル比を検査して、患者ｉＰＳＣにおける鎌状突然変異の最適な矯正効率を決定した。混合物を、ヒト鎌状ｉＰＳ細胞へとヌクレオポレートし、プールした細胞に関するサンガーシーケンシング結果を、ヌクレオフェクションの２日後に分析した。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 ヒト鎌状ｉＰＳＣのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮによる矯正を示す。ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオフェクトしたプールしたヒト鎌状ｉＰＳ細胞のサンガーシーケンシング分析を行った。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ誘導性ＤＳＢの位置を示す。 ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ及びゆらぎｓｓＯＤＮを用いたヒトｉＰＳＣの矯正を示す。ヒト鎌状ｉＰＳＣを、ＴＡＴ−Ｃａｓ９−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ及びゆらぎ塩基をｇＲＮＡ切断部位の近くに含有するｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした。（Ａ）Ｔ１ ｇＲＮＡ及びＴ１−ｗｂ ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートしたｉＰＳＣ集団のサンガーシーケンシングを行った。図１９Ａの左手側にある矢印は、鎌状突然変異の位置を示し、鎌状突然変異の下流に位置する３つの矢印は、ゆらぎ塩基の位置を示す。ハサミは、Ｔ１切断部位を指す。 ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ及びゆらぎｓｓＯＤＮを用いたヒトｉＰＳＣの矯正を示す。ヒト鎌状ｉＰＳＣを、ＴＡＴ−Ｃａｓ９−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ及びゆらぎ塩基をｇＲＮＡ切断部位の近くに含有するｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした。Ｔ２ ｇＲＮＡ及びＴ２−ｗｂ ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートしたｉＰＳＣ集団のサンガーシーケンシングを行った。左手側の矢印は、鎌状突然変異の位置を示し、鎌状突然変異の下流にある２つの矢印は、ゆらぎ塩基の位置を示す。ハサミは、Ｔ２切断部位を指す。 ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮで矯正された４つのｉＰＳＣクローンの全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）分析の結果を示す。オンターゲット配列分析は、鎌状矯正及びゆらぎ塩基置換を実証する。 ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮで矯正された４つのｉＰＳＣクローンの全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）分析の結果を示す。Ｔ１及びＴ２ ｓｇＲＮＡに対する相同性を有するゲノム遺伝子座のＷＧＳオフターゲット分析を示す。 鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子矯正を示す。（Ａ）ヒト鎌状骨髄ＣＤ３４＋細胞を、Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮによりヌクレオポレートした。プールした集団細胞に関する遺伝子矯正効率を、ヌクレオフェクションの６日後に分析した。矢印は、鎌状矯正（Ｔ→Ａ）の位置を示し、ハサミは、鎌状ＨＢＢ ＤＮＡ上のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ切断部位を示す。 鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子矯正を示す。赤血球系細胞分化培地における１０日間の培養の後に回収したＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰヌクレオポレート鎌状ＣＤ３４＋細胞におけるＲＴ−ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングによるｍＲＮＡ矯正。 鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子矯正を示す。Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオフェクト鎌状ＣＤ３４＋細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＲＢＣのＩＥＦゲル分析。ＨｂＦ、ＨｂＳ及びＨＢＡタンパク質を表すヒト鎌状赤血球小児患者血液ライセート（ＳＳ）及びヒト正常成体血液ライセート（ＡＡ）も、対照としてロードした。 鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子矯正を示す。Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオフェクトした鎌状ＣＤ３４＋細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏで分化したＲＢＣの質量分析。ピークは、未矯正ＨｂＳタンパク質及び矯正ＨｂＡタンパク質からのシグナルを示す。 単一のＣＤ３４＋祖先細胞に由来するコロニーの矯正を示す。ヌクレオポレートしたヒト鎌状ＣＤ３４＋細胞に由来するＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー。 単一のＣＤ３４＋祖先細胞に由来するコロニーの矯正を示す。ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮを用いたヌクレオポレーション後にヒト鎌状ＣＤ３４＋細胞から得られたコロニーの代表的なサンガーシーケンシング結果。 単一のＣＤ３４＋祖先細胞に由来するコロニーの矯正を示す。Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ、及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰプラスｓｓＯＤＮを用いたヌクレオポレーション後のコロニー生存。 表６からのディープシーケンシングデータのグラフ概略図である。 Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ標的部位近くの非特異的改変を示す。Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート鎌状ＣＤ３４＋細胞からのＢＦＵ−Ｅコロニーは、切断部位で開始するように思われない挿入欠失を含有する。「上流」と記された上の配列は、予期される切断部位の上流にある非特異的改変を表す。「下流」と記された下の配列は、予期される切断部位の下流で観察される非特異的改変を表す。矢印は、鎌状突然変異の位置を示し、ハサミは、Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰの予期される切断部位を示す。 鎌状赤血球突然変異を矯正するために放射線照射Ｃ５７ＢＩ／６マウスにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした鎌状赤血球マウス胎児肝ｃ−ｋｉｔ＋細胞を最初に移植した６週間後の血液の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分析を示す。マウス胎児肝ｃ−ｋｉｔ＋細胞は、ヒト臍帯血Ｃｄ３４＋細胞に相当する。 放射線照射Ｃ５７ＢＩ６マウスへの移植後１２週間でのＦＡＣＳ精製骨髄細胞のｄｄＰＣＲ分析を示す。ヌクレオポレーション及び移植の１２週間後、おおよそ５０％の赤血球系細胞（Ｔｅｒ１１９＋）及び骨髄系細胞（ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ＋／ＧＲ１＋）が矯正される。赤血球系細胞及び骨髄系細胞は、比較的短命である；それゆえ、これらの細胞は、移植されたＨＳＣに由来する。Ｂ及びＴ細胞における矯正レベルは、１２週間で二次移植後におおよそ５０％まで上昇することができる（合計で２４週間）。２４週間後、造血細胞のすべてではないにしても、ほとんどが長期ＨＳＣ由来であるだろう。 鎌状赤血球突然変異を矯正するためにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした細胞の初回移植の１２週間後及び二回目移植の６週間後のマウスからの血液のＩＥＦゲル分析を示す。ヒトＨｂＡは、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートしたＨＳＣの移植後のマウスにおいて産生される。

細胞のゲノム改変のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を本明細書に提供する。本明細書に提供する複合体を使用する方法は、改変の効率を増加させ、細胞生存率を増加させる及び／または細胞におけるＨＤＲ対ＮＨＥＪの比率を増加させる。これらの複合体及び方法は、治療目的のために使用して、例えば、細胞内の突然変異を矯正することができ、ここで、突然変異は、疾患または障害に関連する。

細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体であって、ａ．突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；ｂ．ガイドＲＮＡの第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及びｃ．ターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体を本明細書に提供する。

本明細書に記載のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、組換え部位特異的ヌクレアーゼ及びドナーヌクレオチドを含む複合体は天然に生じないことが理解されたい。しかしながら、該複合体は、効率的及び有効に細胞を改変するために求められる立体配置及び化学量論に必要な要素を提供する。ｇＲＮＡ分子は、部位特異的ヌクレアーゼに結合し、ヌクレアーゼをターゲットＤＮＡ内の特定の位置に標的化する。ｇＲＮＡは、突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載の複合体は、１つまたは２つの別々のｇＲＮＡを含むことができる。それゆえ、ガイドＲＮＡという用語は、単一ガイドＲＮＡ及び２重のガイドＲＮＡの両方を含む。鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異を矯正するために使用することができるガイド配列の例は、本明細書にてＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣ（配列番号１）と記載される。Ｃａｓ９結合のためのステムループを含むガイド配列の例は、本明細書にてＧＴＡＡＣＧＧＣＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号２）として提供される。配列番号２の５’Ｇは、Ｔ７によりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写中に付加されることに留意されたい。

本明細書に記載の複合体では、組換え部位特異的ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、任意の細菌種由来のＣａｓタンパク質またはその機能的断片であることができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質またはその機能的断片であることができる。本明細書で用いるとき、「Ｃａｓ９」という用語は、第ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムをコードする任意の細菌種に存在するＣａｓ９タンパク質またはその断片を意味する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：４６７−４７７（２０１１）、付記事項を含む、を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来し得る。完全長Ｃａｓ９は、認識ドメイン及び２つのヌクレアーゼドメイン（それぞれ、ＨＮＨ及びＲｕｖＣ）を含むエンドヌクレアーゼである。アミノ酸配列では、ＨＮＨは、直線的に連続している一方で、ＲｕｖＣは、３つの領域に分かれており、１つは認識ドメインの左、他の２つは、ＨＮＨドメインに隣接する認識ドメインの右である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９は、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドＤＮＡ配列にハイブリッド形成するガイドＲＮＡと相互作用することにより細胞内のゲノム部位を標的とする。これは、ターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正するドナーヌクレオチド、例えば、ｓｓＯＤＮまたは二本鎖ＤＮＡ構築物によりＨＤＲを介して修復される二本鎖切断をもたらす。

本明細書に提供する複合体では、ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０であることができる。例えば、ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比は、約１：１：１、１．１：１：１、１：１：１．１５、１：１：１．２５、１：１：１．３０；１：１：１．３５；１：１：１．４０；１：１：１．５０、１．２：１：１、１．３：１：１．１．４：１：１、１．５：１：１、１．５：１：１．１５、１．５：１：１．２５、１．５：１：１．３５；１．５：１：１．４０、１．５：１：１．４５；１．５：１：１．５０；１．５：１：１．５５；１．５：１：１．６０；１．５：１：１．６５；１．５：１：１．７０；１．５：１：１．７５；１．５：１：１．８０；１．５：１：１．８５；１．５：１：１．９０；１．５：１：１．９５；１．５：１：２．０またはこれらの比率間の任意の比率であることができる。これらのモル比を有する複合体は、本明細書に記載の任意の方法において使用することができる。細胞または細胞の集団に複合体を導入する前に複合体を調製するための方法は、実施例に記載する。

本明細書で用いるとき、超荷電タンパク質は、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する超正荷電タンパク質であることができる。例えば、超正荷電タンパク質は、約＋５〜約＋４０の全体的な正電荷を有する超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることができる。例えば、全体的な正電荷は、約＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、＋１５、＋１６、＋１７、＋１８、＋１９、＋２０、＋２１、＋２２、＋２３、＋２４、＋２５、＋２６、＋２７、＋２８、＋２９、＋３０、＋３１、＋３２、＋３３、＋３４、＋３５、＋３６、＋３７、＋３８、＋３９または＋４０であることができる。

超荷電タンパク質は、ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結することができる。超荷電タンパク質は、ヌクレアーゼに必ずしも共有結合することなく、ヌクレアーゼと会合することができることも企図される。超荷電タンパク質の例は、超正荷電ＧＦＰ、例えば、＋３６ＧＦＰである。＋３６ＧＦＰは、Ｃａｓ９またはその機能的断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結することができる。例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ，ｓｉＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＰＮＡＳ １０６（１５）：６１１１−６１１６を参照されたい。Ｃａｓ９のカルボキシ末端に作動可能に連結した＋３６ＧＦＰを含むポリペプチドの例を、配列番号３として本明細書に提供する。

ヌクレアーゼはまた、超荷電タンパク質及び１つまたは複数の正荷電ペプチドに作動可能に連結することができる、例えば、１つまたは複数のトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドは、ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結することができる。例えば、非限定的に、超正荷電タンパク質は、ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結することができ、１つまたは複数のＴＡＴペプチド（例えば、１Ｘ ＴＡＴ、２Ｘ ＴＡＴ、３Ｘ ＴＡＴ、４Ｘ ＴＡＴ等）は、ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結することができる。ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したＴＡＴペプチド及びヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結した超正荷電ＧＦＰを含むポリペプチドの例を、配列番号４として本明細書に提供する。配列番号３または配列番号４に対して少なくとも約７５％同一であるポリペプチド配列も提供する。例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％またはこの間の任意の百分率であるポリペプチド配列も提供する。

ヌクレアーゼはまた、超荷電タンパク質及び１つまたは複数の負荷電ペプチドに作動可能に連結することができる、例えば、約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチド、例えば、配列番号５０は、部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結することができる。例えば、非限定的に、超正荷電タンパク質は、ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結することができ、負荷電ペプチドは、超正荷電タンパク質のカルボキシ末端に作動可能に連結することができる。

本明細書全体を通して使用するとき、組換えは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスである。相同配向性修復（ＨＤＲ）は、例えば、細胞における二本鎖切断の修復中に生じるＤＮＡ修復を表す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、ドナー分子、例えば、一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列を、標的ゲノム配列、すなわち、二本鎖切断を有するゲノム配列の修復のための鋳型として使用し、ドナーから標的ゲノム配列への遺伝情報の移入をもたらす。相同配向性修復は、標的ゲノム配列の配列の改変をもたらすことができる。例えば、ＨＤＲは、標的ゲノム配列における挿入、欠失または突然変異をもたらすことができる。ドナーポリヌクレオチドの配列の一部またはすべては、ターゲットＤＮＡへと組み入れることができる。ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が、ターゲットＤＮＡへと組み込むことも企図される。

本明細書全体を通して使用するとき、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）とは、相同性鋳型を必要とせずに破断末端を互いに直接ライゲーションすることによりＤＮＡ内の二本鎖切断を修復することを意味する（修復を誘導するために相同配列を必要とする相同配向性修復とは対照的）。

本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、ターゲットＤＮＡ内の任意の突然変異をＨＤＲにより矯正することができる。例えば、非限定的に、複合体を使用して、矯正されていないヌクレオチド配列を矯正されたヌクレオチド配列に（例えば、機能喪失突然変異、すなわち、ＳＮＰのために損なわれる標的ポリヌクレオチド配列に機能を回復させるため）ゲノムの特定の部位で置き換えることができる。これらの突然変異は、いくつかの例をあげると、自己免疫障害、遺伝性疾患、血液障害、Ｔ細胞障害、単一遺伝子障害、癌、神経変性疾患、循環器疾患または感染症に関連し得る。例えば、非限定的に、本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、鎌状赤血球症（すなわち、ヘモグロビン遺伝子における突然変異、例えば、グルタミン酸からバリンへの置換をもたらすベータ−グロブリン遺伝子のコドン６でのＧＡＧからＧＴＧへの突然変異）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）（例えば、ＪＡＫ３における突然変異）、ベータサラセミアまたはウィスコット・アルドリッチ症候群に関連する突然変異を矯正することができる。

単一の突然変異または複数の突然変異の矯正は、１つまたは複数の複合体を用いて行うことができる。本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、ゲノムの特定の部位に配列を挿入して、矯正または置換を行うのではなく、欠失を矯正することもできる。本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、細胞内で機能的ポリペプチドを発現するために、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を細胞のゲノムの特定の部位へと挿入することもできる。機能的ポリペプチドは、内因性（すなわち、細胞によって通常発現される）または細胞に対して外因性（すなわち細胞によって通常発現されない）ポリペプチドであることができる。例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列を、癌の処置のための癌特異的Ｔ細胞を生成するために、Ｔ細胞前駆体のゲノムへと挿入することができる。別の例では、本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、細胞のゲノムの特定の部位で遺伝子の活性を阻害することができる。例えば、本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、ＨＩＶ感染を処置するまたは予防するためにＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５受容体へと配列を挿入することができる。

本明細書に提供する複合体は、従来のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと比較して驚くほどに高い効率でターゲットＤＮＡを改変するまたは変えることができる。細胞の集団における変異の効率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％もしくはそれより高いまたはこれらの百分率間の任意の百分率であることができる。変異の効率は、約８０％以上であることもできる。それゆえ、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％もしくはそれより高いまたは間にある任意の百分率が変異する、細胞の集団も本明細書に提供する。例えば、鎌状赤血球症または別の障害に関連する突然変異は矯正されている。鎌状赤血球症に関連する突然変異を含む細胞の集団を本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と接触させ、突然変異が細胞の約５％において矯正される場合、改変または変異の効率は、約５％である。任意選択で、鎌状赤血球症に関連する突然変異が細胞の例えば、２７％、２８％及び２９％を含む、約３０％において矯正された細胞の集団は、鎌状赤血球症を有する対象における移植の際に、鎌状赤血球症を処置するのに十分である。任意選択で、鎌状赤血球症に関連する突然変異は、集団の細胞の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれより高いまたは間にある任意の百分率において矯正される。

高い効率でターゲットＤＮＡを変えることに加え、本明細書に提供する複合体は、複合体と接触する細胞の集団におけるＨＤＲ対ＮＨＥＪの比率を増加させることもできる。ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０〜約０．５であることができる。例えば、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５もしくはそれ未満またはこれらの比率間の任意の比率であることができる。高い効率の矯正及び高い割合のＨＤＲ対ＮＨＥＪに加えて、矯正された細胞に関する細胞生存率は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれより高い及び間にある任意の百分率であることができる。

任意の細胞（複数可）は、本明細書に記載の複合体を使用して改変するまたは誘導することができる。複合体の細胞への導入は、細胞周期依存性または細胞周期非依存性であることができる。特定の時期、例えば、Ｓ期において細胞の比率を増加させるために細胞を同期する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｓ−ｐｈａｓｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，”Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． １９（５）：３４３−３４６（１９９１））を参照されたい。改変される細胞のタイプに応じて、当業者は、細胞周期の同期が必要であるかどうかを容易に決定することができる。

細胞（複数可）は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞であることができる。細胞は、原核細胞または植物細胞であることもできる。細胞は、ヒト細胞であることができる。細胞は、生殖系列細胞、体細胞、幹細胞、前駆細胞または祖先細胞であることができる。前駆細胞は、例えば、多能性幹細胞または複数性幹細胞、例えば、造血幹細胞であることができる。本明細書全体を通して使用するとき、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞を含む。誘導多能性幹細胞の作成方法及び当該分野で公知及び実施例に記載されている。細胞は、ＣＤ３４＋細胞であることもでき、任意選択で、誘導多能性幹細胞に由来する。ＣＤ３４＋細胞は、初代ＣＤ３４＋造血祖先細胞、ＣＤ３４＋末梢血細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞及びＣＤ３４＋骨髄細胞からなる群より選択されることができる。細胞は、初代細胞、例えば、初代ＣＤ３４＋造血祖先細胞であることもできる。細胞は、癌細胞ではない細胞、腫瘍細胞ではない細胞、または形質転換細胞ではない細胞である。細胞を、望ましくない遺伝的特徴のエビデンスに関して矯正の前後でスクリーニングすることができる。本明細書に記載の複合体のいずれかを含む細胞もさらに提供する。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにあることができる。

細胞の集団におけるターゲットＤＮＡの部位特異的改変の方法であって、細胞に本明細書に記載の複合体のいずれかを導入することを含み、複合体が、細胞に、相同配向性修復（ＨＤＲ）及びドナーヌクレオチド、例えば、ｓｓＯＤＮまたは二本鎖ヌクレオチド配列のターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入される、前記方法をさらに提供する。複合体は、細胞に、ヌクレオポレーションを介して導入することができる。ヌクレオポレーションのための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｍａａｓｈｏ ｅｔ ａｌ．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ＮＫＬ，ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８４（１−２）：１３３−１４０（２００４）；及びＡｌｕｉｇｉ ｅｔ ａｌ．”Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４（２）：４５４−４６１（２００６））を参照されたく、これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に提供する方法のいくつかでは、ドナーヌクレオチド、例えば、ｓｓＯＤＮまたは二本鎖ヌクレオチド配列は、ターゲットＤＮＡへと組込み、ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する。本明細書に提供する方法では、細胞の集団におけるＨＤＲ対ＮＨＥＪの比率は、他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９送達方法に対して増加している。ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０〜約０．５であることができる。例えば、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５もしくはそれ未満またはこれらの比率間の任意の比率であることができる。本明細書に提供する方法では、ＨＤＲによる変異の効率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％もしくはそれより大きいまたはこれらの百分率間の任意の百分率であることができる。ＨＤＲによる変異の効率は、約８０％以上であることもできる。例えば、鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異を含む細胞の集団を本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体と接触させ、突然変異が細胞の約５％において矯正される場合、ＨＤＲによる変異の効率は、約５％である。細胞の集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％もしくはそれ以上またはこれらの百分率間の任意の百分率の細胞がＨＤＲを受けて、障害に関連する突然変異を矯正するように、障害を有する対象から得ることができる。いくつかの場合では、対象からの細胞の８０％超が、ＨＤＲを受けて障害に関連する突然変異を矯正するだろう。本明細書に記載の方法では、複合体の導入後、約５０％から９９％の細胞が生存する。例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％超またはこれらの百分率間の任意の百分率、の矯正された細胞が、複合体の導入後に生存する。

対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法であって、（ａ）対象から得られた細胞の集団へと、（１）突然変異を含むヘモグロビン遺伝子である細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；（２）ガイドＲＮＡの第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び（３）ターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、ヘモグロビン遺伝子内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む複合体を導入すること；及び（ｂ）矯正された細胞を対象へと移植することを含む、前記方法をさらに提供する。

対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置するための方法では、例えば、鎌状赤血球貧血症、鎌状赤血球貧血症を有する対象は、任意選択で、輸血依存性対象または少なくとも１つのサイレント梗塞を有する対象であることができる。対象は、生後約１２カ月、１１カ月、１０カ月、９カ月、８カ月、７カ月、６カ月、５カ月、４カ月、３カ月、２カ月、または１カ月未満であることもできる。幼児は鎌状赤血球症に関するスクリーニングが日常的に行われるため、幼児は疾患の症状が顕在化する前に処置することができる。本明細書に提供する方法は、障害、例えば、鎌状赤血球症を有する対象を診断することをさらに含むことができる。

上記のように、細胞は、疾患を有する対象または血縁ドナーから得ることができる。例えば、骨髄細胞は、対象から得るまたは回収することができる。骨髄回収は、骨の柔らかい中心である、髄に針を入れて幹細胞を採取することを必然的に含む。骨髄は、例えば、対象の寛骨または胸骨から回収することができる。約５００ｍｌ〜約１リットルの骨髄を、対象から得ることができる。

本明細書に提供するいずれかの方法では、細胞（複数可）は、真核細胞、例えば、ヒト細胞であることができる。細胞は、生殖系列細胞、幹細胞、前駆細胞であることができる。前駆細胞は、例えば、多能性幹細胞または造血幹細胞であることができる。本明細書全体を通して使用するとき、多能性細胞は、誘導多能性幹細胞を含む。誘導多能性幹細胞を作成する方法及び当該分野で公知及び実施例に記載されている。細胞は、ＣＤ３４＋細胞であることもできる。ＣＤ３４＋細胞は、初代ＣＤ３４＋造血祖先細胞、ＣＤ３４＋末梢血細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞及びＣＤ３４＋骨髄細胞からなる群より選択されることができる。細胞は、初代細胞、例えば、初代ＣＤ３４＋造血祖先細胞であることもできる。細胞は、癌細胞ではない細胞、腫瘍細胞ではない細胞、または形質転換細胞ではない細胞である。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにあることができる。細胞は、薬学的に許容され得る組成物中にあることもできる。

本明細書に提供する方法は、ＨＤＲで矯正された細胞を培養することをさらに含むことができる。例えば、細胞は、増殖のための条件下または矯正された細胞のＴ細胞への分化を促進する条件下で培養することができる。例えば、非限定的に、本明細書に提供する方法を使用して、誘導多能性幹細胞においてＨＤＲを介して突然変異が矯正された後、矯正された細胞を、ヒト骨髄間質細胞と共に共培養して、ＣＤ３４＋細胞を生成することができる。ＣＤ３４＋細胞を、次いで、ＣＤ３４＋細胞をＴ細胞へと分化させる条件下で培養することができる。

本明細書に提供する方法は、矯正された細胞を、適切な矯正、他の突然変異、または移植前のＮＥＪに関してスクリーニングすることをさらに含むことができる。任意選択で、細胞をスクリーニングして、１つまたは複数の矯正を有する細胞を検出することができる。

本明細書に提供する方法では、細胞は、対象へと、改変後、例えば、ＨＤＲによる突然変異の矯正後に、移植することができる。細胞は、分化を伴ってまたは伴わずに対象へと移植することができる。例えば、改変された造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄移植において投与することができ、ここでＨＳＣは、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで分化及び成熟することが可能である。あるいは、改変された細胞は、移植の前に所望の細胞集団に分化することができる。

本明細書で用いるとき、細胞を対象に移植する、導入するまたは投与することは、細胞を対象に入れることを表す。例えば、本明細書に記載の方法に従って矯正されたまたは改変されたターゲットＤＮＡ配列を含む本明細書に記載の細胞は、対象へと、移植された細胞の所望の部位での少なくとも部分的な局在化をもたらす適切な経路により移植することができる。細胞は、所望の部位に直接移植されることができ、またあるいは、移植された細胞の少なくとも一部が生存可能である対象内の所望の場所への送達をもたらす任意の適切な経路により投与されることができる。例えば、細胞は、静脈内注入を介して、全身投与されることができる。対象への投与後の細胞の生存期間は、短い場合には数時間、例えば、２４時間から数日間、長い場合には数年であることができる。

ｅｘ ｖｉｖｏ方法については、細胞は自家細胞、すなわち、細胞（複数可）におけるターゲットＤＮＡの改変を必要とする対象から取得された細胞（複数可）である（すなわち、ドナー及びレシピエントは同じ個体である）ことができる。本明細書に記載するように、改変は、例えば突然変異の矯正、タンパク質の活性を阻害する配列の挿入またはタンパク質の発現を増加させる配列の挿入、例えば、癌細胞を標的とするために使用することができるキメラ抗原受容体をコードする配列の挿入であることができる。自家細胞を使用して、細胞の拒絶をもたらし得る免疫反応を回避することができる。言い換えると、自家細胞を使用するとき、ドナー及びレシピエントは同一対象である。あるいは、細胞は、非相同である、例えば、ドナー、好ましくは血縁ドナーから取得される異種であることができる。第二の対象は、同一であるかまたは異なる種であることができる。典型的には、細胞がドナーに由来するとき、それらは、レシピエントに対して、移植拒絶の可能性を減少させる、及び／または免疫抑制療法の必要性を減少させるのに十分に免疫学的に適合するドナーに由来するだろう。細胞は、異種源、すなわち、レシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫学的に適合するように遺伝子操作されている非ヒト哺乳類から得ることもできる。本明細書に記載の障害を処置する方法はいずれも、１つまたは複数の免疫抑制薬を対象に投与することをさらに含むことができる。

移植を必然的に含む方法では、対象は、本明細書に記載の細胞のいずれかの移植の前に骨髄機能廃絶療法を任意選択で受ける。骨髄機能廃絶療法は、１つまたは複数の用量の化学療法、放射線療法、または両方を施すことを含むことができ、これは、健常な骨髄細胞の重度または完全な枯渇をもたらす。別の例では、対象は、１つまたは複数の用量の化学療法、放射線療法、または両方を投与することを含むサブ骨髄除去療法を受けることができ、これは、健常な骨髄細胞の一部を枯渇させる。細胞は、非侵襲的化学療法を受けたことがある対象へと移植することもできる。例えば、細胞は、ブスルファン、フルダラビン及び／またはトレオサルファンを用いて処置されている対象へと移植することができる。

移植を必然的に含む方法では、有効用量または量の矯正された細胞が、対象に投与される。有効量及び有効投与量という用語は、互換可能に使用される。有効量という用語は、所望の生理学的応答を生成するために必要な任意の量と定義される。いくつかの方法では、約１×１０^６〜約７×１０^６個の矯正された細胞／ｋｇを投与することができるが、この量は、関連する障害に応じて変動することができる。矯正された細胞の割合（％）細胞投与のための有効量及び計画は、経験的に決定してよく、このような決定をなすことは、当該分野の技術内である。投与のための投与量範囲は、所望の効果（例えば、疾患、例えば、鎌状赤血球貧血症の処置）を産生すために十分に大きいものである。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの実質的な有害副作用を引き起こすほどには多くないようにするべきである。一般に、投与量は、年齢、状態、性別、疾患のタイプ、疾患または障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれているかどうかによって変動し得、当業者によって決定することができる。投与量は、任意の禁忌の事象においては個別の医師によって調節することができる。投与量は様々であることができ、薬剤は、必要に応じて１つまたは複数の用量投与で毎日、１日または複数日にわたって投与することができる。

本明細書全体を通して使用するとき、対象は、脊椎動物、より具体的には、哺乳類（例えば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）であることができる。本用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。ゆえに、成体及び新生対象は、雄でも雌でも、含まれることが意図される。本明細書で用いるとき、患者または対象は互換可能に使用されてよく、障害を有するまたは発症するリスクのある対象を表すことができる。患者または対象という用語は、ヒト及び獣医学の対象を含む。

本明細書で用いるとき、処置、処置するまたは処置することという用語は、障害、例えば、鎌状赤血球症の１つもしくは複数の作用、または該障害の１つもしくは複数の症状を、対象における免疫反応を惹起することによって減少させる方法を表す。ゆえに、本開示の方法では、処置は、鎌状赤血球症及び他の障害の重症度における１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％減少を表すことができる。例えば、鎌状赤血球症を処置するための方法は、対照と比較して対象における感染の１つまたは複数の症状において１０％減少がある場合に、処置と考えられる。ゆえに、減少は、未処置または対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％から１００％の間の任意の減少率であることができる。処置は、必ずしも障害または障害の症状の治癒または完全な除去を表さないと理解されたい。

Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正する方法であって、Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の集団へと：ａ．Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；ｂ．ｇＲＮＡの第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含むターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及びｃ．ターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む複合体を導入することを含み、複合体が、細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入されて、Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正する、前記方法も提供する。

本明細書に提供する方法では、Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含むターゲットＤＮＡは、Ｔリンパ球発達に関連するタンパク質をコードするターゲットＤＮＡであることができる。例えば、ターゲットＤＮＡは、ＪＡＫ３をコードすることができる。かかる矯正された細胞は、例えば、ＳＣＩＤの処置において使用することができる。

細胞のゲノム内の突然変異を矯正することに加えて、本明細書に提供する複合体及び方法を使用して、機能的ポリペプチドを細胞のゲノムの特定の部位にて、ポリペプチドが細胞により発現されるように、挿入することもできる。ポリペプチドは、細胞内でまたは細胞表面上で発現することができる。

腫瘍特異的Ｔ細胞前駆細胞を作成する方法であって、Ｔ細胞前駆細胞の集団に、（ａ）Ｔ細胞前駆細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイド（ｇＲＮＡ）；（ｂ）ｇＲＮＡの第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び（ｃ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第三のヌクレオチド配列及びターゲットＤＮＡ内の二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成する第四のヌクレオチド配列を含むドナーヌクレオチド配列を含む複合体を導入することを含み、該複合体が、Ｔ細胞前駆細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）及び第三のヌクレオチド配列のターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入されて、ＣＡＲを発現する改変されたＴ細胞前駆細胞を形成する、前記方法も提供する。

Ｔ細胞前駆細胞は、癌を有する対象から得ることができる。上記のように、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０〜約０．５であることができる。例えば、ＨＤＲ／ＮＨＥＪ比率は、約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５またはこれらの比率間の任意の比率であることができる。本明細書に提供する方法では、ＨＤＲによる変異の効率は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％またはこれらの百分率間の任意の百分率であることができる。ＨＤＲによる変異の効率は、約８０％以上であることもできる。例えば、本明細書に記載の方法を使用するとき、機能的ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、例えば、ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が細胞の約５％に挿入される場合、ＨＤＲによる変異の効率は、約５％である。細胞の集団は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％またはこれらの百分率間の任意の百分率の細胞がＨＤＲを受けて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするヌクレオチド配列を挿入し、ＣＡＲを発現する細胞を形成するように癌を有する対象から得ることができる。いくつかの場合では、対象からの細胞の８０％超が、ＨＤＲを受けて障害に関連する突然変異を矯正するだろう。

ＣＡＲを発現する改変されたＴ細胞前駆細胞は、癌を有する対象に移植することができる。本明細書で用いるとき、癌は、異常細胞の急速及び無秩序増殖を特徴とする疾患である。癌細胞は、局所的にまたは体の他の部位へと血流及びリンパ系を通して拡散することができる。癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌等が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＡＲを発現する改変されたＴ細胞前駆細胞は、抗原結合ドメインがその対応する抗原に結合するとき、抗腫瘍免疫を呈する。

本開示の方法及び組成物のために使用することができる、本開示の方法及び組成物と合わせて使用することができる、本開示の方法及び組成物の調製において使用することができる、またはその産物である、物質、組成物、及び成分を開示する。これらの物質及び他の物質は本明細書に開示されており、これらの物質の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されるとき、これらの化合物のそれぞれの様々な個別の及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な参照が明確に開示されていなくても、それぞれが具体的に企図され、本明細書に記載されると理解される。例えば、方法が開示され、考察され、該方法を含むいくつかの分子になすことことができるいくつかの改変が考察される場合、方法のそれぞれ及びすべての組み合わせ及び順列、及び可能である改変は、そうでないと具体的に指示されない限り、具体的に企図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に企図され開示される。この概念は、本開示の組成物を使用する方法における工程を含むが、これらに限定されない、本開示のすべての態様に当てはまる。ゆえに、行うことができる様々な追加の工程がある場合、これらの追加の工程はそれぞれ、本開示の方法の任意の特定の方法工程または方法工程の組み合わせで行うことができ、それぞれのかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットが具体的に企図され、開示されるとみなされるべきであることを理解されたい。

本明細書に引用する刊行物及び、それらが引用されている資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例１
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換によるＳＣＩＤの矯正
ヤヌスファミリーキナーゼＪＡＫ３遺伝子の突然変異は、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）を引き起こす。ヒトにおけるＪＡＫ３欠損は、循環Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠如と、正常な数の機能が乏しいＢ細胞（Ｔ−Ｂ＋ＮＫ−）を特徴とする。本明細書に示すように、ＳＣＩＤ患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びＴ細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化システムを使用して、ＪＡＫ３欠損細胞の初期Ｔ細胞発達における完全な阻止を実証した。新規ＪＡＫ３突然変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換による矯正は、正常なＴ細胞発達を回復させ、これには、広範なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）レパートリーを有する成熟Ｔ細胞集団の産生を含む。矯正された細胞の全ゲノムシーケンシングは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット改変がないことを実証した。ゆえに、免疫不全症を有するヒトにおけるヒトリンパ球新生の試験に関する新規のアプローチ及び遺伝子置換療法のための方法を本明細書に提供する。

同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植は、ＳＣＩＤに対して確立されている現在唯一の治療法である；しかしながら、免疫回復の遅さ及び移植片対宿主病のリスクが、重大なリスクとして存在する。レトロウイルスに基づく遺伝子療法による処置が、Ｘ連鎖ＳＣＩＤに関して問題なく実証されている。しかしながら、挿入突然変異誘発の重度の有害作用が、レトロウイルス遺伝子療法で観察されている。自己不活性化レンチウイルスベクターが、近年の臨床治験において有効に使用されているが、安全性の問題に完全に対処するためには、長期経過観察が必要である。

患者特異的誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘導し、疾患誘発突然変異がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を使用する遺伝子置換により矯正される、代替の治療的戦略を本明細書に提供する。これらの矯正されたｉＰＳＣは、患者への移植のための造血祖先体へと任意選択で分化して、疾患を処置し得る（Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｓｉｃｋｌｅ ｃｅｌｌ ａｎｅｍｉａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｗｉｔｈ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｓｋｉｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９２０−１９２３（２００７））。本明細書に示すように、ＪＡＫ３欠損ヒトＴ細胞の分化は、初期発達段階で阻止される。ヒトＪＡＫ３突然変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換による矯正は、初期Ｔ細胞祖先体の分化能を回復させることも実証する。これらの矯正された祖先細胞は、ＮＫ細胞及びＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の広範なレパートリーを発現する成熟Ｔ細胞集団を産生することができる。これらの試験は、ヒトＳＣＩＤ患者における免疫不全のメカニズムを決定するため及び該障害の薬理学的及び遺伝的治療を検査するための強力なシステムを確立する。

患者情報
男性患者を、ヘルシンキ宣言に従って治験審査委員会が承認した試験に登録した。家族歴は、免疫不全に関して陰性であった。生まれてから８カ月間、患者は、体重増加不良、下痢、及び再発性細気管支炎を有し、頻繁な入院を必要とした。患者は、重度の呼吸窮迫及び鵞口瘡により生後８カ月で入院した。気管支肺胞洗浄を伴う気管支鏡検査では、細菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｈ ｆｌｕ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）及びウイルス性生物（呼吸器合抱体ウイルス）が示された。免疫学的評価により、重度の低ガンマグロブリン血症が示され、ＩｇＥ＜３、ＩｇＡ＜４、ＩｇＧ＝２９、ＩｇＭ＝２６であった。末梢血の免疫表現型は、Ｂ細胞は存在した（絶対Ｂ細胞数＝８７５）ものの、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の完全な欠如を示した。マイトジェン試験により、コンカナバリンＡ、ポークウィードマイトジェン及びフィトヘマグルチニンＡに対する反応の完全な欠如が示された。ＳＣＩＤの診断は、遺伝子検査により確認され、ＪＡＫ３遺伝子のエクソン１４におけるホモ接合性Ｃ＞Ｔヌクレオチド置換を伴い、これは、アルギニンコドン（ＣＧＡ）の停止コドン（ＴＧＡ）での置換をアミノ酸位置６１３にてもたらす。これは、このＪＡＫ３変異体（ｒｓ１４９３１６１５７）をＳＣＩＤの臨床例に結び付けた最初の報告である。患者は、強度減弱移植前処置に適合する非血縁骨髄移植を受け、治療から２年経って経過良好であり、免疫は完全に再構成されている。

ヒトｉＰＳＣ再プログラミング及び特徴決定
ｉＰＳＣ誘導のために、５×１０^４個の初代ケラチノサイトを、６ウェルプレートの１つのウェルに播種した。翌日に、ケラチノサイトに、１ｍＬのウイルス上清及び４μｇ／ｍＬの最終濃度でポリブレンを含有する１ｍＬのヒトケラチノサイト培地を用いて形質導入した。ケラチノサイトを、８００ｘｇで４５分間スピンフェクトした（１日目）。形質導入手順を、翌日再度繰り返した。３日目に、細胞を、新しいヒトケラチノサイト培地に交換し、さらに２日間培養した。５日目に、ケラチノサイトをトリプシン処理し、マイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を予め播種した１０ｃｍ皿に移し、ヒトケラチノサイト培地中で培養した。７日目に、細胞を、ヒトＥＳ培地に交換し、同じ皿にて３〜４週間継続して培養した。ＥＳ培地は、毎日交換した。潜在的なｉＰＳＣコロニーは、２〜３週間後に見ることができた。これらのコロニーを、個別に採取し、分析のためにＭＥＦ上で増殖させた。組み込まれたレンチウイルス及びポリシストロニックな配列を除去するために、ｉＰＳＣを、Ｃｒｅ発現アデノウイルス（ｒＡｄ−Ｃｒｅ−ＩＥ）に感染させた。個別のコロニーを採取し、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）配列のＣｒｅ媒介性除去を、ＰＣＲによりプライマーｇｃｔａａｔｔｃａｃｔｃｃｃａａａｇａａｇａｃａａｇ（配列番号５）及びｃｔｔｃａｇｃａａｇｃｃｇａｇｔｃｃｔｇ（配列番号６）を使用して確認した。

ＯＰ９共培養を用いたＣＤ３４＋細胞及びＴ細胞の生成
この手順は、前述している（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｏａｄ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”ＰｌｏＳ ｏｎｅ ９，ｅ９７３３５（２０１４））。この方法は、以下の改変を伴って使用した。６ウェルプレートの１つのウェルにおけるｈｉＰＳＣの培養物を、Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ（Ｏｈｎｕｋｉ Ｍ，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｕｎｉｔ ４Ａ ２（２００９））により記載されるように、ＣＴＫ溶液を用いて処理して、小細胞集塊を作成した。細胞集塊を、次いで、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン及び１００μＭモノ−チオグリセロールを含有するα−ＭＥＭ系培地中の２日齢のＯＰ９細胞を予め播種しておいた１０ｃｍプレートへと移した。培地を１日おきに交換し、細胞は、継代することなく１８日間培養した。１８日間の共培養の後、細胞を、解離溶液（α−ＭＥＭ培地中０．１５％コラゲナーゼＩＶ及び０．０１５％ヒアルロニダーゼ）で約３０分間、その後０．２５％トリプシンでさらに３０分間処理することにより回収した。ＣＤ３４＋細胞を、次いで、抗ＣＤ３４＋磁性ビーズ（マイクロビーズキット；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で精製した。Ｔ細胞分化のために、これらのＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４細胞上にプレーティングし、２０％ＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬ ｈＦｌｔ３−Ｌ、５ｎｇ／ｍＬ ｈＩＬ−７、及び１０ｎｇ／ｍＬ ｈＳＣＦを含有するα−ＭＥＭ培地で培養した。培地を１日おきに交換し、細胞は、４日ごとに、新しいＯＰ９−ＤＬ４プレートに移した。

Ｔ細胞刺激
ｈｉＰＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ由来Ｔ細胞を、ＣＤ３／２８ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）と製造業者のプロトコルに従って３日間インキュベートすることにより刺激してから、前述のように（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）フローサイトメトリーにより分析した。

フローサイトメトリー
細胞を回収し、洗浄してからＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａセルアナライザー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。細胞表面染色については、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、死亡細胞を除外した。アポトーシスアッセイについては、回収した細胞を、まず細胞表面抗体で３０分間染色した。１×ＰＢＳで一回洗浄した後、細胞を、アネキシンＶ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）及びＰＩを含有する１００μＬのアネキシン結合バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁し、１５分間インキュベートしてから、ＰＩを有する４００μＬのアネキシン結合バッファーを加えた。抗体は、別段の指定がない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た：ＣＤ３（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５−５、クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＳＫ３）、ＣＤ７（ＡＰＣ、ＢＶ５１０、クローンＭ−Ｔ７０１）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｃｙ７、クローンＳＫ１）、ＣＤ１６（ＰＥ、クローンＢ７３．１）、ＣＤ２５（ＦＩＴＣ、クローン２Ａ３）、ＣＤ３４（ＰＥ−Ｃｙ７、クローンＷＭ５９）、ＣＤ４３（ＰＥ、クローン１Ｇ１０）、ＣＤ５６−ＰＥ（クローンＭＹ３１）、ＣＤ６９（ＦＩＴＣ、クローンＬ７８）、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ（クローン１Ｄ１１）、ＴＣＲ−αβ（ＦＩＴＣ、ＰＥ、クローンＴ１０Ｂ９．１Ａ−３１）、ＴＣＲ−Ｖδ１−ＦＩＴＣ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ、クローンＴＳ８．２）、ＴＣＲ−Ｖδ２−ＰＥ（クローンＢ６）、ＴＣＲＶγ９−ＦＩＴＣ（クローンＢ３）、ＴＮＦ−α−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＭＡＢ１１）、Ｂｅｔａ Ｍａｒｋ ＴＣＲレパトワキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）。

ベクター構築
ポリシストロニックなＯＳＫＭベクターは、前述した（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ“ｈｉｔ ａｎｄ ｒｕｎ”ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ２７：１０４２−１０４９（２００９））。レンチ−ｈＤＬ４−ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドは、ＰＣＲ増幅ヒトＤＬ４ ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＬａＦａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＩＲＥＳ断片（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びｍＣｈｅｒｒｙ ｃＤＮＡを、ＥＦ１αプロモーターを含有するレンチウイルスベクター（ｐＤＬ１７１）へとクローニングすることにより構築した。ＰＣＲ反応は、ＰｒｉｍｅＳｔａｒポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）を使用して行った。

ＣＲＩＳＰＲプラスミドを構築するために、ｇＲＮＡオリゴを設計し、ｐＸ３３０及びｐＸ３３５プラスミドへと、Ｚｈａｎｇ ｌａｂプロトコル（Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に従って導入した。ＪＡＫ３修復プラスミドを構築するために、野生型ヒトゲノムＤＮＡを、ＪＡＫ３プライマーセット（５’アーム：ｇｔｃｇａｃｇｔｃｇａｃｇｃｔｃａｇｔｇａａｇｃｔｇａａｇｔａｔｔｃｃｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃａｇｇｇｃｇａｃｃａｃｔａｃ（配列番号７）及びａｔｔｔａａａｔｃｃｔｃｃｃｃｔｃｇａａｃｃｃｔｔａｃｃａａａｃｔｃｃｔａｔｇｃａｔａｃｔａｃａｇ（配列番号８）；３’アーム：ｔｔａａｔｔａａｔｔａａｔｔａｇｃａｔｔｔｔａｇｇｔｔｃａｇｇｔｔｇｔｇａｇａａｃａｃｔａｇａａｇａｇａａｃａａｇｔｃａ（配列番号９）及びｇｔａｔａｃｇｔａｔａｃｇｃａｔａｃｃｔｇｇａｇａｇｇｇｇａｃａａｇｇｔｃｔｔｇａｇａｔｇｃｇａｇｇｇｔ（配列番号１０）を使用してＰＣＲ増幅した。酵素（５’アーム：ＳａｌＩ及びＳｗａＩ；３’アーム：ＰａｃＩ及びＢｓｔＺ１７Ｉ）で消化した後、ＰＣＲ産物を、ＬｏｘＰ−ＰＧＫ−Ｎｅｏ−ＬｏｘＰ断片を含有するプラスミドへとクローニングした。この試験において使用されたオリゴはすべて、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。ＢＣＬ２レンチウイルスプラスミドを構築するために、プライマーセット（フォワード：ａｇｃｃａｃｃｔｔａａｔｔａａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｃｇｃａｃｇｃｔｇｇｇａｇａａｃｇｇｇｇｔａｃｇａｔａ（配列番号１１）及びリバース：ｔａａｃａｇａｇａｇａａｇｔｔｃｇｔｇｇｃｔｃｃｇｇａｔｃｃｃｔｔｇｔｇｇｃｃｃａｇａｔａｇｇｃａｃｃｃａｇｇｇｔｇａｔ（配列番号１２））を使用して、ヒトＢＣＬ２ ｃＤＮＡ（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）断片を増幅させた。産物を、ＧＦＰと２Ａ配列を通してＰＣＲにより連結し、ｐＤＬ１７１ベクターへとクローニングした。ｇＲＮＡ−Ｆ１ ｃａｃｃＧＴＧ ＡＧＡ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＡＣ ＡＧＡ ＣＡ（配列番号１３）ｇＲＮＡ−Ｒ１ ａａａｃＴＧＴ ＣＴＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＴＡＴ ＣＴＣ ＡＣ（配列番号１４）ｇＲＮＡ−Ｆ２ ｃａｃｃｇＡＡＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＴＧ ＣＣ（配列番号１４）ｇＲＮＡ−Ｒ２ ａａａｃＧＧＣ ＡＴＴ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＡＡ ＴＣＡ ＴＴｃ（配列番号１５）ｇＲＮＡ−Ｆ３ ｃａｃｃｇＣＡＧ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＡＡ ＡＧＧ ＣＣＴ ＧＣ（配列番号１６）ｇＲＮＡ−Ｒ３ ａａａｃＧＣＡ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＧＣ ＣＴＡ ＧＧＣ ＴＧｃ（配列番号１７）ｇＲＮＡ−Ｆ４ ｃａｃｃｇＴＧＣ ＣＡＡ ＣＡＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＡＴ（配列番号１８）ｇＲＮＡ−Ｒ４ ａａａｃＡＴＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＧＧ Ｃａｃ（配列番号１９）ｇＲＮＡ−Ｆ５ ｃａｃｃＧＡＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＧＣＡ ＡＧＴ ＧＴＧ ＧＡ（配列番号２０）ｇＲＮＡ−Ｒ５ ａａａｃＴＣＣ ＡＣＡ ＣＴＴ ＧＣＡ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＣ（配列番号２１）ｇＲＮＡ−Ｆ６ ｃａｃｃＧＣＴ ＣＣＴ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＣ ＡＴＴ ＣＡ（配列番号２２）ｇＲＮＡ−Ｒ６ ａａａｃＴＧＡ ＡＴＧ ＣＣＡ ＧＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＣ（配列番号２３）

細胞培養
ＩＰＳＣを、１×非必須アミノ酸、１×ペニシリン−ストレプトマイシン、１×Ｌ−グルタミン（すべてＭｅｄｉａｔｅｃｈ社製、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を補充されたＤＭＥＭ Ｆ−１２、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２−βＭＥ（Ｓｉｇｍａ）及び５〜１０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなるＥＳ細胞培地中、Ｅ１４．５ ＣＦ−１胚に由来するマイトマイシンＣ処理ＭＥＦ上で培養した。ヒト初代ケラチノサイトは、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｋ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｋｉｔ（ＬｉｆｅＬｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）中で培養した。ＯＰ９細胞は、ＡＴＣＣから購入し、２０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンを有するα−ＭＥＭ培地中で増殖させた。ＯＰ９−ＤＬ４細胞は、ＯＰ９細胞をｈＤＬ４及びｍＣｈｅｒｒｙを含有するレンチウイルスで形質導入することによって確立した。

ウイルス産生
レンチウイルスの調製のために、１０μｇのレンチウイルスベクター、２．５μｇのエンベローププラスミド（ｐＭＤＧ）、及び７．５μｇのパッケージングプラスミド（ｐＣＭＢＶｄＲ８．９．１）を、５×１０６ ２９３Ｔ細胞へとＦｕｇｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪまたはＰｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によりコトランスフェクトした。ウイルス含有上清を、トランスフェクションの２日後に回収し、０．４５μｍフィルターに通した。

遺伝子ターゲティング
ＩＰＳＣを、０．２５％トリプシンを用いて５分間処理して、単一細胞懸濁液を生成した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１〜２百万個の細胞を、５μｇのＪＡＫ３修復プラスミド及び５μｇのｐＸ３３０−ＪＡＫ３またはｐＸ３３５−ＪＡＫ３プラスミドとヌクレオフェクション（ヒト幹細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット，プログラムＡ−０２３，Ｌｏｎｚａ，Ａｌｐｈａｒｅｔｔａ，ＧＡ）のために混合して、ＭＥＦ上にプレーティングした。２〜４日後、３０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するｈＥＳ培地を、プレートに加えて、薬物耐性コロニーを選択した。これらのコロニーを、３〜４週間後に採取し、ゲノムＤＮＡ抽出のために増殖させた。ＰＣＲジェノタイピングのために、５’プライマーセット（ｔｇｃｔａａａｇｃｇｃａｔｇｃｔｃｃａｇａｃｔ（配列番号２４）及びｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｃａｇｇｇｔｃｇｇｃｔ（配列番号２５）ならびに３’プライマーセット（ｃｃｔｃｔｃｔｇｔｇｃａｔｔａｔｇｇｃａｇ（配列番号２６）及びｇｃｃｔｔｃｔａｔｃｇｃｃｔｔｃｔｔｇ（配列番号２７））を使用した。Ｎｅｏ選択マーカーを除去するために、ｈｉＰＳＣを、Ｃｒｅ発現アデノウィルス（ｒＡｄ−Ｃｒｅ−ＩＥ）に感染させた。

ＲＴ−ＰＣＲ
トータルＲＮＡを、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ由来細胞からＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて単離した。ｃＤＮＡを、０．５〜２μｇのトータルＲＮＡでＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔファーストストランド合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の使用説明に従って使用して合成した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ｑＰＣＲのために製造業者の使用説明に従って使用した。ｑＰＣＲのために使用したプライマーセットは、ＧＡＰＤＨ（Ｆ：ａｃｔｃｃｔｃｃａｃｃｔｔｔｇａｃｇｃｔ（配列番号２８）、Ｒ：ｔｃｃｃｃｔｃｔｔｃａａｇｇｇｔｃｔａｃａｔｇ（配列番号２９））；ＰＵ．１（Ｆ：ｇｔｇｃａａａａｔｇｇａａｇｇｇｔｔｔｃ（配列番号３０）、Ｒ：ｇｇａｇｃｔｃｃｇｔｇａａｇｔｔｇｔｔｃ（配列番号３１））；ＧＡＴＡ３（Ｆ：ｔｇｔｔｔｃｃｔｔｔｃａｃｔｇｇｃｃａｃａ（配列番号３２）、Ｒ：ａａｃｇｇｃａａｃｔｇｇｔｇａａｃｇｇｔａ（配列番号３３））；ＢＣＬ１１Ｂ（Ｆ：ｇｇｃｇａｔｇｃｃａｇａａｔａｇａｔｇｃｃｇ（配列番号３４）、Ｒ：ｃｃａｇｇｃｃａｃｔｔｇｇｃｔｃｃｔｃｔａｔｃｔｃｃａｇａ（配列番号３５））；ＲＡＧ１（Ｆ：ｃｃｔｔａｃｔｇｔｔｇａｇａｃｔｇｃａａｔａｔｃｃ（配列番号３６）、Ｒ：ｃｔｇａａｇｔｃｃｃａｇｔａｔａｔａｃｔｔｃａｃａｃ（配列番号３７））；ＲＡＧ２（Ｆ：ｃｃｃａｇａａｇｃａｇｔａａｔａａｔｃａｔｃｇａｇ（配列番号３８）、Ｒ：ａｔｇｔｇｇｇａｔｇｔａｇｔａｇａｔｃｔｔｇｃ（配列番号３９））；ｐＴａ（Ｆ：ｇｇｇｔｃｔｔａｃｃｔｃａｇｃａｇｔｔａｃ（配列番号４０）、Ｒ：ｃｃｔｃａｃａｃａｇｔｇｔｇａｃｇｃａｇ（配列番号４１））；ＢＣＬ２（Ｆ：ｇａｃｔｇａｇｔａｃｃｔｇａａｃｃｇｇｃ（配列番号４２）、Ｒ：ｇｇｇｃｃａａａｃｔｇａｇｃａｇａｇｔｃ（配列番号４３））；ＢＡＸ（Ｆ：ａａｇａｃｃａｇｇｇｔｇｇｔｔｇｇｇａｃ（配列番号４４）、Ｒ：ｇｔａａｇａａａａａｔｇｃｃｃａｃｇｔｃ（配列番号４５））；及びＪＡＫ３（Ｆ：ａｇｔｃａｇａｃｇｔｃｔｇｇａｇｃｔｔｃ（配列番号４６）、Ｒ：ｇｔｇａｇｃａｇｔｇａａｇｇｃａｔｇａｇｔｃ（配列番号４７））であった。すべての値は、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。

全ゲノムシーケンシング及び分析
ｉＰＳＣからのＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２ Ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用して剪断した：マイクロチューブ内の１３０μＬの試料を、２回の４０秒サイクルの１０％のデューティサイクル、４のインテンシティー、及び２００のサイクル／バーストに、周波数掃引モードにて供した。ＤＮＡチップ（ＤＮＡ １０００キット；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）分析には、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザーを使用し、これは、４００ｂｐの平均断片サイズを示した。ライブラリー調製は、ＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（ＮＥＢ番号Ｅ７３７０）を使用して行い、最終ライブラリー濃度は、ＫＡＰＡ Ｉｌｌｕｍｉｎａライブラリー定量キット（ＫＫ４８３５；ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｑＰＣＲにより決定した。シーケンシングクラスターは、フローセル上でＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＰＥ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｋｉｔ ｖ３−ｃＢｏｔ−ＨＳ（ＰＥ−４０１−３００１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ｃＢｏｔを使用して行われた。ＷＧＳを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ Ｋｉｔ ｖ３−ＨＳ−２００サイクル（ＦＣ−４０１−３００１）及びＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００アップグレードを使用して行って、２×１００シングルインデックスペアエンドリードをバイオインフォマティック分析のために生成した。ほぼ確実なオフターゲット部位を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイド配列をｈｇ１９基準ゲノムに対してＥＭＢＯＳＳ ｆｕｚｚｎｕｃソフトウェア（ｖ６．６．０．０）（Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，“ＥＭＢＯＳＳ：ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，”Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ＴＩＧ １６：２７６−２７７（２０００））を使用して整列し、最大で３つのミスマッチを許容することで同定した；１１９３部位が第一のガイド配列（ＧＴＧＡＧＡＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＧＡＣＡ）（配列番号４８）について、２５７部位が第二のガイド配列（ＡＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＣＣ）（配列番号４９）について予測された。各試料についてのＷＧＳからのリードのすべてを、ｈｇ１９基準ゲノムに対してＢＷＡ（ｖ０．７．５ａ）ｍｅｍアルゴリズム（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，“Ｆａｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｌｏｎｇ−ｒｅａｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：５８９−５９５（２０１０））を使用してマッピングし、重複リードを、Ｐｉｃａｒｄ−ｔｏｏｌｓ（ｖ１．１００）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を使用して除去した。局所的再アライメント（Ｌｏｃａｌ Ｒｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及び塩基の品質の再測定をＧＡＴＫ（ｖ２．７−２）（ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ：ａ ＭａｐＲｅｄｕｃｅ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ，”Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０：１２９７−１３０３（２０１０））を使用して行った。ＳＮＶ及び挿入欠失の両方を、ＧＡＴＫ ＨａｐｌｏｔｙｐｅＣａｌｌｅｒを使用してコールした。加えて、ＳＮＶ及び挿入欠失を、ＧＡＴＫ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに記載のように別々に再測定して、品質フィルターを適用した。４つのｉＰＳＣ試料のすべてに共通する基準ゲノムからの変異体を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９オフターゲット分析から除外した。除外されなかった変異体を、Ｂｅｄｔｏｏｌｓ（ｖ２．１７．０）（Ｑｕｉｎｌａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，“ＢＥＤＴｏｏｌｓ：ａ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｓｕｉｔｅ ｏｆ ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６：８４１−８４２（２０１０））を使用してスクリーニングして、これらがほぼ確実なオフターゲット部位に当てはまるかどうかを決定した。分析により、これらの変異体はいずれもオフターゲット部位に属さないことが示され、これらの突然変異が無作為に蓄積されたことが示される。低対立遺伝子頻度（＜１％、ｄｂＳＮＰ １３８）を有する機能的変異体（除外されたもの及び除外されなかったもの）をすべて、次いで、ＡＮＮＯＶＡＲソフトウェアパッケージを使用して注釈をつけ、ＨＧＭＤ及びＣｌｉｎＶａｒ（ｖ２０１４０９０２）において疾患との公知の関わりについてスクリーニングした；加えて、高ＣＡＤＤスコア（ＣＡＤＤ≧２０）を有するヒットもすべて、ＧＷＡＳ Ｃａｔａｌｏｇ及びＣＯＳＭＩＣ（ｖ７０）を使用して複合体疾患との関わりについてスクリーニングした。確認された疾患関連変異体は、照会されたデータベースでは同定されなかった。特に興味深いことに、ＳＮＰ（ｒｓ１４９３１６１５７）は、３．８５のＧＥＲＰスコア、３８のＣＡＤＤスコア（ＣＡＤＤ ｐｈｒｅｄ−ｌｉｋｅスコア）で、有意に有害（ｄｅｌｅｔｅｒｉｕｓ）であると予測されたが、ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）突然変異も疾患と関連すると確認されなかった。それゆえ、ＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ変異体は、ＳＣＩＤの臨床例と初めて関連した。

アクセッションコード
ＷＧＳデータを、アクセッション番号ＳＲＰ０５６１４９でＮＣＢＩ ＳＲＡデータベースにてアクセスすることができる。

ＪＡＫ３欠損ヒトＴ細胞は、低レベルのＢＣＬ２を発現し、初期発達段階で死亡する。
ＩＰＳＣを、ＪＡＫ３遺伝子のエクソン１４におけるＣ＞Ｔヌクレオチド置換に関してホモ接合性であるＳＣＩＤ患者の皮膚ケラチノサイト（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）から生成した。この突然変異は、ＣＧＡコドン（６１３でのアルギニン）をＴＧＡ停止コドン（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）と置き換える。上述のように、月齢４カ月の患者は、Ｔ−Ｂ＋ＮＫ−臨床表現型を提示した。このＳＣＩＤ表現型がｉｎ ｖｉｔｒｏで再現され得るかどうかを決定するために、２段階ＯＰ９及びＯＰ９−ＤＬ４システム（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４）を使用する患者特異的ｉＰＳＣのＴリンパ球への分化を試みた。ＪＡＫ３欠損ｉＰＳＣは、健常ドナー由来の対照ｉＰＳＣに匹敵する速度で増殖し、これらのｉＰＳＣは、ＣＤ３４＋造血祖先体（ＨＰ）へとＯＰ９間質細胞単層上で効率的に分化した。しかしながら、ＪＡＫ３欠損、ｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＨＰを、ＯＰ９−ＤＬ４間質単層上にプレーティングしたとき、Ｔ細胞分化は、対照と比較して欠如していた（図１）。ＣＤ３＋Ｔ細胞またはＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は観察されず（図１Ａ）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ダブルポジティブ（ＤＰ）、ＣＤ４＋シングルポジティブ（ＳＰ）、またはＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）Ｔ細胞は検出されなかった（図１Ｂ）。Ｊａｋ３ノックアウト（ＫＯ）マウスは、生産的ＴＣＲ再編成の前にＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブ（ＤＮ）段階での胸腺分化における遮断のために小さい胸腺を有する。ヒトにおけるＪＡＫ３突然変異から生じる発達異常をさらに理解するために、Ｔ分化系列決定及びＪＡＫ３欠損細胞の成熟を、正常ＪＡＫ３ ＷＴ対照と比較してアッセイした。ＩＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４単層上にプレーティングし、細胞を回収し、リンパ球マーカーについてＴ細胞誘導日（ＴＤ）１４、２１、２８及び３５で分析した（図４Ａ）。正常対照では、１．２×１０７ ＣＤ７＋細胞（リンパ球ゲート内で計数した細胞の８４％）を、ＴＤ１４で１〜２×１０６ ＣＤ３４＋細胞から生成した。Ｔ細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３及びＴＣＲ αβを、Ｔ細胞成熟に際して順次検出した。ＴＤ３５で、集団の５０％超がＣＤ８ ＳＰ細胞であった。ＪＡＫ３欠損細胞では、４．５×１０４ ＣＤ７＋細胞（リンパ球ゲート内で計数した細胞の３８．９％）を、ＴＤ１４で１〜２×１０^６個のＣＤ３４＋細胞から生成した。ＣＤ７＋細胞の数は、長期培養中に低減し、Ｔ細胞マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲ αβは、有意に発現されなかった。初期Ｔ細胞祖先体（ＥＴＰ）を通る移行期に、ＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ）からＣＤ４＋ＣＤ８＋（ＤＰ）への段階は、特定の転写因子の正確な活性化及び抑制によりもたらされる。対照細胞では、ＰＵ．１のサイレンシング及びＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂの誘導（図１Ｃ）は、これらの細胞が、Ｔ分化系列決定の開始（ＤＮ２からＤＮ３）、その後、ＴＣＲ再編成へと進むことを示す。対照的に、ＪＡＫ３欠損細胞では、ＰＵ．１は蓄積し、ＧＡＴＡ３及びＢＣＬ１１Ｂレベルは低下する（図１Ｃ）。これらのデータは、ヒトＪＡＫ３欠損細胞がＤＮ２段階でまたはその前に停止することを示し、これは、Ｊａｋ３ ＫＯマウスにおいてＴ細胞が死亡する段階と類似する。興味深いことに、ヒトＪＡＫ３欠損細胞は、ＴＣＲ再編成を行うために十分なＲＡＧ１、ＲＡＧ２及びＰＴＣＲＡを発現し得る（図１Ｃ）が、細胞は、この重要な発達段階に進むほど長く生存しない。ＪＡＫ３欠損細胞のリンパ球発達におけるこれらの深刻な障害は、リンパ球祖先体の生存及び分化において重要な役割を果たすＩＬ−７シグナル伝達の欠損により説明することができる。ＩＬ−７／ＪＡＫ３シグナル伝達は、胸腺細胞恒常性を、アポトーシス調節因子のＢＣＬ２ファミリーを調節することによって維持する。Ｊａｋ３ ＫＯマウスからの胸腺細胞及び末梢Ｔ細胞は、一部にはアポトーシス促進因子であるＢＡＸを選択的に上昇させることを通して、及び抗アポトーシス性因子であるＢＣＬ２の発現を低下させることにより、高いアポトーシス指数を有する。同様に、これらの試験では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来ヒトＪＡＫ３欠損細胞のアポトーシスは、対照と比較して、ＴＤ１０（９％対２．２％）及びＴＤ１７（７％対１．９％）と増加した（図２Ａ）。この表現型と一致して、対照と比較してＪＡＫ３欠損細胞において、ＢＡＸレベルは増加し、ＢＣＬ２レベルは低下した（図２Ｂ）。Ｂｃｌ２の強制発現は、γｃ欠損マウスにおいてＴ細胞発達を救助するが、Ｂ細胞発達またはＮＫ細胞発達は救助しない（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７：１５５−１６２（１９９７））。Ｂｃｌ２発現Ｊａｋ３ ＫＯ骨髄細胞を用いるＪａｋ３ ＫＯマウスの移植も、末梢Ｔ細胞数を改善する（Ｗｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ２１：６７８−６８９（２００１））。ＢＣＬ２の過剰発現が、ヒトＪＡＫ３欠損細胞のＴ細胞発達異常を救助し得るかどうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ由来の、ＪＡＫ３欠損ＣＤ３４＋細胞を、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動されるＢＣＬ２−２Ａ−ＧＦＰポリシストロンを含有するレンチウイルスで形質導入した。形質導入後、ＣＤ３４＋細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４単層上にプレーティングし、ＮＫ及びＴ細胞マーカーについてＴＤ２８でアッセイした。ＣＤ３−ＣＤ１６＋ＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、ＧＦＰ−（ＪＡＫ３−；ＢＣＬ２低）またはＧＦＰ＋細胞（ＪＡＫ３−；ＢＣＬ２＋）において見いだされなかった（図２Ｃ）。これらの知見は、ＢＣＬ２が、ＪＡＫ３欠損細胞におけるＤＮ段階で妨害物を放出したことを示す。興味深いことに、第二の発達停止がＤＰ段階で明らかであった；ＣＤ８＋ＣＤ４＋ＤＰ陽性細胞のさらなる分化はＧＦＰ＋細胞において観察されなかった（図２Ｃ）。まとめると、上記の試験は、ヒトＳＣＩＤ表現型を、患者由来ｉＰＳＣでｉｎ ｖｉｔｒｏにて再現することができることを実証する。ＪＡＫ３欠損は、ＤＮ胸腺細胞における増殖傷害をもたらす。ＢＣＬ２の強制発現は、ＤＮ細胞の生存を向上し、これは、ＤＰ胸腺細胞にさらに分化する。それにもかかわらず、ＤＰ胸腺細胞は、ＳＰ Ｔ細胞へと成熟することができず、この欠損は、ＩＬ７／ＪＡＫ３シグナル伝達の欠如から生じる可能性がある。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換によるＳＣＩＤ ｈｉＰＳＣにおけるＪＡＫ３欠損の矯正
正常Ｔ細胞発達が、ＪＡＫ３欠損ＳＣＩＤ患者細胞において回復され得るかどうかを決定するために、ＪＡＫ３突然変異を、ｉＰＳＣにおいてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換により矯正した。エクソン１４のイントロン上流及び下流内にある６つのガイドＲＮＡを、Ｃ１８３７Ｔ突然変異付近のｗｔＣａｓ９またはｎＣａｓ９を標的とするように設計し、矯正鋳型を、遺伝子置換のために使用した（図３Ａ）。ＩＰＳＣを、Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼ及び対を成すガイドＲＮＡを発現する２つのプラスミドまたは野生型Ｃａｓ９及び単一のガイドＲＮＡを発現する単一のプラスミドでヌクレオフェクトした。細胞は、ヌクレオフェクションの後２週間、Ｇ４１８を含有する培地中で増殖させた。個別のコロニーを採取し、増殖させ、ＰＣＲにより遺伝子型を同定した（図３Ｂ上）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性ＪＡＫ３遺伝子矯正の効率を図３Ｃに示す。ＷＴ Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃１からの３つのクローン、ＷＴ Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃２からの３つのクローン及びＣａｓ９ニッカーゼ＋対を成すｇＲＮＡ＃１及び＃２からの６つのクローンを、サンガーシーケンシングによりさらに検証した。１２の配列決定したクローンでは、２つのホモ接合性矯正クローン（Ｃａｓ９ニッカーゼ＋対を成すｇＲＮＡ＃１及び＃２から１つのクローン、ならびにＷＴ Ｃａｓ９＋ｇＲＮＡ＃１から１つのクローン）及び１０のヘテロ接合性矯正クローンを同定した（図３Ｄ）。ＪＡＫ３遺伝子発現の回復は、ＲＴ−ＰＣＲ（ＪＡＫ３ ｍＲＮＡ）（図３Ｂ；左下パネル）及びウェスタンブロット法（ＪＡＫ３タンパク質）（図３Ｂ；右下）により実証された。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性ＪＡＫ３矯正の特異性
オフターゲットの可能性について、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性ゲノム改変は、ヒトにおける治療へのこのアプローチの使用に関していくらかの懸念を提起する。癌細胞株では、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡによる比較的高いレベルのオフターゲット突然変異誘発が記載されている。ヒトＳＣＩＤ ｉＰＳＣにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性ＪＡＫ３矯正の特異性を決定するために、全ゲノムシーケンシングを、遺伝子置換の前後で行った。２つのヘテロ接合性及び１つのホモ接合性矯正クローンのゲノムを配列決定した。２つのヘテロ接合性クローンは、ｇＲＮＡ＃２＋野生型Ｃａｓ９で矯正され、ホモ接合性クローンは、ｇＲＮＡ＃１＋ｇＲＮＡ＃２＋ニッカーゼＣａｓ９で矯正された（Ｄ１０Ａ）。２０塩基ＣＲＩＳＰＲガイド配列を、可能性のあるオフターゲット部位を同定するために、ヒト基準ゲノムへとマッピングして最大３つのミスマッチを許容した。これらの部位を次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性遺伝子置換後のｉＰＳＣ試料における変動について分析した。１つのホモ接合性及び２つのヘテロ接合性矯正ｉＰＳＣ株のＷＧＳ分析は、予期されたオフターゲット部位に導入された突然変異はない（ＳＮＶも挿入欠失もない）ことを実証し、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性遺伝子置換に関する強い特異性を示す。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性ＪＡＫ３矯正後のＴ細胞発達の回復
Ｔ細胞発達が、ＪＡＫ３遺伝子矯正後に回復したかどうかを決定するために、Ｔ細胞分化系列決定及び成熟をアッセイした。Ｔ細胞分化は、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される中間体：ＣＤ３４＋ＣＤ７＋Ｔ／ＮＫ確定段階；ＣＤ７＋ＣＤ４＋ＣＤ８−未成熟、ＳＰ段階；ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ段階；及び最後に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＴＣＲαβ成熟段階を順次通過する。成熟Ｔ細胞は、ポリクローナルであり、増殖し、サイトカインをマイトジェンに反応して分泌する。それゆえ、ＪＡＫ３矯正ｈｉＰＳＣは、ＯＰ９単層上で造血祖先体へと分化し、ＣＤ３４＋細胞は、抗ＣＤ３４磁性ビーズ上で陽性選択された。これらの細胞を、ＯＰ９−ＤＬ４単層上にプレーティングし、非接着細胞を、リンパ球マーカーに関してＴＤ１４、２１、２８及び３５で分析した（図４）。対照細胞と同様に、１〜２×１０６ ＣＤ３４＋ＪＡＫ３矯正細胞は、４．７×１０６ ＣＤ７＋細胞（リンパ球ゲート内で計数した細胞の９１％）へとＴＤ１４で分化した。ＴＤ２１、ＴＤ２８及びＴＤ３５までさらに分化させた後、Ｔ細胞成熟マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＴＣＲ αβは、豊富に観察された（図４Ａ）。ＴＣＲ再編成がＪＡＫ３矯正Ｔ細胞において再確立されたかどうかを決定するために、ＴＣＲ Ｖβタイプ分けをフローサイトメトリーにより行い、図４Ｂにまとめた。ＪＡＫ３矯正Ｔ細胞は、本発明者らが検査したすべてのＶβセグメントを発現した（２５のうち１９）；それゆえ、広範なＴＣＲレパートリーが回復された。最後に、ＪＡＫ３矯正Ｔ細胞における、Ｔ細胞機能の代用であるＴＣＲシグナル伝達経路の統合性を、細胞表面活性化マーカーを抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の後に測定することにより検査した。刺激後３日目に、ＣＤ３＋ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋Ｔ細胞の割合（％）は、ＪＡＫ３矯正Ｔ細胞において０．６８％から５９．７％まで増加し、対照細胞（０．０１％から３７．６％）においても同様に増加が観察された（図４Ｃ）。上記のこれらのデータ及び結果により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉＰＳＣモデル系でのＪＡＫ３ Ｃ１８３７Ｔ（ｐ．Ｒ６１３Ｘ）突然変異のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換による矯正が、広範なＴＣＲレパートリーを有する機能的、成熟Ｔ細胞集団を産生する能力を有する正常Ｔ細胞発達を回復させることが実証された。

ヒトでは、ＳＣＩＤ患者の末梢血におけるリンパ球の表現型は、十分に記載されてきたが、リンパ球の分化系列決定及び胸腺発達の重要な段階の研究は、実施することが困難である。ＳＣＩＤを有する未処置患者からの骨髄及び胸腺細胞試料へのアクセスは、これらの状態がまれであり、幼児は生存するために緊急のＨＳＣ移植を必要とする生命を脅かす感染を典型的に有するため困難である。ヒトＳＣＩＤを研究するための本明細書に記載の戦略は、これらの制限を回避する；多数の造血祖先体をｉｎ ｖｉｔｒｏで患者特異的ｉＰＳＣから産生することができ、免疫不全の原因となる機序を正確に決定することができる。本明細書では、ヒトＪＡＫ３欠損ＳＣＩＤにおけるＴ細胞発達がＣＤ４−ＣＤ８−（ＤＮ２）段階の前またはその段階で完全に阻止されることを実証する。興味深いことに、ＢＣＬ２の強制発現は、ＤＰ胸腺細胞にさらに分化するＤＮ細胞の生存を向上させる。しかしながら、ＤＰ胸腺細胞はＳＰ Ｔ細胞に成熟できず、この欠損はＩＬ７／ＪＡＫ３シグナル伝達の欠如から生じる可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換によるヒトＪＡＫ３突然変異の矯正は、初期Ｔ細胞祖先体の分化能を回復させることも実証する。矯正された祖先体は、ＮＫ細胞及び広範なＴＣＲレパートリーを発現する成熟Ｔ細胞集団を産生することができる。１つのホモ接合性及び２つのヘテロ接合性矯正ｉＰＳＣ株の全ゲノムシーケンシング分析により、予期されたオフターゲット部位に導入された突然変異はない（ＳＮＶも挿入欠失もない）ことが実証され、これは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配向性遺伝子置換に関する強い特異性を示す。

本明細書に記載の方法では、ＣＤ３４＋ＨＳＣは、ｈｉＰＳＣから、ヒト骨髄間質幹（ｈＭＳＣ）細胞と共培養することにより生成することができる（図５を参照されたい）。遺伝子矯正／改変後に患者特異的ｉＰＳＣからこの方法により産生されたＨＳＣは、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、ＳＣＩＤまたは癌などの疾患を処置するために患者へと移植し戻すことができる。本明細書に記載の方法では、Ｔ細胞は、ｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞をｈＭＳＣ−ＤＬ４と共培養することによりｈｉＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を培養することにより生成することができる（図６を参照されたい）。矯正／改変後に患者特異的ｉＰＳＣからこの方法により産生されたＨＳＣは、疾患を処置するために患者に移植し戻すことができる。Ｔ細胞は、γδ Ｔ細胞を含むことができる。図７に示すように、組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するγδ Ｔ細胞は、遺伝子改変したｉＰＳＣから効率的に産生することができる。腫瘍抗原に特異的なＴＣＲを発現するγδ Ｔ細胞の産生は、癌に対する細胞療法を提供する。

実施例２
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換による鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異の矯正
ベクター構築
両Ｎ末端及びＣ末端核局在化配列を有するヒトコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓ）を、ｐｘ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４２２３０）からＨｉｓ_６−ＳＵＭＯタグをＮ末端で有する改変ｐＥＴ−２８ｂ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ベクターへとＰＣＲクローニングした。短いリンカーペプチド、続いて＋３６の正味電荷の超荷電ＧＦＰ及び２３アミノ酸インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２変異体ペプチドＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ）（配列番号５０）を含有する遺伝子ブロックカセットを、Ｅ．ｃｏｌｉにコドン最適化し、合成し（ＩＤＴ ＤＮＡ）、クローニングして、ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓのＣ末端に融合させた。ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ））（配列番号５１）コード配列も合成し（ＩＤＴ ＤＮＡ）、クローニングして、ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓのＮ末端に融合させた。

タンパク質過剰発現及び精製
ｐＥＴ−ＳＵＭＯ−ｓｃＣａｓ９プラスミドを、ＬＢ培地中、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）へと形質転換させた。細胞を、３７℃にて６００ｎｍで光学密度が０．６に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導は、０．５ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加え、振とう器中で１８℃にて一晩培養することにより達成した。回収した細胞は、Ｎｉ結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）に再懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ）により溶解した。０．４％の最終濃度のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、清澄化ライセートへと加えて、核酸を沈殿させた。遠心分離後の上清中のタンパク質を、次いで、硫酸アンモニウムにより沈殿させて、ＰＥＩを除去し、Ｎｉ結合バッファーへと再溶解した。タンパク質は、まずＨｉｓＴｒａｐニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製し、その後、ＳＵＭＯプロテアーゼＵｌｐ １で４℃にて一晩消化させた。切断したＨｉｓ−ＳＵＭＯタグを、次いで、第二のＨｉｓＴｒａｐカラムを介して除去した。ｓｃＣａｓ９タンパク質を含有するフロースルー（ｆｌｏｗ ｔｈｏｕｇｈ）を希釈して、０．５Ｍの最終ＮａＣｌ濃度とし、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．０Ｍ ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰを含有するバッファーを用いたグラジエント溶出により精製した。溶出されたｓｃＣａｓ９タンパク質を、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）においてサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製し、０．２２μｍフィルターを通すことにより滅菌し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりカットオフを１００ｋＤａとして濃縮した。濃縮したタンパク質を、ＵＶ分光光度計により定量し、液体窒素で瞬間凍結した。

ガイドＲＮＡ調製
ｓｇＲＮＡ転写のための鋳型ＤＮＡを、ＰＣＲにより、Ｔ７プロモーター及びポリＡ配列を加えたプライマーセットを用いて生成した。ｓｇＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。転写されたＲＮＡは、フェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈殿、その後ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）転写クリーンアップキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いたカラム精製により精製した。精製したｇＲＮＡは、ＵＶ分光光度計により定量し、−８０℃の冷凍庫で保存した。

一本鎖ＤＮＡドナー
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＯＤＮ）ドナーを、ＩＤＴ ＤＮＡにより合成した。

細胞培養
ヒト鎌状赤血球患者ｉＰＳＣは、皮膚繊維芽細胞に由来し、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＣＡ）中、マトリゲル（ＢＤ）上で維持した。

ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体調製及びヌクレオフェクション
１／１０容量の１０×ＰＢＳを、ｓｇＲＮＡへと加えて、１×最終濃度にした。ｓｇＲＮＡを、温度を９５℃から４℃までゆっくりと低下させて、ＰＣＲサーモサイクラーでアニーリングした。アニーリング後、ｓｃＣａｓ９タンパク質を、ｓｇＲＮＡへと１：１．５タンパク質−対−ＲＮＡモル比で加え、すべての一過性沈殿がなくなるまで管を軽くたたいて迅速に混合した。混合物を室温で１０分間、暗所でインキュベートした。次いで、１モル比の量のｓｓＯＤＮを混合物に加え、暗所でさらに１０分間インキュベートして、ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体を形成した。

ヌクレオフェクションの１日前に、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により剥がし、１×１０^６個の細胞／ウェルの細胞を、６−ウェルプレート上に１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に播種した。各実験について、５×１０^５個のｈｓＩＰＳＣを、単一細胞として１００μｌの補充ヒト幹細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液１（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体を次いで、細胞溶液と混合した。細胞を、プログラムＡ−０２３でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩデバイス（Ｌｏｎｚａ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してヌクレオフェクトした。ＨＢＢゲノム矯正の効率を、ｄｄＰＣＲにより、ヌクレオフェクションの２日後に分析した。

ｄｄＰＣＲによる鎌状矯正の検出
ｓｃＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ−ｓｓＯＤＮ複合体でヌクレオフェクトした細胞を、ｐｒｅｐＧＥＭ組織ＤＮＡ抽出試薬（ＺｙＧＥＭ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＮＺ）により製造業者のマニュアルに従って溶解し、水で１：３に希釈した。２２μｌのｄｄＰＣＲ反応では、１１μｌの２×ｄｄＰＣＲ混合物（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を、それぞれ１ｕｌの５μＭ対立遺伝子特異的ＦＡＭまたは以下に記載するＶＩＣ Ｔａｑｍａｎプローブ、それぞれ０．２μｌの１００μＭフォワード及びリバースプライマー、ならびに８．６μｌの希釈ゲノムＤＮＡと混合した。ドロップレットを、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）により製造業者のマニュアルに従って生成した。反応混合物を次いで、９６ウェルＰＣＲプレートへと移し、ＰＣＲを、標準的なサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）上で行った。ＰＣＲのためのプログラムは：工程１：９５℃１０分；工程２：９５℃３０秒；工程３：５５℃１分；工程２〜３を３９回反復；工程４：９８℃１０分；工程５：８℃保持とした。ＰＣＲを行った後、プレートを、次いで、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により分析した。

上記のように、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、改変組換えＣａｓ９タンパク質（ｍｒＣａｓ９）及び一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む複合体を、ヒト幹細胞またはその誘導体に導入して、疾患を引き起こす単一塩基突然変異を矯正することができる。表１及び図８は、鎌状赤血球矯正複合体（ｇＲＮＡ−ｍｒＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）の鎌状赤血球患者の皮膚細胞に由来する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への導入からの結果を示す。ＩＰＳＣは、実施例１に記載のように誘導された。矯正複合体を、鎌状ｉＰＳＣへとヌクレオポレーションにより導入し、２日後にゲノムＤＮＡを、デジタルＰＣＲにより、上記のプライマーを使用して分析し、配列決定した。６５％を超える細胞が、少なくとも１つの矯正された遺伝子を含有した。１つの矯正された遺伝子は、疾患を治癒するのに十分である。結果は、以下のように確認された。矯正複合体の導入の２日後に、細胞を培養皿にプレーティングし、４３の個別のｉＰＳＣコロニーを単離した。ゲノムＤＮＡを、これらのコロニーから単離し、ベータ−グロブリン遺伝子を配列決定した。コロニーの６５パーセントが、少なくとも１つの矯正されたベータ−グロブリン遺伝子（ＳがＡに矯正された）を含有した。

同様の試験を、患者初代骨髄ＣＤ３４＋細胞で行った。プロトコルは以下の通りである。骨髄を、鎌状赤血球患者からＩＲＢに承認されているプロトコルに従って得た。ＣＤ３４＋細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ抗ＣＤ３４＋ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上で精製した。細胞を、上記のように調製した複合体でヌクレオポレートした。ヌクレオポレーション後、細胞をｍｅｔｈｙｃｕｌｔにプレーティングし、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーを、２週間後に採取し、矯正された対立遺伝子について分析した。表２及び図９は、鎌状赤血球矯正複合体（ｇＲＮＡ−ｍｒＣａｓ９−ｓｓＯＤＮ）の患者初代骨髄ＣＤ３４＋細胞への導入による結果を示す。１２日間のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の後、ＤＮＡを、デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）により分析し、配列決定した。おおよそ等量のｂｅｔａＡ及びｂｅｔａＳ ｍＲＮＡが観察された（図９を参照されたい）。ヌクレオポレーションの直後、細胞の一部を、赤血球系細胞分化培地において最大で１８（ｅｉｇｈｔｅｎｎ）日間まで培養し、除核した赤血球細胞をＨｂＡについて分析した。矯正された鎌状赤血球患者ＣＤ３４＋細胞からのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化赤血球細胞の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルは、約１：３のＨｂＡ（正常ヘモグロビン）対ＨｂＳ（鎌状赤血球突然変異を伴うヘモグロビン）比率を示し、これは、鎌状化を阻害し、疾患を処置するのに十分である（図１０を参照されたい）。

実施例３
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子置換による鎌状赤血球貧血症に関連する突然変異の矯正
ｉＰＳＣは、すべての細胞型を生成する可能性を有し、それにはＨＳＰＣ（ヒト幹細胞／祖先細胞）を含む；それゆえ、ｉＰＳＣに基づく遺伝子療法は、鎌状赤血球症に対して根治療法を提供することができる。鎌状ｉＰＳＣの矯正は、矯正されたＨＳＰＣを生成する制限されない数の細胞を提供することができ、これらの矯正されたＨＳＰＣは、自家移植のために使用することができる。重要なことに、矯正されたｉＰＳＣ及びそれに由来するＨＳＰＣは、完全に特徴決定し、安全性について移植前に評価することができる。鎌状赤血球患者の繊維芽細胞に由来するｉＰＳＣのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９増強遺伝子矯正を以下に記載する。

細胞培養
ヒト鎌状ｉＰＳＣ
ヒト鎌状ｉＰＳＣは、ＵＡＢ Ｋｉｒｋｌｉｎ Ｃｌｉｎｉｃにて承諾を得た鎌状赤血球患者から得た皮膚生検の繊維芽細胞に由来した。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシンを有するｍＴｅＳＲ（商標）１培地（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中マトリゲル（ＢＤ）上で維持した。ヒト鎌状ｉＰＳＣは、コロニーをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とインキュベートすることにより、３〜４日ごとに継代し、単一の細胞を、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共にマトリゲル被覆プレート上に播種した。１日後、培地を、Ｒｏｃｋ阻害剤を伴わずに交換した。

ヒト鎌状骨髄ＣＤ３４＋細胞
承諾を得た鎌状赤血球患者からの骨髄を、ＵＡＢのａｄｕｌｔ ｓｉｃｋｌｅ ｃｌｉｎｉｃにおいて吸引した。ＣＤ３４＋細胞を、抗Ｃｄ３４＋ビーズ上で精製し、一定分量に分け、液体窒素中に保管した。

Ｅ．ｃｏｌｉ過剰発現のためのＣａｓ９発現プラスミド
Ｃａｓ９ＷＴ
両Ｎ末端及びＣ末端に核局在化配列が融合しているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ＷＴコード配列（ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓ）を、ｐｘ３３０ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ ＩＤ：４２２３０）からＨｉｓ_６−ＳＵＭＯタグをＮ末端で有する改変されたｐＥＴ−２８ｂ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ベクターへとＰＣＲクローニングし、ｐＳＵＭＯ−Ｃａｓ９ＷＴプラスミドを得た。

ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ
短いリンカーペプチドを含有する合成した遺伝子ブロック（ＩＤＴ ＤＮＡ）及びＥＧＦＰのコード領域を、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓのＣ末端にライゲートし、クローニングした。ＨＩＶ−ＴＡＴペプチドのコード配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５１）も合成し、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓのＮ末端にライゲートし、クローニングして、ｐＳＵＭＯ−ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰプラスミドを得た。

Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ
＋３６の正味の正電荷を有する超荷電ＧＦＰ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．”Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃａｎ Ｉｍｐａｒｔ Ｕｎｕｓｕａｌ Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ，”Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １２９（３３）：１０１１０（２００７）））のＥ．ｃｏｌｉコドン最適化コード配列及び短いリンカーペプチドを含有する合成された遺伝子ブロック（ＩＤＴ ＤＮＡ）を、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓのＣ末端とライゲートし、クローニングし、ｐＳＵＭＯ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰプラスミドを得た。

ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ
ＨＩＶ−ＴＡＴペプチドのコード配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５１）を合成し、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰのＣ末端とライゲートし、クローニングし、ｐＳＵＭＯ−ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰベクターを得た。

ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７
短いリンカーペプチド、その後に＋３６の正味電荷を有する超荷電ＧＦＰ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，２００７）及び２３アミノ酸インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨＡ−２変異体ペプチドＩＮＦ７（ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧ）（配列番号５０）（Ｐｌａｎｋ，１９９４）を含有する合成された遺伝子ブロック（ＩＤＴ ＤＮＡ）を、Ｅ．ｃｏｌｉにコドン最適化し、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓのＣ末端にライゲートし、クローニングした。ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５１）コード配列も合成し、ｎｌｓ−Ｃａｓ９−ｎｌｓのＮ末端にライゲートし、クローニングし、ｐＳＵＭＯ−ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７プラスミドを得た。

Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ
短いリンカーで分けられたＨＩＶ−ＴＡＴペプチドのためのコード領域の３縦列反復のコード配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＡＧＧＧＳＧＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＡＧＧＧＳＧＧＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＡＧ）（配列番号６１）を、Ｅ．ｃｏｌｉにコドン最適化し、合成し、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−ｎｌｓのＣ末端とライゲートし、クローニングし、ｐＳＵＭＯ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴプラスミドを得た。

ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ
ＨＩＶ−ＴＡＴペプチドのコード配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号５１）を合成し、ｎｌｓ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴのＮ末端とライゲートし、クローニングし、ｐＳＵＭＯ−ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴプラスミドを得た。

タンパク質過剰発現及び精製
Ｃａｓ９ＷＴまたは操作した正荷電Ｃａｓ９（ＥｐｃＣａｓ９）発現プラスミドを、ＬＢ培地中、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）２（ＤＥ３）細胞（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと形質転換した。細胞を、３７℃にて６００ｎｍで光学密度が０．６に達するまで増殖させた。タンパク質過剰発現の誘導を、０．５ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えること及び振とうインキュベータ内で１８℃にて一晩培養することにより達成した。回収した細胞を、Ｎｉ結合バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）に再懸濁し、Ｅｍｕｌｓｉｆｌｅｘ Ｃ３高圧ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ）で溶解した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を清澄化ライセート上清に加えて、０．４％の最終濃度として、核酸を沈殿させた。遠心分離後の上清を、次いで、硫酸アンモニウムにより沈殿させて、ＰＥＩを除去し、タンパク質ペレットをＮｉ−結合バッファーに再溶解した。タンパク質溶液を、まずＨｉｓＴｒａｐニッケルアフィニティーカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）により精製し、その後ＳＵＭＯプロテアーゼＵｌｐ１で４℃にて一晩消化した。切断したＨｉｓ−ＳＵＭＯタグを次いで、第二のＨｉｓＴｒａｐカラムを通過させることにより除去した。Ｃａｓ９タンパク質を含有するフロースルーを、０．５Ｍの最終ＮａＣｌ濃度に達するまで希釈し、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．０Ｍ ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰを含有するバッファーを用いたグラジエント溶出により精製した。溶出したＣａｓ９タンパク質を、ゲルろ過バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、及び０．２ｍＭ ＴＣＥＰ）においてサイズ排除カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりさらに精製し、０．２２μｍフィルターを通過させることによって滅菌し、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によりカットオフを１００ｋＤａとして濃縮した。濃縮したタンパク質を、ＵＶ分光光度計により定量し、液体窒素中で瞬間凍結し、−８０℃で保管した。

単一のガイドＲＮＡ調製
ｓｇＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型を、５’末端にＴ７プロモーター及び３’末端にポリＡ配列を加えたプライマーを用いてＰＣＲにより生成した。ｓｇＲＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによりＴ７ Ｒｉｂｏｍａｘ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者のマニュアルに従って使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写した。転写したＲＮＡを、次いで、フェノール：クロロホルム抽出、エタノール沈殿及びＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）転写クリーンアップキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いたカラム精製により単離した。ｓｇＲＮＡを、ヌクレアーゼ不含水に溶出し、濃度をＵＶ分光光度計により測定した。ストックｓｇＲＮＡを次いで、一定分量に分け、−８０℃の冷凍庫で保管した。

Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮアセンブリ
Ｃａｓ９タンパク質と複合体化する前に、１０×ＰＢＳをストックｓｇＲＮＡ溶液に加えて、１×ＰＢＳ最終塩濃度とした。ｓｇＲＮＡを、温度を９５℃から４℃までゆっくりと低下させることにより、サーモサイクラーでアニーリングした。Ｃａｓ９ ＲＮＰを形成するために、ストックＣａｓ９タンパク質を、アニーリングしたｓｇＲＮＡに１：１．５タンパク質：ＲＮＡモル比で加え、すべての一過性沈殿がなくなるまで管を迅速に軽くたたいて完全に混合した。混合物を室温で１０分間、暗所でインキュベートした。続いて、ヌクレオポレーションのためにｓｓＯＤＮをＣａｓ９ ＲＮＰと１：１モル比で加えた。

Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮを用いたヒト鎌状ｉＰＳＣのヌクレオポレーション
ヌクレオポレーションの１日前に、ヒト鎌状ｉＰＳＣを、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により剥がし、インキュベートして、１０μＭ Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充されたｍＴｅｓＲ１培地中の単一細胞懸濁物を得た。この単一細胞懸濁物を、６ウェルプレートへと５×１０^５個の細胞／ウェルの密度で播種した。ヌクレオポレーションの当日、５×１０^５個のヒト鎌状ｉＰＳＣ細胞を、上述のようにＡｃｃｕｔａｓｅで調製し、１００μｌのヒト幹細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液１（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、７．５μＭのＣａｓ９ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮを、細胞懸濁物とヌクレオポレーションキュベット中で混合した。細胞を、プログラムＡ−０２３でＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を使用してヌクレオポレートし、予め温めておいた培地に即座に移した。細胞集団の矯正効率を、ヌクレオポレーションの２日後にアッセイした。

ｄｄＰＣＲによる鎌状矯正の検出
ヌクレオポレーションの２〜５日後、Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート細胞を、ｐｒｅｐＧＥＭ組織ＤＮＡ抽出試薬（ＺｙＧＥＭ）により製造業者のマニュアルに従って溶解し、細胞ライセートを、水で１：３に希釈した。２２μｌのｄｄＰＣＲ反応では、１１μｌの２×ｄｄＰＣＲ混合物（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、それぞれ１ｕｌの５μＭ対立遺伝子特異的ＦＡＭまたはＶＩＣ Ｔａｑｍａｎプローブ、それぞれ０．２μｌの１００μＭフォワード及びリバースプライマー、ならびに８．６μｌの希釈細胞ライセートと混合した。ドロップレットを、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により製造業者の使用説明に従って生成した。反応混合物を次いで、９６ウェルＰＣＲプレートへと移し、ＰＣＲを、標準的なサーマルサイクラー（Ｂｉｏ−ｒａｄ）上で行った。ＰＣＲのためのプログラムは：工程１：９５℃１０分；工程２：９５℃３０秒；工程３：５５℃１分；工程２〜３を３９回反復；工程４：９８℃１０分；工程５：８℃保持とした。ＰＣＲが完了した後、プレートを、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で分析した。

Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレーション後のシングルｉＰＳＣクローンの生成
シングルｉＰＳＣクローンを生成するために、Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート鎌状ｉＰＳＣを、２０、１０及び５細胞／ウェルの密度への連続希釈の後にＢＤマトリクスゲルで被覆した９６ウェルプレートに播種した。１０μＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含む新しいｍＴｅｓＲ１培地を、培養の最初の６日間、２日毎に交換した。ｒｏｃｋ阻害剤を含まないｍＴｅｓＲ１培地を、６日目以降に毎日交換した。播種から１０〜１２日後、シングルｉＰＳＣコロニーを採取し、細胞ライセートをサンガーシーケンシングによりゲノム改変について分析した。

ヒト患者骨髄鎌状ＣＤ３４＋細胞の活性化及びヌクレオポレーション
細胞周期を活性化させるために、凍結したヒト鎌状骨髄ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＣＣ１１０サイトカインカクテル（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補充した予め温めたＳｔｅｍｓｐａｎ培地へと再懸濁した。細胞を、３７℃インキュベータにて５％ＣＯ_２で培養し、新しい培地を２日間毎日部分的に交換してからヌクレオポレーションを行った。ヌクレオポレーション当日、５×１０^５個の生存ＣＤ３４＋細胞を、１×ＰＢＳですすぎ、１５分間の１５０ｇでの遠心分離により回収した。細胞ペレットを、１００μｌのＰ４初代細胞ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ）へと再懸濁し、１５μＭのＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ複合体を、細胞懸濁物とヌクレオポレーションキュベット中で混合した。細胞を、プログラムＤＮ−１００で４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してヌクレオポレートし、予め温めた培地へと即座に移した。遺伝子矯正の効率は、ヌクレオポレーションの６日後に分析した。

Ｃａｓ９ ＲＮＰヌクレオポレートＣＤ３４＋細胞の赤血球系コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ
Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ複合体を用いたヌクレオポレーションの後、ＣＤ３４＋細胞を、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと３５ｍｍ組織培養プレート中５００〜１０００細胞／ｍＬの密度で播種した。細胞を、３７℃インキュベータにて５％ＣＯ_２で１２〜１５日間にわたって、コロニーが分析のための個別採取に十分大きくなるまで増殖させた。

ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのＲＢＣへのｉｎ ｖｉｔｒｏ赤血球系細胞分化
ＣＤ３４＋細胞のＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮを用いたヌクレオポレーションの１日後、培地を、赤血球系細胞増殖培地（１ｕ／ｍＬエリスロポエチン（ＥＰＯ）、２ｎＭデキサメタゾン（ＤＥＸ）、１ｎＭ β−エストラジオール、２０ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ、及び５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３を補充したＳｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））へと交換した。培地を、２日毎に交換した。最初の７日間の増殖及び分化の後、培地に、より高濃度のＥＰＯ（２ｕ／ｍＬ）を、１５〜１８日目に分化したＲＢＣが回収されるまで補充した。

ＲＢＣにおける矯正されたヘモグロビンベータタンパク質の質量分析
ヒト鎌状骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣから分化したＲＢＣの溶血液を、ＰＡＧＥにより分離した。グロビンバンドを、ゲルから切り出し、トリプシン処理した。ペプチドを分離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。

操作された正荷電Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ（ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ）は、ヒト患者ｉＰＳＣ（誘導多能性幹細胞）において鎌状突然変異を効率的に矯正する
鎌状ＨＢＢ遺伝子を矯正するために、ヒト鎌状赤血球患者由来のｉＰＳＣをＣａｓ９ＷＴ／Ｔ２ ＲＮＰ、Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ／Ｔ２、または８つの異なるＥｐｃＣａｓ９／Ｔ２ ＲＮＰ（操作された正荷電Ｃａｓ９／Ｔ２ ＲＮＰ）を９１−ｎｔ ｓｓＯＤＮ矯正鋳型（配列番号５１）と一緒に用いて、ヌクレオポレートした。Ｃａｓ９／Ｔ２ ＲＮＰは、二本鎖切断を鎌状突然変異の近く（２ｂｐ下流）で誘導する。突然変異に対する切断部位の近接は、９１−ｎｔ ｓｓＯＤＮ矯正鋳型を使用する鎌状突然変異のＨＤＲ（Ｔ→Ａ）を向上させる。ｉＰＳＣの集団に関するオンターゲットサンガーシーケンシングデータは、Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート細胞における高い効率での鎌状突然変異の矯正を実証する（図１１）。ＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）ドメインのＣａｓ９ＷＴのＣ末端での付加は、矯正のレベルに影響しなかった。

矯正効率は、８つの異なるＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰでヌクレオポレートした細胞において変動する。正荷電ＨＩＶ ＴＡＴペプチドのＣａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰのＮ末端での付加（ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ）は、Ｃａｓ９ＷＴ及びＣａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰと比較して矯正効率における少しの低減ならびに挿入欠失における少しの低減をもたらした。３×縦列反復のＴＡＴのＣａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰのＮ末端での付加（３ｘＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰ）は、矯正及び挿入欠失レベルをほぼ完全に消失させ、これはこの改変によるＣａｓ９酵素活性の喪失を示す。この結果は、Ｃａｓ９のＮ末端に連結した比較的高い数の正電荷が酵素活性を強く阻害することを示す。興味深いことに、Ｃａｓ９のＣ末端での正電荷の付加（Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴまたはＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ）は、高いレベルの矯正及び比較的低いレベルの挿入欠失をもたらす。これらの結果は、Ｃａｓ９のＣ末端に連結した正電荷は、切断された末端のエクソヌクレアーゼ消化を有意に阻害し、挿入欠失を形成することなく末端の再ライゲーションを刺激することを示す。同様のレベルの矯正及び挿入欠失が、３×縦列反復のＴＡＴペプチドまたは正荷電＋３６ＧＦＰをＣ末端負荷されたＥｐｃＣａｓ９から観察された。

両Ｎ末端及びＣ末端正荷電改変を有するＥｐｃＣａｓ９（ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ）が産生する挿入欠失は、有意に少ない。興味深いことに、負荷電ＩＮＦ７ペプチドのＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰのＣ末端へのさらなる付加（ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７）は、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰと比較して矯正効率を有意に向上させる。サンガーシーケンシング結果は、Ｃａｓ９ＷＴ及び選択されたＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰを用いたヌクレオポレーション後のｉＰＳＣ集団に関するオンターゲット矯正及び挿入欠失のディープシーケンシング分析により確認した（図１２）。

ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰは、ヒト鎌状ｉＰＳＣにおけるオンターゲット挿入欠失を抑制する
ＨＤＲに基づく遺伝子矯正及びＮＨＥＪに基づく挿入欠失の効率に与える正荷電改変の効果をさらに試験するために、ヒト鎌状ｉＰＳＣを、Ｃａｓ９ ＲＮＰプラスまたはマイナス９１−ｎｔ ｓｓＯＤＮ矯正鋳型でヌクレオポレートした。オンターゲットサンガーシーケンシング分析により、両Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰへのｓｓＯＤＮの付加（＋ｓｓＯＤＮ）が、鎌状突然変異を同様に高い効率で矯正することが実証された（図１３）。しかしながら、ｓｓＯＤＮの不在下では（−ｓｓＯＤＮ）、挿入欠失形成は、Ｃａｓ９ＷＴと比較してＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰで劇的に低かった。ＨＤＲがＤＳＢ（二本鎖切断）を必要とするため、Ｃａｓ９の酵素活性は、１ＸＴＡＴの付加によってはあきらかに低下しない。それゆえ、挿入欠失形成における大きな矛盾は、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−ＥＧＦＰの低い形質導入効率または低い酵素活性に起因しない。

これらの所見を確認するために、ｓｓＯＤＮを伴う（＋）または伴わない（−）５つの他のＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰにおける矯正及び挿入欠失効率（図１４）を評価した。サンガーシーケンシング分析により、すべてのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰが、有意に少ないオンターゲット挿入欠失をｓｓＯＤＮの不在下（−ｓｓＯＤＮ）でもたらすことが確認された。ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ／＋ｓｓＯＤＮの矯正効率は、異なる正荷電改変で変動する（図１４）が、挿入欠失形成は、すべての正荷電Ｃａｓ９改変によって抑制される。

ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰは、ヒト鎌状ｉＰＳＣにおいてヌクレオポレーション後に細胞生存を向上させる
正荷電改変が細胞生存に影響するかどうかを決定するために、鎌状ｉＰＳＣを、矯正ｓｓＯＤＮを有する（＋）または有さない（−）Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰまたは７つの異なるＥｐｃＣａｓ９でヌクレオポレートした。ヌクレオポレーションの直後に、細胞を、培養皿にプレーティングし、増殖を４８時間後に検査した。細胞生存はＣａｓ９ＷＴで乏しく、より高い正荷電改変で劇的に増加した（図１５）。優れた細胞生存が、両Ｎ末端及びＣ末端に正荷電改変を含有するＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ及びＥｐｃＣａｓ９で達成された（図１５）。細胞生存及び矯正／挿入欠失効率を考慮すると、高い矯正、低い挿入欠失形成及び優れた細胞生存の最適なバランスは、ヒト鎌状ｉＰＳＣでは、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰで達成されている。

ヒトｉＰＳＣにおける鎌状矯正のためのｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ比率
ｓｓＯＤＮ矯正鋳型対Ｃａｓ９ ＲＮＰ（ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ）の比率は、ＨＤＲ及び細胞生存にとって重要である。一本鎖ＯＤＮは、細胞に対して毒性である；それゆえ、高いｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ比率は、ヌクレオポレーション後に細胞生存不良をもたらし得る。しかしながら、低いｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ比率は、非効率的なＨＤＲをもたらし得る。高い矯正効率と高い細胞生存を達成するために、ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ ＲＮＰ比率を最適化した。鎌状赤血球患者ｉＰＳＣにおいて漸増用量のｓｓＯＤＮを用いた鎌状突然変異矯正の効率を決定した。１：１．３５のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ：Ｔ２ ｓｇＲＮＡモル比をこれらの実験に関して固定し、ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰのモル比を０から２．０に変動させた（ｒ＝０、０．２、０．５、１．０、１．１５、１．３５、１．５及び２．０）。例えば、図６のｒ＝０．５値は、０．５のｓｓＯＤＮ：１．０のＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ：１．３５のＴ２ ｓｇＲＮＡである。ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰのヌクレオポレーションの４８時間後に、鎌状矯正を、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（図１６Ａ）及びサンガーシーケンシング（図１６Ｂ）により定量した。矯正率（％）（ｂｅｔａＡ／ｂｅｔａＳ対立遺伝子×１００）を、ｒ（ｓｓＯＤＮ：Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ）に対してプロットした。矯正効率は、ｒ＝０．２からｒ＝１．０で増加し、１．１５で定常に達した（６５．７％）。１．１５を超えて増加したｒは、矯正効率を有意に増加させず、細胞生存を劇的に阻害した。

ヒトｉＰＳＣにおける鎌状矯正のためのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ比率
理論的に、最適なＣａｓ９：ｓｇＲＮＡモル比は、１：１である。Ｃａｓ９タンパク質のｓｇＲＮＡでの飽和は、最大Ｃａｓ９酵素活性を保証し、予期しないオフターゲットゲノム改変を産生し得る他の低分子ＲＮＡとの遊離Ｃａｓ９相互作用の可能性を低下させる。低分子ＲＮＡは、ヌクレアーゼに対して感受性である；それゆえ、１：１を超えるＣａｓ９：ｓｇＲＮＡのモル比が、Ｃａ９を飽和させるために必要であり得る。１：１．１５、１：１．３５及び１：１．５のＣａｓ９−３６ＧＦＰ：ｓｇＲＮＡモル比を、１．１５または１．３５のｓｓＯＤＮモル比と検査して、患者ｉＰＳＣにおける鎌状突然変異の最適な矯正効率を決定した。サンガーシーケンシング結果及び細胞生存分析は、最適な矯正効率及び細胞生存が、１：１：３５：１．１５のＣａｓ９−３６ＧＦＰ：ｓｇＲＮＡ：ｓｓＯＤＮモル比で達成されたことを実証した（図１７）。

ヒトｉＰＳＣにおける鎌状矯正に関するコロニー分析
ヒト鎌状ｉＰＳＣを、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７：Ｔ２ ｓｇＲＮＡ：ｓｓＯＤＮを１．０：１．３５：１．０のモル比で用いてヌクレオポレートし、細胞集団における矯正効率（図１８）、その後、単一細胞レベルでの矯正効率を調査した（表３）。単一細胞分析については、ヌクレオポレートされたｉＰＳＣを、連続希釈の後に９６ウェルプレートにプレーティングした。２週間後、シングルｉＰＳＣコロニーを採取し、ゲノムＤＮＡを単離し、サンガーシーケンシングを行った。４３個のシングルｉＰＳＣコロニーをオンターゲット改変について分析した。表３は、これらのｉＰＳＣクローンのサンガーシーケンシング結果をまとめる。４３のうち２８のコロニーが、少なくとも１つの矯正された対立遺伝子（Ａ／Ａ、Ａ／ＳまたはＡ／挿入欠失）を含有した；それゆえ、クローンの６５．１％が、少なくとも１つの矯正された対立遺伝子を含有した。少なくとも１つの矯正された対立遺伝子を含有するｉＰＳＣは、鎌状でない赤血球細胞を産生するだろう。

ゲノム編集事象を、これらのｉＰＳＣクローンについて対立遺伝子レベルでも評価した。８６のうち４２の対立遺伝子（４８．８％）が矯正され、８６のうち２８の対立遺伝子（３２．６％）が挿入欠失を含有し、８６のうち１６の対立遺伝子（１８．６％）が改変されなかった。この高い割合のゲノム改変（対立遺伝子の８１．４％及び細胞の９３％）は、生化学複合体を用いた非常に効率的な遺伝子ターゲティングが可能であることを実証する。

ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ及びゆらぎｓｓＯＤＮを用いたヒトｉＰＳＣの矯正
矯正されたＤＮＡの再標的化は、ＨＤＲに基づく遺伝子矯正におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにとって潜在的な落とし穴である。プラスミドまたはウイルス送達と比較して、Ｃａｓ９ ＲＮＰにとって再標的化のリスクは、ＲＮＰの短い半減期のために低い；しかしながら、再標的化は完全に回避することが困難である。本実施例では、鎌状突然変異は、Ｔ２ ｓｇＲＮＡ標的化配列内に位置し、ＰＡＭからわずか２塩基対である。ｓｓＯＤＮを用いた矯正の後、矯正されたＤＮＡは、ｓｇＲＮＡ標的配列と１塩基のミスマッチを含有する。この差異は、再標的化を低下させるが排除することはない。再標的化を防ぐための１つの戦略としては、ゆらぎ塩基変化を矯正鋳型に導入することである。これらの塩基変化は、翻訳されたタンパク質配列を変えないが、ＰＡＭ配列のまたはその付近のＤＮＡ配列を変え、それにより矯正されたＤＮＡはもはやＣａｓ９ ＲＮＰの標的とならないだろう。この戦略に基づき、鎌状ｉＰＳＣを、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７／Ｔ１ｓｇＲＮＡ／Ｔ１ｗｂ−ｓｓＯＤＮ及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７／Ｔ２ｓｇＲＮＡ／Ｔ２ｗｂ−ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートして、ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰが鎌状突然変異を、ゆらぎｓｓＯＤＮを用いて高い効率で矯正することができるかどうかを決定した。

ヌクレオポレートされた細胞集団に関するサンガーシーケンシング結果により、ヌクレオポレートされた細胞の両集団における鎌状突然変異の矯正が確認された（図１９）。Ｔ２ｗｂ−ｓｓＯＤＮを用いた鎌状矯正効率（図１９Ｂ）は、ゆらぎ塩基を伴わないｓｓＯＤＮの矯正効率と類似した（図１８）。しかしながら、Ｔ１ ｓｇＲＮＡ及びＴ１ｗｂ ｓｓＯＤＮを用いた鎌状矯正効率は、Ｔ２ｗｂ−ｓｓＯＤＮより低く、これはおそらく、ｓｇＲＮＡ標的化効率、鎌状突然変異からｓｇＲＮＡ切断部位までの距離及びゆらぎ塩基の数における差に起因するだろう。それゆえ、Ｔ２ｗｂ−ｓｓＯＤＮが、好ましいｓｓＯＤＮである。

ＥｐｃＣａｓ９矯正ｉＰＳＣコロニーの全ゲノムシーケンシング分析
ヒト鎌状赤血球患者ｉＰＳＣのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰ配向性矯正の特異性を決定するために、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）を、未矯正鎌状ｉＰＳＣに行い、４つのホモ接合性矯正クローンを、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰを用いて産生した。４つの矯正されたｉＰＳＣクローンの中で、２つ（Ｔ２−ｃｌ１及びＴ２−ｃｌ２）は、Ｔ２ ｓｇＲＮＡ及びゆらぎ塩基を伴わない９１−ｎｔ ｓｓＯＤＮで矯正され；１つのクローン（Ｔ１ｗ）はＴ２ ｓｇＲＮＡ及び９５−ｎｔ Ｔ２ｗｂ ｓｓＯＤＮで矯正され、１つのクローン（Ｔ１ｗ）は、Ｔ１ ｓｇＲＮＡ及び９０−ｎｔ Ｔ１ｗｂ ｓｓＯＤＮで矯正された（表４）。これらのＷＧＳデータにより、４つのホモ接合性矯正ｉＰＳＣクローンにおける鎌状突然変異のホモ接合性矯正及びオンターゲット挿入欠失の欠如が確認された（図２０Ａ）。Ｔ１ ｓｇＲＮＡに対する相同性を有する４７２０の潜在的なオフターゲット部位及びＴ２ ｓｇＲＮＡに対する相同性を有する１４７６の潜在的なオフターゲット部位（１〜５個のミスマッチ）の分析により、オフターゲット改変がないことが実証された（図２０Ｂ）。さらには、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２（１０）：１６６８−７７（２０１５）に記載の全ゲノム配列データの分析により、ｓｇＲＮＡに対する相同性を有するまたは有さない配列において疾患誘発変異体はないことが実証された。４つのホモ接合性矯正クローンをＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７ ＲＮＰを用いて産生した。

鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの遺伝子矯正
鎌状赤血球患者からの初代ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの矯正とその後の自家移植は、ＳＣＤ遺伝子療法のための強力かつ簡潔なアプローチである。ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰが骨髄祖先体における鎌状突然変異も矯正できるかどうかを決定するために、獲得したＣＤ３４＋ＨＳＰＣを、承諾を得た鎌状赤血球患者の骨髄から得た。鎌状ＣＤ３４＋細胞を、抗ＣＤ３４ビーズ上で精製し、細胞周期を、特定のサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦＬＴ−３）を有する培地中で２日間培養することより活性化した。続いて、細胞を、Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９−３６ＧＦＰまたはＴＡＴ−Ｃａｓ９−３ｘＴＡＴプラスＴ２ ｓｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした。鎌状矯正の効率を、ヌクレオポレーションの６日後にサンガーシーケンシングにより決定した（図２１Ａ）。最も高い矯正効率は、Ｃａｓ９ＷＴで得られた；しかしながら、挿入欠失頻度は高かった。２つのＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰでの矯正効率はＣａｓ９ＷＴよりも低かったが、挿入欠失の頻度は、劇的に低かった。

１つのＥｐｃＣａｓ９（Ｃａｓ９−３６ＧＦＰ）を用いた鎌状突然変異の矯正を、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルで検証した（図２１Ｂ〜Ｄ）。１０日間のヒト赤血球系細胞増殖培地におけるヌクレオポレートされた細胞の増殖後、ＲＴ−ＰＣＲ及びサンガーシーケンシングを行った（図２１Ｂ）。おおよそ等量のｂｅｔａＡ及びｂｅｔａＳ ｍＲＮＡが観察された（ピークは本質的に重なり合っている）。細胞を、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）を含有するヒト赤血球系細胞分化培地においても１５〜１８日間培養した。この培養に由来する赤血球細胞（ＲＢＣ）を溶解し、ヘモグロビンをＩＥＦゲル上で溶解した（図２１Ｃ）。総ヘモグロビンのおおよそ３５％がＨｂＡであり（図２１Ｃ）、この結果は質量分析により確認された（図２１Ｄ）。ｉｎ ｖｉｖｏで、ＨｂＡを含有するＲＢＣは、ＨｂＳのみを含有するｒｂｃよりも５〜１０倍長く生存した。それゆえ、細胞の約３０％が骨髄において移植後に矯正された場合、末梢血において６０〜７０％のＨｂＡレベルが達成されるだろう。

ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰは、鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおいて矯正／挿入欠失比率を向上させる
患者骨髄ＣＤ３４＋細胞の集団において鎌状突然変異の矯正を検査することに加えて、本発明者らは、単一ＣＤ３４＋祖先体に由来するコロニーを分析した。ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ−ＩＮＦ７を用いたヌクレオポレーションの後、ＣＤ３４＋細胞を、半固形ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地と混合し、皿にプレーティングした。プレーティングの２週間後、単一細胞に由来するコロニーを単離し、ＤＮＡを抽出し、サンガーシークエンスを行った。本発明者らが検査したコロニーは、ＢＦＵ−Ｅ（赤血球系バースト形成単位）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球系コロニー形成単位）及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球、単球、巨核球コロニー形成単位）であった。図１１は、典型的なＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー（Ａ）及び得られた６つの遺伝子型の代表的なサンガーシーケンシング結果（Ｂ）を示す。表５は、それぞれ、Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ、ならびにＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰ及びｓｓＯＤＮのヌクレオポレーションの後に得られた９５、９６、及び９６コロニー（ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ）からのサンガーシーケンシング結果をまとめる。最も高い矯正効率は、Ｃａｓ９ＷＴで得られた（５１．６％）；しかしながら、Ｃａｓ９ＷＴで処理された挿入欠失／挿入欠失頻度も非常に高かった（４０．０％）。このレベルの挿入欠失／挿入欠失は、ベータ−サラセミアをもたらし得る。なぜなら、これらのＨＳＣが、限られた数の骨髄ニッチに効果的に競合し得、これらのＨＳＣに由来する赤血球細胞がＨｂＡを合成できないためである。Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰで得られた矯正効率は低かった（２８．１％）が、このレベルの矯正は、上記のような疾患を治癒するのに十分であり、挿入欠失の頻度（８．３％）は遥かに安全である。ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰについては、矯正効率（３２．３％）及び挿入欠失頻度（１４．６％）は中間値であった。Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ、及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰプラスｓｓＯＤＮのヌクレオポレーション後の矯正／挿入欠失比率は、それぞれ、１．２９（５１．６／４０．０）、３．３９（２８．１／８．３）及び２．２１（３２．３／１４．６）であった。それゆえ、３．３９の矯正／挿入欠失比率を有するＣａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰが、本発明者らの好ましいＥｐｃＣａｓ９である。

上に考察するように、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮ複合体の鎌状矯正効率（総ＣＦＵの２８．１％；ＣＦＵ−ＧＥＭＭの２５％）は、疾患を治癒するのに十分高い。移植後の骨髄におけるこのレベルの矯正は、末梢血において６０〜７０％の矯正されたＲＢＣをもたらすだろう。加えて、コロニーの８．３％のみがホモ接合性挿入欠失（挿入欠失／挿入欠失）である；それゆえ、サラセミアが移植後に生じる可能性は低い。

ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰは、鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるヌクレオポレーションの後の細胞生存を向上させる
図２２Ｃにおけるデータは、ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰが、鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣにおけるヌクレオポレーションの後の細胞生存を向上させることを実証する。鎌状赤血球患者骨髄ＣＤ３４＋ＨＳＰＣのヌクレオポレーションの後に得た赤血球系細胞コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の数を、Ｃａｓ９ＷＴ、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ、及びＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰプラスｓｓＯＤＮと比較した。Ｃａｓ９ＷＴ ＲＰＮ／ｓｓＯＤＮで得られたコロニーの数を１に正規化した。Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮで得られたコロニーの数は、Ｃａｓ９ＷＴ対照と比較して２．５倍高く、ＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮは、１．６倍高かった。Ｅｐｃ（操作された正電荷）が、ヒト骨髄祖先体／幹細胞を一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の毒性作用から保護すると結論付けられた。

これらの結果は、ＣＤ３４＋ＨＰＳＣの投与が、移植後の骨髄再構築のために重要であるため、重大なことである。一般に、２百万個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇが、ヒトレシピエントへと移植される。このレベルを下回る細胞用量は、長期再構築不良をもたらす。７５ｋｇの患者は、おおよそ１億５千万個の細胞の投与を必要とする。１リットルの骨髄を、７５ｋｇの患者から麻酔下で回収することができ、おおよそ２億個のＣＤ３４＋細胞を移植のために単離することができる。上に示すように、Ｃａｓ９−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮと比較してＣａｓ９ＷＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮを用いたＣＤ３４＋細胞のヌクレオポレーションの後に得られる細胞は２．５分の１と少ない。それゆえ、矯正に関して本発明者らの好ましい複合体は、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮである。

ＥｐｃＣａｓ９は、より高いゲノム編集特異性をもたらす
ヌクレオポレートされたＣＤ３４＋細胞におけるＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰによるゲノム編集の特異性を評価するために、ディープシーケンシング分析を５つの潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座にて実行した。５つの潜在的なオフターゲット部位は、Ｚｈａｎｇ ＭＩＴ ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）によりｓｇＲＮＡに対する配列相同性に基づいて予測された上位５つの部位とした。Ｃａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート鎌状赤血球患者ＣＤ３４＋細胞では、ディープシーケンシングは、おおよそ０．１％オフターゲット挿入欠失をＯＴ５部位にて測定した（表６）。対照的に、Ｃａｓ９ＷＴ−３６ＧＦＰまたはＴＡＴ−Ｃａｓ９ＷＴ−３ｘＴＡＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート細胞では、オフターゲット改変は観察されなかった（図２３）。

加えて、Ｃａｓ９ＷＴ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮヌクレオポレート鎌状ＣＤ３４＋細胞に由来する赤血球系細胞コロニーでは、標的部位の近く（上流または下流）で非特異的改変を含有するコロニーが９５のうち５つで観察された（図２４）。これらの非特異的改変は、予測されたＣａｓ９ ＲＮＰ切断部位で開始されたと思われないランダム遺伝子置換または挿入欠失である。対照的に、ＥｐｃＣａｓ９ ＲＮＰヌクレオポレート細胞由来のコロニーで非特異的改変を含有したものは９６のうち０であった。

実施例４
マウスにおける鎌状赤血球突然変異の矯正
図２５は、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした鎌状赤血球マウス胎児肝ｃ−Ｋｉｔ＋細胞の最初の移植から６週間後の血液の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分析を示す。マウス胎児肝ｃ−ｋｉｔ＋細胞は、ヒト臍帯血Ｃｄ３４＋細胞に相当する。図２６は、放射線照射Ｃ５７Ｂｌ６マウスへの移植後１２週間でのＦＡＣＳ精製骨髄細胞のｄｄＰＣＲ分析を示す。ヌクレオポレーション及び移植の１２週間後、おおよそ５０％の赤血球系細胞（Ｔｅｒ１１９＋）及び骨髄系細胞（ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ＋／ＧＲ１＋）が矯正される。赤血球系細胞及び骨髄系細胞は、比較的短命である；それゆえ、これらの細胞は、移植されたＨＳＣに由来する。Ｂ及びＴ細胞における矯正レベルは、１２週間で二次移植後におおよそ５０％まで上昇するはずである（合計で２４週間）。２４週間後、造血細胞のすべてではないにしても、ほとんどが長期ＨＳＣ由来であるだろう。図２７は、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートした細胞の初回移植の１２週間後及び二回目移植の６週間後のマウスの血液のＩＥＦゲル分析を示す。ヒトＨｂＡは、鎌状赤血球突然変異を矯正するためにＣａｓ９ ＲＮＰ／ｓｓＯＤＮでヌクレオポレートしたＨＳＣの移植後のマウスにおいて産生される。マウスヘモグロビンバンドは、さらに６週間後に消失するだろう。

Claims (76)

1. 細胞のゲノム内の突然変異を矯正するための複合体であって、
   ａ．突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
   ｂ．前記ガイドＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、二本鎖切断を作成する、超荷電（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
   ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
2. 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項１に記載の複合体。
3. 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項１または２のいずれかに記載の複合体。
4. 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
5. 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
6. 前記負荷電ペプチドが、配列番号５０を含むＩＮＦ７ペプチドである、請求項５に記載の複合体。
7. 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項１〜６のいずれかに記載の複合体。
8. 前記全体的な正電荷が、約＋５〜約＋４０である、請求項７に記載の複合体。
9. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項８に記載の複合体。
10. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、請求項９に記載の複合体。
11. 前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接する前記ゲノム配列にハイブリッド形成する前記ｓｓＯＤＮが、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異の相同配向性修復のための鋳型である、請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
12. 前記ｓｓＯＤＮが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成する、請求項１１に記載の複合体。
13. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１〜１２のいずれかに記載の複合体。
14. ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項１〜１３のいずれかに記載の複合体。
15. ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：１〜約１．５：１：１：１５である、請求項１〜１４のいずれかに記載の複合体。
16. 請求項１〜１５のいずれかに記載の複合体を含む細胞。
17. 前記細胞が、真核細胞である、請求項１６に記載の細胞。
18. 前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１７に記載の細胞。
19. 前記細胞が、生殖系列細胞、幹細胞、または前駆細胞である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の細胞。
20. 前記幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項１９に記載の細胞。
21. 前記前駆細胞が、造血幹細胞である、請求項１９に記載の細胞。
22. 前記細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項１６〜２１のいずれかに記載の細胞。
23. 細胞の集団におけるターゲットＤＮＡの部位特異的改変の方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載の複合体を前記細胞に導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）及び前記ｓｓＯＤＮの前記ターゲットＤＮＡへの組込みを可能にする条件下で導入される、前記方法。
24. 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーション（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒａｔｉｏｎ）により導入される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ターゲットＤＮＡへと組み込まれた前記ｓｓＯＤＮが、前記ターゲットＤＮＡ内の突然変異を矯正する、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）の比率が、約１０〜約０．５である、請求項２３〜２５のいずれかに記載の方法。
27. 前記突然変異が、前記細胞の少なくとも５％において矯正される、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
28. 矯正された細胞に関する細胞生存率が、少なくとも約５０％である、請求項２７に記載の方法。
29. ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項２３〜２８のいずれかに記載の方法。
30. 前記ターゲットＤＮＡが、ヘモグロビンをコードする、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
31. 前記部位特異的改変が、鎌状赤血球貧血症に関連するヘモグロビン突然変異を矯正する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記部位特異的改変が、β−サラセミアに関連する突然変異を矯正する、請求項３０に記載の方法。
33. 対象のヘモグロビンをコードするゲノム配列内の突然変異に伴う疾患を処置する方法であって、
    ａ．前記対象から得られた細胞の集団へと、請求項１１に記載の複合体を、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入して、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列における前記突然変異を矯正すること、及び
    ｂ．ステップ（ａ）の前記細胞を前記対象へと移植することを含む、前記方法。
34. ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列内の突然変異に伴う前記疾患が、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記細胞が、造血幹細胞または誘導多能性幹細胞である、請求項３３または３４に記載の方法。
36. 前記移植された細胞の少なくとも５％が、矯正された突然変異を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
37. 細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
38. 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
39. Ｔ細胞障害に関連する突然変異を矯正する方法であって、前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の集団へと：
    ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞のゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
    ｂ．ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
    ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡ内に組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む複合体を導入することを含み、前記複合体が、前記細胞へと、相同配向性修復（ＨＤＲ）を可能にする条件下で導入されて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する、前記方法。
40. 前記ターゲットＤＮＡが、Ｔリンパ球発達に関連するタンパク質をコードする、請求項３９に記載の方法。
41. 前記細胞が、造血幹細胞または多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
42. 前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞である、請求項４１に記載の方法。
43. 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
44. 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項３９〜４３のいずれかに記載の方法。
45. 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結しているトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項３９〜４４のいずれかに記載の方法。
46. 前記複合体が、前記部位特異的ヌクレアーゼのカルボキシ末端に作動可能に連結している約１０〜約２５アミノ酸長の負荷電ペプチドをさらに含む、請求項３９〜４５のいずれかに記載の方法。
47. 前記負荷電ペプチドが、配列番号５０を含むＩＮＦ７ペプチドである、請求項４６に記載の方法。
48. 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項３９〜４７のいずれかに記載の方法。
49. 前記全体的な正電荷が、約＋５〜約約＋４０である、請求項４８に記載の方法。
50. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項３９〜４９のいずれかに記載の方法。
51. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、請求項５０に記載の方法。
52. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項３９〜５１のいずれかに記載の方法。
53. ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項３９〜５２のいずれかに記載の方法。
54. 前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団における相同配向性修復対非相同性末端結合の比率が、少なくとも約０．５である、請求項３９〜５３のいずれかに記載の方法。
55. 前記複合体が、前記細胞へとヌクレオポレーションにより導入される、請求項３９〜５４のいずれかに記載の方法。
56. 前記Ｔ細胞障害を有する対象から得た細胞の前記集団の少なくとも５％が、ＨＤＲを受けて、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異が矯正される、請求項３９〜５５のいずれかに記載の方法。
57. ＨＤＲで矯正された前記細胞を単離することをさらに含む、請求項３９〜５６のいずれかに記載の方法。
58. ＨＤＲで矯正された前記細胞を培養することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
59. 前記細胞が、増殖のための条件下で培養される、請求項５８に記載の方法。
60. 前記細胞が、前記細胞のＴ細胞への分化を促進する条件下で培養される、請求項５８または５９に記載の方法。
61. 対象において遺伝的突然変異に伴うＴ細胞障害を処置する方法であって、前記対象に、請求項３９〜６０のいずれか一項に記載の方法により得られた細胞を移植することを含む、前記方法。
62. 前記移植が、自家性である、請求項６１に記載の方法。
63. 前記Ｔ細胞障害が、重症複合免疫不全症である、請求項３９〜６２のいずれかに記載の方法。
64. 細胞のゲノムにおけるＴ細胞障害に関連する突然変異を矯正するための複合体であって、
    ａ．前記Ｔ細胞障害に関連する突然変異を含む細胞の前記ゲノム内のターゲットＤＮＡにハイブリッド形成する第一のヌクレオチド配列、及び部位特異的ヌクレアーゼと相互作用する第二のヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；
    ｂ．前記ｇＲＮＡの前記第二のヌクレオチド配列と相互作用するＲＮＡ結合部分を含み、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を含む前記ターゲットＤＮＡと特異的に結合してこれを切断し、前記ターゲットＤＮＡ内に二本鎖切断を作成する、超荷電タンパク質に作動可能に連結した組換え部位特異的ヌクレアーゼ；及び
    ｃ．前記ターゲットＤＮＡ内の前記二本鎖切断に隣接するゲノム配列にハイブリッド形成し、前記ターゲットＤＮＡに組み込んで、前記Ｔ細胞障害に関連する前記突然変異を矯正する第三のヌクレオチド配列を含む一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）を含む、前記複合体。
65. 前記超荷電タンパク質が、前記ヌクレアーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項６４に記載の複合体。
66. 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、前記部位特異的ヌクレアーゼのアミノ末端に作動可能に連結したトランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）ペプチドをさらに含む、請求項６４または６５に記載の複合体。
67. 前記超荷電タンパク質が、その対応する未改変タンパク質より大きな全体的な正電荷を有する、請求項６４〜６６のいずれかに記載の複合体。
68. 前記全体的な正電荷が、約＋５〜約＋４０である、請求項６７に記載の複合体。
69. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項６４〜６８のいずれかに記載の複合体。
70. 前記超荷電タンパク質が、超正荷電＋３６ＧＦＰである、請求項６９に記載の複合体。
71. 前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項６４〜７０のいずれかに記載の複合体。
72. ｇＲＮＡ対超荷電タンパク質に作動可能に連結した部位特異的ヌクレアーゼ対ｓｓＯＤＮのモル比が、約１：１：０．２〜約１．５：１：２．０である、請求項６４〜７１のいずれかに記載の複合体。
73. 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電＋３６ＧＦＰに作動可能に連結した組換えＣａｓ９である、請求項１〜１５のいずれかに記載の複合体。
74. 超荷電タンパク質に作動可能に連結した前記組換え部位特異的ヌクレアーゼが、超正荷電＋３６ＧＦＰに作動可能に連結した組換えＣａｓ９である、請求項１〜１５のいずれかに記載の複合体
75. 超正荷電＋３６ＧＦＰが、Ｃａｓ９のカルボキシ末端に作動可能に連結している、請求項７４に記載の複合体。
76. 前記ｓｓＯＤＮが、ヘモグロビンをコードする前記ゲノム配列にハイブリッド形成し、配列番号５２を含む、請求項７４または７５に記載の複合体。