JP6886404B2 - 初代造血細胞におけるタンパク質送達 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年1月30日に出願された米国特許仮出願第62/110,187号および2015年8月25日に出願された米国特許仮出願第62/209,711号に対して優先権を主張し、これらのそれぞれの内容は、全ての目的に対してその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
初代細胞の正確かつ効率的な操作のための、方法、組成物、反応混合物、キット、およびデバイスは、細胞治療の開発、ならびに体内の種々の細胞、組織、器官、および系の機能への基礎研究に向けて大きな期待が見込める。例えば、初代抗原特異的T細胞の作製および使用における近年の進歩は、癌および感染症に対する免疫療法に向けて大きな期待が見込める。別の例としては、初代細胞において調節遺伝子を正確に標的とする能力は、そのような調節の表現型の結果を研究するために用いることができる。
1つの局面において、本発明は、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、以下の工程:a)Cas9ヌクレアーゼドメイン(例えば、Cas9アポタンパク質)と細胞とを含む反応混合物を提供する工程;およびb)細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程であって、該Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、工程を含む、細胞のゲノムを編集する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞内部のガイドRNAは、DNAを含む細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされる。いくつかの態様において、細胞は、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない。いくつかの態様において、Cas9送達の効率は少なくとも約20%または30%である。いくつかの態様において、初代造血細胞または初代造血幹細胞は、上記または本明細書の他の部分に説明したように、細胞のゲノムが編集される前、その時、またはその後のいずれかで、異種タンパク質を発現するように改変される。いくつかの態様において、異種タンパク質は、ウイルス(例えば、レンチウイルス)ベクターによってコードされる。いくつかの態様において、異種タンパク質は、キメラ抗原受容体(CAR)タンパク質または異種T細胞受容体(TCR)であり、再構成TCRを含むがそれに限定されるわけではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」には、文脈上明白に他の解釈を要する場合を除き、複数形への言及が含まれる。
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T); および
8) システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Co., N. Y.(1984)を参照)。
[本発明1001]
a)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程であって、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、Cas9ヌクレアーゼドメインと、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAとを含む、工程;および
b)細胞内部にCas9リボヌクレオタンパク質複合体を導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞である、方法。
[本発明1002]
少なくとも約20%のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1003]
細胞が、Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない、本発明1001の方法。
[本発明1004]
a)の提供する工程の前に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1001の方法。
[本発明1005]
b)の導入する工程の後に、細胞が不死化も形質転換もされない、本発明1004の方法。
[本発明1006]
a)の提供する工程の前に、細胞が継代されていない、本発明1001の方法。
[本発明1007]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されている、本発明1006の方法。
[本発明1008]
a)の提供する工程の前に、細胞が宿主生物または組織から直接単離されており、かつ培養されていない、本発明1006の方法。
[本発明1009]
導入する工程がエレクトロポレーションを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
導入する工程が、
ナノワイヤまたはナノチューブをCas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートする工程;
細胞を、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブと接触させる工程;および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体でコートしたナノワイヤまたはナノチューブで細胞の細胞膜を突き通す工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
導入する工程が、
反応混合物を、細胞の直径より小さい細胞変形コンストリクション(cell deforming constriction)に強制的に通過させる工程であって、細胞の細胞膜に一過性の細孔を導入する、工程;および
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を、一過性の細孔を通って細胞に進入させる工程
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、細胞上の細胞外受容体に対するリガンドを含み、かつ導入する工程が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の受容体媒介性内部移行を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が細胞透過性ペプチドを含み、かつ導入する工程が細胞透過性ペプチドを細胞に接触させる工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
エレクトロポレーションが、カソード電極とアノード電極との間のチャンバー内に反応混合物を配置する工程、およびカソード電極とアノード電極との間に約20 kV/mから約100 kV/mの電位を印加する工程を含む、本発明1009の方法。
[本発明1015]
電位が、約5 msから約100 msの長さを有するパルスとして印加される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
電位パルスの印加を2から10回繰り返す工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
チャンバーが、長手方向の長さおよび水平断面積を有する中空の部材であり;
チャンバーが、長手方向の長さによって隔てられた第1の遠位端および第2の遠位端を含み;かつ
チャンバーが、第1の遠位端に第1の電極と、チャンバーの第2の遠位端と流体連通している電解液を含有するリザーバーとを有し、該リザーバーが第2の電極を有する、
本発明1014の方法。
[本発明1018]
チャンバーが、50から10,000の範囲で水平断面積に対する長手方向の長さの比率を有する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.25μMから約5μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、約0.9μMから約1.8μMの濃度である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
反応混合物が、約1×10 5 から約4×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1022]
反応混合物が、約2×10 5 から約2.5×10 5 個の初代造血細胞または初代造血幹細胞を含有する、本発明1001の方法。
[本発明1023]
細胞が初代造血細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1024]
初代造血細胞が免疫細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
免疫細胞がT細胞である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
T細胞が制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
制御性T細胞、エフェクターT細胞、またはナイーブT細胞がCD4 + T細胞である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
T細胞がCD4 + CD25 hi CD127 lo 制御性T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1029]
T細胞がFOXP3 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1030]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi エフェクターT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1031]
T細胞がCD4 + CD25 lo CD127 hi CD45RA hi CD45RO - ナイーブT細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1032]
T細胞がCD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1033]
T細胞がCD4 + CD8 + T細胞である、本発明1025の方法。
[本発明1034]
a)の提供する工程の前に、T細胞が予め活性化される、本発明1025の方法。
[本発明1035]
a)の提供する工程の前に、T細胞が刺激されない、本発明1025の方法。
[本発明1036]
T細胞が組換え抗原受容体を含む、本発明1025の方法。
[本発明1037]
反応混合物が、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型をさらに含み、かつ方法が、細胞内部に一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を導入する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1038]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約9μMから約180μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が約45μMの濃度である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
少なくとも約30%の初代造血細胞または初代造血幹細胞のゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
少なくとも約10%または少なくとも約14%の初代造血細胞または初代造血幹細胞の鋳型指向性ゲノム編集の効率をもたらす、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1042]
一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が、組換え抗原受容体、その一部分、またはその構成成分をコードする、本発明1037〜1039のいずれかの方法。
[本発明1043]
細胞がT細胞であり、かつ方法が、
c)b)の導入する工程の後に、CD3アゴニストおよびCD28アゴニストを含有する培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1044]
CD3アゴニストおよびCD28アゴニストが固体表面上に固定化されている、本発明1043の方法。
[本発明1045]
CD3アゴニストが抗CD3抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1046]
CD28アゴニストが抗CD28抗体である、本発明1043の方法。
[本発明1047]
c)c)の培養する工程の後に、CD3アゴニストもCD28アゴニストも含有しない培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、本発明1043の方法。
[本発明1048]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ヌクレアーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1049]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ニッカーゼを含む、本発明1001の方法。
[本発明1050]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼに融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1051]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、転写モジュレーターまたはクロマチン修飾因子に融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、本発明1001の方法。
[本発明1052]
反応混合物が、少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1053]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるsgRNAを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1054]
少なくとも2種類の構造的に異なるCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、構造的に異なるCas9ドメインを含有する、本発明1052の方法。
[本発明1055]
a)Cas9ヌクレアーゼドメインと細胞とを含む反応混合物を提供する工程;および
b)細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集する方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、方法。
[本発明1056]
細胞内部のガイドRNAが細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされ、ガイドRNA遺伝子がDNAを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
細胞が、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない、本発明1055または1056の方法。
[本発明1058]
Cas9送達の効率が少なくとも約20%または30%である、本発明1055の方法。
[本発明1059]
Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞であって、該複数の細胞の少なくとも20%が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、複数の初代造血細胞または初代造血幹細胞。
[本発明1060]
その少なくとも30%が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1061]
その少なくとも20%が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体および一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を含有する、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1062]
Cas9リボヌクレオタンパク質複合体の存在について濃縮されていない、本発明1059の複数の細胞。
[本発明1063]
その少なくとも20%または30%が、二本鎖切断、またはNHEJもしくはHDR修復二本鎖切断を標的ゲノム領域に含有する、本発明1059の複数の細胞。
I. 導入
初代造血細胞または初代造血幹細胞などの初代細胞への核酸、タンパク質、ならびにタンパク質および核酸の複合体の送達は低い効率によって制限される可能性がある。本明細書において、初代細胞または初代幹細胞へのCas9タンパク質またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体の驚くほど高い効率の送達を達成するための方法および組成物を記載する。そのようなCas9 またはそのリボヌクレオタンパク質複合体の高い効率の送達は、ゲノム編集、クロマチン修飾、遺伝子制御、細胞分化、および細胞活性の制御の方法の改良を可能にする。いくつかの態様において、Cas9またはそのリボヌクレオタンパク質複合体の高い効率の送達は初代造血細胞または初代造血幹細胞において行われる。
Cas9タンパク質の初代細胞への送達のための方法は、Cas9ヌクレアーゼドメインを含む反応混合物を提供する工程、およびCas9ヌクレアーゼドメインを細胞内部に導入する工程を含むことができる。いくつかの場合において、方法には、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程、ならびにb)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を細胞内部に導入する工程が含まれる。いくつかの場合において、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9ヌクレアーゼドメインおよびガイドRNA(例えば、スモールガイドRNA)を含む。ガイドRNAは、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするように構成されうる。
Cas9またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体を細胞(例えば、造血細胞または造血幹細胞、ヒト由来のそのような細胞等を含む)内に導入するための方法には、Cas9またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する反応混合物を形成する工程、および細胞の細胞外膜中に一過性の孔を導入する工程が含まれる。そのような一過性の孔は、これらに限定される訳ではないが、エレクトロポレーション、細胞圧縮、またはナノワイヤもしくはナノチューブとの接触を含む、様々な方法によって導入することができる。概して、一過性の孔は、Cas9またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体の存在下で導入され、Cas9またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体が細胞内に拡散するのを可能にする。
送達したCas9タンパク質は、アポタンパク質としてであろうとRNAと複合していようと、活性型エンドヌクレアーゼ形態をとることができ、ガイドRNAにより複合体の一部として標的核酸に結合すると、二本鎖切断を標的核酸内に導入する。二本鎖切断は、NHEJによって修復され、ランダム変異を導入することができるか、またはHDRによって特異的変異を導入することができる。様々なCas9ヌクレアーゼを、本明細書に記載された方法において利用することができる。例えば、ガイドRNAによって標的とされる領域のすぐ3’にNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とするCas9ヌクレアーゼを利用することができる。そのようなCas9ヌクレアーゼは、NGG配列を含有するゲノムの任意の領域を標的とすることができる。別の例として、直交性PAMモチーフ要件を有するCas9タンパク質を利用して、隣接NGG PAM配列を有さない配列を標的とすることができる。直交性PAM配列特異性を有する例示的なCas9タンパク質には、これらに限定される訳ではないが、CFP1、Nature Methods 10, 1116-1121(2013)に記載されたもの、およびZetsche et al., Cell, Volume 163, Issue 3, p759-771, 22 October 2015に記載されたものが含まれる。
いくつかの態様において、Cas9またはCas9リボヌクレオタンパク質複合体を細胞内に導入するための反応混合物は、標的ゲノム領域でのCas9媒介性、またはCas9融合体媒介性の切断またはニッキングの相同組換え修復(HDR)を指示するための核酸を含有することができる。鋳型核酸は概して、二本鎖または一本鎖DNAオリゴヌクレオチドである。いくつかの場合において、鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型(ssODT)である。
本明細書に記載された方法および組成物は、宿主細胞の任意のゲノム配列を本質的に標的とするために利用することができる。そのようなターゲティングは、標的ゲノム配列の少なくとも一部分の変異または置換をもたらすことができる。あるいは、そのようなターゲティングは、例えば、クロマチン修飾エフェクタータンパク質を動員することによって、標的ゲノム領域内のおよび/またはその近傍のクロマチンの修飾をもたらすことができる。そのようなクロマチン修飾は、標的ゲノム領域でのまたはその近傍での遺伝子の転写を増加または減少させるために用いることができる。さらに別の代替として、ターゲティングは、抑制因子(例えば、KRAB)または活性化因子(例えば、VP64)ドメインを標的ゲノム領域に動員することによって、標的ゲノム領域でまたはその近傍で遺伝子を抑制または活性化することができる。
本明細書において、ガイドRNAおよびガイドRNAのライブラリーが記載される。ガイドRNAは、5’から3’に結合領域、5’ヘアピン領域、3’ヘアピン領域、および転写終結配列を含有することができる。ガイドRNAは、Cas9タンパク質との安定かつ活性な複合体を形成するように構成されうる。いくつかの場合において、ガイドRNAは、宿主細胞においてガイドRNAをコードするポリヌクレオチドの発現を増強するように最適化される。
T細胞ゲノム工学は、HIVおよび自己免疫疾患に対する癌免疫療法および細胞療法について大きな期待が見込めるが、初代ヒトT細胞の遺伝子操作は非効率的である。本発明者らは、高い効率のCas9の送達を達成する方法を開発した。この高い効率のCas9の送達は、高い効率のゲノム編集、遺伝子サイレンシング、およびクロマチンもしくは染色体修飾のために用いることができる。送達されたCas9は、ガイドRNAとの構築済み複合体として送達することができる。これらの活性Cas9リボヌクレオタンパク質(RNP)は、初代ヒトT細胞において第1の成功したCas9-媒介性相同組換え修復(HDR)を可能にした。よって、成熟免疫細胞中の特定のヌクレオチド配列を高い効率で置換することができ、これは多様な研究および治療での応用を可能にするこの分野における長年の目標である。これらの試験によって、初代ヒトT細胞における、HDRによる効率的なDNA配列置換を含む、多様な実験的および治療上のゲノム工学応用のためのCas9(例えば、Cas9 RNP)技術が確立される。
CRISPR/Cas9システムは、哺乳類の生殖系列配列および細胞株を編集するために用いられることが多くなっている(1, 2)。初代ヒト組織において直接この強力なシステムを採用するために相当の努力が進められているが、特に、ヒトCD4+T細胞などの初代造血細胞では、効率は限定的である。cas9およびスモールガイドRNA(sgRNA)のプラスミド送達は、他の細胞型では効率的であったが、CD4+T細胞では、標的タンパク質発現の1〜5%を除去しただけである(3)。ヒトT細胞において重要な標的を除去し病原性ゲノム配列を修正する能力の改善は治療応用を有し、例えば、T細胞をエクスビボで編集し、次いで、患者内に再導入することを可能にする。
発明者らは、初代T細胞の遺伝子操作における長年の課題を克服し、ロバストなゲノム操作ツールキットを確立することを目的とした。哺乳類の細胞株における最近の報告は、Cas9 RNPが効率的かつ特異的なゲノム編集を達成できることを示唆する(14〜17)。Cas9のDNA送達によるT細胞の効率的なゲノム編集の重大な課題を考慮し、発明者らは、初代ヒトT細胞における標的ゲノム編集のためのRNP送達の効率を試験した(図 1A)。
T細胞操作における主要な目的は、HIV感染のためのコレセプターおよび腫瘍免疫反応を損なう共抑制免疫チェックポイントを含む、特定の細胞表面受容体の標的化除去である。本実施例において、発明者らは、HIV進入のためのコレセプターとして機能するCD4+T細胞上に発現したケモカイン受容体をコードする、CXCR4のコード配列を標的とするようにCas9 RNPをプログラムした(18, 19)。発明者らは、C末端で融合した2つの核移行シグナル配列(NLS)を保有する組換え化膿レンサ球菌Cas9を精製した。このCas9タンパク質をインビトロで転写させたシングルガイドRNA(sgRNA)と一緒にインキュベートし、ヒトCXCR4ゲノム配列を唯一認識するように設計した(図1B)。これらの構築済みRNP複合体を、健常なドナーから単離したヒトCD4+T細胞内にエレクトロポレーションした(方法)。
外因性鋳型媒介性HDRは、特定の変異配列の実験的および治療的編集を可能にする正確な遺伝子改変にとって強力な技術である。Cas9 RNPの高い編集効率を考慮し、発明者らは次に、初代T細胞において外因性鋳型媒介性HDRを達成できるかどうか試験した。発明者らは、Cas9 RNP切断部位でCXCR4遺伝子座と組み換えるために、90ヌクレオチド(nt)のホモロジーアームを有する一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型(ssODT)を用いた(15)。ssODTを、ヒト参照ゲノムから12 nt置換し、新たなHindIII制限酵素切断部位を導入するように設計した(図2A)。Cas9 RNPを、4種類の異なる濃度のssODT(0、50、100および200 pmol)の存在下で初代CD4+T細胞内にエレクトロポレーションした。ssODTなしのCas9 RNPは再び、CXCR4Hi細胞のパーセンテージを低下させた。特に、ssODTの添加はCXCR4の除去の効率を大幅に改善した。本実施例に示した実験において、発明者らは、100 pmol ssODTおよびCas9 RNPにより、高い細胞表面CXCR4発現を有する細胞の数の最大で98%の低下を達成することができた(対照処理細胞では60%に対して1%に) (図2BおよびC)。
発明者らは次に、Cas9 RNP媒介性ゲノム編集が、病原体および悪性腫瘍に対する防御に関連する炎症誘発性エフェクターT細胞サブセットと、自己免疫の発生を防ぐのに必須である抑制性FOXP3+ Tregとの間のバランスを変更できるかどうか試験した。FOXP3は、マウスにおいて機能的Tregに必須である(21〜24)。ヒトにおけるFOXP3遺伝子の変異は、IPEX、多臓器自己免疫症候群を引き起こすTreg分化および機能の障害につながる(12, 13)。Cas9 RNP媒介性ゲノム編集は、ヒトFOXP3遺伝子内に変異を実験的に導入し、Tregの分化に対するその作用を試験する独自の機会を提供する。
初代造血細胞および/または初代造血幹細胞へのCas9の効率的な送達は、細胞、組織、および系の機能の基礎研究、ならびに細胞療法の開発および使用のための強力なプラットフォームを提供する。例えば、Cas9媒介性ゲノム操作は、炎症性および抑制性ヒトT細胞サブセットに決定的なDNA要素を実験的および治療的に標的とするために用いることができる。発明者らは本実施例において、インビトロで構築された機能的Cas9 RNPの送達によってヒトの通常型および制御性CD4+T細胞におけるゲノム操作の成功を報告する。Cas9 RNPのエレクトロポレーションは、CXCR4細胞表面受容体の標的「ノックアウト」を可能にした。RNPはまた、第1の成功したCas9媒介性遺伝子「ノックイン」初代ヒトT細胞を促進した。成熟免疫細胞における高効率の標的DNA置換は、多様な研究および治療での応用を可能にするこの分野における長年の目標を達成する。最後に、発明者らは、刺激されたヒトナイーブT細胞およびTregにおいてFOXP3、マスター転写制御因子を標的とするCas9 RNPを利用して、IPEXを有する患者におけるTreg分化の機能不全のモデルを作製した。試験は集合的には、ヒト初代T細胞の遺伝子操作のための広く利用可能なツールキットを確立する。
ヒトT細胞の単離および培養
UCSF Committee on Human Research(CHR)によって承認されたプロトコールにしたがって、全血をヒトドナーからナトリウムヘパリン処理された真空採血管(Becton Dickinson)内に収集し、12時間以内に処理をした。末梢血単核球(PBMC)をフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。血液を1:1の比率でCa2+およびMg2+フリーのハンクス平衡塩溶液(HBSS)と混合し、50 ml Falconチューブに移し(30 mlの血液HBSS混合物/チューブ)、12 ml Ficoll-Paque PLUS(Amersham/GE healthcare)を下張りした。密度勾配濃縮遠心分離(1000 g、20分、ブレーキなし)後、PBMC層を注意深く取り除き、細胞をCa2+およびMg2+フリーHBSSで2回洗浄した。製造者のプロトコールにしたがって、CD4+T細胞をEasysepヒトCD4+T細胞濃縮キット(Stemcell technologies)で予濃縮した。予濃縮したCD4+T細胞を以下の抗体で染色した:αCD4-PerCp(SK3; Becton Dickinson)、αCD25-APC(BC96; TONBO Biosciences)、αCD127-PE(R34-34; TONBO Biosciences)、αCD45RA-violetFluor450(HI100; TONBO Biosciences)、およびαCD45RO-FITC(UCHL1; TONBO Biosciences)。CD4+CD25hiCD127lo Treg、CD4+CD25loCD127hi Tエフェクター(Teff)、およびCD4+CD25loCD127hiCD45RAhiCD45RO-ナイーブT細胞(Tnaive)をFACS Aria Illu(Becton Dickinson)を用いて単離した。Treg、TeffおよびTnaiveの純度は>97%であった。
本試験で用いた組換え化膿レンサ球菌(S. pyogenes)Cas9は、HAタグ、および核膜を横断する輸送を容易にする2つの核移行シグナルペプチドをC末端に保有する。タンパク質を、E. coli Rosetta 2細胞(EMD Millipore)中でプラスミドpMJ915からN末端ヘキサヒスチジンタグおよびマルトース結合タンパク質と共に発現させた。Hisタグおよびマルトース結合タンパク質をTEVプロテアーゼによって切断し、Cas9をJinek et al., 2012.に記載のプロトコールによって精製した。Cas9をpH 7.5、150 mM KCl、10%グリセロール、1 mMリン酸トリス(2-クロロエチル)(TCEP)の20 mM HEPES中で-80℃にて保管した。
T7プロモーター、20 nt標的配列およびキメラsgRNA足場をコードするDNA鋳型を、オーバーラッピングPCRにより合成オリゴヌクレオチドから構築した。簡単に言うと、CXCR4 sgRNA鋳型に関して、PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがい、
の20 nMプレミックス、
の1μMプレミックス、200μM dNTP、ならびにPhusion Polymerase(NEB)を含有する。サーモサイクラーの設定は、95℃10秒、57℃10秒および72℃10秒を30サイクルで構成された。PCR産物をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで1回抽出し、次いで、クロロホルムで1回抽出し、その後-20℃で一晩イソプロパノール沈降した。DNAペレットを70%エタノールで3回洗浄し、真空によって乾燥させ、DEPC処理水で溶解した。FOXP3 sgRNA鋳型を、同じ手法によって、T25、SLKS1、SLKS2およびSLKS4
から構築した。
Cas9 RNPを、20μM Cas9を20μM sgRNAと1:1の比率で20μM HEPES(pH 7.5)、150 mM KCl、1 mM MgCl2、10%グリセロールおよび1 mM TCEP中で37℃にて10分間、10μMの最終濃度にインキュベートすることによって、実験直前に調製した。
と隣接しているHindIII制限配列を含有する。
5×104〜2×105個の細胞を100μlのQuick Extraction溶液(Epicenter)で再懸濁し、添加して細胞を溶解しゲノムDNAを抽出した。細胞溶解物を65℃で20分間、次に95℃で20分間インキュベートし、-20℃で保管した。ゲノムDNAの濃度をNanoDrop(Thermo Scientific)によって決定した。
。FOXP3標的1用:
。FOXP3標的2用:
。CXCR4プライマーを、ホモロジーアームの外側へのアニーリングによるHDR鋳型の増幅を避けるように設計した。PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがって、高GCバッファー中に200 ngのゲノムDNAおよびKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を含有した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、98℃20秒間、62℃(CXCR4およびFOXP3標的2)または60℃(FOXP3標的1)を15秒間および72℃1分間を35サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。PCR産物を、SYBR Safe(Life Technologies)を含有する2%アガロースゲル上で精製した。PCR産物を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてアガロースゲルから溶出した。PCR DNAの濃度をNanoDropデバイス(Thermo scientific)により定量した。200 ngのPCR DNAをT7エンドヌクレアーゼI分析およびHindIII分析のために用いた。
編集効率をT7エンドヌクレアーゼIアッセイによって決定した。T7エンドヌクレアーゼIは、野生型および変異DNA鎖のハイブリダイゼーションから生じるミスマッチヘテロ二本鎖DNAを認識および切断する。ハイブリダイゼーション反応は、KAPA高GCバッファーおよび50 mM KCl中に200 ngのPCR DNAを含有し、以下の設定によるサーモサイクラーで行われた:95℃、10分、-2℃/秒で95から85℃、85℃1分間、-2℃/秒で85から75℃、75℃1分間、-2℃/秒で75から65℃、65℃1分間、-2℃/秒で65から55℃、55℃1分間、-2℃/秒で55から45℃、45℃1分間、-2℃/秒で45から35℃、35℃1分間、-2℃/秒で35から25℃、25℃1分間、および4℃で保持。バッファー2および5ユニットのT7エンドヌクレアーゼI(NEB)を添加し、再アニールしたDNAを消化した。37℃でのインキュベーションの1時間後に、反応を、70℃10分間の6×青色ゲルローディング色素(Thermo Scientific)によって停止させた。産物を、SYBRゴールド(Life technologies)を含有する2%アガロースゲル上で分離させた。DNAバンド強度を、Image Labを用いて定量した。編集のパーセンテージを、以下の方程式(1-(1-(b+c/a+ b+c))1/2)×100を用いて計算した、式中「a」はDNA基質のバンド強度であり、「b」および「c」は切断産物である。
CXCR4 HDR鋳型は遺伝子座内にHindIII制限部位を導入する。938 bp領域をPCRとしてプライマー
を用いて増幅した。反応は、CutSmartバッファー(NEB)中に200 ngのPCR DNAおよび10ユニットのHindIII高フィデリティで構成された。37℃でのインキュベーションの2時間後、反応を70℃で10分間の1倍量のゲルローディング色素により停止させた。産物を、SYBRゴールド(Life technologies)を含有する2%アガロースゲル上で分離させた。バンド強度をImage Labを用いて定量した。HDRのパーセンテージを以下の方程式(b+c/a+b+c)×100を用いて計算した、式中、「a」はDNA基質のバンド強度であり、かつ「b」および「c」は切断産物である。
CXCR4細胞表面染色を、氷上で15分間αCXCR4-APC(12G5;BD Pharmingen)を用いて実施した。抗体媒介性内部移行および抗体の分解を避けるために、細胞を染色手法の間にわたって細胞選別まで4℃で維持した。FACS Aria Illu(Becton Dickinson)を用いて、細胞を選別した。
3回のiTreg分化実験においてFOXP3 Cas9 RNP処理後のFOXP3+細胞およびIFNγ分泌細胞の量を、t検定を用いて対照処理後の量と比較した。標準偏差を計算し、エラーバーとして示した。分析の結果を図4Bに示す。
PD-1のエクソン1(sgRNA1により標的とされるPD-1標的1(SEQ ID NO:75)、およびsgRNA2により標的とされるPD-1標的2(SEQ ID NO:74))およびエクソン2(sgRNA3により標的とされるPD-1標的3(SEQ ID NO:72)、およびsgRNA4により標的とされるPD-1標的4(SEQ ID NO:73))に対するsgRNAを設計した(図5A)。sgRNA標的部位で誘導される二本鎖切断の鋳型指向性修復をもたらすHDRオリゴヌクレオチド(SEQ ID NO:71)も作製した(図5A)。sgRNA1〜4を含有するCas9 RNPを作製し、初代ヒトエフェクターT細胞(CD4+CD25loCD127hi)に送達し、細胞を回収した。FACSによる回収後の細胞の分析は、複数のCas9 RNPおよびそれらの組み合わせを用いるPD-1の高い効率の除去を明らかにする。2種類の異なるHDR鋳型を有するPD-1コード配列を標的とするCas9 RNPの様々な組み合わせの機能的作用を、PD-1細胞表面発現のFACS分析によって評価した。除去は、2種類のHDR鋳型 (コード配列の一部を除去し、未成熟終始コドンおよび新たなHindIII制限酵素消化部位を導入するように設計された) それぞれとCas9 RNPの複数の組み合わせで観察された。
Cas9 RNP、FITC標識デキストラン、Pacific Blue(PB)標識デキストラン、および刺激されていないCD4+T細胞を含有する反応混合物を提供し、SQZ細胞圧縮デバイス(SQZ Biotech)を通して圧縮させた。細胞をFACSにより二重標識(FITCおよびPB)細胞の集団および未標識細胞の集団に選別した。2つの細胞の集団を、T7エンドヌクレアーゼ1(T7E1)アッセイを用いてCas9媒介性ゲノム編集についてアッセイした。Pacific Blue(PB)標識デキストラン(3000 MW)、FITC標識デキストラン(500,000 MW)の取り込みに基づき細胞を選別し、T7エンドヌクレアーゼ1アッセイは、両方のデキストランを取り込んだ細胞における編集の濃縮を確認した。(図6)。
イントロダクション
この実施例は、実施例1で実施した実験のさらなる詳細、ならびに追加の関連実験の方法および結果を提供する。この実験者は、本明細書に記載の方法および組成物の、Cas9誘導性二本鎖DNA切断(DSB)の非相同末端結合(NHEJ)修復から生じる可能性があるランダム挿入および欠失変異により標的遺伝子を除去する能力を実証する。CXCR4中にゲノム編集を有する細胞は、低CXCR4発現に基づき選別することによって濃縮されうる。本実施例はさらに、Cas9 RNPおよび外因性一本鎖DNA鋳型を使用する相同組換え修復(HDR)によって初代T細胞においてCXCR4およびPD-1にて正確に標的ヌクレオチド置換を導入する本明細書に記載の方法および組成物を用いることができることを実証する。この技術は、「ノックイン」初代ヒトT細胞のCas9媒介性の作製を可能にした。標的部位のディープシーケンシングは、Cas9 RNPが最大約20%の効率(50 pmolのHDR鋳型で約22%、100 pmolのHDR鋳型で約18%を達成した)での「ノックイン」ゲノム修飾を促進したことを確認し、それは総編集事象のおよそ1/3までを占めた。これらの知見は、Cas9 RNP媒介性ヌクレオチド置換が疾患関連変異の治療的修正に有用であることを証明できることを示す。これは、初代ヒトT細胞におけるゲノムの実験的および治療的なノックアウト編集およびノックイン編集に対するCas9 RNP技術の有用性を確立する。
本明細書に記載の方法および組成物は、初代T細胞の遺伝子操作における長年の課題を克服し、効率的なゲノム操作ツールキットを確立する。哺乳類細胞株における最近の報告は、Cas9 RNPが効率的かつ特異的なゲノム編集を達成できることを示唆する(15〜18)。本明細書に記載の実験は、初代ヒトT細胞における標的ゲノム編集に対するCas9 RNP送達の有効性を実証する(図7A)。
ヒトT細胞の単離および培養。ヒト初代T細胞を、新鮮な全血またはバフィーコートのいずれかから単離した。末梢血単核球(PBMC)をFicoll密度勾配遠心分離によって単離した。CD4+T細胞を、製造者のプロトコールにしたがって、EasysepヒトCD4+T細胞濃縮キット(Stemcell technologies)を用いて予濃縮した。予濃縮したCD4+T細胞を以下の抗体で染色した:αCD4-PerCp(SK3; Becton Dickinson)、αCD25-APC(BC96; TONBO Biosciences)、αCD127-PE(R34-34; TONBO Biosciences)、αCD45RA-violetFluor450(HI100; TONBO Biosciences)およびαCD45RO-FITC(UCHL1; TONBO Biosciences)。CD4+CD25loCD127hiTエフェクター(Teff)をFACS Aria Illu(Becton Dickinson)を用いて単離した。
ヒトT細胞の単離および培養。ヒト初代T細胞を、新鮮な全血またはバフィーコートのいずれかから単離した(Stanford Blood Center)。UCSF Committee on Human Research(CHR)による承認を受けて、全血をヒトドナーからナトリウムヘパリン処理された真空採血管(Becton Dickinson)内に収集し、12時間以内に処理をした。末梢血単核球(PBMC)をフィコール密度勾配遠心分離によって単離した。新鮮な血液を1:1の比率でCa2+およびMg2+フリーのハンクス平衡塩溶液(HBSS)と混合し、バフィーコートをHBSSで1:10の比率に希釈した。30 mlの各HBSS/血液溶液を50 ml Falconチューブに移し、12 ml Ficoll-Paque PLUS(Amersham/GE healthcare)を下張りした。密度勾配遠心分離(1000 g、20分、ブレーキなし)後、PBMC層を注意深く取り除き、細胞をCa2+およびMg2+フリーHBSSで2回洗浄した。製造者のプロトコールにしたがって、CD4+T細胞をEasysepヒトCD4+T細胞濃縮キット(Stemcell technologies)で予濃縮した。予濃縮したCD4+T細胞を以下の抗体で染色した:αCD4-PerCp(SK3; Becton Dickinson)、αCD25-APC(BC96; TONBO Biosciences)、αCD127-PE(R34-34; TONBO Biosciences)、αCD45RA-violetFluor450(HI100; TONBO Biosciences)、およびαCD45RO-FITC(UCHL1; TONBO Biosciences)。CD4+CD25loCD127hi Tエフェクター(Teff)をFACS Aria Illu(Becton Dickinson)を用いて単離した。Teffの純度は>97%であった。
の20 nMプレミックス、
の1μMプレミックス、200μM dNTP、ならびにPhusion Polymerase(NEB)を含有する。サーモサイクラーの設定は、95℃10秒間、57℃10秒間および72℃10秒間を30サイクルで構成された。PCR産物をフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで1回抽出し、次いで、クロロホルムで1回抽出し、その後-20℃で一晩イソプロパノール沈降した。DNAペレットを70%(v/v)エタノールで3回洗浄し、真空によって乾燥し、ジエチルピロカルボネート (DEPC)処理水で溶解した。PD-1 sgRNA鋳型を、同じ手法によって、T25、SLKS1、SLKS2およびSLKS11
から構築した。
をアニールすることによって作製した。ウルトラマーをヌクレアーゼフリーduplexバッファー(IDT)において1:1の比率で混合し、95℃まで2分間加熱し、続いて、RTで30分のインキュベーションを行った。
。CXCR4 HDR対照ドナーは、HindIII制限部位を含有する元のCXCR4 HDR鋳型に対する配列スクランブル化バージョンである
。
。PD-1用:
。両方のプライマーセットを、ホモロジーアームの外側へのアニーリングによるHDR鋳型の増幅を避けるように設計した。PCR反応は、製造者のプロトコールにしたがって、高GCバッファー中に200 ngのゲノムDNAおよびKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を含有した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、98℃20秒間、CXCR4では62℃またはPD-1では68℃を15秒間および72℃1分間を35サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。PCR産物を、SYBR Safe(Life Technologies)を含有する2%(w/v)アガロースゲル上で精製した。PCR産物を、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いてアガロースゲルから溶出した。PCR DNAの濃度をNanoDropデバイス(Thermo scientific)により定量した。200 ngのPCR DNAをT7エンドヌクレアーゼI分析およびHindIII分析のために用いた。図7Eに関して、PCR産物をTOPO Zero Blunt PCR Cloning Kit(Invitrogen)でクローン化し、Sangerシーケンシングに供した。
を用いてPCR増幅した。PD-1遺伝子座に関して、905 bp領域をプライマー
を用いて増幅した。反応は、CutSmartバッファー(NEB)中に200 ngのPCR DNAおよび10ユニットのHindIII高フィデリティで構成された。37℃にて2時間のインキュベーション後、反応を70℃で10分間の1倍量のゲルローディング色素により停止させた。産物を、SYBRゴールド(Life technologies)を含有する2%(w/v)アガロースゲル上で分離させた。バンド強度をImage Labを用いて定量した。HDRのパーセンテージを以下の方程式(b+c/a+b+c)×100を用いて計算した、式中、「a」はDNA基質のバンド強度であり、かつ「b」および「c」は切断産物である。
、オフターゲット#1(POUドメイン、クラス2、転写因子1アイソフォーム1 [POU2F1] 遺伝子座;
)ならびにオフターゲット#2(グルタミン酸受容体1アイソフォーム1前駆体[GRIA1]遺伝子座;
)。最初に、製造者のプロトコールにしたがって、編集された試料および対照試料由来の100〜150 ngのゲノムDNAを、Kapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を用いてPCR増幅した。サーモサイクラーの設定は、95℃5分間を1サイクル、ならびに98℃20秒間、63℃15秒間および72℃15秒間を15〜20サイクル、ならびに72℃1分間を1サイクルで構成された。結果として生じるアンプリコンを2%(w/v)上で分離させ、SYBR Goldで染色し、Qiagenゲル抽出キットを用いてゲル抽出した。
および改変Illumina RNA PCRバーコードプライマー
をKapaホットスタート高フィデリティポリメラーゼ(Kapa Biosystems)を用いる第2のPCR段階でアンプリコンに付着させた。サーモサイクラーの設定は、98℃30秒間を1サイクル、98℃20秒間、65℃15秒間および72℃15秒間を8〜10サイクル、ならびに72℃5分間を1サイクルで構成された。結果として生じるアンプリコンを2%(w/v)上で分離させ、SYBR Goldで染色し、Qiagenゲル抽出キットを用いてゲル抽出した。バーコードを付けかつ精製したDNA試料をQubit 2.0 Fluorometer(Life Technologies)によって定量し、BioAnalyzer(Agilent)によってサイズ分析し、qPCRによって定量し、そして等モル比でプールした。シーケンシングライブラリーをIllumina HiSEq 2500で配列決定した。
Claims (19)
- a)Cas9リボヌクレオタンパク質複合体と細胞とを含む反応混合物を提供する工程であって、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、Cas9ヌクレアーゼドメインと、細胞のゲノムの標的領域に特異的にハイブリダイズするガイドRNAとを含む、工程;および
b)エレクトロポレーションによって細胞内部にCas9リボヌクレオタンパク質複合体を導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集するためのインビトロまたはエクスビボにおける方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞である、方法。 - 細胞が、Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない、請求項1に記載の方法。
- エレクトロポレーションが、カソード電極とアノード電極との間のチャンバー内に反応混合物を配置する工程、およびカソード電極とアノード電極との間に20 kV/mから100 kV/mの電位を印加する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 反応混合物中のCas9リボヌクレオタンパク質複合体が、0.25μMから5μMの濃度である、請求項1に記載の方法。
- 細胞が初代造血細胞である、請求項1に記載の方法。
- 初代造血細胞が免疫細胞である、請求項5に記載の方法。
- 免疫細胞がT細胞である、請求項6に記載の方法。
- T細胞が組換え抗原受容体を含む、請求項7に記載の方法。
- 反応混合物が、一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型をさらに含み、かつ方法が、細胞内部に一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型を導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が9μMから180μMの濃度である、請求項9に記載の方法。
- 一本鎖オリゴヌクレオチドDNA鋳型が、組換え抗原受容体、その一部分、またはその構成成分をコードする、請求項9または10に記載の方法。
- 細胞がT細胞であり、かつ方法が、
c)b)の導入する工程の後に、CD3アゴニストおよびCD28アゴニストを含有する培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。 - d)c)の培養する工程の後に、CD3アゴニストもCD28アゴニストも含有しない培養培地に反応混合物を移し、細胞を培養する工程
をさらに含む、請求項12に記載の方法。 - Cas9リボヌクレオタンパク質複合体がCas9ヌクレアーゼを含む、請求項1に記載の方法。
- Cas9リボヌクレオタンパク質複合体が、転写モジュレーターまたはクロマチン修飾因子に融合されたCas9ヌクレアーゼドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- a)Cas9ヌクレアーゼドメインと細胞とを含む反応混合物を提供する工程;および
b)エレクトロポレーションによって細胞内部にCas9ヌクレアーゼドメインを導入する工程
を含む、細胞のゲノムを編集するためのインビトロまたはエクスビボにおける方法であって、細胞が初代造血細胞または初代造血幹細胞であり、Cas9ヌクレアーゼドメインが細胞内部のガイドRNAと複合体を形成する、方法。 - 細胞内部のガイドRNAが細胞内部のガイドRNA遺伝子によってコードされ、ガイドRNA遺伝子がDNAを含む、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、Cas9ヌクレアーゼドメインをコードする核酸を含有しない、請求項16または17に記載の方法。
- Cas9をコードする核酸および/またはガイドRNAをコードするDNA核酸を含有しない複数の初代造血細胞の集団または複数の初代造血幹細胞の集団であって、該複数の細胞の少なくとも20%が、Cas9リボヌクレオタンパク質複合体を含有する、複数の初代造血細胞の集団または複数の初代造血幹細胞の集団。
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