CN107556385A - 双环肽Fc‑4C及其在抗体检测和重组蛋白表达中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了双环肽Fc‑4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC。实验证明，Fc‑4C双环肽能有效应用于抗体检测及重组蛋白的表达纯化等领域，具有广阔的应用前景。

Description

双环肽Fc-4C及其在抗体检测和重组蛋白表达中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程领域，具体而言，涉及双环肽Fc-4C及其在抗体检测和重组蛋白表达纯化中的应用。

背景技术

噬菌体演示和多肽模拟都是寻找靶蛋白多肽配体的主要技术手段【1-3】。将配体多肽偶联至琼脂糖凝胶颗粒、磁珠或与荧光分子连接，可以应用于检测或纯化与之有高亲和力的目的蛋白。另外，多肽配体还能作为亲和标签与目的蛋白重组表达，经过亲和色谱可对目的蛋白进行分离纯化【4-7】。近年来，人们发展了许多亲和标签用于重组蛋白的表达纯化，例如His标签、Flag标签、谷胱甘肽-硫转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签以及Fc-III标签【8-13】。不同的亲和标签都有其各自的适用范围与限制，因此发展新的亲和标签技术对于蛋白检测与纯化领域十分重要。

Fc-III多肽最初是从环肽文库中通过噬菌体展示技术筛选而来的，它对于IgG-Fc片段有特异的亲和性。Fc-III片段的氨基酸序列是DCAWHLGELVWCT，它能通过片段中两个半胱氨酸之间的二硫键形成具有β-发卡结构的环肽【14】。作为蛋白A(ProA)或蛋白G(ProG)的类似物，Fc-III同IgG的Fc片段之间有较强的亲和力(解离常数为185nM)【15】。发明人之前利用Fc-III环肽发展了蛋白质的融合表达和纯化***，同时也证明了Fc-III标签对于目的蛋白的结构与活性影响很小【16-17】。

然而，Fc-III多肽中仅有的一对二硫键对于稳定整个多肽的β-发卡结构的支撑力有限。Ricardo等人在Fc-III的N、C两端分别添加左、右旋脯氨酸(D-Pro-L-Pro)并形成酰胺键，使得Fc-III变成具有双环结构的FcBP-2。FcBP-2与IgG的亲和力比原始的Fc-III高了近80倍【15】。但是FcBP-2中含有右旋氨基酸并依赖其成环，这使得FcBP-2很难应用于蛋白的重组表达纯化***。

发明内容

我们针对Fc-III序列进行了改造设计，在Fc-III多肽的N、C两端分别添加两个半胱氨酸，通过半胱氨酸之间形成二硫键来模拟D-Pro-L-Pro的连接。我们将这个多肽命名为Fc-4C。Fc-4C同样具有双环结构，它同人IgG的亲和力比Fc-III高了35 倍。同时，Fc-4C与小鼠、兔、大鼠、牛、羊、马以及猪等物种的IgG的解离常数(K_d)都在30nM以内；相较于蛋白A或Fc-III，Fc-4C既提升了与IgG的亲和力，也具有物种广谱性。我们将Fc-4C偶联到琼脂糖凝胶颗粒上能有效地将血清中的IgG分离纯化出来。Fc-4C也能作为亲和标签用于重组蛋白的表达纯化。我们还发现Fc-4C能结合Zn、Ni、Co、Cu等第一过渡系的金属离子，并提升以金属离子为辅酶的重组蛋白的活性。经过实验证明，Fc-4C双环肽能高效快捷地应用于抗体及重组蛋白的纯化领域，是十分方便的工具。

本发明一方面提供了一种多肽Fc-4C，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC(SEQ IDNO：1)。

在本发明的实施方案中，Fc-4C可以与标记物偶联，例如与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素偶联。

本发明还提供了Fc-4C多肽及其偶联物(例如与标记物偶联形成的偶联物)在纯化IgG或其Fc片段中的应用。

本发明还提供了Fc-4C多肽及其偶联物在免疫检测中的应用，例如免疫印迹或免疫荧光。

本发明还提供了Fc-4C多肽作为融合标签的应用。

在本发明的实施方案中，Fc-4C多肽可以作为融合标签与目的蛋白连接，以便通过基于IgG或其Fc片段的纯化体系对所述目的蛋白进行纯化。

在本发明的优选实施方案中，Fc-4C多肽特别适用于作为融合标签与以过渡金属离子为辅酶的目的蛋白连接。优选地，其中所述过渡金属离子为第一过渡系的金属离子，例如Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺。所述以过渡金属离子为辅酶的目的蛋白可以是碳酸酐酶。

本发明还提供了融合蛋白，包含Fc-4C多肽和与之偶联的蛋白质。

本发明还提供了固相基质，其中Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白被固定在所述固相基质中。所述固相基质可以为琼脂糖颗粒或磁珠。

本发明还提供了编码权利要求1的多肽的核酸分子。例如，该核酸分子的碱基序列可以为：TGTGACTGTGCATGGCATCTTGGAGAACTCGTATGGTGTACTTGT(SEQ ID NO：2)。

本发明还提供了表达载体，其包含上文所述的核酸分子，以及必要的表达调控元件。

本发明还提供了检测样本中的IgG或其Fc片段的方法，包括：将所述样本与Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白接触；以及测定Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白与所述样本中的IgG或其Fc片段的结合水平。

本发明还提供了从样本中纯化、富集或去除IgG或其Fc片段的方法，包括：将含有IgG或其Fc片段的样本与Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白接触；以及从样本 中分离出与Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白结合的IgG或其Fc片段。例如，Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白可以被固定在固相基质中，例如琼脂糖颗粒或磁珠。

本发明还提供了纯化或富集目的蛋白的方法，包括：重组产生融合蛋白，该融合蛋白包含目的蛋白和Fc-4C多肽；将含有该融合蛋白的样本与IgG或其Fc片段接触；以及从样本中分离出与IgG或其Fc片段结合的融合蛋白。如果有必要，可以随后从所述融合蛋白中释放出所述目的蛋白。

本发明还提供了用于检测或纯化IgG或其Fc片段的试剂盒，包含Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白，或者固相基质，其中Fc-4C多肽或其偶联物或融合蛋白被固定在所述固相基质中。

附图说明

图1显示了Fc-4C二硫键的鉴定。A图：环状Fc-4C与Asp-N酶切后的Fc-4C一级质谱图。B图：经过Asp-N酶切后的Fc-4C二级质谱图。C图：二级质谱特征峰的序列注释。

图2显示了蛋白A偶联颗粒与Fc-4C偶联颗粒纯化人血清IgG以及兔血清IgG效果对比图。A图：从左至右泳道分别是，1、全人血清蛋白；2、蛋白A纯化后的流出物；3、蛋白A纯化洗脱产物；4、Fc-4C纯化后的流出物；5、Fc-4C纯化后的洗脱产物；6、Fc-III纯化后的流出物；7、Fc-III纯化后的洗脱产物；8、阴性对照纯化后的流出物；9、阴性对照纯化后的洗脱产物；10、蛋白分子量标尺。B图：从左至右泳道分别是，1、全兔血清蛋白；2、蛋白A纯化兔血清的产物；3、1批次偶联的Fc-4C纯化兔血清的产物；4、2批次偶联的Fc-4C纯化兔血清产物；5、蛋白分子量标尺；6、全人血清蛋白；7、蛋白A纯化人血清的产物；8、1批次偶联的Fc-4C纯化人血清的产物；9、2批次偶联的Fc-4C纯化人血清的产物。

图3显示了蛋白A偶联颗粒与Fc-4C偶联颗粒在不同的温度、pH平衡条件以及变性剂条件下的纯化效率。A图：从左至右泳道分别是，1、全人血清蛋白；2、55℃处理后，蛋白A纯化后的流出物；3、55℃处理后，蛋白A纯化洗脱产物；4、55℃处理后，Fc-4C纯化后的流出物；5、55℃处理后，Fc-4C纯化后的洗脱产物；6、蛋白分子量标尺；7、pH 6.0平衡时，蛋白A纯化后的流出物；8、pH 6.0平衡时，蛋白A纯化后的洗脱产物；9、pH 6.0平衡时，Fc-4C纯化后的流出物；10、pH 6.0平衡时，Fc-4C纯化后的洗脱产物。B图：蛋白A偶联颗粒与Fc-4C偶联颗粒在pH 5.0-8.0平衡条件下的纯化效率。C图：蛋白A偶联颗粒与Fc-4C偶联颗粒在不同的变性剂处理后的纯化效率。

图4显示了Fc-4C作为二抗用于蛋白的检测。A图：用FITC-Fc-4C通过免疫荧光检测β-tubulin的细胞亚定位。B图：用FITC-Fc-4C通过免疫荧光检测PCNA的细 胞亚定位。C图：用HRP-Fc-4C通过免疫印迹检测293T细胞中的PRDX3、CA II、CD38蛋白。

图5显示了还原及非还原的重组表达的Fc-4C多肽片段质谱图。A图：上图是融合了CA的Fc-4C片段在酶解后的一级质谱峰，最小同位素峰在1005.88m/z的质谱峰是EFCDCAWHLGELVWCTC(SEQ ID NO：1)的二价多肽片段。下图是融合了CA的Fc-4C片段在还原并烷基化、酶解后的一级质谱峰，最小同位素峰在1121.94m/z的质谱峰是EFCDCAWHLGELVWCTC(SEQ ID NO：1)的二价多肽片段在二硫键打开并烷基化的结构。B图：二价的1121.94m/z的二级质谱峰。相关的b、y离子已经标注出来。

图6是通过微量热泳动(MST)测定融合蛋白Fc-4C-CA、Fc-III-CA及Z-CA同人IgG的亲和力，其解离常数分别为2.28、23.0和13.7nM。

图7是使用Fc-4C标签与His标签纯化重组蛋白的电泳图。A图：从左至右泳道分别是，1&5、重组蛋白Fc-4C标签与His标签融合CA的全菌裂解液蛋白；2、Fc-4C融合CA后的裂解液上清；3、Fc-4C融合CA后用IgG颗粒富集的纯化流出物；4、Fc-4C融合CA后用IgG颗粒富集的纯化产物；6、His标签融合CA的裂解液上清；7、His标签融合CA后用Ni柱富集的流出物；8、His标签融合CA后用Ni柱富集的洗脱产物；9、蛋白分子量标尺。B图：从左至右泳道分别是，1、重组蛋白Fc-4C标签融合CK的全菌裂解液蛋白；2、Fc-4C融合CK后的裂解液上清；3、Fc-4C融合CK后用IgG颗粒富集的纯化流出物；4、Fc-4C融合CK后用IgG颗粒富集的纯化产物。

图8显示了Fc-4C标签对目的蛋白的结构与热稳定性的影响。A图：圆二色谱测定Fc-4C融合CA与His标签融合CA的二级结构。B图：利用圆二色谱对Fc-4C融合的CA与His标签融合的CA热稳定性探究。

图9显示了Zn离子对Fc-4C融合的CA与His标签融合CA的影响。A图：不同浓度的融合蛋白CA酶活力的测定。B图：补充1mM Zn²⁺后不同浓度的CA酶活力的测定。

图10是293T细胞转染了Fc-4C融合GFP的荧光图。A图：未转染GFP；B图：转染了野生型的GFP；C图：转染了N端融合Fc-4C标签的GFP；D图：转染了C端融合Fc-4C标签的GFP。

图11显示了不同浓度的Zn、Ni、Co、Cu等过渡金属离子对Fc-4C的影响。A图：不同浓度的Zn、Ni、Co、Cu等过渡金属离子对Fc-4C内源荧光的猝灭。B图：Zn、Ni、Co、Cu等过渡金属离子与Fc-4C的结合计量比。

表1显示了不同物种的IgG与Fc-4C、Fc-III、Z-结构域的结合常数。

表2显示了经过理论计算推导出的金属离子与Fc-4C的表观结合常数与解离常数。

具体实施方式

本文所用的术语“Fc-4C”、“Fc-4C肽”或者“Fc-4C多肽”可以互换使用，是指序列为CDCAWHLGELVWCTC(SEQ ID NO：1)的肽，其具有四个半胱氨酸，通过氧化可以形成具有两对二硫键的稳定双环结构。

本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，是指由氨基酸通过肽键连接而形成的聚合物。

本文所用的术语“标记物”是指可以与Fc-4C多肽连接并具有指示作用的物质，例如荧光素、碱性磷酸酶或者辣根过氧化物酶等。例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等可用于免疫印迹反应的信号放大。

本文所用的术语“Fc-4C多肽的偶联物”是指Fc-4C多肽与偶联配体连接形成的偶联物。例如，Fc-4C多肽可以与标记物例如荧光素偶联，也可以与聚乙二醇(PEG)等修饰基团偶联。

本文所用的术语“固相基质”是指基本呈固相的介质，例如琼脂糖凝胶颗粒或磁珠。例如，在本发明的具体实施方案中，将Fc-4C肽段偶联到琼脂糖凝胶颗粒上可以高效快捷地对IgG进行分离纯化。

本文所用的术语“融合蛋白”具有本领域公知的含义，是指具有来源于两个或更多个蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或多肽。如本领域技术人员所知，融合蛋白还可以包括氨基酸连接区。

本文所用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有本领域公知的含义，包括整个抗体或其任何抗原结合片段(即“结合抗原部分”)或单链。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。

本文所用的术语IgG的“Fc片段”是指包含IgG的Fc区的片段。“Fc片段”可以包含单聚体或二聚体形式的重链铰链多肽及免疫球蛋白的重链的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，术语“Fc区”可以指由H链的CH2和CH3结构域组成的区域。“Fc区”可以被包含在“Fc片段”中。

IgG的Fc片段可以通过蛋白酶水解IgG获得，也可以通过本领域已知的其他方法获得。

本发明的Fc-4C多肽不仅对人IgG具有高度亲和力，而且具有物种广谱性。实验表明，本发明的Fc-4C多肽对小鼠、兔、大鼠、牛、羊、马以及猪等物种的IgG的解离常数都在30nM以内。因此，本文所用的术语“IgG”并不局限于人IgG，其同样涵盖来自小鼠、兔、大鼠、牛、羊、马以及猪等物种的IgG。

术语“基于IgG或IgG的Fc片段的纯化体系”是指采用IgG或IgG的Fc片段对目的产物进行纯化的体系。例如，IgG或其Fc片段可以被固定在固相载体例如琼脂糖凝胶颗粒上，以便于对目的蛋白(例如与Fc-4C多肽融合的碳酸酐酶)进行分 离纯化。

术语“免疫检测”(immunoassay)是指应用免疫学技术测定样本的方法。包括例如免疫印迹检测和免疫荧光检测。

术语“融合标签”(fusion tag)是指可以与目的蛋白连接以便于例如目的蛋白的纯化或者检测的物质。常见的融合标签包括例如多聚组氨酸标签(His-Tag)、GST-Tag、Trx-Tag、Flag-Tag、S-Tag等。

实施例1双环肽Fc-4C的制备及性质研究

研究概述

Fc-III是一段由13个氨基酸残基组成的多肽，其构象为环状发卡结构，并且含有两个半胱氨酸残基形成的链内二硫键。已有报道证明Fc-III能与IgG的Fc的铰链区有较强的亲和结合。为了提升二者之间的亲和力，我们基于Fc-III设计并合成了含有四个半胱氨酸的多肽Fc-4C，通过氧化可以形成具有两对二硫键的稳定双环结构。测定数据显示Fc-4C与人IgG的亲和力比Fc-III提升了35倍，同时对小鼠、兔、大鼠、牛、羊、马以及猪等物种的IgG的解离常数都在30nM以内；Fc-4C既提升了对IgG的亲和力，也具有物种广谱性。将Fc-4C肽段偶联到琼脂糖凝胶颗粒上可以高效快捷地对IgG进行分离纯化；Fc-4C连接辣根过氧化物酶HRP或荧光素FITC后可还用于免疫印迹、免疫荧光实验进行蛋白质的定位与检测。另外，Fc-4C重组表达后还可以作为融合标签，通过IgG偶联的填料对融合蛋白进行分离纯化。进一步，热变性实验证明Fc-4C融合标签对目的蛋白碳酸酐酶(CA)的结构没有显著影响。而融合标签对目的蛋白碳酸酐酶(CA)的活力测定以及金属结合测定表明，Fc-4C可以与第一过渡系的金属离子Zn、Ni、Co、Cu结合。作为融合标签Fc-4C不仅可以纯化蛋白，而且能够促进以过渡金属离子为辅酶的融合蛋白活力。综合本实验研究，Fc-4C双环肽在抗体的检测纯化以及重组蛋白的表达纯化方面都有很好的应用。

结果与讨论

Fc-4C可形成稳定的双环结构

Fc-4C多肽通过常规固相合成得到，在37℃温和搅拌过夜即可使还原型的直链肽形成丢失4个氢原子的具有两对二硫键的环肽。氧化后的Fc-4C多肽能通过HPLC快速分离，并且通过HPLC鉴定到氧化反应生成目的结构产物的效率高达95％(见图7)。为了精确指认Fc-4C中二硫键的形成位置，多肽经过Asp-N酶解后利用CID(碰撞诱导电离)碎裂并进行质谱鉴定。图1A中二价的质荷比(m/z)为867.83的 峰说明Fc-4C肽形成了两对二硫键；经过Asp-N酶解后，Fc-4C的酶解产物比原来增加了18Da。图1B为酶解产物的二级质谱图，其中的y₁(241.03m/z)和y₂(342.08m/z)是Cys1-Cys15和Cys3-Cys13形成二硫键的特征峰。图1B中其它碎片峰对应的结构如图1C所示。以上结果证明，Fc-4C双环肽可以简单地被制备出来且其两对二硫键的形成模式与设计相符。

Fc-4C与IgG有极高的亲和力并具有物种广谱性

我们通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术分别测定了人IgG与Fc-4C、Fc-III以及蛋白A的Z结构域之间的亲和力。将IgG蛋白偶联在CM5芯片上，多肽则分别稀释到5个不同的浓度，经微流路与芯片上偶联的IgG相互作用，通过检测SPR角度的变化来反映多肽配体与IgG的亲和力。之前的报道显示，FcBP-2与IgG的亲和力比蛋白A或Fc-III都要强10倍以上【15】。与他们的报道趋势及数量级一致，我们发现Fc-4C与人IgG的解离常数为2.45nM，而Fc-III仅为70nM。SPR实验结果显示Fc-4C同IgG的亲和力与FcBP-2相近，且都远高于蛋白A和蛋白G。另外我们还通过表面等离子共振技术分别测定了小鼠、兔、大鼠、牛、羊、马以及猪等物种的IgG与Fc-4C和Fc-III以及蛋白A的Z结构域之间的亲和力(见表1)。数据显示，Fc-4C与不同物种的解离常数均在30nM以内，对比Fc-III与蛋白A的Z结构域，Fc-4C兼具高亲和力与物种广谱性的优势。

利用Fc-4C做抗体纯化与蛋白检测

将Fc-4C通过氨基反应偶联到琼脂糖凝胶颗粒上并与人血清一同孵育，经过多次漂洗以及酸洗脱，洗脱下的蛋白通过一维电泳分离(图2)。纯化时，使用等体积的蛋白A琼脂糖颗粒与Fc-4C琼脂糖颗粒进行比较，通过电泳图灰度可知，相同体积的两种颗粒可富集的IgG的量是大致相同的。进一步，将两种琼脂糖颗粒在55℃与血清孵育后，蛋白A颗粒的IgG纯化量比Fc-4C颗粒低了约30％(图3A)。另外我们调整平衡琼脂糖颗粒的缓冲液pH值，对比了在pH 5-8时两种颗粒的纯化效率，在pH为6.5时两者的纯化效率最高，随pH降低，两种颗粒均有下降，但Fc-4C颗粒比蛋白A颗粒对酸的耐受性更好(图3B)。而使用不同浓度的盐酸胍与脲处理Fc-4C颗粒与蛋白A颗粒后进行IgG的纯化富集，同样可以发现Fc-4C颗粒比蛋白A颗粒更耐受变性剂(图3C)。以上这些结果说明，Fc-4C多肽偶联的颗粒比蛋白A更加稳定。

免疫荧光可以用来检测特定蛋白在细胞内的定位。由于Fc-4C与IgG的Fc片段有高特异的亲和力，我们可以将Fc-4C多肽标记上荧光素并结合一抗用于免疫荧光实验。为了证明Fc-4C的特异性，我们选取了两种具有不同细胞亚定位的蛋白进行 研究：β-微管蛋白(β-tubulin)通常定位于胞浆【18】，而PCNA(proliferating cell nuclear antigen)是一种核蛋白，在细胞周期的DNA合成阶段作为DNA聚合酶的辅助因子发挥作用【19-20】。我们首先将细胞固定在载玻片上，用小鼠来源的单克隆β-微管蛋白抗体和兔来源的单克隆PCNA抗体分别孵育细胞，之后加入FITC偶联的Fc-4C作为二抗，并用Hochest 33342对细胞核进行染色。荧光显微镜下观察，β-微管蛋白广泛分布于胞浆中，而PCNA都聚缩成颗粒分布于核内(图4A&4B)。免疫印迹常用来检测复杂样品中某些特定蛋白。我们同样将Fc-4C多肽与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，作为二抗用于免疫印迹实验。为了证明其特异性，我们选取了三种分子量近似却能通过电泳有效区分的蛋白进行研究：CA2分子量大小为30kD、PRDX3分子量大小为26kD、CD38分子量大小为35kD。我们收集并用RIPA裂解293T细胞，将细胞裂解液通过SDS-PAGE分离，使用半干法将蛋白转至PVDF膜上。用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜，孵育对应的一抗，其中CD38为小鼠来源的单抗，CA2与PRDX3为兔多抗；之后加入HRP偶联的Fc-4C作为二抗，用化学发光显色液进行显色。可以看到，在对应的分子量大小能见到较为特异的条带(图4C)。以上这些结果说明，FITC-Fc-4C以及HRP-Fc-4C具有高度的特异性，是有效的免疫荧光、免疫印迹检测试剂。

建立Fc-4C融合蛋白表达体系

我们选择碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)作为模式蛋白与Fc-4C标签融合，构建重组蛋白表达体系。CA能够高速可逆地催化碳酸与二氧化碳之间的转换，并且作为模式蛋白广泛用于蛋白质折叠与酶学研究【21】。将编码Fc-4C标签的DNA序列(TGTGACTGTGCATGGCATCTTGGAGAACTCGTATGGTGTACTTGT)(SEQ ID NO：2)***到碳酸酐酶cDNA的C端，并构建到质粒pet-28a上。重组质粒转化至具有T7启动子的大肠杆菌BL21(ED3)pLySs菌株中，经IPTG诱导表达后，用一维电泳分离可见在33kD附近有着色较深的染色条带，这与融合了Fc-4C标签的CA大小相符。为了进一步对表达的蛋白进行鉴定，这段染色条带被切下并用胰酶酶解，利用质谱进行鉴定。酶解后的包含有Fc-4C标签序列的肽的一级质谱图见图5A。二价的包含有Fc-4C序列的双环肽最小同位素峰为1005.88m/z，若经过二硫苏糖醇(DTT)还原与碘乙酰胺(IAA)处理后，这段含有Fc-4C多肽的二硫键被打开，其4个巯基被烷基化修饰，因此质荷比将会增加进而迁移至1121.94m/z。还原并烷基化的含有Fc-4C多肽的二级质谱图展示在图5B中。这些结果说明Fc-4C标签可以与目的蛋白重组表达，并且重组表达的标签具有两对二硫键的双环结构。

为了探究融合在目的蛋白上的Fc-4C标签是否还能同IgG进行亲和结合，我们用MST实验测定对比了融合Fc-4C的CA、Fc-III的CA以及Z结构域的CA与IgG的亲和力(图6)。结果显示，Fc-4C-CA与IgG的解离常数为2.28nM，Z-CA为13.7 nM，而Fc-III-CA与IgG的解离常数为235nM。这说明Fc-4C标签在融合表达后与合成的Fc-4C多肽具有类似的亲和性质。之前我们实验室报道了利用Fc-III作为标签、使用偶联了IgG-Fc琼脂糖凝胶颗粒亲和纯化的蛋白纯化体系。相似的，Fc-4C融合的CA同样可以有效地利用IgG琼脂糖凝胶颗粒进行纯化。如图7所示，目的蛋白CA通过Fc-4C标签的纯化效率与His标签纯化的效率相似，并且特异性良好(图7A)。相似的，目的蛋白CK也能通过Fc-4C标签的到很到的纯化效果(图7B)。以上结果说明Fc-4C标签可较好地应用于蛋白质重组表达纯化体系中。

Fc-4C标签对融合蛋白的结构与热稳定性的影响

进一步，我们通过圆二色光谱以及测量酶活实验对比了带有His标签以及Fc-4C标签的CA的二级结构与酶活力。带有Fc-4C标签的CA与带His标签的CA二级结构类似(见图8A)。热变性能够使得二级结构解聚，当温度提升，His标签以及Fc-4C融合的CA逐渐失去二级结构，并且两者的规律相似(图8B)。

以上结果都说明Fc-4C标签对目的蛋白CA的结构和稳定性都没有显著影响，这作为融合标签而言是十分优良的性质。

Fc-4C标签对融合蛋白的活力影响

对于融合蛋白的活性而言，我们对比了Fc-4C标签的CA与His标签的CA催化对硝基苯基乙酸酯的水解活性。发现当CA浓度较低(8μM)时，Fc-4C标签融合的CA与His标签融合CA的活性差距不大。随着CA浓度的提升，Fc-4C标签的CA活力要高于相同浓度下His标签的CA活性。当蛋白浓度达到100μM时，Fc-4C标签CA的活力是同等浓度下His标签CA的2.5倍(图9A)。由于CA的催化反应是以Zn²⁺为辅酶的，我们猜测不同的标签可能对于金属离子的捕获能力不同进而影响到酶的活性。因此我们在测活体系中补充了1mM的ZnSO₄，可以发现Zn²⁺的加入弥补了His标签的活力差异(图9B)，也说明Fc-4C能有效的捕获并利用Zn²⁺帮助CA提升活力。

为了探究Fc-4C标签在体内对融合目的蛋白功能性质的影响，我们使用了GFP作为模式体系，以观察GFP的荧光强度作为评测条件。如图10所示，转染了野生型GFP、Fc-III融合的GFP以及Fc-4C融合的GFP的293T细胞的荧光强度并无显著差异。

Fc-4C与金属离子的结合

为了进一步确认Fc-4C标签能与金属离子相结合以促进以金属为辅酶的酶活力，我们通过荧光淬灭实验【24】，测定了Fc-4C与多种金属离子的结合。Fc-4C多肽有两个色氨酸残基，具有內源荧光可以被监测。我们对Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、 Fe²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Al³⁺以及Mg²⁺等多种离子与Fc-4C的结合能力进行了测定。发现在Fc-4C多肽溶液中添加不同浓度倍比的Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺后，内源荧光强度有较为显著的淬灭现象(图11A)。当金属离子浓度趋于饱和时，滴定曲线的峰强度显著降低。通过绘制ΔF/F的曲线图，可以计算得到单个多肽分子与金属离子的结合位点个数(图11B)。Fc-4C确实能够与多种过渡金属有较强的相互作用，Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺离子与Fc-4C多肽结合的位点分别是3、8、4及3个。通过理论计算，可以分别得出多肽与各金属离子的表观结合常数_app(见表2)，结合常数均在10⁵L/mol以上，说明Fc-4C多肽与Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺离子有特异结合并且结合力都较强。在与Fc-4C有特异结合的金属离子中，Zn²⁺、Cu²⁺离子是十分重要且普遍的蛋白酶辅助因子，因此Fc-4C作为融合标签在表达纯化金属为辅酶的蛋白时可能对目的蛋白的活力有提升。

结论

在本工作中，我们将Fc-III多肽的N、C两端添加了两个Cys残基并设计命名为Fc-4C。通过质谱鉴定，简单氧化后的Fc-4C多肽含有两对链内二硫键，由Cys1-Cys15和Cys3-Cys12介导形成。SPR检测分子相互作用得到，Fc-4C与人IgG的亲和力比Fc-III高80倍，甚至高于蛋白A和蛋白G。另外，Fc-4C可以快速偶联至琼脂糖凝胶颗粒或荧光素上：Fc-4C偶联的琼脂糖凝胶颗粒对于抗体纯化是十分有效的基质，荧光素偶联的Fc-4C可以作为荧光二抗用于免疫荧光实验。另外，我们还将Fc-4C发展成了蛋白质重组表达的融合标签，通过偶联了IgG的琼脂糖凝胶颗粒可以纯化目的蛋白。我们以GFP及CA作为模式蛋白研究了Fc-4C作为标签对目的蛋白结构和活性的影响，Fc-4C对GFP和CA的二级结构、活性以及热稳定性没有显著影响。并且我们发现Fc-4C多肽能够与Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺等第一过渡系的金属离子结合。综上，Fc-4C多肽对抗体纯化、蛋白检测与重组蛋白的融合表达都是十分有用的工具。

实验材料与方法

质粒构建

pEGFP-N1上已经有GFP基因，将Fc-4C标签DNA序列构建到质粒上，重组后转染细胞。

构建融合Fc-4C标签的CA II pET-28a重组质粒(Novagen，Merck Millipore，德国)。主要分成两步：

(1)改造pET-28a以及pET-21b质粒，将Fc-4C构建到原始质粒上。简单说来，将Fc-4C***到pET-28a多克隆位点EcoR I和Xho I之间：

F5：TCCGGAATTCTGTGACTGTGCATGGCATCTTGGAGAACTCGTATGGTGTACTTGTTAGCTCGAGCACC(SEQ ID NO：3)；

R3：GGTGCTCGAGCTAACAAGTACACCATACGAGTTCTCCAAGATGCCATGCACAGTCACAGAATTCCGGA(SEQ ID NO：4)。

将Fc-4C***到pET-21b多克隆位HindIII和Xho I之间：

F5：AGCTTTGTGACTGTGCATGGCATCTTGGAGAACTCGTATGGTGTACTTGTTGAC(SEQ ID NO：5)；

R3：TCGAGTCAACAAGTACACCATACGAGTTCTCCAAGATGCCATGCACAGTCACAA(SEQ ID NO：6)。表达Fc-4C多肽的密码子已经用下划线标出。

(2)在第一步的基础上，构建融合Fc-4C标签的CA II、CK的重组质粒。

将CA II***在NdeI和EcoRI之间：

F5：GGGAATTCCATATGTCCCATCACTGGGGGTACGG(SEQ ID NO：7)；

R3：ATCCGAATTCTTTGAAGGAAGCTTTGATTT(SEQ ID NO：8)。

将CK***在NdeI和HindIII之间：

F5：GGAATTCCATATGATGCCATTCGGTAACACCCACAACAAG(SEQ ID NO：9)；

R3：CCGCAAGCTTCTTCTGGGCGGGGATCATGTCGTCAA(SEQ ID NO：10)。

蛋白表达与纯化

用Lipo2000转染试剂(Invitrogen)将空质粒pEGFP-N1、带有Fc-III标签的GFP、Fc-4C标签的GFP质粒分别转染进HEK293T细胞系中(从ATCC购入)。细胞转染后培养24小时，在荧光显微镜(Nikon，Eclipse Ti-E)下观察。

Fc-4C融合CA、Fc-III融合CA以及仅带有His标签的CA在大肠杆菌BL21(DE3)pLySs菌株(Novagen，Merck Millipore，德国)中表达并纯化。简单来说，对于Fc-4C标签融合的CA、Fc-III标签融合的CA，将细胞裂解后4℃与IgG琼脂糖凝胶颗粒孵育1小时，之后用醋酸-醋酸铵(pH 3.4)缓冲液洗脱。做为生化分析的蛋白，我们用Ni-FF(Qiagen)纯化融合蛋白，蛋白在250mM咪唑的磷酸盐(pH8.0)下洗脱。所有的蛋白样品在纯化后都用Sephacryl S300分子筛进一步纯化。对于Fc-4C标签融合的CK蛋白，同样在大肠杆菌BL21(DE3)pLySs菌株(Novagen，Merck Millipore，德国)中表达并纯化。将细胞裂解后4℃与IgG琼脂糖凝胶颗粒孵育1小时，之后用醋酸-醋酸铵(pH 3.4)缓冲液洗脱。通过SDS-PAGE检测重组蛋白的纯度都超过95％。

LC-MS/MS分析

蛋白样品经过SDS-PAGE检测纯度并分离，对于目的蛋白条带切下DTT还原后用IAA烷基化，之后在50mM碳酸氢铵缓冲液中胰酶酶解37℃过夜。酶解后的肽段用含1％三氟乙酸的乙腈水溶液萃取两次。萃取产物通过真空浓缩仪浓缩。

为了利于LC-MS/MS分析，酶解后的产物用DIONEX ultimate 3000系列nano-HPLC液相色谱以0.25μL每分钟的流速分60分钟梯度洗脱。洗脱产物直接上Thermo的LTQ-Orbitrap质谱仪分析。质谱仪中分析柱是自制的填充了C-18填料(300A，5μm，Varian，Lexington，MA)石英毛细柱(75μm内径，150mm长；Upchurch，Oak Harbor，WA)。流动相A是含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B是含有0.1％甲酸的乙腈溶液。LTQ-Orbitrap质谱仪采用的数据依赖性采集模式(Data-dependent acquisition mode)。Orbitrap中每做一张全扫的一级质谱(400-1800m/z，30000分辨率)都以35％的碰撞能量在离子阱中采集20次数据依赖的二级质谱。质谱数据用Xcalibur 2.0.7软件分析并用Proteome Discovery搜索算法。

表面等离子共振(S)亲和力测定与分析

表面等离子共振(SPR)使用的BIAcore T200仪器(GE healthcare)以及CM5芯片。将人IgG溶解于磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，通过EDC/NHS氨基反应直接偶联在CM5芯片上。空白通道作为阴性对照。为了做SPR测定，所有的肽段都用运行缓冲液(含有0.005％表面活性剂P20的PBS)溶解，重组蛋白也都透析至该缓冲液中。分析物以30μL每分钟的流速进入微流路与芯片上的偶联物结合再解离。每次结合解离的循环后，芯片用10mM的甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.0)再生。通过阴性对照通道的参比背景，可以得到反应的曲线并通过Evaluation1.0软件拟合并测算。

微量热泳动亲和力测定与分析

将蛋白与多肽样品均溶于50mM PBS(pH7.8)缓冲液中。热泳动实验用于测量人IgG与带有三种不同标签的CA II(Fc-4C标签、Fc-III标签与Z-结构域标签)之间的亲和力。人IgG(购自索莱宝公司)用荧光染料NT-647标记，标记过程参见使用手册(NanoTemper)。将CAII用PBS(pH7.8)倍比稀释成12个连续浓度梯度，并与20nM的IgG蛋白溶液(溶于pH7.8的PBS缓冲液，含0.05％BSA以及0.01％Tween 20)混合，具体地，Fc-4C标签的CA II最高终浓度为640nM，Fc-III标签的CA II最高终浓度为3.5μM，Z-结构域标签CA II为233nM。混合蛋白样孵育15分钟，15000g离心5分钟后取上清转移至毛细管中。将毛细管按照浓度由低到高排列转移至NanoTemper Monolith NT.115型微量热泳动分析仪中进行毛细管扫描。最终结果经过均一化与曲线拟合得到K_d值。

免疫荧光与IgG的富集纯化

免疫荧光实验，人肝癌细胞系HepG2细胞(从ATCC购进)以37℃，10％血清及5％二氧化碳浓度的条件下培养在盖玻片上。之后用4％甲醛含0.2％Triton X-100的溶液固定细胞。用PBS缓冲液洗涤三次，用5％的牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时。封闭后用PCNA单克隆兔抗(1∶100稀释，Abcam，Cambridge，UK)以及β-微管蛋白单克隆鼠抗(1∶100稀释，Easybio，北京，中国)4℃孵育过夜并用PBS洗涤三次。将FITC-Fc-4C多肽按1∶500溶解并作为二抗孵育半小时，之后用终浓度为1μg/ml的Hochest 33342染核20min。做好的免疫荧光封片后用Zeiss LSM 710(Carl Zeiss，Germany)共聚焦显微镜观察Hoechest 33342及FITC的荧光图像。

对于IgG富集实验，将Fc-4C多肽偶联至NHS-活化的琼脂糖颗粒上(NHS-activatedSepharose TM 4Fast Flow，GE Healthcare)。在偶联后，Fc-4C填料用50mM Tris-HCl，0.05％Tween 20缓冲液(pH 7.8)平衡。人血清由首都医科大学朝阳医院捐赠，免疫后的兔血清够自。将25μl血清稀释8倍体积后15000g高速离心15min去除沉淀。将血清上清与100μlFc-4C偶联填料或蛋白A偶联填料(Protein A Sepharose 4Fast Flow，GE Healthcare)混匀后4℃颠倒孵育30min。之后用50mM Tris-HCl(pH6.0)漂洗三次，用HAc-NHAc(pH3.4)洗脱。洗脱后的样品用12％SDS-PAGE胶检测纯化效率，并且在不同温度和不同结合pH条件下检测了纯化效率。

活性测定与

CA的活性可以通过酯酶活性测定来测量【15】。1mM的对硝基苯乙酸酯(p-NPA)作为底物与CA共同室温孵育，用分光光度计在348nm波长下检测光的吸收并计算反应效率。

蛋白光谱测定

圆二色光谱用来测量CA二级结构及在热变性条件下的变化。所有的蛋白样品都透析至50mM PBS中(pH7.8)。在25℃下，使用1mm光径的比色皿在Pistarπ-180(AppliedPhotophysics Ltd)仪器上测定。扫描波长从180nm至260nm。并且也在30℃、45℃、55℃以及70℃的不同温度下的谱图变化探究热稳定性对二级结构的影响。

荧光光谱是通过日立F-4500型荧光分光光度计在295nm波长的激发光下激发扫描得到。为了测定Fc-4C与Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺、Al³⁺以及Mg²⁺等多种离子的结合位点，我们测定了Fc-4C与对应离子混合液的荧光滴定光谱，激发光条件同上。具体结合位点个数与表观结合常数的计算方法参见参考文献【24】。

参考文献

1.Sidhu SS，Fairbrother WJ，Deshayes K.(2003)Exploring protein-proteininteractions with phage display.Chembiochem.4：14-25.

2.Dwyer MA，Lu W，Dwyer JJ，KossiakoffAA.(2000)Biosyntheitc phagedisplay：a novel protein engineering tool combining chemical and geneticdiversity.Chem Biol.4：263-274.

3.Hruby VJ，Cai M.(2013)Design ofpeptide and peptidomimetic ligandswith novel pharmacological activity profiles.Annu Rev Pharmacol Toxicol.53：557-580.

4.Nilsson J，Stahl S，Lundeberg J，Uhlen M，Nygren P(1997)Affinity FusionStrategies for Detection，Purification，and Immobilization of RecombinantProteins.Protein Expres Purif.11：1-16.

5.Terpe K(2003)Overview of tag protein fusions：from molecular andbiochemical fundamentals to commercial systems.Appl Microbiol Biotechnol.60：523-533.

6.Malhotra A(2009)Tagging for protein expression.Methods Enzymol 463：239-258.

7.Uhlen M，Forsberg，Moks T，Hartmanis M，Nilsson B(1992)Fusion proteinsin biotechnology.Curr Opin Biotechnol 3：363-369.

8.Hengen P(1995)Purification of His-Tag fusion proteinsfromEscherichiacoli.TrendsBiochemSci 20：285-286.

9.Hopp TP，Pricket KS，Price VL，Libby RT，March CJ，Ceretti DP，Urdal DL，Conlon PJ(1998)A short polypeptide marker sequence useful for recombinantprotein identification and purification.Bio/Technology 6：1204-1210.

10.Marblestone G，Edavettal C，Lim Y，Lim P，Zuo X，Butt R(2006)Comparisonof SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems：enhancedexpression and solubility with SUMO.Protein Sci 15：182-189.

11.Bechett GJ，Hayes JD(1993)Glutathione S-transferases：biomedicalapplications.Adv Clin Chem 30：281-380.

12.Guan C，Li P，Riggs PD，Inouye H(1987)Vectors that facilitate theexpression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusionto maltose-binding protein.Gene 67：21-30.

13.Pryor KD，LeitingB(1997)High-level expression of soluble protein inEscherichia coli using His6-tag and maltose-binding-protein double-affinitysystem.Prot Expr Purif 10：309-319.

14.DeLano WL，Ultsch MH，de Vos AM，Wells JA(2000)Convergent Solution toBinding at a Protein-Protein Interface.Science 287：1279-1283.

15.Dias RL，Fasan R，Moehle K，Renard A，Obrecht D，et al.(2006)ProteinLigand Design：From Phage Display to Synthetic Protein Epitope Mimetics inHuman Antibody Fc-Binding Peptidomimetics.J Am ChemSoc 128：2726-2732.

16.Feng S，Tian E，Zhang L，Wang Q，Deng H(2012)Development of the Fc-IIItagged protein expression system for protein purification and detection.PLoSOne 7：e44208.

17.Feng S，Gong Y，Gulishana A，Deng H(2013)Effects of the Fc-III tag onactivity and stability of green fluorescent protein and human muscle creatinekinase.Protein Science 22：1008-1015.

18.Williams Rc Jr，Shah C，Sackett D(1999)Separation of tubulinisoforms by isoelectric focusing in immobilized pH gradient gels.Anal Biochem275：265-267.

19.Cazzalini O.，Sommatis S.，Tillhon M.，Dutto I.，Bachi A.，Rapp A.，Nardo T.，Scovassi A.I.，Necchi D.，Cardoso M.C.，Stivala L.A.，Prosperi E.(2014)CBP and p300 acetylate PCNA to link its degradation with nucleotide excisionrepair synthesis.Nucleic Acids Res.42：8433-8448.

20.Leonardi E，Girlando S，Serio G，Mauri FA，Perrone G，Barbareschi M etal.(1992)PCNA and Ki67 expression in breast carcinoma：correlations withclinical and biological variables.J.Clin.Pathol.45：416-419.

21.Pocker Y，Stone T(1967)The Catalytic Versatility of ErythrocyteCarbonic Anhydrase.III.Kinetic Studies of the Enzyme-Catalyzed Hydrolysis ofp-Nitrophenyl Acetate.Biochemistry 6：668-678.

22.S.Lindskog(1997)Structure and Mechanism of Carbonicanhydrase.Pharmacol.Ther.74：1-20.

23.Habibzadegan A，Tu C，Silverman DN，McKenna R.(2013)Structural andcatalytic characterization of a thermally stable and acid-stable variant ofhuman carbonic anhydrase II containing an engineered disulfide bond.ActaCrystallogr D Biol Crystallogr.69：1414-1422.

24.Raymond CK，David E，Jensen H.von H.，Peter H.von H(1976)DNA“melting”7 proteins.J.Biol.Chem.251：7240-7250.

表1.Fc-4C、Fc-III、Z结构域对不同物种的IgG的解离常数

表2.Fc-4C与Zn²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺离子的表观结合常数K_app与解离常数K_d

Claims (25)

1.多肽，其氨基酸序列为CDCAWHLGELVWCTC(SEQ ID NO：1)。

2.权利要求1的多肽，其与标记物偶联。

3.权利要求2的多肽，其中所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素。

4.权利要求1-3之任一项的多肽在纯化IgG或其Fc片段中的应用。

5.权利要求1-3之任一项的多肽在免疫检测中的应用。

6.权利要求5的应用，其中所述免疫检测为免疫印迹或免疫荧光。

7.权利要求1的多肽作为融合标签的应用。

8.权利要求7的应用，其中权利要求1的多肽作为融合标签与目的蛋白连接，以便通过基于IgG或IgG的Fc片段的纯化体系对所述目的蛋白进行纯化。

9.权利要求7的应用，其中权利要求1的多肽作为融合标签与目的蛋白连接，所述目的蛋白以过渡金属离子为辅酶。

10.权利要求9的应用，其中所述过渡金属离子为第一过渡系的金属离子。

11.权利要求9的应用，其中所述过渡金属离子选自由Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺构成的组。

12.权利要求9的应用，其中所述以过渡金属离子为辅酶的目的蛋白为碳酸酐酶。

13.融合蛋白，包含权利要求1的多肽和与之偶联的蛋白质。

14.固相基质，其中权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白被固定在所述固相基质中。

15.权利要求14的固相基质，其中所述固相基质为琼脂糖颗粒或磁珠。

16.编码权利要求1的多肽的核酸分子。

17.权利要求16的核酸分子，其核苷酸序列为：

TGTGACTGTGCATGGCATCTTGGAGAACTCGTATGGTGTACTTGT(SEQ ID NO：2)。

18.表达载体，其包含权利要求6或7的核酸分子。

19.检测样本中的IgG或其Fc片段的方法，包括：

将所述样本与权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白接触；以及

测定权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白与所述样本中的IgG或其Fc片段的结合水平。

20.从样本中纯化、富集或去除IgG或其Fc片段的方法，包括：

将含有IgG或其Fc片段的样本与权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白接触；以及

从样本中分离出与权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白结合的IgG或其Fc片段。

21.权利要求19或20的方法，其中权利要求1-3之任一项的多肽或权利要求13的融合蛋白被固定在固相基质中。

22.权利要求21的方法，其中所述固相基质为琼脂糖颗粒或磁珠。

23.纯化或富集目的蛋白的方法，包括：

重组产生融合蛋白，该融合蛋白包含目的蛋白和权利要求1的多肽；

将含有该融合蛋白的样本与IgG或其Fc片段接触；以及

从样本中分离出与IgG或其Fc片段结合的融合蛋白。

24.权利要求23的方法，进一步包括：从所述融合蛋白中释放出所述目的蛋白。

25.用于检测或纯化IgG或其Fc片段的试剂盒，包含权利要求1-3之任一项的多肽、权利要求13的融合蛋白或者权利要求14的固相基质。