CN106715704B

CN106715704B - 糖液的制造方法

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Publication number: CN106715704B
Application number: CN201580049880.4A
Authority: CN
Inventors: 船田茂行; 栗原宏征; 山田胜成
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2014-09-26
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2035-09-18
Also published as: US9920346B2; JP6565684B2; AU2015322688B2; BR112017005071A2; WO2016047589A1; JPWO2016047589A1; PH12017500524A1; MY179402A; CA2962035C; US20170306372A1; AU2015322688A1; PH12017500524B1; CN106715704A; BR112017005071B1; CA2962035A1

Abstract

本发明的糖液的制造方法，是来自含纤维素生物质的糖液的制造方法，包括：工序(1)：将含纤维素生物质用源自枝顶孢属或曲霉属微生物的木聚糖内切酶水解，获得木聚糖内切酶水解物，工序(2)：将所述木聚糖内切酶水解物固液分离成木聚糖内切酶水解固体物和木聚糖内切酶水解液体，工序(3)：将所述木聚糖内切酶水解固体物用源自丝状菌的纤维素酶水解，获得纤维素酶水解物，及工序(4)：使所述纤维素酶水解物通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收糖液，从非透过液侧回收酶成分。

Description

糖液的制造方法

技术领域

本发明涉及由生物质制造可在发酵原料等中使用的糖液的方法。

背景技术

以糖为原料的化学品的发酵生产工艺用于各种工业原料生产。作为成为该发酵原料的糖，现在工业上使用源自甘蔗、淀粉、甜菜等食用原料的糖。但是，从今后世界人口的增加带来的食用原料价格高涨、或者与食用竞争的伦理的方面考虑，构建由可再生的非食用资源、即含纤维素生物质有效地制造糖液的工艺、或者以得到的糖液为发酵原料、有效地转换成工业原料的工艺成为今后的课题。

作为由含纤维素生物质制造糖液的方法，除通过使用浓硫酸经酸将纤维素及半纤维素水解来制造糖液的方法以外，还已知通过用稀硫酸将含纤维素生物质水解后，进一步用纤维素酶等酶进行糖化处理来制造糖液的方法(非专利文献1)。另外，公开了通过将含纤维素生物质用240～280℃的加压热水水解后，进一步用糖化酶进行糖化处理来制造糖液的方法(专利文献1)。这些之中，近年来尤其广泛研究能量使用量及环境负荷少、且糖产量多的使用糖化酶的生物质的水解方法。然而，由于使用糖化酶制造糖液的方法酶费用高，因而用于制造糖液的费用增高。

作为使用糖化酶制造糖液的方法中的前述技术课题的解决方法，提出了将水解中使用的糖化酶回收再利用的方法。例如公开了用旋转过滤器连续进行固液分离，使得到的糖液通过超滤膜进行过滤而回收酶的方法(专利文献2)，通过在酶糖化的阶段投入表面活性剂来抑制酶吸附，使酶的回收效率提高的方法(专利文献3)等。另外，公开了通过在下次以后的糖化反应前使用回收的酶水解生物质，从而糖化反应时的酶回收率提高，能够降低酶使用量的方法(专利文献4)等。专利文献4中，在实施例中回收酶与糖化反应中使用的酶是源自相同丝状菌的酶，实施例中使用木霉。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特许3041380号公报

专利文献2:日本特开2006-87319号公报

专利文献3:日本特开昭63-87994号公报

专利文献4:国际公开第2011/115040号

非专利文献

非专利文献1:A.Aden等，“Lignocellulosic Biomass to Ethanol ProcessDesign and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis andEnzymatic Hydrolysis for Corn Stover”NREL Technical Report(2002)

发明内容

如上所述，开发了回收在含纤维素生物质的水解中使用的酶的方法，但在削减糖化酶的使用量的观点上考虑，其效果依然不充分，寻求在由含纤维素生物质制造糖液时，在更有效地利用糖化酶的同时制造糖液的方法。

于是，本发明的课题在于，提供能够使糖化酶的使用量的削减效果进一步提高的糖液的制造方法。

本发明包含以下[1]～[8]构成。

[1]糖液的制造方法，是来自含纤维素生物质的糖液的制造方法，包括以下工序：

工序(1)：将含纤维素生物质用源自枝顶孢属或曲霉属微生物的木聚糖内切酶水解，获得木聚糖内切酶水解物，

工序(2)：将所述木聚糖内切酶水解物固液分离成木聚糖内切酶水解固体物和木聚糖内切酶水解液体，

工序(3)：将所述木聚糖内切酶水解固体物用源自丝状菌的纤维素酶水解，获得纤维素酶水解物，及

工序(4)：使所述纤维素酶水解物通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收糖液，从非透过液侧回收酶成分。

[2]根据(1)所述的糖液的制造方法，所述含纤维素生物质是经选自碱处理、水热处理及稀硫酸处理中的一种以上方法进行前处理而得的。

[3]根据(1)或(2)所述的糖液的制造方法，所述木聚糖内切酶的酶活性是80U/mg-蛋白以上。

[4]根据(1)～(3)中任一项所述的糖液的制造方法，所述木聚糖内切酶水解物的固液分离满足以下关系式：

木聚糖内切酶水解固体物的重量＜木聚糖内切酶水解液体的重量。

[5]根据(1)～(4)中任一项所述的糖液的制造方法，进一步包括使所述木聚糖内切酶水解液体通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收低聚木糖液，从非透过液侧回收木聚糖内切酶的工序。

[6]根据(1)～(5)中任一项所述的糖液的制造方法，所述源自丝状菌的纤维素酶源自木霉属微生物。

[7]根据权利要求1～6中任一项所述的糖液的制造方法，工序(4) 是使所述纤维素酶水解物固液分离而得的纤维素酶水解液体通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收糖液，从非透过液侧回收酶成分的工序。

[8]根据(1)～(7)中任一项所述的糖液的制造方法，将所述酶成分作为工序(3)的源自丝状菌的纤维素酶使用。

本发明中，在使含纤维素生物质进行糖化反应前，预先将含纤维素生物质用木聚糖内切酶水解，将所得的木聚糖内切酶水解物进行固液分离，从而获得木聚糖内切酶水解固体物。通过将该木聚糖内切酶水解固体物用源自丝状菌的纤维素酶水解而得的非透过液进行回收再利用，由此能够在糖液的制造过程中使糖化酶的使用量的削减效果进一步提高。由此能够将糖液的制造成本抑制得较低。

附图说明

图1是显示本发明的糖液制造方法的图。

图2是显示本发明的糖液的制造方法的另一例的图。

具体实施方式

将本发明的糖液的制造方法示于图1。对于本发明按各工序逐个地进行详细说明。此外，本发明不限定于以下说明。

[工序(1)]

工序(1)是将含纤维素生物质用源自枝顶孢属或曲霉属微生物的木聚糖内切酶水解，获得木聚糖内切酶水解物的工序。

工序(1)中使用的含纤维素生物质，是指至少包含纤维素的生物资源。作为含纤维素生物质的具体例，可以举出甘蔗渣、玉米芯、柳枝稷、象草、蔗茅、玉米秸秆、稻秸、麦秸等草本系生物质、或树木、废建材等木质系生物质、由木质系生物质获得的纸浆、以及藻类、海草等源自水生环境的生物质、玉米外皮、小麦外皮、大豆外皮、稻壳等谷物外皮生物质等，谷物皮类生物质、稻秸最有效，因而优选利用。

含纤维素生物质的水解是指以使纤维素或半纤维素低分子量化而生成单糖或寡糖为目的的水解。在本工序的利用木聚糖内切酶的含纤维素生物质的水解中，作为半纤维素成分的木聚糖被水解。在本发明中，所谓“木聚糖内切酶”，是通过与β-1,4键合的木糖主链作用而将半纤维素水解的酶，是分类成EC号3.3.1.8的酶。

在将含纤维素生物质通过木聚糖内切酶水解前，为了使水解效率提高，优选对含纤维素生物质进行前处理。由此，能够使利用源自丝状菌的纤维素酶的含纤维素生物质的水解效率提高。另外，当准备工序(1)时，可以购买预先进行了前处理的生物质前处理物使用，本发明中也包含这种方式。

作为含纤维素生物质的前处理方法，没有特别限制，具体而言可以举出酸处理、硫酸处理、稀硫酸处理、碱处理、苛性钠处理、氨处理、水热处理、亚临界水处理、微粉碎处理、蒸煮处理等，但在本发明中，从后述工序(4)中高效地回收各种酶的观点考虑，优选水热处理、稀硫酸处理、碱处理。此外，所谓水热处理，添加水使得生物质的固体物浓度为0.1～50重量％，然后在100～400℃的温度下处理1秒～60分钟。通过在这样的温度条件下进行处理，纤维素或半纤维素发生水解。特别是温度优选为 100℃～250℃的范围，处理时间优选为5～30分钟。对处理次数没有特别限定，进行1次以上该处理即可。特别是进行2次以上该处理的情况下，可以在不同的条件下实施第1次和第2次以后的处理。所谓稀硫酸处理，是在水热处理中添加硫酸的处理。硫酸的添加量优选每1g重量的含纤维素生物质添加0.1～150mg硫酸。所谓碱处理，是在常温或水热处理中每1g 重量的含纤维素生物质添加0.1～150mg碱的处理。作为使用的碱，可以使用氢氧化钠、氢氧化钙、氨等。另外，可以在前处理后通过固液分离除去酸及碱。

本工序中，将源自枝顶孢属(Aremonium)或曲霉属(Aspergillus) 微生物的木聚糖内切酶用于水解。作为木聚糖内切酶，可以是由为了生产木聚糖内切酶而培养了一定时间的培养液通过柱等纯化而得的酶，也可以通过制备编码木聚糖内切酶的氨基酸序列的DNA，将其与表达载体连接，在宿主中导入表达载体，作为异种或同种蛋白质生产，进行分离及纯化，由此获得。编码氨基酸序列的密码子使用频率可以与枝顶孢属或曲霉属相同，也可以根据宿主的密码子使用频率变更。

作为枝顶孢属，没有特别限定，有互生枝顶孢(Acremonium alternatum)、弯曲枝顶孢(Acremonium curvulum)、桃色枝顶孢 (Acremonium persicinum)、瑞塞菲枝顶孢(Acremonium recifei)、直立枝顶孢(Acremonium strictum)、解纤维素枝顶孢(Acremonium cellulolyticus)等。

作为曲霉属，没有特别限定，可以举出棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)。

作为枝顶孢属的木聚糖内切酶，只要含有木聚糖内切酶，就没有特别限制，可以举出从Meiji Seikaファルマ株式会社销售的“アクレモニウムセルラーゼ”纯化木聚糖内切酶而得的纯化酶。另外，作为曲霉属的木聚糖内切酶，只要含有木聚糖内切酶，就没有特别限制，可以举出エイチビィアイ株式会社销售的“セルロシンHC100”等。

作为木聚糖内切酶的活性，以桦木木聚糖(Birch wood xylan)为底物，在1分钟生成1μmol的木糖生成的酶量为1U。在活性测定中，可以使用二硝基水杨酸法(DNS法)，测定540nm的吸光度，由此测定反应后的反应液所含的还原糖量，通过预先使用已知的木糖测定的标准曲线求得还原糖量。活性测定的条件由桦木木聚糖1％、50℃、pH5、10分钟的反应求得。

作为利用木聚糖内切酶的水解的反应条件，只要依据木聚糖内切酶的优选反应条件进行，就没有限定，作为木聚糖内切酶的活性，如果活性低，则木聚糖内切酶添加量增多，经济性变差，因而优选使用木聚糖酶活性高的酶。具体而言，优选每1mg重量酶80U以上的木聚糖内切酶，进一步优选为每1mg重量酶80～10,0000U的木聚糖内切酶。

作为木聚糖内切酶的添加量，没有特别限制，优选每1g重量生物质添加木聚糖内切酶0.05mg以上，进一步优选添加0.1mg以上。作为添加木聚糖内切酶进行水解的反应时间，没有特别限制，优选为1～48小时，进一步优选为4～24小时。使用源自枝顶孢属或曲霉属微生物的木聚糖内切酶时，通常的反应温度优选15～100℃的范围，更优选40～60℃，进一步优选50℃。水解的pH优选pH3～9的范围，更优选pH4～5.5，进一步优选pH5。此外，pH调节可以添加酸或碱至所希望的pH来调节，另外，可以适当使用缓冲液。此外，为了促进含纤维素生物质与糖化酶的接触，还为了使水解物的糖浓度均匀，水解物优选进行搅拌混合，加水使得纤维素的固体成分浓度优选为1～25重量％、更优选为5～20重量％的范围。

[工序(2)]

工序(2)是将所述木聚糖内切酶水解物固液分离成木聚糖内切酶水解固体物和木聚糖内切酶水解液体的工序。

对固液分离的方法没有特别限定，可以通过螺旋沉降机等的离心分离、压滤等的膜分离、利用压带、带式过滤、自然沉降的分离、或网筛、无纺布及滤纸等过滤法等进行固液分离。

对通过固液分离而分离的液体、固体的量没有特别限制，在获得提高后述的工序(4)中来自非透过液侧的酶成分的回收量的效果、而且进行木聚糖内切酶的回收及后述的低聚木糖回收上考虑，木聚糖内切酶水解物的固液分离的操作条件优选以满足以下关系式的方式设定条件。

木聚糖内切酶水解固体物的重量＜木聚糖内切酶水解液体的重量

在木聚糖内切酶水解液体中，通过木聚糖内切酶的作用而含纤维素生物质中的木聚糖水解，结果生成低聚木糖。另一方面，由于纤维素不受木聚糖酶水解，因此大部分以未分解的状态在木聚糖内切酶水解固体物中存在。

木聚糖内切酶水解液体可以通过超滤膜进行过滤。可以使木聚糖内切酶水解液体通过超滤膜，在超滤膜的非透过液侧回收木聚糖内切酶，在超滤膜的透过液侧回收低聚木糖。此时，可以通过用水、盐水洗涤木聚糖内切酶水解固体物而获得回收了酶的洗涤液，将该洗涤液与木聚糖内切酶水解液体混合。另外，在超滤膜的非透过侧回收的木聚糖内切酶能够在工序 (1)的含纤维素生物质的水解中再利用。由于低聚木糖具有调整肠道作用，因此作为特定保健用食品被认可，是价值高的寡糖。

本工序中使用的超滤膜及其过滤方法与后述的工序(4)的过滤工序的超滤膜及其过滤方法是同样的。

[工序(3)]

工序(3)是将所述木聚糖内切酶水解固体物用源自丝状菌的纤维素酶水解，获得纤维素酶水解物的工序。

所谓利用源自丝状菌的纤维素酶的木聚糖内切酶水解固体物的水解，是以使木聚糖内切酶水解固体物中的纤维素低分子量化，生成单糖或寡糖为目的的水解。木聚糖内切酶水解固体物的水解中，甘露聚糖、***聚糖、及不能被木聚糖内切酶水解完全分解的木聚糖等半纤维素成分也同时被水解。本工序中，为了将木聚糖内切酶水解固体物水解，使用源自丝状菌的纤维素酶作为糖化酶。

源自丝状菌的纤维素酶是包含纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β葡萄糖苷酶、木聚糖内切酶、木糖苷酶等多种酶成分，具有将纤维素水解糖化的活性的酶组合物。源自丝状菌的纤维素酶包含这样多种酶成分，因此在纤维素分解中可以通过多种酶成分的协同效果或补充效果而有效地进行纤维素的水解。

作为源自丝状菌的纤维素酶，可以例示源自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)、平革菌(Phanerochaete)属、白腐菌、褐腐菌等微生物的纤维素酶。另外，可以为源自通过对这些微生物用诱变剂或紫外线照射等实施突变处理而纤维素酶生产性提高了的突变株的纤维素酶。这些源自丝状菌的纤维素酶中，优选在纤维素水解中使用在培养液中大量生产比活性高的酶成分的源自木霉属的纤维素酶。

所谓源自木霉属的纤维素酶，是以源自木霉属微生物的纤维素酶为主成分的酶组合物。对木霉属微生物没有特别限定，优选里氏木霉 (Trichoderma reesei)，具体而言，可以例示里氏木霉QM9414 (Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichodermareesei QM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichoderma reesei Rut C-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123 (Trichoderma viride9123)。

纤维二糖水解酶是以从纤维素的末端部分开始水解、释放纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.91记载了归属于纤维二糖水解酶的酶群。

内切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的中央部分开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.4、EC3.2.1.6、EC3.2.1.39、EC3.2.1.73 记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群。

外切葡聚糖酶是以从纤维素分子链的末端开始水解为特征的纤维素酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.74、EC3.2.1.58记载了归属于外切葡聚糖酶的酶群。

β葡萄糖苷酶是以水解纤维寡糖或纤维二糖为特征的纤维素酶的总称，作为EC号：EC3.2.1.21记载了归属于β葡萄糖苷酶的酶群。

木糖苷酶是以与低聚木糖作用为特征的纤维素酶的总称，作为EC号： EC3.2.1.37记载了归属于木糖苷酶的酶群。

这样源自丝状菌的纤维素酶所含的酶，可以通过凝胶过滤、离子交换、二维电泳等公知方法进行分离，对分离而得的成分的氨基酸序列进行分析 (N末端分析、C末端分析、质量分析)，通过与数据库的比较而鉴定。

另外，源自丝状菌的纤维素酶的酶活性可以通过Avicel(微晶纤维素) 分解活性、木聚糖分解活性、羧甲基纤维素(CMC)分解活性、纤维二糖分解活性、甘露聚糖分解活性等多糖的水解活性进行评价。显示Avicel(微晶纤维素)分解活性的主要的酶是具有从纤维素末端部分开始水解的特征的纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。显示木聚糖分解活性的主要的酶是木聚糖酶、β-木糖苷酶。参与CMC分解活性的主要的酶是纤维二糖水解酶、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶。显示纤维二糖分解活性的主要的酶是β-葡萄糖苷酶。在此，所谓“主要”的含义是来自已知最参与分解的表达，意味着除此以外的酶成分也参与其分解。

由于丝状菌在培养液中产生纤维素酶，因此可以将其培养液直接作为粗酶剂使用，也可以通过公知的方法纯化酶群，将制剂化而得的物质作为源自丝状菌的纤维素酶混合物使用。以纯化源自丝状菌的纤维素酶、制剂化而得的物质的形式使用的情况下，可以将添加了蛋白酶抑制剂、分散剂、溶解促进剂、稳定剂等除酶以外的物质的制剂作为纤维素酶制剂使用。

在本发明中，作为源自丝状菌的纤维素酶，优选使用粗酶物。粗酶物源自在为了使丝状菌产生纤维素酶而调制的培养基中将该微生物培养任意时间而得的培养上清。对使用的培养基成分不特别限定，但是为了促进纤维素酶的产生，一般可以使用添加了纤维素的培养基。而且，作为粗酶物，优选直接使用培养液、或使用仅除去了菌体的培养上清。

对粗酶物中的各酶成分的重量比没有特别限定，例如，源自里氏木霉的培养液中含有50～95重量％的纤维二糖水解酶，其余成分包含内切葡聚糖酶、β葡糖苷酶等。此外，木霉属的微生物在培养液中产生强的纤维素酶成分，另一方面由于β葡糖苷酶保持在细胞内或细胞表层，因而培养液中的β葡糖苷酶活性低，因此可以在粗酶物中进一步添加异种或同种的β葡糖苷酶。作为异种的β葡糖苷酶，可以优选使用源自曲霉属的β葡糖苷酶。作为源自曲霉属的β葡糖苷酶，可以例示出由ノボザイム社市售的“Novozyme188”等。作为向粗酶物中添加异种或同种的β葡糖苷酶的方法，可以是培养以向木霉属的微生物导入基因使其在其培养液中产生β葡糖苷酶的方式进行基因重组而得的木霉属的微生物，分离其培养液的方法。

作为利用源自丝状菌的纤维素酶的水解的反应条件，只要依据源自丝状菌的纤维素酶的优选反应条件进行，就没有限定，但在本发明中，使用源自丝状菌的纤维素酶时，通常反应温度优选15～100℃的范围，更优选 40～60℃，进一步优选50℃左右。

对于水解反应时木聚糖内切酶水解固体物的pH，由于在源自丝状菌的纤维素酶的最适pH下利用源自丝状菌的纤维素酶的水解的效果最高，因此，在本发明中，纤维素酶处理时的pH优选3～9的范围，更优选4～ 5.5，进一步优选5左右。

此外，由于在水解的过程中pH发生变化，因此，pH调节优选使用酸或碱调节到所希望的pH。另外，pH调节可以适当在水解物中使用缓冲液。作为酸，例如可以举出盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等，从不易引起本发明所得的糖液在发酵时的抑制的观点考虑，优选使用硫酸、硝酸、磷酸，从经济性的观点考虑，更优选使用硫酸。作为碱，从经济性的观点考虑，优选使用氨、氢氧化钠、氢氧化钙和包含它们的水溶液，从抑制在后述的行程 (4)中进行膜分离时发生膜污垢的观点考虑，更优选使用作为1价离子的氨、氢氧化钠，从不易引起发酵时的抑制的观点考虑，进一步优选使用氨。

此外，为了促进木聚糖内切酶水解固体物与糖化酶的接触，并且使水解物的糖浓度均匀，优选将木聚糖内切酶水解固体物和糖化酶一边搅拌一边混合。

加水使得纤维素的固体成分浓度优选为1～25重量％、更优选为5～ 20重量％的范围。

[工序(4)]

工序(4)是使所述纤维素酶水解物通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收糖液，从非透过液侧回收酶成分的工序。作为非透过液回收的酶成分也可以在工序(3)中再利用，从而可降低工序(3)中的酶成分的使用量。

本发明中使用的超滤膜可以使用具有能够透过作为单糖的葡萄糖(分子量180)、木糖(分子量150)、能够阻挡源自丝状菌的纤维素酶的截留分子量的超滤膜。在本发明中，超滤膜的截留分子量只要为500～50,000 的范围即可，从将酶反应中显示抑制作用的夹杂物质与酶分离的观点考虑，更优选为5,000～50,000的范围，进一步优选为10,000～30,000的范围。

其中，超滤膜的孔径过小而难以通过电子显微镜等测量膜表面的细孔径，因而以截留分子量的值代替平均细孔径作为孔径大小的指标。此外，截留分子量是指以溶质的分子量为横轴、以阻挡率为纵轴将数据进行作图时，阻挡率为90％的分子量。

作为超滤膜的材料，可以使用聚醚砜(PES)、聚砜(PS)、聚丙烯腈(PAN)、聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、再生纤维素、纤维素、纤维素酯、磺化聚砜、磺化聚醚砜、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯等。在本发明中，作为使用的超滤膜的材质，再生纤维素、纤维素、纤维素酯受纤维素酶分解，因而优选使用以PES、PVDF等合成高分子为材料的超滤膜。

作为超滤膜的过滤方式，有死端过滤、错流过滤等，但从抑制膜污垢、流量的观点出发，优选错流过滤。

作为超滤膜的膜形态，可以使用平膜型、螺旋型、管状型、中空丝型等适宜的形态。具体而言，可举出DESAL社的G-5型、G-10型、G-20 型、G-50型、PW型、HWSUF型，KOCH社的HFM-180、HFM-183、 HFM-251、HFM-300、HFK-131、HFK-328、MPT-U20、MPS-U20P、 MPS-U20S，Synder社的SPE1、SPE3、SPE5、SPE10、SPE30、SPV5、 SPV50、SOW30，旭化成株式会社制的マイクローザ(注册商标)UF系列的相当于截留分子量3,000～10,000的膜，日东电工株式会社制的NTR7410、 NTR7450等。

作为过滤方法，可以优选使用压滤、真空过滤、离心过滤等。另外，作为过滤操作，可以举出定压过滤、定流量过滤、非定压非定流量过滤等。过滤操作可以是将上述超滤膜使用两次以上的多段过滤。

工序(4)中回收的非透过液作为酶成分包含源自丝状菌的纤维素酶，因此，通过将回收的包含源自丝状菌的纤维素酶的非透过液与工序(3)中使用的源自丝状菌的纤维素酶混合，能够作为工序(3)的源自丝状菌的纤维素酶使用。由此能够降低工序(3)中新使用的源自丝状菌的纤维素酶的量，因此，能够实现降低源自丝状菌的纤维素酶的费用。

这样，根据本发明的糖液的制造方法，在使含纤维素生物质进行糖化反应之前，预先用木聚糖内切酶水解含纤维素生物质，将得到的木聚糖内切酶水解物固液分离，生成木聚糖内切酶水解固体物。通过将该木聚糖内切酶水解固体物用源自丝状菌的纤维素酶水解而得的非透过液进行回收再利用，能够在糖液的制造过程中使作为糖化酶的源自丝状菌的纤维素酶的使用量的削减效果进一步提高。另外，通过将木聚糖内切酶水解物固液分离而得的木聚糖内切酶水解液体进行过滤，能够回收低聚木糖，并且能够回收木聚糖内切酶。得到的木聚糖内切酶能够在含纤维素生物质的水解中再利用，因此，能够在削减含纤维素生物质、特别是半纤维素成分的水解中使用的木聚糖内切酶的使用量的同时制造糖液。所以，本发明的糖液的制造方法能够在将糖化酶回收再利用的同时制造糖液，因此能够将糖液的制造成本抑制的较低。

(其它方式)

在本发明中，对于将在工序(4)中过滤纤维素酶水解物而得的非透过液、与工序(3)的源自丝状菌的纤维素酶混合的情况进行了说明，但不限定于此。将本发明的糖液的制造方法的另一例示于图2。如图2所示，例如将工序(3)中得到的纤维素酶水解物固液分离，分离成含有糖的溶液(纤维素酶水解液体)、和作为固体成分的糖化残渣。在工序(4)中，将得到的纤维素酶水解液体用超滤膜进行过滤，分离成包含源自丝状菌的纤维素酶的非透过液、和作为透过液的糖液。由此，在回收包含源自丝状菌的纤维素酶的非透过液的同时，作为透过液回收糖液。回收的非透过液可以与工序(3)中使用的源自丝状菌的纤维素酶混合而再利用。所以，预先将纤维素酶水解物固液分离，除去纤维素酶水解物中的固体成分，由此能够在工序(4)中高效地进行纤维素酶水解物所含的源自丝状菌的纤维素酶的回收。由此，可在进一步使源自丝状菌的纤维素酶的回收率提高的同时制造糖液。

固液分离的方法与工序(2)同样，可以通过螺旋沉降机等的离心分离、压滤等的膜分离、利用压带、带式过滤、自然沉降的分离、或网筛、无纺布及滤纸等过滤法进行固液分离。其中，优选使用螺旋沉降机、压滤、压带等过滤法。根据这些过滤方法，获得不溶性的固体少、混浊少的溶液成分。如果混浊少，则在工序(4)中抑制超滤膜的污垢，因而优选。

另外，优选将固液分离而得的纤维素酶水解液体进一步通过精密过滤膜进行过滤。由于通过将纤维素酶水解液体用精密过滤膜进行过滤，能够除去在固液分离中没有完全分离的固体成分，因此，能够在工序(4)中更加高效地进行纤维素酶水解物所含的源自丝状菌的纤维素酶的回收。

精密过滤膜是平均细孔径为0.01μm～5mm的膜。作为材质，只要是除去上述固液分离中没有完全分离的固体成分的材质，就没有特别限定，可以举出纤维素、纤维素酯、聚砜、聚醚砜、聚氯乙烯、聚丙烯、聚烯烃、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸甲酯、聚1,1-二氟乙烯、聚四氟乙烯等有机材料、或不锈钢等金属、或陶瓷等无机材料。

如上，本发明中得到的糖液能够用于食品原料、药品原料、化学品等的发酵原料等各种各样的用途。通过本发明而得的糖液作为发酵原料使用，使具有生产化学品的能力的微生物生长，由此能够制造各种化学品。此外，所谓使微生物生长，是指将糖液所含的糖成分或氨基源作为微生物的营养素利用，进行微生物的增殖、生长维持。作为化学品的具体例，可以举出醇、有机酸、氨基酸、核酸等在发酵工业中大量生产的物质。这样的化学品以糖液中的糖成分为碳源，在其代谢过程中在生物体内外以化学品形式蓄积生产。作为可通过微生物生产的化学品，例如可以举出乙醇、丙醇、丁醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、甘油等醇、乙酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸等有机酸、肌苷、鸟苷等核苷、肌苷酸、鸟苷酸等核苷酸、尸胺等胺化合物。并且，通过本发明的糖液的制造方法而得的糖液也可应用于酶、抗生素、重组蛋白质等的生产。作为用于这样的化学品的制造的微生物，只要是能有效地生产目标化学品的微生物即可，可以使用大肠杆菌、酵母、丝状菌、担子菌等微生物。

实施例

以下举出实施例来具体地说明本发明。但是，本发明不受这些实施例限定。

(参考例1)源自丝状菌的纤维素酶(培养液)的制备

源自丝状菌的纤维素酶(培养液)按下面的方法制备。

[预培养]

以玉米浸渍液25％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％ (w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钙0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％ (w/vol)、氯化铁(Ⅲ)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(Ⅱ)五水合物0.004％ (w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、及七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加到蒸馏水中，将含有上述各成分的蒸馏水100mL倒入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃的温度下高压釜灭菌15分钟。放冷后，将与其分开地分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15分钟的PE-M和Tween80分别以0.01％(w/vol)添加到上述500mL带挡板的三角烧瓶中。在该预培养培养基中以1×10⁵个/mL 的方式接种里氏木霉ATCC66589，用振荡装置(TAITEC社制 BIO-SHAKER BR-40LF)在28℃的温度下以180rpm振荡培养72小时，作为预培养。

[主培养]

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(Avicel) 10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钙0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(Ⅲ)六水合物0.01％ (w/vol)、硫酸铜(Ⅱ)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、及七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol) 的方式添加到蒸馏水中，将包含上述各成分的蒸馏水2.5L倒入5L容量的搅拌罐(ABLE社制，DPC-2A)容器中，在121℃的温度下高压釜灭菌 15分钟。放冷后，将与其分开地分别在121℃的温度下高压釜灭菌了15 分钟的PE-M和Tween80分别以0.01％添加。接种预先用前述方法在液体培养基中进行了预培养的里氏木霉ATCC66589 250mL。其后，在28℃的温度下以87小时、300rpm、通气量1vvm的条件进行振荡培养，离心分离。其后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制的Stericup-GV，材质：PVDF)。将在该前述条件下调整的培养液作为源自丝状菌的纤维素酶在以下的实施例中使用。

(参考例2)源自丝状菌的纤维素酶的活性的测定方法

对于源自丝状菌的纤维素酶的酶活性，作为参与纤维素分解的酶群的活性，作为纤维二糖、内切葡聚糖酶的活性通过以下所示的方法测定评价 (1)4-硝基苯基-β-D-吡喃乳糖苷(pNP-Lac)的分解活性，作为β葡萄糖苷酶的活性通过以下所示的方法测定评价(2)4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-Glc)的分解活性，作为参与半纤维素的主成分木聚糖的分解的木聚糖内切酶、木糖苷酶的活性通过以下所示的方法测定评价(3)4- 硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNP-Xyl)的分解活性。此外，将上述(1)～ (3)的底物总称为pNP-糖。

在分别以1mM的浓度包含各底物的100mM乙酸缓冲液(pH5.0) 0.9mL中加入0.1mL酶液，在30℃下使其进行反应。对于反应时间，底物是pNP-Lac的情况下为60分钟，pNP-Glc的情况下为10分钟，pNP-Xyl 的情况下为30分钟，反应后添加0.1mL的2M碳酸钠水溶液使反应停止，测定405nm下的吸光度(ODtest)。对于在底物溶液中依次添加2M碳酸钠水溶液、酶液而得的样品也同样测定405nm下的吸光度(ODblank)作为空白。将在上述反应体系中1分钟生成1μmol的4-硝基苯酚的酶量定义为1U，按照下述式计算出活性值(U/mL)。此外，上述反应体系中的4- 硝基苯酚的毫摩尔分子吸光系数为17.2L/mmol/cm。

pNP-Lac分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×60(分钟)×0.1(mL)}

pNP-Glc分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×10(分钟)×0.1(mL)}

pNP-Xyl分解活性(U/mL)＝{(ODtest-ODblank)×1.1(mL)×酶稀释倍率}/{17.2×60(分钟)×0.1(mL)}。

(参考例3)含纤维素生物质的制备

在甘蔗渣干燥重量100g混合9.3g的苛性钠，121℃使其反应30分钟，制备碱处理甘蔗渣。

(参考例4)源自枝顶孢的纯化木聚糖内切酶的制备

将Meiji Seikaファルマ株式会社销售的“アクレモニウムセルラーゼ”用以下方法纯化而得的酶作为源自枝顶孢属的纯化木聚糖内切酶。

[馏分1、2的制备]

1)使粗酶吸附于强碱性阴离子交换色谱：QAE-TOYOPEARL 550C (东曹(株))，分馏用乙酸缓冲液(0.02M，pH5.5)溶出的木聚糖酶活性馏分。

2)用0.02M乙酸缓冲液(pH6.0)使上述1)的分馏馏分吸附于弱碱性离子交换色谱：DEAE-TOYOPEARL 650S(东曹(株))，分馏用乙酸缓冲液(0.02M，pH5.5)溶出的木聚糖酶活性馏分。

3)用乙酸缓冲液(0.1M，pH3.5)使上述2)的分馏馏分吸附于强酸性离子交换色谱：Mono S(ファルマシア社)，进行在乙酸缓冲液(0.1M， pH3.5)中含有0～0.05M的NaCl的线性梯度溶出，分馏显示木聚糖酶活性的馏分。回收仅显示木聚糖酶活性的两种馏分(馏分1，馏分2)。

[馏分3、4、5的制备]

4)用含有0.1M的NaCl的乙酸缓冲液(0.05M，pH3.5)使上述3) 的馏分1通过凝胶过滤色谱：Superdex 75(ファルマシア社)，分馏木聚糖酶活性馏分(馏分3)。

5)用含有0.1M的NaCl的乙酸缓冲液(0.05M、pH3.5)使上述3) 的分馏馏分2通过凝胶过滤色谱：Superdex 75(ファルマシア社)，分馏两种木聚糖酶活性馏分(馏分4、馏分5)。

通过以上的方法，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳高度纯化馏分3、馏分 4、及馏分5直到显示单一的蛋白质染色带。将馏分3、馏分4、及馏分5 混合作为纯化木聚糖内切酶。以桦木木聚糖(Birchwood xylan)为底物，在50℃、pH5、10分钟的反应后，使用二硝基水杨酸法(DNS法)，测定540nm的吸光度，由此测定反应后反应液所含的还原糖量，结果木聚糖内切酶的活性为100U/mg。

(参考例5)糖浓度的测定

对于糖液所含的葡萄糖及木糖的各浓度，用下述所示的高效液相色谱 (Highperformance liquid chromatography：HPLC条件)通过与标准品的比较进行定量。

(HPLC条件)

柱：Shodex SH1011(昭和电工株式会社制)

流动相：硫酸5mM(流速0.6mL/分钟)

反应液：无

检测方法：RI(差示折射率)

温度：65℃。

(实施例1)源自枝顶孢属微生物的木聚糖内切酶的使用

[工序(1)]

在参考例3中制备的碱处理甘蔗渣1g中添加19g水，调整到固体成分浓度5％。在制备的含纤维素生物质中添加参考例4中制备的源自枝顶孢属微生物的木聚糖内切酶进行水解。对于源自枝顶孢属微生物的木聚糖内切酶的添加量，添加0.1mg/g的前处理物，用盐酸调整到pH为5，进行木聚糖内切酶水解。木聚糖内切酶水解在50℃下进行24小时反应。

[工序(2)]

木聚糖内切酶反应后，用12目的不锈钢制滤网进行固液分离，回收木聚糖内切酶水解液体10g、木聚糖内切酶水解固体10g。

[工序(3)]

在固液分离固体侧10g(固体成分浓度10％)中添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶进行水解。对于源自丝状菌的纤维素酶的添加量，添加8mg/g的前处理物，用盐酸调整到pH为5，开始水解。水解在50℃下进行24小时反应。

[工序(4)]

纤维素酶糖化后，通过离心分离(4500G，10分钟)进行固液分离，分离成纤维素酶水解固体和纤维素酶水解液体。进一步对纤维素酶水解液体进行膜过滤(ミリポア社制Stericup-GP，材质：PES)，得到的上清用截留分子量10,000的超滤膜(Sartorius stedimbiotech社制VIVASPIN 20，材质：PES)以4500G离心直到超滤膜的非透过液侧为1mL。将10mL蒸馏水添加到膜馏分中，再次以4500G离心直到非透过侧馏分为1mL，将所得物质作为回收酶，用参考例2的方法测定酶活性，求得设添加酶的活性为100时的相对值。

[实施例2]源自曲霉属微生物的木聚糖内切酶的使用

[工序(1)]

在参考例3中制备的碱处理甘蔗渣1g中添加水19g，调整到固体成分浓度5％。在制备的含纤维素生物质中添加源自曲霉属微生物的木聚糖内切酶(Megazyme社制，活性80U/mg)进行水解。对于源自曲霉属微生物的木聚糖内切酶的添加量，添加0.13mg/g的前处理物，用盐酸调整到pH 为5，进行木聚糖内切酶水解。木聚糖内切酶水解在50℃下进行24小时反应。

[工序(2)]

[工序(3)]

在固液分离固体10g中添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶进行水解。利用纤维素酶的水解与比较例1同样地进行。

[工序(4)]

与实施例1同样地进行。

(实施例3)实施例1中的工序(2)的木聚糖内切酶的回收、低聚木糖的回收

与实施例1同样地实施工序(1)、工序(2)、工序(3)、及工序(4)。此时，将工序(2)中得到的木聚糖内切酶水解液体进行膜过滤(ミリポア社制Stericup-GP、材质：PES)，得到的上清用截留分子量10,000的超滤膜(Sartorius stedim biotech社制VIVASPIN 20、材质：PES)以4500G 离心直到超滤膜的非透过液侧为1mL。将蒸馏水10mL添加到膜馏分中，再次以4500G离心直到非透过侧馏分为1mL，将所得物质作为木聚糖内切酶回收酶，以桦木木聚糖(Birchwood xylan)为底物，在50℃、pH5、 10分钟反应后，使用二硝基水杨酸法(DNS法)，测定540nm的吸光度，由此以设添加的木聚糖内切酶的活性为100时的回收木聚糖内切酶的相对值作为木聚糖内切酶回收率。木聚糖内切酶回收率是73％。另外，根据参考例5测定木聚糖内切酶水解液体的透过液中的低聚木糖浓度，结果每g 重量的碱处理甘蔗渣回收了80mg的低聚木糖。

(比较例1)省略实施例1中的工序(1)、工序(2)

在参考例3中制备的含纤维素生物质1g中添加9g水，调整到固体成分浓度为10％。在制备的含纤维素生物质中添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶进行水解。水解的条件与实施例1同样地进行。依据实施例1的工序(4)从得到的水解物中回收酶，用参考例2的方法测定酶活性。

(比较例2)省略实施例1中的工序(1)

在参考例3中制备的含纤维素生物质1g中添加水19g，调整到固体成分浓度为5％。将其用12目的不锈钢制滤网进行固液分离，回收液体侧10g、固体侧10g。在固液分离固体10g中添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶，依据实施例1的工序(3)进行水解。依据实施例1的工序(4)，从得到的水解物回收酶，用参考例2的方法测定酶活性。

(比较例3)省略实施例1中的工序(2)

在参考例3中制备的含纤维素生物质1g中添加水9g，调整到固体成分浓度为10％。在制备的含纤维素生物质中添加参考例4中制备的源自枝顶孢属微生物的木聚糖内切酶进行水解。对于源自枝顶孢属微生物的木聚糖内切酶的添加量，以0.1mg/g前处理物添加，用盐酸调整到pH为5，进行木聚糖内切酶水解。木聚糖内切酶水解在50℃下进行24小时反应。木聚糖内切酶反应后，不实施固液分离，添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶，依据实施例1的工序(3)进行水解。依据实施例1的工序(4) 从得到的水解物中回收酶，用参考例2的方法测定酶活性。

(比较例4)源自木霉属微生物的木聚糖内切酶的使用

在参考例3中制备的含纤维素生物质1g中添加水19g，调整到固体成分浓度为5％。在制备的含纤维素生物质中以0.04mg/g前处理物添加源自绿色木霉的木聚糖内切酶(Megazyme社制，活性250U/mg)，用盐酸调整到pH为5，进行木聚糖内切酶水解。木聚糖内切酶水解在50℃下进行 24小时反应。木聚糖内切酶反应后，用12目的不锈钢制滤网进行固液分离，回收木聚糖内切酶水解液体10g、木聚糖内切酶水解固体10g。在固液分离固体10g中添加参考例1中制备的源自丝状菌的纤维素酶，依据实施例1的工序(3)进行水解。依据实施例1的工序(4)从得到的水解物中回收酶，用参考例2的方法测定酶活性。

将比较例1～4、实施例1及2中酶回收率的结果总结于表1。由表1 可知，与比较例1～4相比，实施例1及2中，回收酶的pNP-Lac、pNP-Glc、 pNP-Xyl分解活性高，酶回收率提高。

另外，比较例3中，在工序(1)中使用源自枝顶孢属微生物的木聚糖酶，但没有实施工序(2)，结果回收纤维素酶的活性没有提高，可知在获得本发明的效果方面工序(2)的固液分离是必要的。

另外，比较例4是在工序(1)中使用源自木霉属微生物的木聚糖酶的例。专利文献4中，在源自丝状菌的纤维素酶水解前仅进行利用回收酶的水解，回收纤维素酶中蓄积木聚糖内切酶及将木二糖转换成木糖的木糖苷酶，显示回收酶的纤维素酶活性及纤维素酶水解中的糖化率提高。可期待与专利文献4同等的效果，但与实施例1及2相比，纤维素酶回收率差，与比较例1相比纤维素酶回收率的提高也是轻微的。

表1

使用超滤膜从纤维素酶水解物中回收的回收酶成分的酶活性

Claims

1.糖液的制造方法，是来自含纤维素生物质的糖液的制造方法，包括：

2.根据权利要求1所述的糖液的制造方法，所述含纤维素生物质是经选自碱处理、水热处理及稀硫酸处理中的一种以上方法进行前处理而得的。

3.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，所述木聚糖内切酶的酶活性是80U/mg蛋白以上。

4.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，所述木聚糖内切酶水解物的固液分离满足以下关系式：

5.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，进一步包括使所述木聚糖内切酶水解液体通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收低聚木糖液，从非透过液侧回收木聚糖内切酶的工序。

6.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，所述源自丝状菌的纤维素酶源自木霉属微生物。

7.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，工序(4)是使所述纤维素酶水解物固液分离而得的纤维素酶水解液体通过超滤膜而进行过滤，从透过液侧回收糖液，从非透过液侧回收酶成分的工序。

8.根据权利要求1或2所述的糖液的制造方法，将所述酶成分作为工序(3)的源自丝状菌的纤维素酶使用。