BR112013014103B1

BR112013014103B1 - Método para produzir um l-aminoácido

Info

Publication number: BR112013014103B1
Application number: BR112013014103-4A
Authority: BR
Inventors: Hidetaka Doi; Yasushi Hoshino; Yuri Masumitsu; Yoshihiro Usuda
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2011-12-08
Publication date: 2021-09-14
Also published as: JP2014036576A; BR112013014103A2; US20130260425A1; EP2650376B1; EP2650376A1; US8951760B2; EP2650376A4; WO2012077739A1

Abstract

método para produzir um l-aminoácido a presente invenção fornece um método para produzir um laminoácido, no qual bactérias que pertencem à família enterobacteriaceae com capacidade de produzir l-aminoácido são cultivadas em um meio contendo uma fonte de carbono selecionada de ácidos graxos e álcool, e o laminoácido é coletado deste meio de cultura, em que as bactérias que foram modificadas para intensificar expressão do gene oxys, intensificar expressão do gene fixabc, ou uma combinação destes, são usadas como as bactérias anteriormente mencionadas, ou uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio dentro das células das bactérias anteriormente mencionadas é adicionada ao meio de cultura.

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a um método para produzir um L- aminoácido que utiliza uma bactéria, em particular, um método como este para produzir um L-aminoácido que utiliza um ácido graxo ou um álcool, tal como glicerol, como um material bruto, e uma bactéria usada para o método. Os L- aminoácidos são usados industrialmente como aditivos para ração animal, componentes de alimento saudável, infusões de aminoácido, dentre outros. FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Na produção industrial de L-aminoácidos por fermentação, os sacarídeos, isto é, glicose, frutose, sacarose, melado negro, hidrolisado de amido, dentre outros, são usados como uma fonte de carbono. Além do mais, os métodos para produzir um L-aminoácido usando um ácido graxo (Documento de patente 1), glicerol (Documento de patente 2), ou etanol (Documento de patente 1) como uma fonte de carbono também foram revelados.

Em vários organismos, em geral, um elétron retirado de Acil- CoA por Acil-CoA desidrogenase durante a utilização de ácido graxo é transferido para a flavoproteína que transfere elétron oxidado (ETF0X), por meio de FADH2, para formar a flavoproteína que transfere elétron reduzido, ETFred, e um elétron é transferido adicionalmente de ETFred para ubiquinona por ETF ubiquinona oxidorredutase, e a seguir para a cadeia respiratória (Documento não associado a patente 1). Entretanto, com relação às bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, a flavoproteína que transfere elétron (ETF) e ETF ubiquinona oxidorredutase não foram relatadas até o momento.

Além disso, pode ser estimado a partir das descrições dos documentos não associados a patente 2, 3, dentre outros, que durante a utilização de etanol em bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, um elétron é transferido a partir de NADH, que considera-se ser gerado de maneira abundante em células bacterianas, ou a partir de NADH por meio de NADPH para FAD, e uma grande quantidade de FADH2 acumula-se em função disso.

Em relação à Escherichia coli, fixA (yaaQ) e fixB (yaaR) foram relatados como os genes que codificam homólogos de ETF que podem transferir elétrons a partir de FADH2 (Documento não associado a patente 4). Os genes fix A e fixB constituem o operon fixABCX junto com os genes fiixC e fixX, e a expressão destes é induzida em condições anaeróbicas na presença de camitina (Documentos não associados a patente 5 e 6). Existe um relato que sugere que as proteínas codificadas por estes genes transferem um elétron para crotonobetaína redutase, que participa do metabolismo da camitina (Documento não associado a patente 7). Além disso, é previsto que fixA codifica a subunidade β da flavoproteína que transfere elétron, fixB codifica a subunidade α da mesma proteína, fixC codifica a flavoproteína quinona oxidorredutase que transfere elétron, e fixX codifica um proteína do tipo ferredoxina (Documento não associado a patente 6). Da maneira descrita anteriormente, embora existam relatos que sugerem o envolvimento de fixA, fixB e fiixC no metabolismo da camitina, não foi relatado até o momento que estes possam participar do transporte de elétrons a partir de Acil-CoA desidrogenase para a cadeia respiratória.sodA codifica superóxido dismutase, que catalisa a conversão de superóxido em peróxido de hidrogênio (Documento não associado a patente 8). Entretanto, não foi relatada a relação entre a atividade de superóxido dismutase e a produção de um aminoácido.

Como um sistema de defesa contra o peróxido de hidrogênio intracelular nas bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, a ação do fator de transcrição OxyR foi relatada, em que ativa os genes para eliminar o estresse oxidativo (Documento não associado a patente 9). Foi relatado que, entre os genes ativados por OxyR, o gene oxyS que codifica RNA de baixo peso molecular controla a secreção de peróxido de hidrogênio nas células bacterianas (Documento não associado a patente 10). Entretanto, não foi relatada a produção de L-aminoácido usando um microrganismo no qual a expressão do gene oxyS é intensificada.

Relata-se que tioureia apresenta um efeito de suprimir o estresse oxidativo, incluindo peróxido de hidrogênio para Escherichia coli (Documento não associado a patente 11). Entretanto, qualquer relação entre a produção de tioureia e L-aminoácido não é conhecida.

REFERÊNCIAS DE TÉCNICA PRÉVIA

Documentos de patente:Documento de patente 1: WQ2009/142286.Documento de patente 2: pedido de patente publicado U.S. 2009093029.Documento de patente 3: W02008/010565.Documentos não associados a patente:Documento não associado a patente 1: Voet, D. et al., 1995, Biochemistry, Second edition, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque.Documento não associado a patente 2: Coves, J. et al., 1993, J. Biol. Chem., 268(25): 18604-18609.Documento não associado a patente 3: Fontecave, M. et al., 1987, J. Biol. Chem., 262(25):12325-12331.Documento não associado a patente 4: Tsai, M.H. et al., 1995, Res. Microbiol., 146:397-404.Documento não associado a patente 5: Eichler, K. et al., 1995, J. Basic Microbiol., 35:217-227.Documento não associado a patente 6: Buchet, A. et al., 1998, J. Bacteriol., 180:2599-2608.Documento não associado a patente 7: Walt, A. et al., 2002, J. Bacteriol., 184:4044-4047. Documento não associado a patente 8: Keele, B.B. et al., 1970, J. Biol. Chem., 245 (22):6176-6181.Documento não associado a patente 9: Chistman, M.F. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 86(10):3484-3488.Documento não associado a patente 10: Gonzalez-Flecha, B. et al., 1999, J. Bacteriol., 181 (12):3833-3836.Documento não associado a patente 11: Kohanski, M.A. et al., 2010, Molecular Cell, 37:311-320.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Objetivo a ser atingido pela invenção:

Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir eficientemente um L-aminoácido que utiliza uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, a partir de uma fonte de carbono, especialmente um ácido graxo ou um álcool, tais como etanol e glicerol, como um material bruto, e uma bactéria usada para o método.

Meios para atingir o objetivo

Da maneira descrita anteriormente, sabe-se que durante a utilização de etanol pelas bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, um elétron retirado de Acil-CoA pela Acil-CoA desidrogenase é transferido para a cadeia respiratória por meio de FADH2. Na presente invenção estimam que este elétron foi finalmente transferido para o oxigênio livre para gerar peróxido de hidrogênio e, em função disso, as células foram lesadas pelo peróxido de hidrogênio gerado durante a utilização de ácido graxo, e estimam adicionalmente que a secreção de peróxido de hidrogênio gerada nas células foi promovida pela intensificação da expressão do gene oxyS e, assim, a lesão por peróxido de hidrogênio foi reduzida. Portanto, foi intensificada a expressão do gene oxyS em bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae. Em função disso, a redução de concentração de peróxido de hidrogênio intracelular e a melhoria no crescimento foram confirmadas, e observa-se adicionalmente que a capacidade de produzir L-aminoácido foi melhorada.

Na presente invenção foi estimado adicionalmente que as células das bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae foram lesadas pelo peróxido de hidrogênio gerado a partir do elétron derivado de FADH2 e oxigênio não apenas durante a utilização de ácido graxo, mas também durante a utilização de etanol, mas esta lesão pode ser reduzida intensificando a expressão de ETF. Portanto, a expressão de ETF é intensificada em bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, e observou-se que a capacidade de produzir L-aminoácido foi intensificada.

Na presente invenção foi estimado adicionalmente que nas bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae o peróxido de hidrogênio foi gerado por superóxido dismutase e, em função disso, as células foram lesadas. Portanto, foi amplificado o gene sodA nas bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, e observou-se que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular aumentou, e crescimento foi degradado. Observou-se adicionalmente que, se bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae forem cultivadas em um meio contendo tioureia, a concentração de peróxido de hidrogênio nas células bacterianas diminui, e a capacidade de produzir L-aminoácido melhora.

A presente invenção foi realizada com base nos achados anteriormente mencionados, em que reduzindo a concentração de peróxido de hidrogênio nas células de bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, a capacidade de produzir L-aminoácido pode ser melhor.

Assim, a presente invenção fornece o seguinte.

(1) Um método para produzir um L-aminoácido, compreendendo cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio contendo uma fonte de carbono selecionada de um ácido graxo e um álcool, e coletando o L-aminoácido do meio, em que o método compreende a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria.(2) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria foi modificada, de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida.(3) O método da maneira mencionada anteriormente, em que uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria é adicionada ao meio.(4) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia, Pantoea ou Enterobacter.(5) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria é Escherichia coli, Pantoea ananatis ou Enterobacter aerogenes.(6) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria foi submetida a uma modificação selecionada do grupo que consiste em intensificação da expressão do gene oxyS, intensificação da expressão do gene fixABC e combinações destas.(7) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o gene oxyS codifica RNA com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 9, ou um variante conservativa da mesma.(8) O método da maneira mencionada anteriormente, em que os genes fixABC codificam proteínas com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 11, 13, e 15, ou um variante conservativa das mesmas.(9) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular é tioureia.(10) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a fonte de carbono é um ácido graxo.(11) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o ácido graxo é ácido oleico.(12) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o ácido graxo é uma mistura de ácidos graxos derivados de uma gordura ou um óleo.(13) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a fonte de carbono é um álcool.(14) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o álcool é glicerol.(15) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o álcool é etanol.(16) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a fonte de carbono é uma mistura de um ácido graxo e glicerol obtida hidrolisando uma gordura ou um óleo.(17) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a bactéria é Escherichia coli, e foi modificada de maneira tal que possa utilizar o etanol aerobicamente.(18) O método da maneira mencionada anteriormente, em que o L-aminoácido é L-lisina.(19) O método da maneira mencionada anteriormente, em que a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionadas do grupo que consiste em diidrodipicolinato redutase, diaminopimelato descarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeido desidrogenase, tetraidrodipicolinato succinilase, e succinildiaminopimelato desacilase são intensificadas, e/ou a atividade de lisina descarboxilase é atenuada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 mostra o crescimento de Escherichia coli em um meio mínimo contendo glicose (O) ou ácido oleico (Δ) como uma fonte de carbono.

A figura 2 mostra a relação entre o crescimento (OD600) de E. coli em um meio mínimo contendo glicose (O) ou ácido oleico (Δ) como uma fonte de carbono, e os números de bactérias vivas.

A figura 3 mostra a relação entre o crescimento (OD600) de E. coli em um meio mínimo contendo glicose (O) ou ácido oleico (Δ) como uma fonte de carbono, e a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular desta.

A figura 4 mostra o crescimento (OD600) da cepa de E. coli com o gene oxyS amplificado (superexpressão de oxyS) e da cepa com o gene sodA amplificado (superexpressão de sodA), em um meio mínimo contendo glicose como uma fonte de carbono.

A figura 5 mostra a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da cepa de E. coli com o gene oxyS amplificado (superexpressão de oxyS) e da cepa com o gene sodA amplificado (superexpressão de sodA), cultivadas em um meio mínimo contendo glicose como uma fonte de carbono.

A figura 6 mostra o crescimento (OD600) da cepa de E. coli com o gene oxyS amplificado (superexpressão de oxyS) e da cepa com o gene sodA amplificado (superexpressão de sodA), em um meio mínimo contendo ácido oleico como uma fonte de carbono.

A figura 7 mostra a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da cepa de E. coli com o gene oxyS amplificado (superexpressão de oxyS) e da cepa com o gene sodA amplificado (superexpressão de sodA), cultivadas em um meio mínimo contendo ácido oleico como uma fonte de carbono.

A figura 8 mostra a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular observada na cultura para produção de L-lisina usando glicose ou um ácido graxo como fonte de carbono, e usando a adição de tioureia ou ureia.1. Fonte de carbono, glicose; sem aditivo.2. Fonte de carbono, glicose; adição de ureia 1 rnM.3. Fonte de carbono, glicose, adição de tioureia 1 mM. 4. Fonte de carbono, ácido oleico, sem aditivo.5. Fonte de carbono, ácido oleico, adição de ureia 1 mM.6. Fonte de carbono, ácido oleico, adição de tioureia 1 mM. Modalidades para realizar a invenção

1. Bactéria da presente invenção

A bactéria usada na presente invenção é uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido. De acordo com uma modalidade, a bactéria da presente invenção pertence à família Enterobacteriaceae, apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido, e foi modificada de maneira tal que concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria seja reduzida.

A capacidade de produzir L-aminoácido refere-se a uma capacidade da bactéria usada pela presente invenção (a partir daqui também referida como "bactéria da presente invenção") para produzir e acumular um L-aminoácido em um meio ou nas células, quando a bactéria é cultivada no meio. Significa preferivelmente uma capacidade como esta de acumular um L-aminoácido alvo no meio em um quantidade de não menos que 0,5 g/L, more preferivelmente não menos que 1,0 g/L. A bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido pode ser uma bactéria com uma capacidade inerente de produzir L-aminoácido, ou pode ser uma bactéria obtida modificando uma bactéria como esta da maneira descrita a seguir, de maneira tal que apresente uma capacidade de produzir L-aminoácido usando um método de mutagênese ou um método de DNA recombinante.

Embora o tipo do L-aminoácido não seja particularmente limitado, os exemplos deste incluem aminoácidos básicos tal como L-lisina, L-omitina, L-arginina, L-histidina e L-citrulina; aminoácidos alifáticos tais como L-isoleucina, L-alanina, L-valina, L-leucina e glicina; aminoácidos que são ácidos hidróxi-monoaminocarboxílicos tais como L-treonina e L-serina; aminoácidos cíclicos tal como L-prolina; aminoácidos aromáticos tais como L-fenilalanina, L-tirosina e L-triptofano; aminoácidos contendo enxofre tais como L-cisteína, L-cistina e L-metionina; aminoácidos acídicos tais como ácido L-glutâmico e ácido L-aspártico; e aminoácidos com um grupo amida na cadeia lateral tais como L-glutamina e L-asparagina. A bactéria pode apresentar a capacidade de produzir dois ou mais tipos de aminoácidos.

Na presente invenção, o "L-aminoácido" inclui o L- aminoácido em uma forma livre e sais destes, tais como sal de sulfato, sal de cloridrato e sal de carbonato. O “L-aminoácido” também inclui glicina, a menos que de outra forma indicada.

Embora as bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae usadas para obter a bactéria da presente invenção não sejam particularmente limitadas, elas incluem bactérias que pertencem aos gêneros de Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia, dentre outros. Em particular, as bactérias classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com o taxonomia usada pela base de dados NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347) são preferidas.

Uma bactéria que pertence ao gênero Escherichia significa que a bactéria é classificada no gênero Escherichia de acordo com classificação conhecida pelos versados na técnica de microbiologia, embora a bactéria não seja particularmente limitada. Exemplos destas incluem, por exemplo, as bactérias relacionadas filogeneticamente descritas no trabalho de Neidhardt et al. (Neidhardt F.C. Ed., 1996, Escherichia coli And Salmonella'. Cellular and Molecular Biology/Segunda Edição, pp.2477-2483, Tabela 1, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Os exemplos específicos destas incluem Escherichia coli W3110 (ATCC 27325), Escherichia coli MG 1655 (ATCC 47076), dentre outros, as quais são derivadas da protótipo de cepa tipo selvagem, cepa Kl2.

Estas cepas são disponíveis a partir de, por exemplo, American Type Culture Collection (Address: P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Isto é, os números de registro são fornecidos para cada uma das cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando estes números. Os números de registro das cepas são listado no catálogo do American Type Culture Collection. O mesmo pode se aplicar às cepas mencionadas a seguir com números de registro de ATCC.

Uma bactéria que pertence ao gênero Pantoea significa que a bactéria é classificada no gênero Pantoea de acordo com classificação conhecida pelos versados na técnica de microbiologia. Algumas das Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ou similares, com base na análise de sequência de nucleotídeos de RNAr 16S, etc. (Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)). Na presente invenção, as bactérias que pertencem à gênero Pantoea podem incluir tais bactérias reclassificadas no gênero Pantoea, da maneira descrita anteriormente.

Assim como Pantoea ananatis, a cepa Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e derivados destas podem ser usadas. Estas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, elas foram reclassificadas como Pantoea ananatis com base na análise de sequência de nucleotídeos de RNAr 16S, etc, da maneira descrita anteriormente.

Uma bactéria Enterobacter significa que a bactéria é classificada no gênero Enterobacter de acordo com classificação conhecida pelos versados na técnica de microbiologia, embora a bactéria não seja particularmente limitada. Exemplos destas incluem Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes e similares. Especificamente, as cepas exemplificadas no pedido de patente Europeia aberto ao público (EP-A) No. 952221 podem ser usadas. Exemplos de cepas típicas do gênero Enterobacter incluem a cepa Enterobacter agglomerans ATCC 12287, cepa Enterobacter aerogenes ATCC 13048, cepa Enterobacter aerogenes NBRC 12010 (Biotechnol Bioeng., 2007, Mar. 27;98(2):340-348), cepa Enterobacter aerogenes AJ110637 (FERM ABP-10955) dentre outras.1-1. Bactérias produtoras de L-aminoácido e fornecimento ou conferir ou intensificar a capacidade de produzir L-aminoácido

A partir daqui, são descritas as bactérias produtoras de L- aminoácido que pertencem à família Enterobacteriaceae, e métodos para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido às bactérias, ou métodos para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido de bactérias.

Para conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido, os métodos empregados convencionalmente no cultivo das cepas produtoras de aminoácido das bactérias do gênero Escherichia, dentre outras (ver "Aminoacid Fermentation", Gakkai Shuppan Center (Ltd.), Ia Edição, publicado em 30 de maio de 1986, pp.77-100) podem ser usados. Tais métodos incluem adquirir uma cepa mutante auxotrófico, uma cepa resistente ao análogo de L-aminoácido, ou uma cepa mutante associada a regulação metabólica, ou construir uma cepa recombinante na qual uma enzima biossintética de L-aminoácido é superexpressa. No cultivo de bactérias produtoras de L-aminoácido, a(s) propriedade(s) anteriormente descrita(s), tais como auxotrofia, resistência ao análogo, e mutação da regulação metabólica, pode(m) ser conferida(s) sozinha(s) ou em combinações de duas, ou três ou mais destas. A expressão de enzima(s) biossintética(s) de L- aminoácido pode ser intensificada sozinha ou em combinações de duas, ou três ou mais destas. Além disso, conferir tais propriedades como auxotrofia, resistência ao análogo, e mutação da regulação metabólica pode ser combinado com a intensificação de uma enzima biossintética.

Uma cepa mutante auxotrófica, cepa resistente ao análogo de L-aminoácido, ou cepa mutante da regulação metabólica com uma capacidade de produzir L-aminoácido, pode ser obtida submetendo uma cepa precursora ou cepa tipo selvagem à mutagênese convencional, tal como exposição aos raios-X ou irradiação por UV, ou um tratamento com um agente mutagênico tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, e a seguir selecionando uma cepa que exibe autotrofia, resistência ao análogo, ou uma mutação da regulação metabólica, e com uma capacidade de produzir L-aminoácido a partir das cepas mutantes obtidas.

Além do mais, a capacidade de produzir L-aminoácido também pode ser conferida ou intensificada aumentando uma atividade enzimática por recombinação gênica. A intensificação de uma atividade enzimática pode ser atingida, por exemplo, modificando uma bactéria de maneira tal que expressão de um gene que codifica uma enzima envolvida na biossíntese de um L-aminoácido seja intensificada. A expressão de um gene também pode ser aumentada introduzindo um plasmídeo de amplificação, preparado pela introdução de um fragmento de DNA contendo o gene em um plasmídeo apropriado, por exemplo, um vetor do tipo plasmídeo que contém pelo menos um gene responsável pela replicação e proliferação do plasmídeo em microrganismos, aumentando o número de cópias do gene em um cromossomo por conjugação, transferência ou similares, ou introduzindo uma mutação em uma região promotora do gene (referência a WO95/34672).

Quando um gene objetivo é introduzido no plasmídeo de amplificação ou cromossomo anteriormente mencionado, qualquer promotor pode ser usado para expressar o gene, contanto que o promotor escolhido funcione em bactérias Enterobacteriaceae. O promotor pode ser um promotor natural para o gene, ou um promotor modificado. A quantidade de expressão de um gene também pode ser controlada escolhendo adequadamente um promotor que funciona fortemente em bactérias Enterobacteriaceae, ou tomando as regiões -35 e -10 do promotor mais próximas da sequência consensual. Estes métodos para intensificar a expressão dos genes enzimáticos são descritos em WOOO/18935, EP 1010755 A, dentre outros.

Os métodos para conferir uma capacidade de produzir L- aminoácido às bactérias e bactérias que receberam a com capacidade de produzir L-aminoácido são exemplificados a seguir.

Bactérias que produzem L-lisina

Os exemplos de bactérias que produzem L-lisina da espécie Escherichia coli incluem mutantes com resistência a um análogo de L-lisina. Os análogos de L-lisina inibem o crescimento de Escherichia coli, mas esta inibição é totalmente ou parcialmente dessensibilizada quando L-lisina está presente em um meio. Os exemplos do análogo de L-lisina incluem, mas sem limitação, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC), y-metilisina, a-clorocaprolactam, dentre outros. As cepas mutantes com resistência a estes análogos de lisina podem ser obtidas submetendo Escherichia coli a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Os exemplos específicos de cepas bacterianas usadas para produzir L-lisina incluem Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185, ver patente U.S. 4.346.170) e Escherichia coli VL611. Nestes microrganismos, a retroinibição de aspartoquinase por L-lisina é dessensibilizada.

A cepa WC196 pode ser usada como uma bactéria produtora de L-lisina da espécie Escherichia coli. Esta cepa bacteriana foi cultivada a partir da cepa W3110, que foi derivada de Escherichia coli K-12, substituindo o gene tipo selvagem lysC no cromossomo da cepa W3110 por um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase III mutante, em que a treonina na posição 352 foi substituída por isoleucina, resultando em dessensibilização da retroinibição por L-lisina (patente U.S. 5.661.012), e a seguir conferindo resistência à AEC para a cepa resultante (patente U.S. 5.827.698). Esta cepa foi determinada Escherichia coli AJ13069 e foi depositada no National

Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 6 de dezembro de 1994 e atribuída a um número de acesso de FERM P-14690. A seguir, foi convertida em um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 29 de setembro de 1995, e atribuída a um número de acesso de FERM BP-5252 (patente U.S. 5.827.698).

Os exemplos de bactérias que produzem L-lisina e as cepas precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L- lisina é maior. Os exemplos de tais genes incluem, mas sem limitação, o gene diidrodipicolinato sintase (dapA), gene aspartoquinase (lysC), gene diidrodipicolinato redutase (dapB\ gene diaminopimelato descarboxilase (lysA), gene diaminopimelato desidrogenase (ddh) (patente U.S. 6.040.160), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), gene aspartato semialdeido desidrogenase (as d), diaminopimelato epimerase (dapF), tetraidrodipicolinato succinilase (dapD), succinil diaminopimelato desacilase (dapE) e o gene aspartase (aspÁ) (EP 1253195 A). Entre estas enzimas, a diidrodipicolinato redutase, diaminopimelato descarboxilase, diaminopimelato desidrogenase, fosfoenolpiruvato carboxilase, aspartato aminotransferase, diaminopimelato epimerase, aspartato semialdeido desidrogenase, tetraidrodipicolinato succinilase, e succinil diaminopimelato desacilase são especialmente preferidas. Além disso, as cepas precursoras podem apresentar um maior nível de expressão do gene envolvido na eficiência de energia (cyo) (EP 1170376 A), o gene que codifica nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (pntAB) (patente U.S. 5.830.716), o gene ybjE (W02005/073390), ou combinações dos mesmos. As abreviações dos genes são indicadas entre parênteses.

Sabe-se que a diidrodipicolinato sintase tipo selvagem derivada de Escherichia coli sofre de retroinibição por L-lisina, e a aspartoquinase tipo selvagem derivada de Escherichia coli sofre de supressão da expressão e retroinibição por L-lisina. Portanto, quando os genes dapA e lysC são usados, estes genes são preferivelmente genes mutantes que não sofre de retroinibição por L-lisina.

Os exemplos de DNA que codifica uma diidrodipicolinato sintase mutante dessensibilizada para retroinibição por L-lisina incluem um DNA que codifica uma proteína que apresenta a sequência de aminoácidos, em que o resíduo de histidina na posição 118 é substituído pelo resíduo de tirosina. Os exemplos de DNA que codifica uma aspartoquinase mutante dessensibilizada para retroinibição por L-lisina incluem um DNA que codifica uma AKIII, com a sequência de aminoácidos em que o resíduo de treonina na posição 352, o resíduo de glicina na posição 323, e o resíduo de metionina na posição 318 são substituídos por isoleucina, asparagina e resíduos d e isoleucina, respectivamente (para estes mutantes, ver patentes U.S. 5.661.012 e 6.040.160). Tais DNAs mutantes podem ser obtidos por mutagênese específica de sítio usando PCR ou similar.

Os plasmídeos com uma ampla faixa de hospedeiro RSFD80, pCABl, e pCABD2 são conhecidos como plasmídeos contendo um gene mutante dap A que codifica uma diidrodipicolinato sintase mutante, e um gene lysC mutante que codifica uma aspartoquinase mutante (patente U.S. 6.040.160). A cepa de Escherichia coli JM109, transformada com RSFD80, foi denominada AJ12396 (patente U.S. 6.040.160), a cepa foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry de International Trade e Industry (atualmente, agência administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary) em 28 de outubro de 1993 e atribuída a um número de acesso de FERM P-13936, e o depósito foi então convertido para um depósito internacional nas condições de Budapest Treaty em 1 de novembro de 1994 e atribuído a um número de acesso de FERM BP-4859. RSFD80 pode ser obtida a partir da cepa AJ12396 por um método conhecido.

Os exemplos de bactérias que produzem L-lisina, e das cepas precursoras para dar origem às mesmas, também incluem cepas nas quais a atividade de uma enzima que catalisa uma reação que gera um composto sem ser L-lisina, que se ramifica a partir da via biossintética de L-lisina, é menor ou eliminada. Os exemplos das enzimas que catalisam uma reação para gerar um composto sem ser L-lisina, que se ramifica a partir da via biossintética de L-lisina, incluem homosserina desidrogenase, lisina descarboxilase (patente U.S. 5.827.698) e a enzima málica (W02005/010175). A fim de diminuir ou eliminar a atividade de lisina descarboxilase, é preferível reduzir a expressão tanto do gene cadA quanto do gene IdcC que codificam a lisina descarboxilase (publicação de patente internacional W02006/038695).

Os exemplos da cepa em que o gene cadA e o gene IdcC são interrompidos incluem a cepa Escherichia coli WC196LC (WC196ΔcadAΔldc) (patente U.S. 5.827.698, pedido de patente publicado U.S. 2006/0160191). A cepa WC196LC, que foi determinada AJ110692, foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional, e atribuída a um número de acesso de FERM BP-11027.

Bactérias produtoras de L-treonina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-treonina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (patente U.S. 5.175.107, patente U.S. 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (patente U.S. 5.631.157), E. coli NRRL-21593 (patente U.S. 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (patente

U.S. 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (patente U.S. 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (em Russo), 14, 947956 (1978)), E. coli VL643 e VL2055 (EP 1149911 A), dentre outros.

A cepa TDH-6 é deficiente no gene thC, bem como na capacidade de utilizar sacarose, e no gene ilvA deste que apresenta uma mutação de fuga. Esta cepa também apresenta uma mutação no gene rhtA, que confere a resistência às elevadas concentrações de treonina ou homosserina. A cepa B-3996 carrega o plasmídeo pVIC40, obtido inserindo um operon thA*BC contendo um gene mutante thA em um vetor derivado de RSF1010. Este gene thA mutante codifica aspartoquinase homosserina desidrogenase I, que é substancialmente dessensibilizada para retroinibição por treonina. A cepa B-3996 foi depositada 19 de novembro de 1987 no All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscou, Rússia) com o número de acesso RIA 1867. Esta cepa também foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 7 de abril de 1987 com o número de acesso VKPM B-3996.

A E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) também pode ser usada como uma bactéria produtora de L-treonina ou uma cepa precursora para derivá-la. A cepa B-5318 é prototrófica com relação à isoleucina e, nesta cepa, a região regulatória do operon treonina no plasmídeo pVIC40 é substituída por um repressor Cl e promotor PR do fago X sensíveis à temperatura. A cepa VKPM B-5318 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscou 117545, Rússia) em 3 de maio de 1990 com o número de acesso de VKPM B-5318.

Preferivelmente, a bactéria usada pela presente invenção é modificada adicionalmente para aumentar a expressão de um ou mais dos seguintes genes:- o gene thA mutante que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I resistente à retroinibição por treonina;- o gene thB que codifica homosserina quinase;- o gene thC que codifica treonina sintase;- o gene rhtA que codifica uma possível proteína transmembrana;- o gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido desidrogenase; e- o gene aspC que codifica aspartato aminotransferase (aspartato transaminase).

O gene thA que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 337 a 2799, acesso ao Banco de Gene NC 000913.2, gi: 49175990). O gene thA está localizado entre os genes thL e thB no cromossomo de E. coli K-12. O gene thB que codifica homosserina quinase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 2801 a 3733, acesso ao Banco de Gene NC 000913.2, gi: 49175990). O thB gene está localizado entre os genes thA e thC no cromossomo de E. coli K-12. O thC gene que codifica treonina sintase de Escherichia coli foi elucidado (números de nucleotídeo 3734 a 5020, acesso ao Banco de Gene NC 000913.2, gi: 49175990). O thC gene está localizado entre o gene thB e o quadro aberto de leitura yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três destes genes funcionam como um operon simples de treonina. Para aumentar a expressão do operon treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição pode ser removida do operon (W02005/049808, W02003/097839).

O gene thA mutante que codifica aspartoquinase-homosserina desidrogenase I, resistente a retroinibição por treonina, e os genes thB e thC podem ser obtidos como um operon do plasmídeo pVIC40 bem conhecido, que está presente na cepa de E. coli VKPM B-3996 produtora de treonina. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na patente U.S. 5.705.371.

O gene rhtA está localizado em 18 min no cromossomo de E. coli, próximo ao operon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico à ORF 1 (gene ybiF, números de nucleotídeo 764 a 1651, número de acesso ao Banco de Gene AAA218541, gi:440181) e está localizado entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa uma proteína codificada pela ORF1 foi determinada como o gene rhtA (rht: resistência à homosserina e treonina). Foi também revelado que a mutação rhtA23 é uma substituição de A-por-G na posição -1, com relação ao códon inicial ATG (Resumos do 17° International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, junto com o Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, São Francisco, Califórnia, 24-29 de agosto de 1997, resumo número 457; EP 1013765 A).

O gene asd de E. coli já foi elucidado (números de nucleotídeo 3572511 a 3571408, acesso ao Banco de Gene NC_000913.1, gi: 16131307), e pode ser obtido por PCR (referência a White, T.J., Amheim, N., Erlich, H.UM., 1989, Trends Genet, 5:185-189), que utiliza oligonucleotídeos iniciadores preparados com base na sequência de nucleotídeos do gene. Os genes asd de outros microrganismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.

O gene aspC que codifica aspartato aminotransferase de E. coli também já foi elucidado (números de nucleotídeo 983742 a 984932, acesso ao Banco de Gene NC 000913.1, gi: 16128895), e pode ser obtido por PCR. Os genes aspC de outros microrganismos também podem ser obtidos de uma maneira similar.

Bactérias produtoras de L-cisteína

Os exemplos de bactérias produtoras de L-cisteína e cepas precursoras que derivam destas incluem, mas sem limitação, E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos de cysE, que codificam as serina acetiltransferases resistentes à retroinibição (patente U.S. 6.218.168, pedido de patente Russo 2003121601), E. coli W3110 com genes superexpressos que codificam proteínas adequadas para a excreção de substâncias tóxicas para as células (patente U.S. 5.972.663), as cepas de E. coli com atividade reduzida de cisteina dessulfidrase (patente Japonesa aberta ao público 11-155571), E. coli W3110 com maior atividade de um regulador transcricional positivo para regulação de cisteína codificada pelo gene cysB (W001/27307A1), dentre outros.

Bactérias produtoras de L-leucina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-leucina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, patente U.S. 6.124.121)) ou cepas de E. coli resistentes a um análogo de leucina, tais como β-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina e 5,5,5-trifluoroleucina (publicação de patente Japonesa (Kokoku) No. 62-34397 e patente Japonesa aberta ao público 8-70879); cepas de E. coli obtidas por uma técnica de engenharia genética descrita em WO96/06926; E. coli H-9068 (patente Japonesa aberta ao público 8-70879) dentre outras.

A bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada intensificando a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Os exemplos preferidos de tais genes incluem os genes do operon leuABCD, um exemplo típico de que é um gene leuA mutante que codifica a isopropil malato sintase dessensibilizada para retroinibição por L-leucina (patente U.S. 6.403.342). Além disso, a bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada intensificando a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido a partir das células bacterianas. Os exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-histidina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e as cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli cepa 24 (VKPM B-5945, RU 2003677); E. coli cepa 80 (VKPM B-7270, RU 2119536); E. coli NRRL B-12116 a B12121 (patente U.S. 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (patente U.S. 6.344.347); E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP 1085087); E. coli AI80/pFM201 (patente U.S. 6.258.554) dentre outros.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-histidina e cepas precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética L- histidina é aumentada. Os exemplos de tais genes incluem o gene ATP fosforibosil transferase (hisG), gene fosforibosil AMP cicloidrolase (hisl), gene fosforibosil-ATP pirofosfoidrolase (hisF), gene fosforibosilformimino-5- aminoimidazol carboxamida ribotídeo isomerase (hisA), gene amidotransferase (hisH), gene histidinol fosfato aminotransferase (hisC), gene histidinol fosfatase (hisB\ gene histidinol desidrogenase (hisD) dentre outros.

Sabe-se que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina e, portanto, a capacidade produtora de L-histidina pode ser eficientemente intensificada introduzindo uma mutação que confere a resistência à retroinibição no gene ATP fosforibosil transferase (hisG) (patentes Russas 2003677 e 2119536).

Os exemplos específicos de cepas com capacidade produtora de L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048, que são introduzidas com um vetor que carrega um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (patente Japonesa aberta ao público 56-005099), cepas de E. coli introduzidas com um gene para o transporte de aminoácido (EP 1016710 A), cepa de E. coli 80 conferida com resistência à sulfaguanidina, DL-1,2,4- triazol-3-alanina e estreptomicina (VKPM B-7270, patente Russa 2119536) dentre outras.

Bactérias produtoras de ácido L-glutâmico

Os exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli VL334thC+ (EP 1172433) dentre outras. A E. coli VL334 (VKPM B- 1641) é uma cepa auxotrófica para L-isoleucina e L-treonina com mutações nos genes thC e ilvA (patente U.S. 4.278.765). Um alelo tipo selvagem do gene thC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago PI crescido nas células da cepa E. coli Kl2 tipo selvagem de (VKPM B-7). Em função disso, uma cepa produtora de ácido L-glutâmico auxotrófica para L-isoleucina VL334thC (VKPM B-8961) foi obtida.

Exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de ácido L-glutâmico é aumentada. Os exemplos de tais genes incluem os genes que codificam glutamato desidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato desidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato desidrogenase (aceEF, IpdA), piruvato quinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgml), fosfoglicerato quinase (pgk), gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bisfosfato aldolase (ft>p), fosfofrutoquinase (pfkA, pfkB), glicose fosfato isomerase (pgi), dentre outros.

Os exemplos de cepas modificadas para aumentar a expressão do gene citrato sintetase, do gene fosfoenolpiruvato carboxilase e/ou do gene glutamato desidrogenase incluem aquelas reveladas em EP 1078989 A, EP 955368 A, e EP 952221 A.

Os exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico, e cepas precursoras para dar origem às mesmas, também incluem cepas em que a atividade de um enzima que catalisa a síntese de um composto, sem ser ácido L-glutâmico que se ramifica da via da biossíntese de ácido L-glutâmico, é menor ou eliminada. Os exemplos de tais enzimas incluem isocitrato liase (aceA), a-cetoglutarato desidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato quinase (ack), ácido acetoidróxi sintase (z7vG), acetolactato sintase (ilvP), formato acetiltransferase (pfl), lactato desidrogenase (ldh\ glutamato descarboxilase (gadAB), y-glutamil transferase (ggf), y-glutamilcisteína sintetase (gshA), y-glutamilputrescina sintetase (ycjK), dentre outras. A Escherichia coli deficiente na atividade de a-cetoglutarato desidrogenase ou com atividade reduzida de a-cetoglutarato desidrogenase, e métodos para obtê-las são descritos nas patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945.

Os exemplos específicos incluem os seguintes:E. coliWWQsucÁEKxrfE. coli AJ12624 (FERM BP-3853)E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)E. coli AJ 12949 (FERM BP-4881)E. coli W3110sucA::Kmr é uma cepa obtida interrompendo o gene a-cetoglutarato desidrogenase (daqui por diante também referido como “gene sucA”) de E. coli W3110. Esta cepa é completamente deficiente em a- cetoglutarato desidrogenase.

Outros exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico incluem Escherichia coli com resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Uma cepa também pode ser deficiente em a-cetoglutarato desidrogenase, e exemplos destas incluem, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807, patente U.S. 5.908.768), FFRM P-12379, que apresenta adicionalmente uma menor capacidade de decompor ácido L-glutâmico (patente U.S. 5.393.671), AJ13138 (FERM BP-5565, patente U.S. 6.110.714), dentre outras.

Os exemplos de bactérias produtoras de ácido L-glutâmico de Pantoea ananatis incluem a cepa Pantoea ananatis AJ 13355. Esta cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka-ken, e foi identificada como sendo capaz de se proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em um pH baixo. A cepa Pantoea ananatis AJ13355 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 11, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 19 de fevereiro de 1998 e atribuída a um número de acesso de FERM P-16644. Foi então convertida em um depósito internacional nas condições de Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999, e atribuída a um número de acesso de FERM BP-6614. Esta cepa foi originalmente identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada, e depositada como Enterobacter agglomerans AJ 13355. Entretanto, foi recentemente reclassificada em Pantoea ananatis com base no sequenciamento de nucleotídeo do RNAr 16S, dentre outros.

Além disso, os exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico de Pantoea ananatis também incluem bactérias do gênero Pantoea deficientes na atividade de a-cetoglutarato desidrogenase (aKGDH), ou com atividade reduzida de aKGDH. Os exemplos de uma cepa como esta incluem AJ 13356 (patente U.S. 6.331.419), que foi derivada eliminando a subunidade do gene aKGDH-El (sucA) em AJ13355, e a cepa SC17sucA (patente U.S. 6.596.517), que é uma cepa deficiente no gene sucA, derivada da cepa SC 17 e selecionada de AJ 13355 como uma cepa mutante produtora de pouca fleuma. A cepa AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (atualmente, o independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki- ken, Japão, código postal: 305-8566)) em 19 de fevereiro de 1998, e atribuída a um número de acesso de FERM P-16645. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 11 de janeiro de 1999, e atribuído a um número de acesso de FERM BP- 6616. Embora as cepas AJ13355 e AJ13356 sejam depositadas nos locais de depósito anteriormente mencionados como Enterobacter agglomerans, elas são referidas como Pantoea ananatis nesta especificação. A cepa SC17sucA foi determinada com um número particular de AJ417, e depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary em 26 de fevereiro de 2004, com o número de acesso de FERM BP-08646.

Além disso, os exemplos de bactérias produtoras de ácido L- glutâmico de Pantoea ananatis também incluem as cepas SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, AJ13601, NP106 e NA1. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi obtida introduzindo o plasmídeo RSFCPG, contendo o gene citrato sintase (gltÁ), gene fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc) e gene glutamato desidrogenase (gdhÁ) derivados de Escherichia coli, e o plasmídeo pSTVCB, contendo o gene citrato sintase (gltÁ) derivado de Brevibacterium lactofermentum, na cepa SC17sucA. A cepa AJ 13601 foi selecionada a partir da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB como uma cepa resistente a uma concentração elevada de ácido L-glutâmico em um pH baixo. A cepa NP 106 foi derivada da cepa AJ 13601 eliminando o plasmídeo RSFCPG+pSTVCB. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566), em 18 de agosto de 1999, e determinada com uni número de acesso FERM P-17516. A seguir, o depósito foi convertido em um depósito internacional sob as condições do Budapest Treaty em 6 de julho de 2000, e determinado com um número de acesso FERM BP-7207.

Bactérias produtoras de L-fenilalanina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-fenilalanina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli AJ12739 (tyrA::TnlO, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) que carrega o gene mutante pheA34 (patente U.S. 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR 8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146, NRRL B-12147 (patente U.S. 4.407.952), dentre outros. As cepas precursoras, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR- aroG4, pACMAB] denominada AJ 12604 (FERM BP-3579), também podem ser usadas (EP 488424 Bl). Além disso, também podem ser usadas as bactérias produtoras de L-fenilalanina da espécie Escherichia coli com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou pelo gene yddG (pedidos de patente publicados U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Bactérias produtoras de L-triptofano

Os exemplos de bactérias produtoras de triptofano e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficiente em triptofanoil-RNAt sintetase codificada pelo gene mutante trpS (patente U.S. 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) com um alelo de ser A que codifica fosfoglicerato desidrogenase livre a partir da retroinibição por serina, e um alelo de trpE que codifica antranilato sintase livre a partir da retroinibição por triptofano (patente U.S. 6.180.373), E. coli AGX17(pGX44) (NRRL B- 12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente em triptofanoase (patente U.S. 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps cuja capacidade de produzir fosfoenolpiruvato é intensificada (WO97/08333, patente U.S. 6.319.696), dentre outros. As bactérias produtoras de L- triptofano da espécie Escherichia coli com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo yedA ou pelo gene yddG também podem ser usadas (pedidos de patente publicados U.S. 2003/0148473 Al e 2003/0157667 Al).

Os exemplos de bactérias L-produtoras de triptofano e cepas precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas em que uma ou mais atividades das enzimas selecionadas de antranilato sintase (trpE), 5 fosfoglicerato desidrogenase (serA) e triptofano sintase (trpAB) são aumentadas. A antranilato sintase e fosfoglicerato desidrogenase sofrem ambas de retroinibição por L-triptofano e L-serina e, portanto, uma mutação que pode dessensibilizá-las da retroinibição pode ser introduzida nestas enzimas. Os exemplos específicos de cepas com uma mutação como esta 10 incluem E. coli SV164 que carrega antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida introduzindo o plasmídeo pGH5 (W094/08031), que contém um gene mutante serA que codifica fosfoglicerato desidrogenase dessensibilizada para a retroinibição, na E. coli SV164.

Os exemplos de bactérias L-produtoras de triptofano e cepas 15 precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas nas quais o operon triptofano, que contém um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizada para inibição, é introduzido (patentes Japonesas abertas ao público 57-71397, 62-244382, patente U.S. 4.371.614). Além do mais, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser conferida intensificando a 20 expressão de um gene que codifica triptofano sintase (trpBA) no operon triptofano. A triptofano sintase consiste em subunidades α e β codificadas pelos genes trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade de produzir L-triptofano pode ser melhor intensificando a expressão do operon isocitrato liase-malato sintase (W02005/103275).

Bactérias produtoras de L-prolina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-prolina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli 702ilvA (VKPM B-8012), que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP 1172433), dentre outros.

A bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada intensificando a expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Os exemplos de um gene preferido para as bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB, que codifica glutamato quinase dessensibilizada para retroinibição por L-prolina (DE 3127361). Além disso, a bactéria usada pela presente invenção pode ser melhorada intensificando a expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L- aminoácido a partir das células bacterianas. Os exemplos de tais genes incluem os genes b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP 1239041 A2).

Os exemplos de Escherichia coli com capacidade de produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B- 12404 (patente Britânica 2075056), VKPM B-8012 (pedido de patente Russo 2000124295), plasmídeos mutantes descritos na patente Alemã 3127361, plasmídeos mutantes descritos por Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p. 34), dentre outros.

Bactérias produtoras de L-arginina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, E. coli cepa 237 (VKPM B-7925) (pedido de patente publicado U.S. 2002/058315Al) e cepas derivadas desta, que carregam uma N-acetilglutamato sintase mutante (pedido de patente Russo 2001112869), E. coli cepa 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 Al), uma cepa produtora de arginina, na qual o gene argA que codifica N- acetilglutamato sintetase é introduzido (EP 1170361 Al), dentre outros.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-arginina e cepas precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas nas quais a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L- arginina é aumentada. Os exemplos de tais genes incluem o gene N- acetilglutamil fosfato redutase (argC), gene omitina acetil transferase (argJ), gene N-acetilglutamato quinase (argB), gene acetilomitina transaminase (argD), gene omitina carbamoil transferase (argF), gene ácido argininosuccinico sintetase (argG), gene ácido argininosuccinico liase (argH) e gene carbamoil fosfato sintetase (carAB).

Bactérias produtoras de L-valina

Os exemplo de bactérias produtoras de L-valina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, cepas que foram modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (patente U.S. 5.998.178). É desejável remover a região exigida para atenuação no operon ilvGMEDA, de maneira tal que expressão do operon não seja atenuada pela L- valina produzida. Além disso, o gene ilvA no operon é preferivelmente interrompido, de maneira tal que a atividade de treonina desaminase seja menor.

Os exemplos de bactérias produtoras de L-valina e cepas precursoras para dar origem às mesmas também incluem cepas mutantes com uma mutação em amino-acil RNAt sintetase (patente U.S. 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que apresenta uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina RNAt sintetase, pode ser usada. E. coli VL1970 foi depositada no Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (1 Dorozhny Proezd, 1 Moscou 117545, Rússia) em 24 de junho de 1988 com o número de acesso de VKPM B-4411.

Além disso, as cepas mutantes que exigem ácido lipóico para o crescimento e/ou não apresentam H+-ATPase (WO96/06926) também podem ser usadas como as cepas precursoras.

Bactérias produtoras de L-isoleucina

Os exemplos de bactérias produtoras de L-isoleucina e cepas precursoras para dar origem às mesmas incluem, mas sem limitação, cepas mutantes com resistência a 6-dimetilaminopurina (patente Japonesa aberta ao público 5-304969), cepas mutantes com resistência a um análogo de isoleucina tais como tiaisoleucina e hidroxamato de isoleucina, e tais cepas mutantes com resistência adicional a DL-etionina e/ou hidroxamato de arginina (patente Japonesa aberta ao público 5-130882). Além disso, as cepa recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, tais como treonina desaminase e ácido acetoidroxi sintase, também podem ser usadas como as cepas precursoras (patente Japonesa aberta ao público 2-458, FR 0356739, e patente U.S. 5.998.178).

Bactérias produtoras de L-asparagina

A L-asparagina é produzida transferindo um grupo amino para o ácido aspártico (Boehlein, S.K., Richards, N.G.J., & Schuster, S.M. (1994a), J. Biol. Chem., 269, 7450-7457). Portanto, os exemplos de bactérias da espécie Escherichia coli produtoras de L-asparagina incluem cepas de Escherichia coli que produzem ácido L-aspártico, em que a asparagina sintetase é aumentada.

A capacidade da bactéria da presente invenção em utilizar um ácido graxo ou um álcool, tal como glicerol, pode ser intensificada.

A capacidade de utilizar ácido graxo pode ser intensificada, por exemplo, atenuando a expressão do gene fadR ou eliminado este gene, ou intensificando a expressão de um gene envolvido na utilização de ácido graxo, tal como o gene fadl, fadJ, fadL, fadE, fadD, fadB ou fadA (W02009/142286).

A capacidade de utilizar glicerol pode ser intensificada atenuando a expressão do gene glpR (patente Europeia 1715056), intensificando a expressão de um gene do metabolismo do glicerol tais como os genes glpA, glpB, glpC, glpD, glpE, glpE, glpG, glpK, glpQ, glpT, glpX, tpiA, gldA, dhaK, dhaL, dhaM, dhaR, fsa e talC (EP 1715055 A), ou intensificando a expressão do gene glicerol desidrogenase {gldA}, do gene diidroxiacetona quinase (dhaKLM, dak) e do gene frutose-6-fosfato aldolase (fsaB) (W02008/102861).

A bactéria usada pela presente invenção pode ser uma bactéria com uma capacidade de utilizar etanol. Uma cepa como esta pode ser uma bactéria com capacidade inerente de utilizar etanol, uma cepa recombinante na qual a capacidade de utilizar etanol é conferida, ou uma cepa mutante cuja capacidade de utilizar o etanol é aumentada.

Assim como em Escherichia coli, como uma enzima que geraetanol anaerobicacamente, é conhecida a presença de AdhE que apresenta atividade de acetaldeído desidrogenase e álcool desidrogenase, catalizando reversivelmente as reações mencionadas a seguir. A sequência do gene adhE que codifica AdhE de Escherichia coli é revelada em W02009/031565 e no 10 pedido de patente publicado U.S. 2009/068712.Acetil-CoA + NADH + H+ -> acetaldeído + NAD+ + CoA Acetaldeído + NADH + H+ -> etanol + NAD

Quando o etanol é usado como a fonte de carbono, é preferível usar uma bactéria que não pode utilizar aerobicamente o etanol. Embora a 15 Escherichia coli em geral não possa utilizar o etanol em uma condição aeróbica, uma cepa modificada de maneira a ser capaz de utilizar aerobicamente o etanol pode ser usada. Os exemplos do método para modificar uma bactéria que de maneira inerente não pode utilizar aerobicamente o etanol, de maneira a ser capaz de utilizar aerobicamente o 20 etanol, incluem fazer com que a bactéria carregue o gene adhE modificado de maneira a ser expresso no controle de um promotor não natural que funciona em uma condição aeróbica, e fazer com que a bactéria carregue o gene adhE com uma mutação que possibilita a utilização aeróbica de etanol na região codificante (Clark D.P., e Cronan, J.E. Jr., 1980, J. Bacteriol., 144:179-184;

Membrillo-Hemandez, J. et al., 2000, J. Biol. Chem., 275:33869-33875). Além disso, este gene mutante adhE pode ser expresso no controle de um promotor não natural que funciona em uma condição aeróbica.

Em Escherichia coli, se o promotor localizado à montante do gene que codifica a álcool desidrogenase for substituído por um promotor que funciona aerobicamente, a álcool desidrogenase é expressa em uma condição aeróbica e Escherichia coli se toma capaz de utilizar aerobicamente o etanol (W02008/010565). Assim como o promotor não natural que funciona em uma condição aeróbica, um promotor arbitrário que pode expressar o gene adhE em um nível que excede um certo nível específico, em uma condição aeróbica, pode ser usado. A condição aeróbica pode ser uma condição tipicamente usada para o cultivo de bactérias, em que o oxigênio é fornecido por um método tal como movimentação, aeração, agitação ou similar. Especificamente, um promotor arbitrário que é conhecido por expressar um gene em uma condição aeróbica pode ser usado. Por exemplo, os promotores de genes envolvidos na glicólise, via das pentoses fosfato, ciclo TCA, vias de biossíntese de aminoácido, dentre outros, podem ser usados. Além disso, sabe-se que o promotor Ptac do fago X, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotores PR. e promotor PL são todos promotores fortes que funcionam em uma condição aeróbica, e estes são preferivelmente usados.

Assim como um mutante AdhE com uma tal mutação da maneira mencionada anteriormente, é conhecido especificamente o mutante AdhE de Escherichia coli, em que o resíduo de ácido glutâmico na posição 568 é substituído por um resíduo de aminoácido sem ser os resíduos de ácido glutâmico e ácido aspártico, por exemplo, resíduo de lisina (Glu568Lys, E568K, W02008/010565).

O mutante AdhE anteriormente mencionado pode incluir adicionalmente a(s) seguinte(s) mutação(s) adicional(s).A) Substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 560 por um outro resíduo de aminoácido, tal como resíduo de lisina,B) Substituição do resíduo de fenilalanina na posição 566 por um outro resíduo de aminoácido, tal como resíduo de valina,C) Substituição do resíduo de ácido glutâmico na posição 22, resíduo de metionina na posição 236, resíduo de tirosina na posição 461, resíduo de isoleucina na posição 544, e resíduo de alanina na posição 786, por outro resíduo de aminoácidos tais como resíduo de glicina, resíduo de valina, resíduo de cisteína, resíduo de serina e resíduo de valina, respectivamente, ouD) uma combinação das mutações anteriormente mencionadas.

A expressão "uma bactéria pode utilizar aerobicamente o etanol" significa que a bactéria pode crescer em um meio líquido ou meio sólido mínimo contendo etanol como a única fonte de carbono, em uma condição aeróbica. A "condição aeróbica" pode ser uma condição geralmente usada para o cultivo de bactérias, em que o oxigênio é fornecido por um método tal como movimentação, aeração, agitação ou similar, da maneira mencionada anteriormente. A expressão "uma bactéria pode utilizar aerobicamente o etanol" também significa que, assim como no nível da proteína AdhE, a atividade de álcool desidrogenase em um estrato sem célula, avaliado de acordo com o método de Clark e Cronan (J. Bacteriol., 1980, 141, 177-183), é de 1,5 unidade ou mais, preferivelmente 5 unidades ou mais, mais preferivelmente 10 unidades ou mais por mg da proteína.

Em particular, quando o etanol é usado como a fonte de carbono, a bactéria da presente invenção pode ser modificada de maneira tal que a atividade de ribonuclease G seja reduzida.

A bactéria da presente invenção pode ser uma cepa modificada, de maneira tal que a atividade de piruvato sintase ou piruvato:NADP4 oxidorredutase seja menor. A atividade de piruvato sintase ou piruvato:NADP oxidorredutase é preferivelmente aumentada comparada àquela da cepa precursora, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada. Além disso, quando o microrganismo não apresenta originalmente a atividade de piruvato sintase, o microrganismo foi modificado de maneira tal que apresente a atividade de piruvato sintase atividade maior que a atividade de piruvato sintase ou piruvato:NADP oxidorredutase, comparada a uma cepa não modificada.

A "piruvato sintase" referida na presente invenção significa uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir, que gera ácido pirúvico a partir de acetil-CoA e CO2 na presença de um doador de elétrons tal como ferredoxina ou flavodoxina (EC 1.2.7.1). A piruvato sintase pode ser abreviada como PS, e pode ser determinada como piruvato oxidorredutase, piruvato ferredoxina oxidorredutase, piruvato flavodoxina oxidorredutase ou piruvato oxidorredutase. Como doador de elétrons, ferredoxina ou flavodoxina pode ser usada.Ferredoxina reduzida + acetil-CoA + CO2 -> ferredoxina oxidada + ácido pirúvico + CoA

A intensificação da atividade de piruvato sintase pode ser confirmada preparando soluções brutas de enzima a partir do microrganismo antes da intensificação, e a partir do microrganismo após a intensificação, e comparando as atividades de piruvato sintase das mesmas. A atividade de piruvato sintase pode ser avaliada, por exemplo, pelo método de Yoon et al. (Yoon, K.S. et al., Arch. Microbiol. 167:275-279, 1997). Por exemplo, a medição pode ser atingida adicionando ácido pirúvico a uma solução de reação contendo metil viologênio oxidado como um aceptor de elétrons, CoA e uma solução de enzima bruta, e medindo espectroscopicamente a quantidade de metil viologênio reduzido, que aumenta em virtude da reação de descarboxilação do ácido pirúvico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir 1 μmol de metil viologênio por 1 minuto. Quando a cepa precursora apresenta a atividade de piruvato sintase, a atividade aumenta desejavelmente, por exemplo, preferivelmente 1,5 vez ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, comparada com aquela da cepa precursora. Quando a cepa precursora não apresenta a atividade de piruvato sintase, embora seja suficiente que a piruvato sintase seja produzida em virtude da introdução do gene piruvato sintase, a atividade é preferivelmente intensificada em uma extensão tal que a atividade enzimática possa ser medida, e a atividade é preferivelmente 0,001 U/mg (proteína celular) ou maior, mais preferivelmente 0,005 U/mg ou maior, ainda mais preferivelmente 0,01 U/mg ou maior. A piruvato sintase é sensível ao oxigênio, e a expressão da atividade e a avaliação da atividade são frequentemente difíceis (Buckel, W. e Golding, B.T., 2006, Ann. Rev. de Microbiol., 60:27-49). Portanto, quando a atividade enzimática é avaliada, é preferível realizar a reação enzimática, reduzindo ao mesmo tempo a concentração de oxigênio no vaso da reação.

Assim como o gene que codifica piruvato sintase, é possível usar genes de piruvato sintase das bactérias com o ciclo TCA reduzido, tais como Chlorobium tepidum e Hydrogenobacter thermophilus. Além do mais, também é possível usar genes de piruvato sintase das bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae, incluindo Escherichia coli. Além disso, assim como o gene que codifica piruvato sintase, os genes de piruvato sintase de metanogênicos autotróficos, tais como Methanococcus maripaludis, Methanocaldococcus jannaschii e Methanothermobacter thermautotrophicus, podem ser usados.

Os exemplos específicos incluem um gene com a sequência de nucleotídeos que se localiza nos números de nucleotídeo 1534432 a 1537989 da sequência do genoma de Chlorobium tepidum (número de acesso ao Genbank NC 002932) e é mostrado em SEQ ID NO: 1, como o gene de piruvato sintase de Chlorobium tepidum. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como o número de acesso ao Genbank AAC76906. Além disso, sabe-se que a piruvato sintase de Hydrogenobacter thermophilus forma um complexo de quatro subunidades, subunidade δ (número de acesso ao Genbank BAA95604), subunidade α (número de acesso ao Genbank BAA95605), subunidade β (número de acesso ao Genbank BAA95606) e subunidade y (número de acesso ao Genbank BAA95607) (Ikeda, T. et al., 2006, Biochem. Biophys. Res. Commun., 340:76-82). Os exemplos do gene adicional incluem o gene de piruvato sintase que consiste em quatro genes, HP 1108, HP 1109, HP1110 e HP1111, que se localizam nos números de nucleotideo de 1170138 a 1173296 da sequência do genoma de Helicobacter pylori (número de acesso ao Banco de Gene NC 000915), e o gene de piruvato sintase que consiste em quatro genes, SSO1208, SSO7412, SSO1207 e SSO1206, identificado pelos números de nucleotideo de 1047593 a 1044711 na sequência do genoma de Sulfolobus solfataricus (número de acesso ao Banco de Gene NC 002754). Além disso, o gene de piruvato sintase pode ser aquele clonado a partir de bactérias Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobacter, Thermoproteus, Pyrobaculum ou similar, com base na homologia com os genes exemplificados anteriormente.

E previsto que, em Escherichia coli, o gene ydbK (bl378) com a sequência de nucleotídeos que se localiza nos números de nucleotideo 1435284 a 1438808 na sequência do genoma da cepa K-12 (número de acesso ao Banco de Gene U00096) codifica piruvato flavodoxina oxidorredutase, isto é, piruvato sintase, com base na homologia das sequências. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene AAC76906. Além disso, o gene de piruvato sintase pode ser qualquer dos genes de piruvato sintase das bactérias Enterobacteriaceae, tais como as bactérias dos gêneros Escherichia, Salmonella, Serratia, Enterobacter, Shigella e Citrobacter, que exibem muita homologia com o gene de piruvato sintase de Escherichia coli (ydbK).

O gene de piruvato sintase de Methanococcus maripaludis é codificado pelo operon por CDABEF, que se localiza nos números de nucleotideo 1462535 a 1466397 na sequência do genoma de Methanococcus maripaludis (número de acesso ao Banco de Gene NC_005791)(Hendrickson, E. L. et al., J. Bacteriol., 186: 6956-6969, 2004). Esta piruvato sintase inclui quatro subunidades y, α, β e δ, e sabe-se que PorE e PorF, além destas subunidades, são importantes para a atividade de piruvato sintase (Lin, W. e Whitman, W.B., Arch. Microbiol., 181: 68-73, 2004). A subunidade y é codificada pelo gene por A, que corresponde aos números de nucleotídeo 1465867 a 1466397 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP 988626. A subunidade δ é codificada pelo gene porB, que corresponde aos números de nucleotídeo 1465595 a 1465852 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP 988627. A subunidade α é codificada pelo gene porC, que corresponde aos números de nucleotídeo 1464410 a 1465573 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP_988625. A subunidade β é codificada pelo gene porD, que corresponde aos números de nucleotídeo 1463497 a 1464393 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP 988624. O PorE é codificado pelo gene porE, que corresponde aos números de nucleotídeo 1462970 a 1463473 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP 988623. O PorF é codificado pelo gene porF, que corresponde aos números de nucleotídeo 1462535 a 1462951 (fita complementar) da sequência do genoma, e a sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada como número de acesso ao Banco de Gene NP 988622.

Sabe-se que Methanocaldococcus jannaschii, Methanothermobacter thermautotrophicus e similares, que são arqueobactérias metanogênicas autotróficas, apresentam um gene de piruvato sintase com a mesma estrutura e, portanto, estes genes podem ser usados.

A "piruvato:NADP+ oxidorredutase" referida na presente invenção é uma enzima que catalisa reversivelmente a reação a seguir, o que gera ácido pirúvico a partir de acetil CoA e CO2, na presença de um doador de elétrons tal como NADPH ou NADH (EC 1.2.1.15). A piruvato:NADP+ oxidorredutase pode ser abreviada como PNO, e pode ser determinada piruvato desidrogenase. Entretanto, a "atividade de piruvato desidrogenase" referida na presente invenção é a atividade de catalisar a descarboxilação oxidativa de ácido pirúvico para gerar acetil-CoA, da maneira descrita posteriormente, e a piruvato desidrogenase (PDH) que catalisa esta reação é uma enzima diferente da piruvato:NADP oxidorredutase. A piruvato:NADP oxidorredutase pode usar NADPH ou NADH como o doador de elétrons.NADPH + acetil-CoA + CO2 -> NADP + ácido pirúvico + CoA

A intensificação da atividade de piruvato:NADP+ oxidorredutase pode ser confirmada preparando as soluções brutas de enzima a partir do microrganismo antes da intensificação, e a partir do microrganismo após a intensificação, e comparando as atividades de piruvato:NADP4 oxidorredutase das mesmas. A atividade de piruvato:NADP4 oxidorredutase pode ser avaliada, por exemplo, pelo método de Inui et al. (Inui, H. et al., J. Biol. Chem., 262:9130-9135, 1987). Por exemplo, a avaliação pode ser atingida adicionando ácido pirúvico a uma mistura de reação que contém metil viologênio oxidado como um aceptor de elétrons, CoA, e solução de enzima bruta, e medindo espectroscopicamente a quantidade de metil viologênio reduzido, que aumenta em virtude da descarboxilação de ácido pirúvico. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como uma atividade de reduzir 1 μmol de metil viologênio por 1 minuto. Quando a cepa precursora apresenta a atividade de piruvato:NADP+ oxidorredutase, a atividade aumenta de maneira desejável, por exemplo, preferivelmente 1,5 vez ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, comparada com aquela da cepa precursora. Quando a cepa precursora não apresenta atividade de piruvato:NADP oxidorredutase, embora seja suficiente que a piruvato:NADP oxidorredutase seja produzida pela introdução do gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase, a atividade é preferivelmente intensificada em uma extensão tal que a atividade enzimática possa ser avaliada, e a atividade seja preferivelmente 0,001 U/mg (proteína celular) ou maior, mais preferivelmente 0,005 U/mg ou maior, ainda mais preferivelmente 0,01 U/mg ou maior. A piruvato:NADP oxidorredutase é sensível ao oxigênio, e a expressão e avaliação da atividade são em geral difíceis (Inui, H. et al., 1987, J. Biol. Chem., 262: 9130-9135; Rotte, C. et al., 2001, Mol. Biol. Evol., 18:710-720).

Quanto ao gene que codifica a piruvato:NADP~ oxidorredutase, além do gene de piruvato:NADP' oxidorredutase de Euglena gracilis, que é um microrganismo eucarioto fotossintético e também é classificado como protozoário (Nakazawa et al., 2000, FEBS Lett., 479:155156), e do gene de piruvato:NADP+ oxidorredutase de um protista, Cryptosporidium parvum (Rotte, C. et al., 2001, Mol. Biol. Evol., 18:710720), sabe-se que um gene homólogo também existe em Bacillariophyta, Tharassiosira pseudonana (CRNAtcta, V. et al., 2006, J. Eukaryot. Microbiol., 53:225-231).

Especificamente, um gene com a sequência de nucleotídeos revelado com o número de acesso ao Banco de Gene AB021127 pode ser exemplificado como o gene de piruvato:NADP oxidorredutase de Euglena gracilis. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é revelada com o número de acesso ao Banco de Gene BAB12024.

O microrganismo da presente invenção pode ser um microrganismo modificado, de maneira tal que a atividade de piruvato sintase seja maior por uma modificação como esta, em que a atividade de reciclar o doador oxidado de elétrons em doador reduzido de elétrons, que é exigido para a atividade de piruvato sintase, é maior comparada com uma cepa precursora, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou uma cepa não modificada. O exemplo da atividade para reciclar doador de elétrons oxidado em doador reduzido de elétrons inclui a atividade de ferredoxina NADP redutase. Além disso, o microrganismo pode ser um microrganismo modificado, de maneira tal que a atividade de piruvato sintase seja aumentada por uma modificação como esta, em que a atividade de piruvato sintase seja maior, além da intensificação da atividade de reciclagem do doador de elétrons. A cepa precursora anteriormente mencionada pode ser uma cepa que apresenta de maneira inerente com um gene que codifica a atividade de reciclagem do doador de elétrons, ou uma cepa que não apresenta de maneira inerente a atividade de reciclagem do doador de elétrons, mas pode ser conferida com a atividade pela introdução de um gene que codifica a atividade, e melhora uma capacidade de produzir L-aminoácido.

A "ferredoxina NADP+ redutase" significa uma enzima que catalisa reversivelmente a seguinte reação (EC 1.18.1.2).Ferredoxina reduzida + NADP+ -> Ferredoxina oxidada + NADPH + H+

Esta reação é uma reação reversível, e pode gerar a ferredoxina reduzida na presença NADPH e a ferredoxina oxidada. A redoxina é substituível por flavodoxina, e a enzima apresenta uma função equivalente àquela da enzima determinada flavodoxina NADP * redutase. A existência de ferredoxina NADP* redutase é confirmada em uma ampla variedade de organismos que varia de microrganismos a organismos superiores (referência a Carrillo, N. e Ceccarelli, E.A., 2003, Eur. J. Biochem., 270:1900-1915; Ceccarelli, E.A. et al., 2004, Biochim. Biophys. Acta., 1698:155-165), e algumas das enzimas também são denominadas ferredoxina NADP oxidorredutase ou NADPH-ferredoxina oxidorredutase.

A intensificação da atividade de ferredoxina NADP redutase pode ser confirmada preparando as soluções brutas de enzima a partir do microrganismo antes da modificação, e a partir do microrganismo após a modificação, e comparando as atividades de ferredoxina NADP1 redutase das mesmas. A atividade de ferredoxina NADP+ redutase pode ser avaliada, por exemplo, pelo método de Blaschkowski et al. (Blaschkowski, H.P. et al., 1982, Eur. J. Biochem., 123:563-569). Por exemplo, a atividade pode ser avaliada usando ferredoxina como um substrato para medir espectroscopicamente a diminuição da quantidade de NADPH. Uma unidade (U) da atividade enzimática é definida como a atividade para oxidar 1 μmol de NADPH por 1 minuto. Quando a cepa precursora apresenta a atividade de ferredoxina NADP+ redutase, e a atividade da cepa precursora é suficientemente elevada, não é necessário intensificar a atividade. Entretanto, a atividade enzimática é desejavelmente maior, preferivelmente 1,5 vez ou mais, mais preferivelmente 2 vezes ou mais, ainda mais preferivelmente 3 vezes ou mais, comparada com aquela da cepa precursora.

Os genes que codificam a ferredoxina NADP+ redutase são encontrados em muitas espécies biológicas, e qualquer um destes que exibem a atividade na cepa que produz L-aminoácido em questão pode ser usado. Quanto a Escherichia coli, o gene fpr foi identificado como um gene para flavodoxina NADP+ redutase (Bianchi, V. et al., 1993, 175:1590-1595). Além do mais, sabe-se que em Pseudomonas putida um gene de NADPH- putidarredoxina redutase e um gene de putidarredoxina existem como um operon (Koga, H. et al., 1989, J. Biochem. (Tokyo), 106:831-836).

Os exemplos do gene de flavodoxina NADP+ redutase de Escherichia coli incluem o gene fpr que se localiza nos números de nucleotídeo 4111749 a 4112495 (fita complementar) da sequência do genoma do Escherichia coli cepa K-12 (número de acesso ao Genbank U00096). A sequência de aminoácidos de Fpr é a sequência de aminoácidos codificada por este gene que é revelada como o número de acesso ao Genbank AAC76906). Além do mais, um gene de ferredoxina NADP+ redutase (número de acesso ao Genbank BAB99777) também é encontrado nos números de nucleotídeo 2526234 a 2527211 da sequência do genoma de Corynebacterium glutamicum (número de acesso ao Genbank BA00036).

A atividade de piruvato sintase exige a presença de ferredoxina ou flavodoxina como um doador de elétrons. Portanto, o microrganismo pode ser um microrganismo modificado de maneira tal que a atividade de piruvato 5 sintase aumente por uma modificação como esta, em que a capacidade de produção para ferredoxina ou flavodoxina aumenta.

Além do mais, o microrganismo também pode ser modificado de maneira tal que a capacidade de produção para ferredoxina ou flavodoxina aumente, além de ser modificado de maneira tal que a atividade de piruvato 10 sintase ou a flavodoxina NADP+ redutase e as atividades de piruvato sintase sejam intensificadas.

Na presente invenção, a "ferredoxina" refere-se a uma proteína que contém átomos de ferro (Fe) não associados a heme e átomos de enxofre, ligada com um agrupamento de ferro - enxofre chamado de agrupamento 4Fe- 15 4S, 3Fe-4S ou 2Fe-2S, e que funciona como um portador de um elétron. A"flavodoxina" refere-se a uma proteína que contém FMN (mononucleotídeo flavina) como um grupo prostético e que funciona como um portador de um ou dois elétrons. Ferredoxina e flavodoxina são descritos na referência de McLean et al. (McLean K.J. et al., 2005, Biochem. Soc. Trans., 33:796-801).

As cepas precursoras a serem sujeitas a modificação podem sercepas que têm inerentemente um gene endógeno que codifica ferredoxina ou flavodoxina. Altemativamente, as cepas precursoras podem ser cepas que não têm inerentemente um gene que codifica ferredoxina ou flavodoxina, mas que pode produzir estas proteínas pela introdução de um gene de ferredoxina ou 25 flavodoxina para mostrar melhor capacidade de produção de ácido L- glutâmico.

A melhoria da capacidade de produção de ferredoxina ou de flavodoxina comparada com a cepa precursora, tal como um cepa tipo selvagem ou não modificada, pode ser confirmada, por exemplo, pela comparação da quantidade de RNAm para ferredoxina ou flavodoxina com aquela de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Os exemplos do método para confirmar a quantidade de expressão incluem hibridização Northern e RT-PCR (Sambrook, J. Et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual/Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque.). O grau de aumento da expressão não é particularmente limitado, desde que ela aumente, comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, ela aumenta, desejavelmente, por exemplo, 1,5 vez ou mais, preferivelmente, 2 vezes ou mais, mais preferivelmente, 3 vezes ou mais, comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada.

A melhoria da capacidade de produção de ferredoxina ou de flavodoxina, se comparada com uma cepa precursora, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada, pode ser detectada por SDS-PAGE, eletroforese bidimensional ou Western blotting usando anticorpos (Sambrook J. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Segunda Edição, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque). O grau da melhoria da produção não é particularmente limitado, desde que ela aumente, comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada. Entretanto, desejavelmente, ela aumenta, por exemplo, 1,5 vez ou mais, preferivelmente, 2 vezes ou mais, mais preferivelmente, 3 vezes ou mais, comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou cepa não modificada.

As atividades de ferredoxina e de flavodoxina podem ser medidas as adicionando a um sistema de reação oxidação - redução adequado. Por exemplo, um método que compreende reduzir ferredoxina produzida com ferredoxina NADP+ redutase e quantificar a redução de citocromo C pela ferredoxina produzida reduzida é revelado por Boyer et al. (Boyer, M.E. et al., 2006, Biotechnol. Bioeng., 94:128-138). Além disso, a atividade de flavodoxina pode ser medida pelo mesmo método que usa flavodoxina NADP redutase.

Genes que codificam ferredoxina ou flavodoxina são amplamente distribuídos, e qualquer um destes pode ser usado, desde que ferredoxina ou flavodoxina codificadas pelos genes possam ser utilizadas por sistema de reciclagem de piruvato sintase e um doador de elétrons. Por exemplo, em Escherichia coli, o gene fdx existe como um gene que codifica ferredoxina que tem um agrupamento 2Fe-2S (Ta, D.T. e Vickery, L.E., 1992, J. Biol. Chem., 267:11120-11125), e o gene yfhL é esperado como um gene que codifica ferredoxina que tem um agrupamento 4Fe-4S. Além disso, como o gene de flavodoxina, o gene fldA (Osborne C. et al., 1991, J. Bacteriol., 173:1729-1737) e o gene fldB (Gaudu, P. e Weiss, B., 2000, J. Bacteriol., 182:1788-1793) são conhecidos. Na sequência do genoma de Corynebacterium glutamicum (número de acesso ao Genbank BA00036), múltiplos genes da ferredoxina, fdx (número de acesso ao Genbank BAB97942) foram encontrados nos números de nucleotídeo de 562643 a 562963, e o gene fer foi encontrado nos números de nucleotídeo de 1148953 a 1149270 (número de acesso ao Genbank BAB98495). Além disso, em Chlorobium tepidum, existem muitos genes da ferredoxina, e ferredoxina I e ferredoxina II foram identificadas como genes da ferredoxina para o tipo 4Fe-4S que serve como o aceitador de elétrons de piruvato sintase (Yoon, K.S. et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:4402744036). Gene da ferredoxina ou gene de flavodoxina de bactérias com o ciclo TCA reduzido, tal como o gene da ferredoxina de Hydrogenobacter thermophilus e similares também podem ser usados.

Os exemplos específicos do gene da ferredoxina de Escherichia coli incluem o gene fdx que se localiza nos números de nucleotídeo de 2654770 a 2655105 (fita complementar) da sequência do genoma do Escherichia coli cepa K-12 (número de acesso ao Genbank U00096), e o gene yfhL que se localiza nos números de nucleotídeo de 2697685 a 2697945 da mesma. As sequências de aminoácidos de Fdx e YfhL são reveladas como números de acesso ao Genbank AAC75578 e AAC75615, respectivamente. Os exemplos do gene de flavodoxina de Escherichia coli incluem o gene fldA que se localiza nos números de nucleotídeo de 710688 até 710158 (fita complementar) da sequência do genoma do Escherichia coli cepa K-12 (número de acesso ao Genbank U00096), e o gene fldB que se localiza nos números de nucleotídeo 3037877 até 3038398 da mesma. As sequências de aminoácidos codificadas pelo gene fldA e pelo gene fldB são reveladas como números de acesso ao Genbank AAC73778 e AAC75933, respectivamente.

Exemplos do gene da ferredoxina de Chlorobium tepidum incluem o gene ferredoxina I que se localiza nos números de nucleotídeo de 1184078 a 1184266 na sequência do genoma de Chlorobium tepidum (número de acesso ao Genbank NC 002932), e o gene ferredoxina II que se localiza nos números de nucleotídeo de 1184476 a 1184664 da mesma. As sequências de aminoácidos de Ferredoxina I e Ferredoxina II são reveladas como números de acesso ao Genbank AAM72491 e AAM72490, respectivamente. Os exemplos incluem adicionalmente o gene da ferredoxina de Hydrogenobacter thermophilus (número de acesso ao Genbank BAE02673) e o gene da ferredoxina de Sulfolobus solfataricus indicado com os números de nucleotídeo de 2345414 a 2345728 no genoma de Sulfolobus solfataricus. Além disso, o gene pode ser aquele clonado a partir de bactérias Chlorobium, Desulfobacter, Aquifex, Hydrogenobacter, Thermoproteus, Pyrobaculum ou similares, com base na homologia com os genes exemplificados anteriormente, ou aqueles clonados a partir de y-proteobactéria, tais como aqueles do gênero Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Yersinia ou similares, bactérias corineformes, tais como Corynebacterium glutamicum e Brevibacterium lactofermentum, Pseudomonas, bactérias tais como Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium, bactérias tal como Mycobacterium tuberculosis, dentre outros.

Além disso, na bactéria da presente invenção, é preferível que a atividade da enzima málica diminua, além de que a atividade de piruvato sintase ou a atividade de piruvato NADH4- oxidorredutase aumentem. Especialmente, é preferível que a atividade da enzima málica seja reduzida quando a bactéria da presente invenção for uma bactéria que pertence aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, ou Serattia.

Na presente invenção, atividade da enzima málica significa uma atividade para catalisar reversivelmente a reação de descarboxilação oxidativamente de ácido málico para produzir ácido pirúvico. A reação anteriormente mencionada é catalisada por dois tipos de enzimas, enzima málica dependente de NADP que usa NADP como aceitador de elétrons (também notado como "malato desidrogenase (descarboxilação de oxaloacetato)(NADP+)” (EC: 1.1.1.40 gene b2463 (também notado como gene maeBy), e enzima málica dependente de NAD que usa NAD como aceitador de elétrons (também notado como "malato desidrogenase (descarboxilação de oxaloacetato)(NAP )" (EC: 1.1.1.38 gene sfc (também notado como gene maeA). A atividade da enzima málica pode ser medida pelo método de Bologna et al. (Bologna, F.P. et al., 2007, J. Bacteriol., 2007 189: 5937-5946).enzima málica dependente de NADP: NADP+ + malato -> NADPH + CO2 + piruvatoenzima málica dependente de NAD: NAD+ + malato -> NADH + CO2 + piruvato

Na presente invenção, é preferível que atividades tanto de enzima málica dependente de NADP quanto de enzima málica dependente de NAD diminuam. E particularmente preferido que atividades de ambos os tipos de enzimas málicas diminua quando a bactéria da presente invenção for uma bactéria que pertence aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Klebsiella, ou Serattia.

Além disso, no microrganismo da presente invenção, é preferível que atividade de piruvato desidrogenase seja reduzida, além de que a atividade de piruvato sintase ou a atividade de piruvato :NADH+ oxidorredutase aumentem.

Na presente invenção, atividade de piruvato desidrogenase (a partir daqui, também referida como "PDH") significa uma atividade para catalisar a reação de descarboxilação oxidativamente de ácido pirúvico para produzir acetil-CoA. A reação anteriormente mencionada é catalisada por três tipos de enzimas, PDH (Elp, piruvato desidrogenase, EC: 1.2.4.1, codificado pelo gene aceE), diidrolipoil transacetilase (E2p, EC:2.3.1.12, codificado pelo gene aceP) e diidrolipoamida desidrogenase (E3, EC: 1.8.1.4, codificado pelo gene IpdA). Isto é, estes três tipos de subunidades catalisam as seguintes reações, respectivamente, e a atividade para catalisar a reação correspondente ao total destas três reações é chamada de atividade PDH. Quanto à confirmação da atividade PDH, a atividade pode ser medida de acordo com o método de Visser e Strating (Visser, J. and Strating, M., 1982, Methods Enzymol., 89:391-399).Elp: Piruvato + [resíduo de diidrolipoillisinasucciniltransferase] lipoillisina -> [resíduo de diidrolipoillisina acetiltransferase] S-acetildiidrolipoillisina + CO2E2p: CoA + enzima N6-(S-acetildiidrolipoil)lisina -> acetil- CoA + enzima N6-(diidrolipoil)lisinaE3: Proteína N6-(diidrolipoil)lisina + NAD+ -> proteína N6- (lipoil)lisina + NADH + ET

Além disso, a bactéria da presente invenção pode ser uma cepa modificada, de maneira tal que maleato sintase - isocitrato liase - isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase operon (operon acé) seja constitutivamente expressado, ou a expressão deste operon seja intensificada. A expressão deste maleato sintase - isocitrato liase - isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase operon ser constitutivamente expressada significa que o promotor do operon ace não é suprimido por iclR, que é uma proteína repressora, ou esta supressão é liberada.

A expressão constitutiva do operon ace ou a intensificação da expressão deste operon podem ser confirmadas com base no aumento das atividades enzimáticas de maleato sintase (aceB}, isocitrato liase (aceÁ) e isocitrato desidrogenase quinase/fosfatase (aceK), que são proteínas codificadas pelo operon ace, se comparadas com aquelas de uma cepa não modificada tipo selvagem.

Quanto à medição das atividades enzimáticas, por exemplo, a atividade do maleato sintase pode ser medida pela medição da decomposição dependente de ácido glioxílico da ligação de tioéster de acetil-CoA através da medição da redução de A232 (Dixon, G.H., Kornberg, H.L., 1960, Biochem. J, 1, 41:217-233), a atividade de isocitrato liase pode ser medida pela medição de ácido glioxílico produzido a partir de isocitrato como um derivado de 2,4-dinitrofenilidrazona (Roche, T.E., Williams J.O., 1970, Biochim. Biophys. Acta, 22, 206( 1 ):pp 193-195), e a atividade do isocitrato desidrogenase quinase pode ser medida pela medição da dessorção de fosfato a partir de isocitrato desidrogenase usando ~P (Wang, J.Y.J., Koshland, D.E., Jr., 1982, Arch. Biochem. Biophys., 218, pp59-67).

A supressão pode ser liberada, por exemplo, pela modificação do local de ligação a (iclR) repressor no operon ace, de maneira tal que iclR não possa se ligar ao operon. A supressão também pode ser liberada pela substituição do promotor do operon com um promotor potente que não sofre da supressão da expressão por iclR (promotor lac, etc.).Além disso, a expressão do operon ace pode se tomar constitutiva modificando a bactéria, de maneira tal que a expressão do gene iclR seja reduzida ou eliminada. Especificamente, modificando uma sequência de controle da expressão do gene que codifica iclR, de maneira tal que este gene não seja expressado, ou modificando a região codificante do repressor, de maneira tal que a função do repressor se perca.1-2. Método para diminuir a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular

Uma bactéria Enterobacteriaceae que apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido e foi modificada de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida, que é uma modalidade da bactéria da presente invenção, pode ser obtida modificando uma bactéria Enterobacteriaceae como esta com uma capacidade de produzir L-aminoácido da maneira descrita anteriormente, de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular desta seja reduzida. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida por conferir uma capacidade de produzir L-aminoácido a uma bactéria modificada, de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida.

A expressão "concentração de peróxido de hidrogênio intracelular é reduzida" significa tanto o caso em que concentração de peróxido de hidrogênio é relativamente reduzida, se comparada com aquela de uma cepa não modificada, tais como uma cepa precursora ou tipo selvagem, quanto o caso em que peróxido de hidrogênio não existe substancialmente na célula.

Tal modificação de uma bactéria em que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular é reduzida pode ser alcançada, por exemplo, pela intensificação da expressão do gene oxyS, pelo aumento da expressão da flavoproteína que transfere elétron (ETF) ou por uma combinação destes.A expressão de ETF pode aumentar, por exemplo, pela intensificação da expressão do operon fixABC.

O termo "oxyS' significa um gene que codifica oxyS, que é um RNA de baixo peso molecular abundantemente expressado em bactérias Enterobacteriaceae. Especificamente, como um gene que codifica oxyS, um gene com a sequência de nucleotídeos que se localiza nos números de nucleotideo 4.156.308 a 4.156.417 na sequência do genoma de Escherichia coli (número de acesso ao Genbank U00096), que é mostrado em SEQ ID NO: 9, pode ser exemplificado como o gene oxyS de Escherichia coli.

O termo "fixABC" usado na presente invenção refere-se a um gene que contém pelo menos fix A, fixB, e fixC entre os genes do operon fixABCX. O gene fixX pode estar contido ou pode não estar contido. Especificamente, como o gene fixA de Escherichia coli, um gene com a sequência de nucleotideos que se localiza nos números de nucleotideo de 42403 a 43173 na sequência do genoma de Escherichia coli (número de acesso ao Genbank U00096) e é mostrado em SEQ ID NO: 10 pode ser exemplificado. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 11.

Como o gene que codifica fixB, pode ser especificamente exemplificado um gene com a sequência de nucleotideos que se localiza nos números de nucleotideo de 43188 a 44129 na sequência do genoma de Escherichia coli (número de acesso ao Genbank U00096) e é mostrado em SEQ ID NO: 12 como o gene fixB de Escherichia coli. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 13.

Como o gene que codifica fixC, pode ser especificamente exemplificado um gene com a sequência de nucleotideos que se localiza nos números de nucleotideo de 44180 a 45466 na sequência do genoma de Escherichia coli (número de acesso ao Genbank U00096) e é mostrado em SEQ ID NO: 14 como o gene fixC de Escherichia coli. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 15.

O termo "sodA" significa um gene que codifica SodA utilizando manganês como um cofator, que é um dos superóxido dismutases existentes nas bactérias Enterobacteriaceae. Especificamente, como o gene que codifica SodA, um gene com a sequência de nucleotideos que se localiza nos números de nucleotideo 4.098.833 a 4.099.453 na sequência do genoma de Escherichia coli (número de acesso ao Genbank U00096) e é mostrado em SEQ ID NO: 16 pode ser exemplificado como o gene SodA de Escherichia coli. A sequência de aminoácidos codificada por este gene é mostrada em SEQ ID NO: 17.

RNA codificado pelo gene oxyS e as proteínas codificadas pelo gene fixA, pelo gene fixB e pelo gene fixC podem ser homólogas, versões artificialmente modificadas destas, ou similares, ou RNA ou proteínas com mutação(s) conservadora(s), desde que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida quando a expressão de tais genes for intensificada.

Tais versões homólogas artificialmente modificadas, RNAs e proteínas com mutação(s) conservadora(s) descritos anteriormente são referidos como variantes conservativas.

Uma variante conservativa como esta da proteína codificada pelo genes fixA, fixB ou fixC pode ser, por exemplo, uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 11, 13 ou 15, mas incluindo substituições, deleções, inserções, adições ou similares de um ou diversos resíduos de aminoácido em uma ou diversas posições.

Embora o número pretendido pelo termo "um ou diversos" possa diferir, dependendo das posições dos resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína ou dos tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, ele é preferivelmente 1 a 20, mais preferivelmente 1 a 10, ainda mais preferivelmente 1 a 5. A mutação conservadora é, tipicamente, uma substituição conservadora. A substituição conservadora é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o local da substituição for um aminoácido aromático; entre Leu, He e Vai, se o local da substituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gin e Asn, se o local da substituição for um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se o local da substituição for um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o local da substituição for um aminoácidos ácido; e entre Ser e Th, se o local da substituição for um aminoácido com um grupo hidroxila. Substituições consideradas substituições conservadoras incluem, especificamente, substituição de Ser ou Th por Ala, substituição de Gin, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gin por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gin, substituição de Gly, Asn, Gin, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gin, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Vai ou Phe por Ile, substituição de lie, Met, Vai ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gin, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Vai ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, lie ou Leu por Phe, substituição de Th ou Ala por Ser, substituição de Ser ou Ala por Th, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, lie ou Leu por Vai. As substituições, deleções, inserções, adições, inversões ou similares de aminoácido anteriormente mencionadas pode ser um resultado de uma mutação de ocorrência natural em função de uma diferença individual, diferença de espécie ou similares, de um microrganismo a partir do qual os genes são derivados (mutante ou variante). Uma proteína como esta pode ser obtida, por exemplo, pela modificação da sequência de nucleotídeos de genes fixA, fixB ou fiixC tipo selvagem por mutagênese específica de sítio, de maneira tal que os resíduos de aminoácido nos sítios específicos da proteína codificada incluam substituições, deleções, inserções ou adições de resíduos de aminoácido.

Além disso, uma proteína como esta com uma mutação conservadora descrita anteriormente pode ser uma proteína que mostra uma homologia, por exemplo, de 80 % ou mais, preferivelmente, 90 % ou mais, mais preferivelmente, 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente 97 % ou mais, adicionalmente preferivelmente, 98 % ou mais, particularmente preferivelmente 99 % ou mais, até a íntegra da sequência de aminoácidos de proteína tipo selvagem correspondente, e com uma função equivalente àquela da proteína tipo selvagem. Nesta especificação, "homologia" pode significar "identidade".

Os genes fixA, fixB e fixC tipo selvagem não são limitados aos genes de Escherichia coli, Pantoea ananatis, Enterobacter aerogenes, dentre outros, e eles podem ser qualquer um destes, em que códon(s) arbitrário(s) é/são substituídos por códon(s) equivalente(s), desde que eles codifiquem tais sequências de aminoácidos da maneira descrita anteriormente.

Os genes fixA, fixB e fixCR tipo selvagem também podem ser um DNA que é capaz de hibridizar com uma sequência de nucleotídeos complementar à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 10, 12, 14, 16, ou 18, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência complementar sob condições severas, e codificam uma proteína com uma função equivalente àquela de uma proteína com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 11, 13 ou 15. As "condições severas" referem-se a condições sob as quais um assim denominado híbrido específico é formado, e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições severas incluem aqueles sob os quais DNAs altamente homólogos hibridizam uns com os outros, por exemplo, DNAs não menos que 80 % homólogos, preferivelmente, não menos que 90 % homólogos, mais preferivelmente, não menos que 95 % homólogos, ainda mais preferivelmente, não menos que 97 % homólogos, adicionalmente preferivelmente, não menos que 98 % homólogos, particularmente preferivelmente, não menos que 99 % homólogos, hibridizam uns com os outros, e DNAs menos homólogos que o exposto não hibridizam uns com os outros, ou condições de lavagem de típica hibridização Southern, isto é, condições de lavagem uma vez, preferivelmente, 2 ou 3 vezes, em uma concentração de sal e temperatura correspondente a 1 x SSC, 0,1 % SDS em 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % SDS em 60°C, mais preferivelmente, 0,1 x SSC, 0,1 % SDS em 68°C.

Como a sonda, uma parte de uma sequência que é complementar a um dos genes também pode ser usada. Uma sonda como esta pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos preparados com base em uma sequência de gene conhecida como oligonucleotídeos iniciadores e um fragmento de DNA que contém estas sequências de nucleotideo como um molde. Por exemplo, quando um fragmento de DNA com um comprimento de cerca de 300 bp for usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização podem ser, por exemplo, 50°C, 2 x SSC e 0,1 % SDS.

As descrições anteriormente mencionadas em relação às variantes conservativas das proteínas e dos genes anteriormente mencionados que os codificam são similarmente aplicadas nos outros genes mencionados a seguir para as bactérias produtoras de L-aminoácido.

Os exemplos de variante conservativa de RNA codificado pelo gene oxyS incluem RNA que pode hibridizar com uma sequência complementar à sequência de SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência complementar sob condições severas, e pode reduzir a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular. O significado de "condições severas" é igual àquele supradescrito.

Além disso, a variante conservativa de RNA codificado pelo gene oxyS pode ser RNA que mostra uma homologia, por exemplo, de 80 % ou mais, preferivelmente, 90 % ou mais, mais preferivelmente, 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente, 97 % ou mais, adicionalmente preferivelmente, 98 % ou mais, particularmente preferivelmente, 99 % ou mais, até a íntegra da sequência de nucleotideos, e pode reduzir a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular.

Genes que codificam tais variantes conservativas do RNA ou proteínas da maneira descrita anteriormente também são as "variantes conservativas" de genes tipo selvagem.

A seguir, a modificação para reduzir a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular será especificamente explicada. A intensificação da expressão do gene oxyS e a intensificação da expressão dos genes fixABC podem ser realizadas em uma ordem arbitrária.

1-2-1. Intensificação da expressão do gene

Métodos para melhorar a expressão de um gene alvo serão explicados a seguir. Estes métodos também podem ser aplicados nos genes descrito para as bactérias produtoras de L-aminoácido anteriormente mencionadas.

O primeiro método é aumentar o número de cópia de um gene alvo. Por exemplo, o número de cópia do gene alvo pode aumentar pela clonagem do gene em um vetor apropriado e transformação de um microrganismo hospedeiro com o vetor obtido.

O vetor usado para transformação pode ser um plasmídeo autonomamente replicável em uma célula do microrganismo hospedeiro. Os exemplos do plasmídeo autonomamente replicável em bactérias do Enterobacteriaceae incluem vetores do tipo plasmídeo pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (vetores pHSG e pSTV são disponíveis a partir de Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (vetores pMW são disponíveis a partir de Nippon Gene Co., Ltd.) dentre outros. Além disso, um DNA fago também pode ser usado como o vetor em vez de um plasmídeo.

Os exemplos de métodos de transformação incluem tratamento de células recipientes com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade do DNA, o que foi reportado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. e Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53:159-162), o método do pulso elétrico (Patente Japonesa aberta ao público 2-207791), dentre outros.

O aumento do número de cópia de um gene alvo também pode ser alcançado introduzindo múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico do microrganismo. A introdução de múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico do microrganismo pode ser realizada por recombinação homólogo (MillerI, J.H. Experimentos in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) usando uma sequência cujas múltiplas cópias existem como alvos no DNA cromossômico. Sequências com múltiplas cópias no DNA cromossômico incluem, mas sem limitação, DNA repetitivo, e repetições invertidas existentes no fim de um elemento transponível. Também, da forma revelada na Patente Japonesa aberta ao público 2-109985, é possível incorporar o gene alvo em um transposon e permitir que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias do gene no DNA cromossômico. A introdução de um gene alvo em um cromossomo bacteriano também pode ser alcançada pelo método que usa o fago Mu (Patente Japonesa aberta ao público 2-109985) ou similares. A transferência de um gene alvo para um cromossomo pode ser confirmada por hibridização Southern usando uma parte do gene como uma sonda.

Quando o número de cópia de um gene aumentar, o número de cópia não é particularmente limitado, desde que a atividade do produto do gene alvo possa ser intensificada. Entretanto, quando o microrganismo tiver originalmente o gene alvo, o número de cópia é, preferivelmente, 2 ou mais. Quando o microrganismo não tiver originalmente o gene da presente invenção, o número de cópia do gene introduzido pode ser 1, mas ele também pode ser 2 ou mais.

O segundo método compreende intensificar a expressão de um gene alvo pela substituição de uma sequência reguladora de expressão do gene alvo, tais como o promotor no DNA cromossômico ou o plasmídeo com um promotor que tem uma resistência apropriada. Por exemplo, o promotor th, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor pL, o promotor tac, etc., são conhecidos como promotores frequentemente usados. Os exemplos dos métodos para avaliar a resistência dos promotores e promotores fortes são descritos em um artigo de Goldstein e Doi (Goldstein, M.A. e Doi R.H., 1995, Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1:105-128), etc.

Além do mais, também é possível substituir diversos nucleotídeos em uma região de promotor de um gene, de maneira tal que o promotor tenha uma resistência apropriada, da forma revelada na Publicação Internacional de Patente WOOO/18935. A substituição da sequência reguladora de expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira que na substituição de gene usando um plasmídeo sensível a temperatura. Os exemplos de vetores com uma origem de replicação sensível a temperatura que pode ser usada para Escherichia coli ou Pantoea ananatis incluem, por exemplo, o plasmídeo sensível a temperatura pMAN997 descrito na Publicação Internacional WO99/03988, seus derivados, dentre outros. Além disso, a substituição de uma sequência reguladora de expressão também pode ser realizada por métodos que empregam DNA linear, por exemplo, um método chamado "integração direcionada por Red" que usa recombinase Red do fago À, (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97:6640-6645), um método que combina o método de integração direcionada por Red e o sistema de excisão do fago X. (Cho, E.H. et al., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) (W02005/010175), dentre outros. A modificação de uma sequência reguladora de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópia do gene supradescrito.

Além disso, sabe-se que a substituição de diversos nucleotídeos em um espaçador entre o sítio de ligação do ribossomo (RBS) e o códon inicial, em particular, as sequências imediatamente à montante do códon inicial afetam profundamente a tradutibilidade do RNAm. A tradução pode ser intensificada modificando estas sequências.

A intensificação da expressão do gene oxyS ou dos genes fixABC, se comparada com a cepa precursora, tais como uma cepa tipo selvagem ou não modificada, pode ser confirmada, por exemplo, pela comparação da quantidade de RNAm de cada gene com aquela da cepa tipo selvagem ou não modificada. Os exemplos do método para confirmar a quantidade de expressão incluem hibridização Northern e RT-PCR (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, EUA, 2001). O grau do aumento da quantidade de expressão não é particularmente limitado, desde que ela aumente se comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou não modificada. Entretanto, desejavelmente, ela aumenta, por exemplo, 1,5 vez ou mais, preferivelmente, 2 vezes ou mais, mais preferivelmente, 3 vezes ou mais, se comparada com aquela de uma cepa tipo selvagem ou não modificada.

A expressão dos genes fixA, fixB e fixC pode ser individualmente intensificada, ou pode ser simultaneamente intensificada como um policístron. Além disso, quando os genes forem introduzidos em um microrganismo pelo uso de um vetor, os genes que codificam as subunidades podem ser simultaneamente portados por uma única molécula vetor ou podem ser separadamente portados por diferentes moléculas vetores. Também, quando os genes que codificam as subunidades forem inseridos em um cromossomo, os genes podem ser simultaneamente inseridos no mesmo sítio no genoma ou podem ser separadamente inseridos em diferentes sítios.

1-2-2. Redução de expressão do gene

A expressão de um gene alvo pode ser reduzida modificando o gene alvo em um cromossomo, de maneira tal que RNA tipo selvagem ou proteína tipo selvagem não sejam expressados, por exemplo, pela perturbação do gene alvo. Os exemplos do método para tal perturbação do gene incluem, por exemplo, métodos que usam um DNA linear, tais como o método chamado "integração direcionada por Red" (Datsenko, K.A., e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645) e o método de utilização da integração direcionada por Red em combinação com um sistema de excisão derivado de fago À, (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) (consulte W02005/010175), métodos que usam um plasmídeo que contém uma origem de replicação sensível a temperatura, métodos que usam um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, métodos que utilizam um vetor suicida sem uma origem de replicação em um hospedeiro (patente U.S. 6.303.383, Patente Japonesa aberta ao público 05-007491), dentre outros.

2. Método para produzir L-aminoácido

O método da presente invenção é um método para produzir um L- aminoácido pela cultura de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio que contém uma fonte de carbono selecionada a partir de um ácido graxo e de um álcool, e pela coleta do L-aminoácido a partir do meio, em que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria é reduzida.

A concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria pode ser reduzida, por exemplo, pelo uso de uma bactéria modificada de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria seja reduzida, ou pela adição de uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria no meio.

Assim, o método da presente invenção abrange:um método para produzir um L-aminoácido que compreende cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio que contém uma fonte de carbono selecionada a partir de um ácido graxo e de um álcool, e coletar o L-aminoácido a partir do meio, em que a bactéria foi modificada de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida, eum método para produzir um L-aminoácido que compreende cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio que contém uma fonte de carbono selecionada a partir de um ácido graxo e de um álcool, e coletar o L- aminoácido a partir do meio, em que o meio contém uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria.

Além disso, no método da presente invenção, a bactéria pode ser modificada de maneira tal que a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular seja reduzida e, além disso, o meio pode conter uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria.

Exemplos da substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria incluem uma substância que catalisa uma reação sem proporção de peróxido de hidrogênio. Os exemplos de uma substância como esta incluem, por exemplo, tioureia, dentre outros.

O termo "ácido graxo" refere-se a um ácido carboxílico monovalente de hidrocarboneto de cadeia longa representado pela fórmula geral CnHmCOOH (n+1 e m+1 representam o número de átomos de carbono e o número de átomos de hidrogênio contidos no ácido graxo, respectivamente). No geral, um ácido graxo com 12 ou mais átomos de carbono é frequentemente referido como um ácido graxo de cadeia longa. Existe uma variedade de ácidos graxos com número variado de carbonos e grau variado de insaturação. Também sabe-se que ácidos graxos são constituídos de gorduras e óleos, e as composições de ácidos graxos variam de acordo com os tipos de gorduras e óleos. O ácido mirístico (C13H27COOH) é um ácido graxo saturado com 14 átomos de carbono e fica contido em óleo de coco e óleo de palma. O ácido palmítico (CI5H31COOH) é um ácido graxo saturado com 16 átomos de carbono e é abundantemente contido em gorduras e óleos vegetais em geral. O ácido esteárico (CI7H35COOH) é um ácido graxo saturado com 18 átomos de carbono e é abundantemente contido em gorduras e óleos animais vegetais. O ácido oleico (CI7E133COOH) é um ácido graxo insaturado monovalente com 18 átomos de carbono e é abundantemente contido em gorduras animais ou óleos vegetais. O ácido linoleico (CI7H31COOH) é um ácido graxo insaturado multivalente com 18 átomos de carbono e duas ligações duplas de configuração cis nas posições 9 e 12. Como o ácido graxo, uma mistura dos ácidos graxos de cadeia longa anteriormente mencionados também pode ser usada. Quando uma mistura de ácidos graxos for usada como uma fonte de carbono, qualquer razão de mistura dos ácidos graxos pode ser usada, desde que a razão de mistura seja uma razão de concentração na qual a bactéria usada no método da presente invenção pode utilizar a mistura como a fonte de carbono. Uma mistura de ácidos graxos obtida pela remoção de glicerol de um hidrolisado de gordura ou óleo também pode ser usada.

Exemplos do álcool incluem glicerol, etanol, butanol, propanol, álcoois alifáticos, álcoois aromáticos, dentre outros.

O termo "glicerol" refere-se a uma substância com a nomenclatura propano-l,2,3-triol. Glicerol pode ser glicerol puro ou glicerol cru. Glicerol cru refere-se a glicerol industrialmente produzido que contém impurezas. Glicerol cru é industrialmente produzido pelo contato da gordura ou do óleo com a água em uma alta temperatura e em alta pressão para, desse modo, hidrolisá-lo, ou pela reação de esterificação para produção de combustível biodiesel. Combustível biodiesel refere-se a metil ésteres de ácido graxo produzidos a partir de gordura ou óleo e metanol por uma transesterificação, e glicerol cru é produzido como um subproduto desta reação (consulte Fukuda, H., Kondo, A., e Noda, H., 2001, J. Biosci. Bioeng., 92, 405-416). No processo de produção de combustível biodiesel, em muitos casos, o método do catalisador alcalino é usado para a transesterificação e ácidos são adicionados para neutralização e, portanto, glicerol cru com uma pureza de cerca de 70 até 95 % em peso contendo água e impurezas é produzido. Glicerol cru produzido na produção de combustível biodiesel contém metanol residual, e sais de álcali, tal como NaOH como um catalisador, e um ácido, tal como H2SO4, usado para neutralizar o álcali como impurezas, além de água. Embora dependa dos fabricantes e dos métodos de produção, o conteúdo de tais sais e metanol alcança diversos porcentos.

Preferivelmente, o glicerol cru contém ions derivados do álcali e do ácido usados para a neutralização do álcali, tais como ions de sódio, ions de potássio, íons de cloreto e íons de sulfato, em uma quantidade de 2 até 7 %, preferivelmente, 3 até 6 %, mais preferivelmente, 4 a 5,8 %, com base no peso do glicerol cru. Embora metanol possa não estar contido como uma impureza, ele fica preferivelmente contido em uma quantidade de 0,01 % ou menor.

O glicerol cru pode conter adicionalmente minúsculas quantidades de metais, ácidos orgânicos, fósforo, ácidos graxos, dentre outros. Os exemplos dos ácidos orgânicos incluem ácido fórmico, ácido acético, dentre outros, e, embora eles possam não estar contidos como impurezas, eles ficam preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,01 % ou menor. Como as minúsculas quantidades de metais contidos no glicerol cru, minúsculos metais exigidos para o crescimento de microrganismos são preferidos, e exemplos destes incluem, por exemplo, magnésio, ferro, cálcio, manganês, cobre, zinco, dentre outros. Magnésio, ferro e cálcio ficam preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,00001 a 0,1 %, preferivelmente, 0,0005 a 0,1 %, mais preferivelmente, 0,004 a 0,05 %, ainda mais preferivelmente, 0,007 a 0,01 %, em termos da quantidade total com base no peso do glicerol cru. Manganês, cobre e zinco ficam preferivelmente contidos em uma quantidade de 0,000005 a 0,01 %, preferivelmente, 0,000007 a 0,005 %, mais preferivelmente, 0,00001 a 0,001 %, em termos da quantidade total.

É suficiente que a pureza de glicerol no glicerol cru seja 10 % ou maior, e ela pode ser preferivelmente 50 % ou maior, mais preferivelmente, 70 % ou maior, particularmente preferivelmente, 80 % ou maior. Desde que as quantidades contidas das impurezas estejam na faixa anteriormente mencionada, a pureza do glicerol pode ser 90 % ou maior.

Quando glicerol cru for usado, o glicerol cru pode ser adicionado no meio de acordo com a pureza de glicerol deste, de maneira tal que a concentração de glicerol exposta seja obtida. Tanto glicerol quanto glicerol cru também podem ser adicionados no meio.

A fonte de carbono pode ser um hidrolisado de gordura ou óleo. Desde que um ácido graxo e/ou glicerol esteja contido, um meio que contém um hidrolisado de gordura ou óleo é um "meio que contém um ácido graxo ou um álcool".

Gorduras e óleos são ésteres de um ácido graxo e glicerol, e eles também são chamado de triglicérides. Como as gorduras e os óleos, quaisquer tipos de gorduras e óleos, incluindo óleos que referem-se àqueles em um estado líquido em temperatura ordinária e gorduras que referem-se àquelas em um estado sólido em temperatura ordinária, podem ser usados, desde que gordura ou óleo hidrolisáveis sejam escolhidos. Além disso, qualquer um de gorduras e óleos animais (incluindo gorduras e óleos de peixe) e gorduras e óleos vegetais pode ser usado, e eles podem ser usados independentemente ou como uma combinação de dois ou mais tipos deles. Gordura ou óleo usados como um material bruto podem ser gordura ou óleo puros, ou uma mistura que contém gordura ou óleo e substâncias diferentes da gordura ou do óleo. No caso de gorduras e óleos vegetais, exemplos destes incluem, por exemplo, um extrato de planta que contém gordura ou óleo e um produto de fracionamento deste.

Os exemplos de gorduras e óleos animais incluem manteiga, banha, sebo bovino, sebo de carneiro, óleo de baleia, óleo de sardinha, óleo de arenque, dentre outros. Os exemplos de gorduras e óleos vegetais incluem, mas sem limitações, óleo de palma, óleo de oliva, óleo de colza, óleo de soja, óleo de farelo de arroz, óleo de noz, óleo de gergelim, óleo de amendoim, dentre outros. Oleo de palma é óleo que pode ser obtido a partir de frutas da palmeira-de-óleo, e tem sido amplamente usado como combustível biodiesel nos últimos anos, e a quantidade de produção deste está aumentando. Palmeira-de-óleo é um nome genérico para as plantas classificadas no gênero

Elaeis da família Palmae. Óleo de palma cru, no geral, refere-se a óleo de palma não refinado produzido em olearias, e tal óleo de palma é negociado como óleo de palma cru. Microalgas que acumulam gordura ou óleo também são conhecidas (Chisti, Y, Biotechnol. Adv., 2007, 25: 294-306), e a gordura ou o óleo também podem ser extraídos a partir das células de alga. Embora as células de alga também contenham substâncias orgânicas sem ser a gordura ou o óleo, tais como sacarídeos, proteínas ou aminoácidos, uma mistura que contém estas substâncias pode ser hidrolisada e usada como a fonte de carbono.

Como as gorduras e os óleos, gorduras e óleos cuja espécie de ácido graxo obtenível por hidrólise pode ser utilizada pela bactéria usada no método da presente invenção e que compreende a espécie de ácido graxo em um conteúdo superior são desejáveis. Os exemplos da espécie de ácido graxo de cadeia longa que pode ser utilizada pelas bactérias com uma capacidade de produzir L-aminoácido incluem ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico, dentre outros.

Um hidrolisado de gordura ou óleo refere-se a uma substância obtida pela hidrólise química ou enzimática da gordura ou do óleo anteriormente mencionados, e refere-se a uma mistura de um ácido graxo e glicerol. Como um método de hidrólise industrial, um método de hidrólise contínua em alta temperatura em que gordura ou óleo são colocados em contato com água pelo contato em contracorrente em uma alta temperatura (250 a 260°C) em uma alta pressão (5 até 6 MPa) é comumente realizado. Uma reação realizada em baixa temperatura (cerca de 30°C) pelo uso de uma enzima também é industrialmente usada (Jaeger, K.E. et al., 1994, FEMS Microbial. Rev., 15:29-63). Como a enzima anteriormente mencionada, uma lipase, que é uma enzima que catalisa uma reação de hidrólise de gorduras e óleos, pode ser usada. Lipases são enzimas industrialmente importantes e usadas para várias aplicações industriais (Hasan, F. et al., 2006, Enzyme and

Microbiol. Technol., 39:235-251). Um hidrolisado de gordura ou óleo é uma mistura de um ácido graxo e glicerol, e sabe-se que a razão de peso de glicerol pelo ácido graxo contido em um hidrolisado de gordura ou óleo comuns, tal como óleo de palma, é cerca de 10 %. O hidrolisado de gordura ou óleo não é particularmente limitado, desde que o hidrolisado contenha um ácido graxo e/ou glicerol. Por exemplo, um hidrolisado de gordura ou óleo pode ser usado como ele está, um hidrolisado de gordura ou óleo a partir do qual uma porção de ácido graxo e glicerol é removida também pode ser usado, ou um hidrolisado de gordura ou óleo no qual um ácido graxo ou glicerol são adicionados também pode ser usado. Em um caso como este, a razão de peso de glicerol pelo ácido graxo é, preferivelmente, 5 a 20:100, mais preferivelmente, 7,5 a 15:100.

A concentração de ácido graxo pode ser medida por cromatografia de gás (Hashimoto, K. et al., 1996, Biosci. Biotechnol. Biochem., 70:22-30) ou HPLC (Lin, J.T. et al., 1998, J. Chomatogr A., 808:43-49).

O ácido graxo a ser adicionado no meio ou o ácido graxo contido em um hidrolisado de gordura ou óleo a ser adicionado no meio são desejavelmente usados como um sal de metal de álcali de sódio, potássio ou similares, que podem ser micelizados em água. Entretanto, a solubilidade de um sal de sódio ou sal de potássio do ácido graxo pode não ser suficiente para uso como um material de fermentação bruto. Portanto, a fim de que um ácido graxo possa ser mais eficientemente utilizado como uma fonte de carbono pela bactéria com uma capacidade de produzir L-aminoácido, é preferível empregar uma etapa para promover a homogeneização, por exemplo, realizando emulsificação. Por exemplo, como o método de emulsificação, a adição de um reforço de emulsificação ou de um elemento tensoativo pode ser contemplada. Os exemplos do reforço de emulsificação aqui referidos incluem fosfolipídeos e esteróis. Os exemplos do elemento tensoativo incluem, como elementos tensoativos não iônicos, ésteres de ácido graxo de poli(oxietileno) sorbitano, tal como éster de ácido mono-oleico de poli(oxietileno) sorbitano (Tween 80); glicosídeos de alquila, tais como noctil β-D-glicosideo; ésteres de ácido graxo de sacarose, tal como estearato de sacarose; ésteres de ácido graxo de poliglicerina, tal como éster de ácido esteárico de poliglicerina; dentre outros. Os exemplos do elemento tensoativo incluem, as elementos tensoativos anfolíticos, N,N-dimetil-N-dodecilglicina betaína, que é um alquilbetaína, dentre outros. Além destes, elementos tensoativos usados, no geral, no campo da biologia, tais como Triton X-100, polioxietileno(20) cetil éter (Brij-58) e nonilfenol etoxilato (Tergitol NP-40), podem ser usados.

Além disso, uma operação para promover emulsificação ou homogeneização de ácido graxo também é efetiva. Esta operação pode ser qualquer operação, desde que uma operação que promove emulsificação ou homogeneização de ácido graxo seja escolhida. Os exemplos específicos desta incluem tratamentos com homogeneizador, tratamentos com homomisturador, ultrassonicação, tratamentos em alta pressão, tratamentos em alta temperatura, dentre outros. Tratamentos com homogeneizador, ultrassonicação e combinações dos mesmos são mais preferidos.

É particularmente preferível usar uma combinação do tratamento anteriormente mencionado com um elemento tensoativo e do tratamento com homogeneizador e/ou da ultrassonicação. Estes tratamentos são desejavelmente realizados em uma condição alcalina sob a qual ácidos graxos são mais estáveis. Como a condição alcalina, pEI não menor que 9 é preferido, e pH não menor que 10 é mais preferido.

O ácido graxo ou a álcool podem estar contidos no meio usado no método da presente invenção em qualquer quantidade, desde que a bactéria usada para o método da presente invenção possa utilizá-los como uma fonte de carbono. Entretanto, quando o ácido graxo ou o álcool forem adicionados ao meio como a única fonte de carbono, eles ficam preferivelmente contidos em uma concentração de 10 % p/v ou menos, preferivelmente, 5 % p/v ou menos, mais preferivelmente, 2 % p/v ou menos. Quando o ácido graxo ou o álcool forem adicionados ao meio como a única fonte de carbono, eles ficam preferivelmente contidos em uma concentração de 0,2 % p/v ou mais, preferivelmente, 0,5 % p/v ou mais, mais preferivelmente, 1,0 % p/v ou mais.

Além disso, o meio usado para o método da presente invenção pode conter outras fontes de carbono, além do ácido graxo ou álcool. Preferidos como as outras fontes de carbono são sacarídeos, tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, melado negro, hidrolisado de amido, e soluções de açúcar obtidas por hidrólise de biomassa, e ácidos orgânicos, tais como ácido fumárico, ácido cítrico e ácido succínico. Estas outras fontes de carbono são preferivelmente usadas em quantidade tal que a razão do ácido graxo ou do álcool na fonte de carbono seja 10 % em peso ou mais, preferivelmente, 30 % em peso ou mais, mais preferivelmente, 50 % em peso ou mais. Além disso, uma cepa sem capacidade de utilizar sacarose pode se tomar uma cepa que pode utilizar sacarose como uma fonte de carbono introduzindo um gene para utilização de sacarose (patente U.S. 5.175.107).

Quando um ácido graxo ou glicerol for adicionado em um meio de alimentação como a única fonte de carbono, eles ficam preferivelmente contidos no meio de alimentação em uma concentração tal que a concentração destes no meio depois da alimentação seja 5 % p/v ou menos, preferivelmente, 2 % p/v ou menos, mais preferivelmente, 1 % p/v ou menos. Quando um ácido graxo ou glicerol for adicionado em um meio de alimentação como a única fonte de carbono, a quantidade destes é preferivelmente controlada para ser 0,01 % p/v ou mais, preferivelmente, 0,02 % p/v ou mais, mais preferivelmente, 0,05 % p/v ou mais.

Na presente invenção, um ácido graxo ou um álcool podem estar contidos em uma certa concentração constante por todos o processo de cultura, eles podem ser adicionados somente no meio de alimentação ou no meio de partida ou, se outras fontes de carbono estiverem contidas em um nível suficiente, pode haver um período em que um ácido graxo e/ou um álcool temporariamente se esgotam. O termo "temporariamente" significa que, por exemplo, um ácido graxo e/ou um álcool podem se esgotar por um período correspondente a 10 %, 20 % ou 30 % no máximo, em relação à íntegra do período de fermentação. Mesmo um caso como este descrito anteriormente em que a concentração de um ácido graxo e/ou de um álcool pode se tomar temporariamente 0 é incluído no escopo da expressão "para cultura em um meio que contém um ácido graxo ou um álcool como uma fonte de carbono" de acordo com a presente invenção, desde que exista um período de cultura em um meio que contém um ácido graxo ou um álcool.

Como componentes sem ser a fonte de carbono a ser adicionada no meio, uma fonte de nitrogênio, íons inorgânicos e outros componentes orgânicos podem ser usados, conforme exigido. Como a fonte de nitrogênio contida no meio da presente invenção, amónia; sais de amónio, tais como sulfato de amónio, carbonato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, acetato de amónio e ureia; nitratos; ou similares podem ser usados. Gás de amónia e amónia aquosa usados para ajuste de pH também podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Além disso, peptona, extrato de levedura, extrato de came, extrato de malte, água de maceração de milho, hidrolisado de soja, dentre outros também podem ser usados como a fonte de nitrogênio. O meio pode conter somente um tipo destas fontes de nitrogênio, ou dois ou mais tipos destas fontes de nitrogênio. Estas fontes de nitrogênio também podem ser usadas tanto para o meio de partida quanto para o meio de alimentação. Além disso, a mesma fonte de nitrogênio pode ser usada tanto para o meio de partida quanto para o meio de alimentação, ou a fonte de nitrogênio do meio de alimentação pode ser diferente daquela do meio de partida.

Preferivelmente, o meio da presente invenção contém uma fonte de ácido fosfórico e uma fonte de enxofre, além da fonte de carbono e da fonte de nitrogênio. Como a fonte de ácido fosfórico, potássio diidrogenofosfato, dipotássio hidrogenofosfato, polímeros de ácido fosfórico, tal como ácido pirofosfórico, dentre outros podem ser usados. Embora a fonte de enxofre possa ser qualquer substância que contém átomos de enxofre, sais de ácido sulfúrico, tais como sulfatos, tiossulfatos, e sulfitos; e aminoácidos que contêm enxofre, tais como cisteína, cistina e glutationa, são desejáveis, e sulfato de amónio é especialmente desejável.

Além disso, o meio pode conter um fator de promoção de crescimento (nutriente com um efeito de promoção de crescimento), além dos componentes anteriormente mencionados. Como o fator de promoção de crescimento, minúsculos metais, aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos, bem como peptona, casaminoácido, extrato de levedura, produto de degradação da proteína da soja, dentre outros, que contêm as substâncias expostas, podem ser usados. Os exemplos dos minúsculos metais incluem ferro, manganês, magnésio, cálcio, dentre outros. Os exemplos das vitaminas incluem vitamina Bb vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida, vitamina Bi2, dentre outros. Estes fatores de promoção de crescimento podem estar contidos no meio de partida ou no meio de alimentação.

Além disso, quando um mutante auxotrófico que exige um aminoácido ou similares para o crescimento deste for usado, é preferível complementar um nutriente exigido no meio. Em particular, já que a via biossintética de L-lisina é intensificada e a capacidade de degradação da L- lisina é frequentemente atenuada em bactérias que produzem L-lisina que podem ser usadas para a presente invenção, da forma descrita a seguir, um ou mais tipos de substâncias selecionadas a partir de L-treonina, L-homosserina, L-isoleucina e L-metionina são preferivelmente adicionadas. O meio de partida e o meio de alimentação podem ter a mesma ou diferente composição do meio. Além disso, o meio de partida e o meio de alimentação podem ter a mesma ou diferente concentração de enxofre. Além disso, quando o meio de alimentação for alimentado em múltiplos estágios, as composições do meio de alimentação alimentado nos estágios podem ser as mesmas ou diferentes.

Quando uma substância que reduz a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular da bactéria for adicionada ao meio, esta substância pode estar contida por todo o processo da cultura, ou ser adicionada somente no meio de alimentação ou no meio de partida. A concentração da substância no meio é desejavelmente 0,01 a 25 mM.

A cultura é preferivelmente realizada como uma cultura de aeração em uma temperatura de fermentação de 20 a 45°C, particularmente preferivelmente, 33 a 42°C. A concentração de oxigênio é controlada para ficar em cerca de 5 a 50 %, desejavelmente, cerca de 10 %. Além disso, a cultura de aeração é preferivelmente realizada durante o controle do pH para ficar entre 5 a 9. Se o pH do meio for abaixado durante a cultura, o meio pode ser neutralizado, por exemplo, pela adição de carbonato de cálcio ou de um alcalino, tais como gás de amónia e amónia aquosa. Se a cultura for realizada em tais condições descritas anteriormente, preferivelmente, por cerca de 10 a 120 horas, uma quantidade notável de L-aminoácido é acumulada no meio da cultura.

Na presente invenção, a fim de manter o acúmulo de L- aminoácido em um certo nível ou mais alto, a cultura da bactéria pode ser realizada como cultura do inoculo e cultura principal separadas. A cultura do inoculo pode ser realizada como cultura em agitação ou cultura em batelada usando um frasco ou similares, e a cultura principal pode ser realizada como cultura alimentada em batelada ou de forma contínua. Tanto a cultura do inoculo quanto a cultura principal podem ser realizadas como cultura em batelada.

Quando a cultura alimentada em batelada ou de forma contínua forem realizadas na presente invenção, o meio de alimentação pode ser intermitentemente alimentado de maneira tal que a alimentação de um ácido graxo ou álcool, ou de outras fontes de carbono, seja temporariamente interrompida. Por exemplo, o suprimento do meio de alimentação pode ser interrompido de maneira tal que a duração por alimentação seja 30 % ou menos, desejavelmente, 20 % ou menos, particularmente desejavelmente, 10 % ou menos, do período total para a alimentação de múltiplas vezes. Quando o meio de alimentação for intermitentemente alimentado, o meio de alimentação pode ser inicialmente adicionado durante um certo período de tempo, e a segunda e seguintes adições podem ser controladas de maneira tal que elas sejam iniciadas quando a elevação de pH ou a elevação de concentração de oxigênio dissolvido em função da depleção da fonte de carbono no meio de fermentação durante um período de adição interrompida antes de um certo período de adição no meio forem detectadas por um computador e, assim, a concentração de substrato no tanque de cultura é sempre automaticamente mantida em um baixo nível (patente U.S. 5.912.113).

O meio de alimentação usado para a cultura alimentada em batelada é, preferivelmente, um meio que contém um ácido graxo ou um álcool, uma outra fonte de carbono, e um nutriente com efeito de promoção de crescimento (fator de promoção de crescimento), e a concentração de ácido graxo no meio de fermentação pode ser controlada para ficar em um certo nível ou mais baixa.

Como a outra fonte de carbono adicionada no meio de alimentação, glicose, sacarose e frutose são preferidas. Como o fator de promoção de crescimento, fonte de nitrogênio, ácido fosfórico, aminoácidos, dentre outros, são preferidos. Como a fonte de nitrogênio, amónia; sais de amónio, tais como sulfato de amónio, carbonato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, acetato de amónio e ureia; nitratos; dentre outros, podem ser usados. Além disso, como a fonte de ácido fosfórico, potássio diidrogenofosfato e potássio diidrogenofosfato podem ser usados. Quanto aos aminoácidos, quando uma cepa mutante auxotrófica for usada, é preferível complementar um nutriente exigido. Além disso, o meio de alimentação pode consistir em um tipo de meio ou em uma mistura de dois ou mais tipos de meios. Quando dois ou mais tipos de meios de alimentação forem usados, os meios podem ser misturados e alimentados pelo uso de um tubo de alimentação, ou os meios podem ser alimentados pelo uso de dois ou mais tubos de alimentação.

Quando o método de cultura contínua for usado na presente invenção, o meio pode ser extraído e alimentado simultaneamente ou, depois que uma parte do meio for extraída, o meio pode ser alimentado. Além disso, também pode ser usado um método de cultura contínua que inclui reciclar células nas quais o meio da cultura que contém um L-aminoácido e células bacterianas é extraído, e somente as células são retomadas para o tanque de fermentação (consulte Patente Francesa 2669935). Como o método para alimentar contínua ou intermitentemente uma fonte de nutriente, o mesmo método usado na cultura alimentada em batelada é usado.

O método de cultura contínua que inclui reciclar células é um método de extração intermitente ou contínua do meio de fermentação quando uma concentração de aminoácido pretendida for obtida, coleta somente do L- aminoácido a partir do meio e reciclagem do resíduo de filtração que contém as células no interior do tanque de fermentação, e um método como este pode ser realizado com referência, por exemplo, à Patente Francesa 2669935.

Quando o meio da cultura for intermitentemente extraído, é recomendável que uma parte do L-aminoácido seja extraída quando a concentração de L-aminoácido alcançar um nível pré-determinado, e um meio fresco é alimentado para continuar a cultura. Além disso, o meio é preferivelmente adicionado em um volume tal que o volume final do meio tome-se um volume igual ao volume do meio da cultura antes da extração. O termo "volume igual" significa um volume correspondente a cerca de 93 a 107 % do volume do meio antes da extração.

Quando o meio da cultura for continuamente extraído, a extração é desejavelmente iniciada ao mesmo tempo ou depois da alimentação do meio nutriente. Por exemplo, em 5 horas, desejavelmente, 3 horas, mais desejavelmente, 1 hora depois do início da alimentação, a extração pode ser iniciada. Além disso, o volume de extração do meio da cultura é preferivelmente igual ao volume do meio alimentado.

Quando um aminoácido básico, tal como L-lisina, for produzido, a produção pode ser realizada por um método em que fermentação é realizada pelo controle do pH do meio durante a cultura para ficar entre 6,5 e 9,0 e do pH do meio no fim da cultura para ficar entre 7,2 e 9,0 durante a garantia de um período de cultura em que o meio contém 20 mM ou mais de íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato, de maneira tal que estes íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato ajam como contraíons do aminoácido básico, e o aminoácido básico objetivo é, então, coletado (Patente Japonesa aberta ao público 2002-65287, Pedido de patente publicado U.S. 2002/0025564A, EP 1813677 A).

Quando um microrganismo com uma capacidade de produção de aminoácido básico for cultivado em um meio em condições aeróbicas, íons de carbonato, íons de bicarbonato ou ambos podem ser usados como contraíons principais do aminoácido básico. Para prover íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio em uma quantidade exigida para agir como contraíons do aminoácido básico, sabe-se que o pH do meio pode ser controlado para ficar entre 6,5 e 9,0, preferivelmente, entre 6,5 e 8,0, durante a cultura, e pode ser controlado para ficar entre 7,2 e 9,0 no fim da cultura, e a pressão no tanque de fermentação pode ser controlada de maneira tal que ela fique positiva durante a fermentação, ou dióxido de carbono ou um gás misturado que contém dióxido de carbono podem ser supridos ao meio (Patente Japonesa aberta ao público 2002-65287, Pedido de patente publicado U.S. 2002/0025564, EP 1813677 A).

Na presente invenção, tanto o controle da pressão no tanque de fermentação para ficar positiva durante a fermentação quanto o suprimento de gás de dióxido de carbono ou de um gás misturado que contém gás de dióxido de carbono ao meio podem ser realizados. Em cada caso, as operações expostas são preferivelmente realizadas de maneira tal que exista um período de cultura em que, preferivelmente, 20 mM ou mais, mais preferivelmente, 30 mM ou mais, particularmente preferivelmente, 40 mM ou mais, de íons de bicarbonato e/ou de íons de carbonato estão presentes no meio. A pressão interna do tanque de fermentação, a quantidade de suprimento de dióxido de carbono ou gás misturado que contém dióxido de carbono ou o volume limitado de suprimento de gás podem ser determinados, por exemplo, pela medição de íons de bicarbonato ou de íons de carbonato no meio, ou pela medição do pH ou da concentração de amónia do meio.

Na modalidade exposta, o pH do meio é controlado para ficar entre 6,0 e 9,0, preferivelmente, entre 6,5 e 8,0 durante a cultura, e entre 7,2 e 9,0 no fim da cultura. De acordo com a modalidade exposta, o pH do meio para garantir a presença de íons de bicarbonato e/ou de íons de carbonato em uma quantidade exigida como contraíons pode se tomar inferior, se comparado com os métodos convencionais. Quando o pH for controlado com amónia, amónia é suprida a fim de aumentar o pH, e ela também pode agir como uma fonte de nitrogênio para o aminoácido básico. Os exemplos de cátions sem ser o aminoácido básico no meio incluem K, Na, Mg, Ca, etc. originando nos componentes do meio. Preferivelmente, estes existem em uma quantidade de 50 % ou menos do total de cátions.

Além disso, a pressão interna do tanque de fermentação durante a fermentação pode se tomar positiva, por exemplo, tomando a pressão do suprimento de gás mais alta que a pressão de exaustão. Tomando a pressão interna do tanque de fermentação positiva, o dióxido de carbono gerado por fermentação se dissolve no meio da cultura para gerar íons de bicarbonato ou ions de carbonato, e estes podem agir como contraíons do aminoácido básico. A pressão interna do tanque de fermentação pode ser, especificamente, 0,03 a 0,2 MPa, preferivelmente, 0,05 a 0,15 MPa, mais preferivelmente, 0,1 a 0,3 MPa, em termos da pressão manométrica (diferença

5 de pressão em relação à pressão atmosférica). Além do mais, pelo suprimento de dióxido de carbono ou um gás misturado que contém dióxido de carbono ao meio da cultura, dióxido de carbono pode ser dissolvido no meio. Além disso, durante o suprimento de dióxido de carbono ou um gás misturado que contém dióxido de carbono ao meio, a pressão interna do tanque de 10 fermentação também pode ser ajustada para ficar positiva.

A pressão interna do tanque de fermentação pode ser ajustada para ficar positiva, por exemplo, tomando a pressão do suprimento de gás mais alta que a pressão de exaustão. Além disso, quando dióxido de carbono for suprido ao meio, por exemplo, dióxido de carbono puro ou um gás 15 misturado que contém 5 % em volume ou mais de dióxido de carbono podem ser borbulhados no meio.

Os métodos anteriormente mencionados para dissolver ions de bicarbonato e/ou ions de carbonato no meio podem ser usados independentemente ou como uma combinação de dois ou mais deles.

Nos métodos convencionais, uma quantidade suficiente desulfato de amónio ou de cloreto de amónio é usualmente adicionada no meio para prover contra-ânions do aminoácido básico a ser produzido e produtos da decomposição de ácido sulfurico ou ácido hidroclórico das proteínas, etc. também são adicionados no meio como componentes nutrientes e, portanto, 25 ions de sulfato e íons de cloreto gerados a partir destes estão presentes no meio. Portanto, a concentração dos íons de carbonato fracamente ácidos é extremamente baixa durante a cultura, isto é, ela é da ordem de ppm. A modalidade exposta da presente invenção é caracterizada em que estes íons de sulfato e íons de cloreto são reduzidos, e o dióxido de carbono liberado pelo microrganismo durante a fermentação é dissolvido no meio no ambiente de fermentação anteriormente mencionado e usado como contraíons. Portanto, na modalidade exposta da presente invenção, não é exigido adicionar íons de sulfato ou íons de cloreto no meio em uma quantidade maior que a quantidade exigida para o crescimento. É preferível que uma quantidade apropriada de sulfato de amónio ou similares seja alimentada no meio em um estágio inicial da cultura, e a alimentação é terminada no decorrer da cultura. Altemativamente, sulfato de amónio ou similares podem ser alimentados, ainda mantendo o equilíbrio com a quantidade dissolvida de íons de carbonato ou íons de bicarbonato no meio. Além do mais, como uma fonte de nitrogênio do aminoácido básico, amónia pode ser alimentada no meio. Amónia pode ser suprida ao meio independentemente, ou em conjunto com outros gases.

As concentrações de ânions sem ser íons de bicarbonato e/ou íons de carbonato no meio são, preferivelmente, baixas, desde que elas estejam presentes em quantidades que são exigidas para o crescimento do microrganismo. Os exemplos de tais ânions incluem íons de cloreto, íons de sulfato, íons de fosfato, ácidos orgânicos ionizados, íons de hidróxido, dentre outros. Preferivelmente, a concentração molar total destes outros íons é usualmente 900 mM ou menos, mais preferivelmente, 700 mM ou menos, ainda mais preferivelmente, 500 mM ou menos, adicionalmente preferivelmente, 300 mM ou menos, particularmente preferivelmente, 200 mM ou menos.

Reduzir as quantidades de íons de sulfato e/ou de íons de cloreto a serem usados é um dos objetivos da modalidade exposta, e a quantidade de íons de sulfato ou de íons de cloreto ou a quantidade total de ambos contidos no meio é, usualmente, 700 mM ou menos, preferivelmente, 500 mM ou menos, mais preferivelmente, 300 mM ou menos, ainda mais preferivelmente, 200 mM ou menos, particularmente preferivelmente, 100 mM ou menos.

Se sulfato de amónio for adicionado em um meio como uma fonte de contraíon de um aminoácido básico, dióxido de carbono no meio da cultura é usualmente eliminado por íons de sulfato. Ao contrário, na modalidade exposta, não é necessário adicionar uma quantidade em excesso de sulfato de amónio no meio e, portanto, dióxido de carbono pode ser facilmente dissolvido no meio de fermentação.

Além disso, na modalidade exposta, é preferível controlar a concentração total de amónia no meio até um grau em que a "produção do aminoácido básico não seja inibida". Os exemplos de tais condições incluem, por exemplo, condições que proporcionam rendimento e/ou produtividade correspondente a, preferivelmente, 50 % ou mais, mais preferivelmente, 70 % ou mais, particularmente preferivelmente, 90 % ou mais do rendimento e/ou da produtividade obteníveis na produção do aminoácido básico em condições ideais. Especificamente, a concentração total de amónia no meio é, preferivelmente, 300 mM ou menos, mais preferivelmente, 250 mM ou menos, particularmente preferivelmente, 200 mM ou menos. O grau de dissociação de amónia diminui à medida que o pH toma-se mais alto. Amónia não dissociante é mais tóxica às bactérias, se comparada com íons de amónio. Portanto, o limite superior da concentração total de amónia também deve ser determinado dependendo do pH do meio da cultura. Isto é, à medida que o pH do meio da cultura aumenta, a concentração total aceitável de amónia diminui. Portanto, a concentração total de amónia anteriormente mencionada na qual a "produção do aminoácido básico não é inibida" é preferivelmente determinada para cada valor de pH específico. Entretanto, a faixa da concentração total de amónia que é aceitável no nível de pH mais alto durante a cultura pode ser usada como o limite superior da concentração total de amónia por toda a íntegra do período de cultura.

Por outro lado, a concentração total de amónia como uma fonte de nitrogênio exigida para o crescimento do microrganismo e a produção da substância básica não é particularmente limitada, e pode ser apropriadamente determinada, desde que depleção de amónia não continue durante a cultura e, assim, diminui de produtividade para a substância objetivo do microrganismo em função de a escassez da fonte de nitrogênio não ocorrer. Por exemplo, a concentração de amónia pode ser medida através do tempo durante a cultura e, se amónia no meio for esgotada, uma pequena quantidade de amónia pode ser adicionada no meio. Embora a concentração de amónia depois da adição de amónia não seja particularmente limitada, a concentração total de amónia pode ser, por exemplo, preferivelmente, 1 mM ou mais, mais preferivelmente, 10 mM ou mais, particularmente preferivelmente, 20 mM ou mais.

O L-aminoácido pode ser usualmente coletado a partir da fermentação de caldo por uma combinação de métodos convencionalmente conhecidos, tais como método da resina de troca de íon (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), método da precipitação, método da separação de membrana (Patentes Japonesas abertas ao público 9-164323 e 9-173792), método de cristalização (W02008/078448, W02008/078646) e outro métodos. Quando o L-aminoácido acumular nas células, as células podem ser rompidas, por exemplo, com ondas ultrassónicas ou similares, e o L-aminoácido pode ser coletado pelo método da resina de troca de íon ou similares a partir do sobrenadante obtido pela remoção das células a partir da suspensão de célula rompida por centrifugação.

O L-aminoácido coletado pode conter células bacterianas, componentes do meio, umidade, e metabólitos subprodutos da bactéria, além do L-aminoácido objetivo. A pureza do L-aminoácido coletado pode ser de 50 % ou mais, preferivelmente, 85 % ou mais, particularmente preferivelmente, 95 % ou mais (Patente Japonesa 1214636, patentes U.S. 5.431.933, 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, e Pedido de patente publicado U.S. 2005/0025878).

Além disso, quando L-aminoácido se depositar no meio, ele pode ser coletado por centrifugação, filtração ou similares. L-aminoácido depositado no meio e L-aminoácido dissolvido no meio podem ser isolados em conjunto depois que o L-aminoácido dissolvido no meio for cristalizado. EXEMPLOSA seguir, a presente invenção será mais especificamente explicada em relação aos exemplos.

Exemplo 1: Cultura de Escherichia coli em meio mínimo contendo ácido graxo como uma única fonte de carbono e medição da concentração de peróxido de hidrogênio intracelular

A cepa MG1655/pTWV228 obtida introduzindo plasmídeo pTWV228 (Takara Bio Inc.) na cepa MG1655 de Escherichia coli (ATCC 47076) de uma maneira convencional foi cultivada em 37°C no meio L que contém 50 mg/L de ampicilina até que o OD60o final se tomou cerca de 0,6, então, uma solução de glicerol a 40 % foi adicionada no meio da cultura no mesmo volume do meio da cultura, e a mistura foi agitada, dividida em volumes apropriados e armazenada em -80°C. Esta preparação foi chamada de carga de glicerol.

A carga de glicerol da cepa MG1655/pTWV228 foi raspada com uma alça, e uma alça das células foi esgotada no meio de ágar glicose M9, e cultivado por 24 horas como cultura estática. As células crescidas foram raspadas, suspensas em uma solução aquosa de NaCl a 0,85 % e inoculadas em 10 mL do meio líquido de oleato de sódio M9 para o tubo de ensaio, ou do meio líquido de glicose M9 para o tubo de ensaio contido em um tubo de ensaio em forma de L em uma turvação de 0,02, medida em um comprimento de onda de 600 nm. A cultura foi continuada em 37°C e 70 rpm por 44 horas pelo uso de uma incubadora de agitação em temperatura constante TN- 2612 (Advantech). A turvação foi medida usando um espectrofotômetro U-2000 (Hitachi, Ltd.) (o mesmo deve se aplicar aos seguintes experimentos).

Composições dos meios anteriormente mencionados são mostradas a seguir. Todas as concentrações são concentrações fmais.[Composição do meio de ágar glicose M9]Glicose 2 g/LNa2HPO4 6 g/LKH2PO4 3 g/LNaCl 0,5 g/LNH4CI 1 g/LMgSO4-7H2O 0,246 g/LTiamina 0,5 mg/LÁgar 15 g/L[Composição do meio líquido de oleato de sódio M9 para tubo de ensaio] Oleato de sódio (Junsei Chemical) 1 g/LTween 80* (Nakalai Tesque) 0,5 % (v/v)Na2HPO4 6 g/LKH2PO4 3 g/LNaCl 0,5 g/LNH4CI 1 g/LMgSO4,7H2O 0,246 g/LTiamina 0,5 mg/L*: monooleato de poli(oxietileno) sorbitano[Composição do meio líquido de glicose M9 para tubo de ensaio]Glicose 1 g/LTween 80 (Nakalai Tesque) 0,5 % (v/v)Na2HPO4 6 g/LKH2PO4 3 g/LNaCl 0,5 g/LNH4CI 1 g/LMgSO4,7H2O Tiamina 0,5 mg/L

Durante a cultura, um volume apropriado de cada meio líquido foi amostrado, apropriadamente diluído e inoculado no meio LB, o número de células bacterianas vivas foi medido e turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm. Além disso, a concentração de peróxido de hidrogênio nas células contidas no meio líquido foi medida de acordo com as descrições das seguintes referências: BEATRIZ GONZALEZ-FLECHA e BRUCE DEMPLE, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 1994, Vol. 176, pp.2293-2299; e Ken-ichi Setsukinai et al., 2003, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 278, pp.3170-3175.

Especificamente, 400 μL do meio da cultura anteriormente mencionado foram tomados e centrifugados em 4°C e 13.800 x g por 2 minutos, 360 μL do sobrenadante foram removidos e as células foram suspensas em 360 μL de um tampão de fosfato a 100 mM, pH 7,3, e deixado de pé por 10 minutos. A seguir, a suspensão foi centrifugada em 4°C e 13.800 x g por 2 minutos, 10 μL do sobrenadante obtido foram amostrados, e a seguinte solução da reação (i) ou (ii) foi adicionada no sobrenadante em uma placa de 96 furos.

Solução da reação (i): peroxidase de rábano silvestre (concentração final, 2 μM; Wako Pure Chemical Industries), 10 μM de substrato de desenvolvimento de cor fluorescente HPF (Sekisui Medicai), e tampão de fosfato (concentração final, 100 mM; pH 7,3)

Mistura da reação (ii): catalase (concentração final, 2 μM; Wako Pure Chemical Industries), 10 μM de substrato de desenvolvimento de cor fluorescente HPF (Sekisui Medicai), e tampão de fosfato (concentração final, 100 mM; pH 7,3)

O sobrenadante foi tratado com cada solução da reação em 37°C por 75 minutos na placa de 96 furos em um local escuro, fluorescência obtida por excitação em um comprimento de onda de excitação de 490 nm foi medida em 515 nm, e a intensidade da fluorescência obtida com a mistura da reação (ii) foi subtraída da intensidade da fluorescência obtida com a mistura da reação (i) para determinar a concentração de peróxido de hidrogênio nas células bacterianas.

Foi separadamente confirmado que Escherichia coli não pode utilizar o elemento tensoativo Tween 80 pelo uso do meio mínimo M9 contendo Tween 80. O consumo de toda a glicose adicionada no meio foi separadamente confirmado pelo uso de Biotech Analyzer AS310. Além disso, o consumo de todo o oleato adicionado no meio foi separadamente confirmado pelo uso de um cromatógrafo a gás GC-2014 (Shimadzü).

Os resultados da cultura são mostrados nas figuras 1 a 3. Da forma vista a partir dos resultados mostrados nas figuras 1 a 3, forte correlação positiva foi observada entre a turvação no comprimento de onda de 600 nm não superior a 1 mostrada pela cepa MG1655/pTWV228 e os números de células bacterianas vivas. Além disso, a cepa MG1655/pTWV228 cultivada com o meio líquido de oleato de sódio M9 para o tubo de ensaio mostrou uma concentração significativamente mais alta de peróxido de hidrogênio intracelular, se comparada com a cepa MG1655/pTWV228 cultivada com o meio líquido de glicose M9 para o tubo de ensaio. Com base nestes resultados de cultura, estimou-se que maior estresse oxidativo que consiste principalmente em peróxido de hidrogênio foi imposto em Escherichia coli durante a utilização do ácido graxo, se comparado com aquele imposto durante a utilização de glicose.

Exemplo 2: Cultura de Escherichia coli promovida com secreção de peróxido de hidrogênio em meio mínimo contendo ácido graxo como única fonte de carbono e medição da concentração de peróxido de hidrogênio intracelular(1) Construção de Escherichia coli amplificada pelo gene oxyS A fim de confirmar o efeito da amplificação do gene oxyS em relação à contribuição para o crescimento de Escherichia coli em cultura usando um ácido graxo como uma fonte de carbono, um plasmídeo para amplificar oxyS foi construído. PCR foi realizada usando os oligonucleotídeos sintéticos com as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 1 e 2 como os oligonucleotídeos iniciadores e o DNA cromossômico da cepa MG 1655 de Escherichia coli como o molde. O produto de PCR foi purificado e ligado ao vetor pTWV228 (Takara Bio Inc.) digerido com Sail para construir um plasmídeo pTWV228-OAy5 para amplificação de oxyS.

A cepa MG1655/pTWV228-oxyó' obtida introduzindo o plasmídeo pTWV228-OA75 na cepa MG 1655 de uma maneira convencional foi cultivada em 37°C no meio L que contém 50 mg/L de ampicilina até que o OD6OO final se tomou cerca de 0,6 e, então, a carga de glicerol foi preparada e armazenada. A carga de glicerol foi preparada adicionando uma solução de glicerol a 40 % no meio da cultura no mesmo volume do meio da cultura, agitando a mistura, dividindo a mistura em volumes apropriados e os armazenando em -80°C (o mesmo deve se aplicar às seguintes descrições).(2) Construção de Escherichia coli amplificada pelo gene SodA

A fim de confirmar o efeito da amplificação do gene SodA mostrado em SEQ ID NO: 9 em relação à contribuição para o crescimento de Escherichia coli em cultura usando um ácido graxo como uma fonte de carbono, um plasmídeo para amplificar SodA foi construído. PCR foi realizada usando oligonucleotídeos sintéticos com as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 3 e 4 como os oligonucleotídeos iniciadores e o DNA cromossômico da cepa MG1655 de Escherichia coli como o molde. O produto de PCR foi purificado e ligado ao vetor pTWV229 (Takara Bio Inc.) digerido com Hindlll e Sail para construir um plasmídeo pTWV229-Sbt/4 para amplificação de SodA.

A cepa MG1655/pTWV229-SbdM foi construída introduzindo pTWV229-So<74 na cepa MG1655. A cepa MG1655/pTWV228-So<7/í foi cultivada em 37°C no meio L que contém 50 mg/L de ampicilina até que o

OD6OO final se tomou cerca de 0,6 e, então, a carga de glicerol da cepa MG1655/pTWV228-S'oí74 foi preparada e armazenada.(3) Medição da concentração de peróxido de hidrogênio em cepa amplificada pelo gene SodA cultivada em meio que contém ácido graxo como fonte de carbono

Cada uma das cargas de glicerol da cepa MG1655/pTWV228, da cepa MG1655/pTWV228-oA7S e da cepa MG1655/pTWV229-SWJ foi raspado uma alça, e uma alça das células foi esgotada no meio de ágar glicose M9 e cultivado por 24 horas como cultura estática. As células crescidas foram raspadas, suspensas em uma solução aquosa de NaCl a 0,85 % e inoculadas em 10 mL dos anteriormente mencionados meio líquido de oleato de sódio M9 para tubo de ensaio ou meio líquido de glicose M9 para tubo de ensaio contido em um tubo de ensaio em forma de L em uma turvação de 0,02 medida em um comprimento de onda de 600 nm. A cultura foi continuada em 37°C e 70 rpm por 44 horas pelo uso de uma incubadora de agitação em temperatura constante TN-2612 (Advantech).

Durante a cultura, um volume apropriado de cada meio líquido foi amostrado e apropriadamente diluído, e a turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm. Além disso, a concentração de peróxido de hidrogênio nas células na fase logarítmica contida no meio líquido e mostrando uma turvação de cerca de 0,6 em um comprimento de onda de 600 nm foi medida de acordo com o método anteriormente mencionado.

Foi separadamente confirmado que Escherichia coli usada para a cultura não pode utilizar o elemento tensoativo Tween 80 pelo uso do meio mínimo M9 que contém Tween 80. O consumo de toda a glicose adicionada no meio foi separadamente confirmado pelo uso do Biotech Analyzer AS310. Além disso, o consumo de todo o oleato adicionado no meio foi separadamente confirmado pelo uso de um cromatógrafo a gás GC-2014 (Shimadzü).

Os resultados da cultura são mostrados nas figuras 4 a 7. Da forma vista a partir dos resultados mostrados nas figuras 4 a 7, significativa redução da concentração de peróxido de hidrogênio intracelular e significativa melhoria do crescimento em função da amplificação de oxyS foram observadas na cultura que usa oleato como a fonte de carbono. Além disso, significativo aumento da concentração de peróxido de hidrogênio intracelular e significativa degradação do crescimento na função da amplificação de SodA foram observados.

Exemplo 3: Produção de L-lisina com cepa intensificada pela expressão de oxyS1. Introdução de plasmídeo para intensificar a expressão de oxyS na bactéria produtora de L-lisina

A fim de confirmar o efeito da amplificação do gene oxyS em relação à contribuição para a capacidade de produção de L-lisina, pTWV228-oxyS preparado no Exemplo 2 foi introduzido na bactéria produtora de L-lisina WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 construída pelo método descrito no Pedido de patente publicado U.S. 2006/0160191 para construir a cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2,pTWV228-oxyS. A cepa WC 196ΔcadAΔldcC (também referida como "WC196LC") é uma cepa obtida a partir da cepa de Escherichia coli WC196 pela perturbação dos genes de lisina descarboxilase, cadA e Ide de acordo com o método que usa o método de integração direcionada por Red (Datsenko K.A., Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645) e o sistema de excisão derivado do fago X (Cho, E.H., Gumport, R.I., Gardner, J.F., 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) em combinação (consulte W02005/010175). Uma cepa obtida introduzindo pCABD2 nesta cepa é a cepa WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2 (WC196LC/pCABD2). O plasmídeo pCABD2 contém um gene dapA mutante que codifica diidrodipicolinato sintase (DDPS) derivada de Escherichia coli com uma mutação para dessensibilização à retroinibição por L-lisina, um gene lysC mutante que codifica aspartoquinase III derivada de Escherichia coli com uma mutação para dessensibilização à retroinibição por L-lisina, o gene dapB que codifica diidrodipicolinato redutase derivada de Escherichia coli e o gene ddh que codifica diaminopimelato desidrogenase derivada de Brevibacterium lactofermentum. A cepa WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxμS' foi cultivada em 37°C no meio L que contém 20 mg/L de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina até que o ODgoo final se tomou cerca de 0,6 e, então, a carga de glicerol foi preparada e armazenada em -80°C.

2. Avaliação da capacidade de produção de L-lisina da bactéria produtora de L-lisina intensificada pela expressão de oxyS usando ácido graxo como fonte de carbono

A carga mencionada anteriormente de glicerol foi descongelada, 100 μL da carga descongelado foram uniformemente aplicados em uma placa L contendo 20 mg/L de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina, e cultivado em 37°C por 24 horas como cultura estática. Cerca de 1/4 das células obtidas na placa foram suspensas em 0,5 mL de solução salina fisiológica, e turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm. A suspensão obtida que contém a bactéria foi inoculada em 40 mL do meio de fermentação (descrito a seguir) contendo 20 mg/L de estreptomicina contida em um frasco de Erlenmeyer com volume de 500 mL com dissipadores em um volume tal que a turvação medida em um comprimento de onda de 600 nm tome-se 0,2, e cultura foi realizado em 37°C por 48 horas em um número de rotação de 200 rpm para agitação pelo uso de uma incubadora de agitação rotativa, InnOva 4430 (New Brunswick Scientific).

Como a fonte de carbono para a cultura principal, oleato de sódio foi usado. Tween 80 foi adicionado em uma concentração final de 0,5 % (v/v) como um reforço de emulsificação. A quantidade total da fonte de carbono foi 10 g/L. Foi separadamente confirmado que Escherichia coli não pode utilizar Tween 80 pelo uso do meio mínimo M9 que contém Tween 80.

A cultura foi realizada por 48 horas nas condições anteriormente mencionadas, e a quantidade de L-lisina acumulada no meio foi medida pelo uso do Biotech Analyzer AS310 (Sakura Seikí). O completo consumo do oleato adicionado no meio foi confirmado pelo uso de um cromatógrafo a gás GC-2014 (Shimadzu). Além disso, Tween 80 foi adicionado em uma concentração final de 1,0 % (v/v) imediatamente depois do fim da cultura, o resultante foi apropriadamente diluído e turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm para medir a quantidade de célula no fim da cultura.

Além disso, a concentração de peróxido de hidrogênio nas células contidas no meio foi medida pelo método anteriormente mencionado no momento do fim da cultura. O número de células bacterianas vivas no meio foi estimado com base na estimativa comum de que 109 células de Escherichia coli existem em 1 mL de um meio de cultura que mostra uma turvação de 1 determinada em um comprimento de onda de 600 nm.

A cepa WC196LC/pCABD2, pTWV228, obtida introduzindo pTWV228 na cepa WC196LC/pCABD2 também foi cultivada da mesma maneira descrita anteriormente.

A composição do meio de fermentação usado para a cultura principal que contém oleato como a fonte de carbono é mostrada a seguir. As concentrações mencionadas na unidade de g/L ou % (em termos de volume/volume) são todas concentrações finais.[Meio de fermentação que contém oleato como fonte de carbono]Oleato de sódio (primeiro grau, Junsei Chemical) 10 g/LTween 80 0,5 %MgSO4*7H2O 1 g/LPIPES 20 g/L(NH4)2SO4 16 g/LKH2PO4 1 g/LFeSO4-7H2OMnSO4-7H2O Extrato de levedura (Difcò) 2 g/LOleato de sódio foi ajustado em pH 7,5 com HC1 e autoclavado em 115°C por 10 minutos.Tween 80 foi sujeito a esterilização de filtro usando filtro Nalgene 0,45 μm (Nalgené).MgSO4*7H2O foi autoclavado em 115°C por 10 minutos.PIPES foi ajustado em pH 7,5 com NaOH e autoclavado em 115°C por 10 minutos.

Os ingredientes sem ser os expostos foram misturados, ajustados em pH 7,5 com KOH e autoclavados em 115°C por 10 minutos.

Da maneira descrita anteriormente, os ingredientes foram divididos em cinco grupos, separadamente esterilizados e, então, misturados.

Os resultados da cultura, isto é, acúmulo de L-lisina, rendimento com base em oleato, turvação da célula (OD) e concentração de peróxido de hidrogênio intracelular, são mostrados na Tabela 1. Da forma vista a partir dos resultados mostrados na Tabela 1, a cepa WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxμ$' mostrou melhoria significativamente superior no crescimento e na produção de L-lisina, se comparada com a cepa WC196LC/pCABD2,pTWV228, em que a expressão do gene oxyS não foi intensificada. Além do mais, a cepa WC196LC/pCABD2,pTWV228-oxμS’ mostrou concentração de peróxido de hidrogênio intracelular significativamente mais baixa, se comparada com a cepa WC196LC/pCABD2,pTWV228, em que a expressão do gene oxyS não foi intensificada.

Exemplo 4: Produção de L-lisina com cepa intensificada pela expressão do operon fixABC1. Construção da cepa amplificada pelo operon fixABC

A PCR foi realizada usando os oligonucleotídeos iniciadores mostrados em SEQ ID NOS: 5 e 6, e o DNA cromossômico da cepa W3110 como o molde, para obter um produto de PCR que contém o operon fixABC. O produto de PCR obtido foi ligado com o vetor pTWV228 (Takara Bio Inc.) digerido com Sail pelo uso de In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) para construir um plasmídeo fiVWN-fixABC para amplificação do operonfixABC.

A cepa WC196LC/pCABD2 foi transformada com o plasmídeo pTWV-/zx4Z?C e o vetor de controle pTWV228, da mesma maneira que aquela do exemplo 3, para obter as cepas WC196LC/pCABD2/pTWV- fixABC e WC196 LC/pCABD2/pTWV228, respectivamente.

Cada uma das cepas anteriormente mencionadas foi cultivada em 37°C no meio LB que contém 50 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de estreptomicina, até que o OD60o final tomou-se cerca de 0,6 e, então, uma solução de glicerol a 40 % foi adicionada no meio de cultura no mesmo volume do meio de cultura, e a mistura foi agitada, dividida em volumes apropriados e armazenada em -80°C como carga de glicerol.

2. Produção de L-lisina com cepa amplificada pelo operon fixABCCada uma das cargas de glicerol da cepa amplificada pelo operon fixABC e da cepa de controle foi descongelada, 100 μL da carga descongelada foram uniformemente aplicados em uma placa de LB contendo 50 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de estreptomicina, e cultivados em 37°C por 24 horas. Cerca de 1/4 das células obtidas na placa foram suspensas em 1,0 mL de solução salina fisiológica, e a turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm. A suspensão obtida contendo a bactéria foi inoculada em 40 mL do meio de fermentação descrito no exemplo 3 (contanto que a concentração de (NH4)2SO4 fosse alterada para 24 g/L), contendo 50 mg/L de ampicilina e 20 mg/L de estreptomicina contido em um frasco de Erlenmeyer com ranhuras no fundo, com volume de 500 mL, em um volume tal que a turvação medida em um comprimento de onda de 600 nm seja 0,25, e cultura foi realizada em 37°C for 47 horas em um número de rotação de 200 rpm para agitar, com uso de uma incubadora de agitação rotativa, InnOva 4430 (New Brunswick Scientific).

Após 47 horas, a quantidade de L-lisina no sobrenadante da 5 cultura foi medido usando Biotech Analyzer AS310 (Sakura SI). O consumo completo do oleato adicionado no meio foi separadamente confirmado pelo uso de um cromatógrafo a gás GC-2014 (Shimadzu). Além disso, Tween 80 foi adicionado em uma concentração final de 1,0 % (v/v), imediatamente depois do fim da cultura, o resultante foi apropriadamente diluído, e a turvação foi 10 medida em um comprimento de onda de 600 nm para medir a quantidade de célula no momento do fim da cultura. Além disso, a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular das células no meio foi medido pelo método anteriormente mencionado no momento do fim da cultura.

O número de células bacterianas vivas no meio foi estimado 15 com base na estimativa comum de que 109 células de Escherichia coli existem em 1 mL de um meio de cultura, o que mostra uma turvação de 1 determinada em um comprimento de onda de 600 nm.

O acúmulo de L-lisina, a turvação da célula (OD) e a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular são mostrados na tabela 20 2. A cepa introduzida no operon fixABC mostrou uma produção de L-lisinasignificativamente maior, se comparado com a cepa de controle introduzida no vetor pTWV228. Além disso, a cepa introduzida no operon fixABC mostrou concentração de peróxido de hidrogênio intracelularsignificativamente mais baixa, se comparado com a cepa de controle 25 introduzida no vetor pTWV228.

Exemplo 5: Produção de L-lisina pela cepa com expressão intensificada de fixABC a partir da bactéria que utiliza etanol1. Conferir capacidade de utilizar etanol para a cepa WC196LC

A fim de conferir a capacidade de utilizar etanol para a bactéria produtora de L-lisina, um gene mutante de álcool desidrogenase (adhE*) foi introduzido. Assim como o gene mutante de álcool desidrogenase, o gene derivado da cepa MG1655::PL-tacadhE* (consultar W02008/010565) foi usado. A cepa MG1655:PL-tacadhE* é uma cepa obtida inserindo um fragmento de DNA que compreende o gene de resistência ao cloranfenicol (cat), e um gene mutante adhE controlado pelo promotor PL-tac no genoma da cepa MG 1655 de Escherichia coli. O gene mutante adhE codifica uma proteína mutante, em que o resíduo de ácido glutâmico na posição 568 é substituído pelo resíduo de lisina. Escherichia coli contendo esta álcool desidrogenase pode utilizar etanol em condições aeróbicas.

A fim de tomar possível a remoção do gene cat do genoma da cepa MG1655::PL-tacadhE*, o gene cat foi substituído por um fragmento de DNA obtido ligando o sítio de anexação do fago X e o gene de resistência à tetraciclina (att-tet).

Em relação à substituição do gene cat pelo gene att-tet, o método de X-Red (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645) foi usado. Assim como os oligonucleotídeos iniciadores para a substituição do gene cat pelo gene att-tet, os oligonucleotídeos sintéticos de SEQ ID NOS: 7 e 8 foram usados. Desta maneira, a cepa MG1655- att-tet-PL-tacadhE*, que é uma cepa da cepa MG1655::PL-tacadhE* em que o gene cat é substituído pelo gene att-tet, foi obtida.

A fim de conferir a capacidade de utilizar etanol para a bactéria produtora de L-lisina, o lisado de PI foi obtida a partir da cepa MG1655-att-tet-PL-tacadhE* de uma maneira convencional, e a bactéria produtora de L-lisina, cepa WC196LC, foi usada como um hospedeiro para obter a cepa WC196LC-att-tet-PL-tacadhE* pelo uso do método de transdução de P1.

Então, a fim de remover o gene att-tet introduzido à montante do promotor PL-toc, um plasmídeo auxiliar pMW-intxis-ts (Pedido de patente publicado U.S. 2006/0141586) foi usado. pMW-intxis-ts é um plasmídeo que carrega um gene que codifica integrase de fago X (Int) e um gene que codifica excisionase de fago X (Xis), e com capacidade de replicação sensível a temperatura.

As células competentes da cepa WC196LC-att-tet-PL- tacadhE* obtida da maneira descrita anteriormente foram preparadas de uma maneira convencional, transformadas com o plasmídeo auxiliar pMW-intxis- ts, e cultivadas a 30°C em uma placa do meio ágar LB que contém 50 mg/L de ampicilina para selecionar uma cepa resistente à ampicilina. A seguir, para remover o plasmídeo pMW-intxis-ts, o transformante foi cultivado a 42°C no meio ágar LB, e a resistência à ampicilina e resistência à tetraciclina das colônias obtidas foram examinadas para obter uma cepa sensível à ampicilina e tetraciclina, que foi uma cepa introduzida com PL-tacadhE*, que não contém att-tet e pMW-intxis-ts. Esta cepa foi determinada como cepa WC196LC PL-tacadhE*.

2. Introdução de plasmídeo para intensificar a expressão de fixABC, pTWNZZÜ-fixABC, e plasmídeo para a produção de L-lisina (pCABD2) na cepa WC196LC PL-tacadhE*

Introduzindo pCABD2 na bactéria produtora de L-lisina, cepa WC196LC PL-tacadhE*, a cepa WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2 foi construída. pTWV228-/zx4BC e pTWV228 foram introduzidos nesta cepa para obter a cepa WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228-yzxZBC e a cepa WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228, respectivamente. As cargas de glicerol destas cepas foram preparadas.

3. Avaliação da capacidade de produção de L-lisina da cepa com expressão intensificada de fixABC a partir do etanol

As cargas de glicerol das cepas anteriormente mencionadas foram descongelados, 100 μL de cada uma das cargas descongeladas foram uniformemente aplicadas em um placa L contendo 20 mg/L de estreptomicina, e a cultura foi realizada em 37°C por 15 horas. As células obtidas foram suspensas em uma solução aquosa de NaCl a 0,85 %, inoculado em 5 mL de um meio de fermentação que contém 20 mg/L de estreptomicina e 50 mg/L de ampicilina contido em um tubo de ensaio grande (diâmetro interno: 18 mm), em uma OD60o inicial de 0,25, e cultivadas a 37°C com agitação em 120 rpm pelo uso de uma incubadora recíproca.

A composição do meio de fermentação que contém etanol como a fonte de carbono é mostrada a seguir.[Composição de meio de fermentação que contém etanol como fonte decarbono]Etanol 10 ml/L(NH4)2SO4 24 g/LK2HPO4 1,0 g/LMgSO4-7H2O 1,0 g/LFeSO4-7H2O 0,01 g/LMnSO4-5H2O 0,082 g/LExtrato de levedura 2.0 g/LCaCCh (Farmacopéia Japonesa) 30 g/LÁgua destilada para o volume final de 1 L(NH4)2SO4, K2HPO4, FeSO4-7H2O, MnSO4‘7H2O, e extratode levedura foram misturados, ajustados em pH 5,7 com KOH, e autoclavados em 115°C por 10 minutos. MgSO4*7H2O foi esterilizado separadamente, e o etanol foi esterilizado por meio de filtração. CaCCh foi submetido a esterilização por calor seco a 180°C por 2 horas e adicionado no meio. Posteriormente, foi adicionado 20 μL de etanol a cultura de 16 horas. Depois, na cultura de 21 horas, a quantidade de L-lisina que se acumulou no meio foi medida usando Biotech Analyzer AS210 (Sakura Seiki}, e a concentração de etanol no meio de cultura foi medida usando um biossensor (Oji Scientific Instruments Biossensor BF-5). A cepa com expressão intensificada de fixABC (cepa WC196LC PL-tacadhE*/pCABD2,pTWV228-/Zx^5C cepa) mostrou um crescimento e produção de L-lisina significativamente maiores, se comparada com a cepa de controle (cepa WC196LC PL- tacadhE*/pCABD2,pTWV228).

Exemplo 6: Avaliação de capacidade de produção de L-lisina de bactéria produtora de L-lisina a partir de ácido graxo como fonte de carbono, com adição de tioureia anti-oxidante ao meio.

1. Pré-cultivoA carga de glicerol da bactéria produtora de L-lisina, cepa WC196 LC/pCABD2, foi inoculado em uma quantidade de uma alça no meio ágar LB (1 % de triptona, 0,5 % de extrato de levedura, 0,5 % de cloreto de sódio, 1,5 % de agarose) contendo 20 mg/L de estreptomicina, e cultivado em 37°C por 24 horas como cultura estática.

2. Cultivo principal usando tanque de fermentação pequeno com volume total de 1 LAs células crescidas no pré-cultivo anteriormente mencionado foram raspadas do meio, suspensas em uma solução aquosa de NaCl a 0,85 %, e inoculadas em 300 mL de meio de fermentação MS glicose líquido ou meio de fermentação MS ácido graxo líquido com as composições a seguir, e foram contidas em um tanque de fermentação pequeno com um volume total de 1 L em uma turvação de 0,04, medido em um comprimento de onda de 600 nm para inicia o cultivo. Com o meio de fermentação MS glicose líquido, a cultura foi realizada em uma temperatura de cultivo de 37°C e uma taxa de agitação de 300 rpm por 16 horas, com adição de 20 mg/L de estreptomicina e aeração de ar comprimido esterilizado com um filtro para esterilização em 1 vvm. Além disso, o pH foi mantido a 6,7 com gás de amónia. Com o meio de fermentação MS ácido graxo líquido, a cultura foi realizada em uma temperatura de cultivo de 37°C e uma taxa de agitação de 700 rpm por 42 horas, com adição de 20 mg/L de estreptomicina e aeração de ar comprimido esterilizado com um filtro para esterilização em 1 vvm. Além disso, o pH foi mantido a 6,7 com gás de amónia.

A cultura foi realizada adicionando tioureia 1 mM ou 5 mM como um antioxidante no momento do início da cultura. Como controle, a cultura foi realizada em uma condição que a tioureia não foi adicionada (referida como condição livre de tioureia), e condição em que a ureia foi adicionada nas mesmas concentrações de tioureia (referida como condição de adição de ureia).

Durante o cultivo, um volume apropriado de cada meio líquido foi amostrado, e a quantidade de L-lisina na cultura sobrenadante foi medida com Biotech Analyzer AS310 (Sakura SI). O consumo completo do oleato adicionado no meio foi confirmado pelo uso de um cromatógrafo a gás GC- 2014 (Shimadzu). O consumo completo da glicose adicionada no meio foi separadamente confirmada pelo uso Biotech Analyzer AS310. Além disso, uma solução de Tween 80 foi adicionada em uma concentração final de 1,0 % (v/v), imediatamente depois do fim da cultura, o resultante foi apropriadamente diluído, e a turvação foi medida em um comprimento de onda de 600 nm para medir a quantidade de célula no momento do fim da cultura.

Além disso, a concentração de peróxido de hidrogênio intracelular das células no meio foi medido pelo método anteriormente mencionado no fim da cultura. O número de células bacterianas vivas no meio foi estimado com base na estimativa comum de que 109 células de

Escherichia coli existem em 1 mL de um meio de cultura, que mostra umaturvação de 1 determinada em um comprimento de onda de 600 nm. [Meio de fermentação MS glicose líquido]Glicose 10 g/LTween 80 0,5 % MgSO4‘7H2O 1 g/L (NH4)2SO4 24 g/L KH2PO4 1 g/L FeSO4-7H2O 0,01 g/MnSO4-7H2O 0,082 J Extrato de levedura (Difco) [Meio de fermentação MS ácido graxo líquido] 2g/L Oleato de sódio (primeiro grau, Junsei Chemical) 10 g/L Tween 80 0,5 %MgSO4*7H2O 1 g/L (NH4)2SO4 24 g/L KH2PO4 1 g/L FeSO4’7H2O 0,01 g/ MnSO4-7H2O 0,082 JExtrato de levedura (Difco) 2 g/L

O acúmulo de L-lisina e turvação da célula (OD) no momento do final do cultivo, bem como o tempo de cultivo exigido para o consumo de toda a fonte de carbono no meio de cultura, observado nas várias condições de cultivo, são mostrados nas tabelas 4, 5, e 6, e os resultados da medição da concentração deperóxido de hidrogênio são mostrados na figura 8. No cultivo de produção de L- lisina usando o ácido graxo como a fonte de carbono, a condição de adição de tioureia forneceu uma produção significativamente maior de L-lisina e turvação da célula, se comparada com as condições controle (condição livre de tioureia e condição de adição de ureia). Além disso, no cultivo da produção de L-lisina usando o ácido graxo como a fonte de carbono, o ácido graxo adicionado no meio foi consumido em um tempo significativamente menor na condição de adição tioureia, comparada com as condições controle (condição livre de tioureia e condição de adição de ureia). Além disso, no cultivo para a produção de L-lisinausando glicose como a fonte de carbono e no cultivo para a produção de L-lisinausando ácido graxo como a fonte de carbono, a condição de adição de tioureiaforneceu uma concentração de peróxido de hidrogênio intracelularsignificativamente mais baixa, se comparada com as condições controle (condiçãolivre de tioureia e condição de adição de ureia).Tabela 4: OD600 no final do cultivo

[Explicação de listagem de sequências]SEQ ID NO: 1: Oligonucleotide© iniciador para a amplificação 15 do gene oxyS.SEQ ID NO: 2: Oligonucleotídeo iniciador para a amplificaçãodo oxyS. SEQ ID NO: 3: Oligonucleotideo iniciador para a amplificação do gene SodA.SEQ ID NO: 4: Oligonucleotideo iniciador para a amplificação do gene SodA.SEQ ID NO: 5: Oligonucleotideo iniciador para a amplificação do operon fixABC.SEQ ID NO: 6: Oligonucleotideo iniciador para a amplificação do operon fixABC.SEQ ID NO: 7: Oligonucleotideo iniciador para a substituição do gene att-tet pelo gene cat.SEQ ID NO: 8: Oligonucleotideo iniciador para a substituição do gene att-tet pelo gene cat.SEQ ID NO: 9: Sequência de nucleotídeos de gene oxyS.SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotídeos de gene fixA.SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos codificada pelo gene fix A.SEQ ID NO: 12: Sequência de nucleotídeos do gene fixB.SEQ ID NO: 13: Sequência de aminoácidos codificada pelo gene fixB.SEQ ID NO: 14: Sequência de nucleotídeos do gene fixC.SEQ ID NO: 15: Sequência de aminoácidos codificada pelo gene fixC.SEQ ID NO: 16: Sequência de nucleotídeos do gene SodA.SEQ ID NO: 17: Sequência de aminoácidos codificada pelo gene SodA.

Aplicabilidade industrial

De acordo com a presente invenção, um L-aminoácido pode ser eficientemente produzido por fermentação usando um ácido graxo ou um álcool como uma fonte de carbono.

Claims

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende:(a) cultivar uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, e apresenta uma capacidade de produzir L-aminoácido em um meio que contém uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo consistindo em ácido graxo e de um álcool, em que a bactéria foi modificada para reduzir a concentração intracelular de peróxido de hidrogênio da bactéria pelo aumento do número de cópia de um gene fixABC, e/ou substituir um promotor de um gene fixABC com um promotor mais forte, eem que o L-aminoácido é selecionado a partir do grupo que consiste em L-lisina, L-treonina, L-isoleucina e L-metionina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertence ao gênero Escherichia, Pantoea, ou Enterobacter.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a bactéria é Escherichia coli, Pantoea ananatis, ou Enterobacter aerogenes.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os genes fixABC codificam proteínas com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 11, 13, e 15.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é um ácido graxo.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é ácido oleico.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é uma mistura de ácidos graxos derivados de uma gordura ou um óleo.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é um álcool.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o álcool é glicerol.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado 5 pelo fato de que o álcool é etanol.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é uma mistura de um ácido graxo e glicerol obtida hidrolisando uma gordura ou um óleo.

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a bactéria é Escherichia coli, e foi modificada de maneira tal que possa utilizar o etanol aerobicamente pela introdução de um gene adhE mutante que codifica uma álcool desidrogenase modificada, em que o resíduo de ácido glutâmico na posição 568 é substituído pelo resíduo de lisina, na bactéria.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o L-aminoácido é L-lisina.