BR112013003754B1

BR112013003754B1 - Dispositivo para detectar uma proteína amiloide em um olho de um mamífero

Info

Publication number: BR112013003754B1
Application number: BR112013003754-7A
Authority: BR
Inventors: Paul D. Hartung; Vincent Valvo; Charles Kerbage; Gerald D. Cagle; Dennis J. Nilan
Original assignee: Cognoptix, Inc.
Priority date: 2010-08-16
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2021-11-09
Also published as: MX2013001537A; AU2011292233A1; JP5863797B2; SG188227A1; CN103153168B; RU2577810C2; RU2013110796A; KR20130138211A; EP2420179A3; US9451909B2; MX357628B; CA2807683A1; EP2605694A1; AU2011292233B2; EP2420179A2; JP2015166749A; CN103153168A; NZ607257A; EP2605694B1; CA2807683C

Abstract

DISPOSITIVO PARA DETECTAR UMA PROTEÍNA AMILOIDE EM UM OLHO DE UM MAMÍFERO E USO. De acordo com uma modalidade da invenção, é apresentado um dispositivo e um método de detecção de uma proteína amiloide em um olho de um mamífero. Um método compreende a iluminação do olho com uma fonte de luz que tem pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma propriedade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação de amiloide quando o composto de ligação de amiloide é ligado à proteína amiloide, e o composto de ligação de amiloide é introduzido no olho e se liga especificamente à proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloideogênico; e a determinação de uma taxa de declínio da duração da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação de amiloide ligado à proteína amiloide, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação de amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo.

Description

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedidode Patente Provisório U.S. anterior n°. 61/374.131, depositado em 16 de agosto de 2010 e do Pedido de Patente Provisório U.S. n°. 61/425.490, depositado em 21 de dezembro de 2010; e a prioridade das reivindicações sob o § 119 ou 365 do 35 U.S.C. para o Pedido de Patente Europeu n°. 11001148.3, depositado em 11 de fevereiro de 2011.

[002] Este pedido de patente também está relacionado ao Pedido de Patente U.S. n°. 11/786.514, depositado em 11 de abril de 2007 atualmente Patente U.S. n°. 7.828.436; e ao Pedido de Patente n°. 12/154.226, depositado em 21 de maio de 2008 e publicado como Publicação de Pedido de Patente U.S. n°. 2009/0041666; e Patente U.S. n°. 7.107.092 e Patente U.S. n°. 7.297.326.

[003] Todos os ensinamentos de todas as patentes, publicações e pedidos de patente acima são aqui incorporados a título de referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Sempre é desejável detectar doenças logo em seu progresso. A detecção precoce permite o tratamento imediato, o que foi geralmente comprovado como resultando em uma taxa mais elevada de sucesso no tratamento de várias doenças. Foi descoberto que a análise dos olhos das pessoas, e em particular as lentes dos olhos, pode prover indicações de vários tipos de doenças. Por exemplo, os pesquisadores encontraram peptídeos β-amiloide e agregados dos mesmos no supranúcleo da lente dos olhos de vítimas do mal de Alzheimer [AD]. Vide a Patente U.S. n°. 7.297.326 de Goldstein et al. Uma vez que o supranúcleo tem uma espessura que é somente uma fração de um milímetro, as medições obtidas dessa região da lente do cristalino precisam ser exatas na localização, específicas na informação e rápidas na aquisição. Isto é especialmente verdadeiro porque o olho humano fica em movimento quase constante até mesmo quando um pacienteestá fixando em um alvo iluminado.

[005] Foi mostrado que a presença de, ou um aumento, na quantidade de peptídeos β-amiloide e dos agregados dos mesmos nas regiões supranuclear e/ou cortical da lente do olho de um mamífero de teste em comparação a um valor normal de controle indica que o mamífero de teste está sofrendo de, ou está correndo o risco de desenvolver, uma doença neurodegenerativa tal como um distúrbio amiloi- dogênico.

[006] Há uma necessidade contínua quanto a sistemas e métodos para permitir a detecção precoce de distúrbios amiloidogênicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] De acordo com uma modalidade da invenção, é apresentado um método para detectar em um olho de um mamífero uma proteína amiloide, tal como uma proteína amiloide que compreende um agregado. Em algumas modalidades, a detecção da proteína amiloide é indicativa de um distúrbio amiloidogênico. O método compreende a iluminação do olho com uma fonte de luz que tem pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma propriedade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à proteína amiloide, e o composto de ligação ao amiloide é introduzido no olho e se liga especificamente à proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloidogênico; a recepção da luz incluindo a fluorescência produzida como resultado da iluminação do olho; e a determinação de uma taxa de declínio do tempo de fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo.

[008] Em outras modalidades relacionadas, o método pode compreender ainda a determinação de uma intensidade de fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide. Uma quantidade do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide pode ser determinada, com base em pelo menos uma dentre a intensidade e a taxa de declínio do tempo. O método pode compreender ainda a determinação de uma localização de uma interface ocular tal como uma cápsula da lente do olho com base em um aumento em um sinal fluorescente devido à fluorescência natural emitida dos tecidos do olho. Pelo menos uma região do olho pode ser amostrada ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem compreende a execução de pelo menos uma dentre uma medição da região inteira ou uma amostragem de localizações diferentes dentro da região ou regiões usando a iluminação pela fonte de luz, a amostragem de diferentes localizações que compreende a iluminação de pelo menos um ponto, plano e/ou volume dentro do olho. A amostragem pode compreender localizações de amostragens diferentes de mais de uma região do olho. Por exemplo, as varreduras planar do olho podem ser executadas ao usar a fonte de luz, em planos sucessivos ao longo de um eixo perpendicular que se estende em profundidade para o olho. Uma posição de um supranú- cleo do olho pode ser determinada com base em (i) uma distância afastada de uma estrutura anatômica específica tal como uma interface da cápsula da lente do olho ou da interface da córnea, ou (ii) uma detecção de uma mudança (inclinação) na medição da intensidade. A distinção da presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide pode compreender a distinção do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide da autofluorescência de fundo de tecidos do olho e da autofluorescência de outras partículas não específicas, bem como um agente de formação de imagem não ligado. O método pode compreender a distinção de pelo menos uma dentre uma presença e uma quantidade de mais de um dos seguintes: o composto de ligação ao amiloide; o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide; e a proteína amiloide. A proteína amiloide pode compreender um agregado ou um agregado de proteína pré- amiloide (incluindo dímeros, trímeros ou oligômeros de ordem mais elevada dos peptídeos Aβ1-42 e/ou Aβ1-40). Por exemplo, a proteína ami- loide pode compreender beta-amiloide. O distúrbio amiloidogênico pode compreender o mal de Alzheimer.

[009] Em outras modalidades relacionadas, o composto de ligação ao amiloide pode compreender um rotor molecular, Chrysamine e/ou um derivado de Chrysamine, um composto de ligação ao amiloide de vermelho do Congo e/ou derivado de vermelho do Congo; um composto de ligação ao amiloide de Chrysamine G ou de um derivado de Chrysamine G; um composto de ligação ao amiloide de Thioflavin T ou de um derivado de Thioflavin T; e um composto de ligação ao amiloide de Thioflavin S ou de um derivado de Thioflavin S. O método pode compreender a distinção de pelo menos a presença da proteína ami- loide com base somente na detecção da fluorescência. O método pode compreender ainda a determinação do número médio de fótons com uma taxa específica de declínio em determinada área do olho. Uma taxa de aplicação do composto de ligação ao amiloide ao olho, a uma distribuição espacial do composto de ligação ao amiloide aplicado ao olho, e/ou a um gradiente da concentração do composto de ligação ao amiloide em uma interface da córnea do olho podem ser determinados com base na fluorescência detectada. Além disso, uma distribuição espacial do composto de ligação ao amiloide e/ou uma distribuição temporal do composto de ligação ao amiloide no humor aquoso do olho podem ser determinadas com base na fluorescência detectada.

[0010] O método pode compreender ainda a determinação de pelo menos uma dimensão de uma estrutura ou uma subestrutura anatômica do olho com base na excitação natural da fluorescência de pelo menos uma parte da estrutura ou subestrutura anatômica. A determinação de pelo menos uma dimensão pode compreender pelo menos uma dentre a determinação de uma espessura da estrutura ou da su- bestrutura, a determinação de uma forma da estrutura ou da subestru- tura, e a determinação de uma distância entre uma ou mais estruturas ou subestruturas do olho. Por exemplo, a determinação de pelo menos uma dimensão pode incluir a determinação de uma espessura da cór-nea, uma forma da córnea, uma profundidade do humor aquoso, uma forma da lente ou uma espessura da lente, ou a determinação de uma medição interna dentro da lente ou outra estrutura ou subestrutura do olho, tal como uma distância da superfície da lente ao córtex ou ao su- pranúcleo ou ao núcleo. O método pode compreender ainda a detecção da fluorescência produzida pelo olho ao usar um dispositivo foto- detector, tal como pelo menos um dentre um fotodiodo, um fotomulti- plicador, um dispositivo acoplado com carga (CCD) e um dispositivo acoplado com carga intensificada (ICCD); por exemplo, um detector de fotodiodo rápido de avalanche. O método pode compreender a execução da contagem de único fóton de correlação temporal da fluorescência produzida pelo olho. A contagem de único fóton de correlação temporal pode compreender a pulsação da fonte de luz e a determinação da taxa de declínio do tempo da fluorescência com base em uma distribuição de contagens de fótons como uma função de unidades de canais do tempo.

[0011] Em outras modalidades relacionadas, o método pode compreender a varredura dentro do olho para determinar a fluorescência natural excitada e determinar desse modo pelo menos uma região de interesse no olho; e a amostragem de pelo menos uma região de interesse no olho ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem compreende a execução de pelo menos uma dentre uma medição de pelo menos uma região inteira de pelo menos uma região ou uma amostragem de diferentes localizações dentro de pelo menos uma região ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem de diferentes localizações compreende a iluminação de pelo me-nos um dentre um ponto, um plano ou um volume dentro de pelo menos uma região; em que a amostragem é para determinar uma intensidade da fluorescência e uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide dentro de pelo menos uma região amostrada. Por exemplo, o método pode compreender a execução de uma varredura axial (varredura z) em profundidade no olho para determinar a fluorescência natural excitada ao longo de cada ponto da varredura axial e determinar desse modo pelo menos uma localização de interesse no olho; e a execução de varreduras planar do olho ao usar a fonte de luz, em planos sucessivos perpendiculares à direção da varredura axial, para determinar uma intensidade da fluorescência e uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloi- de ligado à proteína amiloide em cada ponto de cada uma das varreduras planares. O método pode permitir uma busca em tempo real dentro do olho para a proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloi- dogênico.

[0012] Em outras modalidades relacionadas, o método pode compreender ainda iluminação do olho com luz de um comprimento de on- da apropriado para uma região de pico de um espectro de excitação fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho; e a detecção da luz recebida do olho de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de emissão fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho. O composto de ligação ao amiloide pode ser o Composto # 11. O espectro de excitação pode ter um pico de cerca de 470 nm, em que a iluminação do olho se dá a um comprimento de onda dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de excitação, e o espectro de emissão pode ter um pico de cerca de 580 nm, em que a detecção da luz recebida do olho se dá a um comprimento de onda dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de emissão.

[0013] Em uma outra modalidade de acordo com a invenção, é apresentado um dispositivo para detectar uma proteína amiloide em um olho de um mamífero. O dispositivo compreende uma fonte de luz configurada para emitir luz para iluminar o olho com pelo menos um dentre um comprimento de onda da luz, uma polarização da luz ou uma combinação destes, cada um deles apropriado para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à proteína amiloide, em que o composto de ligação ao amiloide é introduzido no olho e se liga especificamente à proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloidogê- nico; e uma unidade ótica configurada para receber a luz incluindo a fluorescência produzida como resultante da iluminação do olho e para determinar pelo menos uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao ami- loide ligado à proteína amiloide, em que a determinação permite a distinção da presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo.

[0014] Em outras modalidades relacionadas, a unidade ótica pode ser configurada para determinar a taxa de declínio do tempo para pelo menos um dentre: um composto de ligação ao amiloide do rotor molecular; um composto de ligação ao amiloide de vermelho Congo ou de um derivado de vermelho Congo; um composto de ligação ao amiloide de Chrysamine; um composto de ligação ao amiloide de um derivado de Chrysamine; composto de ligação ao amiloide de Chyrsamine G ou de um derivado de Chrysamine G; um composto de ligação ao amiloi- de de Thioflavin T ou de um derivado de Thioflavin T; e um composto de ligação ao amiloide de Thioflavin S ou de um derivado de Thioflavin S. A unidade ótica pode determinar uma intensidade de fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide. A unidade ótica pode ser confi-gurada para determinar uma quantidade do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide, com base em pelo menos uma dentre a intensidade e a taxa de declínio do tempo. A unidade ótica pode ser configurada para determinar um número médio de fótons com uma taxa específica de declínio em uma determinada área do olho. A fonte de luz pode compreender um laser pulsado. O dispositivo pode compreender ainda uma unidade de varredura ótica configurada para fazer a varredura da luz da fonte de luz sobre localizações no olho. A unidade de varredura ótica pode compreender uma lente objetiva montada em um estágio de translação e um scanner que compreende um espelho galvanométrico. A unidade de varredura ótica pode ser arranjada para amostrar pelo menos uma região do olho ao usar a ilumina-ção pela fonte de luz, em que a amostragem compreende a execução de pelo menos uma dentre uma medição de pelo menos uma região inteira de pelo menos uma região ou uma amostragem de diferentes localizações dentro de pelo menos uma região ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem de diferentes localizações compreende a iluminação de pelo menos um dentre um ponto, um plano ou um volume dentro da pelo menos uma região. A unidade de varreduraótica pode ser arranjada para amostrar diferentes localizações através de mais de uma região do olho. Em um exemplo, a unidade de varredura ótica pode ser arranjada para executar varreduras planares do olho ao usar a fonte de luz, em planos sucessivos ao longo de um eixo perpendicular que se estende em profundidade no olho. O dispositivo pode compreender ainda uma unidade fotodetectora para detectar a fluorescência emitida do olho, tal como pelo menos um dentre um fotodiodo, um fotomultiplicador, um dispositivo acoplado com carga (CCD), e de um dispositivo acoplado com carga intensificada (ICCD); por exemplo, um fotodetector de avalanche.

[0015] Em outras modalidades relacionadas, o dispositivo pode compreender ainda um módulo da contagem de único fóton de correlação temporal que recebe sinais elétricos da unidade fotodetectora indicativos de contagens de fótons da luz com fluorescência do olho. O dispositivo pode compreender pelo menos um módulo processador configurado para determinar a taxa de declínio do tempo da fluorescência com base em uma distribuição de contagens de fótons como uma função de unidades de canais do tempo. A unidade ótica pode ser configurada para distinguir o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide da autofluorescência de fundo de tecidos do olho e da autofluorescência de outras partículas não específicas, bem como de composto de ligação ao amiloide não ligado. A unidade ótica pode ser configurada para distinguir pelo menos uma dentre uma presença e uma quantidade de mais de um dos seguintes: o composto de ligação ao amiloide; o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide; e a proteína amiloide. A proteína amiloide pode compreender um agregado ou um agregado de proteína pré-amiloide da proteína. Por exemplo, a proteína amiloide pode compreender beta-amiloide. O distúrbio amiloidogênico pode compreender o mal de Alzheimer.

[0016] Em outras modalidades relacionadas, a unidade ótica pode ser configurada para distinguir pelo menos a presença da proteína amiloide com base somente na detecção da fluorescência. A unidade ótica pode ser configurada para determinar uma taxa de aplicação do composto de ligação ao amiloide ao olho, uma distribuição espacial do composto de ligação ao amiloide aplicado ao olho, e/ou um gradiente de concentração do composto de ligação ao amiloide em uma interface da córnea do olho, com base na fluorescência detectada. A unidade ótica pode ser configurada para determinar pelo menos uma dentre uma distribuição espacial e uma distribuição temporal do composto de ligação ao amiloide no humor aquoso do olho com base na fluorescência detectada. A unidade ótica pode ser configurada para determinar uma localização de uma interface ocular tal como uma cápsula da lente do olho com base em um aumento em um sinal fluorescente devido à fluorescência natural emitida dos tecidos do olho. A unidade ótica pode ser configurada para determinar uma localização de um supranú- cleo do olho com base em (i) uma distância afastada de uma estrutura anatômica específica tal como uma interface da cápsula da lente do olho ou da interface da córnea ou (ii) uma detecção de uma mudança (inclinação) na medição da intensidade. A unidade ótica pode ser configurada para determinar pelo menos uma dimensão de uma estrutura ou uma subestrutura anatômica do olho com base na excitação natural da fluorescência de pelo menos uma parte da estrutura ou subestrutu- ra anatômica, em que a determinação de pelo menos uma dimensão pode compreender pelo menos uma dentre a determinação de uma espessura da estrutura ou da subestrutura, a determinação de uma forma da estrutura ou da subestrutura, e a determinação de uma distância entre uma ou mais estruturas ou subestruturas do olho.

[0017] Em outras modalidades relacionadas, a unidade ótica pode ser configurada para fazer a varredura dentro do olho para determinar a fluorescência natural excitada e determinar desse modo pelo menos uma região de interesse no olho; e para amostrar pelo menos uma região de interesse no olho ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem compreende a execução de pelo menos uma dentre uma medição de pelo menos uma região inteira de pelo menos uma região ou uma amostragem de localizações diferentes dentro de pelo menos uma das regiões ao usar a iluminação pela fonte de luz, em que a amostragem das localizações diferentes compreende a iluminação de pelo menos um dentre um ponto, um plano ou um volume dentro de pelo menos uma região; em que a amostragem é para determinar uma intensidade de fluorescência e uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo com-posto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide dentro de pelo menos uma região amostrada. Por exemplo, a unidade ótica pode ser configurada para determinar a fluorescência natural excitada ao longo de cada ponto de uma varredura axial em profundidade (varredura z) no olho e determinar desse modo pelo menos uma localização de interesse no olho; e para determinar uma intensidade da fluorescência e uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide em cada ponto de cada varredura de um conjunto de varreduras planares (varreduras x-y) do olho ao usar a fonte de luz, em planos sucessivos perpendiculares à direção da varredura z. O dispo-sitivo pode ser configurado para permitir uma busca em tempo real dentro do olho para a proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloi- dogênico.

[0018] Em outras modalidades relacionadas, a fonte de luz pode ser configurada para emitir luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de excitação fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho, e a unidade ótica pode ser configurada para detectar a luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de emissão fluorescente para o composto de ligação ao amiloi- de ligado à proteína amiloide no olho. O composto de ligação ao ami- loide pode ser o Composto # 11. O espectro de excitação pode ter um pico de cerca de 470 nm, a fonte de luz é configurada para emitir a luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro da excitação, e o espectro de emissão pode ter um pico de cerca de 580 nm, e a unidade ótica é configurada para detectar a luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de emissão. A proteína amiloide pode ser indicativa de um distúrbio amiloidogênico.

[0019] Em uma outra modalidade de acordo com a invenção, é apresentado um método para diagnosticar um distúrbio amiloidogênico ou uma predisposição ao mesmo em um mamífero, por exemplo, um primata (tal como um ser humano), um canino, um felino, um ovino, um bovino, e outros ainda. O método compreende a iluminação de um olho do mamífero com uma fonte de luz que tem pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma propriedade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado a uma proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloidogênico, em que o composto de ligação ao amiloide é introduzido no olho e se ligando especificamente à proteína amiloide indicativa do distúrbio ami- loidogênico; a recepção da luz incluindo a fluorescência produzida como resultado da iluminação do olho; e a determinação de uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína ami- loide, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo. Um aumento na ligação do composto de ligação ao amiloide à proteína amiloide no olho em comparação a um nível normal de controle de ligação indica um diagnóstico de um distúrbio amiloidogênico, ou um risco de desenvolver um distúrbio amiloidogênico no mamífero. O distúrbio amiloidogê- nico pode ser o mal de Alzheimer.

[0020] Em uma outra modalidade de acordo com a invenção, é apresentado um método para identificar uma estrutura anatômica de um olho de um mamífero. O método compreende a iluminação do olho com uma fonte de luz que tem pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma propriedade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência natural na estrutura anatômica do olho; e a determinação de uma localização dentro do olho da maior mudança na intensidade da fluorescência natural produzida pela iluminação com a fonte de luz, em que a determinação permite identificar a estrutura anatômica com base na localização da maior mudança na intensidade da fluorescência natural. Em uma modalidade particular, um dispositivo aqui descrito de acordo com uma modalidade da invenção é usado em tal método.

[0021] Em outras modalidades relacionadas, a estrutura anatômica pode compreender uma estrutura anatômica do segmento anterior do olho. A identificação da estrutura anatômica pode compreender a determinação da localização de uma interface anatômica, tal como a determinação da localização de uma interface da cápsula da lente do olho com base na determinação de uma localização do maior aumento na intensidade da fluorescência natural. A identificação da estrutura anatômica pode compreender a determinação de pelo menos uma dentre uma espessura da córnea, uma forma da córnea, uma profun- didade do humor aquoso, uma forma da lente, uma espessura da lente, e uma espessura e/ou uma forma das subestruturas da lente (por exemplo, cápsula da lente, córtex, supranúcleo, núcleo) do olho com base na fluorescência natural produzida pela fonte de luz no olho; e pode compreender a determinação de uma distância intraocular entre pelo menos duas estruturas anatômicas do olho. O método pode compreender ainda o uso da fonte de luz para detectar no olho do mamífero uma proteína amiloide indicativa de um distúrbio amiloidogênico. O método pode compreender a iluminação do olho do mamífero com a fonte de luz, em que a fonte de luz também compreende pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma proprie-dade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloidogênico, em que o composto de ligação ao amiloide é introduzido no olho e se liga especificamente à proteína amiloide indicativa do distúrbio amiloidogê- nico; a recepção da luz incluindo a fluorescência produzida como resultado da iluminação do olho; e a determinação der uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloi- de, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo. A distinção da presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide pode compreender a distinção do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide da autofluorescência de fundo de tecidos do olho e da autofluorescência de outras partículas não específicas bem como de composto de ligação ao amiloide não ligado. O método pode permitir uma busca em tempo real dentro do olho para a proteína amiloide indi- cativa do distúrbio amiloidogênico. O método pode compreender ainda a iluminação do olho com luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de excitação fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho; e a detecção da luz recebida do olho de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de emissão fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho. O composto de ligação ao amiloide pode ser o Composto # 11. O espectro da excitação pode ter um pico de cerca de 470 nm, a iluminação do olho se dá a um comprimento de onda dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de excitação, e o espectro de emissão pode ter um pico de cerca de 580 nm, e a detecção da luz recebida do olho se dá a um comprimento de onda dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de emissão.

[0022] Em outras modalidades relacionadas, um método pode permitir a distinção entre pelo menos dois fluoróforos diferentes com espectros de fluorescência similares em um olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo, em que os espectros de fluorescência similares compreendem pelo menos um de uma sobreposição significativa em espectros de emissão e espectros de excitação. Um método pode compreender ainda a representação de uma distribuição de pelo menos uma dentre uma intensidade fluorescente e um declínio do tempo de vida de pelo menos um fluoróforo em duas dimensões. Além disso, um método pode compreender a determinação de um número de fótons ligados e um número de fótons não ligados em um olho com base em pelo menos um dentre uma intensidade fluorescente e um declínio do tempo de vida de pelo menos um fluoróforo. Um método pode compreender a representação em duas dimensões de uma distribuição da intensidade fluorescente e do declínio do tempo de vida do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína e do composto de ligação ao amiloide não ligado à proteína. A representação em du-asdimensões pode ser sincronizada com pelo menos um dentre um scanner e um laser. O método pode compreender ainda a determinação de um parâmetro pelo cálculo da média de uma intensidade fluorescente, associada com um declínio do tempo de vida específico, sobre uma área específica do olho. Além disso, o método pode compreender ainda o alinhamento de uma fonte de luz com o olho ao longo de um trajeto confocal para determinar um ponto de referência dentro do olho.

[0023] Em uma modalidade adicional de acordo com a invenção, é apresentado um método para determinar fluoróforos ligados em uma proteína em um tecido ocular. O método compreende a iluminação do tecido ocular com uma fonte de luz que tem pelo menos uma dentre uma propriedade de comprimento de onda, uma propriedade de polarização ou uma combinação das mesmas, cada uma delas apropriada para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à pro-teína, em que o composto de ligação ao amiloide é introduzido no tecido ocular e especificamente se liga à proteína; a recepção da luz incluindo a fluorescência produzida como resultado da iluminação do olho; e a determinação de uma taxa de declínio do tempo de fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína no tecido ocular com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] O acima exposto será aparente a partir da seguinte descrição mais particular de modalidades de exemplos da invenção, tal como ilustrado nos desenhos anexos nos quais os caracteres de referência idênticos referem-se às mesmas partes por todas as vistas diferen- tes. Os desenhos não são necessariamente em escala, por outro lado é dada ênfase de preferência às modalidades ilustrativas da presente invenção.

[0025] A Figura 1 é um diagrama esquemático de um sistema ótico de acordo com uma modalidade da invenção.

[0026] A Figura 2A é um gráfico da intensidade de fluorescência versus o deslocamento, medido durante o desempenho de um algoritmo para detectar uma interface da lente em uma varredura z do olho, e a Figura 2B é um gráfico da primeira derivada do gráfico da Figura 2A, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0027] As Figuras 3A e 3B são gráficos que ilustram a determinação do tempo de declínio da fluorescência de acordo com uma modalidade da invenção.

[0028] A Figura 4 é um diagrama esquemático que ilustra o uso da contagem de único fóton de correlação temporal, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0029] A Figura 5 mostra a estrutura do Composto # 11, que pode ser usado como um composto de ligação ao amiloide fluorescente de acordo com uma modalidade da invenção.

[0030] A Figura 6 é um histograma fluorescente do composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, obtido por um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção.

[0031] A Figura 7 é um diagrama de uma imagem do tempo de vida da fluorescência do Composto # 11 e de sua imagem de intensidade correspondente, obtidas de acordo com uma modalidade da invenção.

[0032] A Figura 8A é uma imagem do tempo de vida da fluorescência que o composto de ligação ao amiloide e o composto de ligação ao amiloide ligado ao peptídeo agregado de acordo com uma modalidade da invenção.

[0033] A Figura 8B é um diagrama que mostra os histogramas cor-respondentes do tempo de vida da fluorescência para composto de ligação ao amiloide e o composto de ligação ao amiloide ligado ao peptídeo agregado das imagens do tempo de vida da fluorescência da Figura 8A, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0034] A Figura 9A é uma curva da frequência dos fótons de uma taxa de declínio específica que pertence ao Composto # 11 de ligação ao amiloide fluorescente medida em coelhos em um estudo in vivo, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0035] A Figura 9B é um histograma de fluorescência que corresponde ao estudo da Figura 9A, de acordo com uma modalidade da invenção.

[0036] As Figuras 10A e 10B são curvas que mostram a frequência dos fótons de uma taxa de declínio específica que pertencem ao composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, medida de manhã para a linha basal e no final do dia após a dosagem durante um estudo de coelhos, em uma experiência de acordo com uma modalidade da invenção.

[0037] As Figuras 11A e 11B são duas imagens do tempo de vida da fluorescência tomadas na linha basal e depois do final do quarto dia de um estudo animal, em uma experiência de acordo com uma modalidade da invenção.

[0038] A Figura 12 é um espectro de emissão do composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, quando excitado a 470 nm, de acordo com uma modalidade da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] Segue uma descrição de modalidades de exemplos da invenção.

[0040] De acordo com uma modalidade da invenção, é apresentado um sistema e um método para a detecção não invasiva, precoce e confiável de uma proteína amiloide, que pode formar, ou ter se formado, como um agregado. Em algumas modalidades, a detecção da proteína amiloide e/ou do agregado são indicativos de um distúrbio ami- loidogênico. Os distúrbios amiloidogênicos incluem AD, AD Familial, AD esporádico, doença de Creutzfeld-Jakob, doença de Creutzfeld- Jakob variante, encefalopatias espongiformes, doenças de Prion (incluindo Kuru animal, encefalopatia espongiforme de bovinos, e outras prionopatias veterinárias), mal de Parkinson, mal de Huntington (e doenças de repetição de trinucleotídeo), esclerose lateral amiotrófica, Síndrome de Down (Trisomy 21), doença de Pick (Demência Frontotemporal), Doença de Corpos de Lewy, neurodegeneração com acumulação de ferro dn cérebro (Doença de Hallervorden-Spatz), sinu- cleinopatias (incluindo o mal de Parkinson, atrofia de múltiplos siste-mas,demência com Corpos de Lewy, e outras), doença de inclusão intranuclear neuronal, tauopatias (incluindo paralisia supranuclear progressiva, doença de Pick, degeneração corticobasal, demência frontotemporal hereditária (com ou sem parkinsonismo), um estado neuro- degenerativo pré-mórbido de Guam e complexo de esclerose lateral amiotrófica/parkinsonismo demência). Esses distúrbios podem ocorrer sozinhos ou em várias combinações. A análise da proteína amiloide também é útil para detectar Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis (TSEs), que são doenças mediadas por príons caracterizadas pelaneurodegeneração espongiforme fatal do cérebro e são associadas com sinais e sintomas neurológicos graves e fatais. As prionopatias de TSE incluem a doença de Creutzfeld-Jacob (CJD); nova variante, a doença de Creutzfeld-Jacob (nv-CJD); a síndrome de Gertsmann- Straussler-Scheinker; insônia familial fatal; Kuru; Síndrome de Alpers; Encefalopatia Espongiforme de Bovinos (BSE); Kuru animal; e doença de perda crônica (CWD).

[0041] Os métodos de diagnóstico podem ser realizados para teci- dos oculares de mamíferos, por exemplo, um primata (tal como um ser humano), caninos, felinos, ovinos, bovinos, e outros ainda. Os indivíduos (por exemplo, indivíduos humanos) a serem testados incluem aqueles suspeitos de sofrer de tais distúrbios (pacientes) ou que estão correndo o risco de desenvolver tais distúrbios. Por exemplo, os indivíduos com um histórico de AD de família ou outros fatores de risco, tais como idade avançada, são testados ao usar as técnicas aqui descritas. As pessoas que não são conhecidas como sofrendo ou correndo o risco de desenvolver tais distúrbios também podem ser testadas.

[0042] Os métodos de diagnóstico são executados ao colocar um tecido ocular de um mamífero (por exemplo, um indivíduo humano) em contato com um composto de fluoróforo que se liga a uma proteína amiloide, por exemplo, β-amiloide (Aβ). Por "proteína amiloide"entenda-se uma proteína ou um peptídeo que é associado com uma placa senil neurítica de AD, independente do fato se a proteína amiloide está agregada (total ou parcialmente). De preferência, a proteína amiloide é a proteína de precursor amiloide (APP) ou um produto de clivagem proteolítica (por exemplo, de ocorrência natural) de APP, tal como Aβ. Os produtos de clivagem de APP incluem Aβ1-40, Aβ2-40, Aβ1-42, assim como Aβ oxidada ou reticulada. Os compostos de fluoróforo também podem se ligar a variantes naturais de APP e Aβ, incluindo variantes de nucleotídeos polimórficos simples (SNP). Os compostos de fluoróforo podem, mas não precisam necessariamente, de ligar a um agregado de β-amiloide. Uma discussão sobre o fluoróforo que se liga a agregados de β-amiloide pode ser encontrada em Goldstein et al., "Cytosolic β-amylopid deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimers’ disease", Lancet 2003; 361: 1258-65, cuja citação integral é aqui incorporada a título de referência.

[0043] Foi verificado que os agregados que contêm Aβ, a proteína patogênica que se acumula no AD, formam cataratas supranuclea- res/corticais profundas dentro das lentes, bem como nos cérebros de pacientes do mal de Alzheimer. Depósitos de Aβ são coletados como agregados intracelulares dentro do citosol de células de fibras corticais da lente. Foi mostrado que a Aβ da lente existe como espécies mono- mérica e dimérica aparentes solúveis dentro da lente humana de um adulto a níveis comparáveis àqueles no cérebro de um adulto normal. Uma proporção substancial de Aβ da lente é ligada a outras proteínas da lente, incluindo proteína estrutural de lente αB-cristalina abundante. A Aβ e a αB-cristalina exibiram uma afinidade de ligação intermolecu- lar nanomolar in vitro e coimunoprecipitaram de homogenatos de lentes humanas tratados com ácido fórmico, indicando uma forte associação de proteína-proteína. A Aβ1-42 do ser humano promove a agregação de proteína da lente com um teor de β-folha aumentado. A agregação de proteína da lente potencializada com A β foi bloqueada pela quelação de metal ou removedores de espécies de oxigênio reativas, demonstrando desse modo que as reações redox de metaloproteinas estão envolvidas nesse processo de agregação de proteína da lente e formação de catarata supranuclear no AD.

[0044] Os dados indicam que ocorre uma interação patológica entre Aβ e as proteínas da lente. Além disso, essas reações mediadas por Aβ na lente indicam que espécies de Aβ amiloidogênicas, em particular a espécie de Aβ1-42 que está envolvida proeminentemente na patofisiologia do AD, eram potentes peptídeos pró-oxidantes que promoveram a agregação da proteína da lente e a formação de catarata supranuclear/cortical. Uma informação adicional a respeito da agregação da proteína e da formação de catarata pode ser encontrada na Patente U.S. n°. 7.107.092 de Goldstein et al., cujos ensinamentos integrais são aqui incorporados a título de referência.

[0045] De acordo com uma modalidade da invenção, um aumento na ligação do composto de fluoróforo a um tecido ocular, por exemplo, um compartimento intracelular de uma célula da lente, em comparação a um nível de controle normal de ligação, indica que o mamífero está sofrendo de ou correndo o risco de desenvolver o AD. Tal como aqui usado, um "fluoróforo"ou "composto de fluoróforo" é qualquer substância que tem características fluorescentes desejáveis quando iluminada com uma luz de uma determinada propriedade de comprimento de onda e/ou de polarização. De preferência, nas técnicas aqui discutidas, o fluoróforo é "um composto de ligação ao amiloide" que, tal como aqui usado, significa um composto que se liga a uma proteína ami- loide, em que "a proteína amiloide"é tal como definido acima. Tal fluo- róforo pode ser um composto de ligação ao amiloide que apresente fluorescência naturalmente quando exposto a uma luz de uma determinada propriedade de comprimento de onda e/ou de polarização. Alternativa ou adicionalmente, o fluoróforo pode ser um composto que inclua uma porção de etiqueta fluorescente em combinação com uma porção de composto de ligação ao amiloide, onde a porção de composto de ligação ao amiloide em geral não exibe as características desejadas de fluorescência na ausência da etiqueta fluorescente. Em uma modalidade, o fluoróforo tem as seguintes propriedades: exibe uma boa solubilidade em qualquer meio em que o fluoróforo for usado; penetra na córnea do olho; e se liga à proteína amiloide. O fluoróforo pode ter características fluorescentes diferentes quando ligado ao ami- loide e quando não ligado. Por exemplo, a intensidade espectral e a taxa de declínio do tempo da fluorescência do fluoróforo podem mudar quando o fluoróforo for ligado ao amiloide em comparação ao caso quando não é ligado. O Composto # 11 (discutido mais adiante com relação à Figura 5) é tal fluoróforo, em que a taxa de declínio do tempo muda quando o composto é ligado ao amiloide em comparação ao caso quando não é ligado. Uma discussão adicional sobre tais propriedades dos fluoróforos, em particular do Composto # 11, pode ser en- contrada em J. Sutharsan et al., “Rational Design of Amiloide Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif,” ChemMedChem 2010, 5, 56-60, cuja citação integral é aqui incorporada a título de referência. De preferência, o composto de fluoróforo se liga a Aβ1-42 ou um outro fragmento de uma proteína de precursor amiloide (APP). Os compostos do fluoróforo podem se ligar de preferência às proteínas amiloides em comparação a outras proteínas contendo folhas β-plissadas. Tal como observado acima, o composto de fluoróforo pode conter uma sonda fluorescente ou pode agir como um fluoróforo sem a adição de uma sonda fluorescente. Por exemplo, a sonda fluorescente ou fluoró- foro pode ser um composto de Chrysamine ou derivado de Chrysami- ne tal como {(trans, trans), -1-bromo-2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4- hidróxi)estiril benzeno (BSB)}. Em uma modalidade particular, o fluoró- foro pode ser o Composto # 11 (discutido mais adiante com relação à Figura 5), que é um composto fluorescente projetado de acordo com o motivo do rotor molecular. De acordo com uma modalidade da invenção, o composto de ligação ao amiloide pode ser um rotor molecular, Chrysamine e/ou um derivado de Chrysamine. Os fluoróforos exempli- ficadores são discutidos na Patente U.S. n°. 6.849.249 (aqui incorporada a título de referência em sua totalidade), e incluem Chrysamine ou compostos derivados de Chrysamine tais como {(trans, trans), 1- bromo-2,5-bis-(3-hydroxicarbonil-4-hidróxi)estiril benzeno (BSB)}. Chrysamine G e seus derivados são conhecidos no estado da técnica (por exemplo, Patentes U.S. números 6.133.259; 6.168.776; 6,114,175). Esses compostos se ligam aos peptídeos de Aβ, mas não são fluorescentes. Os métodos de diagnóstico podem utilizar um derivado de ligação ao amiloide fluorescente de Chrysamine G para detectar peptídeos de Aβ no olho. Sondas fluorescentes biodisponíveis também podem ser usadas. Tais fluoróforos e sondas são comercialmente disponíveis, por exemplo, junto à Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, USA. Alguns corantes, por exemplo, X-34 ou {(trans, trans), 1-bromo- 2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4-hidróxi)estiril benzeno (BSB)} (Styren et al., 2000, J. Histochem. 48:1223-1232; Link et al., 2001, Neurobiol. Aging 22:217-226; e Skrovonsksy et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97:7609-7614), foram usados para analisar o tecido do cérebro (mas não o tecido do olho). Essas sondas emitem a luz na faixa azul-verde, desse modo o nível de fluorescência, que é diagnosticamente relevante, excede a quantidade de autofluorescência de lente humana na faixa azul-verde. Outros compostos úteis incluem um agente de metóxi detectável tal como Me-X04 (1,4-bis (4'-hidroxiestiril)-2- metoxibenzeno). Outros agentes de metóxi incluem, por exemplo, Chrysamine ou compostos derivados de Chrysamine tais como {(trans, trans), 1-bromo-2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4-hydroxy)estiril benzeno (BSB)}. Tais compostos são descritos em Mathis et al., Curr. Pharm. Des., vol. 10(13):1469-93 (2004); Patentes U.S. números 6.417.178; 6.168.776; 6.133.259; e 6.114.175, cada uma das quais é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Outras sondas de ligação ao amiloide tais como tioflavina T, tioflavina S, corante vermelho Congo, derivados dos elementos acima, ou outros derivados, também podem ser usadas. Mais informações a respeito dos compostos etiquetados de maneira detectável podem ser encontradas na Patente U.S. n°. 7.297.326 de Goldstein et al., cujos ensinamentos integrais são aqui incorporados a título de referência. Além disso, outras informações a respeito do acima exposto podem ser encontradas na Publicação de Pedido de Patente U.S. n°. 2008/0088795, na Publicação de Pedido de Patente U.S. n°. 2009/0041666, e n Patente U.S. n°. 7.107.092, em que os ensinamentos integrais dos pedidos de patente e das patentes são aqui incorporados a título de referência. Em uma modalidade particular, o fluoróforo pode ser o Composto # 11 (discutido mais adiante com relação à Figura 5).

[0046] Outras informações a respeito dos métodos relacionados, dos distúrbios amiloidogênicos, das proteínas amiloide e dos compostos de fluoróforo podem ser encontradas na Patente U.S. n°. 7.297.326 de Goldstein et al., na Patente U.S. n° 7.107.092 de Goldstein et al., e na Patente U.S. n°. 6.849.249 de Goldstein et al., em que os ensinamentos integrais das patentes são aqui incorporados a título de referência. Além disso, outras informações a respeito do acima exposto podem ser encontradas na Publicação de Pedido de Patente U.S. n°. 2008/0088795 e na Publicação de Pedido de Patente U.S. n°. 2009/0041666, em que os ensinamentos integrais dos pedidos são aqui incorporados a título de referência. Os métodos aqui apresentados também podem compreender a comparação de fluorescência da lente do paciente de teste após a administração do fluoróforo a um controle apropriado. Os exemplos de um controle apropriado incluem a autofluorescência endógena de um indivíduo (ou uma população de indivíduos) sem AD ou até o nível de fluorescência de um indivíduo sem AD (ou uma população de indivíduos sem AD) após a administração do fluoróforo.

[0048] De acordo com uma modalidade da invenção, foi verificado que uma quantidade da proteína amiloide que está presente no olho, com base nas técnicas aqui apresentadas, pode ser comparada com as análises estatísticas que indicam a quantidade de proteína amiloide que significa uma condição de doença, ou de risco de desenvolver uma condição de doença. Sem desejar ficar limitado pela teoria, acredita-se que os adultos saudáveis têm tipicamente pelo menos algum nível mínimo de proteína amiloide na região do supranúcleo da lente do olho. As técnicas aqui apresentadas, portanto, podem ser usadas para determinar se um indivíduo tem uma quantidade de proteína ami- loide no olho que é um nível estatisticamente significativo acima de um nível de controle normal da proteína amiloide no olho. Um estudo da deposição de proteína amiloide nos olhos das pessoas com mal de Alzheimer pode ser encontrado em Goldstein et al., “Cytosolic β- amiloide deposition and supranuclear cataracts in lenses from people with Alzheimer’s disease,” Lancet 2003; 361: 1258-65, cuja citação integral é aqui incorporada a título de referência.

[0049] Tal como discutido mais adiante com relação ao Experimento # 1, foi mostrado que uma modalidade de acordo com a invenção pode distinguir entre o composto de ligação ao amiloide quando ligado à proteína amiloide, ao contrário de um composto de ligação ao amiloide não ligado. Em particular, os resultados no Experimento # 1 encontraram uma taxa de declínio do tempo de, por exemplo, 1,4 na- nossegundo para o composto de ligação ao amiloide fluorescente não ligado, Composto # 11; e uma taxa de declínio do tempo de, por exemplo, 2,25 nanossegundos para o composto de ligação ao amiloide quando ligado à proteína amiloide - aqui, o peptídeo beta-amiloide (Aβ) agregado. De acordo com uma modalidade da invenção, a detecção do composto de ligação ao amiloide não ligado, Composto # 11, pode ser indicada por taxas de declínio do tempo de 1,4 nanossegundo mais ou menos 0,3 nanossegundo, ao passo que a detecção do composto de ligação ao amiloide ligado, Composto # 11, ligado à proteína amiloide pode ser indicada por taxas de declínio do tempo de 2,25 na- nossegundos mais ou menos 0,3 nanossegundo. Outras taxas de declínio e níveis de confiança para disti8nguir o composto de ligação ao amiloide da proteína amiloide podem ser usados.

[0050] De acordo com uma modalidade da invenção, é apresentado um método de formação de imagem de fluorescência e um dispositivo para a detecção de proteínas beta-amiloide (Aβ) etiquetadas com composto de ligação ao amiloide na lente do olho, e seus usos. Em um aspecto, um dispositivo aqui provido é um dispositivo de formação de imagens ótico que emprega um mecanismo de varredura de fluores- cência combinado com a espectroscopia do tempo de vida para permitir a detecção de moléculas fluorescentes e para fornecer as informações sobre a sua distribuição espacial, também na natureza de seus arredores.

[0051] De acordo com uma modalidade da invenção, o dispositivo, por exemplo, um sistema fluorescente de varredura ótica multifuncional, permite a identificação das estruturas anatômicas dos segmentos anteriores do olho com base em sua excitação de fluorescência natural; e pode fornecer informações espaciais nos segmentos anteriores do olho, tais como a espessura da córnea e a forma da lente, e pode fornecer distâncias intraoculares.

[0052] Além disso, um sistema de varredura ótica multifuncional de acordo com uma modalidade da invenção provê uma ferramenta de investigação farmacocinética ocular in vivo para compostos de ligação ao amiloide fluorescentes exógenos no olho, sem ficar limitado à proteína amiloide. Por exemplo, o sistema pode determinar a concentração do gradiente de compostos de ligação ao amiloide nas interfaces corneais, tal como a interface da película de lágrima/epitelial da córnea. Além disso, o sistema pode determinar as informações espacial e temporal a respeito da biodisponibilidade de compostos de ligação ao ami- loide no humor aquoso.

[0053] Além disso, um sistema de varredura ótica multifuncional de acordo com uma modalidade da invenção permite a detecção de moléculas fluorescentes e a diferenciação entre elas com base em suas assinaturas óticas, tal como o tempo de declínio da fluorescência (T). O sistema permite a detecção do composto de ligação ao amiloide fluorescente etiquetado ligado a Aβ na lente do olho; a detecção da fluorescência natural no olho; e a discriminação entre (i) o composto de ligação ao amiloide fluorescente etiquetado ligado a Aβ na lente do olho e (ii) a fluorescência natural no olho. Tal como aqui usado, "fluo- rescência natural" significa a fluorescência natural no olho que pode ocorrer independentemente de um agente de formação de imagem introduzido.

[0054] A Figura 1 é um diagrama esquemático de um dispositivo ótico de acordo com uma modalidade da invenção. A excitação da fluorescência é provida por um feixe de laser pulsado que é focalizado por uma lente de objetiva de elevada abertura numérica 101 no olho. A fluorescência é detectada ao usar uma técnica de contagem de único fóton de correlação temporal (TCSPC) através de uma configuração confocal com um detector de fotodiodo de avalanche rápido (APD) 102. A TCSPC é executada ao usar um pulso de luz curto para excitar a amostra (olho) 103 repetidas vezes, e ao registrar a emissão de fluorescência subsequente como uma função do tempo. Isto ocorre geralmente na faixa de tempo de nanossegundos.

[0055] Na modalidade da Figura 1, a identificação das estruturas anatômicas da lente é executada ao fazer a varredura da lente de objetiva 101 na linha central usando um estágio de translação 104. O sinalé medido em cada ponto ao longo da varredura a fim de revelar as estruturas anatômicas dos segmentos anteriores tais como a córnea, a cápsula da lente e a região do supranúcleo da lente. Além disso, a varredura fornece informações sobre a farmacocinética dos compostos de ligação ao amiloide exógenos aplicados ao olho. Tais informações fornecemnão somente as informações espaciais e temporais do composto de ligação ao amiloide, mas também a concentração do composto de ligação ao amiloide que penetra através da córnea e rumo ao humor aquoso.

[0056] Na modalidade da Figura 1, uma vez que a localização de interesse no olho é conhecida a partir da fluorescência natural excitada medida em cada ponto ao longo da varredura axial, uma outra varreduraé executada em um plano (xy) perpendicular ao eixo ótico ao usar um jogo de espelhos galvanométricos 105. Para assegurar a alocação das curvas de declínio da fluorescência medida ao sítio correspondente da varredura bidimensional, a varredura ajustada de galvanômetro é sincronizada com os pulsos laser e a fotodetecção para a contagem de fótons individuais correlacionada com o tempo. Tal varredura em xy revela uma imagem com informações do tempo de declínio da fluorescência para cada sítio (pixel). Na modalidade da Figura 1, um ou mais módulos podem ser implementados ao usar módulos de hardware especializados dedicados e/ou ao usar um computador de finalidades gerais especialmente programado para executar a funcionalidade dos módulos, incluindo, por exemplo, o módulo Frame Grabber, o módulo de TCSPC, o módulo do cálculo de T e o módulo de controle de scan-ner. Um computador de finalidades gerais e/ou um ou mais módulos de hardware especializados podem receber dados uns dos outros através de cabos de dados e de portas de dados apropriados para a funcionalidade dos módulos.

[0057] Na modalidade da Figura 1, para a contagem de fótons individuais correlacionada com o tempo, a curva de declínio da autofluo- rescência é registrada para cada localização escaneada da lente, e desse modo uma representação bidimensional das distribuições dos fluoróforos pode ser avaliada e analisada com base em seu tempo de declínio da fluorescência bem como da sua intensidade. A imagem dos tempos de declínio calculados pode ser codificada por cores falsas e pode ser sobreposta na imagem da intensidade para uma melhor interpretação clínica. Uma vez que o tempo de declínio da fluorescência é uma característica para cada molécula de fluorescência, é possível determinar e separar os fluoróforos (composto de ligação ao amiloide da fluorescência natural da lente) que são excitados no volume da amostra. Ao combinar as medições da intensidade de fluorescência e do tempo de vida, uma dimensão extra de informação é obtida para discriminar entre várias etiquetas fluorescentes.

[0058] Tal como aqui discutido, um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção pode compreender uma fonte de luz. Tal como aqui empregado, uma "fonte de luz" pode ser qualquer fonte de luz que pode ser configurada para emitir luz para iluminar o olho com pelo menos um de um comprimento de onda e uma polarização da luz apropriados para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à proteína amiloide, de uma forma tal que a taxa de declínio do tempo da fluorescência pode ser determinada subsequentemente com base na fluorescência que é recebida como resultado da iluminação.

[0059] Em uma modalidade de acordo com a invenção, a fonte de luz pode ser configurada para emitir luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de excitação fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho, e a unidade ótica pode ser configurada para detectar uma luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de emissão fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho. Por exemplo, onde o composto de ligação ao amiloide é o Composto # 11, o espectro de excitação tem um pico de cerca de 470 nm, e a fonte de luz pode ser configurada para emitir uma luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico de cerca de 470 nm, tal como dentro de mais ou menos 5 nm, mais ou menos 10 nm, mais ou menos 15 nm ou mais ou menos 20 nm de 470 nm. Além disso, o espectro de emissão para o Composto # 11 tem um pico de cerca de 580 nm, e a unidade ótica pode ser configurada para detectar uma luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico de cerca de 580 nm, tal como dentro de mais ou menos 5 nm, mais ou menos 10 nm, mais ou menos 15 nm, ou mais ou menos 20 nm de 580 nm. De modo geral, há tipicamente um deslocamen- to entre o pico do espectro de excitação e o pico do espectro de emissão de um composto fluorescente. De acordo com uma modalidade da invenção, é útil o uso de um composto em que o pico do espectro de emissão é deslocado de maneira significativa em relação ao espectro de excitação, a fim de permitir a distinção entre a fluorescência do fluo- róforo ligado e a autofluorescência natural do olho. Por exemplo, um espectro de emissão que tem um pico de mais de cerca de 500 nm é vantajoso para a distinção da autofluorescência natural do olho. O Composto # 11 prova ser útil para tal finalidade, o qual tem um espectro de emissão com um pico de cerca de 580 nm, deslocado de maneira significativa do espectro de excitação com um pico de cerca de 470 nm. A Figura 12 é um espectro de emissão do composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, quando excitado a 470 nm, de acordo com uma modalidade da invenção. Outros espectros de excitação e de emissão que podem ser usados serão aparentes aos elementos versados na técnica com base no acima exposto.

[0060] De acordo com uma modalidade da invenção, o dispositivo pode usar uma "unidade ótica"que, tal como aqui usado, significa qualquer unidade que pode ser configurada para receber a luz incluindo a fluorescência produzida como resultado da iluminação do olho e para determinar pelo menos uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide, em que a determinação permite distinguir a presença do composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo. Por exemplo, com referência à Figura 1, a unidade ótica pode incluir um ou mais dentre a lente de objetiva 101, o estágio de transla-ção104, o scanner 105, o fotodetector 102, uma câmera, um LED, as várias lentes, aberturas, separadores de feixes, filtros dicroicos, módulo de cálculo do declínio do tempo, módulo capturador de quadros, módulo de TCSPC, e módulo de controle do scanner. As partes da funcionalidade da unidade ótica podem ser implementadas por um computador de finalidades gerais especialmente programado, ou por um hardware dedicado, por exemplo, para executar cálculos do declínio do tempo.

[0061] De acordo com uma modalidade da invenção, a funcionalidade da lente de objetiva 101, do estágio de translação 104 e do scanner com espelhos galvanométrico 105 pode ser executada ao usar uma variedade de diferentes dispositivos possíveis, em vez de ou além desses componentes. Coletivamente, a funcionalidade do estágio de translação, da lente de objetiva e do scanner com espelhos galva- nométricos é aqui indicada como sendo implementada por uma "unidade de varredura ótica", que pode se referir a qualquer dispositivo ou coleção de dispositivos que executam a função equivalente de varredura de um feixe de luz em regiões desejadas de interesse no olho, inclusive para a finalidade de determinar pontos de referência dentro do olho e para a finalidade de analisar fluoróforos dentro do olho. Tal unidade de varredura ótica pode executar as funções de induzir o mo-vimento de translação de uma lente, ou o movimento da lente ao longo de um trajeto multidimensional de movimento; e pode executar as funções de fazer a varredura da luz sobre regiões de interesse, por exemplo, executar uma varredura de ponto, planar, volumétrica ou outro tipo de varredura do feixe de luz sobre regiões de interesse, por exemplo, ao induzir o movimento em um espelho ou um outro dispositivoótico no trajeto ótico de um feixe de luz.

[0062] Na modalidade da Figura 1, o uso de um arranjo confocal significa que um agente de dilatação não precisa ser usado, tal como pode ser requerido nos sistemas em que a luz precisa penetrar no olho fora do eixo, por exemplo, a um ângulo de 45 graus. Isto é de conveniência para os pacientes.

[0063] A Figura 2A é um gráfico da intensidade de fluorescência natgural versus o deslocamento, medida durante o desempenho de um algoritmo para detectar uma interface da lente em uma varredura ao longo do trajeto de iluminação (varredura z) do olho, e a Figura 2B é um gráfico da primeira derivada do gráfico da Figura 2A, de acordo com uma modalidade da invenção. A base lógica para o algoritmo é a suposição que a localização onde o aumento natural do valor da intensidade da fluorescência é o maior por unidade de distância da varreduraé um indicador razoável de onde o limite da lente começa. Em particular, o algoritmo determina a distância do ponto de partida da varredura z que corresponde ao ponto de inflexão máxima na intensidade de fluorescência. Em uma modalidade, o algoritmo prossegue tal como segue, e pode funcionar em tempo real: 1) Coleta de dados em uma disposição bidimensional onde a primeira dimensão (variável independente) é a distância do ponto de partida, isto é, a distância da varredura, tal como medida através de um codificador rotativo, e a segunda dimensão (variável dependente) é a intensidade da fluorescência tal como medida através do detector de fótons (APD). 2) Convolução da disposição de dados com um perfil médio móvel de cinco pontos para moderar os valores da intensidade, isto é, remover o ruído de alta frequência que interfere na diferenciação. 3) Convolução da disposição de dados moderados com perfil diferencial para obter a primeira derivada da disposição da intensidade. 4) Busca da disposição da primeira derivada da intensidade para o valor de intensidade diferencial máxima. Este é o ponto de inflexão máxima. Determinação da distância de varredura correspondente.

[0064] Tal como mostrado nas Figuras 2A e 2B, uma localização da cápsula da lente pode ser determinada ao usar a técnica acima. Além disso, as localizações de, e as distâncias entre, as estruturas anatômicas tais como a córnea, o humor aquoso e a lente também podem ser determinadas. Um deslocamento pode ser aplicado para especificar uma distância de uma medição de uma referência específica ao longo de qualquer eixo.

[0065] As Figuras 3A e 3B são gráficos que ilustram a determinação do tempo de declínio da fluorescência de acordo com uma modalidade da invenção. O tempo de declínio da fluorescência pode ser calculado por um exponencial de ajuste simples ou duplo (Figura 3A) para uma curva da intensidade (aqui, em fótons/s), versus o tempo (aqui, em nanossegundos). Também pode ser obtido por um ajuste linear para a inclinação (Figura 3B). Tal como aqui usado, uma "taxa de declínio do tempo da fluorescência"significa uma constante de tempo característica de uma curva de declínio da intensidade da fluorescên-cia; por exemplo, uma constante de tempo exponencial ou uma inclinação ajustada à curva de declínio da fluorescência.

[0066] Os algoritmos acima das Figuras 2A, 2B e 3A, 3B podem, por exemplo, ser implementados ao usar módulos de hardware especializados dedicados e/ou ao usar um computador de finalidades gerais especialmente programado para executar os algoritmos acima. Tais módulos podem, por exemplo, usar ou receber dados do módulo de TCSPC, do módulo de captura de quadros, do módulo de cálculo de T da modalidade da Figura 1.

[0067] A Figura 4 é um diagrama esquemático que ilustra o uso da contagem de único fóton de correlação temporal, de acordo com uma modalidade da invenção. Uma fonte de luz pulsada 406 excita a amostra 403 de modo repetitivo. A emissão da amostra é observada por um fotodiodo de avalanche da unidade do detector (APD) 402, ao passo que os flashes da excitação são detectados por um módulo de sincro nização (SYNC) 407. Um discriminador de fração constante (CFD) 408 responde somente ao primeiro fóton detectado - independente da sua amplitude - do detector 402. Esse primeiro fóton da emissão da amostraé o sinal de parada para o Conversor de Tempo em Amplitude (TAC) 409. Os pulsos de excitação ativam os sinais de partida. O Analisador de Múltiplos Canais (MCA) 410 registra os sinais de partida- parada repetitivos dos eventos de um só fóton do TAC 409, para gerar um histograma das contagens de fótons como uma função de unidades de canais do tempo. O tempo de vida é calculado a partir desse histograma. O MCA pode ser implementado ao usar um módulo de hardware especializado dedicado e/ou ao usar um computador de finalidades gerais especialmente programado para executar tais tarefas; e pode estar em transmissão de dados com um computador de finalidades gerais especialmente programado.

[0068] Em uma modalidade de acordo com a invenção, um sistema que compreende um composto de ligação ao amiloide fluorescente e um dispositivo é destinado a ajudar no diagnóstico do mal de Alzheimer provável nos pacientes que têm os sintomas e os sinais consistentes com a demência do tipo de Alzheimer depois de um exame clínico adequado. O dispositivo emprega um mecanismo de varredura confocal combinado com uma técnica de espectroscopia do tempo de vida da fluorescência. O dispositivo permite a identificação das estruturasanatômicas dos segmentos anteriores do olho e a discriminação dos fluoróforos fluorescentes com base em suas assinaturas óticas.

[0069] A Figura 5 mostra a estrutura do Composto # 11, que pode ser usado como um composto de ligação ao amiloide fluorescente de acordo com uma modalidade da invenção. O Composto # 11 é um composto fluorescente projetado de acordo com o motivo do rotor molecular, e foi mostrado que se liga ao peptídeo de beta-amiloide (Aβ) agregado. Isto, combinado com a fluorescência nativo, sugere que o Composto # 11 é um bom candidato para um marcador in vivo para os agregados de Aβ que foram encontrados no tecido da lente de pacientes de Alzheimer. O nome químico para o Composto # 11 é [acrilato de (E)-2-(2-(2-metoxietóxi)etóxi)etil-2-ciano-3-(6-(piperidin-1-il)naftalen-2- ila)]. Outras informações a respeito do Composto # 11 podem ser encontradas em J. Sutharsan et al., “Rational Design of Amyloid Binding Agents Based on the Molecular Rotor Motif,” ChemMedChem 2010, 5, 56-60, cuja citação integral é aqui incorporada a título de referência. O Composto # 11 foi formulado como uma pomada oftálmica (Pomada Oftálmica do Composto # 11) que contém cerca de 5 mg/g do Composto # , 80% de petrolato e 20% de óleo mineral.

[0070] De acordo com uma modalidade da invenção, um composto de ligação ao amiloide de fluoróforo pode ser aplicado a um olho de um indivíduo a ser testado em qualquer uma de uma variedade de possíveis formas diferentes. Por exemplo, o composto de ligação ao amiloide de fluoróforo pode ser aplicado como uma pomada, uma solução, ao usar uma lente de contato, por meio de injeção, na forma líquida, na forma sólida, por meio de iontoforese, ou por outras técnicas.

[0071] Um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção é projetado para detectar a fluorescência no domínio de tempo com alta sensibilidade e alta velocidade em um esquema de detecção confocal. O dispositivo tem duas funcionalidades principais: 1) aplicação e varredura do feixe ótico às localizações nos segmentos anteriores do olho, tal como o supranúcleo da lente, ao usar um estágio de translação e um scanner galvanométrico; e 2) identificação e discriminação dos fluoróforos fluorescentes com base na medição do tempo de vida da fluorescência.

[0072] Um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção identifica estruturas anatômicas oculares ao usar uma varredura axial ou uma varredura z, a qual é baseada na excitação a laser da fluorescência natural de tecidos oculares ao longo do eixo ótico do olho para obter a informação sobre as distâncias intraoculares. A varredura z revela uma curva da intensidade de fluorescência natural como uma função da profundidade que fornece informações sobre a localização onde as medições do tempo de vida devem ser executadas. A localização visada pode, por exemplo, ser o supranúcleo da lente no olho humano. A varredura pode ser completada em segundos, por exemplo, em 2 segundos ou menos, tal como em cerca de 0,2 segundo, 0,3 segundo, 0,4 segundo, 0,5 segundo, 0,6 segundo, 0,7 segundo, 0,8 segundo, 0.9 segundo, 1,0 segundo, 1,2 segundos, 1,4 segundos, 1,6 segundos, 1,8 segundos ou 2,0 segundos para reduzir artefatos de movimento do olho, ou uma outra quantidade de tempo apropriada para reduzir artefatos de movimento do olho. Alternativa ou adicionalmente, o dispositivo pode ser usado em conjunto com o rastrea- mento do movimento do olho para reduzir os artefatos de movimento. Piezo acionadores, motores lineares e outros dispositivos de movimento controlado podem ser usados para tal finalidade. A varredura axial também pode permitir a medição da concentração do gradiente do composto de ligação ao amiloide em interfaces oculares tais como a película de lágrima/ interface epitelial da córnea, bem como a biodis- ponibilidade do composto de ligação ao amiloide no humor aquoso.

[0073] Um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção identifica moléculas fluorescentes ao executar uma varredura xy, em que a amostra é escaneada em quadriculação com um dispositivo acionado por galvanômetro. O tempo de vida da fluorescência é registrado para cada localização escaneada da lente humana e desse modo uma representação bidimensional da distribuição de fluoróforo pode ser avaliada e analisada com base na taxa de declínio da fluorescência, bem como da intensidade. Uma representação bidimensional da distribuição de fluoróforo com base no tempo de vida do declínio, que também pode, mas não precisa necessariamente, incluir uma representação bidimensional com base na intensidade da fluorescência, é aqui indicada como uma "imagem do tempo de vida da fluorescência".

[0074] De acordo com uma modalidade da invenção, as medições do tempo de vida da fluorescência são baseadas na excitação repetidas vezes do olho com pulsos laser curtos e no registro da emissão de fluorescência subsequente como uma função do tempo. Uma vez que o tempo de declínio da fluorescência é uma característica de cada molécula de fluorescência, é possível determinar e separar o composto de ligação ao amiloide da fluorescência natural da lente que está sendo excitada no volume da amostra.

[0075] Em particular, em uma modalidade de acordo com a invenção, as medições do tempo de vida da fluorescência podem ser obtidas por uma técnica de contagem de único fóton de correlação temporal (TCSPC). A aquisição de dados de velocidade e de varredura pode ser sincronizada e executada, por exemplo, em 0,5 segundo para reduzir todos os artefatos de movimento do olho, ou uma outra quantidade de tempo apropriada para reduzir os artefatos de movimento do olho. O princípio da TCSPC é baseado na detecção de único fóton emitido por um laser pulsado e o registro dos tempos de detecção dos fótons individuais que chegam. Quando um fóton é detectado, o tempo do pulso do detector correspondente é medido. Os eventos são cole-tados na memória para muitos fótons detectados. Os tempos de vida de declínio da fluorescência podem ser calculados ao construir um histograma das medições de tempo individuais. Um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção, operando no modo de TCSPC, pode obter, por exemplo, taxas de contagens de cerca de 107fótons por segundo. Portanto, 104fótons podem ser coletados em menos de 1 ms. Tais taxas de contagem são importantes onde a alta velocidade é necessária para adquirir a informação de varredura rápida na lente do olho humano. Outras taxas de contagem podem ser usadas.

[0076] Um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção pode ser projetado para obter a informação específica de uma localização particular na lente do olho humano. Os exemplos de tais localizações incluem o supranúcleo, a cápsula da lente, o núcleo, a córnea e o humor aquoso.

[0077] Isso é obtido pelo alinhamento preciso do indivíduo, pelo conhecimento da anatomia ocular do olho, e pela obtenção da informação dos fluoróforos em uma área escaneada na lente com alta especificidade e alta sensibilidade. Um diagrama esquemático de uma plataforma ótica de acordo com uma modalidade da invenção é mostrado na Figura 1 (também discutida também). A excitação da fluorescência é obtida por um feixe de laser pulsado que é focalizado por uma lente de objetiva de abertura numérica elevada 101 no olho 103. O laser pode, por exemplo, ser pulsado a uma taxa da repetição de cerca de 40 MHz e produzir pulsos de cerca de 200 picossegundos de largura, embora outras taxas de repetição e larguras de pulso possam ser usadas. Por exemplo, taxas de repetição tão baixas quanto cerca de 1 MHz até cerca de 240 MHz podem ser usadas, e larguras de pulso de cerca de 40 picossegundos a cerca de 400 picossegundos podem ser usadas. O feixe ótico é então refletido de um par de scanners galvanométricos e focalizado por uma lente de objetiva numérica elevada 101 que é montada em um estágio de translação 104. As medições da fluorescência no supranúcleo do olho são obtidas ao alinhar primeiramente o olho do indivíduo ao dispositivo e ao executar 1) uma varredura z para determinar a localização da região de interesse (ROI) e 2) uma varredura xy para obter a informação específica sobre uma área dentro do supranúcleo.

[0078] De acordo com uma modalidade da invenção, o alinhamento do indivíduo consiste em identificar o plano focal da lente de objetiva como um ponto de partida de referência da medição. Um diodo emissor de luz (LED), que também é usado como um alvo de fixação, é focalizado pela lente de objetiva 101 na córnea do olho 103 na forma de um anel. Uma câmera é usada para visualizar a reflexão do anel fora da superfície da córnea. Uma vez que isto é conseguido, a varredura do olho pode ser executada para obter a informação necessária.

[0079] De acordo com uma modalidade da invenção, a identificação das estruturas anatômicas da lente é executada ao fazer a varredura da lente de objetiva 101 ao longo do eixo ótico (no eixo) ao usar um estágio de translação 104. A varredura z envolve a excitação da fluorescência natural com a fonte de laser e a identificação das estruturasanatômicas dos segmentos anteriores tais como a região da córnea, a cápsula da lente e o supranúcleo da lente e as suas distâncias relativas. Além disso, a varredura pode fornecer informações sobre a farmacocinética do composto de ligação ao amiloide exógeno aplicado ao olho.

[0080] De acordo com uma modalidade da invenção, uma vez que a região de interesse é identificada ao usar a medição da varredura z, uma varredura planar (varredura xy) no plano perpendicular á varredura axial é executada ao usar os espelhos galvanométricos. Para assegurar a alocação das curvas de declínio da fluorescência medido ao local correspondente da varredura bidimensional, os espelhos galva- nométricos são sincronizados com a placa de aquisição de dados para a medição de TCSPC. A varredura xy pode envolver, por exemplo, a varredura de uma região de 50 por 50 μm no supranúcleo de um olho humano em 0,5 segundo e a extração dos valores de declínio do tempo de vida. Deve ser apreciado que podem ser usados regiões de outros tamanhos e localizações, e tempos de varredura.

[0081] De acordo com uma modalidade da invenção, a detecção é obtida com TCSPC através de uma configuração confocal com um de- tector de fotodiodo de avalanche (APD) rápido 102. A fluorescência das moléculas excitadas é coletada com a mesma lente de objetiva 101 que o laser de excitação, filtrada depois do espelho dicroico com um filtro de passagem de faixa adicional para rejeitar luz laser dispersa restante e passada através de uma abertura pequena para permitir a detecção confocal. Com a opção de sincronismo rápido, o APD 102 pode, por exemplo, prover a resolução de sincronismo melhor do que 50 picossegundos de Meio Máximo de Largura Total com uma eficiência de detecção de fótons de 49% a 550 nm, embora outras definições de sincronismo e eficiências de detecção de fótons possam ser usadas.

[0082] Uma ilustração da aquisição de dados e da eletrônica por trás de TCSPC é mostrada na Figura 4 (também discutido acima), de acordo com uma modalidade da invenção. A fonte de luz pulsada 406 excita a amostra 403 de maneira repetitiva (por exemplo) a uma taxa da repetição de 40 MHz enquanto os pulsos de excitação são detectados por um módulo de sincronização (SYNC) 407 que também é ajustado (por exemplo) a 40 MHz. Os pulsos de excitação acionam os sinais de partida. Um discriminador de fração constante (CFD) 408 responde somente ao primeiro fóton detectado do detector, independentemente da sua amplitude. Esse primeiro fóton da emissão da amostra é o sinal de parada para o Conversor de Tempo em Amplitude (TAC) 409. Quando o APD 402 detecta um fóton, um pulso curto é criado na saída do PMT. O pulso é "limpo" pelo CFD 408 e entre no TAC 409 como um pulso de "parada". Uma vez que o pulso de parada (isto é, o primeiro fóton de chegada) tenha sido detectado, a rampa da voltagem é parada e o valor da voltagem (equivalente à diferença do tempo entre os pulsos de partida e parada) é transmitido ao analisador de múltiplos canais (MCA) 410. O MCA 410 grava os sinais de partida-parada repetitivos dos eventos de um só fóton do TAC 409 e incrementa as contagens no canal em correspondência com a voltagem detectada (tempo). Esse processo é repetido com cada pulso e eventualmente, após muitos ciclos, um histograma de contagens de fótons como uma função de unidades de canal do tempo é gerado. O histograma representa a intensidade da fluorescência como uma função do tempo, a partir da qual o tempo de vida do declínio da fluorescência é obtido.

[0083] De acordo com uma modalidade da invenção, a aquisição de dados pode ser executada ao usar uma placa de PC PicoHarp 300 TCSPC (PicoQuant, GmbH, Berlim, Alemanha) trabalhando no Modo Etiquetado no Tempo e Resolvido no Tempo especial, que armazena todas as informações relevantes para cada fóton detectado para uma análise de dados adicional. Em particular, cada tempo de chegada de fóton é registrado no detector em sincronização com o pulso de excitação de laser e a posição da amostra e do número do canal de detecção. A taxa de sincronização da placa de aquisição pode, por exemplo, ser ajustada a 40 MHz com uma resolução do tempo de 4 picossegun- dos e profundidade de contagem de canal de 16 bits (outras taxas de sincronização, resoluções do tempo e profundidades de contagem de canais podem ser usadas).

[0084] De acordo com uma modalidade da invenção, a aquisição de software, que pode ser executada ao usar SymPhoTime, (PicoQuant, GmbH, Berlim, Alemanha), pode ser controlada através de uma rede TCP/IP e ser sincronizados com o scanner galvanométrico e a placa de aquisição através dos sinais de TTL para definir a linha e o quadro da imagem. O SymPhoTime no modo de comando LSM pode, por exemplo, gravar e exibir as imagens do tempo de vida e da intensidade da fluorescência.

[0085] De acordo com uma modalidade da invenção, o tempo de vida da fluorescência pode ser registrado para cada localização esca- neada dentro da lente humana, e desse modo uma representação bi- dimensional da distribuição de fluoróforo pode ser avaliada e analisada com base na taxa e a intensidade do declínio da fluorescência. Uma imagem codificada em cores construída com base no declínio do tempo de vida da fluorescência pode ser sobreposta sobre a imagem da intensidade para facilitar a interpretação clínica. O cálculo de uma imagem do tempo de vida da fluorescência pode ser feito ao classificar todos os fótons que correspondem a um pixel em um histograma, o qual é então ajustado em uma função de declínio exponencial para extrair a informação do tempo de vida. Esse procedimento é repetido então para cada pixel na imagem. O algoritmo do software pode ajustar os dados a funções de declínio multiexponencial ao usar o ajuste de cauda bem como a re-convolução numérica. Uma vez que o proce-dimento apropriado é baseado na qualidade dos parâmetros de partida para o ajuste, a contagem de frequência dos fótons de taxas de declínioespecíficas que é indicativa de fluoróforos específicos em uma varredura de área pode ser extraída diretamente da imagem. Os algoritmos acima podem ser implementados pelo computador, e podem envolver a exibição dos dados em um visor bidimensional tal como um monitor de computador.

[0086] Em uma modalidade de acordo com a invenção, uma intensidademédia associada com um declínio do tempo de vida específico pode ser usada como uma medida da agregação de proteínas amiloi- de. Isto é, um parâmetro pode ser criado ao calcular a média de uma intensidade fluorescente, associada com um declínio do tempo de vida específico, em relação a uma área específica. Esse parâmetro pode ser usado como uma medida da agregação, por exemplo, para monitorar a progressão de uma doença em um indivíduo com base em mudanças no parâmetro. Tal parâmetro pode ser determinado pelo computador ou por um outro hardware especializado.

[0087] Um histograma fluorescente do composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, é mostrado na Figura 6, obtido por um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção. O ajuste exponencial simples apropriado resulta em uma taxa de declínio do tempo de vida de 2 nanossegundos.

[0088] A Figura 7 mostra uma imagem do tempo de vida da fluorescência do Composto # 11 e sua imagem de intensidade correspondente, obtidas de acordo com uma modalidade da invenção. As imagenssão de 100 x 100 pixels obtidas em 0,5 segundo e representam uma área de varredura de 50 x 50 micra.

[0089] Uma modalidade de acordo com a invenção usa uma técnica de domínio de tempo da fluorescência para detectar e resolver fluo- róforos com base em sua assinatura do tempo de vida. Com a combinação da medição da intensidade e do tempo de vida da fluorescência, uma dimensão extra de informação é obtida para a discriminação entre etiquetas fluorescentes. Os estudos in vitro discutidos no Experimento # 1 demonstram a capacidade de uma modalidade de acordo com a invenção de diferenciar os fluoróforos fluorescentes com base em sua assinatura de declínio do tempo de vida. Além disso, os estudos da farmacocinética nos olhos de coelhos discutidos no Experimento # 2 mostram o sinal de fluorescência detectável do composto de ligação ao amiloide fluorescente, Composto # 11, no supranúcleo da lente. Mais importante ainda, o sinal detectado na lente do olho do coelho foi facilmente identificado e atribuído ao próprio composto de ligação ao amiloide.

[0090] Deverá ser compreendido por um versado na técnica que qualquer método aqui apresentado (bem como as etapas individuais do mesmo e combinações de várias etapas subsequentes desses métodos), em particular as etapas técnicas que envolvem a coleta e opcionalmente o processamento dos dados relevantes, a comparação dos dados obtidos desse modo com os valores de controle normais e/ou a descoberta de qualquer desvio significativo durante essa comparação, pode ser executado antes de, independente do mesmo e na preparação de uma etapa de diagnóstico separada subsequente, isto é, antes de atribuir um desvio potencial entre os valores obtidos e o(s) valor(es) de controle normal(is) a um distúrbio amiloidogênico particular tal como o mal de Alzheimer (o diagnóstico real). Esses métodos (incluindo as etapas individuais bem como as combinações de várias etapas subsequentes desses métodos) executados antes de, independentes do mesmo e na preparação de um diagnóstico separado subsequente, são contemplados especificamente como modalidades individuais da invenção.

[0091] De acordo com uma modalidade da invenção, vários sub- componentes do sistema podem ser fornecidos por fornecedores existentes. Por exemplo, as fontes de excitação podem ser Picosecond Pulsed Laser, LDH series, vendido pela PicoQuant de Berlim, Alemanha; Picosecond Diode Laser, BDL series, vendido pela Becker & Hickl de Berlim, Alemanha; ou Picosecond Light Pulser, PLP series, vendido pela Hamamatsu Fotonics de Hamamatsu, Japão. A aquisição de dados pode ser executada ao usar o modulo de TCSPC, PicoHarp 300, vendido pela PicoQuant, Berlim, Alemanha; o módulo de TCSPC, SPC series, vendido pela Becker & Hickl, Berlim, Alemanha; ou o Synchronous Delay Generator, C10647 vendido pela Hamamatsu Fotonics, Hamamatsu, Japão. Os Detectores de Contagens de Fótons podem ser o Detector Unit, PMA series, vendido pela PicoQuant, Berlim, Alemanha; o Detector Unit, ID-100 Series, vendido pela Becker & Hickl, Berlim, Alemanha; ou o Streakscope (C10627 series, vendido pela Hamamatsu Fotonics, Hamamatsu, Japão). Deve ser apreciado que as outras fontes de excitação, módulos de aquisição de dados e detectores de contagens de fótons podem ser usados.

[0092] Partes das modalidades descritas acima da presente inven- ção podem ser executadas ao usar um ou mais sistemas computadorizados. Por exemplo, as modalidades podem ser executadas ao usar hardware, software ou uma combinação destes. Quando executado no software, o código do software pode ser executado em qualquer processador ou coleção apropriada de processadores, quer seja provido em um único computador ou distribuído entre múltiplos computadores.

[0093] Além disso, deve ser apreciado que um computador pode ser englobado em qualquer forma de um número de formas, tais como um computador montado em uma estante, um computador de mesa, um computador do tipo laptop, um computador do tipo tablet, um computador de placa de circuito simples ou um sistema em um microchip. Além disso, um computador pode ser embutido em um dispositivo não geralmente considerado como um computador, mas com capacidades de processamento apropriadas, incluindo um Assistente Digital Pesso-al (PDA), um telefone inteligente ou qualquer outro dispositivo eletrônicoportátil ou fixo apropriado.

[0094] Além disso, um computador pode ter um ou mais dispositivos de entrada e de saída. Esses dispositivos podem ser usados, entre outras coisas, para apresentar uma interface do usuário. Os exemplos dos dispositivos de saída que podem ser usados para prover uma interface do usuário incluem impressoras ou telas de exibição para a apresentação visual da saída e alto-falantes ou outros dispositivos geradores de som para a apresentação audível da saída. Os exemplos dos dispositivos de entrada que podem ser usados para uma interface do usuário incluem teclados, e dispositivos apontadores, tais como mouses, almofadas de toque, telas de toque e tabletes de digitação. Como um outro exemplo, um computador pode receber as informações de entrada através de reconhecimento de voz ou em um outro formato audível.

[0095] Tais computadores podem ser interconectados por uma ou mais redes em qualquer forma apropriada, incluindo uma rede de área local ou uma rede de área ampla, tal como uma rede de empresa ou a Internet. Tais redes podem ser baseadas em qualquer tecnologia apropriada e podem operar de acordo com qualquer protocolo apropriado, e podem incluir redes sem fio, redes com fio ou redes de fibra ótica.

[0096] Além disso, os vários métodos ou processos aqui esboçados podem ser codificados como software que é executável em um ou mais processadores que empregam qualquer sistema de uma variedade de sistemas ou plataformas operacionais. Além disso, tal software pode ser escrito ao usar qualquer linguagem de um número de linguagens de programação apropriadas e/ou ferramentas de programação ou escrita, e também pode ser compilado como o código executável da linguagem de máquina ou o código intermediário que é executado em uma estrutura ou em uma máquina virtual.

[0097] A este respeito, pelo menos uma parte da invenção pode ser englobada como um meio que pode ser lido por computador (ou múltiplos meios que podem ser lidos por computador) (por exemplo, uma memória de computador, um ou mais discos flexíveis, discos compactos, discos óticos, fitas magnéticas, memórias flash, configurações de circuito em Disposições de Porta Programáveis de Campo ou outros dispositivos semicondutores, ou um outro meio de armazenamento em computador tangível) codificado com um ou mais programas que, quando executados em um ou mais computadores ou outros processadores, executam os métodos que executam pelo menos uma parte das várias modalidades da invenção discutida acima. O meio ou meios que podem ser lidos por computador podem ser transportáveis, de maneira tal que o programa ou os programas armazenados nos mesmos podem ser carregados em um ou mais computadores diferentes ou outros processadores para executar vários aspectos da presen- te invenção tal como discutido acima.

[0098] A este respeito, deve ser apreciado que uma implementação de pelo menos uma parte das modalidades descritas acima compreende pelo menos um meio que pode ser lido em computador codificado com um programa de computador (por exemplo, uma pluralidade de instruções), que, quando executado em um processador, executa algumas ou todas as funções acima discutidas dessas modalidades. Tal como aqui usado, o termo "meio que pode ser lido por computador" engloba somente um meio que pode ser lido por computador que possa ser considerado como uma máquina ou uma manufatura (isto é, artigo de manufatura). Um meio que pode ser lido por computador pode ser, por exemplo, um meio tangível em que a informação que pode ser lida por computador pode ser codificada ou armazenada, um meio de armazenamento em que a informação que pode ser lida por compu-tador pode ser codificada ou armazenada, e/ou um meio não transitório em que a informação que pode ser lida por computador pode ser codificada ou armazenada. Outros exemplos não exaustivos de meios que podem ser lidos por computador incluem uma memória de computador (por exemplo, uma ROM, uma RAM, uma memória flash, ou um outro tipo de memória de computador), um disco magnético ou uma fita, um disco ótico, e/ou outros tipos de meios que podem ser lidos por computador que podem ser considerados como uma máquina ou uma manufatura.

[0099] Os termos "programa" ou "software"são aqui usados em um sentido genérico para se referir a qualquer tipo de código de computador ou conjunto de instruções executáveis por computador que podem ser empregadas para programar um computador ou um outro processador para executar vários aspectos da presente invenção tal como discutido acima. Além disso, deve ser apreciado que, de acordo com um aspecto dessa modalidade, um ou mais programas de compu- tador que, quando rodados, executam métodos da presente invenção, não precisam residir em um único computador ou processador, mas podem ser distribuídos de uma forma modular entre um número de computadores ou processadores diferentes para executar vários aspectos da presente invenção.

[00100] As instruções executáveis por computador podem estar em muitas formas, tais como módulos de programa, executados por um ou mais computadores ou outros dispositivos. Geralmente, os módulos de programa incluem rotinas, programas, objetos, componentes, estruturas de dados, etc., que executam tarefas particulares ou executam tipos de dados abstratos particulares. Tipicamente, a funcionalidade dos módulos do programa pode ser combinada ou distribuída tal como desejado em várias modalidades.

Experimento # 1 - Estudo in vitro de Ligando Fluorescente Neuroptix com o peptídeo beta amiloide (1-42):

[00101] De acordo com uma modalidade da invenção, foram realizados estudos in vitro sobre os peptídeos Aβ agregados ligados ao Composto # 11. As medição do tempo de vida da fluorescência do Composto # 11 com o peptídeo Aβ agregado foram feitas ao usar um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção. A Figura 8A é uma imagem do tempo de vida da fluorescência que mostra o Composto # 11 e o Composto # 11 ligado ao peptídeo Aβ agregado, com seus histogramas correspondentes do tempo de vida da fluorescência mostrados na Figura 8B, de acordo com uma modalidade da invenção. Ao ajustar os histogramas do tempo de vida, as taxas de declínio são determinadas. Os resultados demonstram o desempenho superior de uma modalidade de acordo com a invenção que é capaz de diferenciar entre fluoróforos da diferença do tempo de vida de tão pouco quanto 0,85 nanossegundo com um baixo nível de detecção de fótons. Segue uma descrição experimental.

[00102] A finalidade deste estudo in vitro era a identificação da assinaturaótica do composto de ligação ao amiloide, Composto # 11, e a caracterização das suas propriedades de fluorescência quando ligado ao peptídeo Aβ agregado. Em particular, os objetivos do estudo eram: 1) a caracterização de taxas de declínio do tempo de vida co Composto # 11; e 2) a capacidade de detectar e diferenciar entre o Composto # 11 ligado e não ligado aos peptídeos beta amiloide (Aβ).

Dispositivo:

[00103] O dispositivo Neuroptix SAPPHIRE II (Neuroptix Corporation, Acton, MA, USA) é um dispositivo construído para finalidades para estudos clínicos nos seres humanos, o qual foi adaptado para mediçõesin vitro para este experimento. Ele emprega um mecanismo de varredura confocal combinado com a espectroscopia do tempo de vida da fluorescência que permite a diferenciação de fluoróforos. O dispositivo permite 1) a varredura do feixe ótico a localizações específicas nos segmentos anteriores do olho, tal como o supranúcleo e 2) a identificação dos fluoróforos fluorescentes com base em medições do tempo de vida da fluorescência.

Método - Preparação dos peptídeos Aβ agregados:

[00104] O peptídeo Aβ agregado foi preparado ao dissolver Aβ (142) em PBS a um pH 7,4 a uma concentração final de 100 μM. Essa solução foi agitada magneticamente a 1.200 rpm por 3 dias à temperatura ambiente. A solução de partida de Aβ (1-42) de 100 μM em PBS foi separada em alíquotas e congelada a -80°C por até 4 semanas sem mudança visível em sua propriedade. 150 μl de Aβ (1-42) pré- agregado foram adicionados a 2,85 ml do Composto # 11 para obter uma concentração final de 5 μM de Aβ (1-42) e 4 μM do Composto # 11. A solução foi transferida a um frasco de 5 ml e as medições da fluorescência foram feitas a 25°C.

Experimento e Resultados

[00105] A amostra que consiste no Composto # 11 foi colocada na frente do dispositivo Neuroptix SAPPHIRE II. Uma vez determinada a localização da varredura na amostra, uma varredura de quadriculação foi executada para obter medições do tempo de vida da fluorescência. A Figura 8A mostra uma imagem (200 x 200 pixels) com uma faixa de varredura de 100 μm X 100 μm obtida em um tempo de aquisição de 1 segundo. A imagem é sombreada para representar os declínios do tempo de vida. O sombreamento que compõe a maior parte da imagem representa um declínio do tempo de vida de 1,4 nanossegundo, que corresponde àquele do composto de ligação ao amiloide de fluo-rescência. O ponto detectado na imagem é aquele do peptídeo Aβ agregado que representa um declínio do tempo de vida de 2,25 na- nossegundos. A curva na em Figura 8B mostra as taxas de declínio da fluorescência calculadas para ambos o Composto # 11 e aquela do Composto # 11 ligado ao peptídeo Aβ agregado.

Conclusão

[00106] As medições do tempo de vida da fluorescência in vitro do Composto # 11 com o peptídeo Aβ agregado foram executadas com o dispositivo Neuroptix SAPPHIRE II. Com base em taxas de declínio do tempo de vida da fluorescência, o peptídeo ligado e não ligado ao Composto # 11 pode ser resolvido. Os resultados demonstram o de-sempenho superior do dispositivo SAPPHIRE II que é capaz de dife-renciar entre fluoróforos com uma diferença de 0,85 nsec na vida apenas pelo nível de detecção de algumas centenas de fótons.

Experimento # 2 - Estudo Farmacocinético Ocular em Coelhos Cingidos Holandeses:

[00107] De acordo com uma modalidade da invenção, foram realizados estudos farmacocinéticos in vivo do Composto # 11 nos olhos de coelhos ao usar um dispositivo de acordo com uma modalidade da invenção. A Figura 9A é uma curva da contagem da frequência de fó- tons de taxas de declínio específicas medidas em dois coelhos dosados com o composto de ligação ao amiloide junto com um coelho controlado. A contagem da frequência dos fótons das taxas de declínio específicas que pertenciam ao composto de ligação ao amiloide fluorescente (Composto # 11) foi calculada a partir do histograma de fluorescência (Figura 9B), de acordo com uma modalidade da invenção. Os resultados demonstram a capacidade do composto de ligação ao amiloide de penetrar na córnea e ser detectado pelo dispositivo na lente dos olhos do coelho. Segue uma descrição experimental.

Introdução

[00108] A investigação farmacocinética ocular da resposta à dose através da administração tópica do composto de ligação ao amiloide de fluorescência foi executada em coelhos cingidos holandeses. Os coelhos foram testados cada dia por um período de 4 dias ao usar o composto de ligação ao amiloide, Composto # 11, em uma pomada. Dois animais foram dosados no olho direito com o Composto # 11 (0,5%) na forma de pomada. Um animal era não tratado e foi usado como animal de controle. Os animais foram dosados em pontos do tempo específicos por quatro dias e foram testados com o sistema SAPPHIRE II para as medições da intensidade e do tempo de vida da fluorescência no começo e no final de cada dia. Os resultados demonstram: 1) O sinal de fluorescência detectável foi obtido com uma concentração de 5 mg/g do Composto # 11 na forma de pomada após a administração tópica repetitiva. 2) As medições da fluorescência feitas no começo e no final do dia e por um período de quatro dias mostram um aumento da fluo-rescência do Composto # 11 no núcleo da lente dos olhos do coelho.

Métodos:

[00109] As medições oculares foram feitas a intervalos de tempo e a concentrações de dose indicados na tabela abaixo.

Tabela 1: Grupo de animais testado, dosagens administradas, e tempos da medição

[00110] O estudo foi escalonado por quatro dias e executado em uma única localização e em um único instrumento. Os testes foram realizados em um aposento pouco iluminado dedicado ao estudo.

[00111] Todos os animais foram dosados com o Composto # 11 através da aplicação ocular tópica e foram testados no olho direito. Os animais foram anestesiados e presos manualmente em uma plataforma na frente do dispositivo Neuroptix SAPPHIRE II. O posicionamento bruto foi feito pelo manipulador de animais, e o ajuste fino da localização da medição foi feito pelo operador do Neuroptix SAPPHIRE II. Uma vez alinhados, o operador do SAPPHIRE II inicia a sequência de medição. As medições da linha basal foram feitas nos animais antes da dosagem, e então no começo e no final de cada dia (Tabela 1).

Projeto e dosagem experimentais:

[00112] As medições do tempo de vida e da intensidade da fluorescência foram feitas no olho no começo e no final de cada dia. As medições envolveram a varredura do olho do coelho axialmente (varredura z) para obter a informação interocular e uma varredura planar (varredura xy) para executar as medições do declínio do tempo de vida em uma determinada região do olho, que é o núcleo da lente neste caso.

[00113] Uma vez que a localização de interesse foi identificada, a Contagem de Único Fóton de Correlação Temporal (TCSPS) foi iniciada ao executar a varredura xy. As imagens do tempo de vida da fluorescência foram obtidas então onde o histograma do tempo de vida do declínio foi obtido para cada localização de pixel. Os tempos de declínio calculados foram codificados em cores na imagem do tempo de vida da fluorescência. Cada medição foi executada três vezes. A contagem da frequência dos fótons de taxas de declínio específicas foi calculada a partir da frequência das taxas de declínio da assinatura do Composto # 11 obtidas na varredura xy e foi calculada a média para as três medições. As medições da calibração foram feitas uma vez ao dia em um corante de fluorescência e mostraram um desempenho repetí- vel sem nenhuma mudança aparente durante todo o estudo. O dispositivo foi projetado especificamente para o uso humano, mas a plataforma foi modificada ligeiramente para prender os coelhos.

[00114] A dosagem foi feita pela equipe de Toxikon através da aplicação ocular tópica no olho direito de cada animal. Grupo 1: Os animais foram anestesiados com injeção sub-cutâneade Dexdomitor (0,5 mg/kg), Ketamine (5 mg/kg). Uma fita de pomada de cerca de 1/2 polegada de comprimento foi aplicada então à pálpebra inferior do olho direito de cada animal no grupo do teste três vezes ao dia, por quatro dias. Controle: Para o grupo de controle, um animal foi manipulado da mesma maneira que os animais nos grupos do teste exceto pelo fato que nenhuma pomada ou solução foi administrada ao olho.

Sumário dos Resultados:

[00115] As medições da intensidade e do tempo de vida da fluores- cência do composto de ligação ao amiloide no olho foram feitas no começo (manhã) e no final (noite) de cada dia. As Figuras 10A e 10B são curvas que mostram a contagem da frequência dos fótons das taxas de declínio específicas que pertencem ao Composto # 11 medidas de manhã para a linha basal e no final do dia depois de serem dosados durante o período de um estudo de quatro dias no núcleo da lente dos cinco coelhos. A Figura 10A é uma curva para as medições da manhã, e a Figura 10B é uma curva para as medições da noite, ambas as quais são em coelhos dosados com a pomada oftálmica do Composto # 11. As medições nos dois coelhos (1002 e 1003), que foram dosados com a pomada oftálmica do Composto # 11, mostram um aumento significativo no sinal de fluorescência no núcleo do olho. As Figuras 10A e 10B mostram que após três dosagens a cada dia com três horas de separação, um sinal de fluorescência cumulativa é medido ao longo do período de um estudo de 4 dias.

[00116] As Figuras 11A e 11B são duas imagens do tempo de vida da fluorescência tomadas na linha basal e após o final do quarto dia do estudo com o animal 1003. A medição da linha basal exibiu uma imagem preta indicativa de nenhuma presença do Composto # 11 na lente do olho. Após quatro dias, a varredura xy revelou uma imagem do tempo de vida com uma taxa de declínio de 2 nanossegundos (indicada em cinza) que é uma assinatura do tempo de vida da fluorescência. A diferença no sinal coletado entre os dois coelhos pode ser atribuída à variação de dosagem pelo técnico e pelo piscar do animal.

Conclusão

[00117] O objetivo principal foi atingido com a pomada oftálmica do Composto # 11 a uma concentração de 5 mg/g. A administração tópica repetitiva do Composto # 11 tendeu a se acumular no núcleo depois de várias horas da aplicação e tendeu a permanecer ali por pelo menos 12 horas.

[00118] Os ensinamentos de todas as patentes, pedidos de patente publicados e referências aqui citados são incorporados a título de referência em sua totalidade.

[00119] Embora a presente invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência às suas modalidades de exemplos, deve ser compreendido pelos elementos versados na técnica que váriasmudanças na forma e nos detalhes podem ser feitos nas mesmas sem que se desvie do âmbito da invenção abrangido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Dispositivo para detectar uma proteína amiloide em um olho de um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende: uma fonte de luz (406) orientada para iluminar o olho, a fonte de luz (406) emitindo luz com pelo menos um dentre um comprimento de onda, uma polarização ou uma combinação destes, cada um deles apropriado para produzir fluorescência em pelo menos um composto de ligação ao amiloide quando o composto de ligação ao amiloide é ligado à proteína amiloide, uma unidade óptica compreendendo uma unidade fotode- tectora (402) para detectar fluorescência emitida do olho como um re-sultado da iluminação do olho e um módulo de contagem de único fó- ton de correlação temporal (407, 408, 409, 410) que recebe sinais elétricos da unidade fotodetectora indicativa da contagens de fóton de luz fluorescente do olho, e que determina uma taxa de declínio do tempo de fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide, a determinação permitindo distinguir a presença do composto de ligação ao ami- loide ligado à proteína amiloide no olho com base em pelo menos a taxa de declínio do tempo.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a unidade óptica é configurada para determinar a taxa de declínio do tempo para pelo menos um de: um composto de ligação ao amiloide de rotor molecular; um composto de ligação ao amiloide de vermelho do Congo ou um derivado de vermelho Congo; um composto de ligação ao amiloide de Chrysamine; um composto de ligação ao amiloide de um derivado de Chrysamine; um composto de ligação ao amiloide de Chrysamine G ou um derivado de Chrysamine G; um composto de ligação ao amiloide de Thioflavin T ou um derivado de Thioflavin T; e um composto de ligação ao amiloide de Thioflavin S ou um derivado de Thioflavin S e/ou composto # 11.

3. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a unidade óptica é configurada para determinar um ou mais de: a) uma intensidade de fluorescência para pelo menos a flu-orescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide, b) uma quantidade do composto de ligação ao amiloide ligadoà proteína amiloide, com base em pelo menos uma dentre a intensidade e a taxa de declínio do tempo; e/ou c) um número médio de fótons com uma taxa de declínio específica em uma determinada área do olho.

4. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a unidade óptica é configurada para distinguir um ou mais de: a) o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína ami- loide a partir da autofluorescência de fundo de tecidos do olho, da au- tofluorescência de outras partículas não específicas e do composto de ligação ao amiloide não ligado; e/ou b) pelo menos uma dentre uma presença ou de uma quantidade de mais de um dos seguintes: o composto de ligação ao amiloi- de; o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide; e a proteína amiloide.

5. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a unidade óptica é configurada para fazer a varredura dentro do olho para determinar a fluorescência natural excitada e determinar desse modo pelo menos uma região de interesse no olho; e para amostrar a pelo menos uma região de interesse no olho ao usar a iluminação pela fonte de luz, a amostragem compreen- dendo a execução de pelo menos uma dentre uma medida de pelo menos uma região inteira da pelo menos uma região ou uma amostragem de localizações diferentes dentro da pelo menos uma região ao usar a iluminação pela fonte de luz, a amostragem de localizações diferentes compreendendo a iluminação de pelo menos um dentre um ponto, um plano ou um volume dentro da pelo menos uma região; em que a amostragem é para determinar uma intensidade de fluorescência e uma taxa de declínio do tempo da fluorescência para pelo menos a fluorescência produzida pelo composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide dentro da pelo menos uma região amostrada.

6. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a fonte de luz é configurada para emitir luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de excitação fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho, e em que a unidade óptica é configurada para detectar luz de um comprimento de onda apropriado para uma região de pico de um espectro de emissão fluorescente para o composto de ligação ao amiloide ligado à proteína amiloide no olho.

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o composto de ligação ao amiloide é o Composto #11.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o espectro de excitação tem um pico de cerca de 470 nm, a fonte de luz sendo configurada para emitir luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de excitação, e em que o espectro de emissão tem um pico de cerca de 580 nm, e a unidade óptica sendo configurada para detectar luz dentro de mais ou menos cerca de 20 nm do pico do espectro de emissão.