BR112012007778A2 - método para identificar lúpus, método para avaliar se um sujeito está em risco de desenvolver lúpus, medicamentos para tratar uma condição de lupus, método e usos de um agente terapêutico. - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA IDENTIFICAR LÚPUS, MÉTODO PARA AVALIAR SE UM SUJEITO ESTÁ EM RISCO DE DESENVOLVER LÚPUS, MEDICAMENTOS PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LÚPUS, MÉTODO E USOS DE UM AGENTE TERAPÊUTICO São fornecidos métodos de identificação, diagnóstico e prognóstico para lúpus, incluindo determinados subfenótipos de lúpus, bem como métodos de tratamento de lúpus, incluindo determinadas subpopulações de pacientes. Os métodos fornecidos são baseados em um conjunto de alelos associados com o lócus de risco lúpus eritematoso sistêmico (LES), incluindo BLK, TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1, IL1 O, IFIH1, CFB, CEC16A, IL12B E SH2B3 que contribuem para o risco de LES. Também foram fornecidos métodos para identificar agentes terapêuticos efetivos para lúpus e prever a responsividade a agentes terapêuticos para lúpus.

Description

“MÉTODOS PARA IDENTIFICAR LÚPUS, MÉTODO PARA AVALIAR SE UM SUJEITO ESTÁ EM RISCO DE DESENVOLVER LÚPUS, MEDICAMENTOS PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LÚPUS, MÉTODO E USOS DE UM AGENTE TERAPÊUTICO”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO Este pedido reivindica benefício de prioridade ao pedido provisório de patente US 61/278.510, depositado em 7 de outubro de 2009, que é integralmente incorporado ao presente pedido como referência.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS O atual pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada no formato ASCII através de EFS-Web e é integralmente incorporada ao presente pedido como referência. A dita cópia ASCII, criada em 27 de dezembro de 2010, é denominada P4325R1W.txt e tem 57.896 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO São fornecidos métodos de identificação, diagnóstico, prognóstico e avaliação de risco de desenvolvimento de lúpus, bem como métodos para tratamento de lúpus. Também são fornecidos métodos para identificar agentes terapêuticos efetivos para lúpus e prever a responsividade para agentes terapêuticos de lúpus.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O lúpus é uma doença autoimune e estima-se que afete aproximadamente 1 milhão de americanos, principalmente mulheres entre 20 e 40 anos. O lúpus envolve anticorpos que atacam o tecido conjuntivo. A principal forma de lúpus é o sistêmico (lúpus eritematoso sistêmico; LES). O LES é uma doença autoimune crônica com fortes componentes genéticos, bem como ambientais (consulte, por exemplo, Hochberg MC, Dubois' Lupus Erythematosus. 5º ed., Wallace DJ, Hahn BH, eds. Baltimore: Williams e

Wilkins (1997); Wakeland EK, et al., Immunity 2001;15(3):397-408; Nath SK, et al., Curr. Opin. Immunol. 2004;16(6):794-800; D'Cruz et al.,, Lancet (2007), 369:587-596). Várias formas adicionais de lúpus são conhecidas incluindo, mas não se limitando a lúpus eritematoso cutâneo (CLE), nefrite lúpica (LN) e lúpus neonatal.

O lúpus não tratado pode ser fatal à medida que progride a partir do ataque da pele e articulações para os órgãos internos, incluindo pulmões, coração e rins (com doença renal sendo a principal preocupação), dessa forma, tornando importante o diagnóstico prematuro e preciso e/ou a avaliação do risco de desenvolvimento de lúpus. O lúpus aparece principalmente como uma série de sinais, com períodos de intervenção com pouca ou nenhuma manifestação da doença. O dano renal, medido pela quantidade de proteinúria na urina, é uma das áreas mais agudas de danos associados com a patogenicidade no LES, e conta com pelo menos 50% da mortalidade e morbidade da doença.

Clinicamente, LES é uma disfunção heterogênea, caracterizada por autoanticorpos de alta afinidade (autoAbs). AutoAbs desempenham um papel importante na patogênese de LES, e as diversas manifestações clínicas da doença são devido à deposição de complexos imunes contendo anticorpos nos vasos sanguíneos, levando à inflamação dos rins, cérebro e pele. Os autoAbs também têm efeitos patogênicos diretos que contribuem para anemia hemolítica e trompocitopenia. O LES está associado à produção de anticorpos antinucleares, circulação de complexos imunes e ativação do sistema de complemento. O LES tem uma incidência de cerca de 1 em 700 mulheres entre20 e 60 anos. O LES pode afetar qualquer sistema orgânico e pode causar danos severos no tecido. Numerosos autoAbs de especificidades diferentes estão presentes no LES. Pacientes com LES frequentemente produzem autoAbs que têm especificidade para anti-DNA, anti-Ro e anti-

plaquetas e que são capazes de iniciar características clínicas da doença, como glomerulonetfrite, artrite, serosite, bloqueio completo do coração em recém-nascidos, e anomalias hematológicas.

Esses autoAbs também estão possivelmente relacionados com distúrbios do sistema nervoso central. —Arbuckle et al. descreveu o desenvolvimento de autoAbs antes dos primeiros sintomas de LES (Arbuckle et al.

N.

Engl.

J.

Med. 349(16): 1526-1533 (2003)). O diagnóstico definitivo de lúpus, incluindo LES, não é fácil, resultando em recursos clínicos para sinais multifatorialis e abordagem de classificação baseada em sintomas (Gill et al, American Family Physícian 68(11): 2179-

2186(2003)). Um dos desafios mais difíceis no gerenciamento clínico de doenças do complexo autoimune, como lúpus, é a identificação precisa e precoce das doenças em um paciente.

Ao longo dos anos, foram realizados muitos estudos de ligação e de gene candidato para identicar fatores genéticos que contribue, para suscetibilidade ao LES.

Haplótipos que carregam os alelos HLA de Classe Il DRB1*0301 e DRB1*1501 estão claramente associados com a doença, bem como com a presença de anticorpos para autoantígenos nucleares.

Consulte, por exemplo, Goldberg MA, et al, Arthritis Rheum. 19(2):129-32 (1976); Graham RR, et al, Am J Hum Genet. 71(3):543-53 (2002); e Graham RR, et al, Eur J Hum Genet. 15(8):823-30 (2007). Mais recentemente, descobriu-se que variantes do Fator Regulador de Interferon 5 (IRF5) e transdutor de sinal e ativador de transcrição 4 (STATA4) são fatores de risco significativos para LES.

Consulte, por exemplo, Sigurdsson S, et al, Am J Hum Genet. 76(3):528-37 (2005); Graham RR, et al., Nat Genet. 38(5):550-55 (2006); Graham RR, et al., Proc Natl Acad Sci USA 104(16):6758-63 (2007); e Remmers EF, et al., N Engl J Med. 357(10):977-86 (2007). A identificação de IRF5 e STAT4 como genes de risco de LES fornece suporte para o conceito de que, em certos casos, a via do interferon tipo | (IFN) desempenha um papel importante na patogênese da doença LES. O IFN tipo | está presente no soro dos casos de LES, e a produção de IFN está ligada à presença de Ab e ácido nucleico contendo complexos imunes (revisado em Ronnblom et al., J Exp Med 194:F59 (2001)); consulte também Baechler EC, et al., Curr Opin Immunol.

16(6):801-07 (2004); Banchereau J, et al, Immunity 25(3):383-92 (2006); Miyagi et al., J Exp Med 204(10):2383-96 (2007)). A maioria dos casos de LES exibe uma “assinatura” da expressão gênica de IFN tipo | proeminente nas células sanguíneas (Baechler et al., Proc Natl Acad Sci USA 100(5):2610-15 (2003)) e têm níveis elevados de citocinas induzíveis pelo IFN e quimiocinas no soro (Bauer et al, PLoS Med 3(12):e491 (2006)). Os complexos imunes contendo DNA nativo e receptores similares a to// que estimulam RNA (TLRs) 7 e 9 expressos pelas células dendríticas e células B para produzir interferon tipo |, que estimulam ainda a formação de complexo imune (revisado em Marshak- Rothstein et al., Annu Rev Immunol 25:419 (2007)).

Além disso, foram realizados diversos estudos para identificar biomarcadores confiáveis para propósitos de diagnóstico e prognóstico. Entretanto, nenhum marcador para diagnóstico clinicamente validado foi identificado, por exemplo, biomarcadores que permitem médicos ou outros definir com precisão os aspectos patofisiológicos de LES, atividade clínica, resposta à terapia, prognóstico, ou risco de desenvolvimento da doença, embora vários genes e alelos candidatos (variantes) que são conhecidos em contribuir para suscetibilidade de LES tenham sido identificados. Por exemplo, foram relatados pelo menos 13 alelos comuns que contribuem para o risco de LES em indivíduos de descendência europeia (Kyogoku et al, Am J Hum Genet 75(3):504-7 (2004); Sigurdsson et al, Am J Hum Genet 76(3):528-37 (2005); Graham et a/., Nat Genet 38(5):550-55 (2006); Graham et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104(16):6758-63 (2007); Remmers et al, N Engl J Med 357(10):977-86 (2007); Cunninghame Graham et a/.,, Nat Genet 40(1):83-89

(2008); Harley et al., Nat Genet 40(2):204-10 (2008); Hom et al, N Engl J Med 358(9):900-9 (2008); Kozyrev et al., Nat Genet 40(2):211-6 (2008); Nath et a/., Nat Genet 40(2):152-4 (2008); Sawalha et al, PLoS ONE 3(3):e1727 (2008)). Os supostos alelos causais conhecidos para HLA-DR3, HLA-DR2, FCGR2A, 5 PTPN22, ITGAM e BANK1 (Kyogoku et al, Am J Hum Genet 75(3):504-7 (2004); Kozyrev et al., Nat Genet 40(2):211-6 (2008); Nath et al., Nat Genet 40(2):152-4 (2008)), embora o risco de haplotipos IRF5, TNFSF4 e BLK provavelmente contribuem para LES pela influência de mMRNA e níveis de expressão de proteína (Sigurdsson et al, Am J Hum Genet 76(3):528-37 (2005); Graham et al, Nat Genet 38(5):550-55 (2006); Graham et a/., Proc Nat! Acad Sci U S A 104(16):6758-63 (2007); Cunninghame Graham et a/., Nat Genet 40(1):83-89 (2008); Hom et al/., N Engl J Med 358(9):900-9 (2008)). Os alelos causais para STAT4, KIAA1542, IRAK1, PXK e outros genes, como BLK, não foram determinados (Remmers et al., N Engl J Med 357(10):977-86 (2007); Harley et al, Nat Genet 40(2):204-10 (2008); Hom et al., N Engl J Med 358(9):900-9 (2008); Sawalha et al, PLoS ONE 3(3):e1727 (2008)). Essas e outras variações genéticas associadas com lúpus também estão descritas no pedido de patente internacional POT/US2008/064430 (publicação internacional documento WO 2008/144761). Embora a contribuição dessa variação genética para vários aspectos de risco e doença LES que foi descrita até agora tenha sido importante, mais informações sobre a contribuição da variação genética, por exemplo, a heterogeneidade clínica significativa de LES permanecem indeterminadas.

Será, portanto, altamente vantajoso ter métodos adicionais de diagnóstico baseados em moléculas que possam ser usados objetivamente para identificar a presença e/ou classificar a doença em um paciente, definir aspectos patofisiológicos do lúpus, atividade clínica, resposta à terapia, prognóstico e/ou risco de desenvolvimento de lúpus.

Além disso, seria vantajoso ter marcadores de diagnóstico baseados em moléculas associados com vários indicadores clínicos, patofisiológicos e/ou biológicos da doença. Dessa forma, existe uma necessidade contínua de se identificar novos /oci de rixo e polimorfismos associados ao lúpus, bem como outras doenças —autoimunes, Essas associações seriam altamente benéficas na identificação da presença de lúpus em pacientes ou na determinação da suscetibilidade em desenvolver a doença. Essas associações também seriam benéficas na identificação de aspectos patofisiológicos do lúpus, atividade clínica, resposta à terapia ou prognóstico. Além disso, as informações estatisticamente e biologicamente significativas e reproduzíveis em relação a essas associações poderiam ser utilizadas como um componente integral nos esforços para identificar subgrupos específicos de pacientes com expectativa de se beneficiarem do tratamento com um agente terapêutico específico, por exemplo, quando o agente terapêutico é ou mostrou ser benéfico na terapia —nos estudos clínicos nessas subpopulações de pacientes com lúpus. A invenção descrita no presente pedido vai de encontro à necessidade descrita acima e fornece outros benefícios. Todas as referências citadas no presente pedido, incluindo pedidos e publicações de patentes, são integralmente incorporadas ao presente pedido como referência para qualquer propósito.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO Os métodos fornecidos são baseados, pelo menos em parte, na descoberta de que o conjunto de novos /oci está associado com LES e que contribuem para o risco da doença (/oci de risco de LES). Além disso, é fornecido um conjunto de alelos associados com esses /oci de risco de LES. Está também incluído o alelo causal com o locus BLK que está associado com os efeitos biológicos que aumentam o risco de LES. Além disso, são fornecidos os loci de risco associados com outras doenças autoimunes e aumento de risco de LES.

Em um aspecto, é fornecido um método de identificação de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito, a presença de uma variação em um /ocus de risco de LES, emqueo/ocus de risco deLES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5', um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em outro aspecto, é fornecido um método de identificação de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelomenos um /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um dos loci, conforme apresentado na Tabela 4, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /ocí, ou pelo menos três foci, ou pelo menos quatro loci, ou pelo menos cinco /loci, ou pelo menos dez /oci, ou pelo menos 13 loci, ou pelo menos 26 loci. Em uma realização, pelo menos um locus é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10. Em uma realização, a variação em pelo menos um locus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 4. Em certas realizações, a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, é — detectada em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano. Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5', um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de identificação de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelomenos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três loci, ou pelo menos quatro /oci ou pelo menos cinco loci Em uma realização, pelo menos um locus é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLECT16A, IL12B e SH2B3. Em uma realização, a variação em pelo menos um locus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 6. Em certas realizações, a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de

LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, é detectada em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano. Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5', um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de identificação de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e a presença de uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em cada /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para cada locus, conforme apresentado nas Tabelas 4 e 6, respectivamente, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos três /oci, pelo menos quatro loci, pelo menos cinco loci, pelo menos sete /oci ou pelo menos dez loci. Em uma realização, pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 4, é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL1O, e pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A,

1L12B8 e SH2B3. Em uma realização, a variação em pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 4 e variação em pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende um SNP, conforme apresentado nas Tabelas 4 e 6, respectivamente.

Em certas realizações, a — presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela6, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, é detectada em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição deum SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5, um ensaio que emprega balizas moleculares

(molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em um aspecto, é fornecido um método para prever a responsividade de um sujeito com lúpus para um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em um /ocus de risco de LES, em que o locus de risco de LES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO:

13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 82 humano, em que a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES indica responsividade do sujeito para o agente terapêutico.

Em outro aspecto, é fornecido um método para prever a —responsividade de um sujeito com lúpus para um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em pelo menos um focus de risco pára LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, em que a presença de uma variação em pelo menos um locus indica responsividade do sujeito para o agente terapêutico.

Em certas realizações, o sujeito compreende uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três loci, ou pelo menos quatro /oci, ou pelo menos cinco loci, ou pelo menos dez loci, ou pelo menos 13 foci ou pelo menos 26 /oci.

Em uma realização, pelo menos um locus é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10. Em uma realização, a variação em pelo menos um focus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 4. Em certas realizações, o método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, em combinação com uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, em que a presença de uma variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e a presença da variação no locus BLK i indicam responsividade do sujeito para o agente terapêutico.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para prever a responsividade de um sujeito com lúpus para um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em cada /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelo menos um /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 6, em que a presença de uma variação em pelo menos um focus indica responsividade do sujeito para o agente terapêutico. Em certas realizações, o sujeito compreende uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /oci, ou pelo menos quatro /oci ou ou pelo menos cinco /oci. Em uma realização, pelo menos um locus é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em uma realização, a variação em pelo menos um focus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 6. Em certas realizações, o método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelo menos um focus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela6,em combinação com uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, em que a presença de uma variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6 e a presença da variação no locus BLK indicam responsividade do sujeito para o agente terapêutico.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método para prever a responsividade de um sujeito com lúpus para um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus,

conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelo menos um /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, em que a presença de uma variação em pelo menos um focus,

conforme apresentado na Tabela 6, indica responsividade do sujeito para o agente terapêutico.

Em certas realizações, o sujeito compreende uma variação em pelo menos três /oci, pelo menos quatro /oci, pelo menos cinco /oci, pelo menos sete /oci ou pelo menos dez /oci.

Em uma realização, pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, é selecionado a partir de TNIP1,

PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e IL1O, e pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 6, é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A, I1L12B8 e SH2B3. Em uma realização, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e em pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende um SNP, conforme apresentado nas

Tabelas4es&, respectivamente.

Em certas realizações, o método compreende determinar se o sujeito compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um locus, conforme apresentado na

—Tabela4, e uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que a variação em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 6, em combinação com uma variação no locus BLK de risco de LES, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, em que a presença de uma variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e a presença de uma variação em pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 6 e a presença da variação no locus BLK indicam responsividade do sujeito para o agente terapêutico. Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito, a presença de uma variação em um locus de risco de LES, em que o locus de risco de LES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação no locus BLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, a variação em pelo menos um /ocus compreende, ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação em pelo menos um /ocus é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /oci, ou pelo menos quatro /oci, ou pelo menos cinco loci, ou pelo menos dez /loci, ou pelo menos 13 loci ou ou pelo menos 26 /loci. Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e /L1TO. Em certas realizações, o método compreende detectar a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação no locus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e no locus BLK ocorre em uma posição —nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação no locus BLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um /ocus associado ao LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou —suspeitade compreender, um ácido nucleico que compreende pelo menos um locus de risco para LES, conforme apresentado na Tabela 6, a variação em pelo menos um locus compreende, ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e i a presença da variação em pelo menos um /ocus é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /oci, ou pelo menos quatro foci ou pelo menos cinco /oci. Em uma realização, pelo menos um locus de riscodeLES é selecionado a partir de IFIH1, CFB, CLEC16A, lL12B e SH2B3. Em certas realizações, o método compreende detectar a presença de uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, e uma variação no /ocus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, e a presença da variação —nolocusBLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método de diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4,e a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES,

7 conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação pelo menos um locus de - risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, variação em pelo menos um locus compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado nas Tabelas 4 e 6,

respectivamente, e a presença da variação em pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos três loci, pelo menos quatro loci, pelo menos cinco /loci, pelo menos sete /oci,

ou pelomenos dez /oci.

Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10, e pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em certas realizações, o método compreende detectara presença de uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES,

em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, e uma variação em pelo menos um locus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à . posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e a presença de uma variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6 e a presença da variação no locus BLK são diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em outro aspecto, é fornecido um método para auxiliar no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito, a presença de uma variação em um locus de risco de LES, em que o locus de risco de LES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação no locus BLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método auxiliar no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende pelo menos um locus de risco para LES, conforme apresentado na Tabela 4; a variação em pelo menos um locus compreende, ou está localizada em uma posição —nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação em pelo menos um locus é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /oci, ou pelo menos quatro loci, ou pelo menos cinco loci, ou pelo menos dez loci, ou pelo menos 13 loci, ou pelo menos 26 /oci, Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e 1L10. Em certas realizações, o método compreende detectar a presença de S uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, € uma variação no locus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQID NO: 13) em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação no locus BLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método auxiliar no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que — compreende pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, a variação em pelo menos um locus compreende, ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e a presença da variação em pelo menos um locus é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /ocí, ou pelo menos quatro /oci ou pelo menos cinco loci, Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES é selecionado a partir de IFIH1, CFB, CLEC16A,1/L12Be SH2B3. Em certas realizações, o método compreende detectar a presença de uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em combinação com a presença de uma variação no locus BLK de risco de LES, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, e uma variação no locus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e no /ocus BLK ocorre em uma posição —nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, e a presença da variação no locus BLK é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método para auxiliar no diagnóstico ou prognóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença de uma variação em pelo menos um —locusde risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, variação em pelo menos um locus compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado nas Tabelas 4 e 6, respectivamente, e a presença da variação em pelo menos um focus, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, é um diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos três /oci, pelo menos quatro /oci, pelo menos cinco loci, pelo menos sete loci ou pelo menos dez loci.

Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL1O, e pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, é selecionado a partir de IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em certas realizações, o método compreende detectar a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, em combinação com a presença de uma variação no /ocus BLK de risco de LES, em que: a amostra biológica é conhecida por compreender, ou suspeita de compreender, um ácido nucleico que compreende uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, e uma variação em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6, e uma variação em pelo menos um locus BLK, a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, e a variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6, compreende ou está localizada em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, e a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e a presença da variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e a presença de uma variação em pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 6 e a presença da variação no locus BLK são diagnóstico ou prognóstico de lúpus no sujeito.

Em um aspecto, é fornecido um método de tratamento de uma condição de lúpus em um sujeito, em que uma variação genética é conhecida por estar presente em uma posição nucleotídica correspondendo a um SNP em um locus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 3)e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição.

Em um aspecto, é fornecido um método para tratar uma condição de lúpusem um sujeito em que uma variação genética é conhecida por estar presente em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição. Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10.

Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar uma condição de lúpus em um sujeito em que uma variação genética é conhecida por estar presente em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, — conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição. Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES é selecionado a partir de

IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B30.

Em outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição em um sujeito que tem uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP em um locus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, que compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição em um sujeito que tem uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4. Em uma realização, pelo menos um locus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e IL10.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico efetivo para tratar a condição em um sujeito quetem uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6. Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico que se mostrou efetivo para tratar a dita condição em pelo menos um estudo clínico, em que o agente foi administrado

: em pelo menos cinco sujeitos humanos, em que cada um tinha uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP em um locus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico que se mostrou efetivo para tratar a dita condição em pelo menos um estudo clínico, em que o agente foi administrado em pelo menos cinco sujeitos humanos, em que cada um tinha uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4. Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, cujo método compreende administrar ao sujeito um agente terapêutico que se mostrou efetivo para tratar a dita condição em pelo menos um estudo clínico, em que o agente foi administrado em pelo menos cinco sujeitos humanos, em que cada um tinha uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6. Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de /IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3.

Em outro aspecto, é fornecido um método que compreende fabricar um agente terapêutico para lúpus, que inclui embalar o agente com instruções para administrar o agente para um sujeito que tem, ou que se acredita ter lúpus, e que tem uma variação genética em uma posição correspondente a um SNP em um /ocus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

Em ainda outro aspecto, é fornecido um método que compreende fabricar um agente terapêutico para lúpus, que inclui embalar o agente com instruções para administrar o agente para um sujeito que tem, ou que se acredita ter lúpus, e que tem uma variação genética em uma posição correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4.

Em ainda um aspecto adicional, é fornecido um método que compreende fabricar um agente terapêutico para lúpus, que inclui embalar o agente com instruções para administrar o agente para um sujeito que tem, ou que se acredita ter lúpus, e que tem uma variação genética em uma posição correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6.

Em um aspecto, é fornecido um método para selecionar um paciente que sofre de lúpus para tratamento com um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende detectar a presença de uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP em um locus de risco delES,emqueoSNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano. Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotíideo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5', um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método para selecionar um paciente que sofre de lúpus para tratamento com um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende detectar a presença de uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelo menos dois /loci, ou pelo menos três /oci, ou pelo menos quatro /oci, ou pelo menos cinco /oci, ou pelo menos dez /oci, ou pelo menos 13 /oci, ou pelo menos 26 /oci.

Em uma realização, pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e IL10. Em uma realização, a variação em pelo menos um locus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 4. Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5', um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método para selecionar um paciente que sofre de lúpus para tratamento com um agente terapêutico para lúpus, cujo método compreende detectar a presença de uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um SNP, conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6. Em certas realizações, é detectada uma variação em pelomenos dois /oci, ou pelo menos três loci, ou pelo menos quatro /oci ou pelo menos cinco loci.

Em uma realização, pelo menos um focus de risco de LES é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em uma realização, a variação em pelo menos um locus compreende um SNP,

conforme apresentado na Tabela 6. Em uma realização, a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo, um ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo, um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo, um ensaio de nuclease 5, um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons) e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

Em outro aspecto, é fornecido um método para avaliar se um Sujeito está em risco de desenvolver lúpus, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica obtida do sujeito, a presença de uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolver lúpus, em que a dita assinatura genética compreende um conjunto de pelo menos três SNPs, cada SNP ocorrendo em um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6. Em certas realizações, a assinatura genética compreende um — conjunto de pelo menos quatro SNPs, pelo menos cinco SNPs, pelo menos sete SNPs ou pelo menos dez SNPs.

Em uma realização, os loci de risco de LES são selecionados a partir de TNIP1, PRDMT1, JAZF1, UHRF1BP1, IL10, IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em certas realizações, a assinatura genética ainda compreende um SNP em um /ocus de risco de LES, em que o —SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o focus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

Em um aspecto adicional, é fornecido um método de diagnóstico de lúpus em um sujeito, cujo método compreende detectar em uma amostra biológica obtida do dito sujeito, a presença de uma assinatura genética indicativa de lúpus, em que a dita assinatura genética compreende um conjunto de pelo menos três SNPs, cada SNP ocorrendo em um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6. Em certas realizações, a assinatura genética compreende um conjunto de pelo menos quatro SNPs, pelo menos cinco SNPs, pelo menos sete SNPs, pelo menos dez SNPs, pelo menos quinze SNPs, pelo menos vinte SNPs ou pelo menos 30 SNPs. Em uma realização, os loci de risco de LES são selecionados a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1, IL10, IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3. Em certas realizações, a assinatura genética ainda compreende um SNP em um locus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra uma visão geral do projeto experimental para o estudo de replicação direcionada de certos SNPs para identificar loci de risco de LES adicionais, conforme descrito no Exemplo 1.

A Figura 2 mostra novas associações de significância genômica completa em LES e a identificação de novos /oci de risco em TNIP1 (A), PRDM1 (B), JAZF1 (C), UHRF1IBP1 (D) e IL10 (E), conforme descrito no Exemplo 1. (F) Um histograma dos valores P de SNPs independentes no caso e amostras de replicação controle, conforme descrito no Exemplo 1; a densidade esperada de resultados sob uma distribuição nula é indicada pelas linhastracejadas.

A Figura 3 mostra a porcentagem de variantes que alcançam candidatos (P < 1 x 105) e status confirmado (P < 5 x 10º) na metanálise estratificada pelo valor P no GWAS original, conforme descrito no Exemplo 1.

A Figura 4 mostra um bloco de desequilíbrio de ligação (mostrado em) dentro da região promotora BLK, conforme descrito no Exemplo 2. À Figura 4 divulga 'C>T-rs922483' como SEQ ID NO: 13.

A Figura 5 mostra os resultados de ensaios de expressão gênica de luciferase repórter da região promotora BLK, que tem vários haplótipos,

conforme descrito no Exemplo 2. (A) SNP rs922483 C>T (SEQ ID NO: 13) nas células BJAB; (B) SNP rs922483 C>T (SEQ ID NO: 13) nas células Daudi; (C) SNP rs1382568 A>C/G>C nas células BJAB; (D) SNP rs1382568 A>C/G>C nas células Daudi; (E) SNP rs4840568 G>A nas células BJAB; (F) SNP —rs4840568 G>A nas células Daudi; os dados mostrados representam a média +/- desvio padrão das médias dos ensaios em triplicata; as barras manchadas mostram os resultados para o haplótipo indicado à esquerda do gráfico; barras hachuradas: haplótipo de risco 22-ACT; barra vazia: haplótipo sem risco 22- GAC; *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ns = não significativo (ensaio t). As Figuras 5A a F divulgam repetição 22 (GT) como SEQ ID NO: 15. As Figuras 5C a F também divulgam “rs922483 C>T' como SEQ ID NO: 13.

A Figura 6 mostra os resultados de ensaios de expressão gênica repórter de luciferase da região promotora BLK, que tem tanto repetições 18 (GT) (SEQ ID NO: 14) como repetições 22 (GT) (SEQ ID NO: 15) e o SNP rs1382568 A>C/G>C nas células Daudi, conforme descrito no Exemplo 2. Os dados mostrados representam a média +/- desvio padrão da média nos ensaios em duplicata; ns = não significativo (ensaio t). A Figura 6 divulga repetição 18 (GT) como SEQ ID NO: 14, “repetição 22 (GT)' como (SEQ ID NO: 15 e 'rs922483 C>T' como SEQ ID NO: 13.

A Figura 7 mostra a sequência do SNP, rs922483 (SEQ ID NO: 13), e a localização dentro do SNP do alelo causal para o /ocus BLK, conforme descrito no Exemplo 2. A localização do alelo causal é mostrada por colchetes em negrito; as variações C/T estão indicadas em negrito.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro das técnicas do assunto. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura, como, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture" (R. |. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology' (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et a/l., eds., 1987, e periódicos atuais); “PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al, eds., 1994). Além disso, primers, oligonucleotídeos e polinucleotideos empregados na presente invenção podem ser gerados usando-se técnicas padrão conhecidas. A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos usados no presente pedido possuem o mesmo significado como geralmente entendido por um técnico no assunto para o qual essa invenção faz parte. Por exemplo, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2º ed., J. Wiley & Sons (Nova York, N.Y. 1994), e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4º ed., John Wiley & Sons (Nova York, N.Y. 1992), fornecem um guia geral para um técnico no assunto para muitos dos termos usados no presente pedido.

DEFINIÇÕES Para os propósitos de interpretação desse relatório descritivo, as definições a seguir adotarão, e sempre que apropriado, termos usados no singular que também incluem a forma plural e vice-versa. Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no singular “um”, “uma” e “o/a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente de outra forma. Dessa forma, por exemplo, tomar como referência “uma proteína” inclui uma série de proteínas; tomar como referência “uma célula” inclui misturas de células e similares. Na eventualidade de que qualquer definição apresentada abaixo entre em conflito com qualquer documento incorporado no presente pedido como referência, a definição abaixo predominará.

“Lúpus” ou “condição de lúpus”, como usado no presente pedido, é uma doença ou disfunção autoimune que em geral envolve anticorpos que atacam o tecido conjuntivo. A principal forma de lúpus é a sistêmica, lúpus eritematoso sistêmico (LES), incluindo LES cutâneo e LES cutâneo subagudo, bem como outros tipos de lúpus (incluindo nefrite, extrarrenal, cerebrite, pediátrico, não renal, discoide e alopecia).

O termo “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico”, como usado alternadamente no presente pedido, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo também pode ser modificado após polimerização, como por conjugação com um componente marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, “caps”, substituições de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações de internucleotídeos como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonato de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditicoatos, etc.), aqueles contendo unidades pendentes como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, poli-L-lisina, etc.), aqueles contendo intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aqueles contendo quelatos (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos

: alfa anoméricos, etc), bem como formas não modificadas de - polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila geralmente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos. As terminações OH 5' e 3' podem ser fosforiladas ou substituídas por aminas ou componentes de grupos com cobertura orgânico de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas também podem ser derivadas para grupos de proteção padrão. Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil- 2'-O-alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, açúcares carbocíclicos análogos, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, acíclicos análogos e análogos de nucleosídeos não básicos como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligações alternativas. Estes grupos de ligações alternativas incluem, mas não se limitam a realizações em que o fosfato é substituído por P(O)S(“ticato”), P(S)S (“ditioato”), “(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)JOR', CO ou CH2 (“formacetol”), em que cada R ou R' é independente de H ou substituído ou não substituído por alquil (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (--O--), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalguenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior aplica-se a todos os polinucleotídeos referidos no presente pedido, incluindo RNA e DNA.

“Oligonucleotídeo”, como usado no presente pedido, refere-se a polinucleotídeos curtos, de fita simples, que têm pelo menos cerca de 7 nucleotídeos em comprimento e menos que cerca de 250 nucleotídeos em comprimento. Os oligonucleotideos podem ser sintéticos. Os termos

“oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” não são mutuamente exclusivos. À - descrição acima para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicável para oligonucleotídeos. O termo “primer” refere-se a um polinucleotídeo de fita simples queé capaz de hibridizar com um ácido nucleico e permitir a polimerização de um ácido nucleico complementar, geralmente pelo fornecimento de um grupo OH 3' livre. O termo “variação genética” ou “variação de nucleotídeos” refere- se a uma alteração em uma sequência de nucleotídeos (por exemplo, inserção, deleção, inversão, ou substituição de um ou mais nucleotídeos, como polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP)) em relação a uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência comumente encontrada e/ou tipo selvagem, e/ou a sequência de um alelo principal). O termo também engloba a alteração correspondente no complemento da sequência de nucleotídeos, a menos que indicado de outra forma. Em uma realização, uma variação genética é um polimorfismo somático. Em uma realização, uma variação genética é um polimorfismo na linha genética.

Um “polimorfismo de nucleotídeo simples”, ou “SNP”, refere-se a uma posição de base única no DNA, na qual diferentes alelos ou nucleotídeos alternativos, existem em uma população. A posição do SNP é usualmente precedida e seguida por sequências altamente conservadas do alelo (por exemplo, sequências que variam em menos que 1/100 ou 1/1000 membros das populações). Um indivíduo pode se homozigoto ou heterozigoto para um alelo em cada posição do SNP.

O termo “variação de aminoácido” refere-se a uma alteração em uma sequência de aminoácidos (por exemplo, inserção, substituição ou deleção em um ou mais aminoácidos, como deleção interna ou truncamento na terminação N ou C) em relação a uma sequência de referência.

O termo “variação” refere-se tanto a uma variação no nucleotídeo como uma variação no aminoácido.

O termo “uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a uma posição de um SNP”, “uma variação de nucleotídeo em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP”, e variações gramaticais dos mesmos, referem-se a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de polinucleotídeos na posição de DNA correspondente relativa, ocupada pelo dito SNP no genoma. O termo também engloba a variação correspondente no complemento da sequência de nucleotídeos, a menos que indicado de outra forma.

O termo “arranjo” ou “microarranjo” refere-se a um arranjo ordenado de elementos de arranjo hibridizáveis, preferencialmente sondas de polinucleotídeos (como, oligonucleotídeos) em um substrato. O substrato pode ser um substrato sólido, como uma lâmina de vidro ou um substrato —semissólido, como membrana de nitrocelulose.

O termo “amplificação” refere-se ao processo de produção de uma ou mais cópias de uma sequência de ácido nucleico de referência ou seu complemento. A amplificação pode ser linear ou exponencial (por exemplo, PCR). Uma “cópia” não necessariamente significa sequência perfeita de —complementaridade ou identidade relativa para a sequência molde. Por exemplo, as cópias podem incluir nucleotídeos análogos como desoxi-inosina, alterações de sequência intencionais (como alterações de sequências introduzidas por meio de um primer que compreende uma sequência hibridizável, mas não completamente complementar ao molde), e/ou erros de — sequência que ocorrem durante a amplificação.

O termo “oligonucleotídeo específico para alelo” refere-se a um oligonucleotídeo que hibridiza com uma região de um ácido nucleico alvo que compreende uma variação de nucleotídeo (geralmente uma substituição).

“Hibridização específica para alelo” significa que, quando um oligonucleotídeo específico para alelo é hibridizado com seu ácido nucleico alvo, um nucleotídeo no oligonucleotídeo específico para alelo especificamente nos pares de base com a variação de nucleotídeo. Um oligonucleotídeo específico para alelo capazde realizar hibridização específica para alelo em relação a uma variação específica de nucleotídeo é conhecido como “específico para” essa variação. O termo “primer específico para alelo” refere-se a um oligonucleotídeo específico para o alelo que é um primer. O termo “ensaio de extensão de primer" refere-se a um ensaio em que os nucleotídeos são adicionados a um ácido nucleico resultando em um ácido nucleico mais longo ou “produto de extensão”, que é detectado diretamente ou indiretamente. Os nucleotídeos podem ser adicionados para estender as extremidades 5' ou 3' do ácido nucleico.

O termo “ensaio de incorporação de nucleotídeo específico para alelo” refere-se a um ensaio de extensão de primer em que um primer é (a) hibridizado ao ácido nucleico alvo em uma região que é 3' ou 5' de uma variação de nucleotídeo e (b) estendida por uma polimerase, incorporando através disso no produto de extensão de um nucleotídeo que é complementar à variação do nucleotídeo.

O termo “ensaio de extensão de primer específico para alelo” refere-se a um ensaio de extensão de primer em que um primer específico para alelo é hibridizado a um ácido nucleico alvo e estendido.

O termo “ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo” refere-se a um ensaio em que (a) um oligonucleotídeo específico para alelo é hibridizado com um ácido nucleico alvo e (b) a hibridização é detectada diretamente ou indiretamente.

O termo “ensaio de nuclease 5" refere-se a um ensaio em que a hibridização de um oligonucleotídeo específico para alelo a um ácido nucleico

' alvo permite a clivagem nucleolítica da sonda hibridizada, resultando em um sinal detectável.

O termo “ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons)" refere-se a um ensaio em que a hibridização de um oligonucleotídeo — específico para alelo a um ácido nucleico alvo resulta em um nível de sinal detectável que é maior do que o nível de sinal detectável emitido pelo oligonucleotídeo livre.

O termo “ensaio de ligação de oligonucleotídeo” refere-se a um ensaio em que um oligonucleotídeo específico para alelo e um segundo —oligonucleotídeo são hibridizados adjacentes um ao outro em um ácido nucleico alvo, e ligados juntos (tanto diretamente como indiretamente, através de nucleotídeos de intervenção) e o produto de ligação é detectado diretamente ou indiretamente.

O termo “sequência alvo”, “ácido nucleico alvo” ou “sequência de ácido nucleico alvo” refere-se geralmente a uma sequência de polinucleotídeo de interesse em que uma variação de nucleotídeo é suposta ou conhecida por residir, incluindo cópias desse ácido nucleico alvo gerado por amplificação.

O termo “detecção” inclui qualguer meio de detecção, incluindo detecção direta e indireta.

O termo “locus de risco de LES" e “locus de risco confirmado para LES” refere-se a qualquer um dos /oci indicados na Tabela 4, Tabela 8 e o locus BLK.

O termo “alelo de risco de LES" e “alelo de risco confirmado para LES” refere-se a uma variação que ocorre em um locus de risco de LES. Essas variações incluem, mas não se limitam a polimorfismos de nucleotídeo único, inserções e deleções. Certos alelos de risco de LES exemplares são indicados na Tabela 4 e na Tabela 6.

Como usado no presente pedido, um sujeito “com risco” de desenvolver lúpus, pode ou não ter a doença ou sintomas da doença detectáveis e pode ou não apresentar a doença ou sintomas da doença detectáveis, antes dos métodos de tratamento descritos no presente pedido. “Com risco” denota que o sujeito tem um ou mais fatores de risco, que são parâmetros mensuráveis correlacionados com o desenvolvimento do lúpus, conforme descrito no presente pedido e conhecido na técnica. Um sujeito que tem um ou mais desses fatores de risco tem maior probabilidade em desenvolver lúpus do que um sujeito sem um ou mais desse(s) fator(es) de risco.

O termo “diagnóstico” é usado no presente pedido para se referir à identificação ou classificação de um estado molecular ou patológico, doença ou condição. Por exemplo, “diagnóstico” pode se referir à identificação de um tipo específico de condição de lúpus, por exemplo, LES. “Diagnóstico” também pode se referir à classificação de um subtipo específico de lúpus, por exemplo, pelo envolvimento do tecido/órgão (por exemplo, lúpus nefrítico), por características moleculares (por exemplo, uma subpopulação de pacientes caracterizada por variação(ões) genética em um gene específico ou região do ácido nucleico) O termo “diagnóstico auxiliar” é usado no presente pedido para se referir aos métodos que auxiliam na determinação clínica em relação à presença ou natureza de um tipo específico de sintoma ou condição de lúpus. Por exemplo, um método de diagnóstico auxiliar de lúpus pode compreender a medição da presença de ausência de um ou mais /oci de risco de LES ou alelos de risco de LES em uma amostra biológica de um indivíduo.

O termo “prognóstico” é usado no presente pedido para se referir à previsão da probabilidade de sintomas da doença atribuíveis à disfunção autoimune, incluindo, por exemplo, recorrência, surto e resistência à droga, de uma doença autoimune como lúpus. O termo “predição” é usado no presente pedido para se referir à probabilidade em que um paciente responderá tanto de forma favorável como não favorável a uma droga ou conjunto de drogas.

Como usado no presente, “tratamento” refere-se à intervenção clínica como tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada, e pode ser realizado antes ou durante o curso de patologia clínica.

Efeitos desejáveis do tratamento incluem prevenção da ocorrência ou recorrência de uma doença, condição ou sintoma desta, alívio da condição ou sintoma da doença, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alvio do estado da doença, e obtenção de remissão ou melhora do prognóstico.

Em algumas realizações, métodos e composições da invenção são úteis para tentar retardar o desenvolvimento de uma doença ou disfunção.

Uma “quantidade efetiva” refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e para período de tempo necessário para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.

Uma “quantidade terapeuticamente efetiva” de um agente terapêutico pode variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo em obter uma resposta desejada no indivíduo.

Uma quantidade terapeuticamente efetiva também é aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do agente terapêutico é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Uma “quantidade profilaticamente efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva na dosagem e pelo período de tempo necessário para alcançar o resultado profilático desejado.

Tipicamente, mas não necessariamente, desde que uma dose profilática seja usada nos sujeitos, antes da doença ou em um estágio inicial, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.

Um “indivíduo”, “sujeito” ou “paciente” é um vertebrado.

Em certas realizações, o vertebrado é um mamífero.

Mamíferos incluem, mas não se

' limitam a, primatas (incluindo primatas humanos e não humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o mamífero é um humano. Uma “subpopulação de pacientes" e variações gramaticais da mesma, como usado no presente pedido, refere-se a um subgrupo de pacientes caracterizado por ter uma ou mais medidas distintas e/ou características identificáveis que distinguem o grupo de pacientes de outros na categoria geral da doença à qual eles pertencem. Essas características incluem subcategorias da doença (por exemplo, LES, nefrite lúpica), gênero, estilo de vida, histórico de saúde, órgãos/tecidos envolvidos, histórico de tratamento, etc.

Um “sujeito de controle” refere-se a um sujeito saudável que não foi diagnosticado com lúpus ou uma condição de lúpus e que não sofre de qualquer sinal ou sintoma associado ao lúpus ou condição de lúpus.

O termo “amostra”, como usado no presente pedido, refere-se a uma composição obtida ou derivada de um sujeito de interesse, que contém uma entidade celular e/ou outra molecular que será caracterizada e/ou identificada com base, por exemplo, nas características físicas, bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas. Por exemplo, as frases “amostra biológica” ou “amostra da doença" e variações da mesma, referem-se a qualquer amostra obtida de um sujeito de interesse que se espera conter, ou sabe-se que contém a entidade celular e/ou Molecular que será caracterizada.

Por “amostra de célula ou tecido” entende-se uma coleção de células similares obtidas a partir de um tecido de um sujeito ou paciente. À fonteda amostra de célula ou tecido pode ser tecido sólido de uma amostra de um órgão ou tecido fresco, congelado e/ou preservado, biópsia ou aspirado; sangue ou quaisquer componentes do sangue; fluidos corporais, como fluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial, células com qualquer tempo de gestação ou de desenvolvimento do sujeito. A amostra de tecido também pode primária, cultivada ou de linhagens celulares. Opcionalmente, a amostra de célula ou tecido é obtida a partir de um órgão ou tecido doente. A amostra de tecido pode conter compostos que naturalmente não são misturados com o tecido na natureza, como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes, antibióticos ou similares. Uma “amostra de referência”, “célula de referência”, “tecido de referência”, “amostra de controle”, “célula de controle”, ou “tecido de controle”, como usado no presente pedido, refere-se a uma amostra, célula ou tecido obtido a partir de uma fonte conhecida por, ou que se acredita, não ser afetada pela doença ou condição para a qual um método ou composição da invenção está sendo usada para identificar. Em uma realização, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle, ou tecido de controle é obtido a partir de uma parte saudável do corpo do mesmo sujeito ou paciente no qual uma doença ou condição está sendo identificada usando-se uma composição ou método da invenção. Em uma realização, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle, ou tecido de controle é obtido a partir de uma parte saudável do corpo de um indivíduo que não é o sujeito ou paciente no qual uma doença ou condição está sendo identificada usando-se uma composição ou método da invenção.

Para os propósitos no presente um “corte” de uma amostra de tecido significa uma parte única ou pedaço de uma amostra de um tecido, por exemplo, uma porção fina de tecido ou corte de células a partir de uma amostra de tecido. Entende-se que múltiplos cortes de amostras de tecido podem ser tirados e sujeitos à análise, de acordo com a presente invenção, desde que se entenda que a presente invenção compreende um método pelo qual o mesmo corte de amostra de tecido é analisado tanto em níveis morfológicos como molecular, ou é analisado tanto em relação à proteina . como ao ácido nucleico.

Por “correlacionar” ou “que correlaciona"” entende-se comparar, de qualquer maneira, o desempenho e/ou resultados de uma primeira análise ou protocolo com o desempenho e/ou resultados de uma segunda análise ou protocolo. Por exemplo, pode-se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo realizando-se um segundo protocolo e/ou pode-se usar os resultados de uma primeira análise ou protocolo para determinar se uma segunda análise ou protocolo deve ser realizada. Com relação à realização da análise ou protocolo da expressão gênica, pode-se usar os resultados da análise ou protocolo da expressão gênica para determinar se um regime terapêutico específico deve ser realizado.

A palavra “marcador” quando usada no presente pedido refere-se a um composto ou composição que é conjugada ou fundida diretamente ou indiretamente a um reagente, como uma sonda de ácido nucleico ou um anticorpo, e facilita a detecção do reagente ao qual está conjugado ou fundido. O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou no caso de um marcador enzimático, pode catalisar alteração química de um composto ou composição do substrato que é detectável.

Um “medicamento” é uma droga ativa para tratar uma doença, disfunção e/ou condição. Em uma realização, a doença, disfunção e/ou condição é lúpus ou seus sintomas e efeitos colaterais.

O termo “resistência aumentada” para um agente terapêutico — específico ou opção de tratamento, quando usado de acordo com a invenção, significa resposta diminuída para uma dose padrão da droga ou para um protocolo de tratamento padrão.

O termo “sensibilidade diminuída” para um agente terapêutico

' específico ou opção de tratamento, quando usado de acordo com a invenção, ' significa resposta diminuída para uma dose padrão do agente ou para um protocolo de tratamento padrão, onde a resposta diminuída pode ser compensada pelo (pelo menos parcialmente) aumento da dose do agente, ou — pelaintensidade do tratamento.

“Prever resposta” de um sujeito e variações da mesma pode ser avaliada usando-se qualquer meta que indique um benefício ao paciente, incluindo, sem limitação, (1) inibição, até certo ponto, da progressão da doença, incluindo desaceleração e interrupção completa; (2) redução no número de episódios e/ou sintomas da doença; (3) redução do tamanho da lesão; (4) inibição (ou seja, redução, desaceleração ou parada completa) de infiltração celular da doença em órgãos e/ou tecidos periféricos adjacentes; (5) inibição (ou seja, redução, desaceleração ou parada completa) de propagação da doença; (6) diminuição da resposta autoimune, que pode, mas não tem resultado na regressão ou ablação da lesão da doença; (7) alívio, até certo ponto, de um ou mais sintomas associados com a doença; (8) aumento no período de tempo livre de doença após o tratamento; e/ou (9) diminuição da mortalidade em um dado período de tempo após o tratamento.

Um “agente terapêutico para lúpus”, um “agente terapêutico efetivo para tratar lúpus”, e variações gramaticais dos mesmos, como usado no presente pedido, referem-se a um agente que quando fornecido em uma quantidade efetiva é conhecido, clinicamente mostrado, ou esperado pelos médicos, por fornecer um benefício terapêutico em um sujeito que tem lúpus. Em uma realização, a frase inclui qualquer agente que é vendido por um fabricante ou de outra forma usado por médicos licenciados, como um agente aceito clinicamente, que quando fornecido em uma quantidade efetiva é esperado fornecer um efeito terapêutico em um sujeito que tem lúpus. Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus compreende drogas anti-

' inflamatórias não esteroidais (NSAIDs), que inclui ácido acetil salicílico (por exemplo, aspirina), ibuprofeno (Motrin), naproxeno (Naprosyn), indometacina (Indocin), nabumetona (Relafen), tolmetina (Tolectin) e qualquer outra realização que compreenda um ingrediente(s) ativo(s) equivalente(s) —terapeuticamente e formulações dos mesmos. Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus compreende acetaminopeno (por exemplo, Tylenol), corticosteroides ou antimalária3 (por exemplo, cloroquina, hidroxicloroquina). Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus compreende uma droga imunomoduladora (por exemplo, azatioprina, ciclofosfamida, metotrexato, —ciclosporina), Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus é um agente celular anti-B (por exemplo, anti-CD20 (por exemplo, rituximabe), anti- CD22), um agente anticitocina (por exemplo, antifator de necrose tumoral a, receptor anti-interleucina-1 (por exemplo, anakinra), anti-interleucina 10, receptor anti-interleucina 6, anti-interferon alfa, estimulador anti-linfócito B), um inibidor de coestimulação (por exemplo, anti-CD154, CTLA4-Ig (por exemplo, abatacept)), um modulador de anergia de células B (por exemplo, LJP 394 (por exemplo, abetimus)). Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus compreende tratamento hormonal (por exemplo, DHEA), e terapia anti- hormonal (por exemplo, o agente antiprolactina bromocriptina).. Em uma realização, um agente terapêutico para lúpus é um agente que fornece imunoadsorção, é um fator anticomplemento (por exemplo, anti-C5a), vacinação de células T, transfecção de célula com cadeia zeta receptora de células T ou terapias com peptídeos (por exemplo, edratida que direciona idiotipos anti-DNA).

Um agente terapêutico que tem “aprovação no mercado”, ou que foi “aprovado como agente terapêutico”, ou variações gramaticais dessas frases, como usado no presente pedido, refere-se a um agente (por exemplo, sob a forma de uma formulação de droga, medicamento) que é aprovado,

licenciado, registrado ou autorizado por uma entidade governamental relevante (por exemplo, federal, agência reguladora estatal ou local, departamento, escritório) vendido por e/ou através e/ou em nome de uma entidade comercial (por exemplo, uma entidade com fins lucrativos) para o tratamento de uma — disfunção específica (por exemplo, lúpus) ou uma subpopulação de pacientes (por exemplo, pacientes com nefrite lúpica, pacientes de uma etnia específica, gênero, estilo de vida, perfil de risco da doença, etc). Uma entidade governamental relevante inclui, por exemplo, a Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Evaluation Agency (EMEA) e equivalentes dos mesmos.

“Anticorpos” (Abs) e “imunoglobulinas" (lgs) referem-se à glicoproteínas que têm características estruturais semelhantes. Enquanto os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antígeno específico, as imunoglobulinas incluem tanto anticorpos como outras moléculas similares a anticorpos, que geralmente são desprovidas de especificidade de antígeno. Polipeptídeos do último tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em níveis mais altos pelos mielomas.

Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina' são usados alternadamente no mais amplo sentido e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos inteiros ou anticorpos monoclonais intactos), anticorpos policlonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada) e também podem incluir certos fragmentos de anticorpos (conforme descrito em maiores detalhes no presente pedido). Um — anticorpo pode ser quimérico, humano, humanizado e/ou de afinidade madura.

Os termos “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo inteiro” são usados no presente pedido alternadamente, para se referir a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, e sem fragmentos de anticorpo conforme definido abaixo. Os termos referem-se, particularmente, a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm a região Fc. “Fragmentos de anticorpo” compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferencialmente que compreende a região de ligação de — antígenodomesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')», e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação de antígeno, chamados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade em cristalizar de imediato. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab'), que possui dois sítios de combinação de antígeno e é ainda capaz de reticular com o antígeno.

“Fv” é um fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma realização, uma espécie de Fv de cadeia dupla consiste de um dímero de um domínio variável da cadeia pesada e da cadeia leve em estreita associação não covalente. Coletivamente, as seis CDRs de um Fv conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo.

No entanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) possui a capacidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora com afinidade mais baixa do que aquela do sítio de ligação completo.

O fragmento Fab contém os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carboxila do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de

' dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação no presente pedido para Fab' em que o(s) resíduo(s) cisteina dos domínios constantes produzem pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpo F(ab'), originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiças de cisteinas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refereese a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações, por exemplo, mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em menores quantidades. Dessa forma, o modificador “monocional” indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos. Em certas realizações, esse anticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeos que se liga a um alvo, em que a sequência de polipeptídeos de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência de polipeptídeos de ligação alvo, a partir de uma pluralidade de sequências de polipeptídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone, a partir de uma — pluralidade de clones, como um agrupamento de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-se entender que a sequência de ligação alvo selecionada pode, ainda, ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para este alvo, humanizar a sequência de ligação alvo, melhorar sua produção na cultura celular, reduzir sua imunogenicidade in vivo, criarum anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a sequência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal dessa invenção. Ao contrário das preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes

' (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclilonal é dirigida contra um único determinante em um antígeno. Além de suas especificidades, preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas, porque são tipicamente descontaminadas por outras imunoglobulinas.

O modificador “"monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclionais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler ef al., Nature, 256: 495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2º ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (consulte, por exemplo, patente US 4.816.567), tecnologias de exibição por fago (consulte, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou similares aos humanos em animais que têm todo ou partes dos /oci de imunoglobulina humana ou genes que codificam sequências de imunoglobulinas humanas (consulte por exemplo, documento WO 1998/24893, documento WO 1996/34096, documento WO 1996/33735, documento WO 1991/10741, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann ef al, Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825,

5.625.126, 5.633.425, 5.661.016; Marks et al., Bio. Technology 10: 779-783

(1992); Lonberg et a/., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812- 813 (1994); Fishwild et a/., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol,, 13: 65-93 (1995).

Os anticorpos monoclonais no presente pedido especificamente incluem anticorpos “quiméricos” em que uma porção das cadeias pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567 e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6855-9855 (1984)).

Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma realização, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem — compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem, ainda, ser feitas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana.

O anticorpo humanizado, opcionalmente, também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

Para detalhes adicionais, consulte Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et a/l., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr.

Op.

Struct.

Biol. 2:593-596 (1992). Consulte também os seguintes artigos de revisão e referências citadas a esse respeito: Vaswani e Hamilton, Ann.

Allergy, Asthma & Immunol, 1:105-115 (1998); Harris, Biochem.

Soc.

Transactions 23:1035-

1038 (1995); Hurle e Gross, Curr.

Op.

Biotech. 5:428-433 (1994). Um “anticorpo humano" é aquele que compreende uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido porum humano e/ou que foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fabricar anticorpos humanos, conforme divulgado no presente pedido.

Essas técnicas incluem seleção de bibliotecas combinatórias derivadas de humanos, como bibliotecas de exibição por fago (consulte, por exemplo, Marks et al., J.

Mol.

Biol., 222: 581-597 (1991) e Hoogenboom et al., Nucl.

Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)); uso de linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma — camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (consulte, por exemplo, Kozbor, J.

Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987)); e Boerner etal,J.

Immunol., 147: 86 (1991)); e geração de anticorpos monoclonais em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena (consulte, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al, Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígeno a partir de um — animalnãohumano.

Um anticorpo de “afinidade madura” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs do mesmo, o que resulta em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação a um anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Em uma realização, um anticorpo de afinidade madura possui afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descrevem maturação da afinidade por mistura de domínios VH e VL. Mutagênese aleatória de HVR e/ou de resíduos de estrutura são descritas por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809- 3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Um “anticorpo de bloqueio” ou um “anticorpo antagonista" é aquele que inibe ou reduz uma atividade biológica do antígeno ao qual se liga. Certos anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas inibem parcialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

Uma “molécula pequena” ou “molécula orgânica pequena” é definida no presente pedido como uma molécula orgânica que tem um peso molecular abaixo de cerca de 500 Daltons.

A palavra “marcador”, quando usada no presente pedido, refere- se a um composto ou composição detectável. O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou no caso de um marcador enzimático, pode catalisar alteração química de um composto do substrato ou composição que resulte em um produto detectável. Radionuclídeos que podem servir como marcadores detectáveis incluem, por exemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211,Cu-67,Bi-212ePd-109.

Uma molécula biológica “isolada”, como um ácido nucleico, polipeptídeo ou anticorpo é aquela que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente natural.

A referência para “cerca de” um valor ou parâmetro no presente pedido inclui (e descreve) realizações que são direcionadas àquele valor ou parâmetro propriamente dito. Por exemplo, a descrição que se refere a “cerca de X" inclui a descrição de “X”.

TÉCNICAS GERAIS As variações de nucleotídeos associadas ao lúpus são fornecidas no presente pedido. Essas variações fornecem biomarcadores para lúpus e/ou predispõêm ou contribuem para o desenvolvimento, persistência e/ou progressão do lúpus. Consequentemente, a invenção divulgada no presente pedido é útil em uma variedade de definições, por exemplo, nos métodos e composições relacionadas ao diagnóstico e terapia para lúpus.

Em certas realizações, os métodos dizem respeito ao prognóstico, ou seja, a previsão da probabilidade de sintomas da doença atribuíveis à disfunção autoimune, incluindo, por exemplo, recorrência, surto e resistência à droga, de uma doença autoimune como lúpus. Em uma realização, a predição refere-se à extensão dessas respostas. Em uma realização, a predição refere-se se a probabilidade em que um paciente sobreviverá ou obterá melhora após o tratamento, por exemplo, tratamento com um agente terapêutico específico e/ou por certo período de tempo sem recorrência da doença. Os métodos preditivos da invenção podem ser usados

' clinicamente para tomar decisões de tratamento, pela escolha das modalidades de tratamento mais apropriadas para qualquer paciente específico.

Os métodos preditivos da presente invenção são ferramentas valiosas para prever se um paciente provavelmente responderá de forma favorável a um regime de tratamento, como um dado regime terapêutico, incluindo, por exemplo, administração de um dado agente ou combinação terapêutica, intervenção cirúrgica, quimioterapia, etc., ou se é provável a sobrevivência em longo prazo do paciente, após um regime terapêutico.

O diagnóstico do LES pode ser de acordo com o critério do American College of Rheumatology (ACR). A doença ativa pode ser definida por critério único “A” do British ILESs Lupus Activity Group's (BILAG) ou critério duplo “B” do BILAG.

Alguns sinais, sintomas ou outros indicadores usados para diagnosticar LES foram adaptados de: Tan et al. “The Revised Criteria for the Classification of LES” Arth Rheum 25 (1982) pode ser eritema malar como eritema nas bochechas, eritema discoide ou surgimento de manchas vermelhas, sensibilidade a luz, como reação à luz solar, resultando no desenvolvimento ou aumento no eritema da pele, úlceras orais como úlceras no nariz ou na boca, usualmente indolores, artrite, como artrite não erosiva envolvendo duas ou mais articulações periféricas (artrite na qual os ossos ao redor das articulações não são destruídos), serosite, pleurite ou pericardite, disfunção renal como excesso de proteína na urina (maior que 0,5 g/dia ou 3+ no ensaio de bastão) e/ou cilindros celulares (elementos anormais derivados da urina e/ou de glóbulos brancos e/ou células do túbulo renal), sinais neurológicos, sintomas ou outros indicadores, ataques (convulsões) e/ou psicose na ausência de drogas ou distúrbios metabólicos que são conhecidos por causar esses efeitos e sinais hematológicos, sintomas ou outros indicadores como anemia hemolítica ou leucopenia (contagem de glóbulos brancos abaixo de 4.000 células por milímetro cúbico) ou linfopenia (menos que 1.500 linfócitos por milímetro cúbico) ou trombocitopenia (menos que 100.000 plaquetas por milímetro cúbico). A leucopenia e linfopenia geralmente devem ser detectadas em duas ou mais ocasiões. A trombocitopenia geralmente deve ser detectada na ausência de drogas conhecidas por induzir a mesma. A invenção não é limitada a esses sinais, sintomas ou outros indicadores de lúpus.

DETECÇÃO DE VARIAÇÕES GENÉTICAS O ácido nucleico, de acordo com qualquer um dos métodos acima, pode ser de DNA genômico, RNA transcrito a partir de DNA genômico ou cDNA gerado a partir de RNA. O ácido nucleico pode ser derivado de um vertebrado, por exemplo, um mamífero. Um ácido nucleico é dito ser “derivado de” uma fonte específica se este for obtido diretamente dessa fonte ou se este for uma cópia de um ácido nucleico encontrado nessa fonte. Ácido nucleico inclui cópias do ácido nucleico, por exemplo, cópias que resultam da amplificação. A amplificação pode ser desejável em certos casos, por exemplo, a fim de se obter uma quantidade desejada de material para se detectar variações. Os amplicons podem ser então submetidos a um método de detecção de variação, como aqueles descritos abaixo, para determinar se uma variação está presente no amplicon. As variações podem ser detectadas por certos métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Esses métodos incluem, mas não se limitam ao sequenciamento de DNA, ensaios de extensão de primer, incluindo ensaios de incorporação de nucleotídeos específicos para alelos e ensaios de extensão de primer específicos para alelos (por exemplo, PCR específico para alelo, reação em cadeia de ligação específica para alelo (LCR) e gap-LCR), ensaios de hibridização de oligonucleotídeos específicos para alelo (por exemplo, ensaios de ligação de oligonucleotídeos), ensaios de proteção de clivagem nos quais a proteção dos agentes de clivagem é usada para detectar bases incompatíveis nos duplex de ácido nucleico, análise de ligação de proteína MutS, análise eletroforética que compara a mobilidade de moléculas de ácido nucleico variantes e tipo selvagem, eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE, como, por exemplo, em Myers et al. (1985) Nature 313:495), análise de clivagem de RNase nos pares de bases incompatíveis, análise de clivagem química ou enzimática de DNA heteroduplex, espectrometria de massa (por exemplo, MALDI-TOF), análise de bit genético (GBA), ensaios de nuclease 5' (por exemplo, TaqManº) e ensaios que empregam balizas moleculares. Alguns desses métodos são discutidos em maiores detalhes abaixo.

A detecção de variações em ácidos nucleicos alvo pode ser realizada por clonagem molecular e sequenciamento dos ácidos nucleicos alvo usando-se técnicas bem conhecidas. Alternativamente, técnicas de amplificação, como reação em cadeia da polimerase (PCR), podem ser usadas para amplificar as sequências de ácido nucleico alvo diretamente a partir de uma preparação de DNA genômico do tecido tumoral. A sequência de ácido nucleico das sequências amplificadas pode então ser determinada e as variações identificadas a partir desta. Técnicas de amplificação são bem conhecidas, por exemplo, reação em cadeia da polimerase conforme descrito em Saiki et al., Science 239:487, 1988; patentes US 4.683.203 e 4.683.195.

A reação em cadeia da ligase, que é conhecida na técnica, também pode ser usada para amplificar as sequências de ácido nucleico alvo. Consulte, por exemplo, Wu et al., Genomics 4:560-569 (1989). Além disso, uma técnica conhecida como PCR específica para alelo também pode ser usada para detectar variações (por exemplo, substituições). Consulte, por exemplo, Ruano e Kidd (1989) Nucleic Acids Research 17:8392; McClay et al. (2002) Analytical Biochem. 301:200-206. Em certas realizações dessa técnica, é utilizado um primer específico para alelo, em que o nucleotídeo na terminação 3' do primer é complementar a (ou seja, capaz de parear com base específica) uma variação específica no ácido nucleico alvo. Se a variação específica não está presente, um produto da amplificação não é observado. O Sistema de Mutação Refratário à Amplificação (ARMS) também pode ser usado para detectar variações (por exemplo, substituições), O ARMS é descrito, por exemplo, na publicação de pedido de patente europeia Nº 0332435 e em Newton et al., Nucleic Acids Research, 17:7, 1989.

Outros métodos úteis para detecção de variações (por exemplo, substituições) incluem, mas não se limitam a (1) ensaios de incorporação de nucleotídeos específicos para alelo, como ensaios de extensão de base única (consulte, por exemplo, Chen et al. (2000) Genome Res. 10:549-557; Fan et al. (2000) Genome Res. 10:853-860; Pastinen et a/. (1997) Genome Res. 7:606- 614; eYeetal. (2001) Hum. Mut. 17:305-316); (2) ensaios de extensão de primer específico para alelos (consulte, por exemplo, Ye et al. (2001) Hum. Mut. 17:305-316; e Shen et al. Genetic Engineering News, vol. 23, 15 de março de 2003), incluindo PCR específico para alelos; (3) ensaios de nuclease S'(consulte, por exemplo, De La Vega et al. (2002) BioTechniques 32:848-S54 (que descreve o ensaio de TaqManº); Ranade et al. (2001) Genome Res. 11:1262-1268; e Shi (2001) Clin Chem. 47:164-172); (4) ensaios que empregam balizas moleculares (consulte, por exemplo, Tyagi et al. (1998) Nature Biotech. 16:49-53; e Mhlanga et al. (2001) Methods 25:463-71); e (5) ensaios de ligação de oligonucleotídeos (consulte, por exemplo, Grossman et al. (1994) Nuc. Acids Res. 22:4527-4534; publicação de pedido de patente US 2003/0119004 A1; publicação internacional PCT documento WO 01/92579 A2; e patente US 6.027.889).

As variações também podem ser detectadas por métodos de detecção de combinações mal sucedidas. Combinações mal sucedidas são duplex de ácido nucleicos hibridizados que não são 100% complementares. À falta total de complementaridade pode ser devido a deleções, inserções,

inversões ou substituições. Um exemplo de método de detecção de combinações mal sucedidas é o ensaio de Detecção de Reparo de Combinações Mal Sucedidas (MRD) descrito, por exemplo, em Faham et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 102:14717-14722 (2005) e Faham et al., Hum. Mol. Genet 10:1657-1664 (2001). Um exemplo de uma técnica de clivagem de combinações mal sucedidas é o método de proteção de RNase, que está descrito em detalhes em Winter et al.,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:7575, 1985, e Myers et al., Science 230:1242, 1985. Por exemplo, um método da invenção pode envolver o uso de uma ribossonda marcada que é complementar ao ácido nucleico alvo tipo selvagem humano. A ribossonda e o ácido nucleico alvo derivado da amostra de tecido são enrijecidas (hibridizadas) junto e subsequentemente digeridas com a enzima RNase A que é capaz de detectar algumas combinações mal sucedidas em uma estrutura de RNA duplex. Se uma combinação mal sucedida é detectada por RNase A, ela se cliva no sítio da combinação mal sucedida. Dessa forma, quando a preparação do RNA anelado é separada em uma matriz de gel eletroforético, se uma combinação mal sucedida foi detectada e clivada por RNase A, um produto do RNA será visto, o qual é menor do que o duplex de RNA de comprimento total para a ribossonda e o MRNA ou DNA. A ribossonda não precisa ter o comprimento total do ácido nucleico alvo, mas pode ter uma porção do ácido nucleico alvo, desde que a mesma englobe a posição suspeita de ter uma variação. De uma maneira similar, sondas de DNA podem ser usadas para detectar combinações mal sucedidas, por exemplo, através de clivagem enzimática ou química. Consulte, por exemplo, Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397, 1988; e Shenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:989,

1975. Alternativamente, combinações mal sucedidas podem ser detectadas por transferência na mobilidade eletroforética de duplex com combinações mal!

i sucedidas em relação aos duplex com combinações bem sucedidas. Consulte, . por exemplo, Cariello, Human Genetics, 42:726, 1988. Tanto com ribossondas como sondas de DNA, o ácido nucleico alvo suspeito de compreender uma variação pode ser amplificado antes da hibridização. Trocas no ácido nucleico alo também podem ser detectadas usando-se hibridização de Southern, especialmente se as trocas são rearranjos brutos, como deleções e inserções.

Sondas de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) para o ácido nucleico alvo ou que cercam os genes marcadores podem ser usadas para detectar variações, por exemplo, inserções ou deleções. Inserções e deleções também podem ser detectadas por clonagem, sequenciamento e amplificação de um ácido nucleico alvo. A análise de polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP) também pode ser usada para detectar variantes com troca de base de um alelo. Consulte, por exemplo, Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989, e Genomics,5:874-879, 1989.

Um microarranjo é uma tecnologia multiplex que tipicamente utiliza uma série de arranjos de milhares de sondas de ácidos nucleicos para hibridizar com, por exemplo, uma amostra de cCDNA ou cRNA sob condições de alta estringência. Hibridização de sonda alvo é tipicamente detectada e quantifcada por detecção de alvos marcados de fluoróforo, prata ou quimioluminescência para determinar a abundância relativa de sequências de ácidos nucleicos no alvo. Em microarranjos típicos, as sondas são ligadas a uma superfície sólida por uma ligação covalente a uma matriz química (através de epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida ou outros). A superfície sólida é, por exemplo, vidro, um chip de silício ou microesferas microscópicas. Vários microarranjos estão comercialmente disponíveis, incluindo os fabricados, por exemplo, por Affymetrix, Inc. e Illumina Inc.

Uma amostra biológica pode ser obtida usando-se determinados

Ú métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. As amostras biológicas podem . ser obtidas a partir de animais vertebrados e, em particular, de mamíferos. À biópsia de tecido é frequentemente usada para se obter um pedaço representativo do tecido tumoral. Alternativamente, células tumorais podem ser obtidas indiretamente sob a forma de tecidos ou fluidos que são conhecidos, ou que se acredita que contenham células tumorais de interesse. Por exemplo, amostras de lesões de câncer de pulmão podem ser obtidas por resseção, broncoscopia, aspiração por agulha fina, escovação bronquial ou de cuspe, fluido pleural ou sangue. Variações nos ácidos nucleicos alvo (ou polipeptídeos codificados) podem ser detectadas a partir de uma amostra de tumor ou a partir de outras amostras do corpo, como de urina, cuspe ou soro. (Células cancerosas são descartadas dos tumores e aparecem nessas amostras do corpo). Pela seleção dessas amostras do corpo, um diagnóstico precoce simples pode ser alcançado para doenças como câncer. Além disso, o progresso da terapia pode ser mais facilmente monitorado por ensaio dessas amostras do corpo para variações nos ácidos nucleicos alvo (ou polipeptídeos codificados). Adicionalmente, métodos para enriquecer uma preparação de tecido para células tumorais são conhecidos na técnica. Por exemplo, o tecido pode ser isolado de cortes de parafina ou criostato. As células cancerosas também podem ser separadas a partir de células normais por citometria de fluxo ou microdissecção por captura a laser.

De modo subsequente a determinação de que um sujeito ou o tecido ou a amostra celular compreendem uma variação genética divulgada no presente pedido, é contemplada que uma quantidade efetiva de um agente terapêutico — apropriado para lúpus possa ser administrado ao sujeito para tratar a condição de lúpus no sujeito. O diagnóstico de várias condições patológicas em mamíferos descritas no presente pedido pode ser feito por técnicos no assunto. Técnicas de diagnóstico que estão disponíveis na técnica permitem, por exemplo, o diagnóstico ou detecção de lúpus em um mamífero.

Um agente terapêutico para lúpus pode ser administrado de acordo com métodos conhecidos, como administração intravenosa como um bolus ou por infusão contínua por um período de tempo, por rotas intramuscular, intraperitoneal, intracérebro-espinhal, subcutânea, intra-articular, intrasinovial, intratecal, oral, tópica ou inalação. Opcionalmente, a administração pode ser executada através de mini bomba de infusão, usando-se vários dispositivos disponíveis comercialmente.

Dosagens efetivas e programações para administração de agentes terapêuticos para lúpus podem ser determinadas empiricamente e fazer essas determinações estão dentro da técnica. Podem ser empregadas dosagens únicas ou múltiplas. Por exemplo, uma dosagem efetiva ou quantidade de inibidor de interferon usado isoladamente pode variar de cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou mais, por dia. Escalas de dosagens entre espécies — podem ser preparadas de um modo conhecido na técnica, por exemplo, conforme divulgado em Mordenti et al, Pharmaceut. Res., 8:1351 (1991).

Quando é empregada administração ín vivo de um agente terapêutico para lúpus, quantidades normais de dosagem podem variar de cerca de10 ng/kg até 100 mg/kg de peso corporal do mamífero ou mais, por dia, preferencialmente cerca de 1 pg/kg/ídia a 10 mg/kg/dia, dependendo da rota de administração. Orientações para dosagens específicas e métodos de distribuição são fornecidas na literatura; consulte, por exemplo, patentes US 4.657.760,

5.206.344 ou 5.225.212. Antecipa-se que diferentes formulações serão efetivas para diferentes compostos de tratamento e diferentes disfunções, que a administração que atinge um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar de distribuição de um modo diferente daquela para outro órgão ou tecido.

É contemplado que terapias adicionais podem, ainda, ser empregadas nos métodos. Uma ou mais diferentes terapias podem incluir, mas i não se limitam a administração de esteroides e outros regimes de cuidado padrão para a disfunção em questão. É contemplado que essas terapias diferentes podem ser empregadas como um agente separado, por exemplo, de um agente terapêutico direcionado para lúpus.

Kms Para uso nos pedidos descritos ou sugeridos acima, também são fornecidos kits ou artigos de fabricação. Esses kits podem compreender um meio carreador sendo compartimentalizado para receber, em confinamento fechado, um ou mais meios recipientes, como frascos, tubos e similares, cada meio recipiente compreendendo um dos elementos separados para ser usado no método. Por exemplo, um dos meios recipientes pode compreender uma sonda que é, ou pode ser, marcada de forma detectável. Essa sonda pode ser um polinucleotídeo específico para um polinucleotídeo que compreende um locus de risco de LES. Onde o kit utiliza hibridização de ácido nucleico para detectar ácido nucleico alvo, o kit também pode ter recipientes que contêm nucleotídeo(s) para amplificação da sequência de ácido nucleico alvo e/ou um recipiente que compreende um meio repórter, como uma proteína de ligação de biotina, como avidina ou estreptavidina, ligada a uma molécula repórter, como um marcador enzimático, fluorescente ou radioisótopo.

Os kits tipicamente compreendem o recipiente descrito acima e um ou mais recipientes que compreendem materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para uso. Um marcador pode estar presente no recipiente para indicar que a composição é usada para uma terapia específica ou aplicação —não terapêutica e pode também indicar direções tanto para uso in vivo como in vitro, como aqueles descritos acima.

Outros componentes opcionais no kit incluem um ou mais tampões (por exemplo, tampão de bloqueio, tampão de lavagem, tampão substrato, etc.),

outros reagentes como substrato (por exemplo, cromogênio) que é quimicamente alterado por um marcador enzimático, solução de restauração de epítopo, amostras de controle (controles positivos e/ou negativos), lâmina(s) de controle, etc. Um composto adicional é uma enzima, por exemplo, que inclui, mas não se limitaa uma nuclease, uma ligase ou uma polimerase.

MÉTODOS DE COMERCIALIZAÇÃO Também são fornecidos métodos para comercialização de um agente terapêutico para lúpus ou uma composição farmaceuticamente aceitável do mesmo, que compreende promover, orientar e/ou especificar para um público alvo, o uso do agente ou composição farmacêutica do mesmo para tratar um paciente ou uma população de pacientes com lúpus, dos quais uma amostra foi obtida mostrando a presença de uma variação genética, conforme divulgado no presente pedido. O marketing geralmente é uma comunicação paga através de um meio não pessoal no qual o patrocinador é identificado e a mensagem é controlada. Marketing para os propósitos no presente pedido inclui publicidade, relações públicas, disposição do produto, patrocínio, subscrição e promoção de vendas. Esse termo também inclui notícias públicas com informações patrocinadas em qualquer meio de comunicação impresso designada para atrair o público de massa, persuadir, informar, promover, motivar ou de outra forma modificar o comportamento em direção a um padrão favorável de compra, apoio ou aprovação da invenção no presente pedido. O marketing do método de diagnóstico pode ser realizado por qualquer meio. Exemplos de meios de marketing usados para distribuir essas —mensagens incluem televisão, rádio, cinema, revistas, jornais, internet e outdoors, incluindo comerciais que são mensagens que aparecem na radiodifusão. O tipo de marketing usado dependerá de muitos fatores, por exemplo, da natureza do público alvo a ser atingido, por exemplo, hospitais,

Ú companhias de seguro, clínicas, médicos, enfermeiras e pacientes, bem como considerações de custo e a relevância das leis jurisdicionais e normas governamentais de marketing para medicamentos e diagnósticos. O marketing pode ser individualizado ou personalizado com base nas caracterizações do usuário, definidas pela interação do serviço e/ou outros dados, como demografia e localização geográfica. A seguir estão os exemplos dos métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLOS Ao longo dos Exemplos, referências para certas publicações são denotadas por números, que apresentam informação bibliográfica completa no final da seção de Exemplos. EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DOS Novos LocI DE RISCO DELES

MÉTODOS E SUJEITOS SuseITOS A seleção e genotipagem dos casos de LES, as amostras usadas na varredura de associação de genoma completo (GWAS) bem como os controles da coleção New York Health Project (NYHP) (Mitchell et al., J Urban Health 81(2):301-10 (2004)), foram previamente descritos (Hom et al, N Engl J Med 358(9):900-9 (2008)). Conforme detalhado abaixo, os casos de LES consistiram em três séries de casos: a) 338 casos do Autoimmune Biomarkers Collaborative Network (ABCON) (Bauer et al, PLoS medicine 3(12):2491 (2006)), um repositório fundado por NIH/NIAMS, e 141 casos do Multiple Autoimmune Disease Genetics Consortium (MADGC) (Criswell et al, Am J Hum Genet 76(4):561-71 (2005)); b) 613 casos da University of California San Francisco (UCSF) Lupus Genetics Project (Seligman et al., Arthritis Rheum

44(3):618-25 (2001); Remmers et al., N Engl J Med 357(10):977-86 (2007)); e ' c) 335 casos da University of Pittsburgh Medical Center (UPMC) (Demirci et al., Ann Hum Genet 71(Pt 3):308-11 (2007)) e 8 casos do The Feinstein Institute for Medical Research. Os controles foram 1861 amostras da coleção NYHP, 1722 amostras do banco de dados iControlDB disponível publicamente (disponível em lIllumina Inc.), e 4564 amostras do projeto National Cancer Institute Cancer Genetic Markers of Susceptibility (CGEMS) disponível publicamente (disponível na URL: cgems.cancer.gov). CONJUNTO DE DADOS DO GENOMA COMPLETO DE 1310 CASOS DE LES E DE 7859

CONTROLES Descrevemos previamente a seleção e a genotipagem de amostras de casos de LES (Hom et al, N Engl J Med 358(9):900-9 (2008)). Todos os casos de LES eram de Norte Americanos descendentes de Europeus, conforme determinado por auto relato e confirmado pela —genotipagem. O diagnóstico de LES (cumprimento de quatro ou mais dos critérios definidos pelo American College of Rheumatology [ACR] [Hochberg et al., Arthritis Rheum 40(9):1725[1997]]) foi confirmado em todos os casos por revisão de prontuários médicos (94%) ou através de documentação escrita de critérios por tratamento de reumatologistas (6%). Os dados clínicos dessas séries de casos são apresentados em outro lugar (Seligman et al., Arthritis Rheum 44(3):618-25 (2001); Criswell et al, Am J Hum Genet 76(4):561-71 (2005); Bauer et al., PLoS medicine 3(12):2491 (2006); Demirci et al., Ann Hum Genet 71(Pt 3):308-11 (2007); Remmers et al., N Engl J Med 357(10):977-86 (2007)). A genotipagem e a seleção das amostras do NYHP foram previamente descritas (Hom et al, N Engl J Med 358(9):900-9 (2008)). A Tabela 1 descreve o número de amostras contribuídas organizadas por local. A amostra e a filtagem de SNP foram conduzidas usando-se módulos analíticos nos programas de computação PLINK e EIGENSTRAT,

conforme descrito abaixo (consulte também, Purcell et al, Am J Hum Genet 81(3):559-75 (2007); Price et al., Nat Genet 38(8):904-09 (2006)). Os dados de SNP do genoma completo foram usados nesse estudo para facilitar estreita combinação de casos e de controles e para fornecer genótipos nos /oci de LES confirmados e suspeitos. TABELA 1

NÚMERO DE AMOSTRAS ANALISADAS EM GENOMAS COMPLETOS E ESTUDO DE

REPLICAÇÃO ORGANIZADO POR LOCAL Coleção de Coleção de Caso N Controle N Amostras descobertas GWAS*? 1310 7859 Amostras de replicação Us” PROFILE 415 NYHP 776 UMN 366 ALZ 2215 UCSF 284 UPMC 52 JHU 12 Total 1129 2991 Suéciaº Umeâ 244 Umeâ - Uppsala 145 Uppsala 132 Estocolmo 270 Estocolmo 1112 Lund 155 Lund 94 Total 834 Total 1338 Total 3273 12188 ? Amostras a partir da varredura de associação de genoma completo descritas (Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008)). ? Casos de LES independentes a partir de um grupo dos Estados Unidos extraídos do consórcio PROFILE LES, University of California - São Francisco (UCSF) (Thorburn, C.M. et al., Genes Immun 8:279-87 (2007)), University of Pittsburgh Medical Center (UPMC), University of Minnesota (UMN), e Johns Hopkins University (JHU). Controles dos Estados Unidos a partir do New York Health — Project (Gregersen ef al.) e casos e controles de Alzhiemers a partir da University of Pittsburgh e a NCRAD. º Casos e controles de LES a partir de Estocolmo, Karolinska, Solhna, Uppsala, Lund e Umeâá, Suécia. * 823 dos controles de Estocolmo foram genotipados usando-se o arranjo SNP Illumina 317K. SNPs nessas amostras foram imputados e analisados conforme descrito em Métodos.

ARRANJO DE SNP PERSONALIZADO Um arranjo personalizado foi projetado com 10.848 SNPs que passou pelos indicadores de controle de qualidade descritos abaixo. O arranjo completo teve 12.864 SNPs, mas 2.016 SNPs falharam nos indicadores de controle de qualidade, deixando 10.848 SNPs que avançaram na análise. O arranjo personalizado consistiu de 3.188 SNPs selecionados com base em um P nominal <0,05 em uma varredura de associação de genoma completa, 505 SNPs a partir de 25 /oci de risco de LES previamente relatados, 42 SNPs selecionados após uma pesquisa bibliográfica para alelos de risco confirmados com base em outras doenças autoimunes e 7.113 SNPs usados para certificar e controlar a subestrutura da população. O último grupo incluiu SNPs que tinham sido usados para definir as diferenças da população continental (Kosoy, R. et al., Hum. Mutat. 30:69-78 (2009)) e SNPs enriquecidos para subestrutura da população Europeia (Tian, C. et al, PLoS Genet 4, e4 (2008)). O arranjo personalizado foi produzido por Illumina, Inc. usando seu iSelect Custom BeadChip e os números de identificação rs fornecidos para os SNPs, que passaram pelos filtros de controle de qualidade descritos abaixo.

i CONTROLE DE QUALIDADE E IMPUTAÇÃO Para os dados dos EUA, um total de 1.464 casos nos Estados Unidos e 3.078 controles nos Estados Unidos foram genotipados no chip Ilumina personalizado descrito acima, também citado no presente pedido comoochipde 12K personalizado. Usamos rigorosos critérios de controle de qualidade (QC) para assegurar que os dados de alta qualidade estejam incluídos na análise final. Especificamente, a) excluímos 116 indivíduos que tinham > 5% de dados perdidos e b) excluímos 279 indivíduos com base em parentesco oculto e amostras duplicadas com base na condição Idêntica por Estado (IBS) (PI Hat > 0,15). Incluímos somente SNPs com a) dados perdidos < 5%, b) Equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) valor p> 1x 108, c) Alelo de Menor Frequência (MAF) > 0,01 % e d) SNPs com valor p > 1 x 10º em um ensaio para diferencial de omissão completa entre casos e controles. SNPs também foram examinados para efeitos de batelada. Depois de aplicar os filtros acima, um conjunto final de 1.144 casos e 3.003 controles e 11.024 SNPs estavam disponíveis para análise. Todos os ensaios de QC foram realizados utilizando PLINK (Purcell et al, Am J Hum Genet 81(3):559-75 (2007)).

Para os dados suecos, um conjunto de 888 casos e 527 controles — genotipados no chip de 12K personalizado estavam disponíveis para análise. Um conjunto separado de 1.115 controles suecos genotipados pela Illumina, Inc. arranjo de microesfera 317K Human HapMap SNP (também citado no presente pedido como arranjo de 317K) foi também incorporado na análise. Seguimos as seguintes etapas para combinar os dois conjuntos de dados. Em primeiro lugar, foi criado um conjunto de dados sobreposto de 6.789 SNPs entre os dados de 12K e 317K. Usamos esse conjunto de dados para examinar o grupo de replicação sueco para parentesco oculto e amostras duplicadas. Como resultado, 313 amostras foram excluídas (Pl Hat > 0,15). Após as verificações de controle de qualidade, encaminhados para análise 863 casos e - 523 controles genotipados no chip de 12K personalizado e 831 controles genotipados no chip Illumina de 317K. Em segundo lugar, imputamos (consulte abaixo) os 831 controles suecos genotipados com o arranjo de 317K para criar um conjunto maior de sobreposição de SNPs. Dos SNPs restantes, capturamos 4.605 SNPs por imputação. Um conjunto final de 11.394 SNPs de sobreposição foi encaminhado para análise. Filtramos os SNPs nesse conjunto de dados usando os mesmos limiares conforme descrito acima. Os 1.250 SNPs restantes não capturados pela imputação foram analisados somente no conjunto original de amostras suecas genotipados no chip de 12K.

Os 831 controles suecos genotipados com o arranjo de 317K foram imputados utilizando MACH (uma Cadeia de Markov baseada no programa — de computação de haplotivpagem disponível na URL sph.umich.edu/csg/abecasis/MACH) usando amostras de CEU do HapMap —Fasellcomo uma referência. CEU de HapMap de Fase || refere-se a amostras do Projeto de Halotipos Humanos conhecidos como residentes de Utah com ancestralidade do norte e oeste da Europa (CEU) a partir da liberação dos dados da “Fase II”. (Consulte também, Li et al. Am J Hum Genet S79 em 2290 (2006)). Antes da imputação, aplicamos rigorosas verificações de controle de qualidade sobre os SNPs de 317K. Um subconjunto de 293.242 marcadores que passam pelos seguintes critérios (1) MAF >1%, (2) taxa de perdidos <5% e (3) HWE valor p >1 x 10º foram incluídos na imputação. Após a imputação, SNPs com baixa qualidade de imputação, ou seja, R-elevado ao quadrado Hat (RSQR HAT) < 0,40 relatado por MACH, foram descartados. Um conjunto de —sobreposição de 11.394 marcadores estava disponível para análise. Levando em conta a incerteza na imputação, foram utilizadas na análise pontuações probabilísticas ao invés de chamar de genótipo.

Para imputação de amostras de estudo de associação de

Ú genoma completo, o dado de genótipo utilizado na metanálise foi de 1310 - casos de LES genotipados com a plataforma SNP de genoma completo Illumina 550K (consulte, Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008)). À seleção e a genotipagem das amostras de casos de LES foram previamente descritas (Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008)). Além dos 3.583 controles previamente descritos (Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008)), 4.564 amostras de controle a partir do projeto de Suscetibilidade de Marcadores Genéticos de Câncer (CGEMS) publicamente disponíveis foram incluídas após obtenção da aprovação (disponível na URL: cgems.cancer.gov). A amostra inteira de 7.859 controles foi examinada usando-se os dados de filtros de controle de qualidade, como descrito anteriormente (Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008)). A seguir, usamos IMPUTE versão 1 (disponível na URL www.stats.ox.ac.uk/-marchini/software/gwas/impute.html) para inferir genótipos utilizando amostras de CEU HapMap Fase |l como referência (Marchini, J. et al, Nat. Genet. 39:906-913 (2007)). Utiizamos SNPTEST (disponível na URL www.stats.ox.ac.uk/-marchini/software/gwas/snptest v1.1.4.html) para gerar associação estatística (Marchini, J. et al, Nat Genet. 39:906-913 (2007)). Especificamente, as associações estatísticas foram geradas utilizando um modelo de aditivo (-Frequentist 1 opção em SNPTEST), ajustado para a incerteza do genótipo imputado (-proper opção em SNPTEST). A classificação da lista ordenada de associação estatística foi usada para selecionar regiões para replicação como descrito.

ESTRATIFICAÇÃO DA POPULAÇÃO EM AMOSTRAS DE REPLICAÇÃO Para cada grupo de replicação, usamos marcadores informativos de ancestralidade para corrigir os dados de estratificação da população possível. Um subconjunto de 5.486 marcadores informativos de ancestralidade não correlacionados que passaram por rigoroso critério de controle de

: qualidade foi utilizado para inferir os dez principais componentes de variação genética utilizando o programa de computação EIGENSTRAT (Price et a/l., Nat Genet 38 (8):904-09 (2006)). Valores discrepantes foram removidos de cada conjunto de amostra (definido como o > 6). Especificamente, removemos 27 valores discrepantes genéticos do grupo dos EUA e 45 valores discrepantes do grupo sueco, respectivamente. Algum grau de estratificação da população junto com os dois primeiros autovetores foi observado tanto nas coleções de replicação americana como na sueca. Para corrigir a estratificação do caso- controle, utilizamos uma das seguintes estratégias: (1) aplicamos a correção da estatística de ensaio de Cochran-Armitage incorporadas em EIGENSTRAT para o conjunto de dados de replicação americanos e para o conjunto de dados suecos sempre que o dado do genótipo estava disponível; (2) usamos componentes principais como covariáveis em um modelo de regressão logística na análise dos dados suecos imputados.

ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO Para os dados dos EUA, foi observado alguma inflação na estatística de ensaio após a realização de um ensaio alélico de um grau de liberdade não corrigido para associação (PLINK [Purcell, S. et al. Am J Hum Genet 81:559-75 (2007)]). Para corrigir a estratificação da população na amostra dos EUA, foi conduzida análise de componentes principais (EIGENSTRAT), utilizando 5.486 marcadores informativos de ancestralidade não correlacionada. Em primeiro lugar, removemos valores genéticos discrepantes (definido como o > 6). Em segundo lugar, estatísticas de ensaio de qui-quadrado de Cochran-Armitage de tendência calculada para cada SNP —genotipado em 1.129 casos e 2.991 controles, seguido por ajuste do valor estatístico de ensaio de cada SNP em EIGENSTRAT utilizando os quatro primeiros autovetores. Foi calculado valores p bicaudados com base no ensaio estatístico para cada SNP. Após a correção para a estratificação da população,

' O Age Nas amostras dos EUA foi de 1,05.

- Para os dados suecos, examinamos o grupo sueco para a estratificação de população oculta utilizando 5.486 marcadores informativos de ancestralidade genotipados nas amostras de 12K, bem como nos controles de 317K lllumina adicional. Após a remoção de discrepâncias genéticas, tinhamos 834 casos e 515 controles genotipados no chip de 12K personalizado e 823 controles genotipados no chip de 317K da lllumina. Usamos a correção da estatística de ensaio implementada em EIGENSTRAT no conjunto de sobreposição de 6789 SNPs entre os dois arranjos da Ilumina. Para corrigir a estratificação no conjunto de 4605 SNPs genotipados nas amostras de 12K e imputados nas amostras de 317K da lllumina, utiizamos os quatro primeiros autovetores determinados acima como covariáveis em um modelo de regressão logística implementado em SNPTEST porque EIGENSTRAT não foi destinado para uso com dados de genótipos imputados. Um pequeno conjunto de 1250 marcadores não capturados por imputação nos SNPs de 317K da lllumina foram analisados somente nos 834 casos e 515 controles genotipados no chip de 12Kpersonalizado. Após a correção da estratificação da população, o Age nas amostras suecas foi de 1,10.

METANÁLISE Usamos um método de z-score ponderado para realizar a metanálise. Para combinar resultados entre diferentes grupos, os alelos foram orientados para a fita forward do National Center for Biotechnology Information (NCBI), 36 sequências de referência do genoma humano para evitar ambiguidade associada a C/G e A/T dos SNPs. A sequência de referência do NCBI do genoma humano está disponível na URL www.ncbi.nlm.nih.gov. Consulte também Pruitt et a/., Nucl. Acids Res. 35 (edição do banco de dados):D61-D65 (2007). Foram convertidos valores P para cada grupo em z-scores, levando em conta direção de efeito relativo a um alelo de referência arbitrário. A soma ponderada dos z-scores foi calculada pesando cada z-score pela raiz quadrada do tamanho da amostra para cada grupo e, em seguida, dividindo a soma pela raiz quadrada do tamanho da amostra total. O z-score combinado para os grupos de replicação suecos e americanos foram convertidos para valores bp unicaudal A metanálise de z-score foi convertida para um valor Pp bicaudal e foi avaliada a evidência para associação. Consideramos SNPs que passam um limiar de 5 x 10º predominantemente associado com LES. Loci com valores p combinados menor que 1 x 10º, que não passam a significância do genoma completo foram considerados fortes candidatos. O método de metanálise foi executado usando-se o pacote de programa de computação gratuito METAL (disponível na URL www.sph.umich.edu/csg/abecasis/Metal). Para calcular as razões de chance combinadas, utilizamos o método Cochran-Mantel-Haenszel (CMH), conforme executado pelo programa de computação METAL. Foram calculadas as razões de chance relativas ao alelo de risco para cada SNP. Além disso, foi calculada uma frequência alélica média ponderada em controles relativos ao alelo de risco de cada SNP.

PERCENTUAL DE VARIÂNCIA EXPLICADA Foi calculado o percentual de variância explicada para SNPs previamente associados com LES e SNPs com uma meta de valor p menor que 1 x 10º em nosso estudo de replicação. Usamos um modelo de limiar de responsabilidade que assume que o LES tem uma pontuação de responsabilidade subjacente, que é normalmente distribuído com média O e variância um. Assumimos prevalência de 0,1% de LES na população em geral. Para calcular o limite para cada genótipo, utilizamos as frequências alélicas nos controles e um tamanho de efeito

: correspondente à razão de chance (OR) de nossa análise.

ANÁLISE DE INTERAÇÃO Para procurar os efeitos epistáticos entre os sinais de topo, compilamos uma lista de todos os SNPs nas Tabelas 2, 4 e B e realizamos uma análise de interação em cada grupo de replicação usando a opção de epístase implementada em PLINK. Para obter maior poder estatístico, foi realizada uma análise somente de caso. Após correção do número de ensaios, nenhuma das interações SNP-SNP significativas foram encontradas no nível p < 0,05.

ANÁLISE CONDICIONAL Em cada região genômica que exibe forte associação com LES, selecionamos o SNP que exibe o sinal mais forte. Usamos PLINK para condicionar nesse SNP e procurar por outros SNPs que exibem forte associação com LES. UM ESTUDO DE REPLICAÇÃO DE LARGA ESCALA IDENTIFICA TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 E I1L10 como Loci DE Risco Novos PARA LÚPUS

ERITEMATOSO SISTÊMICO Recente associação genômica completa (GWA) e estudos de genes candidatos identificaram pelo menos 15 alelos de risco comuns que atingem significância genômica completa (P < 5 x 10º). Esses importantes genes incluem imunidade adaptativa e a produção de autoanticorpos (alelos HLA de classe Il, BLK, PTPN22 e BANK1) e genes com função na imunidade inata e sinalização de interferon (ITGAM, TNFAIP3, STAT4 e IRF5) (Cunninghame Graham, D.S. et al., Nat. Genet. 40:83-89 (2008); Graham, RR. et al., Nat. Genet. 40(9):1059-61 (2008); Graham, R.R., et al., J Intern Med 265:680-88 (2009); Harley, J.B. et al., Nat. Genet. 40:204-10 (2008); Hom, G. et al, N Engl J Med 358:900-9 (2008); Kozyrev, S.V. et al., Nat. Genet. 40:211-6 (2008); Sawalha, A.H. et al.,

' PLoS ONE 3:e1727 (2008); Sigurdsson, S. et al, Am J Hum Genet 76:528-37 (2005)). Para identificar /oci de risco adicionais, realizamos um estudo de replicação alvo de SNPs a partir de 2.466 /oci que apresentaram um valor P nominal < 0,05 em uma varredura recente GWAS7 de 1310 casos e 7859 controles. Também genotipamos SNPs a partir de 25 /oci de risco de LES previamente relatados, 42 SNPs de 35 loci implicaram em outras doenças autoimunes e mais de 7.000 marcadores informativos de ancestralidade. Uma visão geral do projeto experimental é mostrada na Figura 1. Os SNPs descritos acima foram incorporados em um arranjo de SNP personalizado Illumina. O arranjo foi genotipado em casos independentes e controles dos EUA e da Suécia. Oitocentos e vinte e três dos controles suecos foram genotipados utilizando o arranjo de SNP de 310K lIllumina e variantes foram analisadas como descrito nos Métodos acima.

Especificamente, como descrito acima, foi projetado um arranjo personalizado de SNP que consiste de > 12.000 variantes e genotipados dois casos de LES independentes e populações de controle dos Estados Unidos (1.129 casos de LES e 2.991 controles) e Suécia (834 casos de LES e 1.338 controles). Incluído entre os controles dos EUA estavam 2.215 casos da doença de Alzheimer/amostras de controle, que foram consideradas aceitáveis como controles desde a base genética do LES e espera-se que sejam independentes da doença de Alzheimer. À seguir, aplicamos filtros de qualidade de dados para remover amostras de desempenho pobre e SNPs, população discrepante e indivíduos —duplicados/relacionados (consulte Métodos acima). Após essas medidas de controle de qualidade, um conjunto final de 10.848 SNPs foi examinado como indicado na Figura 1. Associações estatísticas para

3.735 variantes foram calculadas e corrigidas para a estratificação da

' população usando-se 7.113 marcadores informativos de ancestralidade (consulte Métodos acima).

Primeiro examinamos 25 variantes (a partir de 23 loci) que foram previamente relatadas para serem associadas ao LES (consulte — Tabela2). Encontramos evidência adicional de associação para 21 das variantes (P < 0,05), incluindo 9 /oci que alcançaram significância genômica completa (P < 5 x 10º) no conjunto de dados combinados atuais. Entre os resultados de significância genômica completa estavam HLA de Classe |l DR3 (DRB1*0301), IRF5, TNFAIP3, BLK, STATA, ITGAM, PTPN22, PHRF1 (KIAA1542) e TNFSF4 (OX40L). A análise forneceu evidências adicionais para as variantes a partir de 9 /oci onde um único estudo anterior relatou níveis de significância genômica completo: HLA*DR2, TNFAIP3 (rs6920220), BANK1, ATG5, PTTG1, PXK, FCGR2A, UBE2L3 e IRAKI/MECP2).

Um estudo de gene candidato anterior identificou MECP2 (Sawalha, A.H. et al., PLoS ONE 3:61727 (2008)) como um alelo de risco potencial para LES. No entanto, no conjunto de dados atual, SNPs perto de IRAK1, um gene crítico que sinaliza receptor 7 e 9 do tipo Toll e localizados dentro da região identificada de desequilíbrio de ligação que circunda MECP2, mostrou a mais forte evidência de associação. Constatações semelhantes foram recentemente relatadas (Jacob, C.O. et al., Proc. Natl. Acad. USA (2009)), e mais adiante serão necessários trabalhos para determinar o alelo causal no /ocus IRAKI/MECP?2. Encontramos evidências adicionais de associação para 3 /loci - TYK2, ICA1Te NMNAT?2 - que haviam mostrado anteriormente significância, mas não evidência de nível genômico completo para associação. (Harley, J.B. et al., Nat. Genet. 40:204-10 (2008); Sigurdsson, S. et al, Am J Hum Genet 76:528-37 (2005)). Para quatro variantes anteriormente envolvidas

' - LYN, SCUBE1, TLR5 e LY9 - nenhuma evidência de associação foi observada no conjunto de dados combinado.

Para identificar novos /Joci de risco de LES, examinamos um total de 3.188 SNPs a partir de 2.446 foci distintos que mostraram evidência de associação ao LES no nosso conjunto de dados genômico completo (Hom, G. et al, N Engl J Med 358, 900-9 ( 2008)), que compreendeu 502.033 SNPs genotipados em 1.310 casos com LES e um conjunto expandido de 7.859 controles.

Utilizando esse conjunto de dados, imputamos > 2,1 M de variantes usando amostras de CEU de HapMap de Fase |l como referência (consulte Métodos acima), e gerou uma lista de classificação ordenada de associação estatística.

Variantes com P < 0,05 foram selecionadas para possível inclusão no arranjo de replicação personalizado.

Para genotipagem eficiente, identificamos grupos de variantes correlacionadas (Rº > 0,2), seguido por seleção de pelo menos dois SNPs a partir de cada grupo em que o menor valor P foi < 0,001. Para os demais grupos, foi incluído o SNP com o menor valor de P no grupo.

Nas amostras de replicação, calculamos a associação estatística (consulte Métodos) e observamos um enriquecimento significativo dos resultados de replicação em relação à distribuição nula esperada.

Excluindo-se os alelos de risco de LES relatados anteriormente, haviam 134 loci com um P < 0,05 (esperado 64, P = 2x 107% e 12 /oci com P < 0,001 (esperado 1, P=1x 10º), sugerindo a presença de verdadeiros positivos.

Cada uma das Figuras 2A a 2E mostra os resultados de varredura de associação genômica completa plotados no eixo y versus posição genômica sobre o eixo x dentro de uma região de 500 kb que circunda os foci definidos por TNIP1 (Figura 2A), PRDM1 (Figura 28), JAZF1 (Figura 2C), UHRF1BP1 (Figura 2D) e /L-10 (Figura 2E). O valor P

B de metanálise para o marcador mais associado é indicado por um quadrado preenchido em cada uma das Figuras 2A a 2E. Para cada uma das Figuras 2A a 2E, valores P a partir de varreduras genômicas são marcados para indicar LD à variante associada ao genoma completo: círculo pontilhado significa rº > 0,8; círculo tracejado, 1º > 0,5; círculo listrado, P> 0,2; e círculo aberto, nº < 0,2. Junto com o fundo de cada uma das Figuras 2A a 2E, a taxa de recombinação do CEU de HapMap (linha preta sólida) e os genes humanos conhecidos indicados sob cada gráfico. Na Figura 2B (PRDM1), um locus de risco de LES independente e relatado anteriormente no gene ATG5 próximo é indicado (rs2245214) pelo círculo preto sólido. A Figura 2F mostra um histograma dos valores P de 1256 SNPs independentes (rº < 0,1 a qualquer outro SNP no arranjo), nos 1.963 casos e 4.329 amostras de replicação de controle. Sob uma distribuição nula, a densidade esperada dos resultados é indicada pela linha tracejada na Figura 2F. Como indicado na Figura 2F, foi observado um enriquecimento significativo dos resultados menor que P < 0,05.

Consequentemente, o estudo de replicação identificou 5 novos /oci de risco de LES com um valor P combinado que excedeu o limiar do genoma completo para significância (P < 5 x 108): TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1 e IL1O. Associações estatísticas detalhadas para esses e outros /oci são mostradas abaixo na Tabela 4.

Uma variante, rs7708392, no 5933.1 que reside dentro de um íntron de Proteína 3 induzida por TNF-Alfa (TNFAIP3) - Proteína de Interação 1 (TNIP1) foi significativamente associada com LES em três grupos e tinha um P combinado = 3,8 x 107? (Figura 2A). Variantes próximas a TNIP1 foram recentemente encontradas para contribuir para o risco de psoríase (Nair, R.P. et a/., Nat Genet 41:199-204 (2009)), no entanto, o LES e variantes de psoríase são separados por 21 Kb e

: aparentam ser sinais genéticos distintos (1? = 0,001). TNIP1 e TNFAIP3 , são proteínas de interação (Heyninck, K., et al., FEBS Lett 536:135-40 (2003)), no entanto, o papel preciso de TNIP1 na regulação de TNFAIP3 é desconhecido.

A associação de múltiplas variantes distintas próximas a TNFAIP3 com LES (Graham, R.R. et al, Nat.

Genet. 40(9):1059-61 (2008), Musone, S.L. et al., Nat.

Genet. 40(9):1062-64 (2008)), artrite reumatóide (Plenge, R.M. et a/., Nat Genet 39:1477-82 (2007)), psoríase (Nair, R.P. et al., Nat Genet 41:199-204 (2009)) e diabetes do tipo | (Fung, E.Y. et al., Genes Immun 10:188-91 (2009)) sugere que essa via tem um papelimportante na regulação da autoimunidade.

Uma segunda variante de risco confirmada (rs6568431, P = 7,12 x 107%) foi identificada em uma região intergênica entre o Domínio PR que contém 1, com o domínio ZNF (PRDM1, também conhecido como BLIMP1) e autofagia APG5 similar a 5 (ATG5). O sinal na rs6568431 parece ser diferente do alelo de risco de LES relatado anteriormente no ATG5, rs2245214 (Harley, JB. et al., Nat Genet 40:204-010 (2008)) (consulte Tabela 4), como rs6568431 tem um 1º < 0,1 com rs2245214, e rs2245214 permanece significativamente associada com LES (P < 1 x 10º 5) após a regressão logística condicional que incorpora rs6568431 (Figura 2B). A região promotora do Justaposto ao outro gene 1 Dedo de Zinco (JAZF1) é um terceiro novo locus para LES confirmado (rs849142, P = 1,54 x 10º) (Figura 2C). De interesse, essa mesma variante foi previamente ligada ao risco de diabetes tipo 2 (Zeggini, E. ef al., Nat Genet40:638-45 (2008)) e diferenças de altura (Johansson, A. et al., Hum Mol Genet 18:373-80 (2009)). Um alelo de câncer de próstata separado perto de JAZF1, rs10486567, (Thomas, G. et al., Nat Genet 40:310-5 (2008)) não mostrou nenhuma evidência para a associação no estudo

' atual.

: Um quarto locus de risco novo no LES é definido por um alelo não sinônimo (R454Q) da proteína | de ligação ICBP90 (UHRFBP1, 1811755393, P = 2,22 x 10?) (Figura 2D). Esse alelo é uma alteração de aminoácido não conservativa em um suposto parceiro de ligação de UHRF1, um fator de transcrição e metilação ligado as múltiplas vias (Arita, K., et al., Nature 455:818-21 (2008)). O alelo de risco UHRFBP1 está em uma região de desequilíbrio de ligação estendida que engloba múltiplos genes, incluindo polipeptídeo C de ribonucleoproteína nuclear pequena (SNPRC), parte de um complexo processo de RNA frequentemente direcionado por autoanticorpos para LES.

O quinto locus para LES novo identificado é a interleucina-10 (IL10; rs3024505, P = 3,95 x 10º) (Figura 2E). A I1L10 é uma importante citocina imunorreguladora que funciona para infrarregular respostas imunes (Diveu, C., et al., Curr Opin Immunol 20:663-8 (2008)) e variação na IL10 tem sido relatada de modo inconsistente estar associada com LES (Nath, S.K., et al, Hum Genet 118:225-34 (2005)). A variante associada com LES é idêntica ao SNP recentemente identificado como risco contributivo para colite ulcerativa (Franke, A. et al.., Nat Genet 40:1319 23 (2008)) e diabetes do tipo 1 (Barrett, JC. et al., Nature Genetics 41:703 - 707 (2009)), sugerindo a possibilidade de fisiopatologia compartilhada na via da IL10 através dessas disfunções.

Usando-se uma significância limiar de P < 1 x 10º na amostra de replicação combinada, foram identificados 21 loci de risco candidatos para LES adicionais (Tabela 4). Menos de um locus (0,01) comum p < 1 x 10º era esperado sujeito a uma distribuição nula para a metanálise (P = 8 x 10”), sugerindo que diversos desses /oci são provavelmente /oci positivos verdadeiros. Genes candidatos interessantes nessa lista incluem: a) fator 8

' regulador de interferon (IRF8), que implicou em um GWAS anterior (Graham, - R.R. et al, Nat Genet. 40(9):1059-61 (2008)) e cujos membros da família IRF5 e IRF7 estão dentro dos /oci de risco confirmados para LES; b) quinase 3 de TAO (TAOK3), um alelo missense (rs428073, N47S) de uma quinase expressa em linfócitos; c) regulador de tráfico lisossomal (LYST), mutações das quais causa a síndrome de Chediak-Higashi em humanos, uma disfunção complexa caracterizada por uma disfunção linfoproliferativa; e d) receptor 12 de interleucina, beta 2 (IL12RB2), um locus que inclui /L23R e SERPBP1, mas parece diferente das variantes /L23R relatadas nas doenças autoimunes, doença inflamatória do intestino, psoríase, espondilite anquilosante (Duerr, R.H. et al., Science 314:1461-3 (2006)).

Uma característica notável de recentes estudos de GWA é o grande número de sobreposição de loci compartilhados entre diferentes doenças complexas (Zhernakova, A., et al., Nat Rev Genet 10:43-55 (2009)). Testamos 42 variantes de 35 loci que foram previamente relatados como alelos de risco de doenças autoimunes para associação com LES (Tabelas 6 e 7). Nenhum locus único teve um valor P não ajustado < 5 x 10º, no entanto, encontramos um enriquecimento de alelos associados. Dos 35 loci testados (42 variantes totais), haviam cinco alelos com um P não ajustado < 0,0004 (menos que um resultado esperado por acaso, P = 4,4 x 10?) e com um P < 0,05 depois de uma correção de Bonferroni para os 35 /oci pré-especificados. Para cada uma das cinco variantes, o alelo associado com LES corresponde ao alelo relatado anteriormente e tem o mesmo sentido de efeito (Tabela 6). Observamos uma associação altamente significativa de um alelo missense de IFIH1 (rs1990760, P =3,3x107) que tinha sido previamente ligado à diabetes do tipo | e a doença de Graves (Smyth, D.J. et al, Nat Genet 38:617-9 (2006); Sutherland, A. et al, J Clin Endocrinol Metab 92:3338-41 (2007). Também observamos uma associação com um alelo missense (R32Q) de fator B do complemento (CFB,

rs641153) que reside na região HLA de classe Ill e é um alelo de risco validado para degeneração macular relacionada à idade (Gold, B. et al, Nat Genet 38:458-62 (2006)). O alelo de risco de LES não está em desequilíbrio de ligação significante (LD), com outras variantes da região HLA ligadas ao LES (DR2/DR3) e permaneceu significante após a análise de regressão logística condicional que incorporou DR2 e DR3. O HLA é uma região genética complexa, mas é evidente que o alelo de SNP rs641153 tem um efeito protetor quase idêntico ao alelo de risco AMD relatado (Gold, B. et al., Nat Genet 38:458-62 (2006)). Além disso, é indicado um estudo dos cinco de alelos de doença candidatos.

Além disso, a Tabela 7 fornece as estatísticas resumidas detalhadas para as 42 variantes identificadas em outras doenças autoimunes. De interesse, as variantes de CTLA4, IL23R, NOD2 e CD40 que são fatores de risco significativos em outras doenças autoimunes parecem não mostrar evidência de associação ao LES.

Usando-se 26 alelos de risco de LES (21 /oci previamente relatados na Tabela 2, mais os 5 novos /oci para LES descritos acima), foram realizadas diversas análises adicionais. Foi conduzida análise de interação por pares com os loci confirmados e de acordo com a literatura anterior de LES (Harley, J.B. et al., Nat Genet 40:204-10 (2008)) e outras doenças complexas (Barrett, JC. et al, Nat Genet 40:955-62 (2008)), não foi observada evidência para interações não aditivas. Usando-se análise de regressão logística condicional, não encontramos evidência de alelos independentes múltiplos que contribuem para o risco em qualquer um dos loci de risco individuais. A seguir, estimamos a percentagem de variância explicada por cada um dos alelos de risco confirmados para LES, utilizando os métodos descritos por Barrett et al. (Barrett, J.C. et al., Nat Genet 40:955-62 (2008)). Cada HLA-DR3, IRF5 e STAT4 foram estimados serem responsáveis por >1% da variância genética, enquanto que cada um dos loci restantes foram responsáveis por menos de 1% da variância. Juntos, os 26 loci de risco de LES explicam os 8% estimados da ' suscetibilidade genética total para LES. A replicação direcionada de resultados de GWAS é um projeto de estudo eficiente para confirmar /oci de risco adicionais (Hirschhorn, J.N. et al. Nat Rev Genet 6:95-108 (2005)). No entanto, existem poucos dados disponíveis, em relação à probabilidade de replicação de resultados que ficam aquém dos critérios de valor P aceitos para significância genômica completa. No presente estudo, todas as variantes com um P < 0,05 a partir dos estudos originais de GWAS foram incluídas para replicação. Conforme mostrado na Figura 3, quanto mais baixo o valor P no estudo de GWAS, mais alta é a probabilidade de se alcançar o candidato ou status confirmado na metanálise de replicação. De interesse, nenhum candidato ou resultados confirmados foram obtidos no estudo atual a partir do grupo de variantes com um P de GWAS entre 0,05 e 0,01, apesar de explicação para aproximadamente 50% de todas as variantes testadas na replicação. Esses resultados podem ser úteis na orientação de futuros projetos de estudo direcionados, embora certamente o tamanho da população de GWAS original, o tamanho da amostra de replicação, a arquitetura da doença e o tamanho do efeito das variantes candidatas também precisem ser cuidadosamente considerados — no planejamento de esforços de replicação.

Esses dados fornecem evidência adicional de que a variação comum em genes importantes para a função dos braços adaptativos e inatos do sistema imune seja importante no estabelecimento de risco para o desenvolvimento do LES. Enquanto cada um dos alelos identificados —responsabiliza-se por somente uma fração do risco genético global, esses e outros estudos em andamento estão fornecendo uma nova percepção sobre a patogênese do lúpus e estão sugerindo novas metas e caminhos para a descoberta e desenvolvimento de medicamentos.

= 3 ad: 883 E io JF 8 EE ã : : iodo | iii um 8 PELO er S SR trs o els e R ERA ERR =| 2 2 RE E RR DS | ss: : tia: i : Dida o 2 o Ei: ra o 3 8 Sao É ê 338 Ss z C i ' E e: = " Ss i ' : O 2 | ' | a < Rr ai 28? É j | < i : l — $ SG u S 3 x o l po FE O eo o 2 z das! 4 Hi sb? 33.

A FS ; 9 EE & Ss qn o 8 E : 1 o) 8 5 EG: " 1 | : 2 o & $ E = : ER SicEl o < 8 ii 33 3d, x Ex FC " EE | cid 28 LO as a 4 11:38 is : TF : 8 ERR x ; : is bt 2 É ão 2 sã 2 E o 2 ee 2 ERES Et EE & za vd Í : 4 : : : cd = 8 38 a ss í ; t 3 EE = 38 o 8 x x z sas o : tos 2 as T 5 f=| iacGd a. e Pb 2 33 a 7 e Rs o | : | 2: xx É z 3 E): iG Eis: ' a ENS: sê 33, o : 1 ui ico & 2 e io, i Ji E g E ias TES ET: 2.º 1iiipid z za: " iii o coxo = É 3 3 3 1 : ioiicddo ga” ' 8 Diiddo O <) 2 iidiid: . ed AM Ji lido 5. : pd 3 8 : oa & Só E SB 8 8 | Sai i iiciso uai 1; diidd « A xt iii 14 : 20 38d e iii: 8 nt; SS 28d: : É Eta ss 3 é E ix Ss al Í i N 89 FR o 3 Ú | FE : " Jo : 3 Fã a HH ER cod f SI | j 3

EE dado * | 1385 3 io 3 3 : 3 é 2 Soda À

E pp 1 3 3

BS E

SS S&S o E E | 6 E RS ie] & o O g SS 8 o SET SÉ E z S 28 8 | & — 83 8 * E $ O o & cs & <€ q e 2 2? q 8 8 E se ses o 3 8 og 23 E E

E s ST e 8 = <= sã Dn 3 & n o S&S s| 3 TZ Es SS e yo, 2 o ef, o c/2 - 8 8/8 8 à sl so E É É s o É q 2/2 az 2 e eee, 2 E * gq $ gq E o 8/1 e 3 28 888 8 SS e 3 8 2 Ç o 2) g E 8) à 8 Es o E É E Ss 2 = re e ss = o 8 o BE E = | Ss o O SS — Ss g º = = 8 6 gg 3 3 SE Z 2 = 2 s FT egogso & og a 8 E à 3 E e = e mw e a ol 3 to E qm e o o 2 So So SS o So o ss E 8 . E << o vs o o Nr 82 2 o NNW 8 2 z o & o ST SO wo à o ss Ss So DO > TO E & o < 2 PA o g 28 qe W o. 2 && rt : g 2 8 "ºº é 7 E=85ô5 * O 8 vv 2 da à 2 SS E W = DD Ss e 8 ô o << E É S&S E E so Fr ooo E o E o õô o O q Oo É < o = BB CS O 2 E o 8 3 2 8 q o à E ST Ss & TZ o õô 8 É gg o o s go & â a O 8 O GT E çg < = o 8 S - a $ 3 É o 2 2 FZ 3 & ã sc 2 $ TZ = & É .Q&szsS ds) <- O E É ST & 8 818 Ss 523253 3 SS 5 E E SRS 31 É 2 3 E 5 8 SL. Ss AMOR SO + o a QN 7 Doe x 8 > Q, é 38 xd XE E E 2 e lr o x e 3 No 8 o ST O = el x 2% x alt 8 se E PP o O 6 o TF N e) 2 e SS o o o 8 = S O 2 <€ OT o Bl = 2 8 o o 8 sé 3 as x 2 o 3 205 É MO 2 8 $ 6 E Ss o o 8 a 2 2 aa o o SE E q “ E O ; 2 à sa: x x SS 33 8 8 O o 2 eo q ve $ FR Ss 3 2 OP? SE o E al & 8 DP q 8 o 2 vv 82 Ss 9 GF OH E E 8 3 E H Fo Bo q Ss Gg q 8 E SIS 8 x essa SS o é o E o 2 É TE ss) 2) - SS elo So - oj 2 & O E E nn o > Ss E & 3 2 E 83 5X 5 o a 8 5 E $$ 335 z 2 S 2 E & 5 Q ? ô " ajo o Tv NBR A 41% 28883 E Q& E 2 O 4 & & E 3 5 os Ss es E 2 os o = uu Ss F x E o O E O Ee 8 & É E v 2 o gç O 8 vv = BN e o o o o && <€ 2 2 8 E $ 8 SS E 3 o 8 sl lg e sl Sm S 8 SS Q gg 8 "= É ; 2/5 7? 83 885 3 e çy é & o E Q o 2 SS E $a STE Ss Zoo 8 = S o B O O —- DD Sjz gs ES TS Ts ZOO * & o O Bv gq O S/a >? gs 3 $$ 8 8 º SS o O m& à N E TT > & E aj S 53 8 2 4/8 o $&j E ST O SS GG N o 2 El ES" 5 Ex $| 8 SS 2 gq - q & o 2 > Tg" T rj o 3 — & SS & 6 yv E E 8 g q 2 E o SE, 2 8 Ss E O 8 o us E = da E ane = 3 e EQ 3 8 8 8 so 5 8 o SO 2 Ss F 8 8/8 E x & SS gy E 8) Oo o Ss 8 o 2 V 6/8 ce E EST Zg ESB 4 8 o SS SS mw o E x Eggs eEF SS = 8 o S 3 SS 38 SS À é o É 6 3$ £ E 8 = SS O << q = o O un 3 w SO 8 gm SG õ& 8 gg > S E Z E

2. o Fo ô o Oo o, E? & 4 8 3 8 o 2 1" ST E E 8 gg $ 8 ny É 2 3 E 3 3 O SS 5 Ç << E o = a E & XxX 8 X% 6 << É E 5 ele gts 5 og ; 2 $ 5 Z= 3 E 85º SS 35368 3 2 e SS gi as 5 3/5 5 58 / & 2 eg o É 2 3 2 3 ? Pp 8 e E g el 2 oq E E TT 3 E & X gq g E 8 SS 2 gy o o e o 8 0d o 6 = 9 o O vw RE E Oo E & 2 O Oo É a o $$ &à O? É ,ç º q SO 8 à 58 ds q o E SS Pr e 8 o ºC & q o 8 2 E q É E PT ZH 8 «À 5 o & à E 8 E 8 2 E 3 nx 5 8 % 5 8 ÉS BS & 8 8 5 E os 2 É 88

| 84 2 sl. < 3 8/83 383 2 s Sã: = 5 O FA 255 =) ss oO U| Si 2 AA = =| = O â . E? sa gl SE RE 7 e o o =| Ss 318 8 St o ão 323552 ss. : Sesc co << 2 E SIisssces ! g 3 8 Ss 8: à RES 8 ER el & o 2 < 3 888 oo 31 | 2. SN < s sas: a : | o 8 SER SAIA : : 3 EERB8Z = : 1 ERES E e E 8| e 3 8%SR ” fa =) = OS FA sz ESB a 2323 o 3 8s$ê8: te al a CRS a «ls Sã: o : EE SRB o : +. 8888 : : 28 8888 x 2. cado: é secas: uu <| aj 8 SIS : ão cenas: : Ee RES mm O 2) 8 8 ar ss : <| = ss ERBTR 2. a) a FI OO 1! 1, 3 888: dE O << s3 Sã : " 3ào SRS o si= 22233 Ss a dis iscicd: o . > 7 Zz da Bs e 22d: X z 2 ; ui z) Ss isca O ses Sc 2:dcdo - o Ss stn: o 5 RR se É fe) 2928 oO k-) 28S8 ee: : 26 ” ui S " o a ã | 3 = al, 3 Rg , | , 5 É : 8 3: : E clvitsçb: : : ERR: A ei: tugbii: E Ex BEBZi: : d:iissd) SS sk < faicprti: " : iii: o E E ã 1LdEicido 1 ia ço : Ê iigpidioo x so iii didooo u| 2 ig iiadoso 233: ai itis: dg Etta: IG 8 SS: > o : 3 ES Ss 2 a: z RT: 135 So SE gêda < JS po 5a: NENSSNS 0338 asa doS a Ss SESESES 333 OSSO x 8 dido 8 ido ido dao Goo: ia dad 3 384 & 3 np 2

2 ww | o Ss SS 2/ 0/%m = — o oO Nr N Q à —| 8 tl oOo bn = . = O a à o O pl E UU e AN O o e om mm o dq o à To , 8 v/ 0 / o oO o cido ooo ooo $$ $$ Ss a gp 3 2 TD E E s o o SS 2 E = e o » q o NON o nn oe º 6 FL E mw SO N 1. Sd QN TZ = SO Qd | o 92 0 e E | 8/8 A T gq o mm eo o 2 O To 88 o & g/L / 0/90 SD oO do ooo ooo o = RR o 7% o NS QN O 1. O o FT Nm = o o) & Q o 8 = E Na QN = do dão o o — 2/2 < 8 o Ol =Z Z =XTZ E vTr Tr Z- =X“ “ o GB cd we og x E 2 o E 2 7 es) o 3 8 6 O =/ 9/2 PD ON DD O MO O E o BIN ST NS ET a oO NM FS Sos oe gs el San & gd q = Nom WS à TO 3 8$ S& vlO0lo oo ed Ed oo o o o oco eo? É S e SS s dn S&S a Tl o & 2 E o Ss 2 3s $ 2 o Ss o a 3 2 o a Ss = + e o oO mm à nm Ol o O É o sE8j/ O mn .- O & o O bD TT dN|l 2 &— O o E SIS a Sd qo os rm 2 dA Tt q q eo nl OjS o cd do ooo co ooo | o é rf < mom cd 1 O O QN 2 à o o| x N 8 > Kan 8S do od à = à o = à og Ss SS 2 qu os se terre es vo -/ 2? ET 2 tt o à O |) o Oo </ 9/2 8 5 NS OS Yo we E 8 $ 8 | = o o Mm O — O | E . dj o E 8 2 we] | NO 8 6 = Nm oO m om do To gq o vT/0/ oO o oO oO ooo o oc oly O Oo << s 2 gq NS -—- [= o Fm Ss 8 TS so & o 4 8 FE o FF hn o o Too o 2» > g 8 E 8 /%< o Tt SS SgSgS o bos | No & ET 2/ ol < NS TT é o on mr O é T/3 o 2 gg Xr/ 0/5 o ooo oo o o | os 3 E < o nm o o q o o TT o . al 2 & E < z EE << << eosesoss sd 5 às E o OolEF ss esses = = ec = 8 Ç;oê PP E O Qg oe < E ss 2 o $ o oogo<o<soeo<< << E ES 3 < rr << o0Fr Or a O O o) E 8 E < o o 8 8 3 ô8 [= S&S E 8 3 Y E < o - o 3 5 al 8 Ss TE uu 2 EF 85 Lo 5. ES. É SC 8 àja x *8Sa3sEZX 234 SL) 8 é, Fa = o SS & FR TE 2 52 3 o RF 3 gg o 6 8

E ST FE = o Ee Oo o ES ER s/l 3 8 SS SF. ae RS S| 2 8 8 21 = ; o < ; o E /% T TST 83 8 w O S&S S/s õ6 $ 8 618 FEET TT E E Tl ss o 3 ol VS TE o o o 8 Oil gg 3 7 Ss el Q EF Nm QN à O O po o DI) q TT gg O MIT Ss o Nr dg O 60 o o &S| 8 oO 6 +; DI À QN O q O qd Zé O O&* . ol 8 E 38 PprA QN O e Da q E CE oO q S o oO bb T oO mw o y— TT 6|) E BB MIN oO sv sv o vs v 6 v dc v/l O à E o o = 8 S&S a o es E o 5 = 2 Çw 8O O OT fm E vs 82 TF STO ST To ad | s| o 3 o E lv To o dd Qd Ad = & Ss X o à | fd o Oo DT à TT OU o = SS a o O)N &S E SS MW TF ro o qd rr —- To S £ = ms SS 8 E MOS TT SS SO Om O bb o Pv 8 = &O& O N O T TT — à OÓO o õ = N Ô — dq O O O O NR | 3 8 8 o Z es ZyoçZ ST TB 8 * O Ne O O — 4 à à NX o | Oo a | m = S O O O SO O SS NX O a Qd O Z /S à ds TZ = daN qd os Ss EC TT o nl é e e pe pop e e e e é é e —- E o É 3 a [208 ' e & i 8 x i 2 5 | 3 |

ES e : o 8 à 1 | o =. É 1 o 3336 ' O| o 4 1 < 8 5 OS 8 5 3 1 1 BE: z 8 õ SESSs 52: O - o «< AMAM Ss do "ESG | : 8 Ss ” os ã : | s | << o 1 o DE: O) õ o : | 8 * o A = 3 o = FE t Y = À gets: = | DL MA " : 2 RE Ss: << Ss S RE AAA 2 S 32 : a ã o : : 323 2. a dos . é 2 Et 6 ol a * 2 ge PRESS Úú ET: o & 83 vio à < D CC aê ". o É at; o o E 8 a o x 8 sx sis) ! : : = o = 88 : : 258 TS 3 8 e & : : ço = 883 o o Pl x x 8 os ee SETE : 323 3 8 : E = 3 8 Z3 = 8 8 cs. 2 e o = DN 2 13 G : So ERG o ; ia SG cd Hs ; : õ 8 ic: : o 2 ? é 8 É É : do dido POSSTIS 18d 2388 EXE E Ea < 3 cad 1 : S Stiiida: 8 o 55 8 " 0 : dd: 3 8 o CGdddd É 2 SÉ | Da & 83 3 20 e | : = E : -.. ã : | ! &£ . É : ss a o : o z Í : SNS : JiNgpigo | = 338: | 1930 x & E

BESNNSA ES ici: | e NA | e Edo & sc : geo Sid

SS

SS à 2 3 8 3 o BETO? | x ” É F " g 8 o " 1 Ne ss <= 3 " | E) s " | 1 e le 8 à 8 eg Jg idça! | ig;piiçido 8 E 8 ds | ; : e iiididca. e 2 : idiisdo E : BENENNS a pipa: À sil

SENSE 2º o o $ <cC Oo À | o x 3/8 $ o so o co O O E. - | mm e ol E 8 818 Ez ê à | ; ERR mw is) 8 8 & a ÉS io o 8 & 3 : S| s ' É El o Ms : 8 3 E É À uia SENSE ARRSSSA : ih ss 3a333: 0 st: vw Oo als) Pads : É ss E " o TEENS rr 713 3 538 & 3 ã sã : s 3 8 8 il ' PES 3 E) sa 8 e e R 25 1 as 83 " 2538 1 nz 8 zREZ Pd & 3x : 1 são x 8/3 É a 2 x 8 E 3 88: oia 2 & 2X E e do. | gq: 8 e 8 alo É EEE GA 3 alo 3 DERERE o o o BG iG al 8 8 dé 2 E : A Nica RREO = E 4 : iii: id aaa = detido E EI; 2/8 E : SSSESNNNNOS s E & : 1 piiirddo | pila iidiiidal o n. SEESSNE fo vid 1d 3: q = RENDER : à a 8 ss: à SESI ros 48 18 ss ms no o ; | soe ss e E = oe 8 E 8 5 3 É 8 3 3 o gg o JEggãi Í 3 EEE é 5 e eRilrido E 2 & igpitpido & 5 dic: o SESSERE 8 8 pira o SESSESE | SS 6 8 id o o? e & o is es 3 à :Ê o & $ 2 Ê o ês 3 a o E 2 E 3 6 E so o o) 9 2 3 s| 8 a 2/62 à 2 5133 3 3/ > 88835 ddiadrcscos 3 2/2) 2º: : 6 + : FE 3 8 : 3 2 ss: & 8a: < Ss 8 sz 888 SS i : . 3 88 ns. Ss ss z a. : inss S ess 8 sê : io 8 SS 3 ES o > :: i o eo Iaoaso SS : = 2/28 - 52553! 3 S$ 3 8T& A 1 FA 228 ssSSs = Sg5558É 2 923HE 2 ss); 28 8 sm ESA, 8 2/83 [2 EEN ” o 2 8 ES AA = 8) els 5 OO FS & SS o Ss els 8 338 o =| E sê Soo S 1 E 818 es 3: + | SE STE “o: | 21º EEE 22228: = S + : 1: : dt; = NE $ Ta ds Ico a SRA -radsha E “o? í 2 n a 8a o ss 88 .”. gi: 88 ee 2dgiges SEBRAE - : S gas o o o FR 32533 dao. ER) ss 8338 ; ss j' F ” EE O o o o 1 : Es ; S83S ul ol o O! - 1 | o 8 Ss e õ Zz IRES o 3 So o <a : ' Z gesºe S uzo. õ .. a a < 2 nec FP " - o | ' Z Ss à " ' S : S&S? õ z SgE " au E :Ê : ENS 8 | à É á 8 e se 2 Ss ditos] ggEtsis : Ses 0 e 2 555 u à: 22; 25 io «| EN a co : 0 2 382: E pio O Ez 5 ERRA: = o 83 Di jide. CU SS cdEsd: < rn SST | o PETS a a 8 > Sis FE 3 3 e d3psds e e a 3 228 $ js Pit 8 8 ba ns 8 Sã as E 2 n 2228

FS cod 205 2858 3 SS

SS OS o »

S & E vo << E 2 - E o o $ 8 e 8 8 $ 2 3 ao N = oo roaor or | é 2 & </ E SOS S/S om oO O o m/odW ob É oO à|| à O FE 2/02 2 Se" <ZaNoO om dd Tm a O 3 o al Soooosooooccocoooo o 6 ç 8 SE) SN a ooo on a S = qa a a Oo S el 29) 28 = bp o Oo o o Nr oO oO NaN QNY O o DD : 2/&| E/S 2 SS TZ 2 e ooovmr as 38 o À ap Sls oSoSo0o0o0o0o0o0o0SooS5o 32 RP e TS SNS LS E gL on Too E o 2 ff op ànãÁ 280 ooro>aszáad tt ,& = uu RS O A ooo oo ao No e to oo oe AS ASA O A « 8 3 ET 7 o 8 o o o NOO O = O TN o + o or 2 = o T SOS O à O QN = . Oo o dãod mo |U O E q 2 8 oeNob = ao «gr Á| Tm NO 3 8 o& ql ST So oToO0ooSTo0oo0ofÍfooooo o?” ,Q, 8 e| 8 3 o é SE << Sox ga oo, = o onto 23 3 2º ç; > | FT O o ro oo .o;oqdadg]aomNr E 5 msg SZ>SsS2oZ2oe sos r a a 2 ss 3 3| 8) S 0 00000 Ífooooo çÇ To TS gg o o T NO rr 1. v o o obo0 | gv 2 E E S/= O oOoorar- ;doóoooro T E TZ SS Wo = Z seo sososeiesosooror rolo E SS & õ 2 E Q E 2), 8T58EFRgSAZfF atos 2 = = = S Sig oa Zed NON MN STA OS) E SS 3 8g <q o SS ooSToS0o0o0oo0oo0oo0o0o0o0 88 8 es & 8 2 vo 2 3 RSS s E 289 |º o bd ET Mm OD O O (O 1 O (O O | LD Tv 2/ 2/8 3 SS <SS$S SS SS SNS E NE $$ O? o &| ole zoo aos ooo TN A S 6 8 Z S%8 8So0STSO0o0o0o0o0o0o0ococo Ig ô o É E o ST E 8 & $ E E 8 5 3 8 < 2 2 : “ 5 & 5 8 ao Se N O NM QN QN O O qQN oO 8 oC BRENNER ANANASF AZ go Tr Ts sSEe ses s Esso Ss po a E = $ o = <€E<CoOkEE<ELELHKE<AK O = gq ES =/< < << < 2 Ss «o 0o00000000000 [| TE? o v Ss mm 8 o 2 o o q o 9? 8 be a E E 8 É o x TN SP O Tr 8 SD 8 o << Ss oO C o 8 o à XY 2% Ss E e o dijo - NS o Ob 3 o x çaãdl E O "ÀQ 2 O LT Oo%XxXxL42º) Ty) sSoO8 mn go , 8 o x NV 3 OST OA; = <|o ó 3 5 OF 3i0oax ça ossos so 5 o E o 8 Rs 8 Ss E o O Oo É 888ZÇ5T3g88 3 gal3 SS; = Dc N o N e q O SS SsQdãT TESS Ss 2 É 8 g8/ 9 8 TÃIgogSs seas 3 E 3 Sb o nm dz rs os 5 ooso TF SE O 82 PS mr yo oo ÁdroóndóqdaqmN Dogs o gesso açnoçrTr EN et ss FE gg ? O O O QÀN OM = — vs q” à q O Ol 2 | É - 5 np E 'S o E õ o rea ao 8 ww 8 MN or on a FE FE Sião» 2 PS eo/2 2 O 5 oO D O mo o o o %X 4 à *" o Tr O O Na Tr Nr O O NM MN SS daN o ala o MN FT Siro O NG O MSL GG ie 8 Z/ 9 = o dS NI SOS ZW MN O Tr 6 o é) 3 > $8S3T8$83sSS 3 8 E 8 & $ ds SSE SST ETS Pv 3$ 5 = = = E $$ pró pr pS ST 3 8 8 F

DD O 8 TS e sv e

O gq o o o o " S 8 Ô E à oO 2 . & 2º 3 E o 8 4 Ss dE s 8 as 8 < 28 83 3Z 3 3 & x E SC Ss gs E O 8 E ss = SS a ss z8s o E E É $ o 7 8 Ss 8 SH 5 8 65 S&S x o s sv. ax o 5 8 8 8 8 E 8 ss o So pqp & 8 s Ss a). 2) 2 8 ss 238 E À» E S 8 53 ss SS 352 SgZas o a g E ES 3 8 2 S aa 28 2SS E 3 2 5 56 £ 2 2/38/32 2333 SS SS 5 3 3 SO E a 3/3 3 3 8 2/5823) SS 2 g ê8 É Ss Ss Te E E > 3 5) 3/8 E se sê x 8 o SE &w E & 2 S 3/5 33 is SEE go Pç E 3 S/s SS E ss 23 Q 5& 8 8 & | Sm 4 2l!S SO 2 Q oO & 2 o O sola s $jo ol 8 SE Q E ã 3 Ojx3/0 O Sj3 E 8 Tt o vw <ç 5 & g 2 28 4 8 S 8 |E& g 3 $ 83 al à É o H é E o SS 3 2 | Ss | se) é 2 E 2 8 e hr HARE: z F 8 o É 8 2 Ss E o ss ú õ 3 = $ 5 < El 8 S ge << 5 2 8? Qd F õ E E sw E 2 6 2 | F em 8 O Ta 3 s o 8 x = a e e) a | ST o Êêsgss | of = Z = = - "E 8 E 3 o t+ o do SS 2 E

O SE E uu 3 o Ee 8 &£ Ss 5 4 3 3 2 8 E 8 OE E 2 8 2 <| E É Z E 33 5 so 23 ó& 8 ss E Ss Sõ o O S õ 3 Ss 8 ss Ss & ã& Es S a SS 8 o E Ev E 5 1" 3 RB < s s E q o & SS 2d à E. Ss q SS se n à Fo 2 8 rjlo < o Fr ss 5 Nr m s E <a <* 8 à 3 3 5 E Z 00 o Fo o Tr o o E 2 $$ o 3 8 tia 2 É & E 8 8 E Es 2/83 8 8 & 2 PE 3 o < E E $1i8 8 A > FF q 2 $$ 53 O E 65) Tio So So o O 3 3 s & = 8 o - o Ao CE À, 2 a 8 8 8 o ? < al , 8 o 5 é 8 O 3 e RO e 2 | vp É 8 8 SR u al x | Xx x *x S&S o O 3 g O = El E | = E Do e PP 2 q 3 E SS 3 8) 8 |= 2 = s 2 & E o É É aj e 8 8 = 8 = 8 SS 2 q o: sl o 5 o 82 é E 2 El Ss Ss a o O E wW = OS Ss o 8 o O && c 23/ Ss $| = : 3 o E 8 E | - s 3 3 3 3 8 << o & o 8 O S&S & ED $ E o ;g o 8 O) < =? E s & o E É 7? o — | 2 x 8 Ss | Ss o gq 1 8 2 e SS O E nn % - E x E 2 2 s e o O 2 = 21 eg 8 e 2 o $ E 8 3 Xx8 8 2 8 e. E & 6 alo So Ss o o 8 E 8 o É 8 E SS Ss 8 > z n O 2 8 e e [- |] = | 82838 o $$ O q É 9 & $ o õ5õ 8 sl x $ E 8 Fr og & | $ 3) E | õ E Ss E ST gg q e 31 E [5 = E 8 8 O E o = SE E n 8 z E 8 2 o e |. e % 8 gg 2 2 E 3 al 81% 5 8 8 ss 2 ZH RI s 8 s o él Ss | 2 s = s o 3 82 o 8 E) 3 $ 8 Fê E s 8 = a O o 8 E e Pp e E E O 8 5

8 TT O QN Oo 1 v (O O O - O) XT 1 N O O O Qd Y O NM O ' $/ o d o o To nn TZ S A ad

Ojo dc o oO oO oO O O O O O C€£ o

2

2

E) 5 , 8 8 8 8 q 2 8 8 g

S/S d e 6 ST TT e x = o ooeúr

Ol oO ed o o oO oo o o ooo rc

< NO OO Ts mw TT à q o vv :

SS &|= « & = 3 38 TS 3:

BD Ol lv ec sv sv Z TZ co os- To Tr cc v an o el o o

SIS J 33 eo aàaeçs gos;

$ oO FG no O TZ = Nm a Sd à a

>)/)oSOo dc vv oO oO oO O O O O O €£ low o — o vt o à à o Oo a

Ss) 8 SS 8 RR vy SG 3 SG 2 1; 8 O

8 SO à O sm To so LL = do |

2 Ojo 0d oO o o oo ootctcooco

=

F 8

H 2

8 |“ O O tt O O O QN TT oa Oo a s$8/ O — MO O Y O Qd &= MN 1. O tl

= oO S/S &S o o T 6 O TT = Sd o uwj u)| Ojo oO oO oO oO O O O O 06 O O El = &| 5 &

ol silk = à SS ZE 2 E 2d dg = o nn BOJO = Ss = ss sZ =Z/ sv Ss dr < << al SS 7 s ajo o = = << á SR Ss = 8 8 os &L o FE E) S bb TT O O O O 2 A o

8 a Oo <T o Oo O O O = vv O —

O > S&S O oO oO oO o0 o0 o vv“ cid oo uu

O oa

| <

3 É o < oo < oq <q << oq rt

$ = </ r O << OO r o o o roo E s o o o 2 o x LP ne = re < a o SI = O m õg À àN LL L o Z SD ol À mM Ué Qd Q& à 382 £Ç O o Q SE K 4 5 SS EX O & É à À E 8 SIE O O 2 O GV O E > O O an o N o o 2 E o + Qd SS 3 o 8 a nN Sr E ol à O É à às SO O O O Tv O Ki QN =S O QD — O dd Ôô O O O O&O u Sl O QN N 8 N O O À |O O OQ O 8 SS a So 5 S&S SS O N O y $ O 8 $a So SO S O O T q S%$ o oRmN O Qd TZ O TT TT FTF à O dd To o 8 Es A sos em vm O vs OS O e | o o 2 = v s o a o co Ss Ol NO vs o vs Tr O O O O r — iso) o a 2 o Se 8 FT mw Nr o o —- = O O Nm O MN O MN v& 3 vw [o o o 5 2º 8 PSY AQ 2LSÉ 2 P4TmN É 8 TT eeesxrr$I Top kTR o D ww Nr O (O = O O N O T Ss Al O gv qQà O NM y— Oo MN ÓO Tv qQà o o Z| = O = O = O Qd O O É — o Ss ni e e e e p É p É É É pp E o

8 E o à N OS O OQ Tv E à Q T— ' BS 1. 3 à oO oO O O O DÉO O — É SO . " Nm A O O O TT T mm mm O vs o o Ol oO dc o oO oO O O O O O O O O O F£ o 2 8 sl) o & O N O O O O rr OQ NnN O O E| S 1. à QN TF O y O O bb dd à T O SIN qd oO O O O T TT mM mM | Ss o o o Ojo ed oO o oO O O O O O O O O O €& < O . N Oo qa O O O O TT sv TF FT O 3| £X/ O gd 2 O o TT à à o o à à OQ = & mo = e sv se so o-o0o o 7 ZÍTo6o Tr é an = o = 2 . O TT O bb QN MN OQ O — O O Tr wa gq Oo À = o vv o e ao TT 2 = > o dc oO oO oO O O O O O O O O O €£ si Mm QN N FT O O O O Nn O O QD — BIO 1. ST gv o O qd TF O O — à O à o 4) mm mw A Oo 6 O Tv LT mm mm Q& + é o o Ojo dc o oO oO oO oO O O O O O O O O 8 2 =. .o O TFT mw EF No g N O à TT Nr O oO E) T ;, 2 dd gy 3 Sds Ss So gy SS 33 Sm qd À O O O LT $$ mM mM O x e Oo o Ol oO dc o o oO oO oO O O O O O O O O 2 E 1 OS à a O O SS = à o a = Z/ «| 8 -« 3 3 8 8 = 8 8532838 DIO = e 2 Z 2 ZsS Cs ZZS ss Cs ZE E Ss an S| o E x à 8 8 om 8 ow o qa o ms og 2 Só o e dó o 2 2 é o à NE 2 >/ O 0 o O oO oO O O O O O O O O O Zz q O € O o o o ok 2 HE OoOL ok = E 2Q € 8 o 2 Q = Ss E </ 0 6 orar É O O o 2OFrFr o o -— o = > = o“ É EF NS o 4 O <€ TT O T O Te x 8 E g2É RÉ sô asãásgeê o o E Sd) =2 O O 8 O à 2 34 << Z O O O À = a o a o a m oa & 8 eb + 8 E nr el Om mn O Ow oO O T à É O — OQ Tv Y om el So 8 3 $ SS $S 3 NS 3 8 e 8 WE TS & So O N FT O O oO — o = É T 2 So = 3 8 & 8 $ 2 22 8Tr$S3T ÉS SÉ og & o o à T o à $ dg dd STE E/S O O 6 Ss O Rm Ss Tr Qd Oo FT do o

É o a NO or a o Ojo Ss mn vs mr TS WS O sm mr N Tr Qà rr yr = o o o o Ss gg o à 5 8 8 SS dO z $ gS 2 3 2 &W S&S NS 3 o ÓO O |O O | SO $ O T SS TZ SS O À N O sv O O É O À QN QN WE S&S à oO O FT N à O O Qd O NE Qd QN 3 SS 8 5 SS Qd QN Bs 3 SS NS TS SR a / oO QN N 6 TZ à q o 5 Oo T O QN o Z/ 6 QN S&S Ss E ms Qd vs sm sm Tm Tv O à ni pn É pp eo eo e e po p p pop à é e a o o º o o = a o - Fi Bo O “8 8 XT 8 28 A E SEE NS q o T o SÁ O O N o fc oo o e o o o o << o o o o o 2 2 E, 888 & 8 8 E 3 E Ss : = : SIE N SOS q o T o vB o o rm o sc o o sc o o o o e o o o o IS Rg FZ < 2 e &o Do N o o A 5 o o 2JE dd o à à à o; ã ô TT X OQ A O wo e “ o e o o o = e o rm o = a S CO O NnN qn Ko) : = o : co o o o z o o mn o SEN Nm $$ Na Tt 2 o EE TZ o T > [=] o s o o o o s o o o o $$ o So nm tt à om bo q N - no Sd SS N 6 O |O OS : oo oo HIS NS a ó TT 6 5 mM E Oo 4d o oo o o o o o o o e s o s o o 2 2 S/S O O T O à O o = q E) FT N o O T O NX O : o oo SIS NA SS à o T bb 6 vs 2 So NX odjo o o o o o o o < e o sc o É oO FT O O qa SN S = : ; : Z/«x«/5 3 8 3 888 4 ã 8 gd ã OLOL = 2 = ZE =s Z E S e efe os e -s a S o o 2 / a y — N N sz = o : os : o gg A LT e o — 2 Oo NX SS 2 go > /oS09 o o o o o o o s < o s o Zz =/ O <€ << O O OL o O O O O Oo E SS 6 GS Ss = E 2 = <)O O O E 2 O O É FOR E 2 E u mo F SR 8 x E < 8 Na X o = O Tt q = E E m õ o Oo x nm O o o Tr o oC oO o [) a o xr Q o [5 << o Ta o ul W 5 SO Z &º O UU wU à = O UU GN > 2 8 NON Or E o o qr 8 e 8) & 8 8 8 $$ 3 Q SS gq $S O o 8 WS O OS O o Ss ds E 6 6 à oO 8 S TZ FF Nw gy SS N O v E à ô Sô Só ER TS gF TT 2º Qd TZ ÀS O TT O Qd o 8 S $1& 8 E 3 83 Es s3 Ss 83 o oo T T + = Ds) = o 8 = = = EA = : E ê 8 o o o W Ol o — T qo o T - - o - o = o o = < E & o o PSP NU Oo O N ON &n 8 8 5 8 8 3 STF 7 28 BE Ss q ms E 8 SF 8X Ss ó o 2 2 O à SS AQ & e 8 2 sgS gy SS Tt Ex 3Fy 8 FT A SG NNW SS TZ TF Sd FT = E &S O da aj SS o Oo qm OS Em à b 2 3 qd 2? 8 N Z/ 83 dg SS $ OS O à NX q TT qd E 8 OS né e e E é é pp E 23 p à p à GD o ol o = . T o 818 Ss Ojo o o 2 o =| o o El O o 2) 82 à dj o o v o < o o >| É) o o w|/ O = o o E / o o 2/ |O o& SS = >/ oO o o al E 8 8 So dj oO o o 2 o =| o E) Oo o gg 82 à dl o o $ , 88 TZ &X|8ô oro! = — a = Ss) 8 RR $| o o > / oO o

Z = o = kE 2 <<) O O 8/38 e 3) vw oj XxX O 42/ a O wo o gs 8 ss Ss $Sls o | 8 Elo o

EX ol PS rn o o à E

Õ al Sá SS s) 2 >

EE A e o nv oe Z| 5) 2 2 o o ooo 2 sr sr Ss e Ss Tr Tr o ESP ok XxX x o xoxo x 8 8 | 8 3 8 8 mm T e Nr mr o no 6oosoõs ooo o Sm CS XT CZ- QN FT Sr Oo oO oO oO oO O & Sl a

WS si ss ES sl ST OE 1 38 TZ o o = Nu o o oO = FT O à O T Om N O x o o o O O O TT O NE O <— OQ TT NS N O oO o O O O oO oO O O o $i 2 $ E SS Tv SOS gy 2 SO Mw SG O o | SS dd o mw SO SN mg |O MN O OLE BA ENT 8 o Tt 2 o 8 Zn SS oO o0D oO SO SOS oO oO oO o0OoOoo o o 2 2 / o o. EN A o o a 8 £/| 8 2 3 35 Ç o 8 Rag mNs 3

O < SO S&S Oo O LT LT O LT TZ o O "> = dlo o oO0o o0 oO oO o ooo oocooco | z| o Sl « NE OS ON N g« o o o vv o TF 2 O O O w|l mp o MOR OZ 41 4 O q O oO O q = Oo El = Sos ss SS SST So ST TS Ss =| < É to Ex = nn) E 65 /O TT à o o = = N =| / o o o So sy Oo O à o O O E O << S/S 2 SS SS oO Z— Oo <= € O 2 oO À al < SD O oO oO O O O O O O O O O | <q = a Fls Z 8 Z e € o o << o<q<< << o<qk kt nm < ro rFrooor o doõoo f=) õ O) o — 3 $ 8 o = PC o e = rm < a o — O nm o à à LL XL o 2 2X m é à à da 32 € O 6 o «E E E 2 4 XT EF O É é aq O E MN E OQ O 2 O O O FE > O O à Sl nO E Ts o ES SC SOS > Ty Qd o Qd O O à NM O NM OS SDS QN o 5 à à oO O O O — O Tv O | À = SS O = O dd O O D | O O 6 Ow QN N O Nr oO oO O É O O O O &| So à o N S&S O O N O — | O — Àà oO O & O O & q | O O NX & O Qd E O E ET FT à Só à TZ do SOS E Ss E EF OS SS OS 8 TE Ss SS

E o | o Ola o 26 FF FS oa o o o - alo 26 8 ow rw o PN 23) 8 8538585 asz 26 nn) 5 2 8 e SR SS 2 TN RR &S E RX & O O T— O O N O TT O S$ g Ss S&S NS 3 & 5 SS FT SS SS = = O = & Qd SO O É = dd Oo e e pe é pe é e é é é ep é e o Elo - £| - - Es É Ss 388 as oo ra Nma LN TE TN 827/86 à à EZRA ANAN AN DEST o ST SO oO0 oO o0oO0o0OOoooocoocoocooco o Sa ss Ss Ss - o as 2 | > S&S à o O É 1! O d O à E à O É O tv om x SS FT 2 SOS am o so = on > o o or SS oO SD SO Oo0o0oo0oocooooocooo o $$ Se SS o mn bn OL MN Tr O Tv O O O à HIS à oO TFT o O É O TY O Tr O à O | O O SG = 8 o oo LT TN N N Tg O me À O à o do oO oS0S0TSOT oO o0o0oo0o0oo0o0o0o0oScoo 8 o Sl o T s NO — o Oo E NnN O T O O Tv O O 5/8 3 &8 8 SgSy osso To sS TS SS o Boo TT EN Nm T o À O O à O dio 0 o0o0Do0oo0oocoocoooocoococoo Ss

SIX o 3/ Ojo o — É . TT o O O N $ O O O O T O Ó É à ooo o à O à O O O = MM O N SST ZTE ros o ro 7 Toro Ee Eco E na Ss e en Nov ano eot Boo S e do = ab É 6 aos TT à oO o mn O So od o0o0oo0o0oooooooocoooco a <q DS o <ooeooLootL2ktosorLt Oo<<ta << 000 rFrarrooo2Zorocoãõo = 8 ê x z- Es o so & o < E O — 2 7) e ú << a x Si 8 é 8% 3 = 38 xx <S$ + a no x E m E o» O É UD O E E À à à O D O O € O à 2 34 << Z O O O À 2 O 2 à 8 a o o S o q 2 o Sd 8 eo T 8 É mn mo a NS Sir oO O o O TT QN FT O — É Ty Tv o À O Oo | So 2 o NaN oO OS N FT O bb O E F sw O o lo à FT O bb — OS O Ty O TF O oO Tr T ML JS q SS S o Ns O NS o Tr Oo T O dE Tv 3 S & SS o NT o ads mo ST SE 6 6H 6 TH RN YE Tv do Tr dq Ooo TT = õ o NON O or a o Ff) OPS A Sos Ss ovo POR ON = a PS PS o 9 vv alo om q mt 3 o O dd 3 8 o om à O à o Nr 2 / S&S NS Sw o o | os ooo Mo T O bo b = 8 oO Aa MN O = O O | O N QN QN N N &O MS à o o TF N N O Oo dO MN QN QN GS O LO HS OS SN O Qd Qd io TFT O QN T SO O N O Nr O SN GO YE dd Qd dd o Nr O Ty O dd dd é o Oo NS sm Tm Ss Qd Sm mom mo sm O Qd SS O qd e é pe p e pe e e e p o à po o é e e

8 2 RB vv se mw - | o E 3 o El 5 os 2 fls & 6 o nn bb r — 2 8 SN O Tr T o O N Ts FT TZ FT oO o 8 x ss o o o mo oo = Q x O O à o o o oO oO oO OOo SS oOo Soo xr o o E E 2 o E Oo º & 8 26 O &| Ss o 6) = 3 à “% 2). 2 $ o Ss) ss o vs sl Ss DP O O NM Qà O O à O o O N OQ O&* Oo O O N o FT FT o Nr = a x XE SA TZ mom OS & OQ Oo = os. o ooo Go SS oO oO oO oO ooo? 56 = E e o 8

E O 8 Oo o o Ss dl &S TT 1h po bo NE Oo O T NM O O q o O el $ 3 à SN 3 8 2 ST SS E Sa O O 6 o 8 os o à o O à o 8 3 º o o ooo Ss ooS0o0ooooóôêkê E o Ss 6 8 = o 2 o To 8 SS sS/ o o bb T — FT O O Mm O th Oq O 2 ET mw |/w o o SO E O OM E = O s = 8a 6 8 8 es + É O q eo mn do o dlo o ooo Ss ooo ooo ou,. o E = oO Ss - o = Tm 8 E s S = o o Ss FT mo = O à o mm ?” É 3 = D F O O o = &o& b O FTF sT x . 2 o RX 2 O DA O RX X OQ O oO oO 2 2 É Dn ST FT -ÍTo 6 Sor Tr=r-oSW6So É — E a o o o 2 õ 2 o 2 an o o o 3 à Ss 2/2 o osso $ 0 SÉ g 8 OT 8 SS 2 SO N oo Bom OZ o é mM o à o O O O O O ss SS ooo ooosaê ke 68 o 2 E SS o = Soo oLo o o o o orLo* Qi = = = = E E S E o à O <q rr <ZO0OS Fr F Err <ZF OOo = so 8 < LE - vv E& 8 Z En s SS gy E < = 8 dO o -— O T x = & 4X m O o ? $ O +) TT XxX O OQ IE €m XX O à XX *% 2 ao E << E O WwW à 3 X O o» o o oO Mú w à& = O mo > 208 O Es

PT 8 e o 8 E E > o o 8 Re o o co o o o CT Sm oO o rm o qa O à O O oO Ss Sis o T Qd &m O o O o o o 2 Nr 2 |) O o óô daN 6 O à O O O O O o ol! x O N bb T 8 O O O MN O 3 DD E &/ o SS TZ o o & QN SS Lo 6 Nr O O o É T NaN FT O FT T à q óá O O O O O os Ty 6 O N MN 3 O ib O O O O àN G à 8 Ss 6 = 6 Sr sy vv yr bo o so Deo o o "o õ 82% zo ões o S N o es 8ô NO OO Tv mv Tr Tm O Tv O O TT NnN q Tr É Es OR V 2 o a =. = : Alo o FT O NE O O MN N N O 2 a Z/ %€< od oO TFT FTF E NS Oo Sw o;S qd o 7 TN NS O O 2 = O à O Qd O — o NS SS Sw O NwN É — TFT O É NS O SB = FT SS FT = q o oó Oo à ss O O go O O MN Qd o rr O | É O à O O 2 o 3 8 38 5Ev STS e pp ópr > Pp É dp e 8 o o o - o o 2 o + Ss o sc

É 2 2 o o £ o o o o 3 2

E o o o ke) 2 ss q 53 2 8 o 2 ss

FÃ 8 o 28 e $ =s o o 2 Fo o c o o o

E o o o o

E 8 o gg 3 o S&S o o o o

E É o o o < 2 o E 5 So g Es o 8 < E x o Ss o ss 6 & o o o << o o E o o o v 8 n E a 2 2 Ss 2 Ss o > o o o o o o ES)

' EXEMPLO 2

RESEQUENCIAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DO ALELO CAUSAL PARA BLK Como discutido acima, BLK foi identificado como um locus de risco associado com LES que alcança significância genômica completa (P < 5 x 10%). Para caracterizar ainda mais a base genética dessa associação e para identificar o alelo(s) causal(ais), realizou-se estudos de resequenciamento do locus BLK e ensaios de expressão de gene repórter, conforme descrito abaixo.

Para o estudo de resequenciamento, todos os 13 exons e 2,5 kb de sequência promotora a montante do locus BLK no DNA isolado a partir de 192 pacientes na Autoimmune Biomarkers Collaborative Network (ABCoN) (Bauer et al., PLoS medicine 3(12):2491 (2006)), um repositório NIH/NIAMS fundido e 96 indivíduos controle no New York Cancer Project (NYCP) (Mitchell et al., J. Urban Health 81:301-10 (2004)) foi resequenciado. O DNA genômico foi o genoma completo amplificado de acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Valência, CA., Cat. Nº 150045) antes do sequenciamento.

Os resultados de resequenciamento revelaram que 17 mutações (10 não sinônimas, 7 sinônimas) foram encontradas na região de codificação do gene BLK (Tabela 8). Nenhuma dessas mutações mostrou frequências significativamente mais altas em casos do que nos controles. A frequência globalde mutação não sinônima não foi significativamente mais alta nos casos (14/191) do que nos controles (7/96).

Além disso, variações comuns múltiplas foram identificadas na região não codificadora do BLK (mostrado na Tabela 9). Três SNPs (rs4840568, rs1382568 [um SNP tri-alélico (A/C/G); alelo C foi previamente identificado como o alelo de risco] e rs922483 (SEQ ID NO: 13)) mostraram associação com os /oci previamente identificados a partir de GWAS (Hom et al., N Engl J Med 358:900-09 (2008)) (rs13277113, razão de chance, 1,39, P=1 x 107% com rº > 0,5. A Figura 4 mostra um bloco de Desequilíbrio de Ligação

” (LD) (mostrado em À) dentro da região promotora do BLK que foi gerada utilizando Haploview (programa de computação disponível gratuitamente na URL www.broadinstitute.org/haploview/haploview; consulte Barrett J.C., et al., Bioinformatics 21:263-65 (2005). A porção superior da figura mostra um — diagrama esquemático da região promotora de BLK com a localização relativa dos SNPs identificados indicados. O valor de rº entre os SNPs listados é mostrado nas caixas. A força de LD entre dois SNPs é indicada pelo valor À? fornecido em cada caixa. Os /loci identificados a partir de GWAS (rs13277113) e os três SNPs identificados a partir de resequenciamento (rs4840568, rs1382568 e rs922483 (SEQ ID NO: 13)) estão indicados na margem preta no topo da figura.

Esse estudo de resequenciamento não revelou qualquer variação comum na região codificadora de BLK. No entanto, três variantes comuns (rs4840568, rs1382568 e rs922483 (SEQ ID NO: 13)) na região promotora, foram identificadas como alelo(s) causal(ais) potencial(ais) dos efeitos biológicos de BLK associado com aumento de risco de LES. Cada uma dessas variações foi utilizada em ensaios de repórter da luciferase descritos em detalhe abaixo para caracterizar ainda mais a associação.

TABELA 8

MUTAÇÕES NA REGIÃO CODIFICADORA DO BLK Alteração de Troca de Aminoácido Nucleotídeo Casos Controles Exon dbSNP dbSNP Zigosidade Sem sinônimo (Proteína: (MRNA: (n=191) (n=96) NP 0017062) NM 001715.2) 2 39P>L 697 C>T NA N/A Heterozigoto Sim 1 o 4 71A>T 792 G>A rs55758736 N/A Heterozigoto sim 8 4

Alteraçãode — Trocade Aminoácido Nucleotídeo Casos Controles Exon dbSNP dbSNP Zigosidade Sem sinônimo (Proteína: (mMRNA: (n=191) (n=96)

NP 0017062) NM 001715.2) 4 75R2R 806 G>T N/A NA Heterozigoto Não 1 o 4 860>Q0 839 G>A rS56185487 N/A Heterozigoto Não 2 o 8 181R2W 972 CT N/A N/A Heterozigoto sim 2 o 6 1370>Q 992 G>A N/A N/A Heterozigoto Não o 1 7 180R>H 1120 G>A N/A N/A Heterozigoto sim 1 o 7 190S>S 1151 CT N/A N/A Heterozigoto Não o 1 8 237P>P 1292 CT N/A N/A Heterozigoto Não 1 1 8 238R>QO 1294 G>A N/A N/A Heterozigoto Sim 1 o 325K>T 1555 A>C NA N/A Heterozigoto Sim 2 o 10 327D>V 1561 AT N/A N/A Heterozigoto sim o 1 10 331R>| 1573 G>T N/A N/A Heterozigoto sim 1 o nn 359R>C 1656 C>T N/A N/A Heterozigoto sim o 1 12 425L2P 1855 TC NA N/A Heterozigoto sim o 1 13 464121 1973 G>A NA N/A Heterozigoto Não 1 o 13 474R>R 2003 C>T NA N/A Heterozigoto Não 2 o

Frequência de mutação sem 14191 7196 sinônimo o E o e E = 8 El 8 | El s fe) ? Ss 8 ss Es = 8 E " E E 8 E A a " 3 = ão —| FS = o FE GE >| = 2 & 3 o DE E E o Ss 28 OO 8 Es s a no e FE a õ|l à 8 Ss. 8 A o 2 = º 8 8 o ê Ss E . DES as 8 o| Es 8 E A 3 Ss 3| Ss SS se 8 FR Ss a ê 8 8 E.

DS Fo õ 8 8 & o 3 « 8, 3 Ss gt po A ..s TOE 2 S T 3 o DOS - = Sã 2 3 8 3 8 e E 8 o ER: E) º E Fo 8 8 al É E & e o EE : o | al 8 e E o DE ê SN o E 3 = So KR & o = R o S 8 E E W a A = os g & Ss EN > Fr oo & E a a N & o & a 2 EE as EA 2 s E R s o ã = E = o.

E o E) & 2 3 3 EE TE a º a “E 2 s E ão To & E <| a 8 x z 23 e E gs o E à " O E = Ss -s Tm E 8 2 EO o Ss.

Sã soe = m ui o TZ 2 2 FS e Ss 8 5 SS SR < a. õ 2 Z = 2 8 Ta o E é 2 FE À Ss FA g 8 E & Ea e E E É - o 8 8 Ss 3 ? E 2 E 3 Sl gg & ã $ E 3 Í ol 3 sa.

Ne se : 8 T E 3 ds do 8 3 e 8 Bs o a o & é O É o o 8 a É É o e E x 2 o r- e o EE a ã v a e eo ss Ss Z z s = o E 3 8 & 2 8 E ç E Rb DA S < FS 2 A : E & < s É os e e.

XY ê 8 3 5 DB O o P DB : E 2 É 5 ã BE e o z 3 & E go . - & Po So Ss ne Z o ep 8 EE | ES Dão - e z & o 3 s o ãz 8 - | P o < o s o E A [E Z < a S Ê o o O s sl s| 8 EO o o ? â al Ss 4 O E z E) ? à E A e.

Z al” & 5 Do O Ss e 3 3 2 o ne o e E 3 3 a o O o 8 8 Fr E 3 DE e E o 3 E E 8 3 E " 3 Tr ão 8 E Ê E < SS E os o z a? e E 88 à v Ê o SS E ENS. o 3a Fo ô o O ES To É Ss z AC ão o To 8 Dão O EA = T A or ZE A ão x CN. 2 * ro Es 3 85 aos 8 8

Eos E El 3 8 28 BE 3 2 2 2 R é E q 2 ER a o o = = = o o = = = o a S SS SS Sd o oO o Sd 0 Oo o o o Sos a o = nm " E. o o = E o o o = 8 E BB 3 8 8 8 y 83 & $ 38 2 & 8 3 $ & 38 2 s3S 8 8 é s a SS AS 3 SS Sô &$ & SS 32 8 à Ss So So o Ss o o o o o o o -) 2 2 BZ ma e Bo No mo ao 8 NONO NO sz sz 2 $ 8 & 2 $ 8 83 38 3 2 eo a % 3 Ss E E A Aa A ON A A e ST SP OS as SS vs Ss do A ao So E E Ss = 2 mo 8 mo 8 NO o = 8 8 E E 8 8 $ EX& 2 2 5 8 8 2 sã E No Rs A o, O, O o A A a O, O 6 S| S&S S&S S&S Sd o Sd SS Sd o od oO oO OS O SP &s dg 6 60 $$ Jd SS FZ SS N Sé o 6 gl 8 2 ã 8 2 8 8 83 3 2 RE 8 8 MIN ão ao Ro A AA ARA A A 8 S SS S od Sd oO oO 0 o oO o o o $ & sx SS og & 8 8 8 8 8 8 8 3 T Ee) = = = = E ER E To E E 8 ST E S 8 s 8 E 8 Ss s 8 8 s o se E A F i ; | : | 7 so ; E SP Ss E 5 JS g NS 65 8 3 |8S é $ ce 8 8 Rg SE 8 ã SS 8 3 3 S&S dd SS Z <T 2 SIS & 8 & Ss 8 8 $ 8 8 3 $ g 8 & Sd E 8 6 FZ 8 à ZE $ 3 S&S 8 o o 3 Ss Ff 8 8 8 o Pr o < o < < o Pr Pr RP o PR < < wo Bo = SC & 8 68 8 e 8 ê < < < T T S < < T Ss Ss < < 8 Zz Z E a 3 3 Zz Zz 3 8 sa Z Zz E) s ss Ss z 2 P E P e o

É Ss a 8 mom mm mom mm mm mm

E 2 o | = o o 8 Sl 8 & 8 3 8 8 R E 3 8 8 8 &$ C o 8 3 Tv 3 8 É TT z 3 8 SS S$S 3 5 8 S&S 8 & 8 8 8 8 8 8 8 8% 8 8 é É gg 3 2 3 3 $ $ 3 3 3 $$ $$ 3 o S = = = Tr Tr = Tr = Tr = Tr Tr Tr o o 8 38 dg ER 2 2 2 HE E E dh RF OR dE o úC Fr Fr | < o oO o oO o O o o Fr er z

' Os ensaios de genes repórter de luciferase foram executados para investigar o efeito dos três SNPs, rs4840568, rs1382568 e rs922483 (SEQ ID NO: 13) na expressão gênica mediada por BLK. Uma sequência a montante (-2256 a +55 bp) de BLK foi amplificada utilizando o DNA genômico a partir de indivíduos que carregam haplótipo de risco ou sem risco. Cada produto de PCR foi clonado no vetor pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA; Cat. Nº K4500-01) e em seguida subclonado no vetor repórter de luciferase pGL4 (Promega, Madison, WI; Cat. Nº E6651). Um constructo que carrega haplótipo sem risco foi utilizado como molde paraa mutagênese (Stratagene, La Jolla, CA; Cat. Nº 10519-5) para criar vários haplótipos. Os primers utilizados na amplificação de PCR foram como segue: forward! CCACCTCTCTTCCGCCTTTCTCAT (SEQ ID NO: 1); reverso: TITCATGGCTTGTGGCTTTCTGCC (SEQ ID NO: 2). Os primers utilizados na mutagênese estão listados na Tabela 10 abaixo. TABELA 10

LISTA DE PRIMERS DA MUTAGÊNESE rs4840568 G>A GATCCAAGACTATGAAGAGAGAAGAGAGAGCCCA forward Cc (SEQ ID NO.: 3) rs4840568 G>A GTGGGCTCTCTCTTCTCTCTTCATAGTCTTGGATC reverso (SEQ ID NO.: 4) rs1382568 A>C CCAGACACCACTCACCCCTCTAGATGTTGGGAT forward (SEQ ID NO.: 5) rs1382568 A>C ATCCCAACATCTAGAGGGGTGAGTGGTGTCTGG reverso (SEQ ID NO.: 6) rs1382568 A>G CCAGACACCACTCACCGCTCTAGATGTTGGGAT forward (SEQ ID NO.:7)

| rs1382568 A>G ATCCCAACATCTAGAGCGGTGAGTGGTGTCTGG reverso (SEQ ID NO.: 8) rs1382568 G>A CCAGACACCACTCACCACTCTAGATGTTGGGAT forward (SEQ ID NO.: 9) rs1382568 G>A ATCCCAACATCTAGAGTGGTGAGTGGTGTCTGG reverso SEQ ID NO.: 10) rs922483 C>T (SEQ |CGGGGGTGCTGCTACCTCTGTCTGC ID NO: 13) fonvard (SEQ ID NO.: 11) 15922483 C>T (SEQ |GCAGACAGAGGTAGCAGCACCCCCG ID NO: 13) reverso (SEQ ID NO.: 12 Vetor repórter de controle da luciferase renilla pRL-TK (Promega, Madison, WI; Cat.

E2241) foi utilizado para normalização.

À linhagem celular BJAB (uma linhagem celular linfoide contínua com características de células B (derivadas da medula óssea), desprovida do genoma do vírus Epstein-Barr e derivada de três linfomas humanos; Klein et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 71:3283-86 (1974)) ou a linhagem celular de Daudi (American Type Culture Collection (ATCC) cat.

Nº CCL- 213) foi utilizada para transfecções.

Para cada transfecção, 5 x 10º células foram transfectadas com 5 ug de DNA de cada vetor usando-se um dispositivo Amaxa?º Nucleofector” (Lonza, Walkersville Inc, Walkersville, MD (Lonza Group Ltd., Suiça); Cat.

Nº AAD-1001). O Kit L Nucleofectorº de linhagem celular (Lonza, Cat.

Nº VCA-1005) foi utilizado para células Daudi com dispositivo Nucleofector” Programa A-030. O Kit V Nucleofectorº de linhagem celular (Lonza, Cat.

Nº VCA-1005) foi utilizado para células BJAB com dispositivo Nucleofectorº Programa T-020. Todas as transfecções foram realizadas tanto em duplicata como em triplicata.

As células foram incubadas a 37ºC durante 16 horas após a transfecção.

Após a incubação, as células foram coletadas e foi medida a atividade de luciferase utilizando o Dual-Luciferaseº Reporter Assay System (Promega, Madison, WI; Cat.

Nº E1960) de acordo com as instruções do fabricante.

Os efeitos de cada um dos SNPs rs4840568, rs1382568 e rs922483 (SEQ ID NO: 13) sobre a expressão gênica mediada por BLK conforme medido no sistema de ensaio repórter de luciferase descritos acima são mostrados na Figura 5. Os diferentes haplótipos gerados por mutagênese foram comparados com os haplótipos 22-GAC (tipo selvagem) sem risco (barra aberta em cada uma das Figuras SAa F) e o haplótipo 22-ACT de risco (barra hacurada em cada uma das Figuras 5Aa F).

Figuras 5A e 5B mostram que o SNP rs922483 (C>T) (SEQ ID NO: 13) conduziu a um efeito significativo sobre a expressão gênica mediada por BLK tanto em BJAB (Figura 5A) como em células de Daudi (Figura 5B). O haplótipo 22-GAT mostrou atividade transcricional reduzida em quase 50% em ambas linhagens celulares comparado aos haplótipos 22-GAC sem risco (barra aberta). Haplótipos com alelo T apresentaram atividade consistentemente mais baixa do que aqueles com alelos C. Cinco experimentos independentes foram feitos em células BJAB e seis experimentos independentes foram feitos em células Daudi. Os dados apresentados representam a média +/- desvio padrão da média (s.e.m.) em ensaios em triplicata; *p < 0,05, **p < 0,01, **p < 0,001 (ensaio t).

As Figuras 5C e 5D mostram que o SNP rs1382568 (A>C/G>C) não resultou em qualquer efeito significativo sobre expressão mediada por BLK em qualquer linhagem celular. Ambos haplótipos 22- GCC e 22-GGC(barras manchadas) mostraram um nível similar de atividade de luciferase em comparação ao haplótipo 22-GAC sem risco (barra aberta). Cinco experimentos independentes foram feitos em células BJAB e seis experimentos independentes foram feitos em células Daudi. Os dados apresentados representam a média +/- s.e.m. em ensaios em triplicata; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns=não significativo (ensaio tv.

As Figuras 5E e 5F mostram que o SNP rs4840568 (G>A) não resultou em um efeito significativo sobre expressão mediada por BLK em células BJAB ou células Daudi. A diferença entre o haplótipo 22-AAC (barramanchada) e o haplótipo 22-GAC sem risco (barra aberta) não foi estatisticamente significativa em células BJAB (Figura SE), mas foi estatisticamente significativa em células Daudi (Figura 5F) A probabilidade de um alelo A ser um alelo causal é significativamente reduzida, dado o fato que o haplótipo 22-ACC (barra manchada) não apresentou qualquer defeito na atividade de luciferase em comparação ao haplótipo GAC sem risco (barra aberta) (Figura 5F). Os dados apresentados representam a média +/- s.e.m. em ensaios em triplicata; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns=não significativo (ensaio t).

Foi mostrado anteriormente que a repetição (GT) na região a montante do promotor BLK pode funcionar como um enhancer de expressão gênica de BLK (Lin et al., J Biol Chem 270: 25968 (1995)). Portanto, também testamos se o comprimento de repetição (GT) pode afetar a atividade transcricional do promotor BLK. Para executar esses experimentos, amostras de DNA genômico a partir de indivíduos que carregam tanto 18 repetições (GT) (SEQ ID NO: 14) como 22 repetições (GT) (SEQ ID NO: 15) foram selecionadas para clonagem utilizando a estratégia descrita acima. Vetores finais foram sequenciados para confirmar que continham o comprimento correto de repetições (GT). Conforme mostrado na Figura 6, haplótipos com 18 repetições (GT) (SEQ ID NO: 14) exibiram um nível similar de atividade transcricional em comparação com aqueles com 22 repetições (GT) (SEQ ID NO: 15) no ensaio repórter de luciferase. Os dados apresentados representam a média +/- s.e.m. em ensaios em duplicata, ns=não significativo (ensaio t).

: Em resumo, esses resultados dos esforços de resequenciamento de BLK e os resultados dos ensaios de genes repórter de luciferase indicam que o SNP rs922483 (C>T) (Figura 7, SEQ ID NO: 13) é o alelo causal que resulta na redução da transcrição de BLK, um efeito biológico que está associado com um risco aumentado de LES, Além disso, os resultados mostraram que o alelo T de rs922483 (SEQ ID NO: 13) reduziu o nível de expressão gênica mediada por BLK em 50%. É interessante notar que rs922483 (SEQ ID NO: 13) reside em uma região conservada evolutivamente no primeiro exon do BLK e dentro de um possível sítio de iniciação da transcrição humana.

Uma sequência consenso para o motif Inr humano foi identificado como YYANWYY (código do nucleotideo IUPAC). Juven-Gershon et al.

Dev.

Biol. 339:225-229 (2010). No SNP rs922483 (SEQ ID NO: 13), a segunda base na região Inr é alterada em relação ao motif consenso.

Consequentemente, a sequência Inr do haplótipo de risco de LES é CTACCTC enquanto que a sequência Inr do haplótipo “tipo selvagem” é CCACCTC.

Sugerimos que a modificação da segunda base no motif Inr conservado pode alterar a afinidade do complexo de transcrição TFIID resultando na diferença observada na transcrição descrita acima.

Claims (9)

: REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA IDENTIFICAR LÚPUS em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito, a presença de uma variação em um locus de risco de LES, emqueol/locusderiscodeLES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus.

2. MÉTODO PARA IDENTIFICAR LUPUS em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende detectar em uma amostra biológica derivada do sujeito a presença de uma variação em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6, em que a variação no pelo menos um /ocus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) para o pelo menos um /ocus, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6, e em que o sujeito tem suspeita de sofrer de lúpus.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende detectar uma variação adicional em pelo um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6, em que uma variação adicional em pelo menos um locus ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um SNP para o pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado —pelofatode que uma variação é detectada em pelo menos dois /oci, ou pelo menos três /loci, ou pelo menos quatro /oci, ou pelo menos cinco /loci, ou pelo menos dez /oci, ou pelo menos 13 /oci, ou pelo menos 26 /oci.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado

' pelo fato de que o pelo menos um locus é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1 e IL10.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a variação no pelo menos um locus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 4.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um locus é selecionado a partir de /FIH1, CFB, CLECT16A, IL12B, e SH2B3.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a variação no pelo um /ocus compreende um SNP, conforme apresentado na Tabela 6.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para predizer a responsividade em um sujeito com lúpus a um agente terapêutico para lúpus, em que a presença da variação —nolocusBLKe ou a presença da variação no pelo menos um locus, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6, indica a responsividade de um sujeito ao agente terapêutico.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para selecionar um paciente que sofre de lúpus para tratamento com um agente terapêutico para lúpus.

11. MÉTODO PARA AVALIAR SE UM SUJEITO ESTÁ EM RISCO DE DESENVOLVER LÚPUS, caracterizado pelo fato de que compreende detectar em uma amostra biológica obtida do sujeito, a presença de uma assinatura genética indicativa do risco de desenvolver lúpus, em que a dita assinatura genética compreende um conjunto de pelo menos três polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), cada SNP ocorrendo em um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e na Tabela 6.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado

' pelo fato de que a assinatura genética compreende um conjunto de pelo menos quatro SNPs, ou pelo menos cinco SNPs, ou pelo menos sete SNPs, ou pelo menos dez SNPs, ou pelo menos 15 SNPs, ou pelo menos 20 SNPs, ou pelo menos 30 SNPs.

13. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que cada um dos /oci de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1, IL10, IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B e SH2B3.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a assinatura genética compreende ainda um SNP em um locus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e o locus de risco de LES é BLK, em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322 no cromossomo 8 humano.

15. — MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a detecção compreende realizar um processo selecionado a partir de um ensaio de extensão de primer, um ensaio de extensão de primer específico para alelo; um ensaio de incorporação de nucleotídeo — específico para alelo; um ensaio de hibridização de oligonucleotídeo específico para alelo; um ensaio de nuclease 5º; um ensaio que emprega balizas moleculares (molecular beacons); e um ensaio de ligação de oligonucleotídeo.

16. MEDICAMENTO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LÚPUS em um sujeito que compreende lúpus com um agente terapêutico, caracterizado pelo fato de que uma variação genética é conhecida por estar presente em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em um /ocus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), o locus de risco de LES é BLK, e em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322, no cromossomo 8

: humano.

17. MEDICAMENTO PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LÚPUS em um sujeito que compreende lúpus com um agente terapêutico, caracterizado pelo fato de que uma variação genética é conhecida por estar presente em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6, em pelo menos um focus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4 e/ou Tabela 6.

18. MEDICAMENTO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um focus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1, e IL10.

19. MEDICAMENTO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um /ocus é selecionado a partir de 1IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B, and SH2B3.

20. MÉTODO, caracterizado pelo fato de que compreende fabricar um agente terapêutico para lúpus, e embalar o agente com instruções para administrar o agente para um sujeito que tem, ou que se acredita ter lúpus, e que tem uma variação genética em uma posição correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), em um focus de risco de LES, em queoSNP é rs922483(SEQ ID NO: 13), o locus de risco de LES é BLK, e em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322, no cromossomo 8 humano.

21. MÉTODO, caracterizado pelo fato de que compreende fabricar um agente terapêutico para lúpus, e embalar o agente com instruções para administrar o agente para um sujeito que tem, ou que se acredita ter lúpus, e que tem uma variação genética em uma posição correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme apresentado na Tabela 4 ou Tabela 6, no pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado

: na Tabela 4 ou Tabela 6.

22. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição de lúpus em um sujeito, no qual uma variação genética é conhecida por estar 5 presente em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em um focus de risco de LES, em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), o locus de risco de LES é BLK, e em que a variação é timina na localização cromossômica 11389322, no cromossomo 8 humano.

23. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição de lúpus em um sujeito, no qual uma variação genética é conhecida por estar presente em uma em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme apresentado na Tabela 4, empelomenos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4.

24. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar uma condição de lúpus em um sujeito, no qual uma variação genética é conhecida por estar presente em uma em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6.

25. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, que tem uma variação genética em um /ocus de riscode LES, em que o locus de risco de LES é BLK, em que a variação no locus BLK ocorre em uma posição nucleotídica correspondente à posição de um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), em que o SNP é rs922483 (SEQ ID NO: 13), e em que a variação é timina na localização cromossômica

: 11389322 no cromossomo 8 humano.

26. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, que tem uma variação genética em uma posição —nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), conforme apresentado na Tabela 4, em pelo menos um /ocus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 4.

27. "USO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1IBP1, e IL10.

28. USO DE UM AGENTE TERAPÊUTICO, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar um sujeito que tem uma condição de lúpus, que tem uma variação genética em uma posição nucleotídica correspondente a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), — conforme apresentado na Tabela 6, em pelo menos um locus de risco de LES, conforme apresentado na Tabela 6.

29. “USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um /ocus de risco de LES é selecionado a partir de IFIH1, CFB, CLEC16A, IL12B, e SH2B3.

Seleção de Variante Amostras de Replicação (n = 10,848 SNPs) (1963 casos de SLE e 4329 controles) Locicom P < 0,05 em 1310 casos de SLE, 7859 controles GWAS 2,466 Loci (3,188 SNPs) Estados Unidos 1129 casos de SLE e 2991 Loci de Risco de SLE controles anteriormente relatado Loci (505 SNPs) mista Loci confirmado para outras doenças autoimune Loci (42 SNPs) Suécia 834 casos de SLE e 1338 Marcadores Informativos de controles Ancestralidade (AlMs) 7,113 SNPs Fig. 1

Taxa de Recombinação — (CM/Mb) 8 $$ 8 8 E o

A s Es Senna E so $SSS ES 1 SE EA RA GS t o

BALL O PE .c os S&a á GEO SS Ez ro e = É é o V os ã Í e * 8

O do É

SO PE, 2% E e ES 43 = e EO oa 8 E E) 2/ºÉEES || 1: E 2 O Quina 8 QmÊ ã EF SE T a a 2 E õ ço O DS Es " o t E e 6 o rÊ s s UU mm E 7 8 N o 2 é $ 2

N é : o 2 e Tg & o CS e A (=) co o q o o “login (valor P) aN

DD uu.

Taxa de Recombinação - (CM/Mb) 8 2 8 2 8 o

ER " SAE: & SE) Tena« & ESOOS Eid & ARA Q Ad

DN ANN E XX > soco Foscê

É Do & o O E o - 2 Sd VT o dE oa o O = Ss SE o o x DES o Hr RR 2 < & o TE - SÉ ess - TS = ss o. SE o & São & 1 Fa o / E o ár = ã 2 o | às sz Cita & ã& Ee E = SS ON o T 2 o FS = Ss Bo & ” Bê Ss ê SG

E SE 8 SO . SO

E o UM o —— DA 3 - — < ã SO $ FEIA LD é = S O O TT 2 O Ls “logio! (valor P) coa .

D uu

Taxa de Recombinação — (CM/Mb) 8 2 $$ & 8 o

E AZ Í o 1 es & FA T o & É TON & 8 = RR Cão | õ 3 O À o BE e S soco E

O Y — í [es Z e Õ Z Ne & so OA bx 3 8 — nan) sa = co ã &% o & ” & EP | N = S o Z o É be & S E Se o 2 RS Z. é E)

NS E au ÃO = E o SP t ds Ne = a & Ez É o ns 8 e ” E sd é

SA

E S v E

DB O E TT N O Ss -logio (valorP)

O oN

DD uu

Taxa de Recombinação — (CM/Mb) o so so o o o T o o Rss o o & ã V o E s£ 8 de À ã TE OO DS (& os à d RR DS 8 2. Ba DE a "oco o A A ” Um ” RE - 11 "O <:

E DE E 2X E Zi SS. < .. 2 | ê CS 2 = o i o 8 Y = * a DO 1 ã& E nm TT se < - o à EPE E /8s 8 " o = e Ss o 8 & o Z = x oº 1t X o ss Sã BSF E & a 8" o E€ Z n ê o 78 Soo < pi SS S "ss O t 8 oO 8 S. - Pol E e 81 a o 8 + ko o CDS ui & S e Oo ao O o o o + os o s login (valor P) o coa .

D uu

Taxa de Recombinação — (CM/Mb) 8 2 8 & E o Rc Oo &

RS É Fou DES sSSoo GBA t AAA Oo TS " BL E « so0v€º 9 & > Ss | ZE 4 8 | es o E Sezo e t

SS E E F& < Ss a pague Es t Fe =

EA Se a ES S= AH. = e. s t Ee ORE. = em EX | Ss e AEE Ss = s Ss o i 3 o Li 1 - 8 = É te E WS Z z “CT Ss a x 1 = —" TIO, vn a Ss SE dd 985 Es fe == & ê & - 3 E : 8 o. Ps á o = Ss f o & 1 o : o FE SEDA = = ão Ev DE 12 & & = < T Pp |8 ST - fo é E s& x Oõ Í zo o o o As a o s -log1o (valor P) Wu

N :

DD uu

: 1s  P=2x1015 Í A, CI > GAIA, ÇA Fig. 2F o1 0.2 03 O04 veio 06 o7 0.8 0.9 1.0 Fig. 3 | É É |

2517 C>T-rs922483 & N Sd 1825 A>G-rs1382568 | && Jo

REAR

CER — TEN, É NF 1624 G>A-rs4840568] | À) J NA — , RATO | A NS CR SS H 1504 T>Crs1382567 | RR AND AS»

CSZANSSY NAS 1326 Co>G-regega29a | E A RAS

SS CSN 1283 T>C-re27a6a4a | É A A Io 7

ERA 120 OT é = SAS CI v 181, C>A-rs2251056 PR O s É = a SS u. 3 1e> 2 oO

A 8 g 8 s EE à Ss OOo O = es T à 28 Ss o Fe o 2 PR % rm t——"HEU6] BJAB rs922483 C>T -2256 455 po : 22 ac fm EsSSSISE : 22 Aa iT Fig 5A < >» ce 22 ac lc 7 22 ac Tl ASS 22 ea lr ) 7 o 22 ca le Lo AH Controle O 1 2 3 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes)

O x < Ss = o S ô& 5 8 BÊ ç& É 8s 2 à 28 ss o vo o É PE É ; + mt HLUC] Daudi rs922483 C>T 2256 +55 s s 22 ac fr Fig. 5B 22 aa lt ' 22 ec |r 22 ac lc 7 22 ac dr ASS 22 ca 7) FER ) T+ 22 ea fel LE Controle do O 1 2 3 à 5 6 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes)

o

A <o o 82 s somo O 8 SÊ Es ês & 884 < Pp É . BJAB 1513825688 A>C/G>C -2258 +55

HS Fig. 5€ 22 Ae To ASS 22 sec 2º ele 7 ns 22 Gale TA Controle o 1 2 3 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes) v 8 Z coco e (oO o E ss 8 & 38 É vp Daudi rs1382568 A>C/G>C -2256 +55 : : 22 Afel To ASS Fig. 5D * x» aee - 2 ele 7 kb ns 22 SAPOS Tn] Controle FIST o 1 2 3 4 5 86 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes)

o ô = <o e 8% 7 eo O 8 SO So & ESSA é 388 é 6 o Et——Hiuc] — BJABrs4840568G>A “2256 +55 i i Fia. 5E 22 Ale c

9. 2 eo 7 7 & ns 22 ae 7 ASS 22 ala c ESSES: 7 ns 22 ela e HA Controle o 1 2 3 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes) x 8 = O s BE & 8438 2 38 Ss É E 3 ; Daudi rs4840568 G>A -2256 +55 ES Fig. 5E 22 Ale Cc ig. ea 9 2 ee 7 Ts 22 Alec T RSS 22 ala c 1EESA + 22 GA EC TA Controle Sud O 4 2 3 4 85 6 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes)

o

A ô

E TX o ox 7 3 E8 so S Oo o % 388

Z PE É Daudi 151382568 A>C/G>C -: -2256 +55 Fig. 6 * cc 7 — ns 22 GIG| Cc a a Nao 18 GA, ec ) Dores E Ea es 22 GlAl c Controle 19 5A o 1 2 3 4 5 58 Atividade Relativa de Luciferase (Número de Vezes) r$922483: CTCTGATCGCAGACCGGGGGTGCTEGCIC/TIACCTOTGTCATGCOT

GCCGGCAGAAAG (SEQ ID No.13) Fig. 7

' ReEsuMO “MÉTODOS PARA IDENTIFICAR LÚPUS, MÉTODO PARA AVALIAR SE UM SUJEITO ESTÁ EM RISCO DE DESENVOLVER LÚPUS, MEDICAMENTOS PARA TRATAR UMA CONDIÇÃO DE LÚPUS, MÉTODO E USOS DE UM AGENTE TERAPÊUTICO”

São fornecidos métodos de identificação, diagnóstico e prognóstico para lúpus, incluindo determinados subfenótipos de lúpus, bem como métodos de tratamento de lúpus, incluindo determinadas subpopulações de pacientes.

Os métodos fornecidos são baseados em um conjunto de alelos associados com o lócus de risco lúpus eritematoso sistêmico (LES), incluindo BLK, TNIP1, PRDM1, JAZF1, UHRF1BP1, IL1 O, IFIH1, CFB, CEC16A, IL12B E SH2B3 que contribuem para o risco de LES.

Também foram fornecidos métodos para identificar agentes terapêuticos efetivos para lúpus e prever a responsividade a agentes terapêuticos para lúpus.