PL183631B1

PL183631B1 - Pochodna polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów-(polipeptydu MGDF), sposób jej wytwarzania oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca taką pochodną

Info

Publication number: PL183631B1
Application number: PL95345107A
Authority: PL
Inventors: Timothy D. Bartley; Jakob M. Bogenberger; Robert A. Bosselman; Pamela Hunt; Olaf B. Kinstler; Babru B. Samal
Priority date: 1994-10-12
Filing date: 1995-03-30
Publication date: 2002-06-28
Also published as: UA65519C2

Abstract

1 . Pochodna polipeptydu stanowiacego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - M GDF, w ybranego z grupy polipeptydów obejmujacej. - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F-1, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-2, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig 12, okreslany jako M GDF-3, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-4, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GD F-5, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig. 11, okreslany jako M GD F-6, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig. 11, okreslany jako M GD F-7, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GD F-8, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F-11, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 27-353 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F-12, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 27-195 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-13, - polipeptyd o sekwencji am inokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F-14 oraz - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 27-184 przedstawionych na rysunku Fig 11. okreslany jako M G D F -15 w której polipeptyd MGDF przylaczony jest do co najmniej jednego rozpuszczalnego w wodzie polimeru 15 Sposób wytw arzania pochodnej polipeptydu stanowiacego czynnik wzrostu i rozwoju m egakariocytów - M GD F, w ybranego z grupy polipeptydów obej- mujacej - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-1; - polipeptyd o sekwencji am inokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GD F-2, - polipeptyd o sekwencji am inokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig 12, okreslany jako M GDF-3, - polipeptyd o sekwencji am inokw asow 22-172 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-4, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-5, - polipeptyd o sekwencji am inokw asów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-6, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-7; - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M GDF-8. - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F -11, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-353 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F-12, - polipeptyd o sekwencji am inokwasow 27-195 przedstawionych na rysunku Fig 11. okreslany jako M GDF-13, - polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig 11, okreslany jako M G D F -14 o r a z ............................................................... PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych pochodnych polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów, określanego w niniejszym tekście synonimowo jako ligand Mp1 lub MGDF, który stymuluje wzrost megakariocytów i zwiększają różnicowanie lub dojrzewanie megakariocytów, z ostatecznym efektem w postaci wzrostu liczby płytek. Wynalazek zapewnia także sposób otrzymywania tych pochodnych. Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej pochodne MGDF, jako substancję aktywną.

W niniejszym wynalazku są zaangażowane co najmniej dwie szerokie dziedziny badań. Pierwsza dotyczy rozwoju megakariocytów i następnie wytwarzania płytek, natomiast druga dotyczy członu polipeptydowego rodziny receptora czynnika wzrostu, zwanego w niniejszym tekście receptorem Mp1 - oraz jego ligandów. Każda z tych dziedzin badawczych zostanie obecnie omówiona w zarysie.

A. TWORZENIE PŁYTEK Z MEGAKARIOCYTÓW

Płytki krwi są cyrkulującymi komórkami, które odgrywają decydującą rolę w zapobieganiu krwawieniu i koagulacji krwi. Megakariocyty są komórkowym źródłem płytek i powstają z komórki prekursora zwykłego szpiku kostnego, który powoduje wszystkie hemopoetyczne (tj. krwiotwórcze) linie komórkowe. Ta pospolita komórka prekursora znana jest jako komórka macierzysta ze zdolnością wielokierunkowego różnicowania się lub też PPSC.

Hierarchię komórek progenitora megakariocytówego określono w oparciu o czas pojawienia się oraz wielkość kolonii megakariocytów (MK) pojawiających się w układach hodowli in vitro w odpowiedzi na odpowiednie czynniki wzrostu. Najprymitywniejszą komórką progenitora megakariocytowego jest megakariocyt jednostki tworzącej pęknięcie (ang: burst-forming unit; BFU-MK). Uważa się, że BFU-MK wytwarza ostatecznie liczne megakariocyty jednostki tworzącej kolonię (CFU-MK), które są bardziej zróżnicowanymi komórkami progenitora MK.

W trakcie gdy komórki MK podlegają kolejnemu różnicowaniu, tracą one zdolność by podlegać mitozie, lecz nabywają zdolność do endoreduplikacji. Endoreduplikacja (lub endomitoza) jest zjawiskiem podziału jądrowego w komórkach w nieobecności podziału komórki. Endoreduplikacja ostatecznie daje w wyniku MK, który jest poliploidem. Dalsze dojrzewanie MK daje w wyniku nabycie organelli cytoplazmowych i składników błony, które charakteryzują płytki.

Płytki sąwytwarzane z dojrzałych MK przez słabo określony proces, co do którego zasugerowano, że jest konsekwencją fizycznej fragmentacji MK lub innych mechanizmów. Obserwacje rozległych struktur błonowych w obrębie megakariocytów doprowadziły do modelu tworzenia płytek, w którym układ błony demarkacji zarysowuje powstające płytki w obrębie substancji komórki. Inny model tworzenia płytek powstał na podstawie obserwacji, wedle których megakariocyty będą tworzyć długie wyrostki cytoplazmowe ograniczone przedziałami zależnymi od wymiaru płytek, z których płytki, jak można przypuszczać, wydostają się wskutek ciśnień przepływu krwi w szpiku i/lub w płucach. Te wyrostki cytoplazmowe zostały przez Bec-kera i De

183 631

Bruyna nazwane propłytkami, by uwypuklić ich zakładaną rolę prekursora w tworzeniu płytek. Zob. Becker i De Bruyn, Amer. J. Anat. 145: 183 (1976).

Na załączonym rysunku Fig. 1 przedstawia widok z góry różnych komórek prekursora związanych z rozwojem megakariocytów i płytek. Komórka skrajnie z lewej strony figury przedstawia PPSC, a dodatkowe komórki na prawo od PPSC przedstawiają BFU-Mk, a po nim CFU-MK. Komórka podlegająca endoreduplikacji, umiejscowiona bezpośrednio na prawo od PPSC, jest dorosłąkomórkąmegakariocytu. W wyniku endomitozy, komórka ta została poliploidem. Następna struktura na prawo obejmuje długie wyrostki cytoplazmowe wynurzające się z jądra poliploidu dojrzałej komórki megakariocytu. Skrajnie z prawej strony figury pokazano pewną liczbę płytek wytworzonych przez fragmentację wyrostków cytoplazmowych.

Poniżej podsumowano pewne publikacje ze stanu techniki dotyczące powyższego opisu dojrzewania megakariocytów i wytwarzania płytek:

1. Williams, N., Levine, R.F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982).

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation ofMegakaryocytes, publ. Wile-y-Liss, Inc. 1-10(1990).

3. Gewirtz, A.M., The Biology ofHaematopoesis, publ. Wiley-Liss, Inę.. 123-132(1990).

4. Han, Z.C, et al., Int. J. Hematol. 54: 3-14 (1991).

5. Nieuwenhuis, H.K., Sixma, J., New Eng. J. of Med. 327: 1812-1813 (1992).

6. Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).

B. REGULACJA TWORZENIA PŁYTEK

Znaczna ilość danych uzyskanych w wielu laboratoriach wskazuje, że wytwarzanie płytek jest regulowane przez czynniki humoralne. Złożoności tego procesu biologicznego z początku nie doceniano i obecnie okazuje się, że czynniki wzrostu posiadają tę zdolność.

Regulacja megakariocytów odbywa się na wielu poziomach komórkowych. Pewna liczba cytokin poprawia wytwarzanie płytek przez rozszerzenie puli komórki progenitora. Druga grupa humoralnych czynników wzrostu służyjako czynniki dojrzewania działające na bardziej zróżnicowane komórki, by promować endoreduplikację. Ponadto, okazuje się, że istniejądwie niezależne pętle biosprzężenia zwrotnego regulujące te procesy.

Kilka niespecyficznych hemopoetycznych lineażowych czynników wzrostu wywiera ważny wpływ na dojrzewanie MK. Czynnik stymulowania kolonii granulocyt-makrofag (GMCSF), interleukina-3 (IL-3), IL-6, IL-11, czynnik inhibitujący leukemię (LIF) i erytropoetyna (EPO), każde indywidualnie sprzyjają dojrzewaniu ludzkiego MK, jak określono in vitro przez ich wpływ na wielkość, liczbę MK lub ploidy. Związany z dojrzewaniem MK wpływ LIF, IL-6 i IL-11 jest cząstkowo (LIF i IL-6) lub całkowicie (IL-11) addytywny do wpływu iL-3 . Dane z publikacji według stanu techniki sugerują, że kombinacja cytokin może być niezbędna, by sprzyjać dojrzewaniu MK in vivo.

Poniżej podano pewne publikacje ze stanu techniki odnoszące się do regulacji wytwarzania megakariocytów i płytek:

7. Hoffman, R. et al„ Blood Cells 13: 75-86 (1987)

8. Murphy, M. J., Hematology/Oncology Clinics ofNorth America 3 (3): 465-478 (1988).

9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989).

10. Mazur, E.M., Cohen, J.L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989).

11. Gewirtz, A.M., Calabretta, B., Int. J. Celi Cloning 8: 267-276 (1990).

12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990).

13. Gordon, M.S. i Hoffman, R„ Blood 80 (2): 302-307 (1992).

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993).

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993).

Podawano również (zob. odsyłacz 16), że aplastyczna surowica ludzka zawiera kolonię megakariocytów stymulującą aktywność różną od IL-3, czynnika stymulującego kolonię granulocytów, i czynników obecnych w ośrodku uwarunkowanym limfocytami. Jednak cząsteczki odpowiedzialnej za tę aktywność nigdy nie wyodrębniono ani nie scharakteryzowano.

16. Mazur, E.M., et al., Blood: 290-297 (1990) C. Receptor Mpl

183 631

Wirus mieloproliferacyjny leukemii (MPLV) jest mysim retrowirusem o niepełnej replikacji, powodującym ostrą leukemię u zakażonych ssaków. Odkryto, że gen ekspresjonowany przez MpLV składa się z części genu kodującej otoczkę retrowirusową(lub zewnętrzną otoczkę proteinową) wirusa złączonąz sekwencją pokrewną rodzinie receptora cytokinowego, włączając w to receptory dla gM-CsF, G-CSF i EpO.

Ekspresja genu MPLV opisanego powyżej ma interesującą właściwość biologicznąpowodowania, by mysie komórki progenitora różnych typów bezpośrednio zyskiwały niezależność czynnika wzrostu zarówno proliferacji, jak i końcowego dojrzewania. Ponadto, pewne hodowle komórek szpiku kostnego ostro transformowane przez MPLV zawierały megakariocyty, co sugerowałoby związek między genem MPLV a wzrostem i różnicowaniem megakariocytu.

Obecnie uznano, że gen wirusowy MPLV (nazywany v-Mpl) ma homolog w komórkach ssaków, nazywany genem komórkowego Mpl (lub też c-Mpl). cDNA odpowiadające ludzkiemu genowi c-Mpl sklonowano przy użyciu sond pochodzących z v-Mpl. Porównaj publikację zgłoszenia pCt nr WO 92/07074 (opublikowane 30 kwietnia 1992; omawiane poniżej). Analiza sekwencyjna pokazała, że proteina zakodowana przez produkt genu c-Mpl należy do superrodziny wysoce zachowanego receptora cytokinowego, podobnie do homologicznego produktu genu v-Mpl.

Uważa się, że ten gen komórkowy, c-Mpl, odgrywa rolę czynnościową w he-mopoezie, co jest oparte na obserwacji, że jego ekspresję stwierdzono w szpiku kostnym, śledzionie, i wątrobie płodu u normalnych myszy przez zabezpieczenie sondy RNAzy i doświadczenia RT-PCR, lecz nie stwierdzono jej w innych tkankach. W szczególności, c-Mpl jest ekspresjonowany na megakariocytach. Pokazano również, że gen komórki ludzkiej, ludzki c-Mpl, jest ekspresjonowany w komórkach pozytywnych CD34, w tym w oczyszczonych megakariocytach i płytkach. CD34 jest antygenem wskazującym na komórki progenitora wczesnej hemopoezy. Ponadto, wystawienie komórek pozytywnych CD34 na syntetyczne oligodeoksynukleotydy antysensowne względem c-Mpl mRNA lub informacji znacząco inhibituje zdolność tworzenia kolonii progenitorów megakariocytów CFU-MK, lecz nie ma wpływu na progenitory erytroidu lub granulomakrofagu.

Powyższe dane i obserwacje sugerują, że c-Mpl koduje cząsteczkę powierzchni komórki, nazywaną w niniejszym tekście receptorem Mpl, która wiąże się z ligandem, aktywującym receptor, potencjalnie prowadząc do wytwarzania i/lub rozwoju megakariocytów'.

Publikacja zgłoszenia PCT nr WO 92/07074 jest ukierunkowana na sekwencję proteiny wytwarzaną przez gen c-Mpl, zarówno z organizmu człowieka jak i myszy. Ten produkt genu, o którym uważa się, że jest receptorem, jak objaśniono powyżej, składa się z co najmniej trzech zasadniczych obszarów lub domen: domeny zewnątrzkomórkowej, domeny śródbłonowej oraz domeny wewnątrzkomórkowej (lub cytoplazmatycznej). Te domeny połączone razem tworzą cały receptor Mpl. Wspomniana publikacja PCT dotyczy również rozpuszczalnej formy receptora, która zasadniczo odpowiada zewnątrzkomórkowej domenie dojrzałej proteiny c-Mpl. Wewnątrzkomórkowa domena zawiera obszar hydrofobowy, który w przypadku dołączenia przez śródbłonowy obszar do zewnątrzkomórkowej domeny proteiny, powoduje, że cała proteina podlega agregacji i staje się nierozpuszczalna. Z drugiej strony, gdy zewnątrzkomórkowa domena produktu genu c-Mpl jest oddzielona od domeny śródbłonowej i domeny wewnątrzkomórkowej, staje się rozpuszczalna, zatem zewnątrzkomórkowa forma proteiny jest nazywana “rozpuszczalną” formą receptora.

Poniżej podano zestawienie niektórych publikacji ze stanu techniki odnoszących się do powyższego opisu genów i receptorów v-Mpl i c-Mpl:

17. Wendling, F., et al., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989).

18. Wendling, F., et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989).

19. Souyri, M„ et al., Celi 63: 1137-1147 (1990).

20. Vigon, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644(1992).

21. Skoda, R.C. , et al., The EMBO Journal 12 (7): 2645-2653 (1993).

22. Ogawa, M„ Blood 81 (11): 2844-2853 (1993).

23. Methia, N., et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993).

24. Wendling, F, et al., Blood 80: 246a (1993).

183 631

D. ZAPOTRZEBOWANIE NA CZYNNIK ZDOLNY DO STYMULOWANIA WYTWARZANIA PŁYTEK.

Ostatnio donoszono, że coraz częściej wykonuje się transfuzje płytek w ośrodkach medycznych Ameryki Płn., Europy Zach. i Japonii. Zob. Gordon, M.S. andHofcian, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992). Wydaje się, że ten wzrost wynika w znacznej mierze z postępów w technice medycznej i większego dostępu do takich technik, jak operacja na sercu oraz transplantacja szpiku kostnego, serca i wątroby. Intensyfikacja dawekjako sposób prowadzenia terapii chorych na raka i HIV-1 również przyczyniły się do wielkiego zapotrzebowania na dostarczanie płytek.

Użycie płytek niesie z sobąmożliwość przeniesienia wielu przenoszonych przez krew chorób zakaźnych, jak też aloimmunizacji, to znaczy immunizacji antygenami alogenicznymi, pochodzącymi od genetycznie odmiennego osobnika tego samego gatunku. Ponadto, wytwarzanie oczyszczonych płytek jest kosztownym przedsięwzięciem, a zatem zwiększone stosowanie takich płytek podwyższa całkowite koszty medyczne. Wskutek tego istnieje palące zapotrzebowanie na nowe i ulepszone metody wytwarzania płytek dla stosowania u ludzi.

Przykładowe dotychczasowe podejścia do ulepszania wytwarzania płytek opisano w następujących pozycjach:

W opisie patentowym USA 5,032,396 podaje się, że interleukina-7 (IL-7) jest zdolna do stymulowania wytwarzania płytek. Interleukina-7 jest również znana jako limfopoetyna-1 i jest limfopoetycznym czynnikiem wzrostu zdolnym do stymulowania wzrostu progenitorów komórek B i T w szpiku kostnym. Opublikowane zgłoszenie PCT o numerze seryjnym 88/03747, zgłoszone 19 października 1988 i europejskie zgłoszenie patentowe numer 88309977.2, zgłoszone 24 października 1988 ujawniają wektory DNA i związane z tym procesy wytwarzania protein IL-7 ssaków techniką rekombinacyjnego DNA Dane przedstawione w opisie patentowym USA pokazują że IL-7 może zwiększyć cyrkulowanie płytek u myszy normalnych i subletalnie napromieniowanych.

Opis patentowy USA 5,087,448 ujawnia, że megakariocyty i płytki można stymulować do proliferacji u ssaków przez działanie na nie interieukiną-6. Rekombinacyjna ludzka interleukina-6 jest glikoproteiną o ciężarze cząsteczkowym 26000 i licznych działaniach biologicznych. Dane przedstawione w tym opisie patentowym pokazują, że IL-6 wpływa na zwiększanie kolonii megakariocytów in vitro.

Żaden z cytowanych wyżej opisów patentowych nic nie wspomina o Ugandach Mpl, o których mowa w niniejszym wynalazku.

Pomimo powyższych ujawnień, pozostaje paląca potrzeba nowych stymulatorów megakariocytów i/lub płytek u ssaków.

E. STAN TECHNIKI W ODNIESIENIU DO CHEMICZNIE MODYFIKOWANEGO MGDF

Proteiny do stosowania w terapii są obecnie dostępne w odpowiednich formach i ilościach w znacznej mierze w wyniku postępów technik rekombinacyjnego DNA. Chemiczne pochodne takich protein mogą skutecznie blokować przed kontaktem fizycznym enzymu proteolitycznego z głównym łańcuchem samej proteiny i tym samym zapobiegać degradacji. Dodatkowe korzyści mogą obejmować, w pewnych okolicznościach, zwiększanie stabilności i czasu cyrkulacji terapeutycznej proteiny i zmniejszanie immunogenności. Jednak, należy zaznaczyć, że nie można przewidzieć wpływu modyfikacji konkretnej proteiny. Artykuł przeglądowy opisujący modyfikację proteiny i fuzję protein: Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (May 1992) (opublikowany: Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20 OlD, UK).

Glikol polietylenowy (“PEG” lub “peg” ) jest jednym z takich indywiduów chemicznych stosowanych w wytwarzaniu proteinowych produktów terapeutycznych.

Na przykład Adagen^R, preparat pegylowanej deaminazy adenozynowej jest zatwierdzony w leczeniu poważnej choroby złożonego niedoboru odpornościowego;

pegylowana dysmutaza nadtlenkowajest w fazie badań klinicznych odnośnie leczenia urazu głowy;

183 631 pegylowany alfa-interferon badano w fazie I badań klinicznych odnośnie leczenia wirusowego zapalenia wątroby; podano, że pegylowana glukoceramidaza i pegylowana hemoglobina są w badaniach przedklinicznych.

W przypadku pewnych protein, wykazano, że dołączenie glikolu polietylenowego chroni przed proteolizą, zob. Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991), i są dostępne metody dołączenia pewnych reszt glikolu polietylenowego. Zob. opis patentowy USA nr 4,179,337, Davis et al., “Non-Immunogenic Polypeptides” wydany 18 grudnia 1979; i opis patentowy USA nr 4,002,531, Royer, “Modifying Enzymes with Polyethylene Głykol and Product Produced Thereby,” wydany 11 stycznia i 911. Odnośnie przeglądu zob.: Abuchowski et al., w: Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg i J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)).

Stosowano inne rozpuszczalne w wodzie polimery do modyfikacji protein, takie jak kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, karboksymetyloceluloza, dekstran, alkohol poliwinylowy, pirolidon poliwinylowy, poli-1,3-dioksolan, poli-l,3,6-trioksan, kopolimer etylenu i bezwodnika maleinowego oraz poliaminokwasy (homopolimery lub kopolimery losowe).

W przypadku glikolu polietylenowego, stosowano szereg sposobów dla przyłączenia cząsteczek glikolu polietylenowego do proteiny. W ogólnym przypadku, cząsteczki glikolu polietylenowego są dołączane do proteiny przez reaktywną grupę w proteinie. Do takiego przyłączenia są odpowiednie grupy amino, takie jak w resztach lizynowych lub na końcu N. Np. Royer (Patent UsA nr 4,002,531, powyżej) podaje, że redukcyjne alkilowanie zastosowano do przyłączenia cząsteczki glikolu polietylenowego do enzymu. EP 0539167, opublikowany 28 kwietnia 1993, Wright, “Peg Imidates and Protein Derivates Thereof’ podaje, że peptydy i związki organiczne o wolnej grupie (wolnych grupach) amino są modyfikowane pochodną imidynowąPEG lub związanymi z tym rozpuszczalnymi w wodzie polimerami organicznymi. Opis patentowy USA nr 4,904,584, Shaw, wydany 27 lutego 1990 dotyczy modyfikacji liczby reszt lizynowych w proteinach dla dołączenia cząsteczki glikolu polietylenowego przez reaktywne grupy amino.

Jedną z konkretnych terapeutycznych protein, którąchemicznie zmodyfikowano jest czynnik stymulowania kolonii granulocytów, “G-CSF.”; zob. europejskie opisy patentowe EP 0401 384, EP 0473, 268, i EP 0335 423.

Innym przykładem jest pegylowana IL-6; zob. opis patentowy EP 0442 724, zatytułowany “Modified hIL-6,” (Zob. współbieżne zgłoszenie patentowe USA nr seryjny 07/632,070) który ujawnia cząsteczki glikolu polietylenowego dodane do IL-6. Opis patentowy EP 0154316, opublikowany 11 września 1985, opisuje reakcję limfokiny z aldehydem glikolu polietylenowego.

Zdolność modyfikowania MGDFjest nieznana w stanie techniki, ponieważ podatność każdej konkretnej proteiny na modyfikację jest określona przez specyficzne parametry strukturalne tej proteiny. Ponadto, wpływ takiej modyfikacji na właściwości biologiczne każdej proteiny jest nieprzewidywalny według stanu techniki. Ze względu na wiele klinicznych zastosowań MGDF, jak wyłożono w niniejszym tekście, jest pożądany produkt w postaci pochodnej MGDF o zmienionych właściwościach. Takie cząsteczki mogą mieć zwiększony okres półtrwania i/lub aktywność in vivo, jak również inne właściwości.

Pegylowanie cząsteczki proteiny daje w ogólnym przypadku mieszaninę chemicznie zmodyfikowanych cząsteczek proteiny. Np. cząsteczki proteiny o pięciu resztach lizynowych i wolnej grupie amino na końcu N poddane reakcji według powyższych metod mogą dać w wyniku heterogennąmieszaninę, o sześciu resztach glikolu polietylenowego, częściowo pięciu, częściowo czterech, częściowo trzech, częściowo dwóch, częściowo jednym i częściowo zeru. Spośród cząsteczek o kilku takich resztach, reszty glikolu polietylenowego mogą nie być dołączone w tym samym miejscu w różnych cząsteczkach. Często będzie pożądane otrzymanie produktu homogennego zawierającego zasadniczo w każdym przypadkujedno lub małąliczbę (np. 2-3) zmodyfikowanych cząsteczek proteiny, różniących się liczbą i/lub umiejscowieniem reszt chemicznych, takichjak PEG. Niemniej, mieszaniny np. mono-, di i/lub tri-pegylowanych indywiduów mogą być pożądane lub tolerowalne dla danego wskazania terapeutycznego.

183 631

Zmienność mieszaniny od partii do partii byłaby niekorzystna przy opracowywaniu produktu terapeutycznego w postaci pegylowanej proteiny. Przy takim opracowywaniu, ważną rzeczą jest przewidywalność aktywności biologicznej. Np. wykazano, że w przypadku nieselektywnego sprzęgania dysmutazy nadtlenkowej z glikolem polietylenowym, kilka części zmodyfikowanego enzymu było zupełnie nieaktywnych (P. Mc Goff et al. Chem. Pharm. Buli. 36:3079-3091 (1988)). Zob. też: Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), który opisuje selektywne dołączenie karbohydrazydu grupy linkera do C-końcowej grupy karboksylowej substratu proteiny (insulina). Takiej przewidywalności nie ma, gdy terapeutyczna proteina różni się składem od partii do partii. Pewne z indywiduów glikolu polietylenowego mogą nie być związane tak trwale w pewnych miejscach jak inne i to może spowodować, że takie reszty dysocjują od proteiny. Oczywiście, jeśli takie reszty są dołączone losowo i tym samym losowo dysocjują, farmakokinetyka terapeutycznej proteiny nie może być dokładnie przewidywalna.

Jest także wysoce pożądany produkt w postaci pochodnej MGDF, w której brak reszty łączącej resztę polimeru z cząsteczką MGDF. Problem związany z powyższymi metodami polega na tym, że wymagają one w typowym przypadku reszty łączącej między proteiną i cząsteczką glikolu polietylenowego. Te reszty łączące mogą być antygenowe, co jest także niekorzystne przy opracowywaniu terapeutycznej proteiny.

Metodę nie związaną z użyciem grupy wiążącej opisano w: Francis et al., In:

“Stability of protein pharmaceuticals in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization” (Eds. Ahem., T., Manning, M.C.) Plenum, New York, 1991). Także: Delgado et al. “Coupling ofPEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Celi Preparation” w: Fisher et al., ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Celi Biology and Biotechnology, Plenum Press, N.Y., N.Y. 1989, str. 211-213 dotyczy zastosowania chlorku tresylu, co daje w wyniku brak grupy łączącej między resztami glikolu polietylenowego i proteiny. Metoda ta może być trudna do zastosowania, by wytwarzać terapeutyczne produkty, ponieważ użycie chlorku tresylu może wytwarzać toksyczne produkty uboczne.

Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994) opisująmodyfikację immunoadhezyny CD4 aldehydem glikolu monometoksypolietylenowego (“glikol MePEG”) przez redukcyjne alkilowanie. Autorzy podają, że 50% CD4-Ig było zmodyfikowane mePEG przez selektywną reakcję przy grupie alfa-aminowej końca N. Id. na str. 137. Autorzy także podają, że zdolność wiązania in vitro zmodyfikowanego CD4-Ig (do proteiny gp 120) spadła w stopniu skorelowanym ze stopniem mepegylowania. Ibid.

Zatem, istnieje zapotrzebowanie na pochodne MGDF, a zwłaszcza, zapotrzebowanie na pegylowane MGDF. Istnieje także zapotrzebowanie na metody otrzymywania takich pochodnych.

Celem obecnego wynalazku jest opracowanie rozwiązania zaspokajającego to zapotrzebowanie.

Cel wynalazku zrealizowano dzięki opracowaniu rozwiązania według wynalazku.

Wynalazek obejmuje pochodne polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-1;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig. 12, określany jako mGDf-3;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-5;

183 631

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-7;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-8;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-11;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-12;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-13;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-14 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-15;

w których polipeptyd MGDF przyłączony jest do co najmniej jednego rozpuszczalnego w wodzie polimeru.

Korzystnie w pochodnej według wynalazku rozpuszczalny w wodzie polimerjest farmaceutycznie dopuszczalny, zwłaszcza wybrany z grupy obejmującej dekstran, poli(N-winylo-pirolidon), glikole polietylenowe, homopolimery glikolu polipropylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu-tlenek etylenu, poliole polioksyetylenowane, alkohole poliwinylowe i ich mieszaniny.

Szczególnie korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimeremjest glikol polietylenowy, a zwłaszcza monometoksylowany glikol polietylenowy.

Korzystnie w pochodnej według wynalazku wskazany glikol polietylenowyjest przyłączony do polipeptydu MGDF wiązaniem acylowym lub alkilowym, a zwłaszcza reszta polietylenoglikolowa jest przyłączona do N-końca polipeptydu MGDF.

Korzystnie grupa polietylenoglikolowa ma średni ciężar cząsteczkowy 10000 do 50000.

Alternatywnie w pochodnej według wynalazku polipeptyd MGDF jest kowalencyjnie połączony z dwoma cząsteczkami polimeru rozpuszczalnego w wodzie, a korzystnie obie wskazane cząsteczki polimeru rozpuszczalnego w wodzie sącząsteczkami glikolu polietylenowego.

Korzystną grupę pochodnych według wynalazku stanowią monopegylowane polipeptydy MGDF

Korzystną taką pochodną jest (polipeptyd MGDF monopegylowany przy grupie a aminowej na N-końcu tego polipeptydu i mający postać zasadniczo homogenicznego preparatu.

Korzystną taką pochodnąjest polipeptyd MGDF monopegylowany glikolem polietylenowym o średnim ciężarze cząsteczkowym 5000 do 50000.

Inną korzystną taką pochodną jest monopegylowany polipeptyd MGDF z grupą polietylenoglikolową przyłączoną do N-końca tego polipeptydu.

Sposób wytwarzania pochodnej polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

183 631

w której polipeptyd MGDF jest przyłączony do co najmniej jednego rozpuszczalnego w wodzie polimeru, obejmujący przyłączanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru do polipeptydu MGDF, według wynalazku polega na tym, że stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający reaktywną grupę aldehydową i prowadzi się reakcję końcowej grupy aldehydowej pochodnej aldehydowej glikolu polietylenowego ze wskazanym polipeptydem MGDf w obecności środka redukującego, albo stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający pojedynczą reaktywną grupę aldehydową. i prowadzi się kontaktowanie wskazanego polipeptydu MGDF z rozpuszczalnym w wodzie polimerem w warunkach redukcyjnego alkilowania, w pH dostatecznie kwasowym aby grupa α-aminowa na aminowym końcu wskazanego polipeptydu MGDF mogła być reaktywna, albo też stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający pojedynczą reaktywną grupę estrową i prowadzi się kontaktowanie polipeptydu MGDF z rozpuszczalnym w wodzie polimerem w warunkach umożliwiających przyłączenie wskazanego polipeptydu MGDF do rozpuszczalnego w wodzie polimeru przez wiązanie acylowe, a następnie wyodrębnia się wytworzoną pochodną polipeptyd MGDF połączony z co najmniej jednym rozpuszczalnym w wodzie polimerem.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się polimer farmaceutycznie dopuszczalny.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się polimer wybrany z grupy obejmującej dekstran, poli(N-winylo-pirolidon), glikole polietylenowe, homopolimery glikolu polipropylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu-tlenek etylenu, poliole polioksyetylenowane i alkohole poliwinylowe.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się glikol polietylenowy.

W sposobie według wynalazku, korzystnie jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się glikol polietylenowy mający pojedynczą reaktywną grupę aldehydową i prowadzi się kontaktowanie wskazanego polipeptydu MGDF z cząsteczką wskazanego glikolu polietylenowego w warunkach redukcyjnego alkilowania, w pH dostatecznie kwasowym aby grupa α-aminowa na aminowym końcu wskazanego polipeptydu MGDF mogła być reaktywna oraz wydodrębnia się wytworzony monopegylowany polipeptyd MGDF.

Korzystnie, w powyższej reakcji j ako polipeptyd MGDF stosuje się polipeptyd MGDF-11, o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11.

Korzystnie przy tym, stosuje się polipeptyd MGDF-11, wytworzony przez ekspresję w komórce E. coli DNA kodującego polipeptyd zawierający aminokwasy 22-184 przedstawione na rysunku Fig. 11 oraz sekwencję Met'-Lys' na jego N-końcu, wyodrębnienie ekspresjonowanego polipeptydu oraz oderwanie Met'²-Lys'1 od wyizolowanego polipeptydu.

Zgodnie z wynalazkiem korzystnie stosuje się glikol polietylenowy o średnim ciężarze cząsteczkowym 2000 do 100000.

183 631

Wynalazek obejmuje także kompozycję farmaceutyczną zawierającą substancję farmeceutycznie aktywnąoraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, środek wspomagający lub nośnik, która zgodnie z wynalazkiem jako substancję farmaceutycznie aktywną zawiera pochodną polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

-polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDF-14 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-184 przedstawionych na rysunku

Fig. 11, określany jako MGDF-15, stanowiącą połączenie polipeptydu MGDF z co najmniej jednym rozpuszczalnym w wodzie polimerem.

Kompozycja według wynalazku korzystnie jako pochodną MGDF zawiera monopegylowany polipeptyd MGDF.

Wyjściowe polipeptydy do wytwarzania pochodnych według wynalazku sązwiązkami nowymi i stanowią one przedmiot zgłoszenia nr P-312577 z dnia 30.03. 1995 r. Sprzyjająone specyficznie wzrostowi i/lub rozwojowi megakariocytów (“Ligandy Mpl” lub “MGDFs”). Związki te można otrzymać w ich formie rodzimej z organizmu ssaków. Dwa przykładowe ligandy Mpl wyodrębniono z aplastycznego osocza psa. Jednak okazało się, że blisko spokrewnione ligandy Mpl są obecne w osoczu aplastycznym zarówno z organizmu człowieka jak i świni. Zwłaszcza aktywność każdego z ligandów Mpl (z organizmu człowieka, świni i psa) jest specyficznie inhi-bitowalna przez rozpuszczalną formę receptora Mpl z organizmu myszy, pokazując, że wszystkie z tych ligandów Mpl (jak również te z innych organizmów ssaków, w tym myszy) są ściśle spokrewnione zarówno na poziomie strukturalnym, jak i aktywności.

Choć niniejszy wynalazek dotyczy generalnie pochodnych ligandów Mpl, ligandy te mogą pochodzić z organizmów ssaków, takich jak z psy, świnie, ludzie, myszy, konie, owce i króliki. Szczególnie korzystne sąligandy Mpl od psów, świń i człowieka. Ligandy Mpl mogąbyć wytwarzane także metodami syntezy chemicznej lub metodami biotechnologicznymi.

Dwa korzystne ligandy Mpl z organizmu psa mają pozorny ciężar cząsteczkowy około 25000 i 31000, jak określono przez elektroforezę żelową (SDS-PAGE) przy użyciu siarczanu dodecylowo-sodowego i poliakryloamidu w warunkach nieredukujących. Obydwie proteiny

183 631 oczyszczono podczas tego samego protokołu oczyszczania, który wyszczególniono w sekcji przykładów poniżej.

Dwa korzystne ludzkie ligandy, MGDF-1 i MGDF2, majądługość 332 i 174 aminokwasy, odpowiednio, nie włączając sygnałowego próbnego peptydu 21-aminokwasowego. Te sekwencje i trzecią spokrewnioną cząsteczkę, MGDF-3 przedstawiono na Fig. 11 i 12.

Wyjściowe proteiny ligandu Mpl do wytwarzania pochodnych według niniejszego wynalazku cechują się także występowaniem jednego lub więcej spośród fizycznych, biochemicznych, farmakologicznych działań opisanych w niniejszym tekście.

Niniejszy wynalazek dotyczy chemicznie zmodyfikowanego MGDF składającego się z cząsteczki proteiny MGDF połączonej z co najmniej jednym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, oraz metod wytwarzania i zastosowania takich kompozycji. W szczególności, niniejszy wynalazek obejmuje chemicznie zmodyfikowane MGDF, w którym MGDF jest poddane reakcji z cząsteczkami reaktywnego glikolu polietylenowego, tak by przyłączyć PEG do MGDF. Takie dołączenie można wykonać przez reakcję pegylowania omawianą w mniejszym tekście, takąjak acylowanie lub alkilowanie. Acylowanie lub alkilowanie PEG można przeprowadzić w warunkach, w których główny produktjest monopegylowany lub polipegylowany. Połypegulowanie w ogólnym przypadku wiąże się z dołączeniem PEG do grup ε-amino reszt lizyny i może dodatkowo wiązać się z pegylowaniem na końcu N polipeptydu. Monopegylowanie korzystnie wiąże się z dołączeniem PEG do grupy α-aminowej na końcu N proteiny. Wydajność i homogenicznosć takiej reakcji monopegylowania można poprawić przez rodzaj redukcyjnego alkilowania, które selektywnie modyfikuje grupę α-aminową N-końcowej reszty proteiny MGDF, tym samym zapewniając selektywne dołączenie reszty polimeru rozpuszczalnego w wodzie na końcu N proteiny. To zapewnia zasadniczo homogeniczne wytwarzanie cząsteczek koniugatu polimer/proteina MGDF jak również (gdy stosuje się glikol polietylenowy) wytwarzanie cząsteczki pegylowanej proteiny MGDF o reszcie glikolu polietylenowego bezpośrednio sprzężonej z cząsteczką proteiny.

Inny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza farmaceutyczne kompozycje zawierające terapeutycznie skuteczną ilość wyodrębnionego występującego naturalnie lub rekombinacyjnego ligandu Mpl, który można przeprowadzić w pochodną przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie polimeru, takiego jak glikol polietylenowy, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką. Te farmaceutyczne kompozycje można stosować w metodach leczenia stanów chorobowych lub zaburzeń cechujących się niedoborem megakariocytów i/lub płytekjak również niedoborem in vivo ligandu Mpl. Można je także stosować profilaktycznie do polepszenia spodziewanych niedoborów megakariocytów lub płytek (np. wskutek operacji).

Stwierdzono, że wyjściowe ligandy Mpl do wytwarzania pochodnych według niniejszego wynalazku są specyficznie aktywne przy lineażu, zwiększeniu dojrzewania i/lub proliferacji megakariocytów, jak pokazano w badaniach w przykładach II i IV zgłoszenia nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r. Przez “specyficznie” rozumie się, że polipeptydy wykazują aktywność biologiczną w stosunkowo większym stopniu wobec megakariocytów w porównaniu z innymi rodzajami komórek. Można się spodziewać, że te, które stymulują megakariocyty, wykazują w vivo aktywność stymulowania wytwarzania płytek, przez stymulowanie dojrzewania i różnicowania megakariocytów.

Zatem, ligandy Mpl można zastosować w leczeniu anemii aplastycznych, np. by zwiększyć wytwarzanie płytek u pacjentów o upośledzonym wytwarzaniu płytek (takich jak chorzy na AIDS lub przechodzący chemoterapię nowotworu). Ligand Mpl można stosować do leczenia zaburzeń krwi, takichjak trombocytopenia. Ligand Mpl można stosowaćjako leczenie wspomagające u chorych, którym transplantuje się szpik kostny. Tacy chorzy mogąbyć ludźmi lub innymi ssakami. Można się spodziewać, że ligand Mpl z jednego gatunku jest także przydatny u innego gatunku.

Kompozycj a farmaceutczna według wynalazku znajduje zastosowanie w leczeniu wskazanych wyżej i innych stanów patologicznych wynikających z niedoboru płytek. Metody terapii mogą obejmować podawanie, równocześnie lub następczo ligandu Mpl, skutecznej ilości co naj183 631 mniej jednego innego czynnika stymulującego kolonię megakariocytów, cytokinu (np. EPO), rozpuszczalnego receptora Mpl, hemopoetyny, interleukiny, czynnika wzrostu lub przeciwciała.

Inne aspekty i korzyści wynikające z niniejszego wynalazku będą widoczne po rozważeniu następującego szczegółowego opisu jego korzystnych wykonań.

Krótki opis rysunków

Liczne cechy i zalety obecnego wynalazku staną się zrozumiałe po zapoznaniu się z rysunkami, na których

Figura 1 przedstawia ogólny schemat tworzenia i dojrzewania megakaricytów oraz płytek

F igura 2 wykazuj e, że rozpuszczalny mysi receptor Mpl niemal całkowicie inhibituje zdolność plazmy napromieniowanego psa (“aplastyczna psia plazma” lub “APK9) do indukowania rozwoju megakariocytów. Próbę na tworzenie megakariocytów opisano w przykładzie II zgłoszenia nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r.

Figura 3 pokazuje, że zwiększona aktywność z APK9 w procedurach chromatograficznych (“Ligandy Mpl) przez pokrewieństwo lektyn i mysiego receptora Mpl stymuluje wzrost komórek 1A6.1 oraz że rozpuszczalny mysi receptor Mpl blokuje ten wzrost.

Figura 4 ukazuje ogólny schemat procesu oczyszczania dotyczący oczyszczania form o ciężarze cząsteczkowym 25000 i 31000 (25 kd i 31 kd) psiego receptora Mpl z aplastycznej psiej plazmy.

Figura 5 demonstruje oczyszczanie ligandu Mpl metodąHPLC z odwróconąfazą (RP-HPLC). Frakcja 21 zawiera w wysokim stopniu oczyszczony ligand Mpl o ciężarze cząsteczkowym 31000, frakcja 22 zawiera mieszaninę ligandów Mpl o ciężarze cząsteczkowym 31000 i 25000; a frakcja 23 zawiera wysoce oczyszczony ligand Mpl o ciężarze cząsteczkowym 25000.

Figura 6 porównuj e aktywność ligandu Mpl we frakcjach zawierających białka ligandów o ciężarze cząsteczkowym 25000 i/lub 31000 metodą HPLC z fazą odwróconą (kolumna C4).

Figura 7 przedstawia liczbę megakariocytów pochodzących z hodowli wyselekcjonowanych komórek CD34 z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 8 przedstawia całkowitą. liczbę leukocytów otrzymywanych z hodowli wyselekcjonowanych CD34 komórek z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 9 przedstawia procent megakariocytów otrzymywanych z hodowli wyselekcjonowanych CD34 komórek z krwi obwodowej stymulowanej APK9, ligandem Mpl i różnymi innymi czynnikami.

Figura 10 wykazuje, że ludzka IL-3 nie jest zaangażowana w tworzenie i rozwój megakariocytów indukowanych przez ligandy Mpl.

Figura 11 przedstawia cDNA i przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego MGDF-1 oraz MGDF-2.

Figura 12 przedstawia cDNA i przypuszczalną sekwencję aminokwasową ludzkiego MGDF-3.

Figura 13 przedstawia porównanie pomiędzy MGDF-1 a innymi MGDF (ligandy Mpl) pochodzącymi od psa (A) i od myszy (B).

Figura 14. przedstawia przykład acylowania MGDF przy użyciu aktywnych N-hydroksysukcynimidylowego (NHS) estru glikolu monometoksypolietylenowe'go, z wytworzeniem polipegylowanej pochodnej.

Figura 15 przedstawia przykład niespecyficznego redukcyjnego alkilowania MGDF przy użyciu aldehydów glikolu mono-metoksy-polietylenowego, z wytworzeniem polipegylowanej pochodnej.

Figura 16 przedstawia przykład miejscowo specyficznego redukcyjnego alkilowania MGDF przy grupie α-aminowej końca N łańcucha, przy użyciu aldehydów glikolu mono-metoksy-polietylenowego, z wytworzeniem rzeczywiście zasadniczo mono-pegylowanego.

183 631

Figura 17 przedstawia wyniki analizy HPLC z wykluczeniem wielkości (SEC) konjugatów MePEG-MGDF otrzymanych przy użyciu aktywowanych pochodnych MePEG o ciężarze cząsteczkowym 20000 (20 kDa):

A. konjugaty poli-MePEG-MGDF otrzymywane w wyniku acylowania MGDF estrem NHS glikolu MePEG (PEG 11);

B. konjugaty poli-MePEG-MGDF otrzymywane w wyniku alkilowania MGDF aldehydem MePEG (PEG 20);

C. konjugaty mono-MePEG-MGDF otrzymywane w wyniku alkilowania MGDF aldehydem MePEG (PEG 16).

Figura 18 obrazuje liczbę płytek mysich traktowanych rekombinantowym MGDF pochodzenia ludzkiego: kwadraty = pochodne CHO 22-353 MGDF; kółka - niepegylowane 22-184 MGDF wytworzone przez E. coli (tj. 1-163 MGDF); i kropki = pegylowane 22-184 MGDF wytworzone przez E. coli.

Figura 19 przedstawia schematycznie proces oczyszczania dla r-HuMGDF.

Figura 20 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E.coli 1-163) na liczbę płytek w przypadku mysiego modelu karboplatynowego. Balb/c mice były dootrzewnowo iniektowane pojedynczą dawką karboplatyny (1,25 mg/mysz) w dniu zero. Grupa, której podano sam nośnik nie otrzymała karboplatyny. Po upływie 24 godzin leczone karboplatyną zwierzęta otrzymywały podskórne injekcje albo z nośnikiem, albo z dawką 100 gg/kg r-HuMGDF na dzień, przez pozostałe dni prowadzenia badań. (n=10 dla każdej z grup; 5 zwierząt skrwawiano w każdym pomiarowym punkcie czasowym).

Figura 21 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E.coli 1-163) na liczbę płytek u myszy poddanej napromieniwaniu. Myszy Balb/c naświetlano pojedynczą dawką 500 radów promieniowaniem gamma (źródło cezowe) w dniu zero. Grupa, której podawano sam nośnik nie była naświetlana. Po upływie 24 godzin napromieniowanym zwierzętom wstrzykiwano albo nośnik, albo dawkę 100 gg/kg r-HuMGDF na dzień, do końca okresu badań, (n =8 dla każdej grupy); 4 zwierzęta skrwawiano w każdym pomiarowym punkcie czasowym).

Figura 22 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E.coli 1-163) na liczbę płytek u myszy poddawanych jednoczesnemu napromieniowaniu i podawaniu karboplatyny. Myszy Balb/c były naświetlane pojedynczą dawką 500 radów promieniowania gamma (źródło cezowe) i otrzymały dawkę karboplatyny (1,25 mg/mysz) w dniu zero. Po upływie 24 godzin zwierzętom tak potraktowanym podskórnie wstrzykiwano albo nośnik, albo dawkę 100 gg/kg r-HuMGDF na dzień, do końca prowadzenia badań (n=8 dla każdej grupy). Bez wsparcia HuMGDF większość zwierząt nie przeżyło tych badań. W kontrolnej grupie przeżyło 1 zwierzę na 8. W grupie poddanej testowej, której podawano badany środek przeżyło 8 na 8 zwierząt.

Figura 23 przedstawia wpływ r-HuMGDF (E.coli 1-163) na indukowaną naświetlaniem trombocytopenię u małp rezusów. Małpy te poddano naświetlaniu (700 cGy Co-80). Następnie podawano podskórnie r-HuMGDF (n =3) bądź albuminy ludzkiego osocza (n =9) w dawce 25 gg/kg/dzień przez kolejne 18 dni począwszy od 24 godziny po napromieniowaniu. Analizę komórek krwi przeprowadzono w elektronicznym urządzeniu do analizy krwi. Każdy z symboli reprezentuje wartość średnią (+/-sem).

Figura 24 przedstawia wpływ pegylowanego i glikozylowanego r-HuMGDF na liczbę płytek u myszy napromieniowanych i przyjmujących karboplatynę. Myszy potraktowano kombinacja napromieniowania i karboplatyny jak to opisano w odniesieniu do badań zobrazowanych na rysunku Fig. 22. Podskórne injekcje wymienionego preparatu r-HuMGDF (50 gg/kg/dzień) stosowano codziennie przez cały okres badań począwszy od 24. godziny od wystawienia na działanie czynników szkodliwych. Liczbę komórek krwi oznaczano we wskazane dni przy użyciu elektronicznego zliczacza komórek (Sysmex, Baxter).

Figura 25 przedstawia sekwencję syntetycznego genu dla rekombinantowego ludzkiego MGDF, aminokwasy 1-163, zawierającego optymizowane kodony E. coli.

Dodatkowe aspekty i korzystne cechy wynalazku będą widoczne dla specjalistów według stanu techniki po rozważeniu następującego opisu, wyszczególniającego praktykę wynalazku.

183 631

Jak wspomniano, nowe megakariocytowe czynniki z organizmu ssaków sprzyjające wzrostowi, i/lub wytwarzaniu płytek, nazywane Ugandami Mpl, opisano szczegółowo w zgłoszeniu nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r.

Ogólnie, termin “ligandy Mpl”jak to się stosuje w przypadku niniejszego wynalazku oznacza Ugandy Mpl ujawnione w niniejszym tekście jak również ich aktywne fragmenty i odmiany, które opisano bardziej szczegółowo poniżej.

W podsumowaniu, przykładowe Ugandy Mpl są scharakteryzowane przez jedną lub więcej następujących właściwości biochemicznych i biologicznych:

(a) takie Ugandy Mpl są wyodrębnione z aplastycznego osocza psa;

(b) takie Ugandy Mpl mająpozorne ciężary cząsteczkowe w przybliżeniu 25000 lub 31000 jak określono przez elektroforezę żelową z 12-14% siarczanem dodecylowo-sodowym i poliakrylamidem (SDS-PAGE) w warunkach nieredukujących;

(c) Ugandy Mpl obejmują następujące sekwencje aminokwasowe:

SEq ID NO: 1, w przypadku proteiny o ciężarze 25000 (25 kd); lub SEQ ID NO: 2, w przypadku proteiny o ciężarze 31000 (31 kd);

(d) ligandy Mpl dodatkowo obejmują sekwencję aminokwasową SEQ ID NO:

(zwłaszca korzystną w proteinie o ciężarze 25000 - 25 kd);

(e) Ugandy Mpl wiążą się do lektyny kiełków pszenicy;

(f) ligandy Mpl wiążą się do immobilizowanego rozpuszczalnego receptora Mpl z organizmu myszy;

(g) aktywność ligandu Mpl można inhibitować in vitro za pomocą rozpuszczalnego receptora Mpl; i (h) Ugandy Mpl wiążą się do kolumny anionowymiennej przy pH około 8-9.

Aktywność biologiczna korzystnych ligandów Mpl jest wykazana przez ich zdolność do specyficznego stymulowania wzrostu i rozwoju megakariocytów w próbie sprzyjania wzrostowi megakariocytów z przykładu II zgłoszenia nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r.

Niniejszy wynalazek obejmuje szeroko chemicznie zmodyfikowane kompozycje MGDF i metody ich wytwarzania i stosowania. Niniejsze zgłoszenie ujawnia, że jest możliwe zmodyfikowanie MGDF i poprawa jego właściwości.

Wjednym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy produktu MGDF obejmującego proteinę połączoną z co najmniej jedną rozpuszczalną w wodzie cząsteczką polimerową.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy pochodnej MGDF, w której wspomniana proteina MGDF jest połączona z co najmniej jedną cząsteczką glikolu polietylenowego.

W innym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy cząsteczki MGDF dołączonej do co najmniej jednej cząsteczki glikolu polietylenowego przez połączenie acylowe lub alkilowe.

Pegylowanie MGDF można przeprowadzić przez dowolnąreakcję pegylowania znaną według stanu techniki. Zob. np.: Focus on Growth Factors 3 (2): 4-10 (1992); EP O 154 316; EP O 401 384; i inne publikacje cytowane w niniejszym tekście pegylowania. Korzystnie, pegylowanie przeprowadza się przez reakcję acylowania lub alkilowania z cząsteczką reaktywnego glikolu polietylenowego (lub analogicznym reaktywnym polimerem rozpuszczalnym w wodzie). Te korzystne sposoby otrzymywania pochodnych z glikolem polietylenowym będą obecnie omówione bardziej szczegółowo.

I. Acylowanie

Pegylowanie przez acylowanie w ogólnym przypadku wiąże się z poddawaniem reakcji aktywnej pochodnej estrowej glikolu polietylenowego (PEG) z proteiną MGDF. Dowolna znana lub następnie odkryta reaktywna cząsteczka PEG może być użyta do wykonania pegylowania MGDF. Korzystnym aktywowanym estrem PEG jest PEG estryfikowany do N-hydroksysukcynimidu (“NHS”). Uważa się, że stosowane w niniejszym tekście pojęcie “acylowanie” obejmuje bez ograniczeń następujące typy połączeń między MGDF i rozpuszczalnym w wodzie polimerem takimjak PEG: amid, karbaminian, uretan itp. Zob. Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994). Warunki reakcji można wybrać z dowolnych znanych w stanie techniki odnośnie pegylowania lub tych następnie opracowanych, lecz należy unikać warunków, takich by temperatura, rozpusz18

183 631 czalnik i pH deaktywowały modyfikowane indywidua MGDF. Warunki reakcji, które będą się w ogólnym przypadku odnosić do pegylowania MGDF będą opisane poniżej. Przykiadowąreakcję z estrem NHS monometoksy-PEG przedstawiono na Fig. 14.

Pegylowanie przez acylowanie da w ogólnym przypadku polipegylowany produkt MGDF, w którym grupy ε-aminowychliznny sąpegylowaneprezz acylową gnjpęłącząąą. Kozzystnie, połączenie będzie amidem. Korzystnie także, gdy uzyskiwany produkt będzie zasadniczo jedynie (np.>95%) mono, di- lub tri-pe'gylowaay. Jednak pewne indywidua o wyższych stopniach pegylowania (do maksymalnej liczby grup e-aminowych liznay MGDF plus jedna grupa a-aminowa pozc końcu aminowym MGDF) będzie w normalnym przypadku tworzona w ilościach zależnych od ypecgficzagaC stosowanych warunków reakcji. Jeśli jest to pożądane, bardziej oczyszczone pegylowann indywidua można wydzielić z mieszaniny, szczególnie indywidua nieprzereagowane, za pomocą standardowych technik oazyszazaaia, włączając w to, m.in. dializę, wysalanie, ultrafiltrację, chromatografię jonowymienną, chromatografię z filtracją żelu i elektroforezę.

II Alkilowanie

Peeylowanie przez alkilowanie ogólnie wiąże się z poddawaniem reakcji pochodnych PEG końcowego aldehydu proteinątakąjak MGDF w obecności czynnika redukującego. Takjak w przypadku aaylowania, omawianego powyżej, warunki reakcji opisano poniżej.

Pegylowanie przez alkilowanie może także dać polipegylowany MGDF. Przykładową reakcję redukującego alkilowania z MGDF dającą polipegylowaay produkt przedstawiono na Fig. 15. Ponadto, można zmieniać warunki reakcji jak opisano w niniejszym tekście by sprzyjać pegylowaniu zasadniczo jedynie przy grupie α-amino końca N indywiduum MGDF (tzn. monopngylowanego indywiduum). Przykładową reakcję redukującego alkilowania z MGDF dającą monopegglowany produkt przedstawiono na Fig. 16. W każdym przypadku: moaopngylowanie lub polipegylowania, grupy PEG są korzystnie dołączone do proteiny przez grupę -CH2-NH-. Przy szczególnym odniesieniu do grupy -CH2-, ten typ połączenia jest aacgwann w niniejszym tekście jako połączenie typu “alkil”.

Otrzymywanie pochodnych przez redukcyjne alkilowanie by wytworzyć monopegylowang produkt wykorzystuje zróżnicowaną reaktywność różnych rodzajów pingwyzorcędowych grup aminowych (w lizynie i na końcu N) dostępnych dla otrzgIagwania pochodnych w MGDF. Reakcja jest wykonywana przy pH (zob. niżej), które umożliwia wykorzystanie różnic pKa między grupami ε-aminowymi reszt lizyny i grupami a-aminowymi reszty końca N proteiny. Przez takie selektywne otrzymywanie pochodnych, jest kontrolowane dołączenie rozpuszczalnego w wodzie polimeru, który zawiera reaktywną grupę, takąjak aldehyd, do proteiny. Sprzężenie z polimerem ma miejsce przeważnie na końcu N proteiny i nie występuje znacząca modyfikacja innych reaktywnych grup, takich jak grupy aminowe bocznego łańcucha lizyny. W jednym ważnym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza zasadniczo homogennego preparatu cząsteczek koniugatu monopolimer/proteina MGDF (mając na myśli proteinę MGDF, do której cząsteczkę polimeru dołączono zasadniczo jedynie (tzn. (95%) w jednej pozycji). Bardziej specyficznie, jeśli stosuje się glikol polietylenowy, niaieJscn wynalazek dostarcza także proteinę pegylowanego MGDF możliwie bez antygenowych grup łączących i o cząsteczce glikolu polietylenowego bezpośrednio podłączonej do proteiny MGDF.

Zatem, w korzystnym aspekcie, niniejszy wynalazek dotyczy pegylowanego MGDF, w którym grupa (grupy) PEG jest (są) dołączone przez grupy acylowe lub alkilowe. Jak omawiano powyżej, takie produkty można mono- pegylować lub poli- peklować (np. zawierające 2-6, korzystnie 2-5 grup PEG). Grupy PEG są w ogólnym przypadku dołączone do proteiny przy grupach a - lub ε-aminowycC aminokwasów, lecz jest także rozpatrywana możliwość, że grupy PEG można by dołączyć do dowolnej grupy aminowej dołączonej do proteiny, która jest wnstarccająao reaktywna, by ją dołączyć do grupy PEG w odpowiednich warunkach reakcji.

Cząsteczki polimeru stosowane zarówno w podejściach związaayaC z acylowaniem jak i alkilowaniem można wybrać spośród rozpuszczalnych w wodzie polimerów lub ich mieszanin.

183 631

Wybrany polimer powinien być rozpuszczalny w wodzie, tak by proteina, do której jest dołączony nie wytrącała się w środowisku wodnym, takim jak środowisko fizjologiczne. Wybrany polimer powinien być zmodyfikowany, by miał pojedynczą grupę reaktywną, takąjak aktywny ester do acylowania lub aldehyd do alkilowania, korzystnie, by stopień polimeryzacji można było kontrolować,jak tojest zapewnione w przypadku niniejszych metod. Korzystnym reaktywnym aldehydem PEG jest aldehyd propionowy glikolu polietylenowego, który jest trwały w wodzie lub jego monopochodne C1-C10 alkoksy lub aryloksy (zob. opis patentowy USA 5,252,714). Polimer może być rozgałęziony lub nierozgałęziony. Korzystnie, dla zastosowań preparatu produktu końcowego w terapii, polimer będzie farmaceutycznie dopuszczalny. Rozpuszczalny w wodzie polimer można wybrać z grupy obejmującej, np. glikol polietylenowy, glikol monometoksypolietylenowy, dekstran, glikol poli-(N-winylopirolidon)-etylenowy, homopolimery glikolu propylenowego, kopolimer tlenku polipropylenu/tlenku etylenu, polioksyetylowane poliole (np. gliceryna) i alkohol poliwinylowy. W przypadku reakcji acylowania, wybrany polimer (polimery) powinny mieć pojedyncząreaktywną grupę estrową. W przypadku niniejszego redukcyjnego alkilowania, wybrany polimer (polimery) powinny mieć pojedynczą reaktywną grupę aldehydową. W ogólnym przypadku, rozpuszczalny w wodzie polimer nie będzie wybrany z występujących naturalnie reszt glikozylowych ponieważ zwykle bardziej dogodne są uzyskiwane z układów ekspresji rekombinacyjnej z organizmu ssaków. Polimer może mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i może być rozgałęziony lub nierozgałęziony.

Szczególnie korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem do stosowania według niniejszego wynalazku jest glikol polietylenowy, w skrócie PEG.; Według niniejszego wynalazku, uważa się, że glikol polietylenowy obejmuje dowolną z form PEG, którą użyto do uzyskania pochodnych innych protein, takąjak mono-(C 1-C10) al koksy- lub ary loksy-gl i ko 1 j^oli etylenowy.

W znaczeniu stosowanym w niniejszym zgłoszeniu, MGDF jest określone jako obejmujące dowolną z różnych form MGDF opisanych w zgłoszniu nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r. Np. objęte są formy o pełnej długości lub obcięte, glikozylowane lub nieglikozylowane. Następujące cząsteczki MGDF korzystne do przeprowadzania w pochodne (w każdym przypadku numeracja odnosi się do aminokwasów numerowanych zgodnie z Fig. 11):

MGDF- 1 aminokwasy 22-353 Fig. 11

MGDF- 2 aminokwasy 22-195 Fig. 11

MGDF- 4 aminokwasy 22-172 Fig. 11

MGDF-11 aminokwasy 22-184 Fig. 11

MGDF-12 aminokwasy 27-353 Fig. 11

MGDF-13 aminokwasy 27-195 Fig. 11

MGDF-14 aminokwasy 27-172 Fig. 11

MGDF-15 aminokwasy 27-189 Fig. 11

Powyższe korzystne indywidua mogą być glikozylowane, nieglikozylowane lub deglikozylowane, korzystnie nieglikozylowane. Można je otrzymywać rekombinacyjnie w komórkach bakteryjnych (np. E. coli) lub ssaków (np. CHO).

Następujące podgrupy cząsteczek chemicznie przeprowadzanych w pochodne są szczególnie korzystne według niniejszego wynalazku (w każdym przypadku, są one resztami PEG mono- lub poli-, np. 2-9, dołączonymi przez grupę acylową lub alkilową):

pegylowany MGDF-11 pegylowany MGDF- 4 pegylowany MGDF- 2.

Ogólnie, chemiczne otrzymywanie pochodnych można wykonać w dowolnych odpowiednich warunkach stosowanych do przeprowadzania reakcji substancji aktywnej biologicznie z aktywowaną cząsteczką polimeru. Metody wytwarzania pegylowanych MGDF będą w ogólnym przypadku obejmować etapy: (a) poddawania reakcji polipeptydu MGDF z glikolem polietylenowym (takim jak reaktywna pochodna estrowa lub aldehydowa PEG) w warunkach, takich że MGDF jest dołączane do jednej lub więcej grup PEG, i (b) otrzymywania produktu (produktów). W ogólnym przypadku, optymalne warunki reakcji dla reakcji acylowania będą określone od

183 631 przypadku do przypadku w oparciu o znane parametry i żądany wynik. Np. im większa proporcja PEG:proteina, tym większa procentowość produktu polipegylowanego.

Redukcyjne alkilowanie dla wytworzenia zasadniczo homogennej populacji cząsteczek koniugatu monopolimer/proteina MGDF będzie w ogólnym przypadku obejmować etapy: (a) poddawania reakcji proteiny MGDF z reaktywnącząsteczkąPEG w warunkach redukcyjnego alkilowania, przy pH odpowiednim dla umożliwienia selektywnej modyfikacji grupy α-aminowej przy końcu amino wspomnianej proteiny MGDF; i (b) otrzymywania produktów reakcji.

Dla zasadniczo homogennej populacji cząsteczek koniugatu mono-polimer/ proteina MGDF, warunki reakcji redukcyjnego alkilowania są takie, że umożliwiają selektywne dołączenie indywiduum rozpuszczalnego w wodzie polimeru do końcaN MGDF. Takie warunki reakcji, generalnie zapewniają wystąpienie różnic wartości pKa między grupami aminowymi lizyny a grupą α-amino przy końcu N (pKajest to pH przy którym 50% grup aminowych grupyjest protonowane, zaś 50% nie jest). pH wpływa także na proporcję stosowanych polimeru do proteiny. W ogólnym przypadku, jeśli pH jest niższe, będzie pożądany większy nadmiar polimeru względem proteiny (tzn. im mniej reaktywna N-końcowa grupa α-aminowa, tym więcej polimeru jest potrzebne do uzyskania optymalnych warunków). Jeśli pHjest wyższe, proporcja polimer: proteina nie musi być tak wysoka (tzn. im bardziej reaktywne są grupy, tym mniej jest potrzebne cząsteczek polimeru). Dla celów niniejszego wynalazku, pH będzie w ogólnym przypadku w zakresie

3-9, korzystnie 3-6.

Inną ważną kwestiąjest ciężar cząsteczkowy polimeru. W ogólnym przypadku, im wyższy jest ciężar cząsteczkowy polimeru, tym mniejsza jest liczba cząsteczek polimeru, które można dołączyć do proteiny. Podobnie, przy optymalizowaniu tych parametrów należy wziąć pod uwagę rozgałęzienie polimeru. W ogólnym przypadku im ciężar cząsteczkowy jest wyższy lub więcej jest rozgałęzień), tym wyższa jest proporcja polimer:proteina. W ogólnym przypadku, przy reakcjach pegylowania rozpatrywanych w mniejszym zgłoszeniu, korzystny średni ciężar cząsteczkowy wynosi około 2000 do 100000 (około 2 do około 100 kDa) - określenie “około” wskazuje 1000 (1 kDa). Korzystny średni ciężar cząsteczkowy wynosi około 5000 do około 50000 (5 kDa do około 50 kDa), zwłaszcza około 12000 do około 25000. Proporcja rozpuszczalnego w wodzie polimeru do proteiny MGDF będzie w ogólnym przypadku wynosić od 1:1 do 100:1, korzystnie (dla polipegylowania) 1:1 do 20:1 i (dla monopegylowania) 1:1 to 5:1.

Przy zastosowaniu warunków wskazanych powyżej, redukcyjne alkilowanie da selektywne dołączenie polimeru do dowolnej proteiny MGDF o grupie α-aminowej na końcu amino, oraz da zasadniczo homogenny preparat koniugatu monopolimer/proteina MGDF. Określenie “koniugat monopolimer/protema MGDF”jest stosowany w niniejszym zgłoszeniu w znaczeniu kompozycji obejmującej pojedynczej cząsteczki polimeru dołączonej do cząsteczki proteiny MGDF. Koniugat monopolimer/proteina MGDF korzystnie będzie mieć cząsteczkę polimeru usytuowaną na końcu N, lecz nie na aminowych grupach bocznych lizyny. Preparat będzie korzystnie zawierał ponad 90% koniugatu monopolimer/ proteina MGDF, a bardziej korzystnie ponad 95% koniugatu monopolimer/proteina MGDF, przy pozostałości dających się zaobserwować nieprzeragowanych cząsteczek (tzn. indywiduum polimeru bez proteiny). Poniższe przykłady podają preparat, który zawiera co najmniej około 90% koniugatu monopolimer/proteina i około 10% nieprzereagowanej proteiny. Koniugat monopolimer/proteina wykazuje aktywność biologiczną.

W przypadku niniejszego redukcyjnego alkilowania, czynnik redukujący powinien być trwały w roztworze wodnym i korzystnie być zdolnym do redukowania jedynie zasady Schiffa utworzonej w początkowym procesie redukcyjnego alkilowania. Korzystne czynniki redukujące można wybrać z grupy obejmującej: borowodorek sodu, cyjanoborowodorek sodu, boran dwumetyloaminy, boran trójmetyloaminy i boran pirydyny. Szczególnie korzystnym czynnikiem redukującym jest cyjanoborowodorek sodu.

Inne parametry reakcji, takie jak rozpuszczalnik, czasy reakcji, temperatury, itp. i sposoby oczyszczania produktów, można określić od przypadku do przypadku w oparciu o opublikowaną informację odnoszącą się do otrzymywania pochodnych protein z rozpuszczalnymi w wodzie

183 631 polimerami (zob.publikacje cytowane w niniejszym zgłoszeniu). Przykładowe szczegóły przedstawiono w sekcji przykładów poniżej.

Można wybrać wytworzenie mieszaniny cząsteczek koniugat polimer/proteina metodami acylowania i/lub alkilowania i korzyścią dostarczoną w niniejszym zgłoszeniu jest to, że można wybrać ilość koniugatu polimer/proteina zawartą w mieszaninie. Zatem jeżeli jest to pożądane, można wytworzyć mieszaninę różnej proteiny z różną liczbą cząsteczek polimeru dołączonych (tzn. di-, tri-, tetra-, itd.) i połączyć z materiałem koniugatu monopolimer/proteina wytworzonym przy użyciu niniejszych metod i dysponować mieszaniną o wstępnie określonej proporcji koniugatu monopolimer/proteyina.

Niżej podane przykłady robocze przedstawiają wytwarzanie chemicznie zmodyfikowanego MGDF i wytwarzanie MGDF pegylowanego przez acylowanie i alkilowanie. Zatem, inne aspekty niniejszego wynalazku dotyczą tego wytwarzania.

W ogólnym przypadku, stany, które można złagodzić lub modulować przez podawanie pochodnych polimer/MGDF, obejmująte opisane powyżej dla cząsteczki MGDF. Jednak, cząsteczki polimer/MGDF ujawnione w niniejszym tekście mogą mieć dodatkowe działania, zwiększone lub zmniejszone działanie lub inne cechy charakterystyczne, w porównaniu do cząsteczek, których nie przeprowadzono w pochodną

W jeszcze innym aspekcie według niniejszego wynalazku, są dostarczone farmaceutyczne kompozycje powyższych chemicznie zmodyfikowanych cząsteczek MGDF. Takie farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać dowolny ze składników wyszczególnionych w niniejszym tekście dla cząsteczek, których nie przeprowadzono w pochodną

Ponieważ sąprowadzone dalsze badania, pojawi się informacja na temat odpowiednich poziomów dawkowania w leczeniu różnych stanów u różnych chorych, i typowy specjalista, rozważając kontekst terapeutyczny, wiek i ogólny stan zdrowia biorcy, będzie w stanie ustalić właściwe dawkowanie. W ogólnym przypadku, dawkabędzie wynosić między 0.01 gg/kg ciężaru ciała (obliczając masę samej proteiny, bez chemicznej modyfikacji) i 300 ug/kg (oparte na tym samym). Korzystna dawka wyniesie w ogólnym przypadku od 5 gg/kg ciężaru ciała do 100 gg/kg ciężaru ciała, zwłaszcza od 10 gg/kg ciężaru ciała do 75 gg/kg ciężaru ciała

Stany jakie mogą być leczone kompozycjami według niniejszego wynalazku sągeneralnie takie, z którymi wiąże się istniejący niedobór megakariocytów/płytek lub spodziewany w przyszłości niedobór megakariocytów/płytek (np. ze względu na planowaną operacj ę). Takie warunki będą zwykle wynikiem niedoboru (czasowego lub trwałego) aktywnego ligandu Mpl in vivo. Terminem ogólnym odnoszącym się do niedoboru płytekjest trombocytopenia, a zatem metody i kompozycje według niniejszego wynalazku są w ogólnym przypadku dostępne do leczenia trombocytopenii.

Trombocytopenie (niedobory płytek) mogą występować z różnych powodów, włączając chemoterapię i inną terapię szeregiem leków, terapię promieniowaniem, operacje, przypadkową utratę krwi, i inne szczególne stany chorobowe. Przykładowe specyficzne stany chorobowe, które wiążą się z trombocytopenią i mogą być leczone zgodnie z niniejszym wynalazkiem są: anemia aplastyczna, trombocytopenia idiopatyczna, guzy przerzutowe, które powodują trombocytopenię, ogólnoustrojowy liszaj rumieniowaty, splenomegalia, syndrom Fanconiego, niedobór witaminy B12, niedobór kwasu foliowego, anomalia May-Hegglina, syndrom Wiskott-Alldricha i napadowa hemoglobinuria nocna. Także pewne terapie na AIDS powoduje trombocytopenię (np. AZT). Zwiększenie liczby płytek może mieć korzystny wpływ na pewne zaburzenia związane z leczeniem ran.

Ze względu na spodziewane niedobory płytek, np. wskutek przyszłych operacji, ligand Mpl według niniejszego wynalazku mógłby być podawany na kilka dni do kilku godzin przed zapotrzebowaniem na płytki. Ze względu na ostre przypadki, np. utrata krwi w dużych ilościach i w wypadkach, ligand Mpl mógłby być podawany wraz ze krwią lub oczyszczonymi płytkami.

Ligandy Mpl i ich pochodne według niniejszego wynalazku mogą być także przydatne w stymulowaniu pewnych typów komórek innych niż megakariocyty, jeśli okazuje się, że takie komórki ekspresjonuuąreceptor Mpl. Warunki związane z takimi komórkami, które dokonują eks22

183 631 presji receptora Mpl, które odpowiadająna stymulację ze strony ligandu Mpl, również mieszczą się w ramach niniejszego wynalazku.

Cząsteczki MGDF i ich pochodne, które same nie są aktywne w próbach aktywności przedstawionych w niniejszym zgłoszeniu, mogą być przydatne, jako modulatory (np. inhibitory lub stymulanty) receptorów in vitro lub in vivo.

Pochodne polipeptydów według wynalazku mogą być także zastosowane same lub w połączeniu z innymi cytokinami, rozpuszczalnym receptorem Mpl, czynnikami hemopoetycznymi, interieukinami, czynnikami wzrostu lub przeciwciałami, w leczeniu wyżej zidentyfikowanych stanów.

Zatem, jeszcze innym aspektem wynalazku są terapeutyczne kompozycje do leczenia wyżej wymienionych stanów. Takie kompozycje obejmują terapeutycznie skuteczną ilość polipeptydu ligandu Mpl lub terapeutycznie skutecznego fragmentu tego polipeptydu z domieszaniem farmaceutycznie dopuszczalnego nośnika. Nośnikiem może być woda do iniekcji, korzystnie uzupełniona innymi materiałami występującymi zwykle w roztworach do podawania ssakom. W typowym przypadku, terapeutyczny ligand Mpl będzie podawany w formie kompozycji zawierającej oczyszczoną proteinę w połączeniu z jednym lub więcej fizjologicznie dopuszczalnymi nośnikami, zarobkami lub rozcieńczalnikami. Obojętny buforowany roztwór soli lub roztwór soli zmieszany z albuminą osocza są przykładowymi odpowiednimi nośnikami. Korzystnie, produkt jest formułowany jako liofilizat przy użyciu odpowiednich zarobek (np. sacharozy). O ile jest to pożądane, można włączyć inne standardowe nośniki, rozcieńczalniki i zarobki. Inne przykładowe kompozycje to bufor Tris, pH 8,0 i bufor octanowy, pH 5,0, które w każdym przypadku mogą ponadto zawierać sorbitol.

Niniejsze kompozycje można ogólnoustrojowo podawać pozajelitowe. Alternatywnie, kompozycje można podawać dożylnie lub podskórnie. W przypadku podawania ogólnoustrojowego, kompozycje terapeutyczne dla stosowania w niniejszym wynalazku mogą być w postaci apirogennego, dopuszczalnego pozajelitowo roztworu wodnego. Wytwarzanie takich farmaceutycznie dopuszczalnych roztworów protein ze względu na pH, izotoniczność, trwałość itp. mieści się w ramach możliwości specjalisty w stanie techniki.

Schemat dawkowania związany z metodą leczenia wyżej opisanych stanów zostanie określony przez lekarza prowadzącego leczenie, przy uwzględnieniu różnych czynników, które modyfikują działanie leków, np. wiek, stan, ciężar ciała, płeć i dieta pacjenta, ostrość infekcji, czas podawania i inne czynniki kliniczne. W ogólnym przypadku, dawkowanie dzienne powinno mieścić się w zakresie od 0.1 do 1000 mikrogramów proteiny lub jej fragmentu na kilogram wagi ciała.

Metody terapeutyczne, kompozycje i pochodne polipeptydów według niniejszego wynalazku mogąbyć także użyte, same lub w połączeniu z innymi cytokinami, rozpuszczalnym receptorem Mpl, czynnikami hemopoetycznymi, interieukinami, czynnikami wzrostu lub przeciwciałami w leczeniu stanów chorobowych cechujących się innymi symptomami jak również niedoborami płytek. Można się spodziewać, że cząsteczka ligandu Mpl okaże się przydatna w leczeniu pewnych form trombocytopenii w połączeniu z ogólnymi stymulatorami hemopoezy, takimi jak IL-3 lub GM-CSF. Inne megakariocytowe czynniki stymulacji, tzn. meg-CSF, czynnik komórki macierzystej (SCF), czynnik inhibitowania leukemii (LIF), onkostatyna M (OSM) lub inne cząsteczki wykazujące aktywność stymulowania megakariocytów można także zastosować do ligandu Mpl. Dodatkowe przykładowe cytokiny lub czynniki hemopoetyczne dla takiego współpodawania obejmująILr-1 alfa, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL,-11, czynnik-1 stymulowania kolonii (C5 F-1), GM-CSF, czynnik stymulowania kolonii granulocytów (G-CSF), EPO, interferon-alfa (IFN- alfa), IFN-beta lub IFN-gamma. Ponadto może być przydatne podawanie równocześnie lub kolejno, skutecznej ilości rozpuszczalnego receptora Mpl z organizmu ssaków, który wydaje się mieć wpływ na to, by megakariocyty ulegały fragmentacji na płytki, gdy megakariocyty osiągnęły postać dojrzałą. Zatem podawanie ligandu Mpl (by zwiększyć liczbę dojrzałych megakariocytów), następnie podawanie rozpuszczalnego receptora Mpl (by deaktywować ligand i umożliwić, by dojrzałe megakariocyty wytwarzały płytki) wydaje się być szczególnie

183 631 skutecznym sposobem stymulowania wytwarzania płytek. Wyżej podana dawka byłaby dopasowana, by skompensować takie dodatkowe składniki w kompozycji terapeutycznej. Postęp w leczeniu pacjenta można monitorować konwencjonalnymi metodami.

Następujące przykłady włączono, aby pełniej zilustrować niniejszy wynalazek. Ponadto, przykłady te dająkorzystne wykonania wynalazku, lecz nie należy ich rozumieć jako ograniczeniajego zakresu, o ile nie wskazano inaczej. Standardowe metody dla wielu spośród tych procedur opisane w następujących przykładach, lub odpowiednie procedury alternatywne, podano w powszechnie uznanych podręcznikach biologii molekularnej, takich jak np., Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) i w: Ausubel et al., (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Sposoby wyodrębniania i wytwarzania ligandów Mpl oraz badania ich właściwości zilustrowane na załączonych rysunkach szczegowo opisano w przykadach zgłoszenia wynalazku nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r.

Przykład I.

W niniejszym przykładzie opisano syntezy 12 różnych pegylowanych cząsteczek MGDF, PEG9 - PEG 12 oraz PEG 14 -PEG 21. W każdym przypadku pegylowaną cząsteczką MGDF była produkowana przez E. coli cząsteczka MGDF-11 (aminokwasy 22-184, numerowane od początku sygnalnego białka bądź aminokwasy 1-163 numerowane od początku dojrzałego białka). Szczegóły dotyczące tych wszystkich pegylowanych indywiduów zebrano w tabelach 1-5.

1.1 Przygotowanie koniugatów poli-MePEG-MGDF na drodze acylowania

MGDF aktywowanymi pochodnymi MePEG

Ochłodzony (4°C) roztwór MGDF (2,5 mg/ml) w 0, 1M buforze BICINE, pH 8, dodano do 10-krotnego molowego nadmiaru stałego MePEG propionianu imidylu kwasu bursztynowego (MW 20 kDa) (Shearwater Polymers, Inc.). Polimer rozpuszczono intensywnie mieszając i mieszaninę pozostawiono następnie w temperaturze pokojowej.

Postęp modyfikacji białka w czasie reakcji monitorowano metodąHPLC z wykluczaniem wielkości (SEC) stosując kolumnę Superdex 200 HR10/30 (Pharmacia Biotech) eluowanąO, 1 M roztworem buforu fosforanowego (Na) pH 6.9 w proporcji 0,7 ml/min.

Analiza mieszaniny reakcyjnej metoda SEC HPLC w 30 minucie wykazała, że w mieszaninie nie pozostała już żadna wolna proteina. W tym momencie stężenie białka w mieszaninie reakcyjnej zredukowano do 1 mg/ml przez dodanie sterylnej wody i odczyn mieszaniny doprowadzono do pH=4 kilkoma kroplami kwasu octowego.

Koniugat MePEG-MGDF oddzielono od nadmiaru MePEG i innych ubocznych produktów reakcji metodą chromatografii jonowymiennej stosując żywicę jonowymienna SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Mieszaninę reakcyjną umieszczono (2,5 mg/ml żywicy) na kolumnie i nieprzereagowany MePEG eluowano 3. objętościami kolumnowymi wyjściowego buforu A (20 mM fosforanu sodowego, pH=7,2,15% gliceryna). Następnie koniugat MePEG-MGDF eluowano przy użyciu 10 objętości kolumnowych buforu B (IM NaCI w buforze A) przy rosnącym liniowo gradiencie od 0% do 30%. Eluat monitorowano przy 280 nm długością fali. Frakcje zawierające koniugat poliMePEG-MGDF zatężono i sterylnie przesączono.

Oczyszczony koniugat poli-MePEG-MGDF poddano analizie chromatograficznej HPLC SEC przy zastosowaniu żelowych kolumn filtracyjnych TSK-GEL G4000SWXL oraz G2000SWXL zestawionych w baterie. Proteiny wykrywano na podstawie absorbancji światła UV przy 280 nm. Standarty filtracji żelowej BIO-RAD służyłyjako markery ciężaru cząsteczkowego globularnych białek.

Jak można zobaczyć na rysunku Fig. 17A analiza HPLC SEC ujawnia dwa podstawowe składniki w preparacie (w stosunku około 2:1 ), których położenia przy wymywaniu odpowiadająpozycjom protein globulamych o ciężarze 370900 i 155000 (370,9 kDa i 155,0 kDa) odpowiednio. Patrz również tabela 2.

183 631

Koniugatg PEG 9, PEG 10 i PEG 12 przygotowane na drodze acglacji MGDF estrami ^dylu kwasu bursztynowego, o ciężarze cząsteczkowym 6000-50000 (6-50 kDa) MePEG przygotowano w sposób analogiczny. Główne warunki reakcji wykorzystywane w tych przygotowaniach zebrano w tabeli 1.

Wyniki analiz HPLC SEC tych koniugatów przedstawiono w tabeli 2.

1.2 PrzygotpwanieOoningatówpoli-MePEG-iPGDF nadro nze ^u^yj^go aikiloeaania aldehydami MePEG.

Przygotowanie koniugatu poli-MePEG(20kDa)-MGDF (PEG 20). Do ochłodzonego (4°C) i mieszanego roztworu MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) w 100 mM roztworze fosforanu sodu, pH=5, zawierającego 20 mM NaCNBH3 dodano 10-krotny molamy nadmiar aldehydu glikolu moaometoksg-polietylenowego (MePEG) o średnim ciężarze cząsteczkowym 20000 (20 kDa) i kontynuowano mieszanie całości w tej samej temperaturze'.

Stopień zmodyfikowania białka podczas reakcji monitorowano metodą HPLC SEC stosując kolumnę Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) eluowanej 0,1 M buforem fosforanowym, pH=6,9, z szybkością 0,7 ml/min.

Po 16 godzinach analiza SEC HPLC wnkzzała, że więcej niż 90% początkowej ilości białka uległo modyfikacji. W tym czasie stężenie białka w mieszaninie reakcyjnej doprowadzono do 1 mg/ml przez rozcieńczenie całości sterylną wodą i doprowadzono pH do wartości 4 (0,5 M kwas octowy).

Koniugat MePEG-MGDF oddzielono od nadmiaru MePEG i innych produktów ubocznych reakcji metodą chromatografii jonowymiennej stosując żywicę jonowymienną SP Sepharose HP (PCarmαaia Biotech).

Mieszaninę reakcyjną wprowadzono (2,5 mg/ml żywicy) na kolumnę i nieprzereagowang MePEG eluowano wyjściowym buforem A (20 mM fosforan sodu, pH=7,2, 15% glicerolu) w ilości równej trzem objętościom kolumnę·. Następnie, ko-niugat MePEG-MGDF eluowano - zachowując liniowy gradient od 0% do 30%, w ilości równej dziesięciu objętościom kolumny - końcowym buforem B (IM NaCI w buforze A).Eluat monitorowano pozg 280 nm. Frakcje zawierające koniugat poli-MePEG-MGDF zebrano, zatężono i poddano sterylnemu przesączeniu.

Oczyszczony koniugat poli-MePEG-MGDF analizowano metodą HPLC SEC pozc użyciu kolumn do filtracji żelowej TsK-GEL G4000SWXL i G2000SWXL zestawionych w baterie. Białka wckogwano dokonując pomiaru absorbancji promieniowania UV przy 280 nm. Standardy filtracji żelowej BIO-RAD służyły jako globulaone markery ciężaru cząsteczkowego białek.

Jak można zobaczyć na rysunku Fig. 17B, analiza HPLC SEC ujawnia dwa główne składniki (stanowiące 52% i 47% całkowitej ilości) w preparacie, których położenia elucyjne odpowiadają położeniom białek globulamgaC odpowiednio 359400 i 159300 (359,4 kDa i 159,3 kDa). Patrz także tabela 2.

Koniugatg PEG 18, PEG 19 i PEG 21 otrzymywane przez redukcyjne alkilowanie MGDF za pomocą aldehydów MePEG o ciężarze cząsteczkowym 6000-25000 (6-25 kDa) przygotowano w sposób analogiczny. Główne parametry reakcji stosowane w tych procedurach zestawiono w tabeli 1.

Wyniki analiz HPLC SEC przeprowadzonych dla tgch koniugatów przedstawiono w tabeli 2.

1.3. Przygotowanie; komugotówztikolmonomotoksytp₀lictylenown -MGDFmiFro(^zc miejscowego przyłączenia przg końcu N reszty a-aminowej

Przygotowanie koniugatu mono-MePEG(20kDa)-MGDF (PEG 16) Do ochłodzonego (4°C) i mieszanego roztworu MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) w 100 mM roztworu fosforanu sodowego, pH=5, zawierającego 20 mM NaCNBH3, dodano 5-krotng molowy nadmiar aldehydu glikolu metoksgpolietylenowego (MePEG) o średnim ciężarze cząsteczkowym 20000 (20 kDa) i kontynuowano mieszanie mieszaniny reakcyjnej w tej samej temperaturze.

Stopień modyfikacji białka w czasie rezkaji monitorowano metodą SEC HPLC pozc użyciu kolumny Superdnx 200 HR 10,/30 (PCaomαciα Biotech) eluowanej 0,1 M buforem fosforanu sodu, pH=6,9, z szybkością 0,7 ml/min.

183 631

Po upływie 16 godzin analiza SEC HPLC wykazała, że około 90% początkowej ilości białka uległo modyfikacji. W tym czasie stężenie białka w mieszaninie reakcyjnej zmniejszono do 1 mg/ml przez rozcieńczenie sterylną wodą, a pH mieszaniny reakcyjnej doprowadzono do wartości 4 (0,5 M kwas octowy).

Koniugat mono-MePEG(20kDa)-MGDF oddzielono od nadmiaru MePEG oraz innych ubocznych produktów reakcji na drodze chromatografii jonowymiennej stosując żywicę jonowymienną Sp Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Mieszaninę reakcyjną wprowadzono (2,5 mg/ml żywicy) na kolumnę i nipprzerpagowang MePEG eluowano wyjściowym buforem A (20 mM fosforan sodu, pH=7,2, 15%o glicerolu) w ilości równej trzem objętościom kolumny. Następnie, koniugat MePEG-MGDF eluowano - zachowując liniowy gradient od 0% do 25%, w ilości równej dziesięciu objętościom kolumny - końcowym buforem B (1M NaCI w buforze A). Eluat monitorowano przy 280 nm. Frakcje zawierające koniugat poli-MePEG-MGDF zebrano, zatężono i poddano sterylnemu przesączeniu.

Homogeniczność koniugatów mono-MePEG-MGDF potwierdzono metodą elektroforezy na żelu siarczan sodowo dodecylowy - amid kwasu poliakrylowego, stosując gotowe żele o gradiencie 4-20% (NOVEX). Stwierdzono występowanie jednego wyraźnego pasma odpowiadającego położeniem proteinie o ciężarze cząsteczkowym 46900 (46,9 kDa).

Oczyszczony koniugat poli-MePEG-MGDF analizowano metodą HPLC SEC przy użyciu kolumn do filtracji żelowej TSK-GEL G4000SWXL i G2000SWXL zestawionych w baterie. Białka wykrywano dokonując pomiaru absorbancji promieniowania UV przy 280 nm. Standardy filtracji żelowej BIO-RAD służyły jako globulame markery ciężaru cząsteczkowego białek.

Jak można zobaczyć na rysunku Fig. 17C analiza SEC HPLC ujawniajeden główny składnik preparatu, którego położenie elucyjne odpowiada położeniu proteiny globularnej o ciężarze cząsteczkowym 181100 (181,1 kDa). Patrz również tablica 3.

Koniugaty PEG 14, PEG 15 i pEg 17 mono-MePEG-MGDF, otrzymane na drodze redukcyjnego alkilowania aldehydami MePEG o ciężarze cząsteczkowym 6-25 kDa przygotowano w sposób analogiczny. Główne parametry reakcji zastosowane w tych procedurach zebrano w tabeli 1.

Wyniki analizy HPLC SEC tych koniugatów przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 1

Parametry reakcji modyfikowania MGDF

Kod	Reaktywny MePEG	MGDF stężenie mg/ml	Warunki reakcji	Stężenie molowe [MpPEG/MGDF
Rodzaj	Ciężar cząsteczkowy	pH	Temperatura, °c	Czas godz.
1	2	3	4	5	6	7	8
PEG 9	NHS ester	6000	2,5	8	pokojowa	0,5	15
PEG 10	NHS ester	6000	2,5	8	pokojowa	0,5	1
PEG 11	NHS ester	20000	2,5	8	pokojowa	0,5	10
PEG 12	NHS ester	50000	2,5	8	pokojowa	0,5	5
PEG 14	aldehyd	6000	2,5	5	4°C	16	5
PEG 15	aldehyd	12000	2,5	5	4°C	16	5
PEG 16	aldehyd	20000	2,5	5	4°C	16	5
PEG 17	aldehyd	25000	2,5	5	4°C	16	10

183 631 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5	6	7	8
PEG 18	aldehyd	6000	5	5	4°C	16	10
PEG 19	aldehyd	12000	5	5	4°C	16	10
PEG 20	aldehyd	20000	5	5	4°C	16	10
PEG 21	aldehyd	25000	5	5	4°C	16	10

T a b e 1a 2

Charakterystyki poli-MePEG-MGDF według HPLC SEC

Kod	Reaktywny MoPEG	Pozorny ciężar cząsteczkowy SEC	Ilość komponentu %
PEG 9	NHS ester	6000	87900 52700	75 25 (pik boczny)
PEG 10	NHS ester	6000	69200	14 (pik boczny)
PEG 11	NHS ester	20000	370900 155000	68 32
PEG 12	NHS ester	50000	865600 368000	53 47
PEG 18	aldehyd	6000	84600 41500	60 40
PEG 19	aldehyd	12000	218400 106700	59 41
PEG 20	aldehyd	20000	359400 159300	52 47
PEG 21	aldehyd	25000	450500 218400	54 46

Tablica 3

Pozorny ciężar cząsteczkowy koniugatów mono-MePEG-MGDF

Kod	Reaktywny MoPEG	Pozorny ciężar cząsteczkowy SEC	Pozorny ciężar cząsteczkowy SDS PAGE
Rodzaj	Ciężar cząst.
PEG 14	aldehyd	6000	44500	27700
PEG 15	aldehyd	12000	104700	38300
PEG 16	aldehyd	20000	181100	46900
PEG 17	aldehyd	25000	226400	55500

1.4. PrzygotowantekoniugatówDtMe PEG(12 ld)a)-MGDF przez redukcyjnealkilowanle MGDF za pomocą aldehydu glikolu metoksypolietylenowego (PEG 22)

Następująca procedura prowadzi do otrzymani oczyszczonej cząsteczki określanej w niniejszym opisie jako PEG 22:

183 631

Pięciokrotny nadmiar aldehydu glikolu metoksypolietylenowego (MePEG; tzn. OHC-(CH₂)₂O-(CH2-CH₂O)n-CH3; gdzie n jest wielokrotnością zapewniającą osiągnięcie ciężaru cząsteczkowego około 12000) (Shearwater Polymers) dodano do 2,5 mg/ml roztworu MGDF (produkowanego przez E. coli, 1-163) w 100 mM roztworze octanu sodu, pH=-5,0, temperatura 5°C. Po 10. minutach mieszania dodano cyjano-borowodorku sodu w ilości wystarczającej do osiągnięcia stężenia 20 mM w mieszaninie reakcyjnej.

Mieszaninę tę mieszano przez 16 godzin w temperaturze około 5°C. Na koniec tego okresu dodano dostateczną ilość oczyszczonej (USP) wody, aby doprowadzić stężenie MGDF do 1 mg/ml. Roztwór ten przesączono przez filtr próżniowy 0,2 mikrona. W ten sposób otrzymano 90 mg produktu reakcji. Dodano niewielkie ilości 1,0 M roztworu jednozasadowego fosforanu i 1 N roztworu wodorotlenku sodu do mieszaniny reakcyjnej do osiągnięcia stężenia 10 mM fosforanu i pH=6,8.

Koniugat oczyszczono na kolumnie kationowymiennej. Przygotowano wysoko wydajną 40 ml kolumnę wypełnioną żywicą SP-Sepharose, ze złożem o wysokości 7,5 cm. Kolumnę zrównoważono stosując bufor równoważący (10 mM bufor fosforanowy, pH=6,8 z dodatkiem 15% glicerolu). Na kolumnę wprowadzano oczyszczany preparat w ilości 2,2 mg/ml żywicy, z szybkością 0,15 objętości kolumny (CV) na minutę. Następnie przez kolumnę przepuszczano bufor równoważący aż do osiągnięcia linii zasadowej. Kolumnę eluowano dziesięcioma objętościami kolumny z liniowym gradientem od buforu A (20 mM bufor fosforanowy, pH=7,2, 15% gliceryny) do buforu B (bufor A plus 0,3 M NaCl). Szybkość przepływu przez cały czas utrzymywano na poziomie 0,15 CV na minutę. Eluat monitorowano przy 280 nm.

Frakcje analizowano metodą SDS-PAGE zbierając frakcje zawierające koniugat DiPEG. Połączone frakcje zatężono i przesączono przez filtr 0,2 mikrona.

Przykładu. Aktywność biologiczna cząsteczek pegylowanego MGDF

A. PEG-9 - PEG-12 oraz PEG-14 - PEG-21.

Dokonywano zliczania płytek u myszy, którym podawano rekombinantowy ludzki MGDF i uzyskane wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 18. CHO MGDF 212-353 (l^>wa<^iraty), niepegylowany produkt E. coli MGDF 22-184 (kółka) i pegylowany produkt E. coli MGDf 22-184 (kropki), w stężeniach wskazanych powyższej, w opisie rysunków, wstrzykiwano podskórnie zdrowym myszom Balb/c raz dziennie przez 5 dni. W 24 godziny po ostatniej injekcji pobrano krew do badań z małych bocznych nacięć żyły ogonowej. Analizę komórek krwi przeprowadzono posługując się elektronicznym analizatorem komórek krwi Sysmex (Baxter Diagnostic, Inc. Irvine, CA). Wyniki przedstawionojako średniąz pomiarów odczytanych dla czterech zwierząt ± odchylenie standardowe od średniej. Na inne parametry komórek krwi, takie jak całkowita ilość białych ciałek krwi bądź czerwonych ciałek krwi, obecny test nie wywarł wpływu.

Dodatkowe formy rekombinantowego ludzkiego MGDF badano jak wyżej. Liczbę płytek u myszy, którym podawano 50 gg/kg/dzień lub 10/gg/kg/dzień wskazanej postaci r-HuMGDF pokazano w następnej tabeli 4. Podane liczby są średnią odczytów dla 4 zwierząt z odchyleniem standardowym zaznaczonym kursywą.

Tabela 4

Postać	50(tg/kg/dzień	10 pg/kg/dzień
Średnia n = 4	Odchylenie	Średnia n = 4	Odchylenie
1	2	3	4	5
CHO 22-353	4343	309	2571	80
E. Coli 22-184	2021	29	1439	18
PEG 9	2728	56	2369	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG11	3778	59	1861	73

183 631 cd. tabeli 4

1	2	3	4	5
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG 14	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2834	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91
linia podstawowa	939	25

Wyjaśnienia do tabeli 4:

W każdym przypadku cząsteczka MGDF była pegylowanym produktem E. coli oznaczonym jako MGDF-11 (aminokwasy 22-184, licząc od początku sygnalnego peptydu lub aminokwasy 1-163, licząc od początku dojrzałego białka) jak to opisano w powyższym przykładzie I

Nazwa	Pegylacja	Średni ciężar cząsteczkowy PEG	Reaktywna cząsteczka PEG do syntezy
PEG 9	polipegylowany	6000	ester NHS z MePEG
PEG 10	polipegylowany	6000	ester NHS z MePEG
PEG11	polipegylowany	20000	ester NHS z MePEG
PEG 12	polipegylowany	50000	ester NHS z MePEG
PEG 14	monopegylowany	6000	aldehyd z MePEG
PEG 15	monopegylowany	12000	aldehyd z MePEG
PEG 16	monopegylowany	20000	aldehyd z MePEG
PEG 17	monopegylowany	25000	aldehyd z MePEG
PEG 18	polipegylowany	6000	aldehyd z MePEG
PEG 19	polipegylowany	12000	aldehyd z MePEG
PEG 20	polipegylowany	20000	aldehyd z MePEG
PEG 21	polipegylowany	25000	aldehyd z MePEG

Liczba płytek odpowiadająca linii podstawowej to pomiar u zwierząt zdrowych, którym nie podawano żadnych środków.

Jak widać, pegylowanie rekombinantowego ludzkiego MGDF nie wpływa niekorzystnie na zdolność cząsteczki do podwyższania liczby komórek u zwierząt, którymjest podawany, a faktycznie może zwiększać aktywność produktu 22-184 wytwarzanego przez E. coli do poziomu równego lub wyższego niż aktywność obserwowana w cząsteczce 22-353 w postaci pochodnej CHO.

B. PEG-22

Wyniki uzyskane dla PEG-22 zaprezentowano na rysunku Fig. 24. Zauważalnie, normalizacja liczby płytek przy PEG-22 następowała kilka dni wcześniej niż to ma miejsce w przypadku aldehydowych pochodnych MGDF o pełnej długości -PEG-16 lub PEG-17.

Badania dotyczące zarwno wytwarzania jak i aktywności in vivo r-HuMGDF ujawniono w zgłoszeniu nr P-312577 z dnia 30. 03. 1995 r.

183 631

Zestawienie sekwencji (1) INFORMACJA OGÓLNA.:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

Bartley, Timothy D.

Bogenberger, Jakob M.

Bosselman, Robert A Hunt, Pamela Kinstler, Olaf B.

Samal, Babru B.

(ii) TYTUŁ ZGŁOSZENIA: Kompozycje i metody stymulowania wzrostu i różnicowania megakariocytów (iii) LICZBA SEKWENCJI: 34 (iv) ADRES DLA KORESPONDENCJI:

(A) ADRES: Amgen Inc.

(B) ULICA: 1840 Dehavilland Drive (C) MIASTO: Thousand Oaks (D) STAN: Kalifornia (E) PAŃSTWO: Stany Zj^^^oc^one Ameryki Północnej (F) KOD: 91320-1789 (v) POSTAĆ CZYTANA PRZEZ KOMPUTER:

(A) NOŚNIK: Floppy disk (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) OBECNA DATA ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) INFOORM^C^^A. O RZE^ZZ^KKPATENNC^OWY^:

183 631 (A) NAZWISKO: Cook, Robert R.

(C) NUMER: A-290-C (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwas (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI SEQ ID Nr: 1:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp He Tyr 20 25 30 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwas (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 2:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His 20

183 631 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwas (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 3:

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala Leu 15 10 15 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGOA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 5:

183 631

GCARTGYAAC ACRTGNGART C (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA.: Liniowa (u) RODZAJ CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 6:

Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 7:

GTACGCGTTC TAGANNNNNN T (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad

183 631 (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 8:

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 9:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ΤΊΤΙΤΤΤΤΤΤ (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ΊΤΠΤΠΤΊ

183 631 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 11:

TGCGACCTCC GAGTCCTCAG (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA

183 631 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 13:

GGAGTCAACGA AGCAGTTTAC (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 14:

CCTTTACTTC TAGGCCTG (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (d) TOPO1OGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 15:

GAGGTCACAA GCAGGAGGA (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza

183 631 (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 16:

GGZCECGEZZ GGGACGTCG (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 17:

(i) CHC.ZCKENZYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 17:

TCZTCCTGZT TGTGACZEC (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 18:

ZCAGGCAGGA TTZCGGGGA (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 19:

183 631 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 19:

CAACAAGTCA ACCGCCAGCC AGACACCCCG (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 20:

GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 21:

183 631

GCARTGYAAN ACRTGNGART C (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 22:

TTGGTGTGCA CTTGTG (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyńcza (D) TOPOLOGIA· Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 23:

CACAAGTGCA CACCAACCCC (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ!: 1342 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa

183 631 (n) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 99......1094 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 24:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT 113 Ser Pro Ala Pro Pro 1 5

GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 161 Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp ser His Val

15 20

CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

30 35

CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 257 Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr

45 50

CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu

60 65

CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85

CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu

100

183 631

GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg

105 110 115

ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His

120 125 130

CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

135 140 144

CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 110 115

TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu

170 175 180

TTG GAG ACA AAC TCC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu

185 190 195

CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys Iie Pro Gly Leu Leu Asn

200 205 210

CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile

215 220 225

CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CTT GGA CCC TCA CGC His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg 230 235 2·4 245

449

497

545

593

641

669

737

788

833

AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC 881

183 631

Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp He Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly 250 255 260

TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT 929

Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His

265 270 275

CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC 977

Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro

280 285 290

ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA 1(025

Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro

295 300 305

ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC 1073 Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser 310 315 320 325

CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1124 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

330

TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT1184 TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA1244 ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA1304 CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA 1342 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 332 aminokwasy (B) TYP: Aminokwasowy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 25:

183 631

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45

Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp De Leu 50 55 60

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95

Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110

Pro Pro Gin Gly ?Ag ITr TTp Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe 115 120 122

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 135 140

Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn 165 170 175

Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu TPr Asn Pee Płir AL Ser Ala Arg Thr 180 185 190

Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly PPe Arg Ala Lys De

183 631

195 200 205

Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln He Pro Gly 210 215 222

Tyr Leu Asn Arg De His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe 225 230 235 220

Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp lie Ser Ser Gly 245 250 225

Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser 260 265 270

Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285

Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro 290 295 300

Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 332

Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 325 330 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1342 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS

183 631 (B) POŁOŻENIE: 9E: .921 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 26:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

15 20

CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA 209 Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr

30 35

45 50

CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp He Leu Gly Ala Val Thr Leu

60 65

CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC 353 Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 70 75 80 85

CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401 Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu

95 100

GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449 Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg

105

110

115

183 631

ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala He Phe Leu Ser Phe Gin His

120 125 130

TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

135 140 145

CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT CTG CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 150 155 160 165

TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu

170

TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG701

CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA761

ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT821

GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATG AGACACAGGC881

TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA941

CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC1001

CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC1061

TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTCCGGTT CTCAGACACT GCCG ACATCA1121

GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG1181

ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG1241

GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA1301

183 631

ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 174 aminokwasy (B) TYP: Aminokwasowy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Proteina (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 27:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val 20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45

Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu 50 55 60

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln 85 90 95

Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu 100 105 110

Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 115 120 125

1342

Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu

183 631

130 135 140

Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala

145 150 155 160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 170 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1164 pary zasad (B) TYP: Kwas nukleinowy (C) POSTAĆ NICI: Pojedyncza (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHY:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: 27...824 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 28:

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAACC GCTCCTCGTG60

GTCATGCTTG TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT114 Ser Pro Ala Pro Pro Ala

5

TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT 166

Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu

15 20

CAC AGC AGA CTG AGC CAG TTGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT 210 His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro

30 35

183 631

GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG 258 Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln

45 50

ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG 306 Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu 55 60 65 70

CTG GAG GGA GTG ATTG GCA GCA CGG GGA CAA CITG GGA CCC ACT TGC CTC354 Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu

80 85

TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG 4(0ł

Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg leu Leu Leu Gly

95 100

GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC 450 Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr

105 110 115

ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG 498 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu

120 125 130

CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TGC CTC 554 Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly Asp Lys Leu His Cys Leu 135 140 145 150

AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA GTG GCA GCA GGG ATT CAG 559 Ser Gln Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Gly Ile Gln

155 160 165

AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA AAC CTC CAG GTC CCA GGA CCA 642 Ser Gln Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn Leu Gln Val Pro Gly Pro

170 175 180

AAT CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TCG 690 Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thr Arg Thr Leu Glu Trp Asn Ser

183 631

185 190 195

TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA CAT 738 Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gin Asp Pro Arg Ser Pro Gly His

200 205 210

TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC CCT GCC ACC CAA CCT CCA GCC 786 Phe Leu Arg Asn Ile Arg His Arg Leu Pro Ala Thr Gin Pro Pro Ala 215 220 225 230

TGG ATA TTC TCC TTC CCC AAC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT 834

Trp De Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr Ala

235 240 245

CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TGT GGT CCA GCT CCA CCC 882 Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro

250 255 260

CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT 931

Pro Ala Ser

265

CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA991

CTGCCCACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCAC CCCTGGGACA1051

CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC1111

AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA 1164 (2) INFORMACJA O SEQ ID Nr: 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 265 aminokwasów (B) TYP: Aminokwasowy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: Proteina

183 631 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID Nr: 29:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 10 15

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40 45

Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp De Leu 50 55 60

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin 85 90 95

Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 110

Pro Pro Ghi Gly Arg TTr Thr rMa His Lys Asp Pro Asn Ala Ile PPe 115 120 125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Asp Phe Trp Ile Val Gly 130 135 110

Asp Lys leu His Cys Leu Ser Gin Asn Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu 145 150 155 160

Val Ala Ala Gly Ile Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn 165 170 177

Leu Gin Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gln Asp Thir Arg 180 185 190

183 631

Thr Leu Glu Trp Asn ser Trp Thr Leu Ser Trp Thr Leu Thr Gln Asp 195 200 205

Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn De Arg His Arg Leu Pro 210 215 220

Ala Thr Gln Pro Pro Ala Trp De Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser 225 230 235 240

Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr His Leu Ala His Pro 245 250 255

Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ser 260 265

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Pochodna polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MgDf-1;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig. 12, określany jako mGDf-3;

- polipeptyd o sekwencj i aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-7;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-8;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-11;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-12;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-13;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-14 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-1 5 w której polipeptyd MGDF przyłączony jest do co najmniej jednego rozpuszczalnego w wodzie polimeru.
2. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że rozpuszczalny w wodzie polimer jest farmaceutycznie dopuszczalny.
3. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że rozpuszczalny w wodzie polimer wybrany jest z grupy obejmującej dekstran, poli(N-winylo-pirolidon), glikole polietylenowe, homopolimery glikolu polipropylenowego, kopolimery tlenek poli-propylenu-tlenek etylenu, poliole polioksyetylenowane, alkohole poliwinylowe i ich mieszaniny.
4. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy.
5. Pochodna według zastrz. 4, znamienna tym, że wskazany glikol polietylenowy jest monometoksylowanym glikolem polietylenowym.
6. Pochodna według zastrz. 4, znamienna tym, że wskazany glikol polietylenowy jest przyłączony do polipeptydu MGDF wiązaniem acylowym lub alkilowym.

183 631
7. Pochodna według zastrz. 6, znamienna tym, że grupa polietylenoglikolowa jest przyłączona do N-końca polipeptydu MGDF.
8. Pochodna według zastrz. 6, znamienna tym, że grupa polietylenoglikolowa ma średni ciężar cząsteczkowy 10000 do 50000.
9. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że polipeptyd MGDF jest kowalencyjnie połączony z dwoma cząsteczkami polimeru rozpuszczalnego w wodzie.
10. Pochodna według zastrz. 9, znamienna tym,że obie wskazane cząsteczki polimeru rozpuszczalnego w wodzie są cząsteczkami glikolu polietylenowego.
11. Pochodna według zastrz. 1, znamienna tym, że jest monopegylowanym polipeptydem MGDF.
12. Pochodna według zastrz. 11, znamienna tym, żejest polipeptydem MGDF monopegylowanym przy grupie α -aminowej na N-końcu tego polipeptydu i jest zasadniczo homogeniczny.
13. Pochodna według zasbz. 12, znamienna tym, żejest polipeptydem MGDF monopegylowanym glikolem polietylenowym o średnim ciężarze cząsteczkowym 5000 do 50000.
14. Pochodna według zastrz. 11, znamienna tym, że jest monopegylowanym polipeptydem MGDF z grupą polietylenoglikolową przyłączoną do N-końca tego polipeptydu.
15. Sposób wytwarzania pochodnej polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-1;

- polipeptyd o sekwencj i aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig. 12, określany jako MGDF-3;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-6;

- polipeptyd o sekwenci i aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-7;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-8;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako M.G.DF-11;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-12;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-1.3;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-14 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-15;

w której polipeptyd MGDF jest przyłączony do co najmniej jednego rozpuszczalnego w wodzie polimeru, obejmujący przyłączanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru do polipeptydu MGDF, znamienny tym, że stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający reaktywną grupę aldehydową i prowadzi się reakcję końcowej grupy aldehydowej pochodnej aldehydowej glikolu polietylenowego ze wskazanym polipeptydem MGDF w obecności środka redukującego, albo stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający pojedynczą reaktywną grupę aldehydową i prowadzi się kontaktowanie wskazanego polipeptydu MGDF z rozpuszczalnym w wodzie polimerem w warunkach redukcyjnego alkilowania, w pH dostatecznie kwasowym aby grupa α-a4

183 631 minowa na aminowym końcu wskazanego polipeptydu MGDF mogła być reaktywna, albo też stosuje się rozpuszczalny w wodzie polimer mający pojedynczą reaktywną grupę estrową i prowadzi się kontaktowanie polipeptydu MGDF z rozpuszczalnym w wodzie polimerem w warunkach umożliwiających przyłączenie wskazanego polipeptydu MGDF do rozpuszczalnego w wodzie polimeru przez wiązanie acylowe, a następnie wyodrębnia się wytworzoną pochodną polipeptyd MGDF połączony z co najmniej jednym rozpuszczalnym w wodzie polimerem.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się polimer farmaceutycznie dopuszczalny.
17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się polimer wybrany z grupy obejmującej dekstran, poli(N-winylo-pirolidon), glikole polietylenowe, homopolimery glikolu polipropylenowego, kopolimery tlenek polipropylenu-tlenek etylenu, poliole polioksyetylenowane i alkohole poliwinylowe.
18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się glikol polietylenowy.
19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalny w wodzie polimer stosuje się glikol polietylenowy mający pojedynczą reaktywną grupę aldehydową i prowadzi się kontaktowanie wskazanego polipeptydu MGDF z cząsteczką wskazanego glikolu polietylenowego w warunkach redukcyjnego alkilowania, w pH dostatecznie kwasowym aby grupa α-aminowa na aminowym końcu wskazanego polipeptydu MGDF mogła być reaktywna oraz wydodrębnia się wytworzony monopegylowany polipeptyd MGDF.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że jako polipeptyd MGDF stosuje się polipeptyd MGDF-11, o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że polipeptyd MGDF-11, wytwarza się przez ekspresję w komórce E. coli DNA kodującego polipeptyd zawierający aminokwasy 22-184 przedstawione na rysunku Fig. 11 oraz sekwencję Met-Lys na jego N-końcu, wyodrębnienie ekspresjonowanego polipeptydu oraz oderwanie Met² -Lys¹ od wyizolowanego polipeptydu.
22. Sposób według zastrz. 18 albo 19, znamienny tym, że stosuje się glikol polietylenowy o średnim ciężarze cząsteczkowym 2000 do 100000.
23. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję farmaceutycznie aktywną oraz farmaceutycznie dopuszczalny rozcieńczalnik, środek wspomagający lub nośnik, znamienna tym, że jako substancję farmaceutycznie aktywną zawiera pochodną polipeptydu stanowiącego czynnik wzrostu i rozwoju megakariocytów - MGDF, wybranego z grupy polipeptydów obejmującej:

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-353 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf- 1;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-2;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-286 przedstawionych na rysunku Fig. 12, określany jako mGdF-3;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-4;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-177 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-5;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-191 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-6;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-198 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGDf-7;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-265 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-8;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 22-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako mGdF-1 1;

183 631

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-353 przedstawionych na’ rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-12;

- polipeptyd o sekwencj i aminokwasów 27-195 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-13;

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-172 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określany jako MGDF-14 oraz

- polipeptyd o sekwencji aminokwasów 27-184 przedstawionych na rysunku Fig. 11, określanyjako MGDf-15, stanowiącąpołączenie polipeptydu MGDF z co najmniej jednym rozpuszczalnym w wodzie polimerem.
24. Kompozycja według zastrz. 23, znamienna tym, że jako pochodną MGDF zawiera monopegylowany polipeptyd MGDF.