BE1008235A5 - Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen. - Google Patents

Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen. Download PDF

Info

Publication number
BE1008235A5
BE1008235A5 BE9400323A BE9400323A BE1008235A5 BE 1008235 A5 BE1008235 A5 BE 1008235A5 BE 9400323 A BE9400323 A BE 9400323A BE 9400323 A BE9400323 A BE 9400323A BE 1008235 A5 BE1008235 A5 BE 1008235A5
Authority
BE
Belgium
Prior art keywords
amino
acid derivative
dichlorobenzoylglycine
hippuric acid
agonists
Prior art date
Application number
BE9400323A
Other languages
English (en)
Inventor
Block Geert De
Original Assignee
Univ Gent
Dienst Landbouwkundig Onderzoe
Block Geert De
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Gent, Dienst Landbouwkundig Onderzoe, Block Geert De filed Critical Univ Gent
Priority to BE9400323A priority Critical patent/BE1008235A5/nl
Priority to EP95912979A priority patent/EP0751929A1/en
Priority to PCT/BE1995/000027 priority patent/WO1995026330A1/en
Priority to CN 95192269 priority patent/CN1144521A/zh
Priority to JP7524879A priority patent/JPH10500668A/ja
Application granted granted Critical
Publication of BE1008235A5 publication Critical patent/BE1008235A5/nl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/82—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/83—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/82—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/87—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C235/52—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/36—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having the nitrogen atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having carbon atoms of carboxamide groups, amino groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; fish

Abstract

De huidge uitvinding heeft betrekking op een hippuurzuurderivaat en een analysemethode bestemd om de eventuële aanwezigheid van groeistimulatoren in het bijzonder van het type beta-agonisten, alsook beta-antagonisten in een (gespikt) urine-, vlees- of bloedmonster van een dier of mens op te sporen. Het betreft ook een vulmateriaal om de analysemethode toe te passen bij vleeskontroles en anti-dopping-testen. Het vulmateriaal is een hippuurzuurderivaat dat de volgende formule bezit : (zie de fig) waarin R6 = NH2, OH, CONH2,SO2NH2;R7 en/of R8 = C1, Br, OH, CH2OH, CF3, NO2, F;R9 = alkyl in C2-C6 or alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2)nSMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH, (CH)nNH2, (CH2)nNHC(NH)NH2, CH2-O-OH en (CH2)nNH2, Y = CO of SO2.

Description

Analysemethode geschikt om bêta-aoonisten en bêta-antaaonisten on te sporen
De huidge uitvinding heeft betrekking op een verbinding en een analysemethode bestemd om de eventuële aanwezigheid van /?-agonisten, alsook /3-antagonisten in een (gespikt) urine-, vlees- of bloedmonster van een dier of mens op te sporen.
Het betreft ook een vulmateriaal om de analysemethode toe te passen bij vleeskontroles en anti-doping-testen.
Bij de vetmesting van rundvee wordt al jaren gebruik gemaakt van groeistimulatoren. De meest bekende zijn anabole steroïden waarvan het gebruik sinds 01.01.1988 in alle E.E.G. lidstaten verboden is.
Ook worden andere groeibevorderaars aangetroffen in de vetmesting, in het bijzonder jS-agonisten en /3-mimetica met Clenbuterol als best gekende vertegenwoordiger.
Deze stoffen en soortelijke verbindingen werden oorspronkelijk toegediend bij de behandeling van astmatische aandoeningen, als bronchospasmolyticum voor het verwijderen van de bronchitis bij varkens en vee en als uterusrelaxans bij dreigende abortus.
Maar omdat deze stoffen ook de eigenschap bezitten het vet en spiermetabolisme te beïnvloeden en een betere karkaskwaliteit mee te brengen, hebben zij onmiddellijk de interesse en de winstzucht van de veehouders gewekt.
Omdat de biochemische werking schijnbaar via hetzelfde mechanisme verloopt als voor twee welgekende hormonen adrenaline en noradrenaline het geval is, kunnen jS-agonisten beschouwd worden als stoffen met hormonale werking.
Het gebruik van (3-agonisten ter verbetering van de vleeskwaliteit is nu illegaal binnen de E.E.G.
Aangezien de variëteit binnen de groep van de ß-agonisten relatief groot is (functionele groepen, zuur-base eigenschappen), is men er tot nu toe nog niet in geslaagd een snelle monsteropzuiveringsmethode te ontwikkelen die in staat is stoffen van de ß-agonisten groep die allen aanverwante eigenschappen bezitten voldoende snel te concentreren en te identificeren. Een stap in de goede richting zijn de recent beschreven immuno-affiniteitskolommen, maar deze zijn enkel specifiek voor de N-tertiair-butyl, isopropyl en 2-pentyl groep. (The Journal of AOAC international, Vol. 75; p. 554-560, VAN GINKEL et als Development and validation of a multiresidue method for ß-agonists in biological samples and animal feed.)
Toch schijnt een gemeenschappelijke basisstructuur te bestaan in alle ß-agonisten, namelijk de fenylethanol amine structuur die de volgende formule bezit :
Figure BE1008235A5D00031
waarin Rj = H
R2 = CH2OH, Cl, OH, H
R3 = OH, NH2, H
R4 = H, Cl, OH, CF3, CN
R5 * alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH,)„SMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH,
Figure BE1008235A5D00032
Figure BE1008235A5D00033
De gemeenschappelijke fenylethanolamine-groep, die steeds aanwezig is, is tevens het farmacologisch actief fragment van de ß-agonisten.
Naarmate steeds meer ß-agonisten (tabel 1) gesynthetiseerd werden is de gelijkenis met de oorspronkelijke cathecholamines steeds geringer.
Tabel 1.1. Structuren van enkele j3-agonisten
Figure BE1008235A5D00051
Tabel 1.1. Structuren van enkele jS-agonisten
Figure BE1008235A5D00061
Het technisch probleem bestaat erin een methode te ontwikkelen die geschikt is om selectief fenylethanol-amines, die de basis vormen van elke /3-agonist, op een snelle manier op te sporen en op te zuiveren.
/3-agonisten zijn potentieel aanwezig in urine van slachtdieren.
De huidige uitvinding stelt een affiniteits-methode voor, welke in staat is fenylethanoamines op een snelle manier te scheiden en te detecteren.
Volgens een bijzonderheid van de uitvinding wordt in de affiniteitschromatografische methode gebruik gemaakt van een chemisch ligand dat in staat is ß-agonisten te binden.
Als mogelijk ligand wordt 4-amino-3,5-dichloor-benzoylglycine (A.D.B.G.) vooropgesteld voor de opzui-vering van /3-agonisten.
In een voorkeursvorm, wordt A.D.B.G. door middel van resorcinol als spacer aan een klassiek Epoxy-activated Sepharose kolommateriaal gekoppeld. Het materiaal bezit een zeer goede affiniteit voor de geteste ß-agonisten, met uitzondering van salbutamol.
De uitvinding betreft ook een werkwijze om 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine te synthetiseren en te koppelen met spacermoleculen om een efficiënte koppeling aan een affiniteitsmatrix tot stand te brengen.
Als mogelijke liganden voor affiniteitschromatograf ie van /3-agonisten, worden volgende verbindingen vooropgesteld :
Figure BE1008235A5D00071
met :
Ro = NH2, OH, CONH2, S02NH2 R7 en/of Rs = Cl, Br, OH, CH2OH, CF3, N02, F R, = alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2)„SMe, (CH2)nCONH2, (CH^COOH, (CH2)nNH2, (CH2)„NHC(NH)NH2,
Figure BE1008235A5D00081
en (CH2) nNH2.
Controles van gespikte urine en urinemonsters met behulp van affiniteitschromatografie geven uitstekende resultaten voor de verdere toepassing van dit ligand bij de toepassing van de methode voor de residu analyse van zowel bekende als onbekende j8-agonisten.
Uit initiële testen van affiniteitschromatograf ie is gebleken dat CNBr-Activated Sepharose 4B, Epoxygeactiveerde silica of Sepharose en Glutaraldehyde-P-Silica kolommaterialen wanneer zij rechtstreeks met A.D.B.G. gekoppeld zijn geen affiniteit voor de geteste /3-agonisten vertonen. Mogelijke oorzaken kunnen de afscherming van de ligand door de drager zijn.
De affiniteit wordt verbeterd door een extra spacermolecule in te voeren met een functionele groep (NH2 of OH) welke makkelijk te koppelen is aan de kolom-matrix.
Goede resultaten worden bekomen met een aromatische spacer. Fenol, resorcinol of aniline wordt vooraf aan een geschikte kolommatrix gekoppeld. Daarna worden de gediazoteerde A.D.B.G. moleculen op deze gekoppelde aromaten gebonden. Bijkomend voordeel van deze methode is dat er bij de vorming van de azobenzeenverbinding een rode kleur ontstaat, zodat men ogenblikkelijk kan zien of er ligand gekoppeld is.
Gemiddeld werd met het kolommateriaal volgens de uitvinding met fenol- of resorcinol spacers en het 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine een bezettingsgraad van 10 à 15 μιηοΐ/ml gel behaald.
A. SYNTHESE LIGAND : 1. Synthese 4-amino-3.5-dichloorbenzoëzuur en het overeenkomstig ethvlester 1.1. Bereiding van ethyl-4-amino-benzöaat
In een kolf van 1,5 1 voorzien van een magnetische roerstaaf wordt (0,73 mol) 100 g para amino-benzoëzuur (1) opgelost in 500 ml ethanol.
Bij het toedruppelen van (0,73 mol) 87 g thionylchloride wordt de oplossing gekoeld met een waterbad, waarna we het mengsel 10 uur refluxen op een oliebad.
Figure BE1008235A5D00091
Bij het afkoelen ontstaat een neerslag welke na toevoegen van 500 ml water terug oplost. Daarna wordt in kleine hoeveelheden 81 g natriumcarbonaat toegevoegd. Na uitkristallisatie wordt de neerslag afgefiltreerd en uit het filtraat na indampen een tweede worp gehaald.
MW * 165 g rendement = 118,0 g = 98% 1.2. Bereiding van ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat
In een 3 1 kolf met 900 ml tetrachloormethaan wordt (0.7 mol) 115.5 g ethyl-4-amino-benzöaat (2.) opgelost.
Na toevoegen van (1,4 mol) 198 g sulfuryl-chloride wordt gedurende 15 uur gerefluxt op een oliebad.
Figure BE1008235A5D00092
Na de reactie wordt in een scheitrechter 500 ml water toegevoegd. Na afscheiden van de tetralaag wordt deze gedroogd met magnesiumsulfaat en ingedampt tot ongeveer 150 ml. Hieraan wordt 100 ml hexaan toegevoegd en gekoeld bij -10°C zodat het ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat (2) uitkristalliseert.
MW = 233,9 g rendement = 95,0 g = 58% 1.3. Verzepen van ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat
Van het bekomen ethylester (2) wordt (0.36 mol) 85 g opgelost in een 1 1 kolf met een mengsel van 480 ml ethanol en 120 ml water met 34 g natriumhydroxide.
Het mengsel wordt gedurende drie dagen gere-fluxt op een oliebad.
Figure BE1008235A5D00101
Na de reactie wordt een mengsel van 110 ml water met 90 ml geconcentreerd zoutzuur (11M) toegevoegd. Hierbij ontstaat een witte neerslag. Dit wordt een weinig opgewarmd tot bijna alles opnieuw oplost, daarna laten we het mengsel overnacht bij kamertemperatuur uitkristalliseren.
Na affiltreren wordt zuiver ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat gedroogd in de droogstoof.
MW = 205,9 g rendement = 75,1 g = 96% 2 . Synthese van 4-amino-3.5-dichloorbenzovlalvcine en het overeenkomstige methvlester 2.1. Bereiding van 4-amino-dichloorbenzoylchloride
In een 1 liter kolf, voorzien van een bolkoeler met Cad,- buis, wordt (0,1 mol) 2 0,6 g 4-amino-3,5-dichloorbenzoëzuur (4) afgewogen en 10 minuten lichtjes gerefluxt in 300 ml dichloormethaan zodat alles goed oplost.
Daarna wordt (0,3 mol) 36 g thionylchloride toegevoegd en gedurende 5 uur gerefluxt, totdat een heldere oplossing bekomen wordt.
Figure BE1008235A5D00111
Watervrij milieu is noodzakelijk om hydrolysen van het zuurchloride (5) tot het carbonzuur (4.) te voorkomen .
Bij het gebruik van thionylchloride wordt door een bijreactie ook 4-thionylimino-3,5-dichloorbenzoyl-chloride gevormd. Ongeveer 50% van de aminofunctie wordt in de thionyliminovorm omgezet. Dit percentage wordt groter naarmate langer gerefluxt wordt. In waterig milieu ontstaat terug het vrije amine (5.) .
Het reaciemengsel wordt volledig drooggedampt met behulp van een rotavapor en als dusdanig verder gebruikt.
2.2. Bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine
Het ruw zuurchloride (£) , (0,1 mol) uit de vorige stap wordt opgelost in 300 ml dichloormethaan.
Hieraan wordt een oplossing, van (0,45 mol) 33,75 g glycine en (0,45 mol) 18 g natriumhydroxide in 150 ml water, toegedruppeld. De vrije aminogroep van glycine reageert met het zuurchloride via een nucleofiele additie en vormt 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine (6).
Het reactiemengsel wordt, in een kolf met luchtkoeler, gedurende een ganse nacht bij kamertemperatuur geroerd.
Na reactie wordt de waterlaag met geconcentreerd zoutzuur op pH = 3 gebracht. Na affiltreren van de neerslag bekomen we 20,72 g ruw product.
Figure BE1008235A5D00121
(5) (6)
Als nevenreactie, wordt door de additie van water ongeveer 10% van het oorspronkelijk zuur (4.) gevormd.
Door omkristallisatie in 45 ml opgewarmd azijnzuur kan 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine (6) opgezuiverd worden. Het filtraat laat men langzaam uitkristalliseren, na affiltreren en wassen met een kleine hoeveelheid azijnzuur bekomen we een 100% zuivere verbinding.
MW = 263 g rendement (2 stappen) = 15,6 g * 58% 2.3. Bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine methylester
Analoog als voor de bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine wordt het ruwe zuurchloride (.5) , bekomen uit 0,1 mol 4-amino-3,5-dichlorobenzoëzuur (4.) opgelost in een 1 1 kolf met 200 ml dichloormethaan.
Een oplossing, van (0,2 mol) 25,1 g glycinehy-drochloride methylester in 150 ml dichloormethaan en (0,3 mol) 30,3 g triethylamine, wordt aan het zuur-chloride toegedruppeld en overnacht geroerd bij kamertemperatuur .
Figure BE1008235A5D00131
(ÿ w
Triëthylamine wordt toegevoegd om het zout zuur van het glycinehydrochloridemethylester te binden, zodat de vrije aminofunctie een nucleofiele additie kan uitvoeren op de carbonylgroep van het zuurchloride.
Na reactie wordt het triëthylaminehydrochloride en de overgebleven vrije base met 120 ml water geëxtraheerd .
De afgescheiden organische laag wordt gedroogd met magnesiumsulfaat. Na uitkristallisatie wordt de dichloor- methaanlaag afgefiltreerd. Het filtraat wordt ingedampt terwijl 80 ml tetrachloormethaan toegevoegd wordt, hieruit wordt een tweede worp gehaald.
MW - 277 g rendement (2 stappen) * 19,7 g = 69% B. KOPPELINGSREACTIES LIGAND MET SPACER : 1. Synthese van 6-trifluoracetvlamine-l-hexanoylchloride
Het uiteindelijke doel is een chemisch ligand te vormen door 6-aminohexaanzuur (8) te koppelen met het aromatisch aminesubstituent van 4-amino-3,5-dichloor-benzoylglycine methylester (7).
Daar de koppeling van de aminofunctie van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine met de kolommatrix moeilijk verloopt worden spacers met vrije actieve groepen vooraf aan de aromatische aminofunctie gekoppeld. Om ringsluiting, met vorming van caprolactam tot gevolg, te vermijden wordt de aminofunctie van de alifatische keten (8.) vooraf beschermd met een later terug af te splitsen trif luoracetylgroep. (13.) 1.1. Bereiding van 6-trifluoracetylamine-hexaanzuur
In een 500 ml kolf wordt (0,15 mol) 19,8 g 6-aminohexaanzuur (8) opgelost in 300 ml dichloormethaan, samen met (0,16 mol) 13,43 g pyridine.
Hieraan wordt (0,20 mol) 42 g trifluor-azijnzuuranhydride toegedruppeld en gedurende 5 uur geroerd bij kamertemperatuur.
Figure BE1008235A5D00141
Deze oplossing wordt bij kamertemperatuur geroerd tot een heldere oplossing bekomen wordt, die als dusdanig verder gebruikt wordt.
Als nevenreactie wordt een deel van het carbonzuur (9) omgezet tot het gemengd anhydride, wat later zeer snel in het zuurchloride (i0) omgezet wordt.
1.2. Bereiding van 6-trifluoracetylamine-hexanoylchloride
Aan de hierboven bekomen oplossing van hexa-anzuur met beschermde aminogroep (9) wordt (0,25 mol) 19,8 g thionylchloride toegevoegd en gedurende 30 minuten lichtjes verwarmd in oliebad van 50 °C.
De kolf wordt hiervoor voorzien van een bol-koeler en een CaCl2-buis.
Figure BE1008235A5D00151
Het mengsel wordt overnacht verder geroerd bij kamertemperatuur en daarna volledig drooggedampt met de rotavapor.
Gebaseerd op 1JC-NMR vinden we dat ongeveer 85% van het carbonzuur in het zuurchloride werd omgezet.
2. Synthese van 4-N-fe-amino-l-carbonvlpentvl)-3,5-dichloorbenzovlalvcine 2.1. Bereiding van 4-N-(l-carbonylpentyl-6-trifluor- acetylamine)-3, 5-dichloorbenzoylglycinemethylester
In een 500 ml kolf wordt (0,05 mol) 13,8 g 4-araino-3,5-dichloorbenzoylglycine methylester (2) en (0,17 mol) 13,4 g pyridine opgelost in 250 ml dichloormethaan, waarbij gedurende 30 minuten lichtjes opgewarmd wordt.
Figure BE1008235A5D00152
Het ingedampte ruw zuurchloride (20), bekomen uit 0,15 mol 6-aminohexaanzuur, wordt opgelost in 100 ml dichloormethaan en aan de methylester (2) oplossing toegedruppeld. Het mengsel wordt gedurende 5 dagen geroerd bij kamertemperatuur, na 24 uur verschijnen de eerste fijne witte kristallen (.11) .
De bekomen oplossing wordt in een scheitrechter gewassen met 200 ml 0,5 N zoutzuur. Hierbij ontstaat een kleverige emulsie welke afgefiltreerd wordt en goed gewassen met dichloormethaan.
MW = 476 g rendement = 17,4 g = 73% 2.2. Bereiding van 4-N-(6-amino-l-carbonylpentyl)-3,5-dichloorbenzoylglycine
In een 250 ml kolf wordt (0,075 mol) 3 g natriumhydroxide opgelost in 90 ml methanol.
Hieraan wordt (0,03 mol) 14,28 g 4-N-(l-carbo-nylpentyl-6-trifluoracetylamine)-3,5-dichloorbenzoyl-glycine methylester (11) toegevoegd en gedurende 30 minuten verwarmd in een oliebad van 60°C. Daarna wordt gedurende twee dagen geroerd bij kamertemperatuur.
Figure BE1008235A5D00161
Na reactie wordt 50 ml water toegevoegd en wordt de pH van het mengsel op 5,5 gebracht.
Met de rotavapor wordt een deel van de methanol uitgedampt tot de eerst fijne kristallen (12.) verschijnen. We laten de oplossing overnacht verder uitkristalliseren en verwezenlijkt de koppeling van 4- amino-3,5-dicloorbenzoylglycine met een alifatische C6-spacer.
MW = 366 g rendement = 9,1 g = 83% 3. Synthese van 2.6-dichloor-4-carbonvlaziinzuur-M^hvdroxv of 2 *.4'-dihvdroxv)-azobenzeen
Op analoge wijze wordt een diazokoppeling van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine met een aromatische spacer verwezenlijkt.
In 100 ml erlenmeyer wordt (0,48 mmol) 125 mg 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine afgewogen en opgelost in 5 ml koud demi-water (pH > 7). Daarna wordt de pH met geconcentreerd zoutzuur op 1 à 1,5 gebracht, waarbij een fijne suspensie ontstaat.
De oplossing wordt afgesloten van het licht in een ijsbad geplaatst. Terwijl geroerd wordt voegen we 4 ml (1,5 N) natriumnitriet toe, de pH wordt regelmatig gecontroleerd en op 1 à 1,5 gehouden.
Na 30 minuten wordt de oplossing gefiltreerd, aan het gele filtraat wordt voorzichtig 2 g ammonium-sulfamaat, opgelost in 2 ml demi-water, toegdruppeld. Dit totdat er geen belletjes meer gevormd worden. (1 uur, 4°C, donker)
Figure BE1008235A5D00171
Als test worden enkele druppels van de actieve diazoverbinding gemengd met enkele druppels dimethyl-N-aniline, er moet onmiddellijk een diep rode kleur verschijnen.
De hier bekomen diazo-oplossing wordt gebruikt voor de koppeling aan een kolommatrix welke vooraf met benzeenringen bezet werd. (zie deel IV)
Na de koppeling aan de kolommatrix wordt de 5 resterende actieve diazoverbinding afgef iltreerd. Aan het bekomen filtraat wordt, (1 mmol) 94 mg fenol of (lmmol) 110 mg resorcinol opgelost in 5 ml koud demi-water pH = 1,5 toe- gevoegd en gedurende 15 uur in de ijskast geplaatst.
) De ontstane rode neerslag wordt na affiltreren en wassen met demiwater pH = 1,5 gebruikt voor de karakterisatie.
Figure BE1008235A5D00181
C. KOPPELING LIGAND AAN KOLOMMATRIX
Voor het koppelen van de aminofunctie van het ligand wordt volgens de uitvinding een kolommatrix op agarose basis nl. sepharose en een silicamatrix gekozen.
De sepharose affiniteitsmatrixen hebben een open poriën structuur, zodat binnenin de matrix plaats vrij is voor het vasthechten van (grote) ligandmoleculen.
Even belangrijk zijn de extreem lage non-specifieke interacties van de matrix zelf en de korrelvormige structuur die zorgt voor de goede floweigenschappen.
Sepharose-matrixen zijn in de handel verkrijgbaar met verschillende soorten actieve groepen, al dan niet met spacer, waaraan aminogroepen onder milde condities kunnen gekoppeld worden.
1. Koppeling aan Epoxv-activated Sepharose 6B
1.1. Reactiemechanisme
Deze kolommatrix is standaard voorzien van een lange (12 atomen) spacer eindigend met een epoxygroep en is uiterst geschikt voor affiniteitschromatografie met kleine ligandmoleculen.
Figure BE1008235A5D00191
Door nucleofiele additie van een hydroxylgroep of een aminofunctie aan de reactieve epoxygroep wordt een zeer stabiel ringopeningsprodukt gevormd.
1.2. Koppelingscondities
Nadat 1 g gevriesdroogde kolommatrix gewassen werd met 100 ml demi-water, moet de koppelingsbuffer ommiddellijk aan het gel toegevoegd worden. Anders worden de epoxygroepen vooraf gehydrolyseerd.
Voor de koppeling bij 55°C werd het te reageren mengsel in een erlenmeyer in een droogstof geplaatst en regelmatig omgeschud.
Na de koppelingsreactie wordt alternerend gewassen met in totaal 600 ml 0,1 M natriumhydroxide buffer (pH=ll) en 0,1 M acetaat buffer (pH=3) welke beide 0,5 M NaCl bevatten.
1.3. Titratiecurve
Zoals afgebeeld in figuur 1, tonen de vier titratiecurves met Epoxy-activated Sepharose 6B aan dot de rechtstreekse koppeling via het aromatisch amine is niet mogelijk is. Ook de koppeling via een fenol spacer is weinig efficiënt en bindt ongeveer 5 μπιοί gebonden A.D.B.G mole- culen per ml gel.
Via een alifatische spacer is het mogelijk 10 Aimol/ml gel van het A.D.B.G. te koppelen.
Het beste resultaat wordt bekomen met resorcinol of aniline als spacer, waarbij 15-20 /zmol/ml gekoppeld werd.
1.4. NMR-spectroscopie
Ongeveer 1 ml van het, via de resorcinol spacer met gediazoteerd 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine A.D.B.G., gekoppelde epoxy-sepharosegel wordt in een NMR buis gebracht. (90% H20, 10% d20, pH=10)
Het ‘H-NMR spectrum van dit gel ziet u in addendum 3.
Als we dit spectrum vergelijken met het vroeger opgenomen 2,6-dichloro-4-carbonyl-azijnzuur-2', 4'-dihydroxy-azobenzeen kunnen we aan de hand van de aromatische waterstoffen van A.D.B.G. en de 4 zichtbare (beweeglijke) alifatische waterstoffen van de spacer berekenen dat ongeveer 30% van de spacers (12 atomen) met A.D.B.G. bezet is.
D. VOORBEELDEN
1. Voorbeeld 1 : elutiepatroon van standaardoplossing (H20) met als ß-agonisten (salbutamol, fenoterol, cimbuterol, Clenbuterol, mabuterol, clenpenterol) en als ß-antagonist (propanolol) voor de Epoxy-Activated sepharose met 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine als chemisch ligand gekoppeld via resorcinol-spacer.
De beste resultaten worden bekomen met resorci-nol als aromatische spacer (fig. 2). Hierbij kunnen alle teststoffen op de kolom vastgehouden worden bij spoelen met de spoelbuffer, met uitzondering van salbutamol dat een te zwakke affiniteit vertoont.
Cimbuterol en 2,4-aminophenylethanolamnine (2.4.A.P.E.A.) vinden we voor 100% terug in de 55mM zout fractie, ook voor mabuterol wordt de affiniteit bij deze zoutconcentratie verbroken. Voor Clenbuterol gebeurt dit pas bij een spoelen met 110 mM zout. Clenpenterol vinden we slechts voor 25% in deze fractie terug, wat op een sterkere affiniteit wijst. De sterkste interacties treden op voor fenoterol en propanolol, die voor het grootste deel in de 300mM zoutfractie terug te vinden zijn.
Deze kolom werd tevens getest met een 1 mM acetaat spoelbuffer (pH=5,2), waarbij de OH groep van de aromatische spacer gedeprotoneerd is. Ook hier werd hetzelfde verloop teruggevonden.
2. Voorbeeld 2 : het zelfde kolommateriaal als in voorbeeld 1 wordt ditmaal getest met gespikte kalverurine.
Hiervoor wordt 1 ml blanco kalverurine gemengd met lml van het standaard mengsel beschreven in voorbeeld 1 en off-line op de lange Epoxy-resor-A.D.B.G. kolom gebracht.
Daarna wordt gespoeld met 20 ml spoelbuffer (ImM fosfaat, pH=7), gevolgd door 20 ml elutiebuffer met traag stijgende zoutconcentratie (11 mM, 33 mM, 55 mM, 110 mM, 330 mM en 550 mM).
In de grafiek (fig.4.) zien we dezelfde elutievolgorde terug als voor een waterig mengsel. De teststoffen worden reeds na toevoegen van lagere zoutconcentraties geëlueerd.
Dit kan verklaard worden door het reeds aanwezige zout in de urine. Tijdens de spoelstap van 20 ml elueren histamine, 2.4.A.P.E.A., salbutamol en een deel van de toegevoegde cimbuterol van de kolom. Clenbuterol, fenoterol, mabuterol, clenpenterol en propanol blijft op de kolom.

Claims (9)

1. Hippuurzuurderivaat dat in de kern meermaals gesubstitueerd is, met het kenmerk dat het de volgende formule bezit :
Figure BE1008235A5C00231
waarin r6 = nh2, oh, conh2, so2nh2
Figure BE1008235A5C00232
R7 en/of R8 = Cl, Br, OH, CH2OH, CP3, N02, F R9 Y
2. Toepassing van het hippuurzuurderivaat volgens conclusie 1, in een analysemethode bestemd om stoffen in het bijzonder van het type ß-agonisten en ß-antagonisten in urine-, vlees- of bloedmonsters op te sporen.
3. Analysemethode bestemd om groeistimulatoren in het bijzonder van het type ß-agonisten alsook ß-antagonisten in urine-, vlees- of bloedmonsters op te sporen, met het kenmerk dat men het monster op een affi-niteitsschromatografiekolom brengt met de aromatische meermaals gesubstitueerd hippuurzuurderivaat volgens conclusie 1 als chemisch ligand.
4. Analysemethode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het hippuurzuurderivaat uit 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine bestaat.
5. Vulmateriaal voor affiniteitschromato-grafie-kolom bestemd voor de analysemethode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het uit een hippuur-zuurderivaat volgens conclusie 1 bestaat als chemisch ligand dat op een klassieke kolommatrix met behulp van een aromatische of alifatische verbinding als spacer wordt gebonden.
6. Vulmateriaal volgens conclusie 4, met het kenmerk dat het hippuurzuurderivaat uit 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine bestaat.
7. Vulmateriaal volgens conclusie 2, met het kenmerk dat 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine op een Epoxygeactiveerde silica of Sepharose drager met behulp van resorcinol of fenol als spacer wordt gebonden.
8. Werkwijze om een vulmateriaal te vervaardigen volgens een der conclusies 5 tot en met 7, met het kenmerk dat van fenol of resorcinol gediazoteerd 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine op deze gekoppelde aromaten bindt.
9. Werkwijze om 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine te synthetiseren uit ethyl-4-aminobenzöaat dat met sulfurylchloride gedurende 15 uur met reflux opgewarmd wordt op een oliebad en uit hexaan uitgekristalli-zeerd en het bekomen ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat met thionylchloride gedurende 5 uur met reflux opwarmt.
BE9400323A 1994-03-25 1994-03-25 Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen. BE1008235A5 (nl)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400323A BE1008235A5 (nl) 1994-03-25 1994-03-25 Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen.
EP95912979A EP0751929A1 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists
PCT/BE1995/000027 WO1995026330A1 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists
CN 95192269 CN1144521A (zh) 1994-03-25 1995-03-24 显示微量β-***和β-拮抗剂的分析方法
JP7524879A JPH10500668A (ja) 1994-03-25 1995-03-24 β−アゴニストおよびβ−アンタゴニストの微量を検査するための分析方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400323A BE1008235A5 (nl) 1994-03-25 1994-03-25 Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen.
BE9400323 1994-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BE1008235A5 true BE1008235A5 (nl) 1996-02-20

Family

ID=3888065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BE9400323A BE1008235A5 (nl) 1994-03-25 1994-03-25 Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen.

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0751929A1 (nl)
JP (1) JPH10500668A (nl)
CN (1) CN1144521A (nl)
BE (1) BE1008235A5 (nl)
WO (1) WO1995026330A1 (nl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100357738C (zh) * 2004-03-26 2007-12-26 博奥生物有限公司 一种检测小分子化合物的方法
TW200902504A (en) 2007-03-28 2009-01-16 Sumitomo Chemical Co Manufacturing method of trichloropyrimidine compound
US11090313B2 (en) 2010-05-20 2021-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting muscle atrophy
JP5808797B2 (ja) 2010-05-20 2015-11-10 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 筋萎縮を阻害するための方法
CA2838275C (en) * 2011-06-06 2021-08-10 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting muscle atrophy
CN109633031A (zh) * 2019-01-23 2019-04-16 洛阳理工学院 一种莱克多巴胺的检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2738631A1 (de) * 1976-08-26 1978-03-02 Lilly Co Eli 7-(2-benzoylamino)-acetamido-cephalosporine und verfahren zu ihrer herstellung
WO1993003382A2 (en) * 1991-08-01 1993-02-18 Pharmaceutical Discovery Corporation Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ249229A (en) * 1992-03-02 1995-09-26 Enfer Technology Ltd Immunometric test for drugs in fresh meat

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2738631A1 (de) * 1976-08-26 1978-03-02 Lilly Co Eli 7-(2-benzoylamino)-acetamido-cephalosporine und verfahren zu ihrer herstellung
WO1993003382A2 (en) * 1991-08-01 1993-02-18 Pharmaceutical Discovery Corporation Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 095, no. 13, 28 September 1981, Columbus, Ohio, US; abstract no. 109800, MIHARA K ET AL: "Metabolism of tolclofos-methyl in rats and mice" *
HANSELAER R ET AL: "N-Acylamino acids and peptides. VII. Synthesis of oxygen-sensitive N-acylglycines (N-caffeoylglycine, N-protocatechuoylglycine and N-galloylglycine) and a N-acyldipeptide (N-caffeoylglycyl-L-phenylalanin", BULL. SOC. CHIM. BELG. (BSCBAG,00379646);83; VOL.92 (11-12); PP.1029-37, UNIV. GHENT;LAB. PLANT BIOCHEM.; GHENT; B-9000; BELG. (BE) *
HORIBA M ET AL: "Pharmacokinetic studies of mabuterol, a new selective.beta.2-stimulant. II: Urinary metabolites of mabuterol in rats and their pharmacological effects", ARZNEIM.-FORSCH. (ARZNAD,00044172);84; VOL.34 (11A); PP.1668-79, KAKEN PHARM. CO. LTD.;RES. LAB.; TOKYO; 113; JAPAN (JP) *
NIPPON NOYAKU GAKKAISHI (NNGADV,03851559);81; VOL.6 (1); PP.65-74, SUMITOMO CHEM. CO.;PESTICIDES DIV.; TAKARAZUKA; 665; JAPAN *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1144521A (zh) 1997-03-05
EP0751929A1 (en) 1997-01-08
WO1995026330A1 (en) 1995-10-05
JPH10500668A (ja) 1998-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2071036A3 (en) Methods for identifying RNA-binding compounds
JP4298201B2 (ja) 金属キレート化複合物
US4016146A (en) Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies, and use
DE60225299T2 (de) Nucleophile fluorierung an fester phase
BE1008235A5 (nl) Analysemethode geschikt om beta-agonisten en beta-antagonisten op te sporen.
US4021481A (en) Amido derivatives of 2,4,6-triiodobenzoic acids containing at least one N-hydroxyalkyl and at least two hydroxyl groups
HRP20080537T3 (en) Novel process for synthesizing and a novel crystal form of agomelatin as well as pharmaceutical preparations containing these
JPH03504801A (ja) 標識された核酸プローブ
Marroquin et al. The binding of 2-acetylaminofluorene to rat liver ribonucleic acid in vivo
CN101970100A (zh) 用于分离对映体混合物的新型手性选择物及固定相
CN109111478B (zh) 苯磷硫胺衍生物、制备方法及其药物组合物
EP1937243A2 (en) Naphthyl derivatives as inhibitors of beta-amyloid aggregation
Yuan et al. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol without surface regeneration
Counsell et al. Potential organ or tumor imaging agents. 11. Radioiodinated tyramines
JP2004508448A5 (nl)
Noggle Jr et al. Liquid chromatographic determination of the enantiomeric composition of amphetamine prepared from norephedrine and norpseudoephedrine
US2913451A (en) Iodophenylamidoalkanesulfonic acid compounds
CA2803225C (en) Process for the preparation of contrast agents
Wheler et al. Separation and Quantitation of O-Phthalaldehyde Derivatives of Taurine and Related Compounds in a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) System
JP4008446B2 (ja) ベンゼン環上に二置換基を有するβ−ベンジルオキシアスパラギン酸誘導体
JPS5852244A (ja) Ｘ線造影剤に有用なブロモベンゼン化合物
AU2007209853A1 (en) Divalent metal ion sensors and binders
Boto et al. Synthesis and characterization of mono-and dicarboxyalkyloxacarbocyanines
Boschin et al. Optimization of the synthesis of the cross-linked amino acid ornithinoalanine and nuclear magnetic resonance characterization of lysinoalanine and ornithinoalanine
Chauffe et al. Factors affecting cyanoborohydride reduction of aromatic Schiff’s bases in proteins

Legal Events

Date Code Title Description
RE Patent lapsed

Owner name: UNIVERSITEIT GENT LABORATORIUM ORGANISCHE CHEMIE

Effective date: 19970331

Owner name: DE BLOCK GEERT

Effective date: 19970331

Owner name: DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK DLO RIJKSKWALITEI

Effective date: 19970331