EP0751929A1 - Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists - Google Patents

Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists

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EP0751929A1
EP0751929A1 EP95912979A EP95912979A EP0751929A1 EP 0751929 A1 EP0751929 A1 EP 0751929A1 EP 95912979 A EP95912979 A EP 95912979A EP 95912979 A EP95912979 A EP 95912979A EP 0751929 A1 EP0751929 A1 EP 0751929A1
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Roland G. Verhe
Geert De Block
Artjen Lommen
Henk Keukens
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Universiteit Gent
DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK (DLO) RIJKSKWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN (RIKILT-DLO)
Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Original Assignee
Universiteit Gent
DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK (DLO) RIJKSKWALITEITSINSTITUUT VOOR LAND- EN TUINBOUWPRODUKTEN (RIKILT-DLO)
Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
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Definitions

  • La presente invention est relative a un c ⁇ mpo- se et une methode d 1 analyse destinee a deceler la pre ⁇ sencefure de beta-agonistes, and que de beta- antagonistes dans un echantillon frauduleux d'urine, de boss ou de sang d'un animal ou d'uneéclairage.
  • Etant donne que la diversite a 1 ' interieur du terme des beta-agonistes est relativement Register (groupes Letls, proprietes acide-base) , on n'est pas offer parvenu a developper une methodeless de rectification qui former a meme desky concentrer et identifier des substances d'un memeerie de beta- agonistes possedant 6.7 des proprietes apparentees .
  • R s alkyle en C 2 -C 6 , alkylaryle en C 7 -C 9 , CH 2 OH, CH 2 SH, (CH 2 ) n SMe, (CH 2 ) n CONH 2 , (CH 2 ) n COOH, CH 2 - (7) -OH, CHj-Zo) et
  • a measure que de plus en plus de beta-agonistes thank synthetises (Tableau 1) , la tunance aux cate- cholamines originales s'amenuise.
  • Lelie technique consiste a developper une methode appropriee pour deceler selectivement des phenylethanolamines, qui forment un element de base de tout beta-agoniste, et pour les purifier discretion.
  • La presente invention presente une methode chromatographique d'affinite, a meme de separer et dece ⁇ ler gallery des phenylethanolamines .
  • L' invention concerne dam un form proceede de synthese de la 4-amino-3, 5-dichlorobenzoylglycine et de liaison a des molecules intercalaires
  • de creer un accouplement proposes a une matrice d'affinite.

Abstract

An analysis method and a compound consisting of a hippuric acid derivative for testing for any growth promoters, particularly beta-agonists, as well as beta-antagonists, that may be present in a fraudulent urine, meat or blood sample from an animal or human. A filling material is thus provided for carrying out the analysis method during meat and doping tests. In formula (I), R6 is NH2, OH, CONH2 or SO2NH2; R7 and/or R8 are Cl, BL, OH, CH2OH, CF3, NO2 or F; R9 is C2-6 alkyl, C7-9 alkylaryl, CH2OH, CH2SH, (CH2)nSMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH, (a), (b) and (c); and Y is CO or SO2.

Description

METHODE D'ANALYSE POUR DECELER DES TRACES DE BETA- AGONISTES ET DE BETA-ANTAGONISTES
La presente invention est relative a un cσmpo- se et une methode d1 analyse destinee a deceler la pre¬ sence eventuelle de beta-agonistes, ainsi que de beta- antagonistes dans un echantillon frauduleux d'urine, de viande ou de sang d'un animal ou d'une personne.
Elle concerne aussi un materiau de re plissage pour mettre en oeuvre la methode d' analyse au cours de contrδles de viande et tests antidoping. On utilise de- puis de nombreuses annees des stimulants de croissance pour 1 ' engraissement du betail. Les stimulants les plus connus sont les steroides anabolisants dont 1 'usage est interdit dans tous les pays de la Communaute Europeenne depuis le 01.01.1988.
On rencontre egalement d'autres promoteurs de croissance dans 1 ' engraissement, en particulier les beta-agonistes et les beta-mimetiques dont le clenbute- ral est le representant le plus connu.
Les composes et des composes analogues etaient originellement administres lors des traitements d'affec¬ tions asthmatiques, comme bronchospasmolytiques destines a combattre les bronchites chez les pores et le betail et comme relaxant uterin en cas de risque d' avortement .
Mais comme ces substances possedent egalement la propriete d'agir sur la graisse et le metabolisme des muscles et celle d'ameliorer la qualite de la carcasse, elles ont eveille aussitot 1 ' interet et 1 ' appat du gain des eleveurs de betail . Comme 1 ' activite biochimique de ces substances semble se developper selon le meme mecanisme que celui des deux hormones bien connues adrenaline et noradrena- line, on peut considerer les beta-agonistes comme des substances possedant une ac tivite hormonale.
L'usage de beta-agonistes pour ame-liorer la qualite de la viande est illegal dans la Communaute Eco- nomique Europeenne.
Etant donne que la diversite a 1 ' interieur du groupe des beta-agonistes est relativement importante (groupes fonctionnels, proprietes acide-base) , on n'est pas encore parvenu a developper une methode rapide de rectification qui soit a meme de rapidement concentrer et identifier des substances d'un meme groupe de beta- agonistes possedant toutes des proprietes apparentees . Un premier pas dans la bonne direction est 1 ' apparition recente des colonnes d1 immuno-affinite decrites dans la litterature, mais celles-ci ne sont specifiques que pour le groupe butyle tertiaire et normal, isopropyl et 2-pentyle (Le Journal of AOAC international, Vol. 75; p. 554-560, VAN GINKEL et al : Development and valida¬ tion of a multiresidue method for beta-agonists in bio- logical samples and animal feed) .
Cependant, il semble qu'il existe une struc¬ ture fondamentale commune a. tous les beta-agonistes, a savoir la structure phenylethanolamine de la forme suivante :
dans laquelle R. = H
R2 = CH2OH , Cl , OH, H R3 = OH , NH2, H R4 = H , Cl , OH , CF3 , CN
Rs = alkyle en C2-C6, alkylaryle en C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2)nSMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH, CH2- (7) -OH, CHj-Zo) et
Ce groupe commun phenylethanolamine, qui est toujours present, constitue aussi le fragment pharmaco- logiquement actif des beta-agonistes.
A mesure que de plus en plus de beta-agonistes sont synthetises (Tableau 1) , la ressemblance aux cate- cholamines originales s'amenuise.
Tableau 1.1. Structures d'un certain nombre de beta- aσonistes
Tableau 1.1. Structures d'un certain nombre de beta-aσonistes
Le probleme technique consiste a developper une methode appropriee pour deceler selectivement des phenylethanolamines, qui forment un element de base de tout beta-agoniste, et pour les purifier rapidement.
Des beta-agonistes sont potentiellement pre¬ sents dans 1'urine des animaux de boucherie.
La presente invention presente une methode chromatographique d'affinite, a meme de separer et dece¬ ler rapidement des phenylethanolamines .
Selon une particularity de 1' invention, la methode chromatographique d'affinite fait usage d'un li- gand chimique qui est capable de lier des beta-agonis¬ tes.
On propose comme ligand la 4-amino-3,5 dichlo- robenzoylglycine (A.D.B.G.) pour la purification des beta-agonistes.
Dans une forme de realisation preferee, 1'A.D.B.G. est accouplee au moyen de resorcinol en tant qu' intercalaire du materiau de remplissage classique d'une colonne de Sepharose epoxy activee. Le materiau modifie possede une excellente affinite aux beta-agonis¬ tes testes, sauf au salbutamol.
Un article publie dans le Bulletin Societe Chimique Beige (BSCBAG, 00379646) 83, vol 92 (11-12) ; pages 1029-37 par I'Universite de Gand, Laboratoire de biochimie vegetale par Hanselaer R. et al et intitu¬ le : "N-Acylamino acids and peptides. VIIe Synthesis of oxygen sensitive N-acylglycines decrit une methode de synthese de plusieurs composes parmi lesquels ceux ayant la structure suivante :
qui correspond a celle preconisee comme ligand.
L' invention concerne aussi un nouveau procede de synthese de la 4-amino-3, 5-dichlorobenzoylglycine et de liaison a des molecules intercalaires afin de creer un accouplement efficace a une matrice d'affinite.
Les composes suivants sont proposes comme li- gands possibles pour le la chromatographie moleculaire d'affinite :
dans laquelle :
R6 NH2, OH, CONH2, S02NH2
R7 et/ou R8 = Cl, BL, OH, CH2OH, CF3, N02, F R9 = alkyle en C2-C6, alkylaryle en C7-C9,
CH2OH, CH2SH, (CH2)nSMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH, CU2- (θ -OR, CR2- (θ) - et
<__)
Des contrδles par chromatographie d'affinite d'echant llons d'urine contaminee donnent d'excellents resultats pour 1 'application ulterieure de ce ligand dans la methode d1 analyse residuelle tant des beta- agonistes connus qu' inconnus.
Des tests preliminaires de chromatographie par affinite ont fait apparaitre que les materiaux de rem- plissage des colonnes constitutes de Sepharose 4B ac- tivee par CNBr , silice activee par epoxy, ou de sepha¬ rose d1 aldehyde glutarique et silice P, ne presentent aucune affinite pour les beta-agonistes testes lors- qu'ils sont directement couples a du A.D.B.G. Les raisons eventuelles peuvent etre la protection du ligand pour le support.
L' affinite est amelioree par 1 ' introduction d'une molecule intersticielle supplementaire possedant un groupe fonctionnel (ΝH2 ou OH) qui peut aisement s'accoupler a une colonne matricielle.
De bons resultats sont obtenus avec un inter¬ calaire aromatique. Le phenol, le resorcinol ou l'ani- line sont couples prealablement a la matrice d'une co¬ lonne appropriee. Ensuite, les molecules diazotees d'A.D.B.G. sont liees aux aromates couples. Un avantage supplementaire de cette methode reside dans 1 ' apparition d'une couleur rouge due a la formation d'une liaison azoϊque azo-benzene de sorte que 1 'on peut voir imme- diatement si le ligand est couple avec le materiau de remplissage a. phase dispersee d'une colonne selon 1 ' in¬ vention.
En moyenne, on atteint un degre d'occupation de 10 a 15 μmδle/ml de gel a 1 ' aide d' intercalaires phe¬ nol ou resorcinol et de 4-animo-3,5 dichlorobenzoyl- glycine. A. SYNTHESE LIGAND :
1. Svnthese de l'acide 4-animo-3 , 5-dichlorobenzoϊσue et de 1'ester ethyliσue correspondant
1.1. Preparation de 1 ' ethyl-4-animo-benzoate.
Dans un ballon de 1,5 1 munie d'un agitateur a aimant, on dissout (0,73 mole) 100 g d'acide aminoben- zoϊque (1) dans 500 ml d'ethanol.
On refroidit la solution dans un bain d'eau froide, lors άe l'ajout gout e a goutte de (0,73 moles) 86 de chlorure de thionyle et on rechauffe ensuite le melange sous reflux pendant 10 heures dans un bain d'huile.
H
Pendant le refroidissement, il se forme un precipite, qui se redissout apres addition de 500 ml d'eau. On ajoute ensuite, par petites quantites, 81 g de carbonate de sodium. Le precipite separe par cris- tallisation fractionnee est filtre et le filtrat est sousmis a une seconde tentative. PM = 165 g rendement = 118,0 g = 98 %.
1.2. Preparation de 1 'ethyl-4-amino-3 , 5-dichloroben- zoate.
Dans un ballon de 3 litres ou disant 10,7 moles) 115,5 g d' ethyl-4-amino-benzoate ( 2.) dans 900 ml de tetrachloromethane. Apres addition de (1,4 moles) 198 g de chlorure de sulfuryle, on chauffe le melange sans reflux pendant 15 heures sur bain d'huile.
2. Svnthese de 4-amino-3 , 5-dechlorobenzoylαlvcine et methylester correspondant
2.1. Preparation de chlorure de 4-amino-dichloro-ben- zoyle
Dans un ballon d'un litre, pourvu d'un re¬ frigerant a renflements spheriques et tube de CaCl2 test garni de (0,1 mole) 20,6 g d'acide 4-amino-3 , 5-dichlo- robenzoique (4) soumis pendant 10 minutes a. un leger re¬ flux dans 300 ml de dichloromethane de maniere a tout dissoudre.
Ensuite, on ajoute (3,3 mole) 36 g de chlorure de thionyle chauffe sans reflux pendant 5 heures, jus- qu'a ce qu'une solution claire soit obtenue.
Un milieu anhydre est necessaire pour eviter l'hydrolyse du chlorure d'acide (5) en acide carboxyli- que (4) .
L'emploi de chlorure de thionyle provoque
1 ' apparition par une reaction secondaire de chlorure de 4-thionylimino-3 , 5-benzoyle.
Environ 50 % de la fonction amino est transforme en thionylimine. Le pourcentage s'accroit a mesure que le temps de reflux croit . En milieu aqueux, 1 ' amine libre
(5) se libere a nouveau.
Le melange reactionnel est vaporise complete- ment a sec a 1 ' aide d'un rotavapeur et utilise ulterieu- rement tel quel .
2.2. Preparation de 4-amino-3 , 5-dichlorobenzoylglycine
Le chlorure d'acide crut (5.) est (0,1 mole) et provenant de 1 ' etape anterieure sont dissous dans
300 ml de dichloromethane. On y ajoute goutte a goutte une solution comprenant (0,45 mole) 33,75 g de glycine et (0,45 mole) 18 g d'hydroxyde de sodium dans 150 ml d'eau. Ce groupe amine libre de la glycine reagit avec le chlorure d'acide par le biais d'une addition nu- cleophile et forme du 4-amino-3 , 5-dichlorobenzoylglycine
(6) .
Le melange reactionnel est agite, pendant tou- te la nuit a temperature ambiante, dans un ballon muni d'un refrigerant £ air.
Apres reaction, la phase aqueuse est portee a pH = 3 au moyen d'acide chlorhydrique concentre. Apres filtration du precipite, on obtient 20,72 g de produit brut
0H
(5) (6)
II se forme par une reaction secondaire d'ad¬ dition d'eau, environ 10 % d'acide de depart (4) .
Par cristallisation fractionnee dans 45 ml d'acide acetique chaud, on peut purifier la 4-amino-3,5- dichlorobenzoylglycine (6.) . On laisse le filtrat cris- talliser lentement, apres filtration et lavage avec une petite quantite d'acide acetique, on obtient une sub- stance pure a 100 %
PM = 263 g rendement (2 etages) = 15,6 g = 58 %.
2.3. Preparation de 1 ' ester methylique de la 4-amino- 3 , 5-dichlorobenzoylglycine.
De maniere analogue a la preparation de 4-amino-3,5 dichlorobenzoylglycine, on obtient le chlo¬ rure d'acide brut (5.) a partir de 1,1 mole d'acide de 4-amino-3,5 dichlorobenzoique (4.) dissous dans un ballon d'un litre avec 200 ml de dichloromethane.
Une solution , de (0,2 mole) 25,1 g de chloroclydrate d1ester methylique de glycine dans 150 ml de dichloromethane et (0,3 mole) 30,3 g de triethylamine est ajoutee goutte a goutte au chlorure d'acide et agitee a temperature ambiante pendant toute la nuit.
(5) fr)
On ajoute de la triethylamine pour capter 1 'acide chlorhydrique du chlorhydrate du methylester de glycine, de sorte que la fonction aminee libre puisse effectuer une addition nucleophyle sur le groupe carbo- nyle du chlorure d' acide.
Apres reaction, le chlorhydrate de triethyla- mine et la base alcaline libre excedentaire est extraite avec 120 ml d'eau.
La phase organique separee par decantation est sechee sur du sulfate de magnesium. Apres cristallisa- tion, on separe par filtration le dichloromethane. Ce filtrat est evapore tandis qu'on ajoute 80 ml de tetrac- hloromethane, et on effectue un second tour. MW = 277 g rendement cumule des 2 etapes=19,7 g = 69 % B. REACTION DE COPULATION Dϋ LIGAND ET DE L'INTERCALAIRE
1. Svnthese du chlorure de 6-trifluoracetylamine-l- hexanoyle
Ce but final est de former un ligand chimique en couplant 1' acide 6-aminohexanoϊque (8.) avec un sub- stituant amine aromatique de 1 ' ester de methyle de la 4-amino-3 , 5-dichlorobenzoylglycine.
Par le couplage de la fonction aminee de la 4-amiono-3,5 dichlorobenzoylglycine avec le materiau de remplissage d'une colonne naturelle se realise diffici- lement, car couple prealablement des intermediaires com- prenant des groupes libres a une fonction aminee aroma¬ tique. Pour eviter la fermeture du noyau cyclique, qui a pour consequence la formation de caprolactame, la fonction aminee de la chaine aliphatique (8.) est prealablement protegee a 1 ' aide d'un groupe trifluoroa- cetyle qu'il faudra scinder a nouveau ulterieurement .
1.1. Preparation de 1 ' acide 6-trifluoroacetylamine- hexamoϊque
Dans un ballon de 500 ml ou on dissout
(0,15 mole) ou 19,8 g de 6-aτnino-haxanoϊque (8) dans 300 g de dichloromethane en meme temps que (0,16 mole) 13,43 g pyridine.
On ajoute goutte a goutte (0,20 mole) 42 g d'anhydride de 1' acide trifluoroacetique et on melange pendant 5 heures a la temperature ambiante.
Cette solution est agitee a temperature am¬ biante jusqu'a ce qu'une solution claire soit obtenue, qui est ensuite utilisee telle quelle ulterieurement.
Comme reaction secondaire, on transforme une partie de 1 ' acide carboxylique (9.) en anhydride mixte qui est transforme ulterieurement en chlorure d'acide (10) .
1.2. Preparation du chlorure d'acide de 6-trifluoro- acetylamino-hexanoϊque
A la solution d'acide hexanoϊque obtenue ci-dessus en ayant protege les groupes amines (9.) , on ajoute (0,25 mole) 19,8 g du chlorure de thionyle et on chauffe legerement pendant 30 minutes sur bain d'huile a 50 °C.
Ce ballon est muni a cet effet d'un refrige- rant a renflements spheriques et d'un tube de CaCl2
Le melange est agite toute la nuit a tempera¬ ture ambiante et ensuite evapore entierement a I'aide d'un rotavapeur.
Par 13C-RNM on constate qu' environ 85 % de 1 ' acide carboxylique est transforme en chlorure d'acide.
2. Svnthese de 4-Ν- (6-amino-l-cabonylpentyl) -3 , 5-de dichlorobenzoylcrlvcine
2.1. Preparation du methylester de 4-N- (1-carbonyl- pentyl-6-trifluoro-acetylamine) -3 , 5-dichloroben¬ zoylglycine
Dans un ballon de 500 ml, on dissout
(0,05 mole) 13,8 g du methylester de 4-amino-3, 5-dichlo¬ robenzoylglycine (2) et (0,17 mole) 13,4 g pyridine dans 250 ml dichloromethane, lesquelles on rechauffe le- gerement pendant 30 minutes.
Le chlorure d'acide brut (JLO.) concentre par separation, obtenu a partir de 0,15 mole d'acide 6-amino hexamoϊque est dissous dans 100 ml de dichloromethane et ajoute goutte a goutte a la solution de methylester (2) • Le melange est agite pendant 5 jours a temperature ambiante, apres 24 heures apparaissent les premiers fins cristaux (ljL) .
La solution obtenue est lavee dans une ampoule a decanter avec 200 ml d'acide chlorhydrique 0,5 N. II se forme une emulsion visqueuse qui est filtree et bien lavee a 1 ' aide de dichloromethane . PM = 476 g rendement = 17,4 g = 73 %
2.2. Preparation de 4-N- (6-amino-l-carbonylpentyl) - 35, 5-dichlorobenzoylglycine.
Dans un ballon de 250 ml, on dissout (0,075 mole) 3 g d'hydroxyde de sodium dans 90 ml de me- thanol.
On y ajoute (0,03 mole) 14,28 g 4-N- (1- carbonylpentyl-6-trifluoroacetylamine) -ester de methyle de 3 , 5 dichlorobenzoylglycine (12.) que 1 ' on chauffe pen- dant 30 minutes dans un bain d'huile a 60°C. Ensuite on ajoute le melange pendant deux jours a temperature ambiante.
NoOH H-O
0 Apres reaction on ajoute 50 ml et on amene le melange a pH 5,5.
On evapore en partie le methanol έi I'aide d'un rotavapeur jusqu'a ce que les premiers fins cristaux (12) apparaissent. On laisse la solution cristalliser toute la nuit et on realise le couplage du 4-amino-3,5- dichlorobenzoylglycine avec un intermediaire aliphatique en C6 PM = 366 g Rendement = 9,1 g = 83 %
3. Svnthese du 2 , 6-dichloro-4-carbonylacetiσue (4 ' - hydroxy ou 2 ' , 4' dihvdroxy) -azobenzene
De maniere analogue, on realise un diazotage de 4-amino-3, 5-dichlorobenzoylglycine avec un interme¬ diaire aromatique.
On pese 125 mg de 4-amino-3 , 5-dich-loroben- zoylglycine dans un erlenmeyer de 100 ml et on le dissout dans 5 ml d'eau demineralisee (pH > 7) . Ensuite on amene le melange a Ph 1 ) 1,5 a I'aide d'acide chlor- hydrique concentre, au cours de 1 Operation il se forme une fine suspension.
La solution est isolee de la lumiere et placee dans un bain de glace. Pendant que 1 'on agite, on ajou¬ te 4 ml (1,5 N) de nitrite de sodium, le pH est controle regulierement et maintenu a pH la 1,5.
La solution est filtree apres 30 mi-nutes, et on ajoute au filtre precautionneusement 2 g de sulfamate d'ammonium, dissous dans 2 ml d'eau demineralisee.
Ceci, jusqu'a ce qu'aucune bulle ne se forme (1 heure, 4°C dans l'obscurite. En tant que test, on melange quelques gouttes d'un compose diazote actif a. quelques gouttes de dime¬ thyl-N-ameline, et il doit apparaitre immediatement une couleur rouge foncee.
La solution diazotee obtenue ainsi est uti- lisee pour le couplage au materiau de remplissage a. pha¬ se destinee d'une colonne-matrice qui est prealablement chargee de noyau benzenique (voir partie IV) .
Apres couplage a la colonne matrice, la liaison diazotee active excedentaire est separee par filtration. Au filtrat obtenu, on ajoute (1 mmole) 94 mg de phenol ou (1 mmole) 110 mg de resorcinol dis- sous dans 5 ml d'eau froide demineralisee pH = 1,5 et on place le melange pendant 15 heures dans le congela- teur.
Ce precipite rouge qui se forme est separe par filtration, lave a 1 ' eau demineralisee a pH = 1,5 et utilise pour caracterisation.
OH
C. COUPLAGE DU LIGAND A LA COLONNE MATRICIELLE
Pour fixer la fonction aminee du ligand, on choisit selon 1 ' invention un materiau de remplissage a phase dispersee d'une colonne-matrice faite a base d'agarose, a savoir du sepharose et une matrice de sili¬ ce.
Les matrices d'affinite a la sepharose ont une structure poreuse ouverte, de sorte u'a 1 ' interieur de la matrice, il y a place pour fixer de grandes molecules de ligands.
Tout aussi importantes sont les interactions non-specifiques, extremement basses de la matrice elle-meme et la structure granuleuse qui assume de bon¬ nes proprietes d'ecoulement.
Ces matrices de sepharose peuvent etre obte- nues dans le commerce avec divers groupes actifs, com¬ prenant eventuellement des intermediaires, auxquels des groupes animes peuvent etre couples dans des conditions douces.
1. Couplaσe au sepharose 6B epoxy-active
1.1. Mecanisme de reaction.
Le materiau de remplissage a phase dispersee de la colonne matrice est pourvu de maniere standard d'un intermediaire long (12 atomes) se terminant par un groupe epoxy et couvert parfaitement a la chromato¬ graphie d1affinite au moyen de molecules de ligands pe- tites. H.N-R of HO-R
Par addition nucleophile d'un groupe hydroxyle ou d'une fonction aminee sur le groupe epoxy reactif, on forme un produit tres stable a noyau aromatique ou- vert .
1.2. Conditions de couplage
Apres avoir lave 1 g de materiau de remplis¬ sage a phase dispersee d'une colonne a I'aide de 100 ml d'eau demineralisee, le tampon de couplage doit etre ajoute immediatement au gel. Sinon, les groupes epoxy sont hydrolyses prealablement .
Pour le couplage a 55°C le melange reactionnel contenu dans un erlenmeyer est verse sur une substance seche et secoue a intervalles reguliers.
Apres la reaction du couplage, on lave alter- nativement avec une quantite totale de 600 ml solution tampon phosphatee 0,1 M (pH = 11) et 0, 1 M solution tam¬ pon d'acetate (pH = 3) qui contiennent toutes deux 0,5 M NaCl.
1.3. Courbe de titration
Comme illustre dans la figure 1, les quatre courbes de titration relatives a la sepharose 6B epoxy-

Claims

activee montrent que le couplage direct a 1'amine aroma- tique n'est pas possible. De meme, le couplage par le biais d'un intermediaire constitue de phenol est peu ef- ficace et ne lie qu'environ 5 μmol de molecules de A.D.B.G. par ml de gel.Via un intermediaire aliphatique, il est pos¬ sible de coupler 10 μmδles/ml de gel du A.D.B.G.Le meilleur resultat est obtenu avec un inter¬ mediaire constitue de resorcinol ou d'aniline, avec les- quels 15-20 μmδles/ml sont couples.
1.4. Spectroscopie RMN
Environ 1 ml de gel d'epoxy-sepharose couple a de la 4-amino-3,5 dichlorobenzoylglycine A.D.B.G., diazotee par le biais d'un intermediaire constitue de resorcinol, est introduit dans un tube RMN (90 % H20, 10 % D20, pH = 10) . Le spectrum de tø-RMN du gel est joint dans 1'annexe 3.
REVENDICATIONS
1. Derive d'acide hippurique a plusieurs substituants dans le noyau caracterise en ce qu'il presente la formule suivante :
NH2 , OH , CONH2, S02NH2 Cl , Br , OH , CH2OH, CF3 , N02 , F alkyl en C;-C6 ou alkylaryl en C7-C9, CH2OH , CH2SH , ( CH2) πSMe ,
( CH2 ) nCONH2 , ( CH2 ) -COOH ,
CH2- (o) "OH , CH2- (o et <g)
Y CO ou S02
2. Utilisation d'un derive de 1 ' acide hippurique se- lon la revendication 1, dans une methode d' analyse destinee a. deceler des substances du type beta- agonistes et beta-antagonistes en particulier des echantillons d'urine, de viande et de sang.
3. Methode d'analyse destinee a deceler des stimula- teurs de croissance, en particulier de type beta- agonistes ainsi que beta-antagonistes dans des echantillons d'urine, de viande ou de sang, carac- terise en ce que 1 'on amene 1 ' echantillon sur une colonne de chromatographie par affinite comprenant le derive d'acide hippurique selon la revendica¬ tion 1, substitue par divers composes aromatiques comme ligand chimique.
4. Methode d'analyse selon la revendication 1, ce- pendant le derive d'acide hippurique est la 4- amino-3,5-dichlorobenzoylglycine.
5. Matiere de remplissage d'une colonne de chroma¬ tographie par affinite destinee a la methode d'analyse selon la revendication 1, caracterisee en ce qu'elle est constitute d'un derive a 1'acide hippurique selon la revendication 1 en tant que ligand qui est lie sur une colonne-matrice classi¬ que a I'aide d'une liaison aromatique ou aliphati- que comme intermediaire.
6. Matiere de remplissage selon la revendication 4, caracterisee en ce que le derive de 1'acide hippu¬ rique est constitue de 4-amino-3,5 dichloroben- zoylglycine.
7. Matiere de remplissage selon la revendication 2, caracterisee en ce que la 4-amino-3,5 dichloroben- zoylglycine est liee a un support de silice epoxy- activee ou Sepharose au moyen de resorcinol ou phenol comme intercalaire.
8. Procede pour preparer une matiere de remplissage selon l'une des revendications 5 a 7, caracterise en ce que de la 4-amino-3,5 dichlorobenzoylglycine diazotee avec du phenol ou du resorcinol est liee aux dits aromates couples.
9. Procede pour preparer du 4-amino-3,5 dichloroben¬ zoylglycine a partir d'ethyl-4-aminobenzoate qui est rechauffe sous reflux pendant 15 heures avec du chlorure de sulfuryle sur bain d'huile, et se- pare par cristallisation fractionnee et on re- chauffe 1'ethyl-4-amino-3,5-dichlorobenzoate ob- tenu pendant 5 heures sous reflux avec du chlorure de thionyle.
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100357738C (en) * 2004-03-26 2007-12-26 博奥生物有限公司 Method of detecting small molecule compound and its special biochip
JP2008266316A (en) * 2007-03-28 2008-11-06 Sumitomo Chemical Co Ltd Process for producing 4,5,6-trichloropyrimidines
CN104688745B (en) 2010-05-20 2019-11-12 爱荷华大学研究基金会 Method for inhibiting amyotrophia
US11090313B2 (en) 2010-05-20 2021-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting muscle atrophy
EP3520793B1 (en) * 2011-06-06 2023-03-29 University of Iowa Research Foundation Substances and compostions for use in methods of inhibiting muscle atrophy
CN109633031A (en) * 2019-01-23 2019-04-16 洛阳理工学院 A kind of detection method of Ractopamine

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4319028A (en) * 1976-08-26 1982-03-09 Eli Lilly And Company 7-(2-(Substituted benzoyl)amino)acetamido)cephalosporins
AU2407192A (en) * 1991-08-01 1993-03-02 Pharmaceutical Discovery Corporation Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands
US5660995A (en) * 1992-03-02 1997-08-26 Enfer Technology Ltd. Veterinary drug residue surveillance method

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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