BE1008235A5 - ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS. - Google Patents

ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS. Download PDF

Info

Publication number
BE1008235A5
BE1008235A5 BE9400323A BE9400323A BE1008235A5 BE 1008235 A5 BE1008235 A5 BE 1008235A5 BE 9400323 A BE9400323 A BE 9400323A BE 9400323 A BE9400323 A BE 9400323A BE 1008235 A5 BE1008235 A5 BE 1008235A5
Authority
BE
Belgium
Prior art keywords
amino
acid derivative
dichlorobenzoylglycine
hippuric acid
agonists
Prior art date
Application number
BE9400323A
Other languages
Dutch (nl)
Inventor
Block Geert De
Original Assignee
Univ Gent
Dienst Landbouwkundig Onderzoe
Block Geert De
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Gent, Dienst Landbouwkundig Onderzoe, Block Geert De filed Critical Univ Gent
Priority to BE9400323A priority Critical patent/BE1008235A5/en
Priority to CN 95192269 priority patent/CN1144521A/en
Priority to PCT/BE1995/000027 priority patent/WO1995026330A1/en
Priority to EP95912979A priority patent/EP0751929A1/en
Priority to JP7524879A priority patent/JPH10500668A/en
Application granted granted Critical
Publication of BE1008235A5 publication Critical patent/BE1008235A5/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/82—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/83—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/64—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C233/81—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C07C233/82—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/87—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom of a carbon skeleton containing six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C235/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms
    • C07C235/42—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton
    • C07C235/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C235/52—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by oxygen atoms having carbon atoms of carboxamide groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings and singly-bound oxygen atoms bound to the same carbon skeleton with carbon atoms of carboxamide groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/36—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having the nitrogen atom of the carboxamide group bound to an acyclic carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by carboxyl groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/28—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton
    • C07C237/44—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring of the carbon skeleton having carbon atoms of carboxamide groups, amino groups and singly-bound oxygen atoms bound to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; fish

Abstract

De huidge uitvinding heeft betrekking op een hippuurzuurderivaat en een analysemethode bestemd om de eventuële aanwezigheid van groeistimulatoren in het bijzonder van het type beta-agonisten, alsook beta-antagonisten in een (gespikt) urine-, vlees- of bloedmonster van een dier of mens op te sporen. Het betreft ook een vulmateriaal om de analysemethode toe te passen bij vleeskontroles en anti-dopping-testen. Het vulmateriaal is een hippuurzuurderivaat dat de volgende formule bezit : (zie de fig) waarin R6 = NH2, OH, CONH2,SO2NH2;R7 en/of R8 = C1, Br, OH, CH2OH, CF3, NO2, F;R9 = alkyl in C2-C6 or alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2)nSMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH, (CH)nNH2, (CH2)nNHC(NH)NH2, CH2-O-OH en (CH2)nNH2, Y = CO of SO2.The present invention relates to a hippuric acid derivative and an analysis method intended to detect the eventual presence of growth stimulators, in particular of the type beta agonists, as well as beta antagonists in a (spiked) urine, meat or blood sample from an animal or human. to trace. It is also a filling material to use the analysis method in meat controls and anti-dopping tests. The filler material is a hippuric acid derivative having the following formula: (see the figure) wherein R6 = NH2, OH, CONH2, SO2NH2; R7 and / or R8 = C1, Br, OH, CH2OH, CF3, NO2, F; R9 = alkyl in C2-C6 or alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2) nSMe, (CH2) nCONH2, (CH2) nCOOH, (CH) nNH2, (CH2) nNHC (NH) NH2, CH2-O-OH and (CH2) nNH2, Y = CO or SO2.

Description

Analysemethode geschikt om bêta-aoonisten en bêta-antaaonisten on te sporenAnalytical method suitable for detecting beta-ionists and beta-analysts

De huidge uitvinding heeft betrekking op een verbinding en een analysemethode bestemd om de eventuële aanwezigheid van /?-agonisten, alsook /3-antagonisten in een (gespikt) urine-, vlees- of bloedmonster van een dier of mens op te sporen.The present invention relates to a compound and an analysis method intended to detect the eventual presence of / - agonists, as well as / 3-antagonists in a (spiked) urine, meat or blood sample from an animal or human.

Het betreft ook een vulmateriaal om de analysemethode toe te passen bij vleeskontroles en anti-doping-testen.It is also a filling material to use the analysis method in meat controls and anti-doping tests.

Bij de vetmesting van rundvee wordt al jaren gebruik gemaakt van groeistimulatoren. De meest bekende zijn anabole steroïden waarvan het gebruik sinds 01.01.1988 in alle E.E.G. lidstaten verboden is.Growth stimulators have been used for years in the fattening of cattle. The most famous are anabolic steroids, the use of which has been in all E.E.G. since 01.01.1988. Member States is prohibited.

Ook worden andere groeibevorderaars aangetroffen in de vetmesting, in het bijzonder jS-agonisten en /3-mimetica met Clenbuterol als best gekende vertegenwoordiger.Other growth promoters are also found in fattening, in particular jS agonists and / 3 mimetics with Clenbuterol as the best known representative.

Deze stoffen en soortelijke verbindingen werden oorspronkelijk toegediend bij de behandeling van astmatische aandoeningen, als bronchospasmolyticum voor het verwijderen van de bronchitis bij varkens en vee en als uterusrelaxans bij dreigende abortus.These substances and specific compounds were originally administered in the treatment of asthmatic diseases, as a bronchospasmolytic for the removal of bronchitis in pigs and cattle and as a uterine relaxant in the event of imminent abortion.

Maar omdat deze stoffen ook de eigenschap bezitten het vet en spiermetabolisme te beïnvloeden en een betere karkaskwaliteit mee te brengen, hebben zij onmiddellijk de interesse en de winstzucht van de veehouders gewekt.However, because these substances also have the property of influencing fat and muscle metabolism and of better carcass quality, they immediately aroused the interest and profitability of the farmers.

Omdat de biochemische werking schijnbaar via hetzelfde mechanisme verloopt als voor twee welgekende hormonen adrenaline en noradrenaline het geval is, kunnen jS-agonisten beschouwd worden als stoffen met hormonale werking.Since the biochemical action is apparently via the same mechanism as for two well-known hormones adrenaline and norepinephrine, jS agonists can be regarded as substances with a hormonal action.

Het gebruik van (3-agonisten ter verbetering van de vleeskwaliteit is nu illegaal binnen de E.E.G.The use of (3 agonists to improve meat quality is now illegal within the E.E.G.

Aangezien de variëteit binnen de groep van de ß-agonisten relatief groot is (functionele groepen, zuur-base eigenschappen), is men er tot nu toe nog niet in geslaagd een snelle monsteropzuiveringsmethode te ontwikkelen die in staat is stoffen van de ß-agonisten groep die allen aanverwante eigenschappen bezitten voldoende snel te concentreren en te identificeren. Een stap in de goede richting zijn de recent beschreven immuno-affiniteitskolommen, maar deze zijn enkel specifiek voor de N-tertiair-butyl, isopropyl en 2-pentyl groep. (The Journal of AOAC international, Vol. 75; p. 554-560, VAN GINKEL et als Development and validation of a multiresidue method for ß-agonists in biological samples and animal feed.)Since the variety within the group of the ß-agonists is relatively large (functional groups, acid-base properties), it has not yet been possible to develop a rapid sample purification method capable of substances of the ß-agonist group. all of which have related properties to concentrate and identify sufficiently quickly. A step in the right direction is the recently described immuno-affinity columns, but these are only specific for the N-tertiary-butyl, isopropyl and 2-pentyl group. (The Journal of AOAC international, Vol. 75; p. 554-560, VAN Ginkel et as Development and validation of a multiresidue method for ß-agonists in biological samples and animal feed.)

Toch schijnt een gemeenschappelijke basisstructuur te bestaan in alle ß-agonisten, namelijk de fenylethanol amine structuur die de volgende formule bezit :However, a common basic structure seems to exist in all β-agonists, namely the phenylethanol amine structure which has the following formula:

Figure BE1008235A5D00031

waarin Rj = Hwhere Rj = H

R2 = CH2OH, Cl, OH, HR2 = CH2OH, Cl, OH, H

R3 = OH, NH2, HR3 = OH, NH2, H

R4 = H, Cl, OH, CF3, CNR4 = H, Cl, OH, CF3, CN

R5 * alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH,)„SMe, (CH2)nCONH2, (CH2)nCOOH,R5 * alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2) 'SMe, (CH2) nCONH2, (CH2) nCOOH,

Figure BE1008235A5D00032
Figure BE1008235A5D00033

De gemeenschappelijke fenylethanolamine-groep, die steeds aanwezig is, is tevens het farmacologisch actief fragment van de ß-agonisten.The common phenylethanolamine group, which is always present, is also the pharmacologically active fragment of the β agonists.

Naarmate steeds meer ß-agonisten (tabel 1) gesynthetiseerd werden is de gelijkenis met de oorspronkelijke cathecholamines steeds geringer.As more and more β agonists (Table 1) have been synthesized, the similarity to the original cathecholamines becomes less and less.

Tabel 1.1. Structuren van enkele j3-agonistenTable 1.1. Structures of some j3 agonists

Figure BE1008235A5D00051

Tabel 1.1. Structuren van enkele jS-agonistenTable 1.1. Structures of some jS agonists

Figure BE1008235A5D00061

Het technisch probleem bestaat erin een methode te ontwikkelen die geschikt is om selectief fenylethanol-amines, die de basis vormen van elke /3-agonist, op een snelle manier op te sporen en op te zuiveren.The technical problem is to develop a method suitable for the rapid detection and purification of selective phenylethanol amines, which form the basis of each 3-agonist.

/3-agonisten zijn potentieel aanwezig in urine van slachtdieren.Agonists are potentially present in slaughtered animal urine.

De huidige uitvinding stelt een affiniteits-methode voor, welke in staat is fenylethanoamines op een snelle manier te scheiden en te detecteren.The present invention proposes an affinity method capable of rapidly separating and detecting phenylethanoamines.

Volgens een bijzonderheid van de uitvinding wordt in de affiniteitschromatografische methode gebruik gemaakt van een chemisch ligand dat in staat is ß-agonisten te binden.According to a feature of the invention, the affinity chromatographic method uses a chemical ligand capable of binding β agonists.

Als mogelijk ligand wordt 4-amino-3,5-dichloor-benzoylglycine (A.D.B.G.) vooropgesteld voor de opzui-vering van /3-agonisten.As a possible ligand, 4-amino-3,5-dichloro-benzoylglycine (A.D.B.G.) is suggested for the purification of β-agonists.

In een voorkeursvorm, wordt A.D.B.G. door middel van resorcinol als spacer aan een klassiek Epoxy-activated Sepharose kolommateriaal gekoppeld. Het materiaal bezit een zeer goede affiniteit voor de geteste ß-agonisten, met uitzondering van salbutamol.In a preferred form, A.D.B.G. coupled to a classic Epoxy-activated Sepharose column material by means of resorcinol as a spacer. The material has a very good affinity for the tested β-agonists, with the exception of salbutamol.

De uitvinding betreft ook een werkwijze om 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine te synthetiseren en te koppelen met spacermoleculen om een efficiënte koppeling aan een affiniteitsmatrix tot stand te brengen.The invention also relates to a method of synthesizing and coupling 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine with spacer molecules to effect efficient coupling to an affinity matrix.

Als mogelijke liganden voor affiniteitschromatograf ie van /3-agonisten, worden volgende verbindingen vooropgesteld :As possible ligands for affinity chromatography of β-agonists, the following compounds are suggested:

Figure BE1008235A5D00071

met :with:

Ro = NH2, OH, CONH2, S02NH2 R7 en/of Rs = Cl, Br, OH, CH2OH, CF3, N02, F R, = alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2)„SMe, (CH2)nCONH2, (CH^COOH, (CH2)nNH2, (CH2)„NHC(NH)NH2,Ro = NH2, OH, CONH2, SO2NH2 R7 and / or Rs = Cl, Br, OH, CH2OH, CF3, NO2, FR, = alkyl in C2-C6, alkylaryl in C7-C9, CH2OH, CH2SH, (CH2) „ SMe, (CH2) nCONH2, (CH2 COOH, (CH2) nNH2, (CH2) 'NHC (NH) NH2,

Figure BE1008235A5D00081

en (CH2) nNH2.and (CH2) nNH2.

Controles van gespikte urine en urinemonsters met behulp van affiniteitschromatografie geven uitstekende resultaten voor de verdere toepassing van dit ligand bij de toepassing van de methode voor de residu analyse van zowel bekende als onbekende j8-agonisten.Controls of spiked urine and urine samples by affinity chromatography give excellent results for the further use of this ligand using the residue analysis method of both known and unknown β-agonists.

Uit initiële testen van affiniteitschromatograf ie is gebleken dat CNBr-Activated Sepharose 4B, Epoxygeactiveerde silica of Sepharose en Glutaraldehyde-P-Silica kolommaterialen wanneer zij rechtstreeks met A.D.B.G. gekoppeld zijn geen affiniteit voor de geteste /3-agonisten vertonen. Mogelijke oorzaken kunnen de afscherming van de ligand door de drager zijn.Initial affinity chromatography tests have shown that CNBr-Activated Sepharose 4B, Epoxy Activated Silica or Sepharose and Glutaraldehyde-P-Silica column materials when used directly with A.D.B.G. coupled show no affinity for the tested / 3 agonists. Possible causes can be the shielding of the ligand by the wearer.

De affiniteit wordt verbeterd door een extra spacermolecule in te voeren met een functionele groep (NH2 of OH) welke makkelijk te koppelen is aan de kolom-matrix.The affinity is enhanced by introducing an additional spacer molecule with a functional group (NH2 or OH) that is easy to link to the column matrix.

Goede resultaten worden bekomen met een aromatische spacer. Fenol, resorcinol of aniline wordt vooraf aan een geschikte kolommatrix gekoppeld. Daarna worden de gediazoteerde A.D.B.G. moleculen op deze gekoppelde aromaten gebonden. Bijkomend voordeel van deze methode is dat er bij de vorming van de azobenzeenverbinding een rode kleur ontstaat, zodat men ogenblikkelijk kan zien of er ligand gekoppeld is.Good results are obtained with an aromatic spacer. Phenol, resorcinol or aniline is pre-coupled to a suitable column matrix. The diazotized A.D.B.G. molecules bound to these coupled aromatics. An additional advantage of this method is that a red color is formed during the formation of the azobenzene compound, so that one can immediately see whether ligand has been linked.

Gemiddeld werd met het kolommateriaal volgens de uitvinding met fenol- of resorcinol spacers en het 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine een bezettingsgraad van 10 à 15 μιηοΐ/ml gel behaald.On average, the column material according to the invention with phenol or resorcinol spacers and the 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine achieved a degree of occupancy of 10 to 15 µ / ml gel.

A. SYNTHESE LIGAND : 1. Synthese 4-amino-3.5-dichloorbenzoëzuur en het overeenkomstig ethvlester 1.1. Bereiding van ethyl-4-amino-benzöaatA. SYNTHESIS LIGAND: 1. Synthesis 4-amino-3,5-dichlorobenzoic acid and the corresponding ethyl ester 1.1. Preparation of ethyl 4-amino-benzoate

In een kolf van 1,5 1 voorzien van een magnetische roerstaaf wordt (0,73 mol) 100 g para amino-benzoëzuur (1) opgelost in 500 ml ethanol.In a 1.5 l flask equipped with a magnetic stirring bar, 100 g para amino benzoic acid (1) is dissolved in 500 ml ethanol (0.73 mol).

Bij het toedruppelen van (0,73 mol) 87 g thionylchloride wordt de oplossing gekoeld met een waterbad, waarna we het mengsel 10 uur refluxen op een oliebad.When dripping (0.73 mol) 87 g thionyl chloride, the solution is cooled with a water bath, after which we reflux the mixture on an oil bath for 10 hours.

Figure BE1008235A5D00091

Bij het afkoelen ontstaat een neerslag welke na toevoegen van 500 ml water terug oplost. Daarna wordt in kleine hoeveelheden 81 g natriumcarbonaat toegevoegd. Na uitkristallisatie wordt de neerslag afgefiltreerd en uit het filtraat na indampen een tweede worp gehaald.When cooling, a precipitate is formed which dissolves again after adding 500 ml of water. 81 g of sodium carbonate are then added in small amounts. After crystallization, the precipitate is filtered off and a second throw is removed from the filtrate after evaporation.

MW * 165 g rendement = 118,0 g = 98% 1.2. Bereiding van ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaatMW * 165 g efficiency = 118.0 g = 98% 1.2. Preparation of ethyl 4-amino-3,5-dichlorobenzoate

In een 3 1 kolf met 900 ml tetrachloormethaan wordt (0.7 mol) 115.5 g ethyl-4-amino-benzöaat (2.) opgelost.In a 3 L flask with 900 ml of tetrachloromethane (0.7 mol) 115.5 g of ethyl 4-amino-benzoate (2.) are dissolved.

Na toevoegen van (1,4 mol) 198 g sulfuryl-chloride wordt gedurende 15 uur gerefluxt op een oliebad.After adding (1.4 mol) 198 g of sulfuryl chloride, it is refluxed for 15 hours on an oil bath.

Figure BE1008235A5D00092

Na de reactie wordt in een scheitrechter 500 ml water toegevoegd. Na afscheiden van de tetralaag wordt deze gedroogd met magnesiumsulfaat en ingedampt tot ongeveer 150 ml. Hieraan wordt 100 ml hexaan toegevoegd en gekoeld bij -10°C zodat het ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat (2) uitkristalliseert.After the reaction, 500 ml of water are added in a separating funnel. After separation of the tetra layer, it is dried with magnesium sulfate and evaporated to about 150 ml. To this is added 100 ml of hexane and cooled at -10 ° C so that the ethyl 4-amino-3,5-dichlorobenzoate (2) crystallizes out.

MW = 233,9 g rendement = 95,0 g = 58% 1.3. Verzepen van ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaatMW = 233.9 g efficiency = 95.0 g = 58% 1.3. Saponification of ethyl 4-amino-3,5-dichlorobenzoate

Van het bekomen ethylester (2) wordt (0.36 mol) 85 g opgelost in een 1 1 kolf met een mengsel van 480 ml ethanol en 120 ml water met 34 g natriumhydroxide.(0.36 mol) 85 g of the ethyl ester (2) obtained is dissolved in a 1 l flask with a mixture of 480 ml of ethanol and 120 ml of water with 34 g of sodium hydroxide.

Het mengsel wordt gedurende drie dagen gere-fluxt op een oliebad.The mixture is refluxed on an oil bath for three days.

Figure BE1008235A5D00101

Na de reactie wordt een mengsel van 110 ml water met 90 ml geconcentreerd zoutzuur (11M) toegevoegd. Hierbij ontstaat een witte neerslag. Dit wordt een weinig opgewarmd tot bijna alles opnieuw oplost, daarna laten we het mengsel overnacht bij kamertemperatuur uitkristalliseren.After the reaction, a mixture of 110 ml of water with 90 ml of concentrated hydrochloric acid (11M) is added. This creates a white precipitate. This is warmed up a little until almost everything redissolves, then we let the mixture crystallize overnight at room temperature.

Na affiltreren wordt zuiver ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat gedroogd in de droogstoof.After filtration, pure ethyl 4-amino-3,5-dichlorobenzoate is dried in the drying oven.

MW = 205,9 g rendement = 75,1 g = 96% 2 . Synthese van 4-amino-3.5-dichloorbenzovlalvcine en het overeenkomstige methvlester 2.1. Bereiding van 4-amino-dichloorbenzoylchlorideMW = 205.9 g efficiency = 75.1 g = 96% 2. Synthesis of 4-amino-3,5-dichlorobenzovlalvcine and the corresponding methyl ester 2.1. Preparation of 4-amino-dichlorobenzoyl chloride

In een 1 liter kolf, voorzien van een bolkoeler met Cad,- buis, wordt (0,1 mol) 2 0,6 g 4-amino-3,5-dichloorbenzoëzuur (4) afgewogen en 10 minuten lichtjes gerefluxt in 300 ml dichloormethaan zodat alles goed oplost.In a 1 liter flask equipped with a ball cooler with Cad tube, (0.1 mol) 2 0.6 g of 4-amino-3,5-dichlorobenzoic acid (4) is weighed out and refluxed slightly in 300 ml of dichloromethane for 10 minutes. so that everything dissolves well.

Daarna wordt (0,3 mol) 36 g thionylchloride toegevoegd en gedurende 5 uur gerefluxt, totdat een heldere oplossing bekomen wordt.Then (0.3 mol) 36 g of thionyl chloride is added and refluxed for 5 hours, until a clear solution is obtained.

Figure BE1008235A5D00111

Watervrij milieu is noodzakelijk om hydrolysen van het zuurchloride (5) tot het carbonzuur (4.) te voorkomen .Anhydrous environment is necessary to prevent hydrolysis of the acid chloride (5) to the carboxylic acid (4.).

Bij het gebruik van thionylchloride wordt door een bijreactie ook 4-thionylimino-3,5-dichloorbenzoyl-chloride gevormd. Ongeveer 50% van de aminofunctie wordt in de thionyliminovorm omgezet. Dit percentage wordt groter naarmate langer gerefluxt wordt. In waterig milieu ontstaat terug het vrije amine (5.) .When thionyl chloride is used, a side reaction also produces 4-thionylimino-3,5-dichlorobenzoyl chloride. About 50% of the amino function is converted to the thionylimino form. This percentage increases the longer refluxing takes place. Free amine is formed again in an aqueous medium (5.).

Het reaciemengsel wordt volledig drooggedampt met behulp van een rotavapor en als dusdanig verder gebruikt.The reaction mixture is evaporated completely to dryness using a rotary evaporator and further used as such.

2.2. Bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine2.2. Preparation of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine

Het ruw zuurchloride (£) , (0,1 mol) uit de vorige stap wordt opgelost in 300 ml dichloormethaan.The crude acid chloride (1) (0.1 mol) from the previous step is dissolved in 300 ml of dichloromethane.

Hieraan wordt een oplossing, van (0,45 mol) 33,75 g glycine en (0,45 mol) 18 g natriumhydroxide in 150 ml water, toegedruppeld. De vrije aminogroep van glycine reageert met het zuurchloride via een nucleofiele additie en vormt 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine (6).To this is added a solution of (0.45 mol) 33.75 g glycine and (0.45 mol) 18 g sodium hydroxide in 150 ml water. The free amino group of glycine reacts with the acid chloride via a nucleophilic addition to form 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine (6).

Het reactiemengsel wordt, in een kolf met luchtkoeler, gedurende een ganse nacht bij kamertemperatuur geroerd.The reaction mixture is stirred overnight at room temperature in a flask with an air cooler.

Na reactie wordt de waterlaag met geconcentreerd zoutzuur op pH = 3 gebracht. Na affiltreren van de neerslag bekomen we 20,72 g ruw product.After reaction, the water layer is brought to pH = 3 with concentrated hydrochloric acid. After filtering off the precipitate, we obtain 20.72 g of crude product.

Figure BE1008235A5D00121

(5) (6)(5) (6)

Als nevenreactie, wordt door de additie van water ongeveer 10% van het oorspronkelijk zuur (4.) gevormd.As a side reaction, about 10% of the original acid (4.) is formed by the addition of water.

Door omkristallisatie in 45 ml opgewarmd azijnzuur kan 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine (6) opgezuiverd worden. Het filtraat laat men langzaam uitkristalliseren, na affiltreren en wassen met een kleine hoeveelheid azijnzuur bekomen we een 100% zuivere verbinding.4-Amino-3,5-dichlorobenzoylglycine (6) can be purified by recrystallization in 45 ml of warmed acetic acid. The filtrate is allowed to crystallize slowly, after filtration and washing with a small amount of acetic acid we obtain a 100% pure compound.

MW = 263 g rendement (2 stappen) = 15,6 g * 58% 2.3. Bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine methylesterMW = 263 g efficiency (2 steps) = 15.6 g * 58% 2.3. Preparation of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine methyl ester

Analoog als voor de bereiding van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine wordt het ruwe zuurchloride (.5) , bekomen uit 0,1 mol 4-amino-3,5-dichlorobenzoëzuur (4.) opgelost in een 1 1 kolf met 200 ml dichloormethaan.Analogous to the preparation of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine, the crude acid chloride (.5) obtained from 0.1 mol of 4-amino-3,5-dichlorobenzoic acid (4.) is dissolved in a 1 L flask with 200 ml of dichloromethane.

Een oplossing, van (0,2 mol) 25,1 g glycinehy-drochloride methylester in 150 ml dichloormethaan en (0,3 mol) 30,3 g triethylamine, wordt aan het zuur-chloride toegedruppeld en overnacht geroerd bij kamertemperatuur .A solution of (0.2 mol) 25.1 g glycine hydrochloride methyl ester in 150 ml dichloromethane and (0.3 mol) 30.3 g triethylamine is added dropwise to the acid chloride and stirred overnight at room temperature.

Figure BE1008235A5D00131

(ÿ w(ÿ w

Triëthylamine wordt toegevoegd om het zout zuur van het glycinehydrochloridemethylester te binden, zodat de vrije aminofunctie een nucleofiele additie kan uitvoeren op de carbonylgroep van het zuurchloride.Triethylamine is added to bind the hydrochloric acid of the glycine hydrochloride methyl ester so that the free amino function can perform a nucleophilic addition on the carbonyl group of the acid chloride.

Na reactie wordt het triëthylaminehydrochloride en de overgebleven vrije base met 120 ml water geëxtraheerd .After reaction, the triethylamine hydrochloride and the remaining free base are extracted with 120 ml of water.

De afgescheiden organische laag wordt gedroogd met magnesiumsulfaat. Na uitkristallisatie wordt de dichloor- methaanlaag afgefiltreerd. Het filtraat wordt ingedampt terwijl 80 ml tetrachloormethaan toegevoegd wordt, hieruit wordt een tweede worp gehaald.The separated organic layer is dried with magnesium sulfate. After crystallization, the dichloromethane layer is filtered off. The filtrate is evaporated while 80 ml of tetrachloromethane is added, a second throw is taken from this.

MW - 277 g rendement (2 stappen) * 19,7 g = 69% B. KOPPELINGSREACTIES LIGAND MET SPACER : 1. Synthese van 6-trifluoracetvlamine-l-hexanoylchlorideMW - 277 g efficiency (2 steps) * 19.7 g = 69% B. LIGAND COUPLING REACTIONS WITH SPACER: 1. Synthesis of 6-trifluoroacetvlamine-l-hexanoyl chloride

Het uiteindelijke doel is een chemisch ligand te vormen door 6-aminohexaanzuur (8) te koppelen met het aromatisch aminesubstituent van 4-amino-3,5-dichloor-benzoylglycine methylester (7).The ultimate goal is to form a chemical ligand by coupling 6-aminohexanoic acid (8) with the aromatic amine substituent of 4-amino-3,5-dichloro-benzoylglycine methyl ester (7).

Daar de koppeling van de aminofunctie van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine met de kolommatrix moeilijk verloopt worden spacers met vrije actieve groepen vooraf aan de aromatische aminofunctie gekoppeld. Om ringsluiting, met vorming van caprolactam tot gevolg, te vermijden wordt de aminofunctie van de alifatische keten (8.) vooraf beschermd met een later terug af te splitsen trif luoracetylgroep. (13.) 1.1. Bereiding van 6-trifluoracetylamine-hexaanzuurSince the coupling of the amino function of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine with the column matrix is difficult, spacers with free active groups are coupled in advance to the aromatic amino function. To avoid ring closure, resulting in the formation of caprolactam, the amino function of the aliphatic chain (8.) is pre-protected with a trifluoroacetyl group which can be cleaved off later. (13.) 1.1. Preparation of 6-trifluoroacetylamine hexanoic acid

In een 500 ml kolf wordt (0,15 mol) 19,8 g 6-aminohexaanzuur (8) opgelost in 300 ml dichloormethaan, samen met (0,16 mol) 13,43 g pyridine.In a 500 ml flask, (0.15 mol) 19.8 g of 6-aminohexanoic acid (8) is dissolved in 300 ml of dichloromethane together with (0.16 mol) 13.43 g of pyridine.

Hieraan wordt (0,20 mol) 42 g trifluor-azijnzuuranhydride toegedruppeld en gedurende 5 uur geroerd bij kamertemperatuur.To this (0.20 mol) 42 g of trifluoroacetic anhydride are added dropwise and stirred at room temperature for 5 hours.

Figure BE1008235A5D00141

Deze oplossing wordt bij kamertemperatuur geroerd tot een heldere oplossing bekomen wordt, die als dusdanig verder gebruikt wordt.This solution is stirred at room temperature until a clear solution is obtained, which is further used as such.

Als nevenreactie wordt een deel van het carbonzuur (9) omgezet tot het gemengd anhydride, wat later zeer snel in het zuurchloride (i0) omgezet wordt.As a side reaction, part of the carboxylic acid (9) is converted into the mixed anhydride, which is later very quickly converted into the acid chloride (10).

1.2. Bereiding van 6-trifluoracetylamine-hexanoylchloride1.2. Preparation of 6-Trifluoroacetylamine Hexanoyl Chloride

Aan de hierboven bekomen oplossing van hexa-anzuur met beschermde aminogroep (9) wordt (0,25 mol) 19,8 g thionylchloride toegevoegd en gedurende 30 minuten lichtjes verwarmd in oliebad van 50 °C.To the above obtained solution of hexanoic acid with protected amino group (9) is added (0.25 mol) 19.8 g of thionyl chloride and slightly heated in oil bath at 50 ° C for 30 minutes.

De kolf wordt hiervoor voorzien van een bol-koeler en een CaCl2-buis.The flask is equipped with a ball cooler and a CaCl2 tube for this.

Figure BE1008235A5D00151

Het mengsel wordt overnacht verder geroerd bij kamertemperatuur en daarna volledig drooggedampt met de rotavapor.The mixture is further stirred at room temperature overnight and then evaporated completely to dryness with the rotary evaporator.

Gebaseerd op 1JC-NMR vinden we dat ongeveer 85% van het carbonzuur in het zuurchloride werd omgezet.Based on 1JC-NMR, we find that about 85% of the carboxylic acid was converted to the acid chloride.

2. Synthese van 4-N-fe-amino-l-carbonvlpentvl)-3,5-dichloorbenzovlalvcine 2.1. Bereiding van 4-N-(l-carbonylpentyl-6-trifluor- acetylamine)-3, 5-dichloorbenzoylglycinemethylester2. Synthesis of 4-N-fe-amino-1-carbonylpentyl) -3,5-dichlorobenzovlalvine 2.1. Preparation of 4-N- (1-carbonylpentyl-6-trifluoroacetylamine) -3,5-dichlorobenzoylglycine methyl ester

In een 500 ml kolf wordt (0,05 mol) 13,8 g 4-araino-3,5-dichloorbenzoylglycine methylester (2) en (0,17 mol) 13,4 g pyridine opgelost in 250 ml dichloormethaan, waarbij gedurende 30 minuten lichtjes opgewarmd wordt.In a 500 ml flask (0.05 mol) 13.8 g of 4-araino-3,5-dichlorobenzoylglycine methyl ester (2) and (0.17 mol) 13.4 g of pyridine are dissolved in 250 ml of dichloromethane, for 30 warmed slightly for minutes.

Figure BE1008235A5D00152

Het ingedampte ruw zuurchloride (20), bekomen uit 0,15 mol 6-aminohexaanzuur, wordt opgelost in 100 ml dichloormethaan en aan de methylester (2) oplossing toegedruppeld. Het mengsel wordt gedurende 5 dagen geroerd bij kamertemperatuur, na 24 uur verschijnen de eerste fijne witte kristallen (.11) .The evaporated crude acid chloride (20), obtained from 0.15 mol of 6-aminohexanoic acid, is dissolved in 100 ml of dichloromethane and added dropwise to the methyl ester (2) solution. The mixture is stirred at room temperature for 5 days, after 24 hours the first fine white crystals (.11) appear.

De bekomen oplossing wordt in een scheitrechter gewassen met 200 ml 0,5 N zoutzuur. Hierbij ontstaat een kleverige emulsie welke afgefiltreerd wordt en goed gewassen met dichloormethaan.The resulting solution is washed in a separatory funnel with 200 ml of 0.5 N hydrochloric acid. This produces a sticky emulsion which is filtered off and washed well with dichloromethane.

MW = 476 g rendement = 17,4 g = 73% 2.2. Bereiding van 4-N-(6-amino-l-carbonylpentyl)-3,5-dichloorbenzoylglycineMW = 476 g efficiency = 17.4 g = 73% 2.2. Preparation of 4-N- (6-amino-1-carbonylpentyl) -3,5-dichlorobenzoylglycine

In een 250 ml kolf wordt (0,075 mol) 3 g natriumhydroxide opgelost in 90 ml methanol.In a 250 ml flask (0.075 mol) 3 g of sodium hydroxide are dissolved in 90 ml of methanol.

Hieraan wordt (0,03 mol) 14,28 g 4-N-(l-carbo-nylpentyl-6-trifluoracetylamine)-3,5-dichloorbenzoyl-glycine methylester (11) toegevoegd en gedurende 30 minuten verwarmd in een oliebad van 60°C. Daarna wordt gedurende twee dagen geroerd bij kamertemperatuur.To this (0.03 mol) 14.28 g of 4-N- (1-carbonyl-pentyl-6-trifluoroacetylamine) -3,5-dichlorobenzoyl-glycine methyl ester (11) is added and heated in an oil bath of 60 for 30 minutes ° C. It is then stirred at room temperature for two days.

Figure BE1008235A5D00161

Na reactie wordt 50 ml water toegevoegd en wordt de pH van het mengsel op 5,5 gebracht.After reaction, 50 ml of water are added and the pH of the mixture is adjusted to 5.5.

Met de rotavapor wordt een deel van de methanol uitgedampt tot de eerst fijne kristallen (12.) verschijnen. We laten de oplossing overnacht verder uitkristalliseren en verwezenlijkt de koppeling van 4- amino-3,5-dicloorbenzoylglycine met een alifatische C6-spacer.With the rotavapor, part of the methanol is evaporated until the first fine crystals (12.) appear. We allow the solution to further crystallize overnight and effect the coupling of 4-amino-3,5-diclorobenzoylglycine with an aliphatic C6 spacer.

MW = 366 g rendement = 9,1 g = 83% 3. Synthese van 2.6-dichloor-4-carbonvlaziinzuur-M^hvdroxv of 2 *.4'-dihvdroxv)-azobenzeenMW = 366 g efficiency = 9.1 g = 83% 3. Synthesis of 2,6-dichloro-4-carbonvlazacic acid-M-h-hydroxv or 2 * .4'-dihvdroxv) -azobenzene

Op analoge wijze wordt een diazokoppeling van 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine met een aromatische spacer verwezenlijkt.In an analogous manner, a diazo coupling of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine with an aromatic spacer is effected.

In 100 ml erlenmeyer wordt (0,48 mmol) 125 mg 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine afgewogen en opgelost in 5 ml koud demi-water (pH > 7). Daarna wordt de pH met geconcentreerd zoutzuur op 1 à 1,5 gebracht, waarbij een fijne suspensie ontstaat.In 100 ml conical flask (0.48 mmol), 125 mg of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine are weighed and dissolved in 5 ml of cold demi water (pH> 7). The pH is then adjusted to 1 to 1.5 with concentrated hydrochloric acid to form a fine suspension.

De oplossing wordt afgesloten van het licht in een ijsbad geplaatst. Terwijl geroerd wordt voegen we 4 ml (1,5 N) natriumnitriet toe, de pH wordt regelmatig gecontroleerd en op 1 à 1,5 gehouden.The solution is sealed from the light and placed in an ice bath. While stirring, we add 4 ml (1.5 N) sodium nitrite, the pH is checked regularly and kept at 1 to 1.5.

Na 30 minuten wordt de oplossing gefiltreerd, aan het gele filtraat wordt voorzichtig 2 g ammonium-sulfamaat, opgelost in 2 ml demi-water, toegdruppeld. Dit totdat er geen belletjes meer gevormd worden. (1 uur, 4°C, donker)After 30 minutes, the solution is filtered, 2 g of ammonium sulfamate, dissolved in 2 ml of demineralised water, is carefully added dropwise to the yellow filtrate. This until no more bubbles are formed. (1 hour, 4 ° C, dark)

Figure BE1008235A5D00171

Als test worden enkele druppels van de actieve diazoverbinding gemengd met enkele druppels dimethyl-N-aniline, er moet onmiddellijk een diep rode kleur verschijnen.As a test, a few drops of the active diazo compound are mixed with a few drops of dimethyl-N-aniline, a deep red color should immediately appear.

De hier bekomen diazo-oplossing wordt gebruikt voor de koppeling aan een kolommatrix welke vooraf met benzeenringen bezet werd. (zie deel IV)The diazo solution obtained here is used for coupling to a column matrix which has been previously occupied with benzene rings. (see part IV)

Na de koppeling aan de kolommatrix wordt de 5 resterende actieve diazoverbinding afgef iltreerd. Aan het bekomen filtraat wordt, (1 mmol) 94 mg fenol of (lmmol) 110 mg resorcinol opgelost in 5 ml koud demi-water pH = 1,5 toe- gevoegd en gedurende 15 uur in de ijskast geplaatst.After coupling to the column matrix, the remaining active diazo compound is filtered off. To the obtained filtrate, (1 mmole) 94 mg phenol or (1 mmole) 110 mg resorcinol dissolved in 5 ml cold demineralized water pH = 1.5 is added and placed in the refrigerator for 15 hours.

) De ontstane rode neerslag wordt na affiltreren en wassen met demiwater pH = 1,5 gebruikt voor de karakterisatie.The resulting red precipitate is used for characterization after filtration and washing with demineralised water pH = 1.5.

Figure BE1008235A5D00181

C. KOPPELING LIGAND AAN KOLOMMATRIXC. LIGAND CLUTCH TO COLUMN MATRIX

Voor het koppelen van de aminofunctie van het ligand wordt volgens de uitvinding een kolommatrix op agarose basis nl. sepharose en een silicamatrix gekozen.According to the invention, an agarose-based column matrix, namely sepharose, and a silica matrix are selected for coupling the amino function of the ligand.

De sepharose affiniteitsmatrixen hebben een open poriën structuur, zodat binnenin de matrix plaats vrij is voor het vasthechten van (grote) ligandmoleculen.The sepharose affinity matrices have an open pore structure, so that space is available inside the matrix for the attachment of (large) ligand molecules.

Even belangrijk zijn de extreem lage non-specifieke interacties van de matrix zelf en de korrelvormige structuur die zorgt voor de goede floweigenschappen.Equally important are the extremely low non-specific interactions of the matrix itself and the granular structure that ensures the good flow properties.

Sepharose-matrixen zijn in de handel verkrijgbaar met verschillende soorten actieve groepen, al dan niet met spacer, waaraan aminogroepen onder milde condities kunnen gekoppeld worden.Sepharose matrices are commercially available with different types of active groups, with or without spacer, to which amino groups can be coupled under mild conditions.

1. Koppeling aan Epoxv-activated Sepharose 6B1. Coupling to Epoxv-activated Sepharose 6B

1.1. Reactiemechanisme1.1. Response mechanism

Deze kolommatrix is standaard voorzien van een lange (12 atomen) spacer eindigend met een epoxygroep en is uiterst geschikt voor affiniteitschromatografie met kleine ligandmoleculen.This column matrix is standard equipped with a long (12 atoms) spacer ending with an epoxy group and is very suitable for affinity chromatography with small ligand molecules.

Figure BE1008235A5D00191

Door nucleofiele additie van een hydroxylgroep of een aminofunctie aan de reactieve epoxygroep wordt een zeer stabiel ringopeningsprodukt gevormd.A very stable ring-opening product is formed by nucleophilic addition of a hydroxyl group or an amino function to the reactive epoxy group.

1.2. Koppelingscondities1.2. Coupling conditions

Nadat 1 g gevriesdroogde kolommatrix gewassen werd met 100 ml demi-water, moet de koppelingsbuffer ommiddellijk aan het gel toegevoegd worden. Anders worden de epoxygroepen vooraf gehydrolyseerd.After 1 g of freeze-dried column matrix was washed with 100 ml of demineralised water, the coupling buffer should be immediately added to the gel. Otherwise, the epoxy groups are hydrolyzed beforehand.

Voor de koppeling bij 55°C werd het te reageren mengsel in een erlenmeyer in een droogstof geplaatst en regelmatig omgeschud.Before coupling at 55 ° C, the mixture to be reacted was placed in a conical flask in a desiccant and shaken regularly.

Na de koppelingsreactie wordt alternerend gewassen met in totaal 600 ml 0,1 M natriumhydroxide buffer (pH=ll) en 0,1 M acetaat buffer (pH=3) welke beide 0,5 M NaCl bevatten.After the coupling reaction, it is washed alternately with a total of 600 ml of 0.1 M sodium hydroxide buffer (pH = 11) and 0.1 M acetate buffer (pH = 3), both of which contain 0.5 M NaCl.

1.3. Titratiecurve1.3. Titration curve

Zoals afgebeeld in figuur 1, tonen de vier titratiecurves met Epoxy-activated Sepharose 6B aan dot de rechtstreekse koppeling via het aromatisch amine is niet mogelijk is. Ook de koppeling via een fenol spacer is weinig efficiënt en bindt ongeveer 5 μπιοί gebonden A.D.B.G mole- culen per ml gel.As shown in Figure 1, the four titration curves with Epoxy-activated Sepharose 6B demonstrate that direct coupling via the aromatic amine is not possible. Also the coupling via a phenol spacer is not very efficient and binds approximately 5 μπιοί bound A.D.B.G molecules per ml of gel.

Via een alifatische spacer is het mogelijk 10 Aimol/ml gel van het A.D.B.G. te koppelen.Via an aliphatic spacer it is possible to use 10 Aimol / ml gel of the A.D.B.G. to link.

Het beste resultaat wordt bekomen met resorcinol of aniline als spacer, waarbij 15-20 /zmol/ml gekoppeld werd.The best result is obtained with resorcinol or aniline as a spacer, coupling 15-20 / zmol / ml.

1.4. NMR-spectroscopie1.4. NMR spectroscopy

Ongeveer 1 ml van het, via de resorcinol spacer met gediazoteerd 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine A.D.B.G., gekoppelde epoxy-sepharosegel wordt in een NMR buis gebracht. (90% H20, 10% d20, pH=10)Approximately 1 ml of the epoxy-sepharose gel coupled via the resorcinol spacer with diazotized 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine A.D.B.G. is placed in an NMR tube. (90% H20, 10% d20, pH = 10)

Het ‘H-NMR spectrum van dit gel ziet u in addendum 3.The "H-NMR spectrum of this gel is shown in addendum 3.

Als we dit spectrum vergelijken met het vroeger opgenomen 2,6-dichloro-4-carbonyl-azijnzuur-2', 4'-dihydroxy-azobenzeen kunnen we aan de hand van de aromatische waterstoffen van A.D.B.G. en de 4 zichtbare (beweeglijke) alifatische waterstoffen van de spacer berekenen dat ongeveer 30% van de spacers (12 atomen) met A.D.B.G. bezet is.If we compare this spectrum with the previously included 2,6-dichloro-4-carbonyl-acetic acid-2 ', 4'-dihydroxy-azobenzene, we can use the aromatic hydrogens of A.D.B.G. and the 4 visible (mobile) aliphatic hydrogens of the spacer calculate that about 30% of the spacers (12 atoms) with A.D.B.G. is busy.

D. VOORBEELDEND. EXAMPLES

1. Voorbeeld 1 : elutiepatroon van standaardoplossing (H20) met als ß-agonisten (salbutamol, fenoterol, cimbuterol, Clenbuterol, mabuterol, clenpenterol) en als ß-antagonist (propanolol) voor de Epoxy-Activated sepharose met 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine als chemisch ligand gekoppeld via resorcinol-spacer.1. Example 1: Elution pattern of standard solution (H 2 O) with β agonists (salbutamol, fenoterol, cimbuterol, Clenbuterol, mabuterol, clenpenterol) and as β antagonist (propanolol) for the Epoxy-Activated sepharose with 4-amino-3, 5-dichlorobenzoylglycine as chemical ligand coupled via resorcinol spacer.

De beste resultaten worden bekomen met resorci-nol als aromatische spacer (fig. 2). Hierbij kunnen alle teststoffen op de kolom vastgehouden worden bij spoelen met de spoelbuffer, met uitzondering van salbutamol dat een te zwakke affiniteit vertoont.The best results are obtained with resorcinol as an aromatic spacer (fig. 2). All test substances can be retained on the column when rinsing with the rinsing buffer, with the exception of salbutamol, which shows too weak an affinity.

Cimbuterol en 2,4-aminophenylethanolamnine (2.4.A.P.E.A.) vinden we voor 100% terug in de 55mM zout fractie, ook voor mabuterol wordt de affiniteit bij deze zoutconcentratie verbroken. Voor Clenbuterol gebeurt dit pas bij een spoelen met 110 mM zout. Clenpenterol vinden we slechts voor 25% in deze fractie terug, wat op een sterkere affiniteit wijst. De sterkste interacties treden op voor fenoterol en propanolol, die voor het grootste deel in de 300mM zoutfractie terug te vinden zijn.Cimbuterol and 2,4-aminophenylethanolamnine (2.4.A.P.E.A.) can be found 100% in the 55mM salt fraction, the affinity for mabuterol is also broken at this salt concentration. For Clenbuterol, this only happens when rinsing with 110 mM salt. Clenpenterol can only be found in this fraction for 25%, which indicates a stronger affinity. The strongest interactions occur for fenoterol and propanolol, most of which can be found in the 300mM salt fraction.

Deze kolom werd tevens getest met een 1 mM acetaat spoelbuffer (pH=5,2), waarbij de OH groep van de aromatische spacer gedeprotoneerd is. Ook hier werd hetzelfde verloop teruggevonden.This column was also tested with a 1 mM acetate rinse buffer (pH = 5.2), with the OH group of the aromatic spacer being deprotonated. The same course was also found here.

2. Voorbeeld 2 : het zelfde kolommateriaal als in voorbeeld 1 wordt ditmaal getest met gespikte kalverurine.2. Example 2: The same column material as in Example 1 is tested this time with spiked calf urine.

Hiervoor wordt 1 ml blanco kalverurine gemengd met lml van het standaard mengsel beschreven in voorbeeld 1 en off-line op de lange Epoxy-resor-A.D.B.G. kolom gebracht.For this, 1 ml of blank calf urine is mixed with 1 ml of the standard mixture described in Example 1 and off-line on the long Epoxy resor-A.D.B.G. column.

Daarna wordt gespoeld met 20 ml spoelbuffer (ImM fosfaat, pH=7), gevolgd door 20 ml elutiebuffer met traag stijgende zoutconcentratie (11 mM, 33 mM, 55 mM, 110 mM, 330 mM en 550 mM).Then rinse with 20 ml of rinse buffer (ImM phosphate, pH = 7), followed by 20 ml of elution buffer with slowly rising salt concentration (11 mM, 33 mM, 55 mM, 110 mM, 330 mM and 550 mM).

In de grafiek (fig.4.) zien we dezelfde elutievolgorde terug als voor een waterig mengsel. De teststoffen worden reeds na toevoegen van lagere zoutconcentraties geëlueerd.In the graph (fig. 4.) we see the same elution order as for an aqueous mixture. The test substances are already eluted after the addition of lower salt concentrations.

Dit kan verklaard worden door het reeds aanwezige zout in de urine. Tijdens de spoelstap van 20 ml elueren histamine, 2.4.A.P.E.A., salbutamol en een deel van de toegevoegde cimbuterol van de kolom. Clenbuterol, fenoterol, mabuterol, clenpenterol en propanol blijft op de kolom.This can be explained by the salt present in the urine. During the 20 ml rinsing step, histamine, 2.4.A.P.E.A., salbutamol and part of the added cimbuterol elute from the column. Clenbuterol, fenoterol, mabuterol, clenpenterol and propanol remain on the column.

Claims (9)

1. Hippuurzuurderivaat dat in de kern meermaals gesubstitueerd is, met het kenmerk dat het de volgende formule bezit :1. Hippuric acid derivative which is multi-substituted in the core, characterized in that it has the following formula:
Figure BE1008235A5C00231
Figure BE1008235A5C00231
 waarin r6 = nh2, oh, conh2, so2nh2where r6 = nh2, oh, conh2, so2nh2
Figure BE1008235A5C00232
Figure BE1008235A5C00232
 R7 en/of R8 = Cl, Br, OH, CH2OH, CP3, N02, F R9 YR7 and / or R8 = Cl, Br, OH, CH2OH, CP3, NO2, F R9 Y 2. Toepassing van het hippuurzuurderivaat volgens conclusie 1, in een analysemethode bestemd om stoffen in het bijzonder van het type ß-agonisten en ß-antagonisten in urine-, vlees- of bloedmonsters op te sporen.Use of the hippuric acid derivative according to claim 1, in an analysis method intended for detecting substances in particular of the type β agonists and β antagonists in urine, meat or blood samples. 3. Analysemethode bestemd om groeistimulatoren in het bijzonder van het type ß-agonisten alsook ß-antagonisten in urine-, vlees- of bloedmonsters op te sporen, met het kenmerk dat men het monster op een affi-niteitsschromatografiekolom brengt met de aromatische meermaals gesubstitueerd hippuurzuurderivaat volgens conclusie 1 als chemisch ligand.3. Analytical method intended to detect growth stimulators, in particular of the type β agonists as well as β antagonists in urine, meat or blood samples, characterized in that the sample is placed on an affinity chromatography column with the aromatic multi-substituted hippuric acid derivative according to claim 1 as a chemical ligand. 4. Analysemethode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het hippuurzuurderivaat uit 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine bestaat.Analysis method according to claim 1, characterized in that the hippuric acid derivative consists of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine. 5. Vulmateriaal voor affiniteitschromato-grafie-kolom bestemd voor de analysemethode volgens conclusie 1, met het kenmerk dat het uit een hippuur-zuurderivaat volgens conclusie 1 bestaat als chemisch ligand dat op een klassieke kolommatrix met behulp van een aromatische of alifatische verbinding als spacer wordt gebonden.Filling material for affinity chromatography column intended for the analysis method according to claim 1, characterized in that it consists of a hippuric acid derivative according to claim 1 as a chemical ligand which is spaced on a classical column matrix using an aromatic or aliphatic compound be bound to. 6. Vulmateriaal volgens conclusie 4, met het kenmerk dat het hippuurzuurderivaat uit 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine bestaat.Filling material according to claim 4, characterized in that the hippuric acid derivative consists of 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine. 7. Vulmateriaal volgens conclusie 2, met het kenmerk dat 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine op een Epoxygeactiveerde silica of Sepharose drager met behulp van resorcinol of fenol als spacer wordt gebonden.Filling material according to claim 2, characterized in that 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine is bound on an Epoxy-activated silica or Sepharose support using resorcinol or phenol as a spacer. 8. Werkwijze om een vulmateriaal te vervaardigen volgens een der conclusies 5 tot en met 7, met het kenmerk dat van fenol of resorcinol gediazoteerd 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine op deze gekoppelde aromaten bindt.A method of manufacturing a filler material according to any one of claims 5 to 7, characterized in that diazotized 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine of phenol or resorcinol binds to these coupled aromatics. 9. Werkwijze om 4-amino-3,5-dichloorbenzoylglycine te synthetiseren uit ethyl-4-aminobenzöaat dat met sulfurylchloride gedurende 15 uur met reflux opgewarmd wordt op een oliebad en uit hexaan uitgekristalli-zeerd en het bekomen ethyl-4-amino-3,5-dichloorbenzöaat met thionylchloride gedurende 5 uur met reflux opwarmt.9. Method for synthesizing 4-amino-3,5-dichlorobenzoylglycine from ethyl 4-aminobenzoate which is heated with reflux for 15 hours on an oil bath with sulfuryl chloride and crystallized from hexane and the resulting ethyl-4-amino-3 , 5-dichlorobenzoate with thionyl chloride warms with reflux for 5 hours.
BE9400323A 1994-03-25 1994-03-25 ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS. BE1008235A5 (en)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400323A BE1008235A5 (en) 1994-03-25 1994-03-25 ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS.
CN 95192269 CN1144521A (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists
PCT/BE1995/000027 WO1995026330A1 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists
EP95912979A EP0751929A1 (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analysis method for testing for traces of beta-agonists and beta-antagonists
JP7524879A JPH10500668A (en) 1994-03-25 1995-03-24 Analytical method for testing trace amounts of β-agonists and β-antagonists

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BE9400323A BE1008235A5 (en) 1994-03-25 1994-03-25 ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS.
BE9400323 1994-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BE1008235A5 true BE1008235A5 (en) 1996-02-20

Family

ID=3888065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BE9400323A BE1008235A5 (en) 1994-03-25 1994-03-25 ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS.

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0751929A1 (en)
JP (1) JPH10500668A (en)
CN (1) CN1144521A (en)
BE (1) BE1008235A5 (en)
WO (1) WO1995026330A1 (en)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100357738C (en) * 2004-03-26 2007-12-26 博奥生物有限公司 Method of detecting small molecule compound and its special biochip
TW200902504A (en) * 2007-03-28 2009-01-16 Sumitomo Chemical Co Manufacturing method of trichloropyrimidine compound
US11090313B2 (en) 2010-05-20 2021-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting muscle atrophy
CA2800109C (en) 2010-05-20 2020-06-30 University Of Iowa Research Foundation Methods for inhibiting muscle atrophy
US9295664B2 (en) 2011-06-06 2016-03-29 University Of Iowa Research Foundation Methods for lowering blood glucose
CN109633031A (en) * 2019-01-23 2019-04-16 洛阳理工学院 A kind of detection method of Ractopamine

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2738631A1 (en) * 1976-08-26 1978-03-02 Lilly Co Eli 7- (2-BENZOYLAMINO) -ACETAMIDO-CEPHALOSPORINE AND THE METHOD FOR MANUFACTURING IT
WO1993003382A2 (en) * 1991-08-01 1993-02-18 Pharmaceutical Discovery Corporation Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE154848T1 (en) * 1992-03-02 1997-07-15 Enfer Tech Ltd VETERINARY MONITORING OF DRUG RESIDUES IN FRESH MEAT

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2738631A1 (en) * 1976-08-26 1978-03-02 Lilly Co Eli 7- (2-BENZOYLAMINO) -ACETAMIDO-CEPHALOSPORINE AND THE METHOD FOR MANUFACTURING IT
WO1993003382A2 (en) * 1991-08-01 1993-02-18 Pharmaceutical Discovery Corporation Characterization of specific drug receptors with fluorescent ligands

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 095, no. 13, 28 September 1981, Columbus, Ohio, US; abstract no. 109800, MIHARA K ET AL: "Metabolism of tolclofos-methyl in rats and mice" *
HANSELAER R ET AL: "N-Acylamino acids and peptides. VII. Synthesis of oxygen-sensitive N-acylglycines (N-caffeoylglycine, N-protocatechuoylglycine and N-galloylglycine) and a N-acyldipeptide (N-caffeoylglycyl-L-phenylalanin", BULL. SOC. CHIM. BELG. (BSCBAG,00379646);83; VOL.92 (11-12); PP.1029-37, UNIV. GHENT;LAB. PLANT BIOCHEM.; GHENT; B-9000; BELG. (BE) *
HORIBA M ET AL: "Pharmacokinetic studies of mabuterol, a new selective.beta.2-stimulant. II: Urinary metabolites of mabuterol in rats and their pharmacological effects", ARZNEIM.-FORSCH. (ARZNAD,00044172);84; VOL.34 (11A); PP.1668-79, KAKEN PHARM. CO. LTD.;RES. LAB.; TOKYO; 113; JAPAN (JP) *
NIPPON NOYAKU GAKKAISHI (NNGADV,03851559);81; VOL.6 (1); PP.65-74, SUMITOMO CHEM. CO.;PESTICIDES DIV.; TAKARAZUKA; 665; JAPAN *

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10500668A (en) 1998-01-20
CN1144521A (en) 1997-03-05
WO1995026330A1 (en) 1995-10-05
EP0751929A1 (en) 1997-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2071036A3 (en) Methods for identifying RNA-binding compounds
JP4298201B2 (en) Metal chelating composite
Yang et al. Comparative analysis of cleavable azobenzene-based affinity tags for bioorthogonal chemical proteomics
US4016146A (en) Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies, and use
DE60225299T2 (en) NUCLEOPHILIC FLUORATION AT FIXED PHASE
BE1008235A5 (en) ANALYSIS METHOD SUITED TO DETECT BETA AGONISTS AND BETA ANAGONISTS.
US4021481A (en) Amido derivatives of 2,4,6-triiodobenzoic acids containing at least one N-hydroxyalkyl and at least two hydroxyl groups
JPH03504801A (en) Labeled nucleic acid probe
Marroquin et al. The binding of 2-acetylaminofluorene to rat liver ribonucleic acid in vivo
RS50662B (en) Novel process for synthesizing and a novel crystal form of agomelatin as well as pharmaceutical preparations containing these
CN101970100A (en) Novel chiral selectors and stationary phases for separating enantiomer mixtures
CN109111478B (en) Benfotiamine derivative, preparation method and pharmaceutical composition thereof
EP1937243A2 (en) Naphthyl derivatives as inhibitors of beta-amyloid aggregation
Bonilla et al. Ce (SO 4) 2-catalysed the highly diastereoselective synthesis of tetrahydroquinolines via an imino Diels Alder ABB′ type reaction and their in vivo toxicity and imaging in zebrafish embryos
Counsell et al. Potential organ or tumor imaging agents. 11. Radioiodinated tyramines
JP2004508448A5 (en)
Noggle Jr et al. Liquid chromatographic determination of the enantiomeric composition of amphetamine prepared from norephedrine and norpseudoephedrine
CA2803225C (en) Process for the preparation of contrast agents
Wheler et al. Separation and Quantitation of O-Phthalaldehyde Derivatives of Taurine and Related Compounds in a High Performance Liquid Chromatography (HPLC) System
JP4212652B2 (en) Trans-platinum compounds and diagnostic kits
JP4008446B2 (en) Β-Benzyloxyaspartic acid derivatives having disubstituents on the benzene ring
US6410700B1 (en) Glycan derivatives
JPS5852244A (en) Bromobenzene compound useful for x-ray contrast agent
AU2007209853A1 (en) Divalent metal ion sensors and binders
Boto et al. Synthesis and characterization of mono-and dicarboxyalkyloxacarbocyanines

Legal Events

Date Code Title Description
RE Patent lapsed

Owner name: UNIVERSITEIT GENT LABORATORIUM ORGANISCHE CHEMIE

Effective date: 19970331

Owner name: DE BLOCK GEERT

Effective date: 19970331

Owner name: DIENST LANDBOUWKUNDIG ONDERZOEK DLO RIJKSKWALITEI

Effective date: 19970331