AT394577B - Polydom, verfahren zu seiner herstellung und immunodiagnostische verfahren - Google Patents
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Description
AT 394 577 B
Diese Erfindung bezieht sich auf Antikörper, die doppelte Spezifitäten aufweisen. Nach einem anderen Aspekt bezieht sie sich auf immunodiagnostische und immunotherapeutische Verfahren. Nach einem weiteren Aspekt bezieht sie sich auf Hybridome und verwandte monoklonale Antikörpertechnologie.
Die Antigen-Antikörperreaktion wird bereits routinemäßig in verschiedenen praktischen Anwendungen ausgewertet und wirdinweitemUmfange untersucht, um deren Wertauf anderen,bishernichterprobten Anwendungsgebieten festzustellen. Beispielsweise können Serumantikörper, die bei einer Immunantwort eines Wirtstieres auf ein Immunogen gebildet werden, in Affinitätsreinigungsverfahren benützt werden, um das Immunogen aus Lösungen zu isolieren, in welchen es in nur geringfügigen Mengen vorhanden ist.
Unter anderen Umständen, falls das Immunogen ein krankheitsassoziiertes Antigen ist, kann dessen Anwesenheit in dem Serum eines Patienten oder in anderer Körperflüssigkeit unter Anwendung von Immunoassay oder immunometrischen Methoden festgestellt werden. Beispielsweise ist die Ermittlung von HBsAg unter Verwendung einer radioimmunometrischen Methode die derzeitige Methode der Wahl. Auf einem anderen Gebiet ist über S erumantikörper gegen Ferritin, die aus weißen Neu Seeland-Kaninchen erhalten wurden und mit ^11 markiert wurden, berichtet worden, daß sie sich bei der Behandlung von Lebertumoren als aussichtsreich zeigen. (Siehe Order und Mitarbeiter, International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics, 6,703 (1980)).
Serumantikörper, beispielsweise solche, die aus Kaninchen, Mäusespezies oder anderen Säugetieren erhalten wurden, sind „polyklonaler“ Art, da das Immunsystem des Wirtes zur Produktion eines Gemisches spezifischer Antikörper, die gegen die verschiedenen antigenischen Determinanten oder Epitopen an dem Immunogen, auf welches der Wirt anspricht, gerichtet sind, stimuliert ist. Die einzelnen, das Gemisch bildenden Antikörper sind jeweils das Produkt eines B-Zellenklons; ferner sondert jede B-Zelle nur eine Antikörperspezies ab. Der Antikörper, der durch einen Klon produziert wird, unterscheidet sich von einem Antikörper gegen dasselbe Antigen, welcher durch einen anderen Klon produziert worden ist, dadurch, daß er wenigstens einen feinen Unterschied zwischen seiner Peptidsequenz und jener des anderen Antikörpers aufweist. Im Ergebnis ist daher jede Antikörperspezies ein bestimmtes Molekül und die Unterschiede in der Peptidsequenz zwischen verschiedenen Spezies beeinflussen deren allgemeine Spezifitäten sowie die speziellen Epitopen, die sie erkennen, und deren Affinitäten für das Antigen.
Eine individuelle B-Zelle kann unter Verwendung derzeit verfügbarer Gewebekulturtechniken nicht unbegrenzt unter Erzielung der Antikörperspezies, die sie als eine reine Verbindung absondert, gezüchtet werden. In relativ neuerer Zeit haben Köhler und Milstein ein Verfahren entdeckt und über dieses berichtet, durch welches ein monoklonaler Antikörper in zweckmäßiger Weise als das Absonderungsprodukt einer Hybridzelle, die als ein „Hybridoma“ bezeichnet wird, erhalten werden kann (G. Köhler und C. Milstein, Nature, 256, 495 (1975)). Grundsätzlich umfaßt das Verfahren die Fusion von aus einer immunisierten Maus entnommenen Milzzellen mit Mäusemyelomazellen unter Bildung der Hybridoma. Myelomazellen, welche ihr eigenes Immunoglobulin oder Teile davon nicht produzieren oder wenigstens nicht absondem, werden bevorzugt Kulturen von Zellen, die durch Klonen eines einzelnen Hybridoms erhalten worden sind, werden identische Antikörpermoleküle absondem, die in der Folge leicht als eine reine chemische Verbindung erhalten werden können. Dies steht im Gegensatz zu der üblichen Antikörperherstellung aus beispielsweise Serum, in welchem irgendein Antikörper nur eine der Komponenten eines im wesentlichen untrennbaren Antikörpergemisches verwandter, aber dennoch unterschiedlicher chemischer Verbindungen ist
Da es sich um eine reine Verbindung handelt, wird ein monoklonaler Antikörper eine konstante Spezifität für eine einzige Stelle an den Antigenmolekülen und eine gut definierte Affinität haben. Somit können Klone verschiedener Hybridomen getrennt werden, um den einen auszuwählen, der den monoklonalen Antikörper mit den am meisten erwünschten Eigenschaften füreine gegebene Anwendungproduziert. Die Unsteiblichkeitdes Hybridoms garantiert eine fast unbeschränkte Versorgung mit dem Antikörper, den es absondert, und mildert Probleme, die mit Schwankungen im Antikörpertiter und der Gesamtaffinität von Tier zu Tier, das zur Produktion von Serum-antikörpem benutzt wird, verbunden sind. Monoklonale Antikörper, die aus Hybridomen erhalten wurden, sind zum Beispiel bei der praktischen Anwendung in Diagnosebestecken eingesetzt worden. Eine Auswahl solcher Bestecke ist von der Firma Hybritech, Inc., auf die diese Anmeldung übertragen worden ist, erhältlich.
Ein Antikörpermolekül kann allgemein derart betrachtet werden, daß es eine einzelne Spezifität ausdrückt, welche gegen das Immunogen gerichtet ist, auf das das Immunsystem des Wirtes durch Produktion des Antikörpers antwortete. Der Antikörper ist aus zwei identischen Hälften zusammengesetzt, von denen jede ein schweres und leichtes Kettenpaar enthält und von denen jede dieselbe antigenische Determinante wie die andere erkennt.
(s- -2-
AT 394 577 B
Die -S-S-Disulfidbrücken, welche die beiden (H)-Ketten miteinander an der Stelle der Cysteinabschnitte verbinden, können üblicherweise selektiv in vitro durch eine milde Reduktion gespalten und die Halbmoleküle durch nachfolgende Ansäuerung entassoziiert werden. Die Halbmoleküle können dann erneut in vitro bei neutralem pH rekombiniert (renaturiert) werden, wobei die Reassoziierung durch nicht-covalente Wechselwirkung erfolgt.
Falls Antikörper von verschiedenen Spezifitäten einer selektiven Spaltung der Disulfidbrücken zwischen den schweren Ketten unterworfen und nachfolgend Bedingungen für die Renaturierung eingestellt werden, kann die Reassoziierung zwischen Halbmolekülen willkürlich Unterproduktion einer Population von Antikörpern erfolgen, von denen wenigstens einige insofern Hybride sind, als sich eine Hälfte eines Antikörpermoleküls einer Spezifität mit einer Hälfte eines Antikörpermoleküls einer unterschiedlichen Spezifität verbindet. Beispielsweise haben Nisonoff und Mitarbeiter in „The Antibody Molecule“, Academic Press, New York (1975), auf den Seiten 260-261 eine in vitro-Erzeugung eines polyklonalen Antikörperhybrids von Kaninchenantiovalbumin- und Anti-BGG-Antikörpem beschrieben. Monoklonale Hybrid-Antikörper sind auch unter Anwendung eines analogen Verfahrens erhalten worden. Siehe D. M. Kranz und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78, 5807 (1981). Der Hybrid-Antikörper wird wenigstens theoretisch eine Doppelspezifität insofeme zeigen, als eine Hälfte des Antikörpers eine antigenische Determinante oder ein antigenisches Epitop erkennen und sich an diese(s) binden wird, wohingegen die andere Hälfte ein verschiedenes Epitop an demselben oder einem verschiedenen Antigen erkennen wird.
Obgleich Hybrid-Antikörper in der oben beschriebenen Weise erhalten werden können, sind die Ausbeuten oft sehr niedrig, die zur Herstellung derselben angewendeten Reaktionen schwierig zu reproduzieren und die Hybrid-Antikörper unterliegen üblicherweise signifikanter, irreversibler Denaturierung. Eine solche Denaturierung kann die Immunoreaktivität verringern, und es istzu erwarten, daß sie in vivo zu unterschiedlichen Stoffwechselkennmeikmalen führt. Als Ergebnis davon bleibt der Hybrid-Antikörper derzeit größtenteils eine Laboratoriumskuriosität, die schwierig erhältlich ist.
Antikörper, die Doppelspezifität aufweisen, können auch durch Konjugieren von Paaren intakter Antikörper, monoklonaler oder sonstiger, hergestellt werden, wobei verschiedene Kupplungs- oder Vemetzungsmittel, wie Protein A (aus Staphylococcus aureus), Carbodiimid und bifunktionelle Verbindungen, wie N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat, verwendet werden, um dimere und höhere Antikörpermultimere zu erhalten, zu denen jedes Glied des Antikörperpaares seine Spezifität beiträgt Beispielsweise haben Mandoche und Mitarbeiter über die Bildung von multivalenten Antikörpern mit Doppelspezifität berichtet, wobei eine Folgereaktion von Antikörpern mit Protein A erfolgte, welche Antikörper, wie gezeigt wurde, befähigt sind, Zelloberflächenantigene in vitro festzustellen. Siehe J. Immunological Methods, 42,355 (1981). Nach ihrer Methode binden sich Antikörper einer Spezifität an das Oberflächenantigen und die anderen an einen Rest, der die Ermittlung erlaubt
Die Synthese von Doppelspezifitätsantikörpem nach der vorstehenden Methode ist kompliziert und bisher ist keine kommerzielle Anwendung derselben erfolgt
Durch die vorliegende Erfindung wird unter anderem ein neues, zur Gänze biologisches Verfahren zur verläßlichen Gewinnung von monoklonalen Hybrid-Antikörpem in guten Ausbeuten ohne Denaturierung geschaffen. Im Rahmen dieser Beschreibung wird der Ausdruck „Hybrid-Antikörper“ verwendet, um ein einziges Antikörpermolekül zu bezeichnen, das zwei verschiedene Spezifitäten aufweist Die einzelnen Spezifitäten können auf antigenische Determinanten an zwei verschiedenen Antigenen oder auf verschiedene antigenische Determinanten (Epitope) an demselben Antigen gerichtet sein. Ferner umfaßt der Ausdruck „Antigen“, soweit nichts anderes angegeben ist, auch Haptene.
Nachdem VerfahrendervorliegendenErfmdungwerdenHybrid-Antikörper.dieeineDoppelspezifitätaufweisen, durch Fusion eines Hybridoms, vorzugsweise eines selektiv zerstörbaren Hybridoms, welches einen Antikörper gegen eine vorgewählte antigenische Determinante absondert, mit einem fusionierbaren B-Lymphozyten oder einem zweiten Hybridom, wobei der B-Lymphozyt oder das zweite Hybridom einen zweiten Antikörper gegen eine unterschiedliche antigenische Determinante absondem, unter Bildung eines Hybridoms der zweiten Generation (nachstehend „Polydom“ genannt) erhalten. Im Rahmen der Erfindung bedeutet der Ausdruck „selektiv zerstörbares Hybridom“ ein Hybridom, dem dio Fähigkeit des Überlebens in dem Medium, in welchem das Polydom gezüchtet wird, fehlt oder wenigstens im wesentlichen fehlt. Wir haben unerwarteterweise gefunden, daß zum Unterschied von dem Ausgangshybridom oder dem B-Lymphozyten, von dem es sich ableitet und von denen jede(r) eine Population identischer Antikörper, die eine einzige Spezifität haben, absondert, das Polydom zusätzlich einen hohen Prozentsatz eines monoklonalen Hybrid-Antikörpers absondert, der eine Doppelspezifität hat, d. h. eine Fähigkeit, entweder mit der einen von den beiden antigenisehen Determinanten, die durch die individuellen, von den Ausgangszeilen produzierten Antikörper erkannt werden, oder mit beiden Determinanten gleichzeitig, eine Bindung einzugehen. Der in dieser Weise erhaltene monoklonale Hybrid-Antikörper unterlag nicht der unerwünschten Denaturierung, welche Hybride charakterisiert, die aus dem Verfahren chemischer Rekombination von Antikörperhalbmolekülen erhalten werden. Ferner gestattet es das Verfahren der Erfindung, die Hybride zuverlässig und in großen Mengen zu erhalten.
Gleichfalls gemäß der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Immunodiagnose und Immunotherapie -3-
AT 394 577 B geschaffen, bei welchen Antikörper mit Doppelspezifität angewendet werden. Im allgemeinen gelangen bei diesen Verfahren ein monoklonaler Antikörper oder polyklonale Antikörper zur Anwendung, die eine erste Spezifität gegen ein Targetantigen und eine zweite Spezifität gegen eine Substanz, zum Beispiel ein anderes Antigen oder Hapten, haben, welche Spezifitäten es gestatten, eine Diagnose des Targetantigens zu machen, oder welche die Freisetzung eines Mittels ermöglichen, oder dieses selbst sind, welches für das Targetantigen oder das Gewebe, mit dem es assoziiert ist, letal ist
Somit kann durch eine entsprechende Auswahl der Ausgangszeilen eine Polydoma nach der vorliegenden Erfindung erhalten werden, welche einen Antikörper absondert, der eine Spezifität für ein Targetantigen und eine zweite Spezifität für einen in der Diagnose oder Therapie nützlichen Rest aufweist. Alternativ können Antikörperhalbmoleküle in vitro unter Verwendung chemischer Mittel rekombiniert werden, oder einzelne intakte monospezifische Antikörper können durch chemische Mittel gekuppelt oder vernetzt werden, um An tikörpermul timere (die ein Dimer, Trimer oder höheres Multimer sein können) mit einer Doppelspezifität und mit der gleichen oder einer ähnlichen Brauchbarkeit wie ein monoklonaler Hybrid-Antikörper zu erhalten, welcher die gleiche Doppelspezifität, die nach der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, hat.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfaßt der Ausdruck „Antikörper“ Antikörperffagmente, die immuno-chemische Eigenschaften haben, wie Fab oder F(ab)2-Fragmente.
Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, monoklonale Hybrid-Antikörper zuverlässig und in guter Ausbeute zu erhalten, die beim Verfahren ihrer Herstellung nicht denaturiert worden sind.
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von monoklonalen Hybrid-Antikörpem.
Noch ein anderes Ziel dieser Erfindung ist die Schaffung immunodiagnostischer und immunotherapeutischer Verfahren, bei welchen Antikörper angewendet werden, die eine Doppelspezifität aufweisen.
Die Art und Weise, in welcher diese und andere Ziele erreicht werden können, wird bei einer Betrachtung der folgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen ersichtlich.
Wie oben angegeben, erfordert das Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Hybrid-Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Ausgangsmaterial ein Hybridom, und vorzugsweise ein selektiv zerstörbares Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine vorgewählte antigenische Determinante oder ein vorgewähltes antigenisches Epitop absondert. Die Verwendung eines selektiv zerstörbaren Hybridoms als ein Ausgangsmaterial hat den Vorteil, zu verhindern, daß die Zellen, welche durch Fusion des selektiv zerstörbaren Hybridoms miteinem B-Lymphozyten odereinem zweiten Hybridom erhalten werden, d. h. das Polydom, durch eine Population des Ausgangshybridoms überwachsen werden, wenn die beim Fusionsverfahren erhaltenen Zellen gezüchtet werden, und es hat den (weiteren) Vorteil, ein Mittel zur Verfügung zu stellen, durch das die Polydomzellen von Ausgangshybridomzellen isoliert werden können.
Wir haben gefunden, daß selektiv zerstörbare Hybridome, die im Rahmen unserer Erfindung nützlich sind, aus Hybridomen erhalten werden können, welche einen Antikörper mit einer der gewünschten Spezifitäten absondem und welche nach dem klassischen Kohler-Milstein-Verfahren hergestellt worden sind, d. h. aus Hybridomen, die durch Fusion einer Myelomazelle und eines B-Lymphozyten, wie jenem, der in den Milzzellen einer Maus gefunden wird, erhalten werden. Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird ein solches Hybridom einem Rückselektionsverfahren unterworfen, um das Hybridom zu erhalten, das selektiv zerstörbar ist.
Im allgemeinen kann selektive Zerstörbarkeit durch Rückselektion zu einem Hybridom erhalten werden, welchem eine genetische Komponente fehlt, die für sein Überleben in einem Medium der Wahl notwendig ist, in welchem das durch die Fusion erzeugte Polydom gezüchtet werden kann, und zwar aufgrund eines genetischen Beitrages aus dem Fusionspartner des selektiv zerstörbaren Hybridoms, d. h. des B-Lymphozyten oder des zweiten Hybridoms.
Das im vorliegenden Fall bevorzugte Rückselektionsverfahren umfaßt die Züchtung eines dem Hybrid-Antikörper einzuverleibenden Hybridoms, welches einen Antikörper absondert, der eine der gewünschten Spezifitäten hat, in einem 8-Azaguanin enthaltenden Nährmedium. In einem solchen Medium können beliebige solcher Zellen wachsen, in welche 8-Azaguanin ein verleibt wird, und welchen daher das Enzym Hypoxanthin-guaninphosphoribosy 1-transferase (HPRT) fehlt. Klone von Zellen, denen dieses Enzym fehlt, können in einem Medium, welches Hypoxanthin-aminopterin-thymidin (HAT) enthält, nicht wachsen. Somit können sie nunmehr selektiv in diesem Medium zerstört werden.
Ein sehr ähnliches Verfahren zurP ackselektion umfaßt das Züchten der den gewünschten Antikörper absondemden Hybridome in einem Medium, das 6-Thioguanin enthält, ein anderes Analogon von Guanin, das für die Zelle toxisch ist, wenn es der DNA einverleibt wird. Wieder fehlt bestimmten Zellen, welche in diesem Medium wachsen werden, das HPRT-Enzym, und Klone dieser Zellen werden notwendigerweise gegenüber HAT-Medium empfindlich sein.
Noch ein anderes Verfahren zur Rückselektion, das im Rahmen der Erfindung angewendet werden kann, umfaßt das Züchten von Zellen der selektierten Hybridomzellinie in einem Medium, das eines der beiden Thyminanaloga -4-
AT 394 577 B 5-Bromuracyldeoxyribose(BUdR)oder2-Aminopurinenthält.Nursolche Zellen, denen dasEnzymThymidinkinase (TK) fehlt, können in einem Medium wachsen, welches einen dieser zwei Inhibitoren enthält. Wie im Fall von Zellen, denen das Enzym HPRT fehlt, werden Zellen, denen TK fehlt, in HAT-Medium nicht wachsen.
Ein unterschiedliches Verfahren zur Gewinnung eines selektiv zerstörbaren Ausgangshybridoms umfaßt die irreversible Enzymhemmungunter Verwendung von Stoffwechselinhibitoren. Unter diesen werden die sogenannten Kcat-Inhibitoren bevorzugt Diese Inhibitoren sind Analoga eines Enzymsubstrats, welche durch das Targetenzym in ein hoch reaktives Molekül umgewandelt werden, das mit dem Enzym an seiner Aktivstelle unter irreversibler Hemmung des Enzyms reagiert. Zum Beispiel hemmt die Behandlung des selektierten Hybridoms mit einem Analogem von Glutamin, wie Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin (DON), das Enzym Formylglycinamid-ribonucleotidamidotransferase unter Bildung einer kovalenten Bindung mit einem Cysteinrest an der Aktivstelle des Enzyms irreversibel. Diese Hemmung wird letztlich zum Zelltod führen. Das Hybridom kann jedoch durch Fusion mit dem zweiten Ausgangsmaterial des Polydoms, welches das erforderliche Enzym liefert, gerettet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das selektiv zerstörbare Hybridom mit komplementären B-Lymphozyten fusioniert, typischerweise solchen, die als Milzzellen einem Wirt entnommen wurden, der vorher mit einem Antigen immunisiert worden ist, welches ein an ein Trägerprotein gebundenes Hapten sein kann, das ausgewählt wurde, um den Wirt zu veranlassen, eine Immunantwort hervorzurufen, welche Antikörper erzeugt, die die in dem Hybrid-Antikörper erwünschte zweite Spezifität haben. Der Wirt ist üblicherweise eine Maus, doch können Spezies von Kaninchen, Menschen und andere Tiere ebenfalls verwendet werden, obgleich eine Interspeziesfusion eine Stabilität niedriger Ordnung ergeben kann. Das Verfahren zur Immunisierung eines solchen Wirtes ist selbstverständlich wohlbekannt und es brauchen keine Einzelheiten hier angegeben werden.
Die Fusion des selektiv zerstörbaren Hybridoms mit den B-Lymphozyten zur Gewinnung des Polydoms kann durch Vereinigung der zwei Gruppen von Zellen in einem Medium bewirkt werden, welches ein Mittel enthält, das dafür bekannt ist, daß es die Zellfusion nach bekannten Verfahren begünstigt, wie Polyethylenglykol oder Sendi virus.
Nach der Fusion werden die Zellen in ein Medium, wie HAT-Medium, zur Züchtung überführt. Die B-Lymphozyten werden nur einen kurzen Zeitraum überleben und die Ausgangshybridomzellen können in dem Medium nicht wachsen. Die Population des Polydoms, das als Ergebnis der Fusion gebildet wird, kann jedoch wegen der Komplementierung des Ausgangshybridoms durch den B-Lymphozyten, zum Beispiel durch einen genetischen Beitrag der Fähigkeit zur Herstellung eines fehlenden Enzyms, wie HPRT oder TK, oder durch einen direkten Beitrag eines in dem Ausgangs-Hybridom inhibierten Enzyms, in dem Medium gezüchtet werden. Klone der einzelnen Polydome werden gezüchtet und ausgesondert, um solche zu selektieren, welche Antikörper mit der gewünschten Doppelspezifität absondem. Klone von Polydomen, deren Antikörper die gewünschte Doppelspezifität zeigen, werden weiterhin getrennt, um solche auszuwählen, deren zweite Spezifität, d. h. jene, die von den B-Lymphozyten erhalten wurde, und Affinität am meisten erwünscht sind.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Polydom durch Fusionierung des selektiv zerstörbaren Hybridoms, unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, mit einem zweiten Hybridom, das ebenfalls selektiv zerstörbar ist, erhalten. Das zweite Ausgangshybridom wird in der gleichen Weise wie das erste erhalten, d. h. durch ein Verfahren von Rückselektion, irreversible Enzymhemmung oder durch irgendwelche andere geeignete Methoden. In einem solchen Fall muß das zweite Hybridom befähigt sein, das erste zu komplementieren. Wenn zum Beispiel dem ersten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym HPRT fehlt, muß das zweite dazu befähigt sein, dem Polydom ein Gen beizusteuem, welches das Polydom befähigt, HPRT zur Expression zu bringen. In ähnlicherWeise muß, falls dem zweiten selektiv zerstörbaren Hybridom das Enzym TK fehlt, das erste ein Gen für TK des Polydoms beisteuern. Eine ähnliche Komplementarität zwischen den zwei Hybridomen muß vorhanden sein, falls eine irreversible Hemmung eines Enzyms bewirkt worden ist, um denselben selektive Zerstörbarkeit zu verleihen. Es ist auch möglich, als ein Hybridomausgangsmaterial ein Hybridom zu verwenden, das einem Rückselektionsverfahren unterworfen worden ist, und als das andere ein Hybridom, das einem Verfahren zur Enzymhemmung unterworfen worden ist.
Die Verwendung von komplementären, selektiv zerstörbaren Hybridomen als Ausgangsmaterialien für das Polydom hat den Vorteil, daß beide Ausgangsmaterialien auf der Basis der Spezifitäten und Affinitäten des monoklonalen Antikörpers, den sie bilden, ausgewählt werden können, wohingegen im Falle von Fusion eines einzelnen Hybridoms mit B-Lymphozyten keine Prefusionsselektion unter den B-Lymphozyten zur Gewinnung solcher, die einen Antikörper der gewünschten Spezifität und Affinität produzieren, vorgenommen werden kann.
Die Fusion der zwei selektiv zerstörbaren Hybridomen kann unter Verwendung von Polyethylenglykol oder unter Verwendung anderer Fusionierungsmittel, wiederum gemäß bekannten Methoden, bewirkt werden. Nach der Fusion werden die Zellen in ein Wachstumsmedium überführt, in welchem die zwei Ausgangsmaterialien nicht wachsen können, aber in welchem die aus der Fusion entstandenen Polydome wegen der komplementären Beiträge der Ausgangsmaterialien zu wachsen in der Lage sind. -5-
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Bisher haben wir Selektionsverfahren zur Gewinnung selektiv zerstörbarer Hybridome für die Verwendung als beide Hybridompartner in einer Hybridom-Hybridom-Fusion zur Bildung eines Polydoms erörtert. Das Erfordernis für das zweite Hybridomausgangsmaterial, selektiv zerstörbar zu sein, kann jedoch vermieden werden, indem dem ersten Hybridomausgangsmaterial sowohl eine dominante als auch eine rezessive Markierung verliehen wird. Ein derzeit bevorzugtes Verfahren ist die HAT-Ouabain-Selektion. Das Arzneimittel Ouabain ist ein spezifischer Inhibitor der Na+-K+-aktivierten ATPase der Plasmamembran. Jenes Enzym ist für die Einführung von K+ in eine Zelle und den Austritt von Na+ aus der Zelle verantwortlich. Zellen eines Hybridoms, das vorher rückselektiert wurde, um ihr selektive Zerstörbarkeit, zum Beispiel HAT-Empfindlichkeit,zu verleihen, werden in Ouabainmedium gezüchtet, um Ouabain-resistente Zellen zu selektieren. Klone dieser Zellen worden HAT-empfindlich, aber Ouabain-resistent sein. Im Gegensatz dazu wird das Hybridom, das zur Fusion damit selektiert worden ist, Ouabainempfindlich sein, kann aber in HAT überleben und wachsen. Alternativ kann eine Selektion hinsichtlich Ouabain-Resistenz zuerst entweder an der Ausgangsmyelomalinie oder der daraus stammenden Hybridom erfolgen, worauf eine Rückselektion oder andere Methode angewendet wird, um selektive Zerstörbarkeit zu verleihen.
Zellen, die durch Fusion der zwei Hybridomen in Polyethylenglykol oder einem anderen Fusionsmittel erhalten worden sind, werden in das HAT-Medium überführt, das Ouabain in einer Konzentration enthält, welche für das zweite Hybridomausgangsmaterial letal ist. Das selektiv zerstörbare Hybridomausgangsmaterial kann in dem HAT-Medium, selbst wenn es Ouabainresistent ist, nicht überleben, weil ihm entweder zum Beispiel das HPRT- oder ein anderes Enzym fehlt. Die Polydomzellen können jedoch in dem Medium wachsen, da sie die für das Überleben erforderlichen Enzyme und Ouabain-Resistenz besitzen. Das vorstehende Verfahren hat den Vorteil, daß es möglich ist, ein Polydom durch direkte Fusionierung eines selektiv zerstörbaren Hybridomausgangsmaterials, das einen Antikörper absondert, der eine der in dem Hybrid erwünschten Spezifitäten hat, mit einem zweiten „Außerbord“-Hybridom, die einen Antikörper mit der anderen, in dem Hybrid erwünschten Spezifität absondert, zu erhalten, und daß keine Anwendung von Methoden erforderlich ist, um selektive Zerstörbarkeit auf das zweite Hybridomausgangsmaterial zu übertragen.
Noch eine andere Methode zur Gewinnung eines Polydoms, die ein universelles Ausgangsmaterial anwendet, d. h. ein solches, das sowohl eine positive als auch eine negative Markierung aufweist, und das mit irgendeinem „ Außerbord“-Hybridom fusioniert werden kann, umfaßt die Verwendung von Rekombinations-DNA-Vektoren, die verschiedene Arzneimittelresistenzmaikierungen tragen. Zum Beispiel kann S V40, das ein Gen für Neomycinresistenz trägt, verwendet werden.
Ein derzeit bevorzugtes universelles Ausgangsmaterial ist ein solches, das HAT-empfindlich-Neomycin-resistent ist Das gewählte Ausgangsmaterial wird auf HAT-Empfindlichkeitrückselektiertunddann mitSV40-Vektor, der ein Gen für Neomycinresistenz trägt, transfiziert. Diese Verfahrensweise kann auch umgekehrt werden, wobei die Transfizierung zuerst erfolgt. Die entstehende Hybridoma kann in Gegenwart von Neomycin, welches normalerweise für Säugetierzellen toxisch ist, wachsen, wird aber in Gegenwart von HAT absterben. Außerbord-Hybridome jedoch wachsen in HAT, sterben aber in Gegenwart von Neomycin ab. Produkte der Fusion der Ausgangsmaterialien überleben daher in Gegenwart von HAT und Neomycin. Während die Verwendung von Vektoren zur Übertragung von Resistenz gegen Neomycin derzeit bevorzugt wird, können auch Vektoren, die Gene tragen, welche an Säugetierzellen Resistenz gegen andere Arzneimittel übertragen, verwendet werden.
Obgleich es derzeit bevorzugt wird, ist es für unser Verfahren zur Gewinnung von Polydomen aus Paaren von Hybridomen nicht wesentlich, daß wenigstens eine der Ausgangszellinien selektiv zerstörbar ist. Es liegt im Rahmen unserer Erfindung, ein Paar von Hybridomen zu fusionieren, von denen keines selektiv zerstörbar ist, welches Paar aber einen Antikörper mit einer der in dem Hybrid gewünschten Spezifitäten absondert, in Gegenwart eines geeigneten Fusionierungsmittels zu fusionieren, worauf die S ubklonierung aller Zellen erfolgt, bevor die Population der unfusionierten Ausgangshybridome in einem Ausmaß zunimmt, daßdieTrennungder Subklonen zur Identifizierung von Polydomen nicht praktisch ist. Die Subklone werden anschließend ausgesondert, um festzustellen, welche von ihnen Antikörper mit einer Doppelspezifität absondem.
Dieses Verfahren ist bestens geeignet, um Polydomezu erhalten, wenn dieFusionsfrequenz der Ausgangszellinien hoch ist. In jedwedem Falle und insbesondere, wenn die Zellfusionsfrequenz niedrig ist, können die bei der Fusion von Hybridomen, deren monoklonale Antikörper gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, erhaltenen Zellen unter Verwendung eines Cytofluorographen zur Identifizierung der Polydome ausgesondert werden. Um dies zu bewirken, werden Proben der zwei Antigene mit verschiedenen fluoreszierenden Resten etikettiert, deren Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen auftritt. Beispielsweise kann man eines mit Fluorescin und das andere mit Rhodamin etikettieren. Die Population von Zellen aus der Fusion, die vorzugsweise über Nacht oder während irgendeines anderen geeigneten Zeitraumes für die Erhöhung ihrer Zahl gezüchtet worden ist, wird mit den zwei etikettierten Antigenen bebrütet Die Zellen werden dann unter Verwendung des Cytofluorographen ausgesondert. Solche Zellen mit Fluoreszenz bei nur einer der zwei Wellenlängen werden aus Zellinien der Ausgangshybridome stammen. Zellen jedoch, die Fluoreszenz bei beiden Wellenlängen zeigen, werden Polydomen sein, die isoliert und -6-
AT 394 577 B subkloniert werden können.
Bei noch einer anderen Ausfuhrungsform kann ein Polydom unmittelbar durch Entfernen des Nukleus aus einem ersten Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper mit einer der in dem Hybrid erwünschten Spezifitäten absondert, und Einsetzen desselben in das Cytoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper mit der zweiten erwünschten Spezifität absondert, erhalten werden. Selbstverständlich braucht keine der Ausgangshybridome selektiv zerstörbar zu sein, um bei diesem Verfahren verwendet zu werden. Nach Einsetzen des Kemmaterials wird die Zelle geklont, um eine Population des Polydoms zu erhalten.
Wir haben gefunden, daß zum Unterschied von den Ausgangshybridomen oder B-Lymphozyten, welche einen einzigen Antikörper absondem, nach unserer Erfindung erhaltene Polydomzellen ein Gemisch von Antikörpern absondem, von denen wenigstens einer ein Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität ist. Durch das Polydom werden auch relativ kleinere Mengen von Antikörpern der gleichen Spezifität produziert, wie sie durch die bei der Gewinnung des Polydoms verwendeten Ausgangszeilen produziert werden. Das Verhältnis von Hybride zu monospezifischen Antikörpern scheint etwa 2:1:1 zu sein, welches das erwartete ist, wenn die Polydoma gleiche Mengen aller möglichen, durch die Ausgangszeilen synthetisierten (H)-Ketten produziert, welche in dem Polydom selbst willkürlich kombiniert sind.
Die Polydome können in vitro kultiviert oder in vivo in entweder genetisch kompatiblen Tieren oder Nacktmäusen gezüchtet werden, um große Mengen des Hybrid-Antikörpers zu erhalten, der aus dem Kulturmedium oder der ascitischen Flüssigkeit des Tieres unter Anwendung bekannter Verfahrensweisen gewonnen wird. Siehe zum Beispiel die Protokolle in „Monoclonal Antibodies“, herausgegeben von Kennen und Mitarbeitern, Plenum Press, New York (1980), auf den Seiten 363 - 418.
Das Gemisch der durch das Poly dom produzierten Antikörper kann zur Gewinnung des Hybrids getrennt werden. Beispielsweise gestattet aufeinanderfolgende Affinitätschromatographie gegen zuerst das eine und dann das andere Antigen, für welche das Hybrid spezifisch ist, deren Abtrennung von den monospezifischen Antikörperverunreinigungen. Wir haben auch gefunden, daß einfache Ionenaustauschchromatographie und elektrophoretische Methoden ebensogut unter wenigstens bestimmten Umständen angewendet werden können. Erforderlichenfalls könnte der Ladungsunterschied für Ionenaustausch eines der Kennmerkmale des Antikörpers sein, der bei der Auswahl der Ausgangslinien berücksichtigt wird.
Beispiel 1:
Ein monoklonaler Hybrid-Antikörper, der eine Doppelspezifität für Hepatitis B-Oberflächenantigen (HBsAg) und Prostatinsäurephosphatase (PAP) aufweist, wurde gemäß der vorliegenden Erfindung in folgender Weise hergestellt:
Ein Hybridom, das einen monoklonalen Antikörper gegen PAP absondert, wurde in HAT-Medium eine Woche gezüchtet und dann in ein nicht-selektives Medium übertragen und in diesem gezüchtet. Nach verschiedenen Zeiträumen des Wachstums unter nicht-selektiven Bedingungen wurden aliquote Anteile von 2 ml der Zellen in ein 10"^ M 8-Azaguanin enthaltendes Medium gebracht, welches die Zellen am Wachstum, durch Einverleibung von 8-Azaguanin in deren DNA anstelle von Guanin, hinderte. Zellen, denen das HPRT-Enzym fehlt, überlebten und wuchsen in diesem Medium, und diese Zellen überlebten notwendigerweise in HAT nicht.
Klone, die in dem 8-Azaguanin enthaltenden Medium wuchsen, wurden auf Empfindlichkeit gegen HAT und Anti-PAP-Produktion geprüft. Ein Klon, der noch Anti-PAP produzierte und HAT-Empfindlichkeit bei einer Umkehrfrequenz von weniger als 4 x 10"® zeigte, wurde subkloniert. Alle Subklone verhielten sich ähnlich wie der Ausgangsklon.
Zellen aus einem der HAT-empfindlichen Subklone wurden in Polyethylenglykol mit Milzzellen fusioniert, die aus mit HBsAg hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen erhalten wurden, um Polydome unter Anwendung der Fusionsmethode von Gerhard zu gewinnen. Siehe „Monoclonal Antibodies“, oben, auf Seite 370. Die Fusion lieferte 220 Polydome, die ausgesondert wurden, um festzustellen, welche abgesonderten Antikörper Spezifität für sowohl PAP als auch HBsAg zeigen. Bei Klonen von zweien solcher Polydome wurde festgestellt, daß sie Antikörper und in der Folge Asciten produzieren, welche beide Spezifitäten zeigen.
Subklone von beiden Polydomen setzten die Produktion von Asciten fort, welche beide Spezifitäten zeigten, und ergaben an Orstein-Davis-PAGE Dreifachbanden, die ähnlich jenen der Ausgangsklone sind. In Radioimmunotests zeigten die Asciten aus beiden Klonen die Bindung von ^I-HBsAg und ^I-PAP und ergaben Ka-Werte von je annähernd 10^, was die Annahme der Bildung von Antikörpern mit zwei Spezifitäten zuläßt.
Die Daten in der folgenden Tabelle I zeigen die Ergebnisse, die bei Immunotests unter Verwendung der Asciten erhalten wurden, die aus einem Klon des einen der Polydome erhalten wurden, im Vergleich mit Asciten, die von Hybridomen erhalten wurden, welche monoklonale Antikörper gegen IgE (als Kontrolle verwendet), PAP bzw. HBsAg absondem, unter Verwendung von immobilisiertem HBsAg als feste Phase und verschiedenen radio- -7-
AT 394 577 B markierten Antigenen als Lösungsphase.
Eine 200 μΙ-Probe der Asciten aus dem Polydom und jedem der drei Hybridome wurde jeweils über Nacht mit 12Polystyrolkugeln,an welche HBsAg gebunden war,bebrütet. Die HBsAg-Kugeln wurden von AbbottLaboratories, North Chicago, Illinois, erhalten. Nach dem Waschen wurden Dreifachproben 4 Stunden mit 100.000 cpm des angegebenen I-markierten Antigens bebrütet. Nach einer zweiten Wäsche wurden die Kugeln einem Zähl Vorgang unterworfen, um die Menge an markiertem Antigen, das an die Kugeln gebunden ist, zu bestimmen. Bei einem Testsatz unter Verwendung von radiomarkiertem PAP als Lösungsphasenantigen wurde Anti-PAP dem Antigen vor seiner Bebrütung mit der Kugel zugesetzt. Der Antikörper gegen PAP, der für diesen Zweck verwendet wurde, ist der monoklonalen Antikörper, der durch das zur Herstellung des Polydoms verwendete Ausgangshybridom produziert wird, und ist daher gegen das gleiche PAP-Epitop gerichtet, wie jenes, gegen das erwarteterweise auch der Hybrid-Antikörper gerichtet ist.
Tabelle I
Ergebnisse von Radiotests, welche das Vorliegen von Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität in Polydomasciten zeigen
Spezifität von Asciten cpm *HBsAg cpm *PAP cpm *PAP + Anti-PAP cpm * IgE Anti-IgE 15.340 2.145 2.930 3.290 Anti-PAP 16.280 2.956 3.128 3.180 Anti-HBsAg 73.020 2.973 2.870 3.330 erwartete Doppelspezifität 78.900 82.533 2.936 3.143 * I-markiertes Antigen
Die Daten in Tabelle I zeigen, daß nur die aus nicht-spezifischer Bindung erwartete Strahlung für die Anti-PAP-Asciten im Vergleich zu jener für die IgE-Kontrolle gemessen wurde. Die Asciten, welche den HBsAg-Antikörper enthalten, banden anderseits das markierte HBsAg-Antigen in der erwarteten Weise, zeigten aber unspezifische Bindung, wenn die anderen markierten Antigene getestet wurden. Die Asciten aus dem Polydomklon banden jedoch sowohl markiertes HBsAg als auch markiertes PAP, wobei das erstere dem Vorliegen von etwas nicht-hybridischem, monospezifischem Antikörper gegen HBsAg in den Asciten zuzuschreiben ist, und das letztere einem Hybrid zuzuschreiben ist, das das HBsAg an der Kugel und die Spur markierter PAP in Lösung binden und überbrücken kann. Der Versuch unter Verwendung eines Gemisches aus markiertem PAP und Anti-PAP aus dem Ausgangshybridom bestätigt, daß die Anti-PAP-Spezifitätdes Hybrids für dasselbe Epitop wie beim vom Ausgangsmaterial abgesonderten Antikörper gegeben ist, da aufgrund der Hemmung, durch den Ausgangsantikörper, von Bindung von markiertem PAP an den Hybrid-Antikörper nur die Hintergrundstrahlung beobachtet wird.
Die Analyse der Asciten aus dem in den Vergleichsradiotests verwendeten Polydomklon wurde unter Anwendung von Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) und Immunoelektrophorese (IEP) ausgeführt. Beide zeigten das Vorliegen von wenigstens drei Antikörperspezies an. Im präparativen Maßstab ausgeführte DEAE-Ionenaus-tauschchromatographie ergab drei gut getrennte Spitzen,von denen die mittlere eine Schulter hatte. Jede der Spitzen war gemäß Analyse durch PAGE und IEP homogen, und jede entsprach einer der Banden in den ursprünglichen Asciten.
Material, das jede der DEAE-Spitzen repräsentiert, wurde unter Anwendung von radiomarkiertem HBsAg und PAP auf Antigenbindung geprüft. Die erste Spitze band HBsAg, doch nicht PAP. Die mittlere Spitze und deren Schulter banden sowohl HBsAg als auch PAP, und die letzte Spitze band nur PAP. Somit ist die mittlere Spitze ein Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität gegen HBsAg und PAP, der wenigstens zwei Subspezies enthält. -8-
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Der als mittlere Spitze der DEAE-Chromatographie erhaltene Hybrid- Antikörper wurde mit ^1 radiomarkiert. Nach der Markierung waren 85 % des markierten Antikörpers zur Bindung anPAP, und 88 % zur Bindung an HBsAg, befähigt. Die Affinität des Hybrids für PAP war, wie gefunden wurde, etwas niedriger als jene des durch die Ausgangslinie produzierten monoklonalen Antikörpers gegen PAP. Dieser Unterschied in der Affinität war etwa der gleiche wie jener, der von uns zwischen einem monoklonalen Antikörper und seinem Fab-Fragment beobachtet wurde. DEAE-Chromatographie zeigte, daß der Hybrid-Antikörper mehr als 50 % der durch das Polydom produzierten Antikörper enthielt und sich grob dem Verhältnis2:1:1 näherte, das aus statistischen Gründen vorausgesagt wurde, falls das Polydom in der Lage wäre, alle die möglichen schweren Antikörperketten zu synthetisieren, d. h. solche, die entweder PAP- oder HBsAg-Spezifität zeigen, und die innerhalb der Zelle auf willkürlicher Basis, unter Bildung von Hybrid-Antikörper, im Gemisch mit kleineren Mengen der zwei monospezifischen Antikörper kombiniert sind, welche die gleiche Spezifität wie solche, die durch die Ausgangszeilen produziert sind, haben. Die Existenz an Subspezies von Hybrid-Antikörper legt nahe, daß sie sich in derZusammensetzung ihrer leichten Kette unterscheiden können.
Beispiel 2:
Monoklonale Hybrid-Antikörper, die Doppelspezifität für Human IgD und Prolactin aufweisen, wurden gemäß der vorliegenden Erfindung durch Fusion von zwei Hybridomen hergestellt, wobei eines davon so aufgebaut war, daß es zwei selektible genetische Markierungen enthält: Empfindlichkeit gegenüber HAT-Medium und Resistenz gegen Ouabain. Dieses doppelt markierte Hybridom oder dieses sogenannte „Universalausgangsmaterial“ könnte dann mit irgendeiner anderen Hybridoma fusioniert werden. Die entstandenen Polydome wachsen in Gegenwart von HAT und Ouabain, während etwaige unfusionierte Ausgangszeilen absterben. Die Vorteile der Verwendung solch eines „Universalausgangsmaterials“ sind hier bereits beschrieben worden.
Zur Konstruktion solch eines universellen Ausgangsmaterials wurden beide selektierbaren Markierungen während der Anfangskonstruktion des Hybridoms eingeführt. Zur Gewinnung dieser Ausgangszellinie wurde die verbreitet verfügbare, HAT-empfindliche Mäusemyeloma P3.653 für eine zweite genetische Markierung, Ouabain-Resistenz, durch Einführung von 1 mM Ouabain in das Wuchsmedium selektiert Während die meisten Zellen abstarben, hatte annähernd 1/100.000 der Zellen durch zufällige Mutation Resistenz gegen das Arzneimittel erworben und so überlebt und sich unter Bildung der neuen Myelomapopulation vermehrt, die HAT-empfindlich und Ouabain-resistent war.
Diese HAT-empfindliche, Ouabain-resistente Myeloma wurde dann mit Milzzellen fusioniert, die aus mit IgD hyperimmunisierten Balb/c-Mäusen, unter Anwendung der oben zitierten Methode von Gerhard, erhalten wurden. Hybride wurden in HAT-Medium (ohne Ouabain) selektiert und Klone wurden hinsichtlich einer Produktion von monoklonalem, gegen IgD gerichteten Antikörper ausgesondert. Aus den positiven Klonen wurde einer, der einen IgG gegen IgD produzierte, zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Dieser Klon wurde hinsichtlich Retention des Charakters von Ouabain-Resistenz durch Zugabe von 1 mM Ouabain zu dem Wachstumsmedium getestet. Annähernd ein Drittel der Zellen behielt diese genetische Markierung bei. Wenn die Kultur in Ouabain exponentiell wuchs, wurden die Zellen subkloniert. Ouabain-resistente Subklone wurden hinsichtlich fortgesetzter Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antikörpers geprüft Einer der Subklone wurde weiterhin nach der Verfahrens weise des Beispiels 1 rückselektiert, um eine Population von Zellen zu erhalten, die gegen HAT empfindlich ist Dieser Subklon wurde zwei Wochen lang unter nicht-selektiven Bedingungen gezüchtet und dann in ein 6-Thioguanin enthaltendes Medium gebracht. Wie oben angegeben, ist der Mechanismus der Wirkung von 6-Thioguanin ähnlich dem von 8-Azaguanin. Zellen, die 6-Thioguanin anstelle von Guanin in ihre DNA einverleiben, werden nicht wachsen. Zellen, welchen HPRT-Enzym fehlt, werden 6-Thioguanin aus dem Medium nicht verwerten und können daher wachsen, sind aber als Folge davon gegen HAT empfindlich. Diese Population des rückselektierten Subklons wurde dann selbst in 6-Thioguanin- und Ouabain-hältigem Medium subkloniert. Subklone wurden hinsichtlich fortgesetzter Produktion des monoklonalen Anti-IgD-Antiköipers getestet. Ein Klon, der all die gewünschten Kennmerkmale aufwies - Wachstum in Ouabain und 6-Thioguanin sowie Produktion von monoklonalem Anti-IgD - wurde zu einem sogenannten „Universalausgangsmaterial“ selektiert Dieses Universalausgangsmaterial könnte dann mit irgend einem anderen HAT-resistenten, Ouabain-empfindlichen Hybridom, unter Bildung eines Polydoms, fusioniert werden, welche einen Hybrid-Antikörper zur Expression bringen würde, von dem eine Spezifität Anti-IgD sein würde. Für diesen Zweck haben wir anfänglich ein Mäuse-Hybridom selektiert, welches einen monoklonalen, gegen Prolactin gerichteten Antikörper absondert Der monoklonale Antiprolactinantikörper gehört der gleichen Unterklasse (IgGj) an wie das Anti-IgD, das durch die Ausgangslinie zur Expression gebracht wird, und es wird leicht an Omstein-Davis-Gelen von jenem Antikörper separiert Eine solche Separation ist ein Anzeichen für eine in hohem Maße unterschiedliche Ladung an den Antikörpern und sollte somit eine leichte Isolierung eines Hybrid-Antikörpers durch DEAE-Sephadex-Chromatographie ermöglichen. -9-
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10^-Zellen der HAT-empfindlichen, Ouabain-resistenten Zellinie wurden in Polyethylenglykol mit 10^-Zellen, die Antiprolactin produzieren, fusioniert. Die fusionierten Zellen wurden zuerst drei Tage lang in HAT-Medium gezüchtet, dann drei Tage lang wieder mit HAT+Ouabain-Medium ernährt und schließlich erneut in HAT-Medium gebracht Mehr als 600 Klone entstanden aus dieser Fusion: 66 Klone wurden zur Analyse willkürlich selektiert. Von diesen Klonen zeigten 36 sowohl Anti-IgD- als auch AntiprolactinaktivitäL
Diese höherwertigen („supematant“) Klone wurden bezüglich des Vorliegens von Hybrid-Antikörper nach folgendem Test untersucht Ein Polystyrolkügelchen, das mit einem anderen monoklonalen Antiprolactinantikörper überzogen war, wurde 5 Stunden mit 200 μΐ einer 100 ng/ml-Prolactinlösung bebrütet. Der verwendete Antikörper bindet Prolactin an einer unterschiedlichen Stelle von jener des Antikörpers, der durch die fusionierte Hybridomzellinie produziert wurde. Das Kügelchen wurde gewaschen und dann über Nacht mit den höherwertigen Klonen bebrütet. Am nächsten Tag wurde nach verschiedenen Waschvorgängen ^I-maritiertes IgD zugegeben. Hybrid-Antikörper, der an das Kügelchen durch einen funktionellen Arm gebunden ist, könnte das radiomarkierte IgD mit der freien Anti-IgD-Funktionalitätbinden,wohingegenkeinerder Ausgangsmaterialtypusantikörper IgD-IgDoderProlactin-Prolactin diese Brücke zwischen dem Prolactinkügelchen und der ^I-IgD-Markierung bilden konnte. Die Ergebnisse eines typischen Tests für Klone, die hybride, bifunktionelle Antikörper produzieren, sind in der nachstehenden Tabelle 2 angegeben:
Tabelle 2
Ergebnisse von immunometrischen Tests, die das Vorliegen von Hybrid-Antikörper demonstrieren, welcher Doppelspezifität für IgD und Prolactin in ausgewählten, höherwertigen Polydomen und Asciten hat.
Klonat Nr.
IOC cpm 'T-IgD-Markierungsbindung 1 15339 2 16337 3 22886 4 23356 5 24434 Anti-IgD 9357 Anti-Prolactin 8721
Nach diesem Test zeigten 21 von 36 Klonen signifikante bifunktionelle Aktivität. Asciten, die von 2 derzeit verfügbaren Klonen erzeugt wurden, haben sich in dem bifunktionellen Test als reaktionsfähig erwiesen. Diese Asciten enthalten Antikörper, welche an Omstein-Davis-Gelen in drei unterschiedliche Banden getrennt werden: zwei Banden fallen genau mit Antikörpern zusammen, die durch die Ausgangshybridomen (Anti-IgD und Anti-Prolactin) produziert werden. Die dritte Bande wandert mittwegs zwischen den monoklonalen Ausgangsantiköiperbanden, wie für den Hybrid-Antikörper zu erwarten.
Daß ein monoklonaler Hybrid-Antikörper gegen IgD und Prolactin eine Dosisantwort zeigt, wenn die Menge an Prolactin in dem zur Gewinnung der Daten der Tabelle 2 angewendeten Versuch variiert wird, wird durch die Daten der Tabelle 3 gezeigt, woder Antikörper des Klonats Nr. 2 und, als Kontrollen, Antikörper aus den Ausgangszellinien (Anti-IgD und Anti-Prolactin) verwendet wurden. -10- 5
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Tabelle 3
Ergebnisse von Versuchen unter Anwendung von Hybrid-Antikörper und variierenden Mengen von Prolactin
Prolactin ng/ml Hybrid- Antikörper1 Anti- IgD1 Anti- Prolactin 0 8010 6847 8020 10 9169 7982 7405 50 13558 7783 8314 100 17599 7654 7844 20 * cpm der ^I-IgE-Bindung 25 Diese Daten zeigen, daß die Menge von durch den Hybrid-Antikörper gebundenem Prolactin dosisabhängig ist, da die Menge von markierter IgD-Bindung zunimmt, wenn die Dosis von Prolactin erhöht wird. Im Gegensatz dazu wird keine Dosisantwort beobachtet, wenn die Ausgangsantikörper gegen IgD und Prolactin verwendet werden, da sie die Brücke zwischen dem an das Kügelchen gebundenen Prolactin und dem markierten IgD nicht bilden können. Somit kann der Hybrid-Antikörper als eine Komponente eines Tests für Prolactin verwendet werden. Maß-30 geschneiderte andere Hybrid-Antikörper bieten ähnliche Möglichkeiten für andere Tests.
Beispiel 3:
Nach einer ähnlichen Methode wie jener des Beispiels 2 wurde ein Universalausgangshybridom erzeugt, das einen monoklonalen Antikörper absondert, welcher gegen das Haptenarsenatarsenatdimer gerichtet und sowohl 35 gegen Ouabain resistent als auch gegen HAT empfindlich ist. Dieses Hybridom wurde mit einem Hybridom fusioniert, welches einen monoklonalen Antikörper mit Spezifität für carcinoembryonisches Antigen (CEA) absondert, ein Antigen, das sowohl von embryonischen Geweben als auch von verschiedenen Carcinomtypen zur Expression gebracht wird. Wieder entstanden bei der Fusion mehr als 600 Klone. Von 72 Klonen, die auf die Fähigkeit, sowohl CEA als auch Arsenat zu binden, geprüft wurden, hatten 69 beide Bindungsaktivitäten. Solche 40 Klone, die die größte Bindung zeigten, wurden für enzymgebundenen Immunoabsorbent-(ELIS A)-Test von Hybrid-
Antikörper selektiert. Für jeden Test wurde eine CEA-Lösung (600 ng oder 250 ng) über Nacht an jeden Napf einer Kunststoffmikrotiterplatte mit 96 Näpfen adsorbieren gelassen. Am nächsten Tag wurde unadsorbiertes Material aus den Näpfen mit PBS-Tween 20 ausgewaschen. Höherwertige Klone wurden zugegeben und 2 1/2 Stunden bei 35 °C bebrütet und dann von der Platte 45 abgewaschen. CEA-CEA- und CEA-Arsenatantikörper wird an die Platte über das adsorbierte Antigen gebunden verbleiben. Das zweite Antigen, Arsenylsäure, die an das Enzym Alkaliphosphatase gekuppelt ist, wurde den Näpfen während 3 Stunden bei 35 °C zugegeben. Nach einem weiteren Waschen mitPSB-Tween wurde ein Chromagensubstrat für Alkaliphosphatase; p-Nitrophenylphosphat den Näpfen zugesetzt und während 48 Stunden Farbe entwickelt Die Absorption in jedem Napf wurde bei 410 nm gemessen. Falls in einem höherwertigen Klon vorhanden, band Hybrid-50 Antikörper die an der Platte adsorbierte CEA über eine Funktionalität wobei die andere frei blieb, um an Alkaliphosphatase gekuppelte Arsenylsäure zu binden. Farbe aus dem Chromagensubstrat entwickelte sich nur, wenn die an Arsenylsäure gekuppelte Alkaliphosphatasegebunden worden ist In diesem Test zeigten 3 von 12 höherwertigen Klonen Hybrid-Antikörperaktivität wie in Tabelle 4 angegeben. -11- 55
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Tabelle 4
Demonstration von Hybrid-Antikörper mit Doppelspezifität durch enzymgebundenen Immunoabsorptions (ELISA)-Test
Absorption bei 490 nm Absorption bei 490 nm
Klon 600 ng CEA/Napf 250 ng CEA/Napf 1 0,087 0,105 0,022 0,060 2 0,082 0,054 0,023 0,033 3 0,011 0,017 0,041 0,036 Antiarsenat 0,010 0,006 0,006 0,005
Durch die vorliegende Erfindung werden auch Verfahren zur Immunodiagnose und Immunotherapie unter Verwendung von Antikörpern geschaffen, die eine Doppelspezifität aufweisen, zum Beispiel Hybrid-Antikörper, wie oben beschrieben oder aus Antikörperhalbmolekülen nach der üblichen Methode von Nisonoff und Mitarbeitern, oben, erhalten, oder Antikörpermultimere, die durch Kupplung oder Vernetzung einzelner monospezifischer Antikörper erhalten wurden. Vorzugsweise ist der bei diesen Verfahren verwendete Antikörper mit einer Doppelspezifität ein Hybrid-Antikörper, der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, da ein solcher Antikörper verläßlich als eine im wesentlichen reine Verbindung erhalten werden kann, die keine Denaturierung erfahren hat und die eine gleichmäßige Spezifität und Affinität für das Antigen hat.
Im Fall von immunodiagnostischen Anwendungen wird eine der zwei Spezifitäten des Hybrid- oder anderen Antikörpers m it doppelter Spezifität wieder gegen das Targetantigen gerichtet sein, dessen Ermittlung erwünscht ist, und die andere gegen ein anderes Antigen, das ein Hapten oder eine andere Molekularspezies, welche die Diagnose gestattet, sein kann. Zum Beispiel würde ein in der Immunohistologie nützlicher Antikörper eine erste Spezifität für ein vermutetes Antigen haben, zum Beispiel ein tumorassoziiertes Antigen, wie CEA, PAP oder Ferritin, und eine zweite Spezifität gegen ein Hapten oder Antigen, welches an einer Farbreaktion teilnimmt, wie ein Enzym, welches eine Farbreaktion in Gegenwart eines geeigneten Substrates hervorruft. Zu geeigneten Enzymen, gegen die die zweite Spezifität des Antikörpers gerichtet sein kann, gehören Prostatinsäurephosphatase (PAP), Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase und Alkaliphosphatase.
Zur Ausführung der histologischen Prüfung wird ein Gewebeabschnitt zuerst mit dem Antikörper mit Doppelspezifität behandelt Vor diesem Vorgang kann man das Hybrid bereits das Enzym binden gelassen haben, welches die Farbreaktion katalysiert. Falls dies nicht der Fall ist, wird der Abschnitt dann mit einer zweiten Lösung behandelt, die das Enzym enthält und nach einer entsprechenden Bebrütung abgespült und dann mit dem Substrat behandelt, welches eine Farbänderung in Gegenwart des Enzyms eingeht Die Bildung der von dem Enzym und Substrat in der Gewebeprobe erzeugten Farbe ist eine positive Anzeige für das Vorhandensein des Targetantigens in dem Gewebe. Der Hybrid-Antikörper gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung hier beschrieben ist, bindet wie gefunden wurde, an HBsAg auf einem Testsubstrat (Polystyiolkugeln), und an PAP in einem simulierten Farb-experiment, unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphat als Enzymsubstrat. Nach Bebrütung des Hybrid-Antikörpers mit PAP und dem HBsAg ergibt die Zugabe des p-Nitrophenylphosphats in den Kugeln das Auftreten der charakteristischen Gelb- zu Braunfarbänderung.
Wie in Beispiel 2 angegeben, kann ein Antikörper mit Doppelspezifität auch in Immunotests und immuno-metrischen Tests verwendet werden. Unter Verwendung des Hybrid-Antikörpers gegen HBsAg und PAP, dessen Herstellung oben beschrieben ist kann ein immunometrischerTestfürHBsAgunterVerwendung eines immobilisierten monoklonalen Antikörpers gegen HBsAg als eine feste Phase ausgeführt werden, um HBsAg aus einem Serum oder einer anderen flüssigen Probe, worin der Antigengehalt vermutet wird, zu extrahieren. Die Probe wird mit einer Kugel, mit Kügelchen, Teströhrchen oder anderem Substrat, welches das Anti-HBsAg an seiner Oberfläche gebunden oder als Überzug aufweist, bebrütet. Im Anschluß an die Bebrütung mit der Serumprobe, gleichzeitig damit oder vorhergehend, kann eine Bebrütung mit einer Lösung des Hybrids vorgenommen werden. In jedem Fall wird, falls in der Probe HBsAg vorhanden ist, das Ergebnis die Bildung eines Sandwiches aus dem immobilisierten Antikörper, HBsAg, falls in der Probe vorhanden, und dem Hybrid-Antikörper sein. Als einen Teil des T ests läßt man PAP an den Hybrid-Antikörper binden. Dies kann während oder nach der Bildung des Sandwiches erfolgen, oder als Alternative kann der Antikörper-PAP-Komplex vorgebildet werden. Nach Bildung des Sandwiches wird die feste -12-
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Phase gewaschen, um einen Proberückstand und ungebundenen Hybrid-Antikörper zu entfernen, und dann mit einer Lösung in Berührung gebracht, die ein Substrat, wie p-Nitrophenylphosphat oder α-Naphtholphosphat, enthält, welches in Gegenwart von PAP eine Farbänderung erfährt. Das Auftreten der Farbänderung bestätigt das Vorliegen von Targetantigen in der Probe.
In einem solchen Test, unter Verwendung der polyklonalen Anti-HBsAg-Kügelchen eines im Handel erhältlichen Diagnosebestecks fürHBsAg, hergestellt von AbbottLaboratories of North Chicago, Illinois (unter dem Namen „Aushia“ im Handel), wurden Proben, die verschiedene Mengen von HBsAg enthielten, mit den Kügelchen bebrütet. Die verwendeten Proben waren die posiüven und negativen Kontrollen aus dem im Handel erhältlichen Besteck und zwei Proben, die durch Verdünnung der positiven Kontrolle mit negativer Kontrolle in den Verhältnissen von entweder 1 Teil negativer Kontrolle: 2 Teilen positiver Kontrolle oder 2 Teilen negativer Kontrolle: 1 Teil positiver Kontrolle erhalten wurden.
Nach Bebrütung der Proben mit dem Kügelchen, um HBsAg zu binden, wurde das Kügelchen gewaschen und mit dem Hybrid Antikörper bebrütet, der sowohl gegenüber HBsAg als auch PAP reaktionsfähig ist Dies gestattet die Bildung eines Sandwiches von immobilisierten Antikörpern: Antigen: und Hybrid-Antikörper. Das Kügelchen wurde erneut gewaschen und mit einer Lösung von PAP bebrütet. Dieser Bebrütung folgte eine weitere Wäsche und das Kügelchen wurde mit einem Substrat von α-Naphtholphosphat bebrütet PAP entfernt Phosphat enzymatisch. Nach einer entsprechenden Bebrütung wurde das Substrat vom Kügelchen entfernt und es wurde ihm ein IndikatorfarbstoffFastGametGBC-Salz,4-Amino-2,3-dimethylazol, zugesetzt welcher von klar zu einem rötlichen Purpur in Gegenwart desProduktes der enzymatischen Reaktion umschlägt. Es wurdeeineFarbänderungbeobachtet, die das Vorliegen von HBsAg in den Proben bestätigt Die Absorption bei 570 nm wurde an den Proben gemessen und diese Daten sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben.
Tabelle 5 HBsAg-Konzentration Absorption (% positiver Kontrolle) 570 nm 0 0,031 34 0,166 67 0,243 100 0,379
Diese Daten zeigen eine Dosisantwort bei Variation der HBsAg-Konzentration, die zu erwarten war, falls der Hybrid-Antikörper eine Brücke zwischen dem an die Kugel gebundenen HBsAg undPAP büdet. Dies zeigt weiterhin die Brauchbarkeit eines Hybrid-Antikörpers in einem Immunotest
Andere, von enzymatisch katalysierten Reaktionen verschiedene Feststellungsmittel sind auch möglich. Zum Beispiel kann die zweite Spezifität des Hybrids oder des anderen Antikörpers mit Doppelspezifität gegen ein Hapten oder Antigen gerichtet sein, das ra'.liomarkiert ist oder das ein Fluoreszenzstoff ist oder das in dem Sandwich durch irgendwelche andere geeignete Mittel feststellbar ist
Ein bevorzugtes Verfahren, bei welchem ein Hybrid-Antikörperoderein anderer Antikörper mitDoppelspezifität in einem Immunotest benützt wird, wertet das Phänomen der Fluoreszenzlöschung aus. In einem solchen Test ist eine Spezifität des Antikörpers gegen ein Targetantigen gerichtet und das andere gegen beispielsweise ein Hapten, das einen fluoreszierenden Chromophor trägt. Der Chromophor ist entweder an das Hapten gebunden oder kann in entsprechenden Fällen das Hapten selbst sein.
Der Test wird durch Bebrüten des Antikörpers mit Serum oder einer anderen Probe ausgeführt, von dem bzw. der vermutet wird,daß es bzw.sietargetantigenhältigist, zu welchem(welcher)eine vorbestimmte Menge Targetantigen, die mit einem Löschchromophor markiert ist, zugegeben worden ist Das markierte Antigen konkurrenziert mit dem Targetantigen in der Probe, falb ein solches vorliegt, hinsichtlich der Antikörperbindungsstelle, die für das Targetantigen spezifisch ist. Vor. während oder nach dieser Bebrütung wird eine Menge des Haptens, das den fluoreszierenden Chromophor trag l, mit dem Antikörper bebrütet und wird an der anderen Bindungsstelle gebunden.
Die zwei Chromophore werden so ausgewählt, daß der erste von diesen bei einer Wellenlänge fluoresziert, die durch den anderen absorbiert (gelöscht) werden kann, falls sie nahe genug zueinander angeordnet sind, so daß das durch den Fluoreszenzgeber emittiertePhotondurchden Löschereingefangen ^werden kann. Umdies zubewerkstelligen, sollen die zwei Chromophore innerhalb etwa 10 nm und vorzugsweise innerhalb etwa 5 nm zueinander liegen. Diese -13-
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Positionierung wird auftreten, wenn der fluoreszierende Chromophor an eine Antikörperbindungsstelle gebunden ist, und der Löschchromophor an das zugesetzte Antigen an der anderen Stelle gebunden ist. Ein geeignetes Paar von Chromophoren umfaßt Fluorescin als den fluoreszierenden Chromophor und Rhodamin als den Löschchromophor.
Die gemessene Fluoreszenz wird in umgekehrtem Verhältnis zu der Menge an nativem Antigen in der Probe variieren, da bei Fehlen von nativem Antigen das gesamte, an den Antikörper gebundene Antigen mit dem Löschchromophor markiert und so angeordnet sein wird, daß es die Fluoreszenz von dem durch das Hapten getragenen Chromophor absorbiert Ein Vergleich der gemessenen Fluoreszenz mit jener einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge Antigen enthält, gestattet eine qualitative und quantitative Bestimmung des Vorliegens von Antigen in der Probe.
Diese Art von Immunotestkann zum Beispiel benutzt werden, um die Mengen an Arzneimittel, wie Dilantin, die streng überwacht werden müssen, im Serum zu bestimmen. In einem solchen Test würde das Targetantigen selbstverständlich Dilantin sein. Es ist für den Sachverständigen ersichtlich, daß dieses Verfahren verwendet werden kann, um auch andere Antigene zu ermitteln, einschließlich, im speziellen, tumorassoziierte Antigene.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren, bei welchem ein Hybrid-Antikörper oder anderer Antikörper mit einer Doppelspezifität in einem Immunotest benützt wird, beruht auf einer enzymatischen Reaktion. In einem derzeit bevorzugten Verfahren ist eine der Antikörperspezifitäten selbstverständlich auf das Targetantigen und die andere auf ein Enzym oder ein Hapten, an das ein Enzym gebunden ist, gerichtet
Der Test wird durch Bebrüten des Antikörpers mit einer Probe ausgeführt, von der vermutet wird, daß sie das Targetantigen enthält, zu welcher eine vorbestimmte Menge des Targetantigens zugesetzt worden ist welches durch Bindung einer Substanz an dieses modifiziert worden ist, welche Substanz mit dem Enzym unter Bildung einer ermittelbaren Substanz oder in anderer Weise in Wechselwirkung tritt um die Feststellung der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes zu gestatten. Die Ermittlung kann zum Beispiel durch Fluorimetrie, Lumineszenz, Spektrophotometrie od. dgl. erfolgen.
Bei einem alternativen Verfahren kann das zugesetzte Targetantigen das Enzym an dieses gebunden aufweisen, in welchem Falle der Antikörper eine seiner Spezifitäten gegen die Substanz gerichtet hat welche mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt, oder gegen ein Hapten, an das die Substanz gebunden ist
Die Substanz, welche mit dem Enzym in Wechselwirkung tritt kann selbst ein anderes Enzym sein. In einem solchen Falle katalysiert eines der Enzyme die Produktion eines Produktes, das von dem anderen benötigt wird. Wenn somit der Antikörper sowohl das zugesetzte Targetantigen, an welches eines der Enzyme gebunden ist, als auch das andere Enzym bindet so wird das Produkt der ersten enzymatischen Reaktion in der Nähe des zweiten Enzyms gebildet und kann eine durch das letztere Enzym katalysierte Reaktion eingehen, bevor eine signifikante Diffusion des Produktes in das umgebende Medium erfolgen kann.
Ein Beispiel für ein solches Verfahren unter Verwendung von zwei Enzymen, nämlich Hexokinase (HK) und Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH), ist in dem folgenden Reaktionsschema angegeben. (1) Adenosintriphosphat + Glucose (ATP)
Adenosindiphosphat + Glucose-6-phosphat (ADP) (2) Glucose-6-phosphat + f licotinamidadenindinucleotid (NAD+) —6-6-PDH— Gluconolacton-6-phosphat + Dihydronicotinamidadenindinucleotid (NADH)
Zur Auswertung dieses Reaktions^chemas wird das zugesetzte Targetantigen entweder HK oder G-6-PDH an dieses gebunden aufweisen und der Hybrid-Antikörper wird eine seiner Spezifitäten gegen das andere (oder ein es tragendes Hapten) gerichtet haben. D e Probe weist außer dem Hybrid-Antikörper und der vorbestimmten Menge an enzymmarkiertem Antigen Glucose, ATP und das Coenzym NAD+ als Zusätze auf. Der Hybrid-Antikörper hat vorzugsweise das andere Enzym bereits an sich gebunden. Alternativ kann dieses Enzym der Probe mit den anderen Reagenzien zugesetzt werden. Während der Bebrütung wird das enzymmarkierte Antigen mit dem nativen Antigen in der Probe, falls ein solches -14-
AT 394 577 B vorhanden ist, hinsichtlich einer der Hybrid-Antikörper-Bindungsstellen konkurrenzieren. Das andere Enzym ist oder wird an die zweite Bindungsstelle gebunden. Dies gestattet es, daß die durch HK katalysierte Bildung von Glucose-6-phosphat in nächster Nähe zu G-6-PDH erfolgt. Das letztere wandelt das Glucose-6-phosphat in Gluconolacton-6-phosphat um, ein Ergebnis, das von der Reduktion von N AD+ zu NADH begleitet ist. Das NADH absorbiert staik bei 340 nm und kann daher spektrophotometrisch ermittelt werden. Die Menge an gebildetem NADH variiert im umgekehrten Verhältnis mit der Menge an nativem Antigen in der Probe, d. h. seine maximale Bildung tritt auf, wenn kein Targetantigen in der zu prüfenden Probe enthalten ist Ein Vergleich der Menge des gebildeten NADH mit einer Kontrollprobe gestattet eine qualitative und quantitative Bestimmung des Vorliegens von Antigen in der Probe.
Diese Art von Test kann benützt werden, um die Menge von Dilantin oder anderen Arzneimitteln im Serum zu überwachen. In einem solchen Fall ist das Arzneimittel das Targetantigen. Ein solcher Testkann jedoch auch benützt werden, um andere Serumantigene zu ermitteln, wie solche, die mit Tumoren oder anderen Krankheiten im Zusammenhang stehen.
Eine in vivo-Immunodiagnose kann auch unter Verwendung eines Hybrids oder eines anderen Antikörpers mit Doppelspezifität ausgeführt werden. Der Antikörper mit einer Spezifität gegen ein Targetantigen, wie ein tumorassoziiertes Antigen, und der zweiten, gegen ein Hapten, an welches ein geeignetes Radionuclid, vorzugsweise ein solches, das γ-Strahlung emittiert, gebunden ist, wird zuerst an den Wirt verabreicht. Nachdem eine genügend lange Zeit verstrichen ist, während welcher der Antikörper sich an der Targetstelle lokalisiert hat und ungebundener Antikörper aus gesundem Gewebe im Wirt hat austreten können, wird das das Radionuclid tragende Hapten verabreicht und bindet sich an den lokalisierten Antikörper. Nach einem geeigneten Zeitraum, der dazu dient, daß ungebundenes Hapten den Wirt verlassen kann, wird eine Abtastung des Wirtes mit einer geeigneten Kamera ausgeführt, um zu bestimmen, ob es Bereiche gibt, in welchen sich die Strahlung angereichert hat. Falls solche vorliegen, wird die Anwesenheit des Targetantigens in dem Wirt bestätigt und dessen Lage bestimmt.
Dieses Verfahren hat verschiedene Vorteile gegenüber jenem, bei dem monospezifischer Antikörper verwendet wird, der gegen das Targetantigen gerichtet ist, an welches das Radionuclid direkt gebunden ist. In solchen Fallen muß das Radionuclid eine genügend lange Halbwertszeit haben, damit nach Ablauf der für eine wesentliche Lokalisierung des Antikörpers an der Targetstelle notwendigen Zeit eine genügende Menge zurückbleibt. Ferner kann während dieses V erfahrens der Antikörper für einen Zeitraum in der Leberoder in anderen Nicht-Targetgeweben zurückgehalten werden, welche dann der vom Antikörper mitgeführten Strahlung unterworfen werden. Die vorliegende Erfindung gestattet anderseits die Verwendung von Radionucliden, die kürzere Halbwertszeiten als jene aufweisen, welche mit monospezifischen Antikörpern verwendet werden. Das das Radionuclid führende Hapten, das ein relativ kleines Teilchen ist, hat in vivo eine hohe Mobilität und wird rasch durch den Wirt wandern und entweder sich an den Antikörper binden, der sich an der Targetstelle lokalisiert hat, oder den Körper verlassen, ohne in Nicht-Targetgewebe nennenswerte Zeit zu verbleiben. Aus diesem Grunde können Isotopen mit kurzer Halbwertszeit in Mengen verabreicht werden, welche das minimale Risiko für gesundes Gewebe selbst dann ergeben, wenn die Verabreichung in wesentlichem Überschuß erfolgt
Vorzugsweise ist das Hapten ein Mittel, an das das Radionuclid direkt gebunden ist oder welches mit dem Radionuclid eine komplexe Bindung eingehen wird. Es kann ein chelatbildendes Mittel für das an ein Hapten gebundene Radionuclid zu dem letzteren Zweck verwendet werden. Für den Sachverständigen wird es ersichtlich sein, daß eine umfassende Vielfalt von chelatbildenden Mitteln und Radionucliden für diesen Zweck geeignet sind. Phenylarsenat, an welches Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) als ein chelatbildendes Mittel gebunden ist, ist ein geeignetes Hapten. Ein Radionuclid, das zur Verwendung mit diesem Hapten geeignet ist, ist11 *In.
Der Antikörper mit Doppelspezifität kann auch in der Immunotherapie verwendet werden, indem er so aufgebaut wird, daß er eine Spezifität gegen ein mit einer Krankheit assoziiertes Antigen hat und die andere gegen ein Haptan hat, welches ein für das Antigen oder das erkrankte Gewebe, mit welchem das Antigen assoziiert ist und welches zu zerstören erwünscht ist, letales Mittel ist, oder an ein solches letales Mittel gebunden ist. Zum Beispiel kann der Antikörper eine Spezifität gegen ein tumorassoziiertes Antigen, wie PAP, carcinoembryonisches Antigen (CEA), Ferritin oder anderes solches Antigen aufweisen, und eine zweite Spezifität, die gegen ein Hapten gerichtet ist, an welches ein Radionuclid, vorzugsweise eines, welches a- oder ß-Strahlung emittiert, gebunden ist, oder welches Hapten eine Ricin A-Kette oder ein anderes Toxin oder Arzneimittel umfaßt. Unter solchen Arzneimitteln können Gelonin, α-Amanitin, Diphtherietoxin A, Methotrexat, Dichlormethatrexat, Dounomycin undChlorombucil erwähnt werden. Falls das Toxin oder Arzneimittel selbst als ein Hapten fungieren kann, braucht es selbstverständlich nicht an irgendeinen anderen Rest gebunden sein.
In dem Falle, wo ein Radionuclid als das letale Mittel zu verwenden ist, wie eben in der Situation, wo diese für in vivo-Immunodiagnose verwendet werden, kann das Hapten das Radionuclid direkt an dieses gebunden aufweisen oder das Hapten kann ein Mittel, wie ein chelatbildendes Mittel, sein oder an es gebunden aufweisen, welches mit dem Radionuclid einen Komplex bilden wird. In einem solchen Falle wird das Hybrid oder der andere Antikörper -15-
Claims (54)
- AT 394 577 B mitDoppelspezifitätdem erkrankten Wirt verabreicht und es wird ermöglicht, daß eine Lokalisierung derselben bzw. desselben an der Stelle des angegriffenen Gewebes erfolgt und ein etwaiger Überschuß den Wirt verläßt, worauf die Verabreichung des Haptens folgt, welches durch den Antikörper, wo immer er sich lokalisiert hat, gebunden wird. Dies gestattet die Verwendung eines Radionuclids mit einer kurzen Halbwertszeit, welches das Risiko der Schädigung von gesundem Gewebe selbst dann auf ein Minimum herabsetzt, wenn das das Radionuclid tragende Hapten in wesentlichem Überschuß verabreicht wird, weil ein solcher Überschuß den Körper rasch verlassen wird und sich in gesundem Gewebe nicht in wesentlichen Mengen lokalisiert, weil die Größe des Haptens relativ gering ist. Es wird auch die Möglichkeit ausgeschaltet oder verringert, daß zirkulierendes Targetantigen Antikörper binden wird, der eine für das Gewebe letale Substanz trägt, und diese bei gesundem Gewebe freisetzt, wie dies Vorkommen kann, wenn das letale Mittel direkt an einen monospezifischen, gegen das Targetantigen gerichteten Antikörper gebunden ist. Ein Beispiel für ein Hapten, an das ein Radionuclid direkt gebunden ist, ist 6-^*At-Astato-2-methyl-l,4- naphthochmol-bis(dinatriumphosphat), welches in „International Journal of Applied Radiation and Isotopes“, 33, 911 75 (1982), beschrieben ist. Das At ist ein Emitter von α-Strahlung. Sachverständige werden erkennen, daß es zahlreiche geeignete Radionuclide gibt, welche unmittelbar an Haptene gebunden oder mit einem Hapten mittels irgendeines einer umfassenden Vielheit von chelatbildenden Mitteln komplexiert werden können. PATENTANSPRÜCHE 1. Ein Polydom, welches ein Gemisch ausbildet, das einen monoklonalen Hybridantikörper mit Doppelspezifität und zwei monospeziftsche Antikörper im Verhältnis von etwa 2:1:1 umfaßt, welches Polydom durch Fusionieren eines Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste Antigendeterminante produziert, mit einem B-Lymphozyten, welcher einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante absondert, in Anwesenheit eines fusionsbegünstigenden Mittels hergestellt ist.
- 2. Ein Polydom, welches ein Gemisch, umfassend einen monoklonalen Hybridantikörper mit einer Doppelspezifität und zwei monospezifische Antiköiper im Verhältnis von etwa 2:1:1, produziert, welches Polydom durch Fusionieren eines Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste Antigendeterminante absondert, mit einem zweiten Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante absondert, in Anwesenheit eines fusionsbegünstigenden Mittels hergestellt ist.
- 3. Ein Polydom, welches ein Gemisch, umfassend einen monoklonalen Hybridantikörper mit Doppelspezifität und zwei monospezifische Antikörper im Verhältnis von etwa 2:1:1, produziert, welches Polydom durch Entfernen des NukleusauseinererstenHybridomzelle, weicheeinen monoklonalen Antikörpergegeneineerste Antigendeterminante produziert, und Insertieren des Kernes in das Zytoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante produziert, erhalten worden ist.
- 4. Verfahren zur Herstellung eines Polydoms, welches ein Gemisch ausbildet, umfassend einen monoklonalen Hybridantikörper mit Doppelspezifität und zwei monospezifische Antikörper im Verhältnis von 2:1:1, gekennzeichnet durch die Fusionierung eines Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste Antigendeterminante produziert, mit einem B-Lymphozyten, welcher einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante absondert, in Gegegenwart eines fusionsbegünstigenden Mittels.
- 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Hybridom eingesetzt wird, das selektiv zerstörbar ist.
- 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom rückselektiert worden ist, um Zellen zu erhalten, die gegenüber einem Medium, in welchem das Polydom gezüchtet werden kann, empfindlich sind. -16- AT 394 577 B
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückselektion durch Züchten von Zellen des Hybridoms in einem Medium bewirkt wird, welches 8-Azaguanin, 6-Thioguanin, 5-Bromuracyldeoxyribose oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten werden, die gegen Hypoxanthinaminopterinthymidin enthaltendes Medium empfindlich sind.
- 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte selektiv zerstörbare Hybridom durch irreversible Enzymhemmung erhalten worden ist.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hemmung unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors erhalten worden ist.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Kcat-Inhibitor ist
- 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Kcat-Inhibitor aus Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin ausgewählt ist
- 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der B-Lymphozyt eine Säugetiermilzzelle ist.
- 13. Verfahren zur Herstellung eines Polydoms, das ein Gemisch, umfassend einen monoklonalen Hybridantikörper mitDoppelspezifitätundzwei monospezifische Antikörperim Verhältnis vonetwa2:1:1,absondert, gekennzeichnet durch das Fusionieren eines ersten Hybridoms, das einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste Antigendeterminante absondert, mit einem zweiten Hybridom, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante absondert, in Gegenwart eines Fusionspromotors.
- 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes und ein zweites Hybridom eingesetzt werden, die selektiv zerstörbar sind.
- 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eines der Hybridomen rückselektiert worden ist, um Zellen zu erhalten, die gegen ein Medium empfindlich sind, in welchem das Polydom gezüchtet werden kann.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß beide der Hybridomen rückselektiert worden sind.
- 17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückselektion durch Züchten von Zellen des Hybridoms in einem Medium bewirkt wird, welches 8-Azaguanin, 6-Thioguanin, 5-Bromuracyl oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten werden, die gegen ein Hypoxanthinaminopterinthymidin enthaltendes Medium empfindlich sind.
- 18. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten selektiv zerstörbaren Hybridome durch irreversible Enzymhemmung erhalten worden sind.
- 19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Hemmung unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors erzielt wird.
- 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Kcat-Inhibitor ist.
- 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor aus Azaserin oder 5-Diazo-5-oxa-L-norleucin ausgewählt ist.
- 22. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein erstes Hybridom eingesetzt wird, das selektiv zerstörbar ist
- 23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das selektiv zerstörbare Hybridom weiterhin so ausgewählt wird, daß es die Fähigkeit dafür mitbringt, in einem Medium zu überleben, das für das andere Hybridom letal ist. -17- AT 394 577 B
- 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das selektiv zerstörbare Hybridom gegenüber einem Ouabain enthaltenden Medium resistent ist
- 25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom rückselektiert worden ist, um Zellen zu erhalten, die gegen ein Medium empfindlich sind, in welchem das Polydom gezüchtet werden kann.
- 26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückselektion durch Züchten von Zellen des Hybridoms in einem Medium bewirkt wird, das 8-Azaguanin, 6-Thioguanin, 5-Bromuracyldeoxyribose oder 2-Aminopurin enthält, wobei Hybridomzellen erhalten werden, die gegen ein Hypoxanthinaminopterinthymidin enthaltendes Medium empfindlich sind.
- 27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das selektiv zerstörbare Hybridom durch irreversible Enymhemmung erhalten worden ist.
- 28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Hemmung unter Verwendung eines Stoffwechselinhibitors erhalten worden ist.
- 29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor ein Kca(-Inhibitor ist
- 30. Verfahren zur Herstellung einesPolydoms, welches ein Gemisch, umfassendeinen monoklonalenHybridantikörper mitDoppelspezifitätund zwei monospezifische Antikörperim Verhältnis von etwa2:1:1, absondert gekennzeichnet durch die Entfernung des Nukleus aus einer ersten Hybridomzelle, welche einen monoklonalen Antikörper gegen eine erste Antigendeterminante ausbildet und ein Insertieren des Nukleus in das Zytoplasma eines zweiten Hybridoms, welches einen monoklonalen Antikörper gegen eine zweite Antigendeterminante produziert.
- 31. Verfahren zur Erzeugung eines monoklonalen Hybridantikörpers mit Doppelspezifität gekennzeichnet durch die Isolierung des Antikörpers aus Zellen eines Polydoms, das nach dem Verfahren eines der Ansprüche 4 bis 30 erzeugt worden ist.
- 32. Immunometrisches Verfahren zum Binden eines letalen Mittels an ein krankheitsassoziiertes Antigen, gekennzeichnet durch: a) die Verabreichung eines nach dem Verfahren von Anspruch 31 erhaltenen Antikörpers mit Doppelspezifität an einen vom Menschen verschiedenen Wirt, dessen eine Spezifität gegen ein krankheitsassoziiertes Antigen und dessen andere gegen ein Hapten gerichtet ist wobei das Hapten ein Mittel ist, welches gegen das Antigen oder assoziierte Gewebe letal ist, oder das daran ein letales Mittel gebunden aufweist und b) die Verabreichung des Haptens nach Verstreichen genügender Zeit um es dem Antikörper zu ermöglichen, das krankheitsassoziierte Antigen zu binden.
- 33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet daß das letale Mittel ein Radionuclid oder ein Gewebetoxin ist
- 34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Hybridantikörper ist der von einem Polydom erzeugt ist.
- 35. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper ein Hybridantikörper ist, der durch dieReassoziation von Antikörperhalbmolekülen, welche durch die selektive Spaltung eines monospezifischen Antikörpers gegen das krankheitsassoziierte Antigen erhalten worden ist, und von einem monospezifischen Antikörper gegen das Hapten erzeugt worden ist.
- 36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die selektiv gespaltenen Antikörper monoklonale Antikörper sind.
- 37. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Multimer eines Paares von intakten monospezifischen Antikörpern ist, wobei einer der genannten monospezifischen Antikörper gegen das krankheitsassoziierte Antigen und der andere gegen das Hapten gerichtet ist. -18- AT 394 577 B
- 38. Immunodiagnostisches in vivo-Verfahren zur Feststellung eines Antigens, gekennzeichnet durch: a) die Verabreichung eines nach dem Verfahren von Anspruch 31 erhaltenen Antikörpers mit Doppelspezifität an einen vom Menschen verschiedenen Wirt, wobei eine Spezifität desselben gegen ein krankheitsassoziiertes Antigen und die andere gegen ein ein Radionuclid tragendes Hapten gerichtet ist; b) die Verabreichung des Haptens nach Verstreichen genügender Zeit, um eine Bindung des Antikörpers an das krankheitsassoziierte Antigen zu ermöglichen; und c) das Abtasten des Wirtes zur Feststellung des Ortes der vom Radionuclid emittierten Strahlung.
- 39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Hybridantikörper ist, der von einem Polydom erzeugt ist
- 40. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Hybridantikörper ist, der durch Reassoziation von Antikörperhalbmolekülen, die durch die selektive Spaltung eines monospezifischen Antikörpers gegen das krankheitsassoziierte Antigen »halten worden sind, und von einem monospezifischen Antikörper gegen das Hapten erzeugt worden ist
- 41. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Multimer eines Paares von intakten, monospezifischen Antikörpern ist, wobei einer der genannten monospezifischen Antikörper gegen das krankheitsassoziierte Antigen und der andere gegen das Hapten gerichtet ist.
- 42. Immunotestverfahren zum Feststellen des Vorliegens einer Menge eines Analyten, gekennzeichnet durch: a) das Versetzen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie ein Targetantigen enthält, mit einer vorbestimmten Menge des Targetantigens, an welches ein Chromophor fixiert ist; b) das Versetzen der Probe mit einem nach dem Verfahren von Anspruch 31 erhaltenen Antikörper mit einer Doppelspezifität, wovon eine Spezifität gegen das Targetantigen und die andere gegen ein Hapten gerichtet ist, welches ein fluoreszierender Chromophor ist, oder an das ein solcher gebunden ist, welcher Chromophor bei einer Wellenlänge fluoresziert, die durch den Chromophor an dem Targetantigen absorbierbar ist, wenn diese Chromophore innerhalb etwa 10 nm voneinander liegen; c) das Binden des Haptens an den Antikörper; d) das Messen der Fluoreszenz der Probe nach einem Bebrütungszeitraum; e) das V ergleichen der Intensität der Fluoreszenz der Probe mit jener einer Kontrollprobe, die einebekannte Menge an Targetantigen enthält
- 43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Hapten an den Antikörper gebunden wird,bevor der Antikörper der Probe zugesetzt wird.
- 44. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Hybridantikörper ist, der von einem Polydom produziert wird.
- 45. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Hybridantiköiper ist, der durch Reassoziation von Antikörperhalbmolekülen, welche durch die selektive Spaltung eines monospezifischen Antikörpers gegen das krankheitsassoziierte Antigen erhalten worden sind, und von einem monospezifischen Antikörper gegen das Hapten erzeugt wurde.
- 46. Verfahren nach Anspruch 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Multimer eines Paares intakter, monospezifischer Antikörper ist, wobei einer der genannten monospezifischen Antikörper gegen das Targetantigen und der andere gegen das Hapten gerichtet ist.
- 47. Verfahren nach Anspruch42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, daß der fluoreszierendeChromophorFluorescin und der nicht-fluoreszierende Quenchchromophor Rhodamin ist
- 48. Immunotestverfahren zum Feststellen des Vorliegens einer Menge eines Analyten, gekennzeichnet durch: a) das Versetzen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie ein Targetantigen enthält, mit ein» vorbestimmten Menge des Targetantigens, an welches eine Substanz gebunden ist die zur Wechselwirkung mit einem Enzym unter Bildung eines feststellbaren Produktes befähigt ist; -19- AT 394 577 B b) das Versetzen der Probe mit einem nach dem Verfahren von Anspruch 31 erhaltenen, eine Doppelspezifität aufweisenden Antikörper, von dem eine Spezifität gegen das Targetantigen und die andere gegen das Enzym oder ein Hapten, an welches das Enzym gebunden ist, gerichtet ist; c) das Binden des Haptens an den Antikörper; d) das Messen der Bildung der feststellbaren Substanz nach einem Bebrütungszeitraum; e) das Vergleichen der Bildung der feststellbaren Substanz mit jener einer Kontrollprobe, die eine bekannte Menge von Targetantigen enthält.
- 49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an den Antikörper gebunden wird, bevor der Antikörper der Probe zugesetzt wird.
- 50. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Hybridantikörper ist, der von einem Polydom erzeugt worden ist.
- 51. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Hybridantikörper ist, der durch die Reassoziation von Antikörperhalbmolekülen, die durch selektive Spaltung eines monospezifischen Antikörpers gegen das taigetassoziierte Antigen erhalten worden sind, und von einem monospezifischen Antikörper gegen das Hapten erzeugt worden ist.
- 52. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Multimer eines Paares intakter monospezifischer Antikörper ist, wobei einer der genannten monospezifischen Antikörper gegen das krankheitsassoziierte Antigen und der andere gegen das Hapten gerichtet ist.
- 53. Verfahren nach Anspruch 48 oder 49, dadurch gekennzeichnet, daß die an das Targetantigen gebundene Substanz ein zweites Antigen ist und worin ein Enzym die Bildung eines Produktes katalysiert, welches mit einem weiteren Enzym unter Bildung einer feststellbaren Substanz in Wechselwirkung tritt.
- 54. Verfahren nach Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, daß die feststellbare Substanz durch ihre Fluoreszenz, Lumineszenz oder spektroskopischen Eigenschaften festgestellt wird. -20-
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