NL8501219A - Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan. - Google Patents

Description

NO 32967 -1- * ^

Immunologisch complex, de bereiding en toepassing daarvan.

Bij het uitvoeren van immunologische bepalingen is het noodzakelijk de mate, waarin een immunologische reactie (antigeen-antilichaam-reactie) heeft plaatsgevonden, te meten. In het algemeen moet het anti-5 geen of het antilichaam daarom voorzien worden van een detecteerbare groep (label). Hiervoor zijn reeds verschillende methoden in gebruik, waarvan het merken met radioactieve, fluorescerende, chemiluminescerende of enzymatisch actieve atomen of groepen genoemd kan worden. In het algemeen worden deze detecteerbare groepen of atomen langs chemische IQ weg in het antigeen of het antilichaam ingevoerd. Verschillende chemische koppelingsmethoden, in het bijzonder voor enzymen,,zijn besproken in Immunohistochemistry 20 (1983), biz. 87-100. Bij het chemisch koppelen van enzymen aan antilichamen gebruikt men doorgaans bifunctionele koppelingsmiddelen, die zowel met het enzym als met het antilichaam 15 reageren. De chemische koppelingsmethoden hebben verscheidene nadelen.

Zo kan het antilichaam door reactie met het koppelingsmiddel gedenatureerd worden, terwijl steeds ook met zichzelf gekoppeld enzym en met zichzelf gekoppeld antilichaam naast het gewenste gemerkte antilichaam worden verkregen.

20 Een andere benadering van het merken van antilichamen is beschreven in Nature 305 (1983), blz. 537-540. Deze publikatie betreft de produktie van hybride antilichamen, die zich met twee verschillende antigenen kunnen binden. De produktie van deze hybride antilichamen geschiedt met behulp van hybride hybridoma's. In het bijzonder is een anti-somatostatine-anti-25 peroxidase antilichaam beschreven, dat derhalve zowel met een label, het enzym peroxidase, als met somatostatine kan reageren. Hoewel deze bifunctionele antilichamen een verbetering ten opzichte van de langs chemische weg gemerkte antilichamen betekenen, hebben ze toch het nadeel, dat voor elk afzonderlijk bifunctioneel antigeen een hybridoma gecon-30 strueerd moet worden, hetgeen zeer tijdrovend is.

Gevonden werd nu, dat immunologische reagentia, die twee verschillende functies bezitten, op een veel eenvoudiger wijze bereid kunnen worden. Er is namelijk gevonden, dat antilichamen van een eerste diersoort een cyclisch tetrameer complex vormen met monoclonale antilichamen 35 van een tweede diersoort, waarvan de Fab-fragmenten gericht zijn tegen de Fc-fragmenten van de eerste diersoort. Het cyclische tetramere complex is opgebouwd uit twee moleculen van antilichamen van de eerste diersoort en twee moleculen van de antilichamen van de tweede diersoort.

C; i? <?'. ·* ^ Ü £ w -> - —' i -2- i ?

Deze cyclische tetramere complexen bezitten een grote stabiliteit. Wanneer de antilichamen van de eerste diersoort van elkaar verschillend zijn is het immunologische complex bifunctioneel en kan op dezelfde manier gebruikt worden als de boven vermelde bifunctionele antilichamen, 5 die met hybridoma’s geproduceerd kunnen worden.

De uitvinding betreft in de eerste plaats een immunologisch complex, dat is opgebouwd uit twee antilichamen van een eerste diersoort, die tot een cyclisch tetrameer geconjugeerd zijn met twee, tegen het Fc-fragment van de antilichamen van de eerste diersoort gerichte mono-10 clonale antilichamen van een tweede diersoort.

De belangrijkste uitvoeringsvorm van de uitvinding is een immunologisch complex, dat bifunctioneel is en waarin twee verschillende antilichamen van de eerste diersoort tot een cyclisch tetrameer geconjugeerd zijn met twee, tegen het Fc-fragment van de antilichamen van de eerste 15 diersoort gerichte monoclonale antilichamen van een tweede diersoort.

De vorming van de cyclische tetramere complexen volgens de uitvinding is aangetoond met behulp van electroforese op agarplaten en met behulp van electronenmicroscopie.

Zo werden muize-antilichamen van de immunoglobuline gamma-1 20 (IgG1) subklasse tegen het enzym peroxidase gemengd met een monoclonaal ratte-antilichaara, dat specifiek is voor muize IgG1. Laatstgenoemd antilichaam werd geselecteerd op het vermogen twee verschillende muize-antilichamen te binden. Bij reactie van het anti-enzym antilichaam met een equimolaire hoeveelheid van het ratte-antilichaam bleek nagenoeg 25 alle enzym-bindende werking bij electroforese als een enkele band te migreren met een mobiliteit, die verschillend was van die van de afzonderlijke antilichamen. Een zelfde proef werd uitgevoerd met muize-antilichamen tegen het enzym alkalische fosfatase. Ook hierbij werd een soortgelijk complex gevormd.

30 De vorming van de complexen geschiedt buitengewoon snel, in ieder geval binnen de tijd, die nodig is om de antilichamen te mengen, een monster op de agarplaat te brengen en de electroforese te beginnen. De minimaal hiervoor benodigde tijd is 20 seconden.

Wanneer men de twee anti-enzym antilichamen eerst met elkaar mengt 35 en daarna het monoclonale ratte-antilichaam toevoegt ontstaan drie verschillende complexen, namelijk een complex, dat uitsluitend het anti-peroxidase bevat, een complex dat uitsluitend het anti-alkalische fosfatase bevat en een complex dat beide anti-enzym antilichamen bevat. Wanneer men de anti-enzym antilichamen eerst afzonderlijk mengt met het 8501119 -3- ’j'ien.'ia.u monoclonale ratte-antilichaam en de beide, zo gevormde homologe complexen daarna met elkaar mengt, wordt geen bifunctioneel complex gevormd. Blijkbaar zijn de gevormde complexen zo stabiel, dat geen uitwisseling van antilichamen onderling plaats vindt. Wanneer men aan een mengsel van 5 de anti-enzym antilichamen een geringere dan equivalente hoeveelheid van het ratte-antilichaam toevoegt, worden de bovengenoemde drie complexen eveneens gevormd, doch blijft er ongebonden anti-enzym antilichaam over.

De structuur van de complexen volgens de uitvinding werd onderzocht met aftastende transmissie-electronenmicroscopie (scanning 10 transmission electron microscopy; STEM). In beelden van negatief gekleurde complexen konden structuren worden waargenomen, die overeenkomen met cyclische tetrameren van immunoglobulinen. In het beeld domineren tetramere complexen, waarvan de Fab-f ragmenten van de muize- en ratte-antilichamen samen met het Fc-fragment van de ratte-antilichamen duide-15 lijk zichtbaar zijn. Bepaalde details van de complexen, zoals de domeinen en de twee ketens van de muize-Fab-fragmenten en de ruimtelijke oriëntatie van de Fab- en Fc-fragmenten konden goed worden onderscheiden.

Uit de resultaten van de agar-gelelectroforese die in figuur 1 en in voorbeeld I zijn toegelicht en de electronenmicroscopische onder-20 zoekingen blijkt duidelijk, dat de cyclische tetramere complexen worden gevormd. De stabiele complexen volgens de uitvinding hebben blijkbaar de structuur, die in figuur 2 schematisch is aangegeven.

Wanneer men de bifunctionele complexen wil bereiden, bijvoorbeeld van antilichamen tegen peroxidase en antilichamen tegen een oppervlakte-25 antigeen op menselijke blcedplaatjes, kan men de beide antilichamen in willekeurige verhouding mengen en het mengsel laten reageren met een monoclonaal antilichaam tegen de Fc-fragmenten van de twee eerst genoemde antilichamen. De hoogste opbrengst aan bifunctioneel complex wordt echter bereikt, wanneer de antilichamen tegen peroxidase en de antilichamen 30 tegen een oppervlakte-antigeen op menselijke bloedplaatjes in equi-molaire verhouding worden gemengd. Zoals boven reeds opgemerkt, bevat het reactieprodukt steeds ook homologe complexen, in het geval van het voorbeeld complexen die alleen antilichamen tegen peroxidase en complexen die alleen antilichamen tegen een oppervlakte-antigeen op mense-35 lijke bloedplaatjes bevatten. Deze homologe complexen behoeven bij het gebruik van het reactieprodukt als immunologisch reagens niet altijd te storen. Wanneer men bijvoorbeeld het bovengenoemde reactieprodukt laat reageren met menselijke bloedplaatjes zullen de uitsluitend antilichamen tegen peroxidase bevattende complexen niet aan de bloedplaatjes 3* n i o i ö

& V V * Om i (J

V S

-4- worden gehecht. Dit is wel het geval met de beide andere complexen, doch alleen de bifunctionele complexen zullen zowel een reactie met plaatjes als een reactie met peroxidase geven.

Desgewenst kan men het bifunctionele complex in zuivere toestand 5 isoleren, bijvoorbeeld door middel van anionen-uitwisselingschromato-grafie. Ook kan men de verhouding tussen het bifunctionele complex en de beide homologe complexen in het reactieprodukt beïnvloeden door de molaire verhouding tussen de toegepaste antilichamen van de eerste diersoort te veranderen. Zo verkrijgt men bij toepassing van het 10 antiperoxidase-antilichaam en het antilichaam tegen een oppervlakte-antigeen op bloedplaatjes in een grotere verhouding dan 1:1, bijvoorbeeld 5:1» een reactieprodukt, waarin de verhouding van het homologe, uitsluitend anti-bloedplaatjes-antilichamen bevattende complex tot het bifunctionele complex ten gunste van het bifunctionele complex is ge-15 wijzigd.

Van de bifunctionele immunologische complexen volgens de uitvinding verdienen de complexen de voorkeur, waarin de Fab-fragmenten van een der antilichamen van de eerste diersoort gericht zijn tegen een stof met een gewenste eigenschap zoals detecteerbaarheid, toxiciteit, 20 geneeskrachtige werking. Een vöorwaarde is in dit verband dat dergelijke stoffen in een dier, met inbegrip van de mens de produktie van antilichamen bewerkstelligen. Voorbeelden van detecteerbare stoffen, die de produktie van antilichamen kunnen opwekken, zijn enzymen, zoals mieriks-wortelperoxidase, alkalische fosfatase, glucose-oxidase en galactosidase. 25 Het andere antilichaam, dat samen met het antilichaam tegen een stof met een gewenste eigenschap tot een bifunctioneel complex wordt gevormd, kan gericht zijn tegen elk willekeurig antigeen. Als voorbeelden van antigenen, waartegen het tweede antilichaam van de eerste diersoort gericht kan zijn, kunnen genoemd worden: oppervlaktemembraanantigenen, 30 zoals antigenen op het oppervlak van bloedcellen, bijvoorbeeld erythro-cyten of bloedplaatjes, of virale antigenen. Verder kan het tweede antilichaam van de eerste diersoort gericht zijn tegen een specifiek antigeen, dat door een kwaadaardige cel geproduceerd wordt. Bifunctionele complexen, die een dergelijk antilichaam van de eerste diersoort bevatten, 35 kunnen niet alleen gebruikt worden voor het aantonen van kwaadaardige cellen doch ook voor het dirigeren van voor deze cellen toxische stoffen naar de kwaadaardige cellen. In het eerste geval is het eerste antilichaam van de eerste diersoort gericht tegen een detecteerbare stof, bijvoorbeeld een enzym, en in het tweede geval tegen een stof die de 850*218 J 1 -5- » groei van de kwaadaardige cellen remt.

De diersoorten waarvan de antilichamen van de onderhavige tetramere complexen zijn afgeleid, zijn niet belangrijk. Het is dikwijls gemakkelijk rauize-antilichamen te combineren met ratte-antilichamen. De monoclo-5 nale antilichamen van de tweede diersoort dienen gericht te zijn tegen de Fc-fragmenten van de antilichamen van de eerste diersoort, terwijl de beide Fab-fragmenten van de monoclonale antilichamen van de tweede diersoort elk in staat moeten zijn te binden met het Fc-fragment van een antilichaam van de eerste diersoort.

10 De aanwezigheid van een Fc-fragment in de monoclonale antilichamen van de tweede diersoort is niet essentieel. Het kan in bepaalde gevallen zelfs voordelig zijn, het Fc-fragment vóór de vorming van het cyclische complex uit de antilichamen van de tweede diersoort af te splitsen. Dit kan op bekende wijze met behulp van een enzym, bijvoorbeeld pepsine, 15 geschieden.

Verder betreft de uitvinding een bifunctioneel immunologisch complex, als boven beschreven, dat gekoppeld is met het antigeen waartegen één der antilichamen van de eerste diersoort gericht is. Dit antigeen kan bijvoorbeeld een detecteerbare stof zijn, zoals een enzym. Het 20 complex heeft dan de eigenschappen van een gemerkt antilichaam. Wanneer het antigeen een stof is met een andere gewenste eigenschap, bijvoorbeeld toxiciteit voor kwaadaardige cellen, kan het complex bijvoorbeeld als geneesmiddel worden toegepast.

De uitvinding betreft ook een werkwijze ter bereiding van immuno-25 logische complexen, die gekenmerkt is doordat men antilichamen van een eerste diersoort laat reageren met een ongeveer equivalente hoeveelheid antilichamen van een tweede diersoort, die gericht zijn tegen de Fc-fragmenten van de antilichamen van de eerste diersoort en men desgewenst het gevormde tetramere complex isoleert.

30 De bereiding van een met een antigeen gekoppeld bifunctioneel complex, die eveneens tot de uitvinding behoort, geschiedt door reactie van een bifunctioneel complex met het desbetreffende antigeen.

Tevens betreft de uitvinding een werkwijze voor het uitvoeren van immunologische reacties, waarbij men de bifunctionele immunologische 35 complexen volgens de uitvinding toepast. Een voorbeeld van een dergelijke reactie is het aantonen van aan virale antigenen gebonden menselijke antilichamen, die na electroforese op nitrocellulosepapier zijn overgebracht, met behulp van bispecifieke anti-menselijk IgG/anti-alkalische fosfatase/alkalische fosfatase complexen.

g 5 Π i Λί V V i t ^ -6-

De uitvinding maakt het oogelijk op eenvoudige, specifieke en efficiënte wijze antilichamen met elkaar te koppelen en bijvoorbeeld van een merk te voorzien. De grote specificiteit van de monoclonale antilichamen van de tweede diersoort maakt het mogelijk, niet-gezuiverde 5 antilichamen te gebruiken. De werkwijze ter bereiding van de tetramere complexen is zeer eenvoudig en vergt buitengewoon weinig tijd. Hierdoor wordt een grote verbetering bereikt in vergelijking met het langs chemische weg merken van antilichamen. Ook in vergelijking met de door hybride cellijnen geproduceerde bifünctionele monoclonale antilichamen 10 biedt de uitvinding het voordeel, dat er geen cellijnen geselecteerd behoeven te worden, terwijl de complexen opgebouwd kunnen worden met bivalente monoclonale antilichamen met bekende eigenschappen.

De bifünctionele complexen volgens de uitvinding kunnen ook worden toegepast voor het specifiek koppelen van antigenen. Geschikte combina-15 ties van monoclonale antilichamen kunnen gebruikt worden voor het identificeren en scheiden van antigenen. Verder kunnen specifieke interacties, die door bifünctionele of homologe tetramere complexen worden geïnduceerd, de effectiviteit van fusies, transfecties en interacties tussen cellen in het algemeen verbeteren. Zo kan men bijvoorbeeld 20 erythrocyten merken met bifünctionele complexen, die opgebouwd zijn uit anti-erythrocyt-antilichamen en anti-HLA-DR-antilichamen. Op deze manier kunnen bifünctionele complexen gebruikt worden om interacties tussen cellen te dirigeren of te verbeteren. In dit verband kan de toepassing in vivo om bepaalde effectorcellen naar micro-organismen, 25 met virussen geïnfecteerde cellen en tumorcellen te dirigeren, genoemd worden.

De homologe cyclische tetramere complexen volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld worden toegepast voor het aantonen van menselijke antistoffen aan menselijke rode bloedcellen, bijvoorbeeld Rhesus-30 antilichamen. Hierbij worden homologe complexen van anti-menselijk IgG-antilichamen gebruikt als anti-immunoglobuline (Coomb's reagens) voor de agglutinatie van gesensibiliseerde erythrocyten.

De uitvinding wordt toegelicht in de volgende voorbeelden, die de uitvinding echter op geen enkele wijze beperken.

8501219 -7- VOORBBELD I.

Aantonen van de vorming van cyclische tetramere antilichaamcomplexen door middel van gel-electroforese.

i a. Miize-antiperoxidase-antilichaam.

5 Voor de gel-electroforese werden monoclonale muize-antilichamen tegen mierikswortel-peroxidase (CLB-HRP-1) gebruikt. Een voorraadop-lossing (0,2 mg/ml, in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,2}} van het antilichaam, dat gezuiverd was over een proteine-A-Sepharose-kolom werd met PBS verdund tot de gewenste concentratie.

10 b. Muize-anti-alkalische fosfatase-antilichaam.

Er werden monoclonale antilichamen tegen alkalische peroxidase (CLB-AP-4) gebruikt. Er werd uitgegaan van de 20-maal geconcentreerde bovenstaande vloeistof van de weefselcultuur, die 0,2 mg antilichaam/ml bevatte. Deze werd met PBS verdund tot de gewenste concentratie.

15 c. Monoclonale ratte-antimuis-antilichamen.

Bij de gel-electroforese werden monoclonale ratte-antilichamen tegen muize-IgGI gebruikt, die verkregen waren door fusie (Nature 266, 550-553 (1977)) van muize-Sp2/0 Ag14-cellen (Nature 274, 917-919 (1978)) met miltcellen van een Brown Norway rat, die driemaal geïmmuniseerd was 20 net verschillende preparaten van gezuiverd raonoclonaal muize-IgG1. De bovenstaande vloeistoffen van de hybridomacellen werden onderzocht op de eigenschap monoclonale muize-peroxidase-antiperoxidase (PAP) complexen te koppelen aan als een laag op microtiterplaten aangebracht muize-IgG1, met behulp van de ELISA-techhiek. Uit een aantal positief reagerende cel-25 lijnen werd een hybridomacellijn (CLB-MJf1-1) voor verder onderzoek geselecteerd en gebruikt voor cultuur op grotere schaal. Het door deze cellijn geproduceerde IgG1-kappa-antIlichaam werd gezuiverd door affiniteitschro-matografie over een muize-IgG1-sepharose-kolom.

d. Gel-electroforese werd volgens Wieme "Gel Electroforesis" Elsevier 30 Publ. Co., Amsterdam (1976) uitgevoerd op agarplaten.

Op de banen van drie agarplaten werden de volgende produkten gebracht.

Baan 1: Monoclonaal antiperoxidase (anti-POD),"2,5 ^il; 50 ^ig/ml.

Baan 2: Monoclonaal anti-alkalische fosfatase (anti-AP), 2,5 ^il; 50^jg/ml.

35 Baan 3: Anti-POD, gecomplexeerd met gelijke hoeveelheid monoclonaal ratte-antimuis-IgG1 (anti-mIgG1). Eindconcentratie 50 ^Jg/ml, berekend op anti-POD. Van de oplossing van het complex werd 2,5 Jil opgebracht.

OU . - i 'J

-8-

Baan 4: Anti-AP, gecomplexeerd met gelijke hoeveelheid anti-IgGl. Eindconcentratie 50 ^jg/ml, berekend op anti-AP. Van de oplossing van het complex werd 2,5 ^1 opgebracht.

Baan 5: Anti-POD, eerst gemengd met een gelijke hoeveelheid anti-AP 5 en het mengsel daarna gecomplexeerd met een met het totaal van de muize-antilichamen equivalente hoeveelheid anti-mIgG1. Eindconcentratie 50 ^jg/ml, berekend op het totaal van de muize-antilichamen. Van de oplossing werd 2,5 yl opgebracht.

Baan 6: Complex van anti-POD met gelijke hoeveelheid anti-mIgG1, 10 gemengd met zelfde hoeveelheid complex van anti-AP met anti- ralgGI. Eindconcentratie 50 ^ig/ml, berekend op het totaal van de muize-antilichamen. Van de oplossing werd 2,5 ^il opgebracht.

Baan 7: Anti-POD eerst gemengd met gelijke hoeveelheid anti-AP en het mengsel daarna gecomplexeerd met 40% van de met het 15 totaal van anti-POD en anti-AP equivalente hoeveelheid anti- mlgGI. Eindconcentratie 50 jig/ml, berekend op het totaal van de muize-antilichamen. Van de oplossing werd 2,5^1 opgebracht.

De electroforese werd uitgevoerd gedurende 45 minuten bij pH 8,5 en 300 volt. Daarna werden de agarplaten bedekt met nitrocellulosepapier en 20 filtreerpapier en werd gedurende 2 uren een druk aangebracht van ongeveer 2 0,1 kg/cm . De verkregen "blots" werden gedurende 16 uren geïncubeerd in PBS, pH 7,2, met 3% (gew^ol.) runderserumalbumine (BSA).

De drie verkregen "blots" werden op verschillende wijzen met enzymen behandeld en ontwikkeld. De resultaten blijken uit figuur 1.

25 "Blot" a (figuur 1) werd gedurende 2 h geïncubeerd met PBS-BSA, dat met peroxidase gemerkte, voor menselijke kappa-ketens specifieke konijne-immunoglobulinen (DAK0, Kopenhagen, Denemarken, codenummer p-129) in een verdunning 1:100 bevatte. Deze gemerkte immunoglobulinen gaven een sterkere kleurreactie met het aan nitrocellulose gebonden monoclonale anti-30 peroxidase-antilichaam dan gezuiverde (monovalente) peroxidase. De "blots" werden driemaal gedurende 5 minuten gewassen met PBS, dat 0,1 gew.% Tween 20 bevatte en eenmaal gedurende 20 minuten geïncubeerd met 0,5 mg/ml diamino-benzidine (Sigma, Grade II) in 0,05 M tris-buffer, pH 7,5, die 0,01 gew.% H2O2 bevatte. Daarna werd het resultaat gefotografeerd.

35 "Blot" b (figuur 1) werd gedurende 2 h geïncubeerd met PBS-BSA, dat alkalische fosfatase (Sigma, Grade VII, catalogusnummer p-5521) in een concentratie van 10 ^jg/ml bevatte. De "blots" werden driemaal gedurende 8501219 - “«'VV'. V: -9- 5 minuten gewassen met PBS, dat 0,1 gew.% Tween 20 bevatte en eenmaal gedurende 20 minuten geïncubeerd met 0,2 mg/ml naftol-AS-MX-fosfaat (Sigma) in 0,1 M tris-buffer, pH 8,2, die 1 mg/ml Fast Red TR (Sigma) bevatte. Daarna werd het resultaat gefotografeerd.

5 "Blot" c (figuur 1) werd verkregen door eerst te werk te gaan als bij "blot" a en na de behandeling met het peroxidase-substraat driemaal te wassen met PBS, dat 0,1% Tween 20 bevatte, vervolgens te incuberen met <fe alkalische fosfatase, weer te wassen en daarna te ontwikkelen met het fosfatase-substraat.

10 Uit de resultaten blijkt, dat de muize-antilichamen een stabiel com plex vormen met de monodonale ratte-antimuis-antilichamen. In baan 6 van figuur 1a en figuur 1b ziet men namelijk slechts één reactieprodukt.

In baan 6 van figuur 1c worden twee reactieprodukten aangetoond, namelijk het homologe complex van het anti-POD met de ratte-antilichamen en het 15 homologe complex van het anti-AP met de ratte-antilichamen. Hieruit blijkt, dat geen bifunctioneel complex wordt gevormd, wanneer men twee homologe complexen met elkaar mengt.

VOORBEELD II.

Bereiding van homoloog cyclisch tetrameer complex van anti-immunoglobuline.

20 Aan 100 jxL van een oplossing van monodonale antilichamen met een specificiteit voor menselijke IgG van de muis IgG1-klasse in een concentratie van 1 mg/ml in met fosfaat gebufferde zoutoplossing met een pH van 7,2 met 0,1 % (gew./vol.) NaN^ voegt men 100 ratte-antimuis-antilichaam (zie voorbeeld Ic) met een concentratie van 1 mg/ml toe. Laatstgenoemde 25 oplossing bevat eveneens 0,1 % (gew^Vol.) NaN^.

Dit mengsel kan in een verdunning van 1:1000 als Coombs-reagens in een indirekte agglutinatietechniek gebruikt worden om de binding van Rhesus-antistoffen aan menselijke bloedcellen aan te tonen.

VOORBEELD III.

30 Bereiding van een gemerkt bifunctioneel complex.

Aan 100 jil van een oplossing van monodonale muize-antilichamen anti-leu-3a (Becton en Dickinson, commercieel verkrijgbaar) met een concentratie van 0,1 mg/ml in PBS (pH 7,2) met 0,2 % (gew./vol.) gelatine en 0,1 % (gew./vol.) NaN3 wordt 200pi van een oplossing van monodonale muize-anti- 35 alkalische fosfatase antilichamen (zie voorbeeld Ib) met een concentratie van 0,2 mg/ml toegevoegd. Aan het mengsel van muize-IgG1-antilichamen wordt 3 £ Ö 2 1 ö V V v i ί- i ~ -10- vervolgens 100 ^al van een oplossing van ratte-anti-muis-antilichamen (zie voorbeeld Ic) met een concentratie van 1 mg/ml en ten slotte 200 ^il van een oplossing van alkalische fosfatase (Sigma, Grade VII) met een concentratie van 2,5 mg/ml in PBS (pH 7,2) toegevoegd.

5 Dit mengsel kan in een verdunning van 50 a 100 maal gebruikt worden om ten opzichte van leu-3a positieve cellen in vriescoupes van bijvoorbeeld menselijke huid aan te tonen.

VOORBEELD IV.

Monoclonale muize-IgG1-anti-erythrocyt-antilichamen en muize-IgG1-anti 10 HLA-DR-antilichamen werden in een molaire verhouding van 1:4 met elkaar gemengd. Daarna werd een met het totaal van de muize-antilichamen equivalente hoeveelheid van de monoclonale ratte-anti-muis-antilichamen (zie voorbeeld Ic) toegevoegd. Het mengsel werd gebruikt voor het merken van erythrocyten. Daartoe werd aan een erythrocytensuspensie met een concen-8 15 tratie van 10 cellen/ml een zodanige hoeveelheid van het bovengenoemde mengsel van antilichamen toegevoegd, dat de eindconcentratie berekend op de toegepaste muize-antilichamen, 50 ^ig/ml bedroeg. Vervolgens werd 60 min. bij 0°C gelncubeerd. Daarna werden de gemerkte erythrocyten gewassen met PBS-BSA, het mengsel gecentrifugeerd (200 g; 10 min.) en weer gesuspen-20 deerd in het oorspronkelijke volume PBS-BSA. Daarna werden menselijke, mononucleaire perifere bloedcellen toegevoegd in een verhouding van ery-throcyten tot menselijke mononucleaire perifere bloedcellen van 10:1. Na centrifugeren (200 g; 10 minj werd 60 min. gelncubeerd bij 0°C. Daarna werd het sediment voorzichtig gesuspendeerd in PBS-BSA. Cytocentrifugepreparaten 25 van de suspensie werden gekleurd met May-Gr£inwald/Giemsa. Er bleken duidelijke rosetten te zijn gevormd, die bestaan uit door erythrocyten omhulde HLA-DR-positieve cellen. Het percentage rosette-vormende, kern-houdende cellen (25 %) komt goed overeen met het percentage HLA-DR-positieve cellen (29 %) dat wordt bepaald door middel van een stapsgewijs versterkte immuno-30 peroxidase-kleuring (J. Histochemistry and Cytochemistry 32, nr. 2, blz. 172-178 (1984)). Wanneer men dezelfde proef uitvoert, doch de anti-HLA-DR-antilichamen vervangt door anti-peroxidase-antilichamen, worden geen rosetten gevormd.

85012 IS

Claims (19)

1. Immunologisch complex uit twee antilichamen van een eerste diersoort, die tot een cyclisch tetrameer geconjugeerd zijn met twee, tegen het Fc-fragment van de antilichamen van de eerste diersoort gerichte monoclonale antilichamen van een tweede diersoort.

2. Immunologisch complex volgens conclusie 1, m e t het k e n m e r k, dat het een bifunctioneel complex is, waarin twee verschillende antilichamen van de eerste diersoort tot een cyclisch tetrameer geconjugeerd zijn.

3. Immunologisch bifunctioneel complex volgens conclusie 2, 10 gekoppeld met het antigeen, waartegen één der antilichamen van de eerste diersoort gericht is.

4. Immunologisch complex volgens conclusie 2 of 3,met het kenmerk, dat de Fab-f ragmen ten van een der antilichamen van de eerste diersoort gericht zijn tegen een stof met gewenste eigenschappen.

5. Immunologisch complex volgens conclusie 4, m e t het k e n m e r k, dat de stof met gewenste eigenschappen een detecteerbare stof is.

6. Immunologisch complex volgens conclusie 5, m e t het kenmerk, dat de detecteerbare stof een enzym is.

7. Immunologisch complex volgens conclusie 6, m e t het kenmerk, dat het enzym peroxidase is.

8. Immunologisch complex volgens conclusie 2 of 3,met het kenmerk, dat de Fab-fragmenten van één der antilichamen van de eerste diersoort gericht zijn tegen een detecteerbare stof en de

25 Fab-fragmenten van het andere antilichaam van de eerste diersoort tegen een willekeurig antigeen.

9· Immunologisch complex volgens conclusie 8, m e t het k e n m e r k, dat het antigeen een plasma-eiwit is.

10. Immunologisch complex volgens conclusie 8, m e t het 30 kenmerk, dat het antigeen een zich aan het oppervlak van een deeltje bevindend eiwit is.

11. Immunologisch complex volgens conclusie 10, m e t het kenmerk, dat het eiwit een zich op het oppervlak van bloedcellen bevindend eiwit is.

12. Immunologisch complex volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de bloedcellen erythrocyten of bloedplaatjes zijn.

13. Immunologisch complex volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat de eerste diersoort de muis en de tweede diersoort 85 0 1 2 1 D -12- de rat is.

14. Werkwijze ter bereiding van immunologische complexen, met het kenmerk, dat men antilichamen van een eerste diersoort laat reageren met een ongeveer equimolaire hoeveelheid antilichamen van 5 een tweede diersoort, die gericht zijn tegen de Fc-fragmenten van de antilichamen van de eerste diersoort, en desgewenst het gevormde tetramere complex isoleert.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men bifunctionele complexen bereidt door twee verschillende anti- 10 lichamen van de eerste diersoort met de antilichamen van de tweede diersoort te laten reageren, en het gevormde complex desgewenst te laten reageren met een antigeen, waartegen één der antilichamen van de eerste diersoort gericht is.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, 15 dat men immunologische complexen volgens een of meer der conclusies 4-13 bereidt.

17. Werkwijze volgens conclusies 14-16, met het kenmerk, dat men het tetramere complex isoleert door middel van anionenui twis selings chromatografie.

18. Werkwijze voor het uitvoeren van immunologische reacties, met het kenmerk, dat men daarbij een bifunctioneel immunologisch complex volgens een of meer der conclusies 1-13 toepast.

19· Geneesmiddel met één of meer der complexen volgens conclusies 1-13 als actieve stof. 8501213