DE60036452T2

DE60036452T2 - Monoklonaler anti-uracil antikörper

Info

Publication number: DE60036452T2
Application number: DE60036452T
Authority: DE
Inventors: Gen-ichiro Setagaya-ku SOMA
Original assignee: Biomedical Research Group Inc
Current assignee: Biomedical Research Group Inc
Priority date: 1999-10-19
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2020-10-19
Also published as: EP1142995A4; JP4070372B2; CA2355893A1; US6927035B1; EP1142995A1; ATE373705T1; ES2293924T3; CA2355893C; DE60036452D1; WO2001029207A8; JP2001112472A; WO2001029207A1; EP1142995B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper, der zum Screenen von Krebspatienten mit DPD-Mangel geeignet ist, für die eine Verabreichung eines Antitumormittels auf Pyrimidinfluorid-Basis kontraindiziert ist; den monoklonalen Antikörper produzierendes Hybridoma; ein Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Uracil oder Thymin unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers; und ein diagnostisches Mittel zur Diagnose von DPD-Mangel, das den monoklonalen Antikörper enthält.
Stand der Technik
Als Antitumormittel werden zur Zeit Verbindungen auf Pyrimidinfluorid-Basis, wie z.. Fluoruracil, verwendet. Unter Krebspatienten leiden jedoch einige (ca. 3% kaukasischer Brustkrebspatienten) an einem Dehydropyrimidindehydrogenase(nachstehend als DPD abgekürzt)-Mangel, das ein Enzym ist, das beim Stoffwechsel der Verbindung in seinem Zersetzungsweg beteiligt ist. Es wurde berichtet, dass, wenn ein Antitumormittel auf der Basis eines Pyrimidinfluorids an einen solchen Patienten mit DPD-Mangel verabreicht wird, die Verbindung nicht metabolisiert wird und im Körper verbleibt, was zu Nebenreaktionen oder vielleicht sogar zum Tod führt (Biochim. Biophys. Acta, 633, 400-409 (1980)).
Im Organismus werden Uracil und Thymin durch die Wirkung von DPD im allgemeinen zu Dihydrouracil bzw. Dihydrothymin metabolisiert. Von Patienten mit DPD-Mangel ist es jedoch bekannt, dass sie Uracil lind Thymin nicht metabolisieren und große Mengen von unverändertem Uracil und Thymin in das Blut oder den Urin ausscheiden, insbesondere Uracil (Adv. Exp. Med. Biol., 253A, 111-118 (1989)). Wenn Uracil oder Thymin im Blut oder Urin vor der Verabreichung eines Antitumormittels auf Pyrimidinfluorid-Basis bestimmt werden, können Patienten mit DPD-Mangel vorher gescreent werden. Als Ergebnis kann die Anwendung des Antitumormittels abgesetzt oder die Dosis des Mittels reduziert werden, um dadurch schwere Nebenwirkungen zu vermeiden.
Es sind Methoden zur Bestimmung von Uracil bekannt, einschließlich einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Methode (Journal of Chromatography B, 672 (1995), 233-239) und einer Immunoassay-Methode, die einen monoklonalen Antikörper für Pseudouridin verwendet ( japanische Patentveröffentlichung (kokoku), 4-21479 ). Die erstere Methode ist jedoch insofern unvorteilhaft, weil die Herstellung von Proben umständlich ist, eine starke Arbeitsbelastung erfordert, und ein beträchtliches Ausmaß an Erfahrung erfordert. Zusätzlich wird im allgemeinen eine lange Zeitspanne benötigt, um eine Anzahl von Proben zu untersuchen, und die hohen Kosten der Messung und anderer Vorrichtungen macht die Methode unvorteilhaft. In der letzteren Methode ergibt der verwendete monoklonale Antikörper – ein zur Diagnose eines fortschreitenden Krebses verwendeter Antikörper – eine Reaktivität mit Uracil von 30 bis 40% und ebenfalls eine Reaktivität mit Pseudouridin von so hoch wie 95 bis 99%. Die Verwendung eines solchen monoklonalen Antikörpers, der eine Kreuzreaktivität mit Uracil und Pseudouridin aufweist, kann deshalb Patienten mit DPD-Mangel nicht von Patienten ohne Mangel unterscheiden. The Lancet (1985), 363-365, beschreibt einen Uracil-spezifischen anti-RNA-Antikörper. Experimental and Molecular Pathology (1981), 34, 52-61, beschreibt die Verwendung von anti-Thymin-Antikörpern zur Bestimmung der Thermolabilität von Chromatin in situ während des Zellzyklus.
Unter solchen Umständen haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung bereits früher einen monoklonalen Antikörper aufgefunden, der mit Uracil ohne Kreuzreaktion mit Dehydrouracil – ein Metabolit von Uracil im Organismus – und mit als Tumormarker verwendetem Pseudouridin stark reagiert (internationale Patentveröffentlichung WO 99/20748 ).
Der obige monoklonale Antikörper reagiert jedoch auch stark mit N-Carbamyl-β-alanin, das ein Metabolit von Dihydrouracil ist und in großen Mengen in normalem Urin vorhanden ist, und weist eine unzulängliche Reaktivität mit Uracil auf. Die Verwendung dieses monoklonalen Antikörpers als diagnostisches Mittel auf DPD-Mangel ist deshalb problematisch.
Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers, der eine höhere Spezifität mit Uracil und Thymin aufweist. Eine weitere Aufgabenstellung ist die Bereitstellung von den monoklonalen Antikörper produzierendem Hybridoma. Eine weitere Aufgabenstellung ist die Bereitstellung einer immunochemischen Bestimmungsmethode, die im Urin enthaltenes Uracil und Thymin genau nachweisen kann. Eine weitere Aufgabenstellung ist die Bereitstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von DPD-Mangel, das den monoklonalen Antikörper enthält.
Beschreibung der Erfindung
Im Hinblick auf die vorstehenden Ausführungen haben die Erfinder der vorliegenden Anmeldung ausgedehnte Untersuchungen über die relevanten Immunogen- und Immunisierungsmethoden durchgeführt und haben gefunden, dass ein von einem Hybridoma, das zur Verabreichung von 5-Brom-1-carboxymethyluracil an ein Tier gebildet wird, produzierter Antikörper stark spezifisch sowohl mit Uracil als auch mit Thymin reagiert, aber nur eine geringe Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und N-Carbamyl-β-alanin zeigt, und deshalb zur Diagnose von DPD-Mangel sehr geeignet ist. Die vorliegende Erfindung wurde auf dieser Basis erzielt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Hybridoma, das den monoklonalen Antikörper produziert, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Uracil und/oder Thymin unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein diagnostisches Mittel zur Diagnose von DPD-Mangel bereit, das den monoklonalen Antikörper enthält.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Diagnostizieren von DPD-Mangel bereit, gekennzeichnet durch Bestimmen von Uracil und Thymin in einer Probe unter Verwendung des diagnostischen Mittels.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung des monoklonalen Antikörpers zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose eines DPD-Mangels bereit.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper reagiert selektiv mit Uracil und Thymin mit hoher Sensitivität, um dadurch in einer Probe enthaltenes Uracil und Thymin selektiv rasch und einfach zu bestimmen. Zusätzlich ist der monoklonale Antikörper, der keine oder eine geringe Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil und N-Carbamyl-β-alanin zeigt, zur Diagnose von DPD-Mangel unter Verwendung einer menschlichen Urinprobe geeignet. Der monoklonale Antikörper ist insbesondere sehr geeignet zum Screenen von Krebspatienten mit DPD-Mangel, für die eine Verabreichung eines Antitumormittels auf Pyrimidinfluorid-Basis kontraindiziert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Reaktivität des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit Uracil zeigt (CMU-1) und SU-1, untersucht durch indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA (Beispiel 8).
2 ist ein Diagramm, das die Beziehung zwischen Prozent-Absorption des farbentwickelten monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Erfindung und der Konzentration an Uracil, Thymin und Pseudouridin zeigt.
Beste Ausführungsformen zur Durchführung der Erfindung
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper reagiert stark mit Uracil und Thymin, aber kaum mit N-Carbamyl-β-alanin. Der Ausdruck "kaum mit" bezieht sich auf den Zustand, dass der monoklonale Antikörper keine dosisabhängige Reaktion in Verbindung mit N-Carbamyl-β-alanin zeigt.
Vorzugsweise reagiert der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper stark mit Uracil und Thymin, aber kaum mit N-Carbamyl-β-alanin, und zeigt keine oder nur eine geringe Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil und Dihydrothymin. Der Ausdruck "keine oder nur geringe Reaktivität" bezieht sich auf einen Zustand, bei dem in Verbindung mit einer spezifischen Verbindungskonzentration keine dosisabhängige Reaktion beobachtet wird, oder auf einen Zustand, bei dem in Verbindung mit einer spezifischen Verbindungskonzentration eine dosisabhängige Reaktion beobachtet wird, aber die Affinität der Verbindung bei einem spezifischen spektralen Absorptionsmaß gering ist.
Der monoklonale Antikörper zeigt in Kreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin eine Selektivität von 10% oder weniger, wenn die Selektivität in der Kreuzreaktion mit Uracil oder Thymin 90% oder mehr beträgt. Vorzugsweise zeigt, wenn die Selektivität der Kreuzreaktion mit Uracil oder Thymin 90% oder mehr beträgt, der monoklonale Antikörper in einer Kreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin eine Selektivität von 10% oder weniger; eine Selektivität in der Kreuzreaktion mit Pseudouridin von 33% oder weniger, eine Selektivität in der Kreuzreaktion mit Dihydrouracil von 8% oder weniger und eine Selektivität in der Kreuzreaktion mit Dihydrothymin von 23% oder weniger.
Der Globulin-Typ des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers ist nicht besonders beschränkt, und irgendein monoklonaler Antikörper ist annehmbar, solange der Antikörper stark mit Uracil und/oder Thymin aber kaum mit N-Carbamyl-β-alanin reagiert. Spezifisch ausgedrückt ist irgendeines von IgG, IgM, IgA, IgE und IgD annehmbar, wobei IgG und IgM bevorzugt sind.
Im Hinblick auf den Zellstamm, der den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produziert, besteht keine besondere Beschränkung, solange der produzierte Antikörper mit den vorstehend genannten Merkma len ausgestattet ist. Beispiele von bevorzugten Zellstämmen umfassen ein Hybridoma, das durch Zellfusion mit einer Antikörper-produzierenden Zelle mit einem Myelom-Zellstamm erhalten wird.
Als Antikörper-produzierende Zelle zum Erhalt des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers kann eine Milzzelle, eine Lymphknotenzelle oder ein B-Lymphozyt eines Tiers verwendet werden, die in vivo mit 5-Halogen-1-carboxymethyluracil, das als Immunogen dient, immunisiert wird. Beispiele für ein die 5-Stellung des 5-Halogen-1-carboxymethyluracils einnehmendes Halogenatom umfassen Fluor, Chlor, Brom und Iod, wobei Brom bevorzugt ist.
Das 5-Halogen-1-carboxymethyluracil per se weist eine ziemlich schwache Immunogenizität auf. Während der Immunisierung wird die Verbindung deshalb vorzugsweise an einen geeigneten Schlepper gebunden, um dadurch einen Immunogen-Schlepper-Komplex zu bilden, der als Immunogen wirkt.
Der Ausdruck "Schlepper" bezieht sich auf einen Träger, der mit einer Substanz mit sehr geringer Immunogenizität bindet oder auf eine Substanz, wie z.B. einem Hapten, das per se keine Antikörper-Produktivität aufweist, um dadurch die Immunogenizität zu potentieren oder hervorzubringen. Im allgemeinen wird ein Protein mit relativ hohem Molekulargewicht als Schlepper verwendet. Zusätzlich zu einem solchen Protein können auch Zellen, wie z.B. Erythrozyt und Polysaccharid, verwendet werden. Beispiele für den Schlepper umfassen Hämocyanin von SUKASHI-GAI (KLH), Ovalbumin (OVA), Rinderserumalbumin (BSA) und Kaninchenserumalbumin, wobei KLH und BSA besonders bevorzugt sind.
Das Verfahren zum Verbinden von 5-Brom-1-carboxymethyluracil und den Schlepper ist nicht besonders beschränkt, und es kann irgendeine bekannte Methode verwendet werden. Beispiele umfassen eine Säureanhydridmischung-Methode (B.F. Erlanger et al., J. Biol. Chem., 234, 1090-1094 (1954)) und eine Aktivierungsester-Methode (A.B. KARU et al., J. Agric. Food. Chem., 423-309 (1994)). Als einfache Technik kann auch eine Methode eines Immject-Immunogen-EDC-Konjugationskit (Produkt von Pierce) gemäß der beiliegenden Anweisung verwendet werden.
Zu immunisierende Tiere umfassen Mäuse, Ratten, Pferde, Ziegen und Kaninchen, und diesen Tieren wird auf dem Wege einer Routinemethode ein Antigen verabreicht. Spezifisch werden ein Adjuvans, wie z.B. vollständiges Freund's-Adjuvans oder unvollständiges Freund's-Adjuvans und das vorstehend erwähnte 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-KLH oder 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-BSA zur Herstellung einer Suspension oder Emulsion davon gemischt, und die Suspension oder Emulsion wird intravenös, subkutan, intradermal, intraperitoneal oder auf ähnliche Weise einem Tier, wie z.B. einer Maus, mehrere Male verabreicht, um das Tier zu immunisieren.
Aus dem so immunisierten Tier wird eine Antikörper-produzierende Zelle, wie z.B. eine Milzzelle, erhalten, und mit einer Myelomzelle fusioniert, um dadurch ein Hybridoma gemäß der vorliegenden Erfindung zu produzieren.
Obwohl die zu fusionierenden Myelom-Zellstämme aus Mäusen, Ratten, Pferden, Ziegen, Kaninchen oder Menschen abgeleitet sein können, werden die Zellstämme vorzugsweise vom gleichen Tier, von dem eine Antikörper-produzierende Zelle erhalten wird, abgeleitet. Wenn eine Antikörper-produzierende Zelle von einer Mäuse-Milzzelle abgeleitet wird, wird z.B. vorzugsweise ein von einer Maus erhaltener Gegen-Myelom-Zellstamm als zu fusionierende Zelle verwendet. Spezifischerweise ist der Myelom-Zellstamm ein 8-Azaguanin-resistenter Mäuse(BALB/c-abgeleitet)-Myelom-Zellstamm. Beispiele für spezifische Zellen umfassen P3/X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495-497 (1975)], P3/X63-Ag8 (P341) [Current Topfics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1987)], P3/NSI-1-Ag4-1 (NS-1) [Eur. J. Immuno Meth., 35, 1-21 (1976)], Sp2/O-Ag14 (Sp2/O) [Nature, 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immuno Meth., 35, 1-21 (1980)], MPC-11, X63,653, und S194, wobei P3U1 bevorzugt ist.
Die Zellfusion einer Antikörper-produzierenden Zelle mit einer Myelomzelle kann nach einem bekannten Verfahren durchgeführt werden (siehe z.B. Nature, 256, 495-497 (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5122-5126 (1981)) oder nach einer dazu ähnlichen Methode. Spezifischerweise werden die vorstehend genannte Antikörper-produzierende Zelle und die Myelomzelle in einem üblicherweise verwendeten Nährstoffmedium in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers fusioniert. Der Fusionsbeschleuniger ist nicht besonders beschränkt, und irgendeiner der typischen Beschleuniger, Poylethylenglykol, Sendai-Virus usw. können verwendet werden (z.B. Shuji YAMASHITA et al., Cell Tissue Chemistry, herausgegeben von Nihon Soshiki Saibo Kgaku-Kai; Gakusai Kikaku, 1986). Von diesen ist Polyethylenglykol im Hinblick auf die vergleichsweise geringe Cytotoxizität und die Leichtigkeit des Fusionsvorgangs bevorzugt. Zusätzlich kann ein optionales Adjuvans, wie z.B. Dimethylsulfoxid, in Kombination verwendet werden, um die Fusionseffizienz zu erhöhen. Anstelle des Fusionsverfahrens, das den vorstehend erwähnten Fusionsbeschleuniger verwendet, kann auch ein Fusionsverfahren mittels elektrischer Behandlung (elektrische Fusion) zweckmäßigerweise verwendet werden.
Das Zahlenverhältnis der Antikörper-produzierenden Zellen zu den Myelomzellen kann innerhalb des in Routineverfahren verwendeten Bereichs fallen. Spezifischerweise können die Antikörper-produzierenden Zellen in einer Menge von ca. dem 2- bis 10-fachen, vorzugsweise dem 4- bis 7-fachen, der der Myelomzellen verwendet werden.
Eine Hybridomagruppe, die mit der Fähigkeit der Antikörper-Produktion und Vermehrung durch Zellfusion der Antikörper-produzierenden Zelle und der Myelomzelle ausgestattet ist, kann durch Kultivieren unter Verwendung eines üblichen Mediums zur Selektion ausgewählt werden. Beispiele für das Medium zur Selektion umfassen HAT-Medium, wenn 8-Azaguanin-resistenter Stamm als Myelom-Zellstamm verwendet wird. Die Kultivierung im HAT-Medium kann während eines ausreichenden Zeitraums so durchgeführt werden, dass von Ziel-Hybridoma verschiedene unfusionierte Zellen und dergleichen entfernt werden, typischerweise während 3 bis 10 Tagen.
Danach wird das so erhaltene Hybridoma einem Screenen auf Ziel-anti-Uracil-monoklonalen Antikörper produzierende Stämme unterworfen und danach geklont, wobei das Screenen und das Klonen gemäß einem üblichen Verfahren durchgeführt werden.
Das Screenen von Stämmen, die den erfindungsgemäßen anti-Uracil-monoklonalen Antikörper produzieren, wird durchgeführt durch Sammeln eines Teils des Kulturüberstands, der die so erhaltene Hybridomagruppe enthält, um dadurch eine Probe herzustellen, und Bestimmen (Bestätigen), dass Uracil in der so gesammelten Probe vorhanden ist, nach irgendeiner einer Vielzahl von routinemäßigen Antikörper-Bestimmungsmethoden ("Hybridoma Method and Monoclonal Antibody", veröffentlicht von R & D Planning Co., Ltd., S. 30-53, 5. März 1982); z.B. durch Radioimmunoassay. Beispiele für die Antikörper-Bestimmungsmethode umfassen ELISA, eine Fluoreszenz-Antikörper-Technik, eine Plaque-Methode, eine Fleckmethode, Hämagglutination und die Methode nach Ouchterlony. Von diesen wird ELISA, insbesonde re indirekter kompetitiver Inhibierungs-ELISA, im Hinblick auf die Sensitivität, die rasche Durchführung, die Genauigkeit, die Sicherheit und die Automation besonders bevorzugt.
Das Hybridoma, von dem durch Screenen festgestellt wurde, dass es einen Uracil-spezifischen monoklonalen Antikörper produziert, wird nach einer Methode kloniert, in der eine Zellflüssigkeit durch limitierende Verdünnung so verdünnt wird, dass ein Hybridoma in einer Vertiefung enthalten ist (limitierende Verdünnung); nach einer Methode, in der die Zellflüssigkeit auf ein weiches Agar-Medium aufgetragen und die gebildete Kolonie gesammelt wird; eine Methode, in der eine Zelle mittels eines Mikromanipulators entnommen wird; oder eine Methode, in der eine Zelle mittels eines Zell-Sortierers abgetrennt wird (Sortierer-Klonen).
Als Kloniermethode wird die Methode der limitierenden Verdünnung aufgrund der Einfachheit der Durchführung bevorzugt. Spezifischerweise werden Vertiefungen, die ein Hybridoma enthalten, für das ein Antikörpertiter bestimmt wurde, 1 bis 4 Mal einer limitierenden Verdünnung unterworfen, und das Hybridoma, für den der Antikörper konstant bestätigt wurde, wird als einen anti-Uracil-monoklonalen Antikörper produzierender Zellstamm ausgewählt.
Das nach dem vorstehend genannten Verfahren erhaltene erfindungsgemäße Hybridoma kann durch Einfrieren bei –80°C oder tiefer (z.B. –195°C in flüssigem Stickstoff) in einem Kulturmedium, z.B. RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% fetales Rinderserum und 5 × 10⁶ Zellen/ml oder mehr umfassend, optional mit 10% Dimethylsulfoxid, das als Gefrierstabilisator dient, gelagert werden.
Wie ferner erwähnt, ist das erfindungsgemäße Hybridoma während der Kultur in einem Basismedium, wie z.B. RPMI 1640, DMEM oder IMEM, stabil, und produziert und sekretiert einen monoklonalen Antikörper, der spezifisch sowohl mit Uracil als auch mit Thymin reagiert, aber nur eine geringe oder Kaum-Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und N-Carbamyl-β-alanin zeigt. Zusätzlich kann das in flüssigem Stickstoff stabilisierte Hybridoma darin gelagert und leicht daraus regeneriert werden. Das erfindungsgemäße Hybridoma (Mäuse-Hybridoma CMU-1) ist als leicht erhältliche Quelle zur Herstellung eines reinen monoklonalen Antikörpers, der mit einem Uracil-Antigen reagiert, geeignet und ist als "FERM BP-6870" (Datum der Hinterlegung: 7.09.1999) beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (Adresse: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 JAPAN) unter dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Der Ziel-monoklonale Antikörper wird aus dem so erhaltenen Hybridoma durch Kultivieren des Hybridomas auf eine Routineweise, wie z.B. Zellkultur oder Bildung von Aszites; Trennen des monoklonalen Antikörpers vom Kulturüberstand oder Aszites; und Reinigung produziert. Der aus dem Kulturüberstand der Aszites erhaltene monoklonale Antikörper kann nach einem Routineverfahren gereinigt werden. Spezifischerweise können zweckmäßigerweise Methoden, wie z.B. Fraktionierung unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Gelfiltration, Ionen-Austauschchromatographie und Affinitätschromatographie in Kombination verwendet werden.
Der so erhaltene erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann im Hinblick auf seine Selektivität bei der Kreuzreaktion nach einer Methode, wie z.B. einem indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA, wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben, bewertet werden. In den Beispielen hat sich gezeigt, dass der monoklonale Antikörper spezifisch sowohl mit Uracil und Thymin reagiert und nur eine geringe oder Kaum- Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und N-Carbamyl-β-alanin zeigt; d.h., es wurde bestätigt, dass er eine hohe Reaktivität mit Uracil und Thymin und eine hohe Reaktionsspezifität dafür aufweist.
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper weist somit eine hohe Reaktivität mit Uracil und Thymin auf, zeigt aber nur eine geringe oder Kaum-Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und N-Carbamyl-β-alanin. Darüber hinaus kann der Antikörper konstant und in einer großen Menge durch Kultivieren des erfindungsgemäßen Hybridoma bereitgestellt werden. Der Antikörper ist deshalb als Reagens zur immunochemischen spezifischen Bestimmung von Uracil und Thymin geeignet und kann zum Reinigen von Uracil und Thymin verwendet werden.
Wie vorstehend beschrieben, weist der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper eine Reaktionsspezifität auf; d.h., geringe oder Kaum-Reaktivität mit Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und N-Carbamyl-β-alanin, die Substanzen sind, die möglicherweise in den Urin von Krebspatienten wandern können. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper ist deshalb zum Screenen von Patienten mit DPD-Mangel, die Uracil und Thymin in den Urin als Ergebnis eines DPD-Mangels ausscheiden, und von Patienten ohne DPD-Mangel, insbesondere für Krebspatienten, geeignet.
Im Hinblick auf das Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Uracil und Thymin unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers besteht keine besondere Beschränkung, solange die Methode Uracil und Thymin in einer Probe, die möglicherweise Uracil und Thymin enthält, spezifisch feststellen oder bestimmen kann. Eine bevorzugte Bestimmungsmethode umfasst jedoch die Stufe des Inkubierens einer biologischen Probe eines Patienten und des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers unter den Bedingungen zur Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes, und eine Stufe des Bestimmens des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes. Das obige Bestimmungsverfahren gemäß Techniken, die typischerweise auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung verwendet werden, variiert werden, und Beispiele der Variationen umfassen direkte, indirekte, kompetitive und Sandwich-Verfahren. Spezifische Beispiele umfassen ELISA, Radioimmunoassay, Fluoreszenz-Antikörper-Technik und eine Emissions-Antikörper-Technik, wobei ELISA bevorzugt ist.
In einem Beispiel kann immobilisiertes ELISA mit einer menschlichen Urinprobe auf folgende Weise durchgeführt werden:

(a) Immobilisieren des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers auf einem beliebigen Träger und Bedecken eines Teils der festen Oberfläche, die nicht mit Antikörper bedeckt ist, mit einem gegenüber dem Antigen irrelevanten Protein;
(b) Waschen der Oberfläche und Zugeben der zu prüfenden Urinprobe und eines Enzym-markierten Antigens; z.B. Enzym-markiertem (5-Halogen-1-carboxymethyluracil)-Schlepper-Komplex, um eine kompetitive Reaktion zu verursachen; und (c) Zugeben eines Enzymsubstrats dazu und Messen des Abfalls des der Zugabe der zu untersuchenden Probe zuzuschreibenden spektralen Absorptionsmaßes. Kurz gesagt, kann die Detektion des Abfalls des der zu testenden Probe zuzuschreibenden spektralen Absorptionsmaßes die Gegenwart von Uracil in der Urinprobe bestimmen, und durch Messung der Menge des Abfalls des der zu testenden Probe zuzuschreibenden Absorptionsabfalls kann quantitativ Uracil und Thymin in der Urinprobe unter Verwendung einer vorher aus Daten eingegebener Mengen von Uracil und Thymin erstellten Eichkurve gemessen werden.

Indirekter kompetitiver Inhibierungs-ELISA unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers kann Uracil oder Thymin in einer Probe innerhalb eines Bereiches von 0,001 bis 2 mg/ml, vorzugsweise 0,005 bis 0,5 mg/ml, bestimmen. Das Bestimmen von Uracil oder Thymin in einer Urinprobe durch indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA kann auf die folgende Weise durchgeführt werden.
(a) Adsorbieren lassen eines 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-Schlepper-Komplexes, der als Antigen dient, auf einem Träger, um dadurch das Antigen zu immobilisieren; (b) Blockieren eines Teils der Trägeroberfläche, die von dem Antigen-adsorbierten Anteil verschieden ist, mit einem gegenüber dem Antigen irrelevanten Protein; (c) Zugeben der zu testenden Urinprobe und des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers so, um den monoklonalen Antikörper mit dem immobilisierten Antigen und freien Uracil (oder Thymin) auf kompetitive Weise zu binden, wodurch ein immobilisierter Antigen-Antikörper-Komplex und ein freier Uracil-(oder Thymin-)Antikörper-Komplex gebildet wird; (d) Abwaschen des freien Uracil-(oder Thymin-)Antikörper-Komplexes und Reagieren lassen eines Enzym-markierten sekundären Antikörpers mit dem immobilisierten Antigen-Antikörper-Komplex; und (e) Reagieren lassen eines geeigneten Substrats mit dem Enzym und Messen des spektralen Absorptionsmaßes.
In der vorstehend genannten Stufe (a) können die vorstehend genannten Immunogene als 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-Schlepper-Komplex, der als immobilisiertes Antigen dient, verwendet werden. Vorzugsweise wird das gleiche Immunogen, das zur Herstellung einer Antikörper-produzierenden Zelle verwendet wurde, als immobilisiertes Antigen verwendet. Der 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-Schlepper-Komplex, der als immobilisiertes Antigen dient, ist jedoch nicht notwendigerweise identisch mit dem gleichen Komplex, der als Immunogen dient. Kurz gesagt, kann der 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-BSA-Komplex als Immunogen und 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-KLH als immobilisiertes Antigen dienen.
Im Hinblick auf den Träger, auf dem das Antigen immobilisiert wird, besteht keine besondere Beschränkung, und jeder Träger, der typischerweise in ELISA verwendet wird, kann verwendet werden. Beispiele des Trägers umfassen eine Mikroplatte oder Perlen aus Polystyrol oder Polyvinylharz, wobei eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen bevorzugt ist. Die Konzentration des Antigens ist nicht besonders beschränkt und wird zweckmäßigerweise im allgemeinen innerhalb eines breiten Bereiches von ca. 0,01 bis 100 μg/ml, vorzugsweise 0,4 bis 50 μg/ml, festgesetzt. Wenn eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen als Träger verwendet wird, kann das Antigen in einem Volumen verwendet werden, das ausreicht, um die Bodenflächen der Vertiefungen in ihrer Gesamtheit zu bedecken. Vorzugsweise wird ein Volumen von ca. 20 bis 100 μl pro Vertiefung verwendet.
Im Hinblick auf die Adsorptionsbedingungen besteht keine besondere Beschränkung. Typischerweise ist ein Stehen lassen bei ca. 4 bis 40°C während ca. 1 Stunde bis 1 Nacht geeignet, und ein Stehen lassen bei ca. 4°C während ca. 1 Nacht und bei ca. 37°C während ca. 2 Stunden ist bevorzugt.
In Stufe (b) umfassen Beispiele von Proteinen, die zum Blockieren verwendet werden können, Kälberserum, Ovalbumin, Rinderserumalbumin, fetales Kälberserum, entrahmte Milch und Gelatine, wobei Gelatine und Kälberserum bevorzugt sind. Im Hinblick auf die Blockierbedingungen besteht keine besondere Beschränkung, und typischerweise ist ein Stehen lassen bei ca. 4 bis 40°C während ca. 1 Stunde bis zu 1 Nacht ge eignet, und ein Stehen lassen bei ca. 4°C während ca. 1 Nacht oder bei ca. 37°C während ca. 2 Stunden ist bevorzugt. Nach Vervollständigung des Blockierens wird die Mikroplatte unter Verwendung eines Puffers gewaschen. Der hierbei verwendete Puffer ist nicht besonders beschränkt, und Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), die Tween 20 (pH 7,3 bis 7,7) enthält, ist z.B. bevorzugt.
In Stufe (c) besteht keine besondere Beschränkung im Hinblick auf die spezifische Bedingungenen, und typischerweise ist ein Stehen lassen bei ca. Raumtemperatur bis 40°C während ca. 0,5 bis 3 Stunden geeignet, und ein Stehen lassen bei ca. 37°C während ca. 1 Stunde ist bevorzugt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wird die Mikroplatte unter Verwendung eines Puffers gewaschen. Der hierbei verwendete Puffer ist nicht besonders beschränkt, und PBS, das Tween 20 (pH 7,3 bis 7,7) enthält, ist z.B. bevorzugt.
Als in Stufe (d) verwendeter sekundärer Antikörper kann ein Enzym-markierter anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper verwendet werden. Beispiele für das Enzym umfassen alkalische Phosphatase (AP), Meerrettichperoxidase (HRPO), β-Galactosidase (β-GS), Glucoseoxidase (GO) und Urease. Unter solchen sekundären Antikörpern ist ein AP-markierter anti-Maus-Immunoglobulin-Antikörper bevorzugt. Der sekundäre Antikörper wird zur Verwendung typischerweise verdünnt, und vorzugsweise wird ein sekundärer Antikörper verwendet, der mit einem Verdünnungsfaktor ca. 100- bis 10.000-fach verdünnt wurde, insbesondere ca. 200- bis 1.000-fach, bezogen auf die Konzentration des monoklonalen Antikörpers (primärer Antikörper), der mit der Mikrotiterplatte via Uracil-Schlepper-Komplex gebunden wurde. Um den sekundären Antikörper zu verdünnen, wird vorzugsweise ein zum Blockieren verwendetes Protein verwendet, das mit PBS verdünnt ist; z.B. PBS (pH 7,3 bis 7,7), enthaltend 0,1% Gelatine. Die Reaktionsbedingungen sind nicht besonders beschränkt, und die Reaktion wird typischerweise bei ca. 37°C während ca. 1 Stunde durchgeführt. Nach Vervollständigung der Umsetzung wird das Reaktionssystem mit einem Puffer gewaschen. Durch die obige Reaktion wird der sekundäre Antikörper dazu veranlasst, mit dem monoklonalen Antikörper, der mit der Mikrotiterplatte via immobilisiertes Antigen gebunden ist, zu binden.
In Stufe (e) wird ein Substrat mit dem an den sekundären Antikörper gebundenen Enzym Reagieren gelassen, um es dem Substrat zu ermöglichen, eine Farbe zu entwickeln. Im Reaktionssystem kann ferner ein optionaler Farbentwickler zugefügt werden. Die Veränderung im spektralen Absorptionsmaß wird gemessen. Spezifischer ausgedrückt wird in einer bevorzugten Methode, bei der alkalische Phosphatase als an den sekundären Antikörper zu bindendes Markerenzym verwendet wird, p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat verwendet, um dadurch durch enzymatische Reaktion eine Farbe zu entwickeln. Die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 2N NaOH beendet, und das spektrale Absorptionsmaß wird bei 415 nm gemessen.
Im Falle, in dem Peroxidase als mit dem sekundären Antikörper zu bindendes Markerenzym verwendet wird, werden vorzugsweise Wasserstoffperoxid und o-Phenylendiamin als Substrat bzw. Farbentwickler verwendet. In diesem Fall sind die spezifischen Bedingungen nicht besonders beschränkt, und es wird eine Methode verwendet, in der eine Lösung eines Farbentwicklers zum Reaktionssystem zugegeben wird; das System wird bei ca. 25°C während ca. 10 Minuten Reagieren gelassen; und die enzymatische Reaktion wird durch Zugabe von 4 N Schwefelsäure beendet.
Wenn o-Phenylendiamin als Farbentwickler verwendet wird, wird das spektrale Absorptionsmaß bei 492 nm gemessen. Zusätzlich kann auch eine Sensibilisierung unter Verwendung eines Avidin-Biotin-Systems verwendet werden.
In einer einfachen Weise zur Durchführung des vorstehend genannten immunochemischen Assays wird ein diagnostisches Mittel zur Diagnose von DPD-Mangel, das den erfindungsgemäßen anti-Uracil-monoklonalen Antikörper enthält, verwendet.
Spezifischerweise ist das diagnostisches Mittel – zur Bestimmung oder Quantifizierung von Uracil oder Thymin in einer zu untersuchenden Probe verwendet – ein Kit, der den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper und optional Uracil oder 5-Halogen-1-carboxymethyluracil-Schlepper-Komplex enthält.
Das diagnostische Mittel kann ein Set sein, das zusätzlich zum erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper mindestens eines von fünf Bestandteilen, ausgewählt unter Trägern zur Immobilisierung, Markierungsmitteln, Substraten (Bestimmungsmitteln), die den Markierungsmitteln entsprechen, Antigenen und sekundären Antikörpern (z.B. anti-Maus-Immunoglobulin) enthält. Wenn das Set ein Markierungsmittel enthält, kann das Markierungsmittel vorher mit einem beliebigen Bestandteil, wie z.B. einem sekundären Antikörper, konjugiert sein. Beispiele für das Markierungsmittel umfassen eine Vielzahl von Verbindungen, wie z.B. Radioisotope, Enzyme und fluoreszierende Substanzen. Von diesen sind aus einer Vielzahl von Gesichtspunkten heraus, wie z.B. Durchführbarkeit, Enzyme bevorzugt.
Das diagnostische Mittel kann ferner für Messzwecke geeignete Bestandteile, wie z.B. ein Verdünnungsmittel für einen Antikörper oder ein Antigen, ein Verdünnungsmittel für die Reaktion, einen Puffer, ein oberflächenaktives Mittel, ein Substrat-lösendes Mittel, ein die Reaktion terminierendes Mittel und ein eine Feststoffadsorption-verhinderndes Mittel, enthalten.
Beispiel 1. Herstellung von 5-Brom-1-carboxymethyluracil-Schlepper-Komplex
Unter Verwendung eines Immject Immunogen EDC Conjugation-Kits (Produkt von Pierce) und gemäß der beigelegten Vorschrift wurde 5-Brom-1-carboxymethyluracil an Rinderserumalbumin (BSA) oder Hämocyanin (KLH) gebunden, um dadurch einen 5-Brom-1-carboxymethyluracil(BSA)-Komplex oder einen 5-Brom-1-carboxymethyluracil-KLH-Komplex herzustellen. Spezifischerweise wurde das folgende Verfahren verwendet.

1) 5-Brom-1-carboxymethyluracil (4 mg) wurde in einem Konjugationspuffer (1 ml; 0,1 M MES (2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure), 0,9 M NaCl, 0,02% NaN₃, pH = 4,7) gelöst.
2) BSA (oder KLH) (10 mg) wurde in einem anderen Teil des Konjugationspuffers (1 ml) gelöst.
3) Die in Stufe 1) hergestellte 5-Brom-1-carboxymethyluracil-Lösung (50 μl) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (125 μl; wenn KLH anstelle von BSA verwendet wird, 50 μl) wurden zu der in Stufe 2) hergestellten BSA(oder KLH)-Lösung (200 μl) zugegeben.
4) Die in Stufe 3) hergestellte Lösung wurde bei 37°C 2 Stunden lang stehen gelassen und einer Zentrifugation bei 10.000 UpM während 5 Minuten unterworfen, um dadurch Pellets zu entfernen.
5) Die in Stufe 4) erhaltene Lösung wurde auf eine D-Salz-Dextran-Entsalzungsäule gegeben, und das Eluat wurde mit 0,5 ml/Röhrchen fraktioniert. Das spektrale Absorptionsmaß jeder Fraktion wurde bei 280 nm und 260 nm gemessen. Die dem ersten Peak entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, und dadurch eine Lösung von 5-Brom-1-carboxymethyluracil-BSA(oder KLH)-Komplex erhalten.
6) Die Gegenwart des Komplexes wurde durch Analyse des spektralen Absorptionsmaßes in der Nachbarschaft von OD 260 nm bestätigt, was der Pyrimidin-Skelettstruktur von 5-Brom-1-carboxymethyluracil zuzuschreiben ist. Als Ergebnis wurde in Bezug auf den 5-Brom-1-carboxymethyluracil-BSA-Komplex abgeleitet, das 7,31 Moleküle 5-Brom-1-carboxymethyluracil an ein BSA-Molekül gebunden waren, während in Relation zum 5-Brom-1-carboxymethyluracil-KLH-Komplex abgeleitet wurde, dass 26 Moleküle 5-Brom-1-carboxymethyluracil an ein KLH-Molekül gebunden waren.

Die vorstehend beschriebenen Komplexe wurden verwendet, um ein Hybridoma und einen monoklonalen Antikörper herzustellen.
Beispiel 2. Herstellung der Antikörper-produzierenden Zellen
Jeder von fünf BALG/c-Mäusen wurde vollständiges Freund's-Adjuvans (200 μl), das das in Beispiel 1 hergestellte Antigen enthielt (5-Brom-1-carboxyuracil-KLH, 10 μg), intraperitoneal injiziert. Zwei Wochen später wurde unvollständiges Freund's-Adjuvans (200 μl), das das gleiche Antigen (10 μg) enthielt, den gleichen Mäusen intraperitoneal verabreicht.
Weitere 2 Wochen danach wurde aus dem Fundus der Mäuse Blut entnommen. Während das so gesammelte Blut als Antikörperquelle verwendet wurde, wurde die Inhibierung der Antigen-Antikörper-Reaktion durch Uracil geprüft. PBS-Lösung (200 μl), die das Antigen (10 μl) enthielt, wurde einer Maus, dessen Serum den höchsten Inhibierungsgrad durch Uracil zeigte, intravenös verabreicht. Drei Tage später wurde die Milz der Maus aseptisch entfernt und mit RPMI1640-Medium zweimal gewaschen. Die Milz wurde auf einen reinen Tisch gegeben und mit dem gleichen Medium zwei zusätzliche Male gewaschen. Danach wurde die Milz in einer Petrischale zerkleinert, und die so erhaltenen Milzzellen wurden in RPMI1640-Medium suspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein 15 ml-Zentrifugenrohr gegeben und einer Zentrifugation während 7 Minuten bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur unterworfen. Der Überstand wurde verworfen.
Die Zellsedimente wurden in RPMI1640-Medium (10 ml) suspendiert, und die resultierende Zellsuspension wurde 3 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Zellsuspension wurde in ein 50 ml-Zentrifugenrohr so abgezogen, dass sie die Gewebsmasse am Boden des Zentrifugenrohrs nicht enthielt, und einer Zentrifugation während 7 Minuten bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur unterworfen. Der Überstand wurde verworfen und RPMI1640-Medium wurde dem Zentrifugenrohr zugegeben, damit das Gesamtvolumen der Suspension 10 ml wurde. Die Zahl von Milzzellen mit einem Kern wurde mit einem Hämozytometer gemessen. Die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Milzzellen wurden zur Fusion mit Myelomzellen verwendet.
Beispiel 3. Zellfusion
(1) Herstellung von Myelomzellen
P3U1-Zellen eines Myelomstamms einer 8-Azaguanin-resistenten Maus (BALG/c-Maus) wurde zur Zellfusion mit den vorstehend genannten Milzzellen verwendet. Die P3U1-Zellen wurden vorher mit RPMI1640-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) subkultiviert.
Die P3U1-Zellen der Tag 1-Subkultur wurden in ein 50 ml-Zentrifugenrohr übertragen und einer Zentrifugation während 5 Minuten bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur unterzogen. Der Überstand wurde verworfen und die P3U1-Zellen wurden in RPMI1640-Medium (10 ml) suspendiert. Die Zahl der Zellen wurde mit einem Hämozytometer gezählt. Die so hergestellten Myelomzellen (P3U1-Zellen) wurden zur Zellfusion verwendet.
(2) Zellfusion
Die Zahl der Zellen der in Stufe (1) hergestellten P3U1-Zellen und der in Beispiel 2 hergestellten sensibilisierten Zellen wurde gezählt, und die Zellen wurden in folgendem Verhältnis (Zahl der Zellen) gemischt. P3U1-Zellen: sensibilisierte Zellen = 1:5. Die Mischung wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann 5 Minuten lang bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellpellets wurden durch Klopfen auf das Zentrifugenrohr gelöst. 50% Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht = 1.000) wurde während 10 Sekunden dem Zentrifugenrohr, das die gelösten Zellen in einer Menge von 1 ml pro kombinierter Zellzählung von 2 × 10⁸ Zellen enthielt, zugegeben, während das Zentrifugenrohr rotiert wurde. Das Rotieren wurde weitere 50 Sekunden lang fortgesetzt. Danach wurde während Rotieren RPMI1640-Medium (15 ml) während 3 Minuten zugegeben und zusätzliche 25 ml des Mediums wurden während 1 Minute zugegeben. Der Inhalt des Zentrifugenrohrs wurde durch leichtes Pipettieren gleichmäßig gemacht, und danach 5 Minuten bei 1.000 UpM bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in HAT-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (um die Konzentration der sensibilisierten Zellen auf 1,6 × 10⁶ Zellen/ml zu bringen) suspendiert. Die so hergestellte Zellsuspension wurde auf eine flache Platte mit 96 Vertiefungen mit 200 bis 250 μl/Vertiefung aufgetragen. Die Zellen wurden während eines Zeitraums von 10 bis 14 Tagen bei 37°C unter 5% CO₂ inkubiert.
Beispiel 4. Screenen von Hybridoma
Die in Beispiel 3 erhaltenen Hybridomazellen wurden einem Screening-Test mittels ELISA unterworfen. In eine Immunoplatte mit 96 Vertiefungen wurde Uracil-BSA-Komplex (10 μg/ml, auf BSA bezogen) mit 50 μl/Vertiefung gegeben und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Danach wurde die Immunoplatte siebenmal mit PBS, das 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat (Produkt von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; einem zu Tween 20 äquivalenten Produkt) (pH 7,3 bis 7,7, Produkt von Nissui Chemical; nachstehend als PBS-T bezeichnet) gewaschen. Danach wurde 0,2% Gelatine (200 μl) jeder Vertiefung zugegeben, und die Immunoplatte wurde 2 Stunden bei 37°C oder über Nacht bei 4°C belassen.
Danach wurde die Immunoplatte fünfmal mit PBS-T gewaschen, und eine der nachstehend beschriebenen Proben (50 μl/Vertiefung) wurde der Immunoplatte zugegeben, die dann 1 Stunde lang bei 37°C belassen wurde.

(i) Eine Reaktionsmischung, hergestellt durch Mischen des Überstandes der in Beispiel 3 erhaltenen Hybridoma-Kultur (nachstehend als Hybridoma-Kulturüberstand bezeichnet) (30 μl) und PBS (30 μl) zur Reaktion bei 37°C währen 1 Stunde;
(ii) eine Reaktionsmischung, erhalten durch Mischen des Hybridoma-Kulturüberstands (30 μl) und einer Lösung (30 μl) von Uracil in PBS (Uracil-Konzentration: 1 mg/ml) zur Umsetzung bei 37°C während 1 Stunde; und
(iii) 1 μl/ml gesundes Maus-IgG (Produkt von Biological). Danach wurden die Vertiefungen fünfmal mit PBS-T gewaschen, und zu jeder Vertiefung wurde mit alkalischer Phosphatase markiertes (AP-markiertes) anti-Maus-multivalenter Immunoglobulin-Antikörper (Produkt von Sigma) zugegeben, der auf das 1.000-fache mit 0,1% Gelatine verdünnt wurde (50 μl). Danach wurde die Mischung 1 Stunde bei 37°C stehen gelassen. Danach wurden die Vertiefungen fünfmal mit PBS-T gewaschen. Eine Lösung von Dinatrium-p-nitrophenylphosphat (Produkt von Wako Chemical Industries, Ltd.), gelöst in Substratpuffer (1 mg/ml) wurde jeder Vertiefung zugegeben (100 μl/Vertiefung) und 30 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Zu den Reaktionsmischungen wurde 2N NaOH (50 μl/Vertiefung) zugegeben und dann unter Verwendung eines Plattenmischers gemischt, um dadurch die Reaktion zu stoppen. Unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts wurde das spektrale Absorptionsmaß bei 415 nm gemessen.

Die Prozent-Absorption wurde berechnet unter Verwendung der folgenden Gleichung:
worin bedeuten:

OD_PBS:: Spektrales Absorptionsmaß, gemessen mittels ELISA für eine Probe, in der der Hybridoma-Kulturüberstand nur mit PBS vorbehandelt wurde,
OD_Uracil:: Spektrales Absorptionsmaß, gemessen mittels ELISA für eine Probe, in der der Hybridoma-Kulturüberstand mit Uracil in PBS vorbehandelt wurde, und
OD_Kontrolle:: Spektrales Absorptionsmaß, gemessen mittels ELISA für eine nur mit gesunder Mäuse-IgG behandelten Probe.

Beispiel 5. Klonen
Das in Beispiel 4 erhaltene den monoklonalen Antikörper produzierende Hybridoma wurde zweimal nach einer bekannten üblichen Limitierungsverdünnungsmethode geklont.
Spezifischerweise wurde die Zahl der in Beispiel 4 erhaltenen den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoma-Zellen gezählt. Eine Hybridoma-Zelle und RPMI1640 (0,2 ml), enthaltend 10% FBS und 10% BM Condimed H1 (eingetragenes Warenzeichen von Boehringer Mannheim) wurden in jede Vertiefung einer Immunoplatte gegeben und unter 5% CO₂ bei 37°C 10 bis 14 Tage lang inkubiert.
Die resultierenden Hybridoma-Klone wurden einem Screenen mittels ELISA, wie in Beispiel 4 beschrieben, unterworfen. Danach wurden die ausgewählten Hybridoma-Klone wieder mittels der vorstehend beschriebenen Methode kloniert, gefolgt von einem weiteren Screenen mittels dem vorstehend genannten ELISA. Als Ergebnis wurden die klonierten Zellen (2D3 und 2H10), die einen gegenüber Uracil und Thymin spezifischen Antikörper produzieren, aus den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomas abgetrennt. Eine der so erhaltenen klonierten Zellen (2D3), Maus-Hybridoma-CMU-1, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, unter dem Budapester Vertrag hinterlegt (Hinterlegungs-Nr.: FERM BP-6870).
Beispiel 6. Lagerung von anti-Uracil-monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridomas
Die in Beispiel 5 erhaltenen den monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoma-Klone wurden zu RPMI1640-Medium, enthaltend 10% FBS und 10% DMSO, damit die Hybridoma-Konzentration 1 × 10⁷ Zellen/ml wurde, zugegeben. Aliquote Mengen (1 ml) der resultierenden Mischung wurden in Cryo Tubes (Produkt von Nunc) gegeben und dann in einer Tiefgefriervorrichtung bei –90°C eingefroren und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Beispiel 7. Herstellung von monoklonalem Antikörper und seine Bewertung
Das in Beispiel 5 erhaltene den monoklonalen Antikörper produzierende Hybridoma, Maus-Hybridoma-CMU-1, wurde in RPMI1640-Medium, enthaltend 10% FBS und 10% BM Condimed H1 (Produkt von Boehringer Mannheim) unter 5% CO₂ bei 37°C 2 bis 3 Tage lang kultiviert.
Unter Verwendung des aus der vorstehend beschriebenen Inkubation erhaltenen Hybridoma-Kulturüberstands wurde die Reaktivität des monoklonalen Antikörpers, CMU-1, der vorliegenden Erfindung mittels indirektem kompetitivem Inhibierungs-ELISA, beschrieben in Beispiel 4, untersucht.
Spezifischerweise wurde ein aliquoter Anteil (50 μl) von Uracil-BSA-Komplex (10 μg/ml) in jede Vertiefung einer Immunoplatte mit 96 Vertiefungen gegeben (Immunoplate I, Produkt von Nunc) und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Jede Vertiefung wurde fünfmal mit PBS-T (200 μl), enthaltend 0,1% Tween 20, gewaschen. Danach wurde jeder Vertiefung der Immunoplatte PBS (200 μl), enthaltend 0,2% Gelatine, das als Blockierungsmittel dient, zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Jede Vertiefung wurde wieder fünfmal mit PBS-T gewaschen, um dadurch eine Platte herzustellen.
Inzwischen wurde jeder der folgenden Proben:

(i) eine Mischung aus dem vorstehend genannten Hybridoma-Kulturüberstand (30 μl) und PBS (30 μl);
(ii) eine durch Mischen des Hybridoma-Kulturüberstands (30 μl) und PBS (30 μl), enthaltend Uracil mit einer Konzentration von 0,03 bis 1,0 mg/ml, und reagieren lassen bei 37°C während 1 Stunde, erhaltene Reaktionsmischung; und
(iii) 1 μl/ml gesunde Maus-IgG (Produkt von Biologicals) einer Platte mit 96 Vertiefungen, auf der das vorstehende Antigen adsorbiert worden war (50 μl/Vertiefung) zugegeben, und die Platte wurde 1 Stunde lang bei 37°C stehen gelassen. Danach wurde die Platte fünfmal mit PBS-T gewaschen, und jeder Vertiefung Aliquote (50 μl) von AP-markiertem anti-Maus-Antikörper (als sekundärer Antikörper dienend, Produkt von Sigma), mit PBS, enthaltend 0,1% Gelatine, auf das 1.000-fache verdünnt, zugegeben, und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37°C stehen gelassen. Danach wurde jede Vertiefung fünfmal mit PBS-T gewaschen. Jeder Vertiefung wurde eine Enzymsubstrat-Pufferlösung (p-Nitrophenylphosphat, 1 mg/ml, pH 9,8) zugegeben (100 μl/Vertiefung) und 30 Minuten bei 37°C stehen gelassen. Zu den Reaktionsmischungen wurde 2N NaOH (50 ml/Vertiefung) zugegeben, um dadurch die Reaktion zu beenden. Unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts wurde das spektrale Absorptionsmaß bei 415 nm gemessen. Zum Vergleich wurde dasselbe Verfahren unabhängig an Hybridoma-FERM BP-6141, beschrieben in der PCT- Publikation Nr. WO99/20748 , durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 angegeben. Die Prozent Absorption wurde aus der vorstehend beschriebenen Gleichung berechnet.

Wie in 1 dargestellt, erlaubt der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper die Bestimmung von Uracil in einem Konzentrationsbereich von 0,005 bis 0,5 mg/ml. Die Bestimmungssensitivität für die Uracil-Bestimmung ist im Vergleich mit monoklonalem Antikörper SU-1, stammend aus Hybridoma-FERM BP-6141, beträchtlich erhöht.
Beispiel 8. Kreuzreaktivitätstest

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 wurde die Reaktivität des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit anderen Verbindungen untersucht. Spezifischerweise wurde das Verfahren von Stufe (ii) des Beispiels 7 zur Untersuchung der Inhibierung mit Uracil wiederholt, mit der Ausnahme, dass Pseudouridin, Dihydrouracil, Dihydrothymin, Thymin, Cytosin oder N-Carbamyl-β-alanin (1 mg/l) anstelle von Uracil (1 mg/ml) verwendet wurden, um dadurch die Reaktivität des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit Uracilverbindungen zu untersuchen. Als Vergleichs-Antikörper wurde ein monoklonaler Antikörper (SU-1), abgeleitet vom Hybridoma-"FERM BP-6141", beschrieben in WO 99/20748 , verwendet. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 1

Verbindung*	Monoklonaler Antikörper
Verbindung*	Vorliegende Erfindung (CMU-1)	Vergleich (SU-1)
Uracil	95-96%	41%
Thymin	91-97%	5%
N-Carbamyl-β-alanin	8%	91%
Dihydrouracil	8%	2%
Dihydrothymin	22%	-
Pseudouridin	32%	26%
Cytosin	15%	15%

*Endkonzentration 0,5 mg/ml

Wie in Tabelle 1 gezeigt, reagierte der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper mit Uracil und Thymin stark und zeigte eine dosisabhängige Reaktion. Seine Reaktivität mit N-Carbamyl-β-alanin, Dihydrouracil, Dihydrothymin, Pseudouridin und Cytosin wurde jedoch als niedrig festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte der Vergleichs-Antikörper mit N-Carbamyl-β-alanin eine höhere Reaktivität als mit Uracil oder Thymin.
Zusätzlich zeigte der erfindungsgemäße Antikörper keine dosisabhängige Reaktion gegenüber N-Carbamyl-β-alanin, Dihydrouracil, Dihydrothymin und Cytosin, aber eine dosisabhängige Reaktion gegenüber Pseudouridin. Deshalb wurde das Konzentrations-Prozent Absorption-Verhältnis, bezogen auf Uracil, Thymin und Pseudouridin, gegenüber denen eine dosisabhängige Reaktion bestätigt wurde, untersucht. 2 zeigt die Ergebnisse und Tabelle 2 zeigt die Konzentrationen (mg/ml) der entsprechenden Verbindungen, wenn die Prozent Absorption 30% (ED₃₀) erreichte. Tabelle 2

Verbindung ED₃₀ (mg/ml)

Uracil 0,03

Thymin 0,015

Pseudouridin 0,39
Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration an Uracil 1/13 von der von Pseudouridin war, um die gleiche Prozent Absorption zu zeigen, und dass die Konzentration von Thymin 1/26 der von Pseudouridin war, um die gleiche Prozent Absorption zu ergeben. Somit wurde gefunden, dass die Bindungsfähigkeit von Uracil 13 Mal größer als die von Pseudouridin und die Bindungsfähigkeit von Thymin 26 Mal größer als die von Pseudouridin war.
Industrielle Anwendbarkeit
Der monoklonale Antikörper der vorliegenden Erfindung ist dazu fähig, mit hoher Geschwindigkeit und auf einfache Weise selektiv in einer Probe enthaltenes Uracil und Thymin zu bestimmen. Zusätzlich ist der monoklonale Antikörper zur Diagnose eines DPD-Mangels unter Verwendung einer menschlichen Urinprobe brauchbar. Der monoklonale Antikörper ist insbesondere sehr geeignet zum Screenen von Krebspatienten mit DPD-Mangel, bei denen eine Verabreichung eines Antitumormittels auf Basis eines Pyrimidinfluorids kontraindiziert ist.

Claims

Monoklonaler Antikörper, der in einer Kreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin Selektivität für Uracil und Thymin zeigt, worin die Selektivität in der Kreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin 10% oder weniger ist, wenn die Selektivität in der Kreuzreaktion mit Uracil und Thymin 90% oder mehr ist, wobei die Selektivität in einem indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA bestimmt wird.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, der in Kreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin eine Selektivität von 10% oder weniger aufweist, wenn die Selektivität in der Kreuzreaktion mit Uracil und Thymin 90% oder mehr ist, worin der Wert des Prozentgehalts für Uracil Prozent Absorption (%) bedeutet, bestimmt in einem indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA unter Verwendung einer Uracil-beschichteten Immunoplatte, eines mit alkalischer Phosphatase markiertem sekundären Antikörpers und Nitrophenylphosphat als Phosphatase-Substrat, und unter Verwendung der folgenden Formel
worin bedeuten OD_PBS: das für eine Probe, in der ein Hybridomakultur-Überstand, der den monoklonalen Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 enthält, mit Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) vorbehandelt wurde, gemessene spektrale Absorptionsmaß, OD_uracil: das für eine Probe, in der der Hybridomakultur-Überstand mit Uracil in PBS bei einer Uracil-Konzentration von 0,5 mg/ml vorbehandelt wurde, gemessene spektrale Absorptionsmaß, OD_Kontrolle: das für eine Probe von Mäuse-IgG gemessene spektrale Absorptionsmaß, und wobei die Werte des Prozentgehaltes für Thymin und N-Carbamyl-β-alanin bestimmt werden unter Verwendung von Thymin bzw. N-Carbamyl-β-alanin anstelle von Uracil im indirekten kompetitiven Inhibierungs-ELISA und der obigen Formel.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, der in der Überkreuzreaktion mit N-Carbamyl-β-alanin eine Selektivität von 10% oder weniger, in der Kreuzreaktion mit Pseudouridin eine Selektivität von 33% oder weniger, in der Kreuzreaktion mit Dihydrouracil eine Selektivität von 8% oder weniger und in der Kreuzreaktion mit Dihydrothymin eine Selektivität von 23% oder weniger aufweist, wenn die Selektivität in der Kreuzreaktion mit Uracil und Thymin 90% oder mehr ist, wobei die Werte des Prozentgehalts Prozent-Absorption (%) bedeuten, bestimmt wie in Anspruch 1 beschrieben.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, der für eine Hybridoma, der aus einer Myelomzelle und einer von einem Tier, dem 5-Halogen-1-carboxymethyluracil verabreicht worden war, abgeleiteten Antikörper produzierenden Zelle ausgebildet ist, produzierbar ist.
Monoklonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der aus Hybridoma FERM BP-6870-Stamm produzierbar ist.
Eine einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 produzierende Hybridoma.
Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Uracil und Thymin in einer Probe unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Diagnostisches Mittel zum Diagnostizieren von Dihydropyrimidindehydrogenase(DPD)-Mangel, wobei das Mittel einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
Verfahren zum Diagnostizieren von DPD-Mangel, gekennzeichnet durch Bestimmen von Uracil und Thymin in einer Probe unter Verwendung eines diagnostischen Mittels zum Diagnostizieren von DPD-Mangel nach Anspruch 8.
Verwendung eines monoklonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose eines DPD-Mangels.