KR100561781B1 - 방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방기(Sinomenium acutum)를 60 내지 90℃의 온도에서 추출하여 얻어진 방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 방기 추출물은 멜라노사이트(melanocyte)에서 멜라닌 생성을 억제하고, 멜라노사이트와 케라티노사이트(keratinocyte)를 공동 배양하였을 때 생성되는 멜라닌의 양을 뛰어나게 감소시키며, 동물실험 및 임상실험에서도 우수한 미백 효과를 나타내므로, 본 발명에 의한 피부 미백용 조성물을 이용하면, 방기 추출물의 미백 효능으로 인해 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 피부를 환하게 할 수 있으므로, 피부 미백용 화장료 조성물 또는 피부 미백용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

방기 추출물, 멜라노사이트, 케라티노사이트, 멜라닌, 미백, 화장료, 약학, 조성물.

Description

방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Composition for skin whitening containing extract of Sinomenium acutum}

도 1은 방기 추출물이 멜라노사이트의 멜라닌 생성에 미치는 효과를 나타낸 그래프로, 방기 추출물을 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm 처리했을 때 멜라닌 생성의 억제 정도를 보여주며, 특히 방기 추출물이 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 1 ppm에서도 탁월하게 저해함을 보여준다.

도 2는 방기 추출물이 멜라노사이트와 케라티노사이트 공동배양(co-culture)에서 멜라닌 생성에 미치는 효과를 나타낸 그래프로, 방기 추출물을 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm 처리했을 멜라닌 생성량이 농도 의존적으로 저해 받고 있음을 보여주며, 특히 같은 농도에서 그 효과가 알부틴보다 더 좋게 나옴을 보여준다.

도 3은 방기 추출물이 멜라노사이트와 케라티노사이트 공동배양에서 전체 단백질 중 타이로시나제의 활성에 미치는 효과를 나타낸 그래프로, 방기 추출물은 타이로시나제의 활성을 농도 의존적으로 감소시키고 있음을 보여준다.

도 4a는 갈색 기니아 피그를 이용하여 측정한 방기 추출물(0.3 %)의 미백효과를 색차계의 L 값으로 나타낸 그래프로, 색차계의 L값은 밝기를 나타내는 값으로서 밝을수록 커지고 어두울수록 작아지며, 따라서 시료 처리전과 시료 처리 후의 ΔL 값이 큰 것일수록 좋은 미백효과를 갖고 있음을 시사하고 있는 것으로, 평균적으로 방기 추출물이 비이클보다 효과가 좋음을 볼 수 있다.

도 4b는 하기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 미백 조성물을 처리한 후 측정한 인공색소반 사진으로, 1/4 분면은 비이클, 2/4 분면은 비처리군, 3/4분면은 하이드로퀴논(HQ) 2%, 4/4 분면은 방기 추출물 0.3 %을 처리한 결과로서, 방기 추출물의 경우 본래의 피부색에 가깝게 밝아진 것을 볼 수 있다.

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 멜라닌(melanin)은 멜라노사이트(melanocyte)의 멜라노솜(melanosome)이라는 피부 세포의 소기관에서 만들어져 주위의 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다.

멜라닌은 타이로신(tyrosine)을 기질로 하여 타이로신을 산화시키는 타이로시나제(tyrosinase)에 의해 산화과정을 거치면서 만들어진다.

한편, 상기와 같은 반응에는 TRP1과 TRP2도 관여하는 것으로 알려져 있는데 멜라닌이 합성되는 속도를 결정하는 단계는 바로 타이로시나제에 의해 타이로신에 하이드록시기가 붙는 단계이다.

따라서, 타이로시나제의 활성을 저해하면 멜라닌의 생성속도를 줄여서 피부를 밝게 할 수 있다고 알려져 있다.

그러나, 피부색을 결정하는 것은 말처럼 그리 단순하지만은 않다. 멜라노사이트의 증식 및 분화, 타이로시나제의 정확한 3차 구조 형성 및 당과의 결합, 타이로시나제의 ER에서 골지(Golgi)로의 이동, 멜라노좀의 멜라노사이트내에서의 이동 및 케라티노사이트로의 전달, 합성되는 멜라닌의 종류, 피부의 산화-환원상태, 미백에 관여하는 싸이토카인(cytokine)과 호르몬의 생성 조절 등 다양한 인자에 의해 영향을 받는다.

상기와 같이 피부색이 결정되는 것은 실로 다양한 요인의 복합작용에 의해서 결정된다.

따라서, 단순히 타이로시나제의 저해제가 좋은 미백제라고 볼 수 없는 것이며, 많은 타이로시나제 저해제가 개발되고 있지만 모두가 좋은 미백효과를 보이고 있지는 않다.

그 이유는 설령 타이로시나제를 저해하더라도 이 물질이 각질형성세포인 케라티노사이트에 작용하여 멜라닌의 생합성을 촉진시키는 인자의 생성을 증가시킨다면, 결과적으로 미백작용은 약화되거나 오히려 악효과를 거둘 수 있기 때문이다. 실제로 멜라노사이트만 키운 상태에서는 밝은 페오멜라닌이 우세하게 생성되던 것이 케라티노사이트와 같이 키운 상태에서는 어두운 유메라닌이 우세하게 생성되는 경우도 보고되고 있다.

따라서, 종합적으로 멜라닌의 생합성을 관찰하는 일이 중요하며, 케라티노사 이트와 멜라노사이트에 대한 영향을 함께 알아보는 것이 더욱 중요하고, 궁극적으로는 동물실험에서 효과가 있어야 좋은 미백제라고 할 수 있다.

한편, 지금까지 여러 가지 멜라닌 생성 억제제가 합성되고 있지만 합성물질은 자연계에 존재하지 않는 전혀 새로운 물질인 경우가 많아서 생분해가 되지 않거나 암의 발생 등 악영향을 미칠 가능성이 크므로, 천연물에서 지금까지 알려지지 않은 미백 효과가 우수한 새로운 물질을 찾고자 하는 요구가 증대되고 있다.

천연물인 방기(Sinomenium acutum)는 청등 또는 한방기라고도 하며 쌍떡잎식물 미나리아재비목 방기과의 낙엽 덩굴식물로서, 한국·일본·중국 등지에 분포한다. 길이는 약 7 m 이며, 가지에 털이 없고 세로줄이 있으며, 잎은 어긋나고 둥글거나 넓은 달걀 모양이다. 꽃은 암수딴그루로서 6월에 연한 녹색으로 피고, 열매는 핵과(核果)로서 둥근 모양이며 10월에 검게 익는다. 한방에서 성질은 한(寒)이며, 줄기와 뿌리를 소염·이뇨·진통제로서 수종(水腫)·신경통·관절염·류머티즘에 썼고, 임산부가 출산 후 붓기가 빠지지 않을 때도 사용했다고 한다.

방기의 활성성분으로는 시노메닌, 이소시노메닌, 디시노메닌, L-시낙틴, 아쿠투민과 같은 알카로이드와 베타시토스테롤, 스티그마스테롤이 함유되어 있는 것이 밝혀졌으며, 최근 동물 세포로부터 종양괴사인자와 아낙필락스 억제인자와 관련된 시험이 연구되어진바 있다.

또한, 한방기 및 다른 여러 약초 추출물을 함유하는 저자극성 화장료 조성물이 알려져 있고(한국특허공개 제2002-95616호), 방기의 뿌리 및/또는 줄기와 아미노산 또는 그 유도체를 함유하여 피부 질환, 거친 피부, 건성 체질 등의 개선 및 예방 효과를 가지는 피부 외용제(일본 특개평 11-269028호 공보), 방기 추출물과 피막 형성제를 포함하여 높은 체중 감량 관리법(slimming) 효과감을 부여할 수 있는 피부 외용제(일본 특개평 11-269027호 공보), 방기 및 다른 식물 추출물을 함유하는 bcl-2 증가 유도제 및 아폽토시스(apoptosis) 억제제(일본특허공개 2002-80382호), 및 방기 추출물을 함유하는 빛 노화 방지 개선제(일본 특개평 10-158143호 공보)가 알려져 있다.

그러나, 지금까지 방기의 멜라닌 생성 억제 및 미백효과에 대해서는 보고된 바가 없으며, 더구나 미백제로 개발된 예도 전혀 없다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 이제까지의 미백제 보다 효능이 뛰어나고 좀 더 안전한 새로운 미백물질을 찾고자 여러 천연물에서 멜라닌 생성 억제 및 미백 효능을 검색해 본 결과, 방기 추출물이 매우 우수한 멜라닌 생성 억제능 및 미백 효과를 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 방기 추출물을 함유하여 우수한 미백효과를 나타내면서도 부작용이 없는 새로운 미백제를 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 방기(Sinomenium acutum)를 60 내지 90℃의 온도에서 추출하여 얻어진 방기 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 상기 방기 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물 또는 피부 미백용 약학 조성물임을 특징으로 한다.

상기 방기 추출물은 건조중량 기준으로 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량 %로 함유될 수 있다. 이는 0.001 중량 % 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 20.0 중량 %를 초과하면 안전성, 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 방기는 전초, 줄기, 뿌리, 잎, 꽃을 단독으로 또는 함께 사용할 수 있으며, 바람직하게는 줄기와 뿌리를 단독으로 또는 함께 사용할 수 있다.

상기 방기 추출물을 수득하기 위하여 용매로는 극성용매, 구체적으로 메탄올, 에탄올, 부틸렌글리콜 등의 알코올 류, 에틸 에테르 등의 에테르 류, 아세톤 등의 케톤 류, 초산에틸에스테르 등의 에스테르 류 등의 극성 유기 용매 또는 물을 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

또한, 상기 방기 추출물은 상기 극성용매로 추출한 추출물을 비극성용매로 다시 추출하여 수득할 수 있으며, 비극성용매로는 구체적으로 에틸 아세테이트, 헥산, 디클로로메탄 또는 클로로포름을 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물을 사용할 수도 있다.

상기 방기 추출물의 추출방법으로는 방기의 성분을 뽑아낼 수 있는 에탄올 추출, 메탄올 추출, 부틸렌글리콜 추출, 에틸 아세테이트 추출 등의 어떠한 다른 방법들도 더 포함시킬 수 있다.

상기 추출물은 추출물 또는 추출액 그 자체, 추출물 또는 추출액의 농축물 또는 건조물일 수 있고, 이들의 혼합물일 수도 있다.

본 발명의 방기 추출물을 수득하기 위하여, 먼저 방기에 약 1 내지 15배의 극성용매를 가한 후, 약 20 내지 100 ℃, 바람직하게는 60 내지 90 ℃에서, 1 내지 24 시간동안 가열하는 열수 추출로 1 내지 5회 추출하여 수득된 추출액을 감압여과하여 고형상이 제거된 추출액을 감압증류하여 용매를 완전히 제거하거나, 보다 효과를 높이기 위해 용매를 일정량 제거한 후 추출액의 2 내지 4배의 비극성용매를 가한 후, 상온에서 1 내지 24 시간 동안 방치하여 층을 완전히 분리한 다음, 상층을 분리한 후, 분리된 용액을 다시 감압증류하여, 본 발명의 방기 추출물을 수득할 수 있다.

상기 방법으로 수득된 방기 추출물의 미백 효과를 알아보기 위하여, 멜라닌 생성 저해 및 타이로시나제 활성 저해 효과를 시험관 실험(in vitro)으로, 미백효과를 생체내 실험(in vivo)을 통해 조사해본 결과, 방기 추출물이 멜라노사이트(melanocyte)에서의 멜라닌 생성을 억제하고, 더욱이 멜라노사이트와 케라티노사이트(keratinocyte)를 공동 배양하였을 때 생성되는 멜라닌의 양을 감소시키는 효과도 우수하며, 동물실험 및 임상실험에서도 미백 효과가 우수함을 확인하였다.

본 발명은 상기 방기 추출물의 양이 전체 화장료 조성물의 건조중량 기준으로 0.001 내지 20 중량 %를 갖는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 이는, 0.001 중량 % 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 20.0 중량 %를 초과하면 안전성, 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다.

또한, 본 발명에 따른 미백용 화장료 조성물은, 상기한 방기 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주 효과에 상승 효과를 줄 수 있는 다른 미백 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 이와 같은 성분으로서, 코직산, 알부틴, 이스코빅 산 유도체 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 방기 추출물은, 추출물 또는 추출액 그 자체, 추출물 또는 추출액의 농축물 또는 건조분말이나 이들의 혼합물을 미백화장료 제형으로 제조하여 그대로 도포하는 것이 적합하나, 통상의 내복 또는 외용의 제제로도 할 수 있다.

본 발명의 조성물은 피부 미백 효과를 위한 화장품 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품 류와 클렌징, 세안제, 비누, 미용액 등이 있다.

본 발명의 방기 추출물을 함유하는 조성물이 첨가된 미백용 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

즉, 본 발명의 미백용 화장료는 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징크림, 클렌징 워터, 비누, 분무제 등과 같은 제형을 들 수 있다.

각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 방기 추출물 이외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의선정하여 배합할 수 있다.

상기한 제제는 미백 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 방기 추출물의 양이 전체 약학 조성물의 0.001 내지 20 중량 %를 갖는 피부 미백용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 방기 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

제형으로는 본 발명에 따른 방기 추출물을 포함하는 약학조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등 의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다. 이 때, 비경구 루트로는 경피투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소도포가 가장 바람직하다.

상기 제제의 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 투여 방법에 의해 상이하나, 외용제의 경우는 1일당 1.0 내지 3.0 ㎖로 이를 1일 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속하는 것이 좋다.

또한, 경구형 제형의 경우도 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 방기 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예: 방기 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 외용제 조성물의 제 조>

실시예 1. 방기 추출물의 제조

방기 추출물을 수득하기 위하여 먼저, 냉각콘덴서가 달린 온탕기에 방기(구입처: 건화약품) 600 g을 넣고 70 % 에탄올 2.4 ℓ를 가한 후, 약 80 ℃에서 2시간 동안 끓인 다음, 추출액이 식으면 와트만 2번 여과지를 사용하여 감압여과하여 고형상을 제거하고 추출액 만을 수득하였다. 상기에서 수득된 추출액은 냉각콘덴서가 달린 증발기에 넣고 감압증류하여 용매를 제거하며, 이 때, 용액이 600 ㎖ 정도 남으면 여기에 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1200 ㎖를 가하여 완전히 섞은 후 상온에서 5시간 방치하여 층이 완전히 분리되면 윗층을 분별깔대기로 분리하였으며, 분리된 용액은 다시 감압증류기에 넣고 감압증류하여 본 발명의 방기 추출물 약 15 g을 수득하였다.

실시예 2. 방기 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물의 제조

상기 실시예 1에서 수득된 방기 추출물로 하기 표 1의 조성을 갖는 피부 미백용 조성물을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

먼저, 하기 표 1 의 원료 1 ~ 6 을 혼합하여 70 ℃ 에서 용해하고 수상으로 한 다음, 원료 7 ~ 14 를 70 ℃에서 용해하여 오일상으로 하였다. 그 다음, 상기 오일상을 수상에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika사)로 교반하여 1차 유화하고, 원료 15를 첨가하여 점증시켰다. 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 방기 추출물을 함유하는 피부 미백용 조성물을 제조하였다.

비교예 1. 피부 미백용 조성물의 제조

비교예 1의 피부 미백용 조성물을 제조하기 위하여, 먼저 하기 표 1 의 원료 1 ~ 6 을 혼합하여 70 ℃ 에서 용해하고 수상으로 한 다음, 원료 8 ~ 14 를 70 ℃에서 용해하여 오일상으로 하였다. 그 다음, 상기 오일상을 수상에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika 사)로 교반하여 1차 유화하고, 원료 15를 첨가하여 점증시켰다. 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각시켜 비교예 1의 피부 미백용 조성물을 제조하였다.

성분	실시예 1	비교예 1
1. 정제수	100 까지	100 까지
2. 글리세린	8.0	8.0
3. 부틸렌글리콜	4.0	4.0
4. 히아루론산 추출물	5.0	5.0
5. 베타글루칸	7.0	7.0
6. 카모머	0.1	0.1
7. 방기 추출물	0.3	-
8. 카프릴릭 카프릭 트리글리세라드	8.0	8.0
9. 스쿠알란	5.0	5.0
10. 세테아릴 글루코사이드	1.5	1.5
11. 소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4
12. 세테아릴 알코올	1.0	1.0
13. 방부제	적량	적량
14. 향	적량	적량
15. 트리에탄올아민	0.1	0.1

본 발명에 의한 피부 미백용 조성물의 효과를 입증하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험예 1. 방기추출물의 멜라노사이트에서 멜라닌 생성 저해 효과

방기추출물의 멜라노사이트에서 멜라닌 생성 저해 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 멜라노사이트의 일종인 멜란-a(melan-a)(입수처: gift from Bennett D.C St. George's Hospital Medical School London, UK)를 FBS 10 % 함유한 RPMI-1640 배지에 넣어 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 세포수가 6 ×10⁴ 이 되게 6-웰 플레이트(well plate)에 깔고, 다음날부터 방기 추출물이 각각 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm이 들어 있는 새배지로 갈아주었다. 대조군으로는 방기 추출물을 녹이기 위해 사용한 같은 양의 DMSO가 들어 있는 배지를 사용하였다. 또한, 미백 효과가 잘 알려진 알부틴(50 ppm)도 별도로 처리하였다. 이 후, 처음 시료(방기, 알부틴, DMSO)를 처리한 날부터 2일 후와 4일 후 같은 방법으로 각각의 시료를 두 번 더 처리하여 배양하고, 다음날 생성된 멜라노사이트를 추출 용매로 추출한 후 원심분리하여 단백질을 정량하고 생성된 멜라닌의 양을 측정하였다. 이 때, 대조군의 단백질량, 멜라닌 양을 각각 100 %로 했을 때 방기 추출물 및 알부틴 처리군의 멜라닌 양을 대조군 대비 % 로 계산하여 도 1에 나타내었다.

그 결과, 도 1에서 알 수 있는 것처럼, 방기 추출물은 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm 처리하였을 때 각각 멜라닌 생성을 억제하였다. 또한, 알부틴 50 ppm은 멜라노사이트의 멜라닌 생성을 62 % 줄이는데 비하여, 방기 추출물은 1 ppm으로도 멜라노 사이트의 멜라닌 생성을 76 % 감소시켰다.

실험예 2. 방기 추출물의 멜라노사이트-케라티노사이트 공동배양에서 멜라닌 생성 저해 효과

방기 추출물의 멜라노사이트-케라티노사이트 공동배양에서 멜라닌 생성 저해 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이는 멜라닌의 형성에 있어서 멜라노사이트와 케라티노사이트의 상호작용은 상당히 중요한데, 이들을 공동배양시 멜라닌 형성을 저해한다면, 생체내에서도 미백효능을 보일 가능성이 아주 크기 때문이다.

먼저, 멜라노사이트의 일종인 멜란-a(melan-a)를 1.2 ×10⁴ 이 되게 6-웰 플레이트에 깔고 FBS 10 % 함유한 RPMI-1640 배지에 넣어 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이틀 후, 배지를 제거한 후 그 위에 케라티노사이트를 2.4 ×10⁵ 이 되게 깐 다음, FBS 10 %가 함유된 S-MEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 배양하였다. 그 다음날부터 상기 실험예 1에서 제시한 방법대로 시료를 처리한 후, 동일한 방법으로 멜라닌과 단백질양을 측정하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

그 결과, 도 2에서 알 수 있는 것처럼, 방기 추출물은 1 ppm, 10 ppm, 50 ppm 처리하였을 때, 각각 멜라닌 생성을 농도 의존적으로 저해하였으며, 특히 같은 농도에서 그 효과가 알부틴보다 더 좋게 나오는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 멜라닌의 양이 알부틴 50 ppm 처리결과 57 % 감소되었고, 방기 추출물은 멜라닌 양을 농도 의존적으로 감소시켜 50 ppm에서 최고 76 %까지 감소시켰다.

이와 같은 결과로, 방기 추출물이 알부틴보다도 더 좋은 미백 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 3. 방기추출물의 멜라노사이트-케라티노사이트 공동배양에서 타이로시나제 저해 효과

방기추출물의 멜라노사이트-케라티노사이트 공동배양에서 타이로시나제 저해 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 멜라노사이트의 일종인 멜란-a(melan-a)를 1.2 ×10⁴ 이 되게 6-웰 플레이트에 깔고 FBS 10 % 함유한 RPMI-1640 배지에 넣어 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이틀 후 배지를 제거한 후 그 위에 각질 형성세포를 2.4 ×10⁵ 이 되게 깐 다음, FBS 10 % 함유한 S-MEM 배지를 사용하여 37 ℃, 5 % CO₂ 조건하에서 배양하였다. 그 다음날부터 상기 실험예 1에서 제시한 방법대로 시료를 처리하였고, 시료 처리가 끝나면 다음날 6-웰 플레이트의 배지를 제거한 후 PBS로 2번 세척한 후 멜라노사이트와 케라티노사이트를 단백질 분해효소 저해제가 함유된 추출 용매로 파쇄한 후 원심분리하여 상등액의 단백질을 정량하고 타이로시나제의 활성을 측정하였다. 이 때, 대조군의 단백질량, 타이로시나제의 활성을 100 %로 했을 때 방기 추출물 처리군의 타이로시나제의 활성을 대조군 대비 %로 계산하여 도 3에 나타내 었다.

그 결과, 도 3에서 알 수 있는 것처럼, 방기 추출물이 멜라노사이트와 케라티노사이트 공동배양시 전체 단백질 중 타이로시나제의 활성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 알부틴 50 ppm을 처리한 군은 타이로시나제의 전체 활성이 25 % 감소한 반면에, 같은 농도의 방기 추출물을 처리했을 때는 타이로시나제의 활성이 약 49 % 감소하였다.

실험예 4. 갈색 기니아 피그(brown guinea pig)를 이용한 미백 동물실험

본 발명의 방기 추출물의 미백효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 미백 동물실험을 수행하였다.

먼저, 본 발명의 방기 추출물을 비이클(vehicle, 에탄올: 프로필렌 글리콜(propylene glycol):물 = 3: 5: 2)에 0.3 %의 농도로 용해시켜 시료를 제조하였으며, 대조군으로 비이클을 사용하였으며, 하이드로퀴논(HQ) 2 %도 별도로 처리하였다.

또한, 몸무게 600 g 내외의 갈색 기니아 피그를 실험동물로 하여, 등 부위 털을 제거하고 펜토바비탈(pentobarbital, 30 ㎎/㎏)로 마취시킨 후 500 mJ의 자외선으로 태웠다. 태운 부위는 지름 1 ㎝ 정도의 동그라미(인공색소반)가 되게 하였으며, 동일한 방법으로 같은 부위에 일주일 간격으로 3 번의 자외선 조사를 시행하였다. 마지막 자외선 조사가 끝나고, 그 다음날부터 4 주간, 매주 5일 동안 아침, 저녁으로 두 번씩 상기 각 시료 즉, 비이클, 방기추출물, 하이드로퀴논을 각각 5 ㎕씩 처리하였다. 그 후, 상기 무처리군, 비이클만을 처리한 인공색소반(대조군), 방기 추출물을 처리한 인공색소반, 및 하이드로퀴논을 처리한 인공색소반의 색깔을 색차계(크로마미터; chromameter)로 명암판정 하였으며, 인공색소반의 명암을 색차계로 수치화한 값(L값)의 변화(L값)를 평균내어, 도 4에 나타내었다.

한편, L값은 실험 물질을 도포하여 효과가 있는 경우 점차 증가하게 되며, 실험 물질들 사이의 비교는 ΔL 값, 즉 최종 L 값에서 초기 L 값을 뺀(ΔL) 수치(최종 L값 - 실험 물질 도포전의 L값)로 표현하였는데, ΔL값이 클수록 미백효과가 큰 것이다.

도 4a에 나타낸 것처럼, 색차계를 이용한 실험결과에서 방기 추출물은 4주 동안의 실험 기간 내내 대조군에 비해 큰 L값을 나타내어 평균적으로 방기 추출물이 비이클(대조군)보다 효과가 좋음을 알 수 있었고, 하이드로퀴논 2 %와 비교했을 때 비슷한 정도의 미백 효과를 보이는 것을 알 수 있었다.

또한, 상기 4주 동안의 시료 처리 후 인공색소반 사진을 각각 도 4b에 나타내었으며, 방기 추출물이 하이드로퀴논 2 %와 비슷한 정도의 미백 효과를 보이는 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

실험예 5. 실시예 1 및 비교예 1에 따라 제조된 미백 조성물의 효과

상기 실시예 1 및 비교예 1에서 각각 제조된 미백 조성물의 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 윗팔뚝 부위에 직경 1.5 cm 의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5∼2 배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하고, 상기 실시예 1 및 비교예 1에서 제조된 각각의 미백 조성물(실험 물질들)을 도포한 다음, 두 달 후에 크로마미터(Chromameter, Minolta CR-300)를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 또한, 각 실험 물질들인 상기 비교예 1 및 실시예 1에 따라 제조된 미백용 피부 외용제를 하루에 2회씩(아침, 저녁) 매일 바르게 하였으며, 효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 "L"값을 구하여 결정하였다. 일반적으로, 태우지 않은 한국인 피부색은 50～70의 값을 나타낸다.

한편, 실험 물질을 도포하여 효과가 있는 경우는 L값이 점차 증가하게 되며, 실험 물질들 사이의 비교는 ΔL 값, 즉 최종 L 값에서 초기 L 값을 뺀(ΔL) 수치(최종 L값 - 실험 물질 도포전의 값)로 표현하였다. ΔL값이 클수록 미백효과가 큰 것이며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

	비교예1	실시예1
ΔL	2.18	1.32

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 방기 추출물을 함유한 조성물의 ΔL값은 2.18로, 비교예의 ΔL값 1.32와 비교하여 볼 때 높은 수치이므로, 미백효과도 더 큼을 알 수 있었다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 의한 피부 미백용 조성물은 방기(Sinomenium acutum)를 60 내지 90℃의 온도에서 추출하여 얻어진 방기 추출물을 유효 성분으로 함유하고 있어 멜라노사이트(melanocyte)에서 멜라닌 생성을 억제하고, 멜라노사이트와 케라티노사이트(keratinocyte)를 공동 배양하였을 때 생성되는 멜라닌의 양을 뛰어나게 감소시키며, 동물실험 및 임상실험에서도 우수한 미백 효과를 나타내므로, 본 발명에 의한 피부 미백용 조성물을 이용하면 부작용 없이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 피부의 톤을 밝게 할 수 있다.

Claims (4)

1. 방기(Sinomenium acutum)를 60 내지 90℃의 온도에서 추출하여 얻어진 방기 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백용 화장료 조성물임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물임을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 방기 추출물은 건조중량 기준으로 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20중량 %로 함유됨을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.

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