WO2023003176A1 - 토마토 유래 식물면역조절인자 srfr1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2023003176A1
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srfr1
tomato
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protein
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김상희
손건희
브엉티우옌
문지윤
김재연
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경상국립대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a tomato-derived plant immunomodulatory factor SRFR1 ( SUPPRESSOR OF rps4-RLD1 ) gene and uses thereof.
  • PTI pattern-triggered immunity
  • ETI effector-triggered immunity
  • PRR Plant receptor (pattern recognition receptor, PRR) protein recognizes the structure and prevents the spread of pathogens in plants through the activation of mitogen-activated protein (MAP) kinase chain reaction, the expression of transcriptional regulators, and the expression of immune-related genes.
  • MAP mitogen-activated protein
  • NLR proteins are divided into the coiled-coil (CC)-NB-LRR (CNL) family and the Toll-interleukin 1-like receptor (TIR)-NB-LRR (TNL) family according to the N-terminal domain.
  • the Arabidopsis SRFR1 ( SUPPRESSOR OF rps4-RLD 1 ) gene was discovered through suppressor screening using wild-type RLD Arabidopsis thaliana, which has a missense mutation in the RPS4 ( Ribosomal protein S4 ) gene.
  • the mutation of SRFR1 in Arabidopsis thaliana Pseudomonas syringae pv .
  • tomato ( Pto ) DC3000 Pseudomonas syringae pv. tomato ( Pto ) DC3000
  • resistance was increased when the corresponding R genes, RPS4 and RPS6 , were mutated, respectively.
  • SRFR1 Since the recessive srfr1 mutant showed similar susceptibility to Pto DC3000 as wild-type RLD, SRFR1 was identified as a negative regulator in ETI. SRFR1 functions as an adapter protein that forms a complex with proteins such as the immune regulator EDS1 (Enhanced disease susceptibility 1) and the TNL-type resistance proteins RPS4, RPS6, and SNC1 (suppressor of npr1-1, constitutive 1). SRFR1 has a TPR (tetratricopeptide repeat) domain similar in nucleotide sequence to Saccharomyces cerevisiae Ssn6 protein, known as a transcriptional repressor regulator.
  • EDS1 Enhanced disease susceptibility 1
  • RPS4, RPS6, and SNC1 uppressor of npr1-1, constitutive .
  • SRFR1 has a TPR (tetratricopeptide repeat) domain similar in nucleotide sequence to Saccharomyces cerevisiae
  • SRFR1 protein interacts with immune chaperone SGT1b (Suppressor of G2 allele of SKP1 homolog B) and TCP family transcription factors. These results support the role of the SRFR1 protein as an adapter protein that negatively regulates the ETI-related transcriptional immune response.
  • the Arabidopsis srfr1 mutant showed a resistance phenotype compared to the wild-type RLD of Arabidopsis thaliana against the insect moth ( Spodoptera exigua ) and the nematode sugar beet cyst nematode ( Heterodera schachtii ).
  • the CRISPR/Cas system consists of an endonuclease Cas protein and a hybrid RNA called single guide RNA (sgRNA).
  • SpCas9 Streptococcus pyogenes Cas9
  • PAM protospacer adjacent motif
  • Cas9 protein RNA-DNA interactions occur, causing Cas9 protein to cause double-strand breaks (DSBs) and error-prone DSB repair while non-homologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR ) through which Indel (Insertion/Deletion) mutation occurs.
  • DSBs double-strand breaks
  • NHEJ non-homologous end joining
  • HDR homology-directed repair
  • Crop genome editing using the CRISPR/Cas system will be an opportunity to accelerate the improvement of crop characteristics against plant pathogens.
  • SRFR1 gene is well conserved as a single copy in many useful crops. Therefore, elucidating the function of SRFR1 in tomato is expected to provide important clues for studying the crop's immune system.
  • Korean Patent No. 101342265 discloses 'disease resistance-related gene CaMLO2 , plant disease resistance search and transformed plants using the same'
  • Korean Patent No. 101007314 discloses 'proteins that regulate plant disease resistance and their gene' is disclosed, but there is no description of the 'tomato-derived plant immunomodulatory factor SRFR1 gene and its use' of the present invention.
  • the present invention was derived from the above needs, and the present inventors prepared a tomato SRFR1 mutant ( slsrfr1 ) using sgRNA and CRISPR / Cas9 targeting two regions of tomato SRFR1 genomic DNA, and the mutant It was confirmed that the expression of a pathogen-related (PR) gene involved in salicylic acid signaling was increased, and it was confirmed that the mutant had increased resistance to Pto DC3000 compared to unmodified tomato plants. However, the necrotrophic fungus Fusarium oxysporum f. sp. It was confirmed that resistance to Lycopersici ( Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ) was reduced compared to unmodified tomato plants. Through this, by confirming that SRFR1 is involved in regulating resistance to parasitic trophic (biotrophic) pathogens and parasitic pathogens in tomato plants, the present invention was completed.
  • PR pathogen-related
  • the present invention provides a method for controlling the disease resistance of a plant, comprising the step of regulating the expression of a gene encoding a protein derived from tomato ( Solanum lycopersicum ) SRFR1 ( SUPPRESSOR OF rps4-RLD1 ) .
  • the present invention comprises the steps of transforming plant cells with a recombinant vector containing a gene encoding tomato-derived SRFR1 protein; and regenerating the transformed plant from the transformed plant cell.
  • the present invention provides a transgenic plant with controlled resistance to plant diseases prepared by the above production method and a transformed seed thereof.
  • the present invention provides a composition for regulating disease resistance of a plant containing, as an active ingredient, a gene encoding tomato-derived SRFR1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • SRFR1 which has been studied as a plant immunomodulatory factor in Arabidopsis so far, is also conserved in tomato, and the SRFR1 results of the model plant can be applied to tomato crops and provide grounds for extending to other crops present.
  • SRFR1 is known as a negative regulator in the ETI (effector-triggered immunity) plant immune system mediated by EDS1 by recognizing the effector protein of Pseudomonas, but through the present invention, SRFR1 in both Arabidopsis and tomato is a necrotrophic fungus It was found to be a positive regulator for pathogens. Therefore, by regulating the expression of genes in plants, it is possible to provide new plants with resistance to pathogens, and contribute to the development of the seed industry and the increase in export of food resources.
  • Figure 1a shows the genomic structure and gRNA target location (Target 1, 2) of tomato SRFR1
  • Figure 1b is the target sequence of gRNA
  • Figure 1c is a T-DNA schematic diagram of the pSlSRFR-GE construct
  • Figure 1d is As a result of CAPS analysis of SlSRFR1 sgRNA1- and sgRNA2 -induced G1 mutants, white arrows indicate homozygous mutants.
  • Figure 2 is the result of analyzing the target site in the tomato G0 plant. Vertical dotted lines indicate the cleavage site by SpCas9 for each sgRNA.
  • Figure 5 is a parasitic trophic (biotrophic) pathogen of the G1 generation slsrfr1 plants Pseudomonas syringae pv.
  • tomato DC3000 Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
  • (a) is a photograph showing the disease on the leaves 5 days after inoculation
  • (b) is the result of measuring the number of bacteria. *; P ⁇ 0.01 .
  • the present invention tomato ( Solanum lycopersicum ) Derived SRFR1 ( SUPPRESSOR OF rps4-RLD1 ) A method for regulating disease resistance of a plant, comprising the step of regulating the expression of a gene encoding a protein to provide.
  • the scope of the tomato-derived SRFR1 protein according to the present invention includes a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 and functional equivalents of the protein.
  • the term "functional equivalent” means at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a result of addition, substitution or deletion of amino acids. More preferably, it refers to a protein having a sequence homology of 95% or more and exhibiting substantially the same physiological activity as the protein represented by SEQ ID NO: 3.
  • “Substantially homogeneous physiological activity” means an activity that regulates the resistance of plants to plant diseases.
  • the method for controlling plant disease resistance inhibits the expression of the tomato-derived SRFR1 protein-encoding gene to increase resistance to plant diseases caused by biotrophic pathogens, or to necrotrophic pathogens It may be to reduce resistance to plant diseases by, but is not limited thereto.
  • the biotrophic pathogen is preferably Pseudomonas syringae pv. Tomato ( Pto ) DC3000 ( Pseudomonas syringae pv. tomato ( Pto ) DC3000), and the necrotrophic pathogen is preferably Fusarium oxysporum f. sp. It may be Lycopersici ( Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ), but is not limited thereto.
  • VIGS Virus-induced gene silencing
  • RNAi or antisense RNA T-DNA insertion
  • gene correction system or irradiation gene correction system or irradiation
  • Any conventional method in the art that can inhibit the may be possible.
  • VIGS refers to a phenomenon in which, when a plant gene is introduced into a viral vector and then infected, the expression of the endogenous gene of the introduced gene is suppressed. This is a type of PTGS (Post-transcriptional gene silencing), and has the characteristics of post-transcriptional, RNA turnover, and nucleotide sequence-specific.
  • the VIGS vector can be used as a transient expression vector for transient expression in a plant into which a foreign gene has been introduced and a plant expression vector for permanent expression in a plant into which a foreign gene has been introduced.
  • the gene encoding the tomato-derived SRFR1 protein includes both genomic DNA and cDNA.
  • the genomic DNA of tomato-derived SRFR1 of the present invention may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • the cDNA of tomato-derived SRFR1 may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • homologs of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 are included within the scope of the present invention.
  • the gene is a nucleotide sequence having 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more sequence homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • the "percentage of sequence homology" for polynucleotides is determined by comparing two optimally aligned sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide sequence in the comparison region is a reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. may include additions or deletions (i.e., gaps) compared to (not including).
  • the present invention also relates to the present invention.
  • Regenerating the transformed plant from the transformed plant cell provides a method for producing a transgenic plant with controlled resistance to plant diseases, including.
  • the term "recombinant” refers to a cell that replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a peptide, a protein encoded by a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene segments not found in the cell's native form, either in sense or antisense form.
  • a recombinant cell may also express a gene found in the cell in its natural state, but the gene has been reintroduced into the cell by artificial means as a modified one.
  • vector is used to refer to DNA fragment(s), nucleic acid molecules, which are delivered into cells. Vectors replicate DNA and can reproduce independently in host cells.
  • delivery vehicle is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and appropriate nucleic acid sequences necessary to express the operably linked coding sequence in a particular host organism.
  • the vectors of the present invention may typically be constructed as vectors for cloning or expression.
  • the vector of the present invention can be constructed using a prokaryotic cell or a eukaryotic cell as a host.
  • a strong promoter capable of promoting transcription eg, pL ⁇ promoter, Trp promoter, Lac promoter, T7 promoter, Tac promoter, etc.
  • It typically includes a ribosome binding site for initiation of translation and a transcription/translation termination sequence.
  • Escherichia coli is used as the host cell, the E. coli tryptophan biosynthesis pathway promoter and operator regions and the leftward promoter of phage ⁇ (pL ⁇ promoter) can be used as control regions.
  • the promoter may be promoters suitable for transformation, preferably CaMV 35S promoter, actin promoter, ubiquitin promoter, pEMU promoter, MAS promoter or histone promoter, preferably CaMV 35S promoter. However, it is not limited thereto.
  • promoter refers to a region of DNA upstream from a structural gene and refers to a DNA molecule to which RNA polymerase binds to initiate transcription.
  • a "plant promoter” is a promoter capable of initiating transcription in a plant cell.
  • a “constitutive promoter” is a promoter that is active under most environmental conditions and states of development or cell differentiation. Constitutive promoters may be preferred in the present invention because selection of transformants may be made by various tissues at various stages. Thus, constitutive promoters do not limit selection possibilities.
  • the recombinant vector of the present invention can be constructed by methods well known to those skilled in the art.
  • the method includes in vitro recombinant DNA technology, DNA synthesis technology, in vivo recombinant technology, and the like.
  • the DNA sequence can be effectively linked to a suitable promoter in an expression vector to direct mRNA synthesis.
  • the vector may include a ribosome binding site and a transcription terminator as a translation initiation site.
  • a preferred example of a plant expression vector is the Ti-plasmid vector, which when present in a suitable host, such as Agrobacterium tumefaciens , is capable of transferring a part of itself, the so-called T-region, into plant cells.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumefaciens
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is currently used to transfer hybrid DNA sequences into plant cells, or protoplasts, from which new plants can be produced that properly integrate the hybrid DNA into the plant's genome.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those that can be derived from double-stranded plant viruses (eg, CaMV) and single-stranded viruses, gemini viruses, and the like.
  • CaMV double-stranded plant viruses
  • it may be selected from incomplete plant viral vectors. The use of such vectors can be particularly advantageous when properly transforming a plant host is difficult.
  • a preferred example of the recombinant vector of the present invention may be a vector comprising a gRNA sequence targeting a gene encoding tomato-derived SRFR1 protein and a sequence encoding a Cas9 endonuclease.
  • Recombinant expression vectors may preferably contain one or more selectable markers.
  • the marker is a nucleic acid sequence having a characteristic that can be selected by a conventional chemical method, and includes all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells.
  • the marker gene may be a dominant drug resistance gene, but is not limited thereto.
  • Any host cell known in the art can be used as the host cell capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention.
  • E. coli JM109 E. coli BL21
  • Bacillus genus strains such as E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110
  • Bacillus subtilis Bacillus thuringiensis
  • enterobacteriaceae and strains such as Salmonella typhimurium , Serratia marcescens and various Pseudomonas sp.
  • yeast eg, Saccharomyce cerevisiae
  • insect cells eg, human cells
  • human cells eg, CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7 , 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • plant cells preferably plant cells.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA into a plant. Such transformation methods need not necessarily have a period of regeneration and/or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species including both dicotyledonous as well as monocotyledonous plants.
  • any transformation method can be used to introduce the hybrid DNA according to the present invention into suitable progenitor cells. Methods include the calcium/polyethylene glycol method for protoplasts (Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), electroporation of protoplasts, microinjection into plant elements (Crossway A. et al. Gen. Genet. In Paciens mediated gene transfer, it can be suitably selected from infections by (incomplete) viruses (EP 0 301 316) and the like. Preferred methods according to the present invention include Agrobacterium mediated DNA delivery.
  • any method known in the art may be used for regenerating the transgenic plant from the transformed plant cell.
  • Transformed plant cells must regenerate into whole plants.
  • Techniques for regeneration of mature plants from callus or protoplast cultures are well known in the art for a number of different species.
  • a “plant cell” used for plant transformation can be any plant cell.
  • a plant cell is a cultured cell, cultured tissue, cultured organ or whole plant.
  • Plant tissue refers to differentiated or undifferentiated plant tissues, such as but not limited to roots, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues, and various types of cells used in culture, i.e., single cells, protoplasts. (protoplast), shoot and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or may be in organ culture, tissue culture or cell culture.
  • Parasitic trophic pathogens and parasitic pathogens are as described above.
  • the present invention also provides transgenic plants and their transformed seeds having controlled resistance to plant diseases prepared by the above production method.
  • Transgenic plants with controlled resistance to plant diseases inhibit the expression of the SRFR1 protein-coding gene to increase resistance to plant diseases caused by parasitic trophic pathogens or to increase resistance to plant diseases caused by parasitic pathogens It is characterized by this reduction.
  • the plants are tomato, Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, red pepper, burdock, crown daisy, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, water parsley, parsley, Chinese cabbage, cabbage, mustard, watermelon, melon, cucumber, It may be a dicotyledonous plant such as pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, or pea, or a monocotyledonous plant such as rice, barley, wheat, rye, corn, sugar cane, oats, and onion, preferably a dicotyledonous plant. It may be, more preferably may be a tomato plant, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for regulating disease resistance of a plant containing, as an active ingredient, a gene encoding tomato-derived SRFR1 ( SUPPRESSOR OF rps4-RLD1 ) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the composition of the present invention contains, as an active ingredient, a tomato-derived SRFR1 protein coding gene capable of controlling the resistance of tomato plants to plant diseases, and inhibiting the expression of the gene can control the disease resistance of the plants.
  • the target site of the SpCas9-gRNA complex was investigated at the N-terminal region of SlSRFR1 using the CRIPSR -P v2.0 program (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/).
  • two gRNAs were selected considering the on-score, which is a numerical value that can cause genome editing, the secondary structure of gRNA, the GC nucleotide content of the target site, and the off-target sequence.
  • the two gRNAs were linked with the Arabidopsis U6 promoter (originated from Addgene #46968), scafford RNA and poly T through primer dimerization, and the entire gRNA was Level 1 plasmid through the Golden Gate cloning system.
  • Each gRNA module created was cloned into pAGM4723 using the Golden Gate cloning system along with a plant selectable marker (Addgene #51144), SpCas9 (Addgene #49771), and a linker (Addgene #48019) to prepare a construct.
  • the site was named pSlSRFR1-GE.
  • Tomato transformation and plant selection were performed with reference to previous studies (Plant Cell Rep. 2021 Jun; 40(6):999-1011).
  • Tomato cultivar M82 Solanum lycopersicum cv. M82
  • the pSlSRFR1-GE plasmid was transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101 (MP90) by electroporation.
  • Agrobacterium having pSlSRF1-GE cultured at 28 ° C for 18 hours was transferred to 30 ml of LB medium (including 50 mg L -1 kanamycin and 10 mg L -1 gentamicin), and the OD 600 value was about 0.8 to 1 cultured until The Agrobacterium was centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes and the pellet was washed in 30 ml of ABM-MS [1.106 g K 2 HPO 4 , 0.565 g KH 2 ] containing 200 ⁇ M acetosyringone (#D134406, Sigma, USA).
  • Tomatoes were transformed by incubating the suspension for one hour at 28° C. and co-incubating tomato cotyledon explants with Agrobacterium for 20 minutes. Tomato cotyledon explants were transferred to ABM-MS containing 200 ⁇ M acetosyringone and cultured for 2 days at 25° C. in the dark.
  • Agrobacterium attached to the explants was washed by stirring in 500 mg ⁇ L -1 titentin solution for 2 minutes. The water remaining on the explants was completely removed using Whatman paper, and the selective medium [SEL4-70; 4.4g MS salts + B5, 30g maltose, 0.05mg IAA, 0.976g MES, 0.5mg zeatin ribose trans-isomer, 70mg kanamycin, 300mg timentin, 1mM putrescine (pH 5.7), 8g agar for 1L] to induce callus Callus was transferred to a new selection medium (SEL4-70) every 2 weeks until complete stems appeared.
  • the explants from which the stems emerged are rooted induction medium [RIM; 2.2g MS salts + B5, 20g sucrose, 0.1mg NAA, 0.3mg IBA, 300mg Timentin (pH 5.7), 8g agar for 1L] and cultured until roots were induced. Healthy plants are grown at 25°C, 16 hours light/8 hours dark conditions.
  • Genomic DNA isolation was performed with reference to Pater et al. (Plant Biotechnol J. 2009 Oct;7(8):821-835). Using a cork borer No. 5, two leaf pieces from G0 and G1 generation tomato plants were put into a tube, frozen in liquid nitrogen, and ground using beads in a mixer mill (#MM301, Retsch, Germany) for 1 minute. . 300 ⁇ l of 2X CTAB extraction buffer (0.1M Tris, 2% CTAB, 1.4M NaCl, and 20mM EDTA) was added to the powder and reacted at 65° C. for 20 minutes. 300 ⁇ l of chloroform was additionally added to the tube, mixed vigorously, and centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes.
  • 2X CTAB extraction buffer 0.1M Tris, 2% CTAB, 1.4M NaCl, and 20mM EDTA
  • the SlSRFR1 target region was amplified by PCR in G0 or G1 generation tomatoes and sequencing was performed.
  • the above results were confirmed by ICE (Inference of CRISPR Edits, https://ice.synthego.com/#/) analysis to see how many Indel mutations occurred in G0 or G1 generation tomatoes.
  • ICE Inference of CRISPR Edits, https://ice.synthego.com/#/
  • Miseq sequencing was performed and analyzed with the Cas-Analyzer program (http://www.rgenome.net/).
  • a 945 bp PCR fragment was amplified using the SlSRFR1-F1/SlSRFR1-R2 primer set, and primers (MiSeq-1-F2/MiSeq-1-R2 and MiSeq-1-R2 and MiSeq-2-F2/MiSeq-2-R2) were used to amplify DNA fragments of 155bp and 150bp in size through secondary PCR.
  • the tertiary PCR fragment was amplified using dual index adapter (a combination of D501-D508 and D701-D712) primers provided by the MiSeq sequencing service (MiniSeqTM System, Illumina, USA), and the degree of indel mutation was analyzed by Miseq sequencing.
  • Pseudomonas cold dog pv. Pathogenesis analysis by tomato DC3000 was performed according to a previous study (Scalschi, L. et al ., PLoS One 2014, 9:e106429).
  • Pto DC3000 containing the pVSP61 empty vector grown in Pseudomonas medium was diluted to 2x10 8 CFU/ml, and the third or fourth leaf of a 6-week-old tomato plant was treated with the diluted solution for 30 seconds and maintained at high humidity. To do this, it was wrapped in a plastic bag and maintained for 5 days.
  • Fusarium oxysporum f. sp. Pathogenesis analysis by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (hereinafter referred to as FOL) follows previous studies (Kostov, K. et al ., Biotechnol. Biotechnol. Equip. 2009, 23(1):1121-1125). performed according to After culturing FOL in potato dextrose (#254920, BD Difco, USA) in the dark at 30 ° C, it was grown for 5 days at 25 ° C for 16 hours light / 8 hours in the dark and used for the experiment. Using Corkborder No. 1, a fungus grown in the medium was made into a plug and placed on 6-week-old tomato leaves, and left at 25 ° C. for 3-8 days under 16-hour light / 8-hour dark conditions.
  • FOL Fusarium oxysporum f. sp. Pathogenesis analysis by Fusarium oxysporum f.
  • the dyed leaves were soaked in 99% ethanol for one day to remove the pigment.
  • the degree of development of fungal hyphae was visualized using a fluorescence microscope.
  • Protein immunoblot analysis was performed using ⁇ -PR1 antibody (1:10,000 dilution, #AS10 687, Agrisera, SWEDEN) or ⁇ -Actin antibody (1:10,000 dilution, #AS13 2640, Agrisera), and Clarity Western ECL Substrate (#1705061, Bio-Rad, USA) and SuperSignalTM West Femto Maximum Sensitivity Substrate (#34094, Thermo Scientific, USA).
  • SRFR1 is a single-copy gene in Arabidopsis thaliana, and Arabidopsis SRFR1 is mainly composed of 11 TPR (tetratricopeptide repeat) domains involved in protein-protein interactions.
  • the Blast algorithm was used to annotate the tomato proteome, and Solyc02g09280 (SlSRFR1) with 65% similarity to Arabidopsis SRFR1 was identified.
  • SlSRFR1 encodes a protein consisting of 1,055 amino acids, with two TPR domains located at the N-terminus and nine TPR domains located at the center.
  • sgRNA was designed based on standard conditions, and the 5' end of the open reading frame (ORF) of SlSRFR1 was selected as a site for correction (Table 2).
  • gRNA target site for SlSRFR1 correction Name gRNAs Target position on genome Number of off-targets ( ⁇ 4MMs) sgRNA1 GTAACTTTCGACGCCATCG (SEQ ID NO: 4) 5'UTR and CDS One sgRNA2 ATTGACTATAGCAAAACGCT (SEQ ID NO: 5) CDS 3
  • a 1 bp or 11 bp deletion of the TPR domain resulted in a premature stop codon.
  • mutations in slsrfr1-2 and slsrfr1-4 were identified in the initiation codon.
  • Sanger sequencing analysis of the purified PCR amplicons revealed that off-target sites were not identified in all subjects.

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Abstract

본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 병 저항성을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

토마토 유래 식물면역조절인자 SRFR1 유전자 및 이의 용도
본 발명은 토마토 유래 식물면역조절인자 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 결과물은 농촌진흥청의 "바이오그린연계농생명혁신기술개발(PJ01575601)" 사업 및 "차세대농작물신육종기술개발(PJ01653202)" 사업의 지원을 받아 연구되었습니다.
식물은 끊임없이 외부의 다양한 병원균으로부터 공격을 받고, 그로부터 스스로를 보호하기 위해서 선천적 면역시스템을 발달시켜왔다. 선천적 면역시스템은 pattern-triggered immunity (PTI)와 effector-triggered immunity (ETI)로 나뉘어진다. PTI는 키틴이나 플라젤린, EF-Tu (elongation factor thermo unstable)와 같이 미생물이나 식물 병원균의 구조적 물질의 일부를 식물이 인지하여 방어시스템을 활성화시켜서 일어나는 면역반응이다. 식물의 리셉터(pattern recognition receptor, PRR) 단백질이 구조물을 인지하고 MAP (mitogen-activated protein) 키나아제 연쇄반응활성이나 전사조절인자 발현조절, 면역관련 유전자 발현조절을 통해서 식물에서 병원균이 퍼져나가는 것을 막는다. 하지만 병원균은 이펙터(effector) 단백질을 식물에 주입시켜 식물의 면역시스템을 저해한다. 이를 극복하기 위해서 식물은 이펙터 단백질을 모니터할 수 있는 저항성 단백질을 발달시키고 이 단백질들이 병원균의 이펙터 단백질을 인지하면 ETI라는 방어시스템이 활성화 된다. 많은 저항성 단백질들은 NLR이라 불리는 nucleotide-binding (NB)과 leucine-rich repeat (LRR) 도메인을 가지고 있다. NLR 단백질은 N-말단의 도메인에 따라 coiled-coil (CC)-NB-LRR (CNL) 패밀리와 Toll-interleukin 1-like receptor (TIR)-NB-LRR (TNL)로 나뉘어 진다.
애기장대 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD 1) 유전자는 RPS4 (Ribosomal protein S4) 유전자에 과오 돌연변이(missense mutation)를 가지고 있는 야생형 RLD 애기장대를 이용한 억제제 스크리닝(suppressor screening)을 통해서 발견되었다. 애기장대에서 SRFR1의 돌연변이는 이펙터인 avrRPS4 또는 hopA1을 발현하는 슈도모나스 시린개 pv. 토마토 (Pto) DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato (Pto) DC3000)에 대해, 각각 상응되는 R 유전자인 RPS4 및 RPS6가 돌연변이되었을 때 저항성을 증가시켰다. 열성 형질의 srfr1 돌연변이체는 야생형 RLD처럼 Pto DC3000에 유사한 감수성을 보이므로 SRFR1은 ETI에서 음성조절자로 확인되었다. SRFR1은 면역조절자인 EDS1 (Enhanced disease susceptibility 1)과 TNL 종류의 저항성 단백질인 RPS4, RPS6, SNC1 (suppressor of npr1-1, constitutive 1)과 같은 단백질과 복합체를 형성하는 어댑터 단백질로써 기능을 한다. SRFR1은 전사억제조절자로 알려져 있는 사카로미세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) Ssn6 단백질과 염기서열이 유사한 TPR (tetratricopeptide repeat) 도메인을 가지고 있다. 그리고 애기장대 srfr1 돌연변이체에서 면역관련유전자의 발현이 증가되는 것이 확인되었다. 게다가, SRFR1 단백질은 면역 샤페론인 SGT1b (Suppressor of G2 allele of SKP1 homolog B)와 TCP 패밀리 전자사조절인자들과 상호작용한다. 이러한 결과들은 SRFR1 단백질이 ETI 관련 전사면역반응을 음성으로 조절하는 어댑터 단백질로써의 역할을 뒷받침한다.
애기장대 srfr1 돌연변이체는 곤충인 파밤나방(Spodoptera exigua)과 선충류인 사탕무시스트선충(Heterodera schachtii)에 대해 애기장대 야생형 RLD에 비해서 저항성 표현형을 보였다. 이 결과는 Pto DC3000에 대한 ETI 반응에 더하여 SRFR1이 다양한 생물학적 스트레스에 대한 식물의 선천적 면역의 세트포인트를 결정하는 광범위한 역할을 수행할 가능성을 보여준다. 그러므로, 작물에서 SRFR1 단백질의 기능을 연구하는 것은 식물 병원균으로부터 작물을 보호하는데에 중요한 단서를 제공할 것으로 예상된다.
최근 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 유전체교정연구가 식물에서도 적용되고 있다. CRISPR/Cas 시스템은 엔도뉴클레아제(endonuclease) Cas 단백질과 single guide RNA (sgRNA)라 불리는 하이브리드 RNA로 이루어져있다. 많이 사용되고 있는 Cas 단백질인 SpCas9 (Streptococcus pyogenes Cas9)은 sgRNA와 복합체를 형성하고, 타겟 시퀀스 부위에 있는 PAM (protospacer adjacent motif) 서열인 NGG를 인지한다. 그리고 Cas 단백질-RNA-DNA 상호작용이 일어나 Cas9 단백질이 이중가닥 절단(double-strand breaks, DSBs)을 일으키고 error-prone DSB repair가 일어나는 동안에 non-homologous end joining (NHEJ) 또는 homology-directed repair (HDR)를 통해서 Indel (Insertion/Deletion) 돌연변이가 일어난다. CRISPR/Cas 시스템을 이용한 작물유전체교정은 식물병원균에 대한 작물특성향상을 가속시킬 수 있는 계기가 될 수 있을 것이다.
SRFR1 유전자는 많은 유용작물에 단일 카피로 잘 보존되어 있다. 그러므로 토마토에서 SRFR1의 기능을 밝히는 것은 작물의 면역시스템을 연구하는데 있어서 중요한 단서를 제공할 것으로 예상된다.
한편, 한국등록특허 제101342265호에는 '병저항성 관련 유전자 CaMLO2, 이를 이용한 식물병 저항성 탐색 및 형질전환 식물체'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제 101007314호에는 '식물의 병저항성을 조절하는 단백질 및 그 유전자'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '토마토 유래 식물면역조절인자 SRFR1 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 SRFR1 게노믹 DNA의 두 영역을 표적으로 하는 sgRNA와 CRISPR/Cas9을 이용하여 토마토 SRFR1 돌연변이체(slsrfr1)를 제조하였고, 상기 돌연변이체에서 살리실산 신호전달에 관여하는 병원체 관련(pathogen-related, PR) 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며, 상기 돌연변이체가 비교정 토마토 식물체에 비해 Pto DC3000에 대한 저항성이 증진되었음을 확인하였다. 하지만 사물기생성(necrotrophic) 곰팡이인 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라이코페르시씨(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)에 대한 저항성은 비교정 토마토 식물체에 비해 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이를 통해, SRFR1이 토마토 식물체에서 기생영양(biotrophic) 병원균과 사물기생성 병원균에 대한 저항성을 조절하는 데 관여함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 토마토 유래 SRFR1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 SRFR1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 현재까지 애기장대에서 식물면역조절인자로 연구되었던 SRFR1의 기능이 토마토에서도 보존되어 있음을 확인하였고, 모델식물의 SRFR1 결과가 토마토 작물에 적용될 수 있고, 다른 작물로 확장시킬 수 있는 근거를 제시한다. SRFR1은 슈도모나스균의 이펙터 단백질을 인지하여 EDS1을 매개로 하는 ETI (effector-triggered immunity) 식물면역시스템에서 음성 조절자로 알려져 있지만, 본 발명을 통해서 애기장대와 토마토 모두에서 SRFR1이 사물기생(necrotrophic) 곰팡이 병원균에 대해선 양성 조절자임을 알아내었다. 그러므로 식물체에서 유전자의 발현을 조절함으로써 병원균에 저항성을 갖는 새로운 식물체를 제공할 수 있으며, 종자 산업의 발전과 식량자원의 수출 증대에 기여할 수 있을 것이다.
도 1a는 토마토 SRFR1의 게놈 구조 및 gRNA 표적 위치(Target 1, 2)를 보여주고, 도 1b는 gRNA의 표적 서열이고, 도 1c는 pSlSRFR-GE 컨스트럭트의 T-DNA 모식도이며, 도 1d는 SlSRFR1 sgRNA1- 및 sgRNA2-유도 G1 돌연변이체의 CAPS 분석 결과로, 하얀색 화살표는 동형접합 돌연변이체를 나타낸다.
도 2는 토마토 G0 식물체에서 표적 부위를 분석한 결과이다. 수직 점선은 각 sgRNA에 대해 SpCas9에 의한 절단 부위를 나타낸다.
도 3은 토마토 G1 식물체의 유전체 교정 양상을 분석한 결과이다.
도 4는 토마토 SRFR1 돌연변이체(slsrfr1)의 생장모습이며(a), 상기 돌연변이체에서 식물방어기작에 관여하는 유전자의 발현 정도를 qRT-PCR을 통해서 확인한 결과(b)이다. *; P<0.01.
도 5는 G1 세대 slsrfr1 식물체의 기생영양(biotrophic) 병원균인 슈도모나스 시린개 pv. 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000)에 대한 반응을 보여주는 것으로, (a)는 접종 5일 후의 잎에서 나타난 병증을 보여주는 사진이고, (b)는 균수를 측정한 결과이다. *; P<0.01.
도 6은 G1 세대 slsrfr1 식물체의 사물기생 병원균인 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라이코페르시씨(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)에 대한 반응을 보여주는 것으로, (a)는 접종 3일 후의 잎 사진이고, (b)는 트립판 블루 염색 이미지이며, (c)는 병변 부위의 직경을 측정한 결과이다. *; P<0.01.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 토마토 유래 SRFR1 단백질의 범위는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물병에 대한 식물체의 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.
본 발명에 따른 식물체의 병 저항성 조절 방법은, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하여 기생영양(biotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 증가시키거나, 사물기생성(necrotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 병 저항성 조절 방법에 있어서, 상기 기생영양(biotrophic) 병원균은 바람직하게는 슈도모나스 시린개 pv. 토마토 (Pto) DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato (Pto) DC3000)일 수 있으며, 상기 사물기생성(necrotrophic) 병원균은 바람직하게는 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라이코페르시씨(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자의 발현 저해는 VIGS (Virus-induced gene silencing), RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 유전자 교정 시스템 또는 방사선 조사를 통한 돌연변이 유발에 의해 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해할 수 있는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물 유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
또한, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질을 코딩하는 유전자는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 토마토 유래 SRFR1의 게놈 DNA는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, 토마토 유래 SRFR1의 cDNA는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
토마토 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 토마토 유래 SRFR1 단백질을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA 서열과, Cas9 엔도뉴클레아제를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터일 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종(Pseudomonas sp.)과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법, 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법, 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질 코딩 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜면 야생형에 비해 기생영양(biotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성이 증가되거나, 사물기생성(necrotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성이 감소될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
기생영양 병원균 및 사물기생성 병원균은 전술한 것과 같다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체는 SRFR1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시켜 기생영양 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성이 증가되거나, 사물기생성 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성이 감소된 것을 특징으로 한다.
상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 토마토 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 토마토 식물체의 식물병에 대한 저항성을 조절할 수 있는 토마토 유래 SRFR1 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 병 저항성을 조절할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 토마토 형질 전환을 위한 벡터 구축
CRIPSR-P v2.0 프로그램 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)을 이용하여 SlSRFR1의 N-말단 부위에서 SpCas9-gRNA 복합체의 타켓부위를 조사하였다. 그리고 유전체 교정을 일으킬 수 있는 수치인 on-score, gRNA의 2차 구조, 타켓 부위의 GC 뉴클레오티드 함량 및 off-target 서열을 고려하여 두 개의 gRNA를 선정하였다. 두 개의 gRNA는 애기장대 U6 프로모터 (originated from Addgene #46968), scafford RNA와 poly T를 프라이머 이합체화반응(dimerization) 방법을 통해 서로 연결하였고, 상기 gRNA 전체는 Golden Gate 클로닝 시스템을 통해서 레벨1 플라스미드인 pICH47751 및 pICH47761에 각각 클로닝 하였다. 만들어진 각 gRNA 모듈은 식물 선별마커 (Addgene #51144), SpCas9 (Addgene #49771), 링커 (Addgene #48019)와 함께 Golden Gate 클로닝 시스템을 통해서 pAGM4723 내부로 클로닝하여 컨스트럭트를 제조하였으며, 상기 컨스트럭트를 pSlSRFR1-GE로 명명하였다.
2. 아그로박테리움을 이용한 토마토 형질전환 및 CRISPR/Cas9으로 유전체 교정이 일어난 식물체 선별
토마토 형질전환 및 식물체 선별은 이전 연구를 참고하여 수행하였다 (Plant Cell Rep. 2021 Jun;40(6):999-1011). 토마토 품종 M82 (Solanum lycopersicum cv. M82)를 25℃, 16시간 명/8시간 암조건에서 1/2 MSO 배지(2.2g MS salts + B5, 20g sucrose, 0.5g MES (pH=5.7), 7.5g agar for 1L)에 7일동안 키운 후 칼을 이용하여 자엽(cotyledon) 외식편들을 만들어 PREMC 배지(2.2g MS salts + B5, 30g maltose, 0.1g Ascorbic acid, 1.952g MES, 0.2mg IAA (pH=5.5), 7.5g agar for 1L; 상기 혼합물을 멸균한 후, 1.0mg Zeatin trans-isomer, 1㎖ Putrescine(1mM), acetosyringone(AS) 100μM 첨가) 위에 올려 25℃ 암조건에서 하루동안 보관한다. pSlSRFR1-GE 플라스미드는 전기천공법을 통해 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101 (MP90)으로 형질전환시켰다. 28℃에서 18시간동안 배양한 pSlSRF1-GE를 보유한 아그로박테리움 3㎖을 30㎖의 LB 배지(50mg·L-1 kanamycin 및 10mg·L-1 gentamicin 포함)로 옮겨 OD600 값이 0.8~1 정도될 때까지 배양하였다. 아그로박테리움을 3,000rpm으로 15분동안 원심분리하고 펠렛은 200μM 아세토시린곤(acetosyringone, #D134406, Sigma, USA)을 함유한 30㎖의 ABM-MS [1.106g K2HPO4, 0.565g KH2PO4, 0.748g NH4NO3, 0.0745g KCl, 0.154g MgSO4, 0.0075g CaCl2, 0.0015g FeSO4, 20g glucose, 1.952g MES, 1.1g MS salts + B5, 2.5g sucrose (pH 5.5) for 1L]에 현탁시켰다. 현탁액을 한시간동안 28℃에서 배양하고 토마토 자엽(cotyledon) 외식편을 아그로박테리움과 20분동안 공동배양하여 토마토를 형질전환시켰다. 토마토 자엽 외식편을 200 μM 아세토시린곤을 함유하고 있는 ABM-MS에 옮겨 25℃ 암조건에서 2일동안 배양하였다. 외식편에 붙은 아그로박테리움은 500mg·L-1 티멘틴(timentin) 용액에 2분간 저어서 세척하였다. 외식편에 남아있는 물은 와트만(Whatman) 페이퍼를 이용하여 완전히 없애주고, 선별배지[SEL4-70; 4.4g MS salts + B5, 30g maltose, 0.05mg IAA, 0.976g MES, 0.5mg zeatin ribose trans-isomer, 70mg kanamycin, 300mg timentin, 1mM putrescine (pH 5.7), 8g agar for 1L]에 올려놓고 캘러스를 유도하며 완전한 줄기가 나오기까지 2주마다 캘러스를 새 선별배지(SEL4-70)에 옮겨주었다. 줄기가 나온 외식편은 뿌리유도배지[RIM; 2.2g MS salts + B5, 20g sucrose, 0.1mg NAA, 0.3mg IBA, 300mg Timentin (pH 5.7), 8g agar for 1L]에 옮기고 뿌리가 유도될 때까지 배양하였다. 건강한 식물체는 25℃, 16시간 명/8시간 암조건에서 키운다.
3. 토마토에서 게노믹 DNA 분리
게노믹(genomic) DNA 분리는 Pater 등(Plant Biotechnol J. 2009 Oct;7(8):821-835)을 참고하여 수행하였다. 콜크보러(cork borer) 5호를 이용하여 G0와 G1세대 토마토 식물체에서 두 장의 잎 조각을 튜브에 넣고 액체질소에 얼려 구슬을 이용하여 mixer mill (#MM301, Retsch, Germany)에서 1분동안 분쇄하였다. 상기 분말에 300㎕의 2X CTAB extraction buffer (0.1M Tris, 2% CTAB, 1.4M NaCl, and 20mM EDTA)를 넣고 65℃에서 20분간 반응시켰다. 튜브에 300㎕ 클로로포름을 추가로 넣어주고 강하게 섞어준 다음 14,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등액 200㎕를 취하여 새 튜브로 옮기고 200㎕의 이소프로판올을 상등액에 넣어 섞고 상온에서 2분간 반응시켰다. 그 후, 14,000rpm으로 5분간 원심분리한 후 1㎖의 70% 에탄올을 이용하여 펠렛을 씻어주었다. 14,000rpm으로 1분간 원심분리하여 DNA 펠렛을 회수하고, 상기 펠렛을 상온에서 10분간 건조시키고 50㎕의 삼차증류수를 넣어 녹였다. 이 중 2㎕의 게노믹 DNA를 이용하여 25㎕ 부피의 PCR 반응에 사용하였다.
4. 시퀀싱을 통한 유전체교정 분석
G0이나 G1 세대 토마토에서 SlSRFR1 타켓부위를 PCR을 통해서 증폭시키고 시퀀싱을 수행하였다. 상기 결과를 ICE (Inference of CRISPR Edits, https://ice.synthego.com/#/) 분석을 통해서 G0이나 G1 세대 토마토에서 Indel 돌연변이가 얼마나 일어났는지 확인하였다. G1 세대 토마토에서 좀 더 명확한 결과를 확인하기 위해서는 Miseq 시퀀싱을 수행하여 Cas-Analyzer 프로그램 (http://www.rgenome.net/)으로 분석하였다. SlSRFR1-F1/SlSRFR1-R2 프라이머 세트를 이용하여 945bp 크기의 PCR 단편을 증폭하고 유전자 특이적 염기서열과 어댑터(adaptor) 프라이머 일부 서열을 공유하는 프라이머(MiSeq-1-F2/MiSeq-1-R2 and MiSeq-2-F2/MiSeq-2-R2)를 이용하여 2차 PCR 을 통해 155bp 와 150bp 크기의 DNA 단편을 증폭하였다. MiSeq sequencing service (MiniSeqTM System, Illumina, USA)에서 제공하는 dual Index adapter (D501~D508과 D701~D712의 조합) 프라이머를 이용하여 3차 PCR 단편을 증폭하여 Miseq 시퀀싱을 통해 Indel 돌연변이 정도를 분석하였다.
5. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 연구
G1 세대 유전자변형 토마토에서 동형(homozygous) 식물체를 찾기 위해서 유전자의 다형성(polymorphism)을 이용한 CAPS 분석을 수행하였다. SlSRFR1-sgRNA1과 SlSRFR1-sgRNA2에서 일어난 돌연변이 양상을 구별하기 위해서 SlSRFR1-F1/SlSRFR1-Bcc-R2와 SlSRFR1-F1/SlSRFR1-R2를 이용하여 DNA 단편을 증폭하였다. 이 DNA에 BccI과 BcgI을 각각 처리하고 37℃에서 3-4시간 반응시켰다. 이후 상기 혼합물을 아가로스 겔에 로딩하여 전기영동을 수행하고 G1 세대의 유전형(genotype)을 선별하였다.
6. 박테리아와 곰팡이 병원균에 의한 발병 분석
슈도모나스 시린개 pv. 토마토 DC3000 (Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, 이하 Pto DC3000)에 의한 발병 분석은 이전의 연구를 따라 수행하였다(Scalschi, L. et al., PLoS One 2014, 9:e106429). 슈도모나스 배지에서 자란 pVSP61 공벡터(empty vector)가 들어있는 Pto DC3000을 2x108 CFU/㎖로 희석하고 6주된 토마토 식물의 세 번째 또는 네 번째 잎에 상기 희석액을 30초동안 처리한 후 높은 습도를 유지하기 위해서 플라스틱백으로 감싸서 5일동안 유지하였다. 슈도모나스균이 처리된 식물에서 콜크보더 5호를 이용하여 두 장의 잎 조각을 10 mM 염화마그네슘 용액에 넣어 분쇄한 후 단계희석하여 슈도모나스 배지에 도말한 뒤 30℃에서 배양시키며 자라난 박테리아 수를 관찰하였다.
푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라이코페르시씨(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, 이하 FOL)에 의한 발병 분석은 이전의 연구(Kostov, K. et al., Biotechnol. Biotechnol. Equip. 2009, 23(1):1121-1125)를 따라 수행하였다. 30℃ 암조건의 potato dextrose (#254920, BD Difco, USA)에서 FOL을 배양한 후, 25℃ 16시간 명/8시간 암조건에서 5일동안 키워 실험에 사용하였다. 콜크보더 1호를 사용하여 배지에서 자란 곰팡이를 플러그를 만들어 6주된 토마토 잎 위에 얹고, 25℃, 16시간 명/8시간 암조건에서 3-8일동안 두었다.
7. Trypan Blue 염색
곰팡이가 감염된 토마토 잎 조각을 트립판 블루(trypan blue) 용액 (1:1:1=85%(w/v) lactic acid:phenol (pH 8.0):glycerol(≥ 99%), 10mg/㎖ trypan blue)에 1시간동안 담가두었다. 염색된 잎을 99% 에탄올에 하루 담궈 색소를 제거하였다. 형광현미경을 이용하여 곰팡이 균사의 발달정도를 시각화하였다.
8. RNA 분리와 cDNA 합성
G1 세대 slsrfr1 돌연변이체에서 콜크보더 5호를 이용하여 잎 조각 3장을 뚫어 2㎖의 튜브에 넣고 액체질소에 얼린다음 mixer mill을 이용하여 분쇄하였다. RiboEx (#301-001, GeneAll, Korea) 프로토콜을 따라 50㎕ 총 RNA를 분리하고 TURBO DNA-free kit (#AM1907, Invitrogen, USA)를 사용하여 총 RNA로부터 섞여있는 genomic DNA를 제거하였다. SuperiorScrippt Ⅲ cDNA synthesis kit (#EZ405S, Enzynomics, SouthKorea)를 이용하여 cDNA를 합성한 다음 그 중에서 1㎕를 qRT-PCR 반응에 사용하였다.
9. qRT-PCR을 통하여 유전자 발현 분석
확인하고자 하는 유전자의 프라이머와 QuantiNova SYBR® Green PCR Kit (#208054, Qiagen, Germantown, USA)를 이용하여 CFX384 system (BioRad, Hercules, USA) 기계에서 95℃ 2분, 40 cycle (95℃ 5초, 60℃ 15초) 조건으로 DNA를 증폭하였다. SlACT와 SlGAPH를 이용하여 상대적인 유전자 발현정도를 분석하였다.
Figure PCTKR2022008349-appb-img-000001
10. 단백질 면역 블랏 분석
콜크보더 5호를 이용하여 토마토 잎 조각 2개를 튜브에 넣고 50㎕의 8M 우레아(urea)를 튜브에 넣어 막자를 이용하여 분쇄하였다. 12,000rpm으로 10분간 두 번 원심분리하여 상층액을 12%의 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 단백질 면역 블랏 분석은 α-PR1 antibody (1:10,000 dilution, #AS10 687, Agrisera, SWEDEN) 또는 α-Actin antibody (1:10,000 dilution, #AS13 2640, Agrisera)를 이용하여 수행하였으며, Clarity Western ECL Substrate (#1705061, Bio-Rad, USA)와 SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (#34094, Thermo Scientific, USA)을 이용하여 시각화하였다.
실시예 1. 표적 선발 및 SlSRFR1 교정을 위한 벡터 구축
SRFR1는 애기장대에서 단일 카피 유전자로, 애기장대 SRFR1는 주로 단백질-단백질 상호작용에 관여하는 11개의 TPR (tetratricopeptide repeat) 도메인으로 구성되어 있다. 토마토 프로테옴에 주석을 달기위해 블라스트(Blast) 알고리즘을 사용하였고, 애기장대 SRFR1와 65%의 유사성을 가지는 Solyc02g09280 (SlSRFR1)을 확인하였다. 애기장대 SRFR1과 서열 정렬을 통해 SlSRFR1이 1,055개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하며, 두 개의 TPR 도메인이 N-말단에 위치하고, 9개의 TPR 도메인이 중앙에 위치함을 알 수 있었다.
본 발명자는 SlSRFR1의 기능을 분석하기 위해, CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 돌연변이체를 제조하였다. 표준 조건에 기반하여 sgRNA를 디자인하였고, SlSRFR1의 ORF (open reading frame)의 5' 말단쪽 위치를 교정을 위한 자리로 선정하였다(표 2).
SlSRFR1 교정을 위한 gRNA 표적 위치
Name gRNA Target position
on genome		 Number of off-targets
(<4 MMs)
sgRNA1 GTAACTTTCGACGCCATCG
(서열번호 4)		 5' UTR and CDS 1
sgRNA2 ATTGACTATAGCAAAACGCT
(서열번호 5)		 CDS 3
실시예 2. CRISPR/Cas9에 의해 생성된 SlSRFR1 대립유전자 분석
G0 세대에서, 37개 식물체가 형질전환된 자엽으로부터 재분화되었다. 생성된 식물체로부터 분리한 게노믹 DNA를 통해 잠재적인 게놈 교정 이벤트를 입증하였다. 표적 DNA 부위를 유전자 특이적 프라이머를 통해 증폭하고 아가로스 겔에 로딩하여 비교한 결과, 비교정 식물체 M82와 증폭산물의 크기가 유사하게 확인되어 표적 영역에서 큰 결실은 일어나지 않았음을 알 수 있었다. ICE (Inference of CRISPR Edits) 프로그램을 사용하여 분석한 결과, 14개의 G0 식물체에서 InDel 변이가 확인되어, CRISPR/Cas9 매개 교정 효율은 37.84%임을 알 수 있었다(도 2). 특히, 서열번호 4의 sgRNA (Target 1) 표적 부위가 서열번호 5의 sgRNA (Target 2) 표적 부위에 비해 InDel 돌연변이가 많이 발생하였음을 알 수 있었다.
모든 InDel 변이는 절단 위치에서 발생하였다. SRFR1-sgRNA1 표적 자리에서는 1 bp 삽입(G0-5, G0-6, G0-7, G0-8, 및 G0-9) 및 3 bp 결실(G0-10 및 G0-11)이 주로 관찰되었으며, 다섯 개의 독립적인 이벤트(G0-5 to 9)에서 유사한 교정 패턴을 나타냈다. ICE-기반 decomposition 분석에서 나타난 혼재된 피크는 G0 세대에서 이형접합의(heterozygous) slsrfr1 돌연변이체의 존재를 확인시켜 주었다. 그래서, 3개의 G0 계통(G0-1, G0-2, G0-3)을 동형접합의 식물체를 획득하기 위해 다음 세대(G1)로 진전시켜 분석하였다. G1 세대 식물체로부터 분리한 DNA를 사용하여 PCR 반응을 수행하고, CAPS 분석을 진행하여 동형접합의 G1 식물체를 확인하였다(도 1d).
또한, CAPS 분석을 통해 동형접으로 확인된 G1 식물체 모두를 대상으로 Deep sequencing 또는 Sanger sequencing 분석을 수행하였다. 그 결과, 2종의 monoallelic 동형접합체 (11 bp 결실 in TPR domain, slsrfr1-1; 및 1 bp 삽입 in TPR domain, slsrfr1-3), 1종의 multiallelic 동형접합체 (1, 4, 및 4 bp 결실, slsrfr1-2), 1종의 biallelic 동형접합체 (22 bp 결실 및 4 bp 결실 removing the start codon, slsrfr1-4)을 포함하는 4 유형의 대립유전자를 가진 G1 식물체가 생산되었음을 알 수 있었다(도 3). TPR 도메인의 1 bp 또는 11 bp 결실은 조기 종결코돈을 생성하였다. 또한, slsrfr1-2 및 slsrfr1-4의 돌연변이는 개시 코돈에서 확인되었다. 또한, 정제된 PCR 앰플리콘의 Sanger sequencing 분석을 통해 모든 대상에서 off-target site가 확인되지 않았음을 알 수 있었다.
실시예 3. slsrfr1 돌연변이 식물체의 형태 및 방어 마커 유전자 발현 분석
slsrfr1 G1 세대 식물체는 야생형 M82 식물체와 비교하여 약한 성장 감소가 확인되었으나, 심각한 왜화는 나타나지 않았다(도 4a). 또한, 야생형 M82 식물체와 비교하여 식물방어기작에 관여하는 유전자인 SlPR1 (Solyc09g007010.1), SlPR2 (Solyc01g008620.2), SlPR5(Solyc08g080640), 및 TomloxD (Solyc03g122340.2) 유전자의 발현 수준이 증가되어 있음을 확인할 수 있었고(도 4b), 이 결과는 CRISPR/Cas9 매개 SlSRFR1의 돌연변이는 살리실산 의존 방어 유전자의 발현 수준을 상향 조절하고 자스몬산 신호 마커 유전자(TomloxD)의 발현도 유도함을 의미하였다.
실시예 4. slsrfr1 돌연변이 식물체의 병 저항성 분석
애기장대 srfr1 돌연변이체는 식물방어기작에 관여하는 유전자들이 항시적으로 상향 조절되었으나 병독성의 Pto DC3000에 대한 증진된 저항성이 없는 것으로 보고되었으나(Kim, S.H. et al., Plant Signal Behav. 2009, 4;149-150), 6주령의 slsrfr1 G1 세대 식물체는 야생형 M82 식물체에 비해 Pto DC3000에 대한 저항성이 증진되었음을 알 수 있었다(도 5). 반면, 사물기생 병원균인 푸사리움 옥시스포럼 f. sp. 라이코페르시씨(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)에 대해서는 애기장대에서와 같이 slsrfr1 G1 세대 식물체가 야생형 M82 식물체에 비해 감수성이 더욱 증가되었음을 확인할 수 있었다(도 6).

Claims (10)

  1. 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 병 저항성을 조절하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질 코딩 유전자의 발현 조절은 SRFR1 유전자의 발현을 저해하여 기생영양(biotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 증가시키거나, 사물기생성(necrotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자의 발현 저해는 VIGS (Virus-induced gene silencing), RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 유전자 교정 시스템 또는 방사선 조사를 통한 돌연변이 유발에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 토마토 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 토마토 유래 SRFR1 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시켜 야생형에 비해 기생영양(biotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 증가시키거나, 사물기생성(necrotrophic) 병원균에 의한 식물병에 대한 저항성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 식물병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체.
  9. 제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  10. 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 SRFR1 (SUPPRESSOR OF rps4-RLD1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 병 저항성 조절용 조성물.
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