CN117965566B - 一种与烟草叶片衰老相关的基因家族及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种与烟草叶片衰老相关的基因家族及其应用。该基因家族包括六个基因，分别为NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6。利用该六个基因开发的生物材料可对烟草材料进行多基因编辑，从而获得六个基因均发生突变的六突变体，相对于野生型烟草而言，该六突变体烟草材料的叶片衰老速率显著减缓。本发明提供的基因家族、蛋白组合和相关生物材料可以用于创制具有延迟叶片衰老效果的烟草材料或者烟草育种。
Description
技术领域
本发明属于烟草育种领域，具体涉及一种与烟草叶片衰老相关的基因家族及其应用。
背景技术
植物叶片是植物重要的源器官，为植株的生长发育提供各种营养组分，包括大量的能量和有机物。而植物的衰老最早也体现在叶片上。叶片衰老是植物叶片发育的最终阶段，但是由于一些不利的内外因素，可能导致叶片提前衰老。叶片早衰导致作物叶片过早地丧失光合功能和同化作用，缩短叶片功能期，从而显著减少籽粒中干物质的积累，进而导致产量和品质的下降。因此，叶片衰老进程在很大程度上决定了作物的产量和品质。而延迟植物叶片衰老进程不仅可以提高产量还能改善养分利用效率，对于农业生产具有重要意义。
叶片衰老最显著的变化是叶色改变，其原理在于叶绿体的解体导致叶绿素含量迅速降低，最终引发叶片的死亡脱落。滞绿蛋白（stay-green protein, SGR）是核基因编码的叶绿体的靶蛋白，结构高度保守，是植物生长发育过程中叶绿素降解和器官衰老的关键因子。目前在多种植物中发现SGR基因突变导致得滞绿突变体，如拟南芥（Arabidopsis thalian）、水稻（Oryza sativa）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、草甸羊茅（Festuca pratensis）、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、大豆（Glycine max）等。SGR1基因在调控衰老的分子机制多与叶绿素退化或降解有关。SGR1基因的突变导致植物叶绿素降解速率减慢，使作物产量、品质、生物量等农艺性状发生改变。相反，SGR1过表达则加快叶片衰老速率，使叶片呈现黄色等颜色的变化。通过基因编辑敲除或突变衰老过程中的关键基因，损坏叶片衰老机制，可以有效的延缓植物衰老。
目前，有关植物叶片衰老调控的分子机理的研究已经取得不少成果，大多数集中在叶片衰老相关基因的鉴定及功能分析上，也有利用基因工程手段，在延缓植物叶片衰老特性上取得了一定的成果。目前烟草中报道的和叶片衰老有关的基因有NtCP1，NtCP2，NtCP23，MC，NtGln1-3，NtGDH1，NtGDH2，NtPSA1，NtH1N1，NtH1N18，ndhF（参见文献：高晓明，郭永峰，中国烟草科学37（4），烟草叶片衰老相关基因），而关于SGR基因对于烟草叶片衰老的研究目前未见报道。
基因编辑技术为解决烟草叶片衰老提供了有效途径，但是由于烟草为异源四倍体植物，在同源基因之间存在基因功能的冗余性，通过单基因编辑往往很难获得理想的效果。多基因编辑技术可以同时干涉多个同源基因，为解决控制同一性状的同源基因的抑制提供了有效途径，但这一技术存在非特异性、以及敲除不彻底的问题。因此，寻找控制烟草叶片衰老的所有同源基因，并设计涵盖所有这些同源基因的靶标序列组合，进而通过多基因编辑技术对其进行多基因编辑是解决烟草叶片早衰的有效方法。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明目的之一在于提供一种与烟草叶片衰老相关的基因家族、蛋白组合以及与基因家族和蛋白组合相关的生物材料。
本发明另一目的在于提供上述基因家族、蛋白组合以及生物材料的用途。
本发明第三目的在于提供一种利用多基因编辑技术延迟烟草叶片衰老的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种与烟草叶片衰老相关的基因家族，所述基因家族包括6个基因；所述基因家族命名为NbSGR1；所述6个基因分别命名为NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6；其中，
基因NbSGR1.1的编码序列（CDS）为如下（a1）或（a2）中的任意一种：
（a1）如序列表中序列1所示的核苷酸序列，
（a2）在严格条件下与（a1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列；
基因NbSGR1.2的编码序列（CDS）为如下（b1）或（b2）中的任意一种：
（b1）如序列表中序列2所示的核苷酸序列，
（b2）在严格条件下与（b1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列；
基因NbSGR1.3的编码序列（CDS）为如下（c1）或（c2）中的任意一种：
（c1）如序列表中序列3所示的核苷酸序列，
（c2）在严格条件下与（c1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列；
基因NbSGR1.4的编码序列（CDS）为如下（d1）或（d2）中的任意一种：
（d1）如序列表中序列4所示的核苷酸序列，
（d2）在严格条件下与（d1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列；
基因NbSGR1.5的编码序列（CDS）为如下（e1）或（e2）中的任意一种：
（e1）如序列表中序列5所示的核苷酸序列，
（e2）在严格条件下与（e1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列；
基因NbSGR1.6的编码序列（CDS）为如下（f1）或（f2）中的任意一种：
（f1）如序列表中序列6所示的核苷酸序列，
（f2）在严格条件下与（f1）所述的核苷酸序列杂交且编码具有调控烟草叶片衰老功能的蛋白分子的核苷酸序列。
以上各个基因的编码序列为DNA水平的核苷酸序列，所述严格条件是指：用0.1 XSSPE（或0.1 X SSC），0.1%SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。
本发明第二方面提供一种与烟草叶片衰老相关的蛋白组合，其包括6个蛋白，所述6个蛋白共同作用以调控烟草叶片衰老，所述6个蛋白分别命名为NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6，其中，
蛋白NbSGR1.1的氨基酸序列为如下（a3）或（a4）中的任意一种：
（a3）由序列表中序列1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（a4）（a3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列；
蛋白NbSGR1.2的氨基酸序列为如下（b3）或（b4）中的任意一种：
（b3）由序列表中序列2所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（b4）（b3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列；
蛋白NbSGR1.3的氨基酸序列为如下（c3）或（c4）中的任意一种：
（c3）由序列表中序列3所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（c4）（c3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列；
蛋白NbSGR1.4的氨基酸序列为如下（d3）或（d4）中的任意一种：
（d3）由序列表中序列4所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（d4）（d3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列；
蛋白NbSGR1.5的氨基酸序列为如下（e3）或（e4）中的任意一种：
（e3）由序列表中序列5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（e4）（e3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列；
蛋白NbSGR1.6的氨基酸序列为如下（f3）或（f4）中的任意一种：
（f3）由序列表中序列6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，
（f4）（f3）所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有调控烟草叶片衰老功能的氨基酸序列。
上述6个蛋白共同作用可以调控烟草叶片衰老，当6个蛋白同时发生突变而导致功能丧失时，则可以延迟烟草叶片的衰老。
本发明第三方面提供一种与上述第一方面基因家族或上述第二方面蛋白组合相关的生物材料，所述生物材料选自如下（M）或（N）：
（M）用于沉默或抑制上述第一方面基因家族中各个基因或上述第二方面蛋白组合中各个蛋白的编码基因的表达的物质、或敲除上述第一方面基因家族中各个基因或上述第二方面所述蛋白组合中各个蛋白的编码基因的物质；
（N）用于降低或抑制上述第二方面蛋白组合中各个蛋白的活性和/或含量的物质。
本发明中所述生物材料可以利用多基因编辑技术、siRNA技术、shRNA技术、转座子技术等对烟草材料的相关基因进行突变或者对基因表达进行干扰，从而沉默或抑制基因家族中各个基因的表达，或者降低或抑制蛋白组合中各个蛋白的活性或含量。
在本发明的第三方面的生物材料中，作为一种可选方式，所述生物材料选自如下（1）-（4）中的任意一种：
（1）针对上述第一方面基因家族中各个基因的sgRNA靶点序列组合；
（2）sgRNA组合表达盒，所述sgRNA组合表达盒表达靶标上述第一方面基因家族中各个基因的sgRNA，sgRNA的靶点序列为（1）所述sgRNA靶点序列组合或sgRNA靶点序列组合中各个序列的反向互补序列；
（3）包含（2）所述sgRNA组合表达盒的载体；
（4）包含（3）所述载体的宿主。
sgRNA组合表达盒可以表达多个sgRNA，多个sgRNA可以靶向上述第一方面基因家族中的各个基因，从而将各个基因全部敲除，由此达到使其功能丧失的目的。sgRNA组合表达盒中，针对每一个基因可以设计1个或更多靶标序列结合区的编码DNA序列，优选，每个基因设计2个靶标序列结合区的编码DNA序列。sgRNA组合表达盒***到含有Cas9表达盒的CRISPR/Cas9的载体中，即可以得到用于多基因编辑的重组表达载体。
所述生物材料还可以是含有上述重组表达载体的转基因细胞系、含有上述重组表达载体的宿主菌等可用于基因编辑的产品。
进一步地，所述sgRNA靶点序列组合包括：
针对基因NbSGR1.1的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.1-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列7所示，以及NbSGR1.1-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列8所示；
针对基因NbSGR1.2的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.2-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列9所示，以及NbSGR1.2-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列10所示；
针对基因NbSGR1.3的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.3-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列11所示，以及NbSGR1.3-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列12所示；
针对基因NbSGR1.4的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.4-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列13所示，以及NbSGR1.4-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列14所示；
针对基因NbSGR1.5的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.5-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列15所示，以及NbSGR1.5-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列16所示；
针对基因NbSGR1.6的sgRNA靶点序列包括：NbSGR1.6-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表中序列17所示，以及NbSGR1.6-sgRNA2，其核苷酸序列如序列表中序列18所示。
序列7至序列18为5’端至3’端的核苷酸序列。
进一步地，所述载体是基于CRISPR/Cas9基因组编辑***设计的，包括：Cas9表达盒、上述sgRNA组合表达盒，所述Cas9表达盒表达Cas9，sgRNA组合表达盒表达多个sgRNA，多个所述sgRNA的靶标基因是第一方面基因家族中的6个基因。
更进一步地，所述载体是pSolycp00032-Cas9-6SGR1-12gRNA，核苷酸序列如序列表中序列33所示（结构如图4）。
本发明第四方面提供上述第一方面基因家族或上述第二方面蛋白组合在延迟烟草叶片衰老方面的用途，或者上述第三方面生物材料在创制具有延迟叶片衰老效果的烟草材料或者烟草育种中的用途。
利用上述生物材料通过多基因编辑技术敲除第一方面基因家族中的6个基因，使其功能丧失，从而获得具有延迟叶片衰老效果的烟草材料或突变株；然后将该突变株进行多代自交可以获得6个基因的纯合突变株，从纯合突变株中继续鉴定可以获得无Cas9基因的非转基因纯合突变株，由此得到叶片衰老被延迟的烟草株系。
本发明第五方面提供一种利用多基因编辑技术延迟烟草叶片衰老的方法，包括：
S1：将上述载体导入烟草材料中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑***对烟草材料基因组中的6个基因NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6进行编辑，进而使所述6个基因功能丧失；
S2：通过筛选得到转化成功的植株，并从转基因植株中鉴定出叶片衰老显著延迟的烟草突变株。
在本发明第五方面的方法中，作为一种可选方式，从转基因植株中鉴定出叶片衰老显著延迟的烟草突变株的方法包括：以转基因植株的基因组作为模板进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳或者测序的方法检测以得到基因NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6均发生突变的株系；
所述PCR扩增采用的引物组合包括如下第一引物对至第六引物对：
第一引物对为：NbSGR1.1-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列19所示，和NbSGR1.1-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列20所示；
第二引物对为：NbSGR1.2-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列21所示，和NbSGR1.2-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列22所示；
第三引物对为：NbSGR1.3-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列23所示，和NbSGR1.3-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列24所示；
第四引物对为：NbSGR1.4-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列25所示，和NbSGR1.4-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列26所示；
第五引物对为：NbSGR1.5-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列27所示，和NbSGR1.5-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列28所示；
第六引物对为：NbSGR1.6-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列29所示，和NbSGR1.6-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列30所示。
序列19至序列30为5’端至3’端的核苷酸序列。
本发明第六方面提供一种延迟烟草叶片衰老的非转基因烟草材料的获取方法，包括：
将上述第五方面方法获得的突变株进行多代自交，从自交子代中鉴定出第一方面基因家族中6个基因均发生纯合突变且不携带外源DNA片段的自交子代，即为延迟烟草叶片衰老的非转基因烟草材料。
在本发明第六方面，所述鉴定的方法进一步包括：
A1：以自交子代的基因组DNA为模板，采用上述第一引物对至第六引物对进行PCR克隆，电泳和/或测序，选择基因家族中6个基因均发生纯合突变的株系，即其电泳条带单一且与野生型烟草植株的电泳条带大小不同或测序结果不同；
A2：采用序列表中序列31和序列32作为引物对步骤A1中获得的纯合突变株系的Cas9基因进行PCR扩增和电泳，选择不携带外源Cas9基因片段的纯合突变株系即为延迟烟草叶片衰老的非转基因烟草材料。
序列31至序列32为5’端至3’端的核苷酸序列。
本发明中所述烟草优选为本生烟。
与现有技术相比，本发明至少具有下列优点及有益效果：
（一）本发明提供了可以控制烟草叶片衰老的基因家族，该基因家族中的六个基因NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6的组合可以调控烟草叶片衰老速度。抑制或沉默上述六个基因的表达或者降低六个基因编码的蛋白含量可以显著延缓烟草叶片衰老速度。
（二）本发明还提供了与上述基因家族和蛋白组合相关的生物材料，该生物材料可以通过快速编辑六个基因而使其功能丧失，从而显著延迟植物叶片衰老黄化。具体地，以NbSGR1六个同源基因为靶，六个同源基因同时编辑后的突变体叶片衰老黄化被延迟。
（三）本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑***，通过单次转基因导入含有12个分别靶向NbSGR1.1-NbSGR1.6六个同源基因的sgRNA编码序列，从而快速获得六个基因功能全部丧失的突变体，nbsgr1.1/2/3/4/5/6多突变体叶片黄化衰老具有明显的延迟。
（四）相对于野生型背景（本生烟），六突变体nbsgr1.1/2/3/4/5/6叶片衰老显著延迟，野生型暗处理前叶绿素含量为26.1 SPAD，暗处理10天后叶绿素含量为17.7 SPAD。六突变体暗处理前叶绿素含量为26.1 SPAD，暗处理10天后叶绿素含量为25.3 SPAD。
附图说明
图1为本发明实施例2中sgRNA靶点在各个基因编码区CDS上的位置示意图。
图2为本发明实施例3中用于构建所述多基因编辑载体的骨架载体pSolycp00032质粒图谱。
图3为本发明实施例3中用于构建所述多基因编辑载体的pSolycp00032-Cas9质粒图谱。
图4为sgRNA组合表达盒在pSolycp00032-Cas9质粒中位置结构示意图。
图5为本发明实施例3构建的最终质粒pSolycp00032-Cas9-6NbSGR-12gRNA的图谱。
图6为本发明实施例4得到的本生烟六突变体nbsgr1.1/2/3/4/5/6表型数据。其中，A为暗处理之前野生型叶片表型，B为暗处理10天之后野生型叶片表型。C为暗处理之前六突变体（CR19）叶片表型，D为暗处理10天之后六突变体（CR19）叶片表型。
图7为本发明实施例4得到的六突变体nbsgr1.1/2/3/4/5/6（CR19）和野生型叶片暗处理前后叶绿素含量数据比较。
图8为本发明实施例4得到的本生烟双突（六个基因中两个基因发生突变）、三突（六个基因中三个基因发生突变）、四突（六个基因中四个基因发生突变）、五突（六个基因中五个基因发生突变）的突变体，其中，A为暗处理之前双突叶片表型，B为暗处理10天之后双突叶片表型；C为暗处理之前三突叶片表型，D为暗处理10天之后三突变体叶片表型；E为暗处理之前四突叶片表型，F为暗处理10天之后四突叶片表型；G为暗处理之前五突叶片表型，H为暗处理10天之后五突叶片表型，野生型暗处理之前和暗处理10天后的叶片表型参见图6中的A和B。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例中使用的野生型烟草材料为本生烟。
实施例1与烟草叶片衰老相关的基因家族的获取
（1）在公共本生烟基因组注释网站上(https://solgenomics.net/)，以AtSGR1核苷酸序列为query序列进行blast比对，最终得到6个与AtSGR1高度同源的基因，分别是Niben101Scf02361g03009；Niben101Scf16022g02004；Niben101Scf00490g01040；Niben101Scf09467g02008；Niben101Scf12732g00004；Niben101Scf16022g02005序列。
（2）在公共本生烟基因组注释网站上(https://solgenomics.net/)，下载上述（1）中6个同源基因序列。
结果：将所述6个基因分别命名为NbSGR1.1（Niben101Scf02361g03009）、NbSGR1.2 （Niben101Scf16022g02004）、NbSGR1.3（Niben101Scf00490g01040）、NbSGR1.4 （Niben101Scf09467g02008）、NbSGR1.5（Niben101Scf12732g00004）和NbSGR1.6 （Niben101Scf16022g02005）；其中基因NbSGR1.1的CDS由序列表中序列1所示的核苷酸序列组成；基因NbSGR1.2的CDS由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成；基因NbSGR1.3的CDS由序列表中序列3所示的核苷酸序列组成；基因NbSGR1.4的CDS由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成；基因NbSGR1.5的CDS由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成；基因NbSGR1.6的CDS由序列表中序列6所示的核苷酸序列组成。
实施例2基因NbSGR1.1-NbSGR1.6的sgRNA靶点序列设计
按照如下步骤进行：
对于实施例1中得到的6个同源基因利用网站CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)设计sgRNA，每个基因设计2个sgRNA靶点，共12个sgRNA靶点，根据靶向效率和脱靶情况并综合考虑六个靶向基因的情况进行sgRNA靶点的选择，针对各个基因的sgRNA靶点在相应基因编码区上的位置如图1所示，各个基因的sgRNA靶点序列如下，靶点序列名称中含有的对应基因名称即表示该靶点序列为针对该基因设计的。
NbSGR1.1-sgRNA1:5’-AAAGAGAGCTTTCCTTATGA-3’（序列表中序列7）；
NbSGR1.1-sgRNA2:5’-TTAGATGCTTCAAAAATAGA-3’（序列表中序列8）；
NbSGR1.2-sgRNA1:5’-AACTATGGACTGATTCTTGT-3’ （序列表中序列9）；
NbSGR1.2-sgRNA2:5’-TGTTACCTCTAAACTCACTT-3’ （序列表中序列10）；
NbSGR1.3-sgRNA1:5’-GCGGAAAATTACAGGGACAA -3’ （序列表中序列11）；
NbSGR1.3-sgRNA2:5’-TTTGATGCTTCAAATATAGC-3’ （序列表中序列12）；
NbSGR1.4-sgRNA1:5’-CATACTCCAGTATCGTGCCA-3’ （序列表中序列13）；
NbSGR1.4-sgRNA2:5’-AATGTCATACCTGATCGTAT-3’ （序列表中序列14）；
NbSGR1.5-sgRNA1:5’-AAGACAAGGGTGTTGTAAGG-3’ （序列表中序列15）；
NbSGR1.5-sgRNA2:5’-TATTGAAGCTGGATCAAGAT-3’ （序列表中序列16）；
NbSGR1.6-sgRNA1:5’-TAGACTGCACAGAGATGAAG-3’ （序列表中序列17）；
NbSGR1.6-sgRNA2:5’-GCAGAAGATATAACAAGAAA-3’ （序列表中序列18）。
另外，靶点序列NbSGR1.1-sgRNA1、NbSGR1.5-sgRNA1和NbSGR1.5-sgRNA2的3’连接的PAM序列均为GGG；靶点序列NbSGR1.1-sgRNA2的3’连接的PAM序列为AGG；靶点序列NbSGR1.2-sgRNA1、NbSGR1.2-sgRNA2、NbSGR1.3-sgRNA1、NbSGR1.3-sgRNA2、NbSGR1.4-sgRNA2、NbSGR1.6-sgRNA1以及NbSGR1.6-sgRNA2的3’连接的PAM序列均为TGG；NbSGR1.4-sgRNA1的3’连接的PAM序列为CGG。
PAM序列若位于5’端则为上述对应PAM序列的反向互补序列。
实施例3 NbSGR1.1-NbSGR1.6多基因编辑载体pSolycp00032-Cas9-6NbSGR-
12gRNA的构建
按照如下方法进行：
（1）设计含有12个sgRNA靶点序列或者含有与12个靶点序列结合的sgRNA的编码DNA序列的核酸片段。该核酸片段的设计为：针对每一个靶位点，设计两个互补DNA序列，分别在靶序列5’端添加同源臂F序列，tRNA序列，在3’端添加gRNA scaffold 序列，同源臂R序列，下划线为实施例2提供的12个sgRNA靶点序列，具体设计原则参见文献(Kabin Xie,Bastian Minkenberg, and Yinong Yang,P Natl Acad Sci USA,112, 3570-3575.Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with theendogenous tRNA-processing system)。人工合成该核酸片段，合成的核酸片段的序列如下所示（即序列表中的序列34）：5’-ggccagtgccaagcttcgacttgccttccgcacaatacatcatttcttcttagctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagcttacattttcttgaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagtttttgtatcttgtttcatagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaataaaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaagaagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccatttaagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagtttatatacagctagagtcgaagtagtgattgAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAA AAGAGAGCTTTCCTTATGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATTAGATGCTTCAAAAATAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAAACTATGGACTGATTCTTGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATGTTACCTCTAAAC TCACTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGCGGAAAATTACAGGGACAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATTTGATGCTTCAAATATAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCACATACTCCAGTATCGTGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAAATGTC ATACCTGATCGTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAAAGACAAGGGTGTTGTAAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATATTGAAGCTGGATCAAGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCATAGACTGCACAGAGATGAA GGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCAACAAAGCACCAGTGGTCTAGTGGTAGAATAGTACCCTGCCACGGTACAGACCCGGGTTCGATTCCCGGCTGGTGCAGCAGAAGATATAACAAGAAAgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttttgcaaaattttccagatcgatttcttcttcctctgttcttcggcgttcaatttctggggttttctcttcgttttctgtaactgaaacctaaaatttgacctaaaaaaaatctcaaataatatgattcagtggttttgtacttttcagttagttgagttttgcagttccgatgagataaaccaataagcttgcatgcctgc-3’
（2）采用CRISPR/Cas9载体***，包括载体pSolycp00032-Cas9，该载体的质粒图谱如图3所示，其骨架载体pSolycp00032可在纽谱生物公司（货号：V003093#）购买，其质粒图谱参见图2，改造后的pSolycp00032-Cas9（即图3的23kn175），保存于中国农业科院棉花生物技术育种创新研究组，公众可以从该实验室获得。图4为sgRNA组合表达盒的位置结构示意图。将sgRNA组合表达盒***载体pSolycp00032-Cas9的HindⅢ酶切位点处，由此得到本发明的多基因编辑载体。具体如下：
用PstⅠ和EcoRⅠ酶切骨架载体pSolycp00032，然后通过PstⅠ和EcoRⅠ酶切位点将Cas9表达盒骨架载体片段***到酶切后的骨架载体上，从而得到pSolycp00032-Cas9。其中Cas9表达盒的核苷酸序列如序列表序列33所示。将载体pSolycp00032-Cas9用NEB公司HindⅢ酶切（酶切条件参见NEB官网），形成带有粘性末端的载体大片段；
以上述（1）合成的核酸片段为模板，以12gRNA-F和12gRNA-R为引物，用TOYOBO公司的高保真酶KOD -Plus- Neo (货号：KOD-401)进行PCR扩增（扩增条件参考高保真酶KOD -Plus- Neo的说明书中的2步扩增法），得到2724bp的扩增产物；
12gRNA-F: 5’-ggccagtgccaagcttcgacttgccttcc-3’（序列表中序列35）；
12gRNA-R: 5’-gcaggcatgcaagcttattggtttatctcatcgg-3’（ 序列表中序列36）。
然后将酶切后的载体大片段和扩增产物按照摩尔浓度约1:5混合，用TaKaRa公司的In-Fusion® HD Cloning Kit（货号： 639648）进行infusion连接（连接步骤参考说明书），转化大肠杆菌DH5α得到连接质粒，利用公共引物M13进行测序，选取正确的质粒克隆。最终得到目的重组质粒即多基因编辑载体pSolycp00032-Cas9-6NbSGR-12gRNA（图5）。
实施例4 多基因编辑转基因植株的获得
1、将重组质粒转化农杆菌
取1 μg实施例3制备的重组质粒pSolycp00032-Cas9-6NbSGR-12gRNA置于100 μLGV3101感受态细胞（北京华越洋生物，NRR01270）中，液氮中速冻3 分钟，37 ℃水浴5 分钟，然后加入1 mL YEB培养基（YEB培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及在培养基中的浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨5g/L，牛肉浸膏5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，蔗糖1g/L），28℃培养2-4小时；10000×g离心30秒，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有50 μg/mL 卡那霉素、500 µg/mL 链霉素和50 μg/mL 利福平的YEB平板上，28 ℃黑暗培养2-3 天；挑单菌落，接种于含有50 μg/mL 卡那霉素、500 µg/mL 链霉素和50 μg/mL 利福平的YEB液体培养基中，28 ℃振荡培养过夜，得到转化子；将转化子进行菌液PCR鉴定，以hpt557-F和hpt557-R为引物，得到大小为557bp的扩增片段的即为阳性重组菌，-80℃冻存备用。
hpt557-F：5’- ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3’（序列表中序列31）；
hpt557-R：5’- TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’（序列表中序列32）。
2、T0代再生植株的获得
（1）于培养基中种植的4-6周龄的本生烟草叶片为侵染材料。从-80℃冰箱取出带有pSolycp00032-Cas9-6NbSGR-12gRNA质粒的农杆菌GV3101，划线活化后挑单克隆于含有相应抗生素（100ug/mlKan,50ug/mlRif）100ml LB培养基，28℃，过夜培养。5000xg，5min收集菌体。用MS培养基重悬菌体至OD600=0.6左右。
（2）将烟草无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小，放入（1）中重悬好的菌液浸泡10min,期间摇晃数次。捞出叶片，用滤纸吸干叶片表面菌液，将叶片平铺在共培养基（每升含4.4gMS粉末，30g蔗糖，0.5mgIAA，2mg 6-BA）上暗培养2天。
（3）将暗培养后的叶片转移到分化培养基（每升含4.4g MS粉末，30g蔗糖，500mgcef，100mg Kan，0.5mg IAA，2mg 6-BA）上，培养期间，每隔10天换一次分化培养基，直至分化出小芽。
（4）待小芽长至2cm左右时，将小芽切下，移到生根培养基（每升含4.4g MS粉末，30g蔗糖，250mg cef，100mg Kan，0.5mg IAA）上，将20天还没有生根的小芽遗弃，生根的苗子即潜在阳性苗转移到土里种植，待苗子状态稳定后取样进行检测。
3、转基因苗的分子检测
将获得的T0潜在阳性苗与野生型本生烟草提取基因组DNA，直接在各个靶标位点两侧设计引物，利用Genstar公司 2×Taq PCR StarMix（货号：A012）进行PCR扩增 (扩增条件参考2×Taq PCR StarMix说明书)，一对引物一个PCR体系，然后对各对引物扩增后得到的相应扩增产物进行测序，检测引物序列如下（序列表中序列19-30）：
NbSGR1.1-sgRNA-F:5’- AGGAAAAGCGAGTACGCAAG-3’ （序列表中序列19）
NbSGR1.1-sgRNA-R:5’-CTGTAGACCCTCCGCTCAAG-3’ （序列表中序列20）
NbSGR1.2-sgRNA-F:5’-AGGAAATCCTTTGCCCACTT-3’ （序列表中序列21）
NbSGR1.2-sgRNA-R:5’-ATTAGAGAGCCAGCGCGATA -3’ （序列表中序列22）
NbSGR1.3-sgRNA-F:5’-TGAAATCGGAACTTTGACTGC -3’ （序列表中序列23）
NbSGR1.3-sgRNA-R:5’-ACGGGTCCGACACCTATTTT-3’ （序列表中序列24）
NbSGR1.4-sgRNA-F:5’-TGCCTACTAAGACGATCATTTCTG -3’ （序列表中序列25）
NbSGR1.4-sgRNA-R:5’-TCGAGGGCTTTGGTCTCTAA-3’ （序列表中序列26）
NbSGR1.5-sgRNA-F:5’-CCGCATCCACATATTCTCCT-3’ （序列表中序列27）
NbSGR1.5-sgRNA-R:5’-TGCCGTAAAGGAAATTCAGG -3’ （序列表中序列28）
NbSGR1.6-sgRNA-F:5’-GCAGTTAAAAGGATGGCACC -3’ （序列表中序列29）
NbSGR1.6-sgRNA-R:5’-GGGGCCCATGTATCTCACTA -3’ （序列表中序列30）。
一对引物一个PCR体系，利用上述引物对，以野生型本生烟草基因组为模板进行PCR，得到的扩增产物序列如下：
序列19和序列20组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列37所示；
序列21和序列22组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列38所示；
序列23和序列24组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列39所示；
序列25和序列26组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列40所示；
序列27和序列28组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列41所示；
序列29和序列30组成的引物对的PCR产物序列如序列表中序列42所示；
结果：比较转基因苗中每个引物对得到的PCR产物测序序列与野生型烟草对应引物对的PCR产物测序序列，分析突变情况，发现在所有12个sgRNA处均能检测到突变，突变类型以复杂变异（Complicated Variant，CV），单碱基或多碱基***(in)或缺失(del)居多。T0代转基因株系中CR19为六个基因均发生突变的突变体（比如下面中Line16），也称为六突变体，该六突变体在黑暗处理下叶片衰老黄化的速率较野生型显著延迟，具体参见图6和图7。
除上述六突变体以外，本试验还获得了T0代本生烟突变体5个株系（二突变体（Line 28）、三突变体（Line 24）、四突变体（Line 12和 18）和五突变体（Line19）），每个突变株系的每个基因的两个靶位点突变情况的检测结果见表1，具体是根据各个株系的PCR产物测序结果与WT的PCR产物测序结果进行比对，当全部靶位点未发生突变时用WT表示，当有靶位点发生单碱基或多碱基***时用in表示，当有靶位点发生单碱基或多碱基缺失时用del表示，当有靶位点发生复杂变异时用CV表示，复杂突变是指除单碱基或多碱基***(in)或缺失(del)以外的复杂突变。表1中给出了每个基因的两个靶位点的突变情况。
4、采用转基因阳性突变体获取纯合突变体
将T0代转基因株系CR19自花授粉繁殖两代，每一代均使用上述NbSGR1.1-NbSGR1.6检测引物（序列19-30）检测突变情况，并同时利用引物对hpt557-F（序列31）和hpt557-R（序列32）检测转基因载体是否还存在于基因组中，如果PCR产物中不含有557bp片段，则显示转基因载体已经不存在于基因组中，则证明该植株为非转基因植株，如经证明转基因载体不存在于植株中且该植株的各个基因为纯合突变，则说明得到了非转基因纯合突变株。
实施例5、多基因编辑后所得转基因植株叶片的表型观察及叶绿素含量测定试验
试验方法：
黑暗是促进叶片衰老有效地外部刺激，因此，暗培养常常作为叶片衰老模拟的一个有效手段应用于衰老研究。将上述表1中各个T0代突变体材料在温室种植，在6叶期，取相同部位发育年龄一致的叶片进行暗处理，叶柄处用湿棉球保住，避免叶片失水萎蔫。处理前和处理后分别用SPAD-502测量叶片叶绿素含量。
结果：暗培养10天后，野生型叶片显著黄化衰老(图6A,B），NbSGR1六突变体CR19叶片保持绿色(图6C,D）。叶绿素含量测定结果和表型一致，如图7所示，CR19叶片叶绿素含量下降速率显著减缓。其它双突（图8A,B）、三突（图8C,D）、四突（图8E,F）、五突（图8G,H）的突变体比如Line28、24、18和19暗培养10天后的叶片也有变黄，其与野生型叶片没有本质区别，具体参见图8。说明采用本发明方法编辑这6个基因而得到的六突变体才具有明显的延迟叶片衰老的特征。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种与烟草叶片衰老相关的基因家族在延迟烟草叶片衰老方面的用途，所述基因家族包括6个基因；所述基因家族命名为NbSGR1；所述6个基因分别命名为NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6；其中，
基因NbSGR1.1的编码序列为如下（a1）：
（a1）如序列表中序列1所示的核苷酸序列，
基因NbSGR1.2的编码序列为如下（b1）：
（b1）如序列表中序列2所示的核苷酸序列，
基因NbSGR1.3的编码序列为如下（c1）：
（c1）如序列表中序列3所示的核苷酸序列，
基因NbSGR1.4的编码序列为如下（d1）：
（d1）如序列表中序列4所示的核苷酸序列，
基因NbSGR1.5的编码序列为如下（e1）：
（e1）如序列表中序列5所示的核苷酸序列，
基因NbSGR1.6的编码序列为如下（f1）：
（f1）如序列表中序列6所示的核苷酸序列；
通过使所述6个基因的功能丧失来实现烟草叶片衰老的延迟。
2.利用多基因编辑技术延迟烟草叶片衰老的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1：将载体导入烟草材料中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑***对烟草材料基因组中的6个基因NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6进行编辑，进而使所述6个基因功能丧失；所述载体是基于CRISPR/Cas9基因组编辑***设计的，包括：Cas9表达盒、sgRNA组合表达盒，所述Cas9表达盒表达Cas9，sgRNA组合表达盒表达多个sgRNA，多个所述sgRNA的靶标基因是权利要求1所述基因家族中的6个基因；
S2：通过筛选得到转化成功的植株，并从转基因植株中鉴定出叶片衰老显著延迟的烟草突变株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，从转基因植株中鉴定出叶片衰老显著延迟的烟草突变株的方法包括：以转基因植株的基因组作为模板进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳或者测序的方法检测以得到基因NbSGR1.1、NbSGR1.2、NbSGR1.3、NbSGR1.4、NbSGR1.5和NbSGR1.6均发生突变的株系；
所述PCR扩增采用的引物组合包括如下第一引物对至第六引物对：
第一引物对为：NbSGR1.1-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列19所示，和NbSGR1.1-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列20所示；
第二引物对为：NbSGR1.2-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列21所示，和NbSGR1.2-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列22所示；
第三引物对为：NbSGR1.3-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列23所示，和NbSGR1.3-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列24所示；
第四引物对为：NbSGR1.4-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列25所示，和NbSGR1.4-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列26所示；
第五引物对为：NbSGR1.5-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列27所示，和NbSGR1.5-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列28所示；
第六引物对为：NbSGR1.6-sgRNA-F，其核苷酸序列如序列表中序列29所示，和NbSGR1.6-sgRNA-R，其核苷酸序列如序列表中序列30所示。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述烟草为本生烟。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述sgRNA组合表达盒包括如序列表中序列7至序列18所示的核苷酸序列。
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