KR102478475B1 - 식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현을 조절하여 흰잎마름병에 저항성을 갖는 새로운 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도{LOC_Os08g26230 gene mutant for controlling disease resistance of plant and uses thereof}
본 발명은 식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.
흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)은 그람음성 박테리아로서 벼 흰잎마름병의 주요 병원체이며 전 세계적으로 벼의 박테리아성 질병의 주원인으로 알려져 있다. 흰잎마름병균은 기주 식물체의 상처 또는 배수조직을 통해 감염되며 피복조직을 통해 증식되고 관다발계를 통해 이동한다. 분자마커 연구를 통해 얻어진 흰잎마름병균의 다양성, 분포도, 계통 및 감염성에 대한 상관관계는 흰잎마름병균의 계통정보에 대한 보다 많은 이해를 도와주었고, 아시아에서 발생하는 흰잎마름병균들이 지역에 따라 서로 다른 양상을 나타내고 있음을 보여주었다.
한국형 흰잎마름병균의 계통은 필리핀형 및 일본형과 각각 64% 및 58%의 계통학적 차이를 보였고, 이러한 한국형 흰잎마름병균은 다른 나라에 비해 유전적 변이가 심화된 계통으로 감염경로가 보다 다양할 것으로 예상된다. 한국형 K1 균주는 세균성 마름병 저항성 유전자인 Xa1과 Xa3 유전자를 보유하고 있는 벼 품종의 확산에 의해 감소되는 추세이이지만, K2와 K3 균주는 한국에서 계속해서 증식하고 있는 상황이다. 새로운 병원체인 K3a는 2003년에 심각한 흰잎마름병 피해를 주었던 K3와 동일한 감염 양상을 보이고 있다.
기능적 유전자 분석은 식물에서 비특이적 발현 단백질 유전자를 조사함에 있어서 검증된 유전자의 생물학적 유의성을 검증하는데 필수적인 것으로 입증되었다. 비록 Xa 유전자로써 언급되는 몇몇 유전자가 존재하나 벼와 흰잎마름병의 올리고뉴클오티드 마이크로어레이 분석을 통해 식물 면역 네트워크에 관여할 것으로 여겨지는 비특이적 발현 단백질은 알려진 바 없다.
본 발명자는 Xoo의 한국형 균주 K2에 대한 내성과 관련된 중요한 유전자를 확인하기 위해 자포니카 벼 품종인 '동진'과 '진백'의 전장 유전체 마이크로어레이 분석을 수행하여 여러 유전자의 과발현을 확인하였는데, 그 중 LOC_Os08g26230 유전자는 특성이 규명되지 않은 발현 단백질이었다. 따라서, 본 발명은 벼의 Xoo 감염에 반응하는 발현 단백질의 기능을 검증하기 위해 수행되었다.
한편, 한국등록특허 제1636154호에는 '흰잎마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질전환 식물체'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0055766호에는 벼 유래 PSK08 유전자를 이용한 '유전자 발현 억제를 통한 벼 흰잎마름병 저항성 부여법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 병 저항성을 조절하는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 8번 염색체에 존재하는 LOC_Os08g26230 유전자의 코딩 서열에 93 bp 염기가 삽입된, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 과발현하는 벼 형질전환체를 제조한 후 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K2)을 접종하여 흰잎마름병에 의한 식물체의 손상 정도를 관찰한 결과, LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 과발현하는 벼 형질전환체가 야생형 동진벼(흰잎마름병 감수성)에 비해 병변 길이가 감소된 것을 확인하였고, 이를 통해 LOC_Os08g26230 유전자 변이체가 흰잎마름병에 대한 식물체의 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 유효성분으로 함유하는 식물체의 식물병 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 과발현시킨 형질전환 식물체는 흰잎마름병에 대한 저항성이 증대되므로, LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현 조절을 통해 흰잎마름병에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 벼 표준유전체(Nipponbare 품종) 내 LOC_Os08g26230 유전자(REF-NB)와 본 발명에서 클로닝된 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 염기서열을 비교한 결과이다.
도 3은 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 과발현시킨 벼 형질전환체의 조직별(뿌리, root; 줄기, stem; 잎집, leaf sheath; 잎, leaf; 및 지엽, flag leaf)·생육 시기별(발아, germination stage; 3엽 단계, 3-leaf stage; 최고분얼기 단계, maximum tillering stage; 유수분화기, panicle initiation stage)에 따른 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현 수준을 확인한 PCR 결과이다.
도 4는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 과발현 벼 형질전환체에서 삽입 유전자의 카피 수를 확인한 PCR 결과이다. NC(Negative control, 음성대조군): 동진벼, PC(Positive control, 양성대조군): mock 벡터(LOC_Os08g26230 유전자 변이체가 삽입되지 않은 pCAMBIA1300 벡터).
도 5는 흰잎마름병 감수성 품종인 야생형 동진벼(DJ), 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼(JB) 및 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 과발현 벼 형질전환체(LOC_Os08g26230 OX-12, 20 및 23)에 흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae strain K2)을 접종하고 8일, 12일 및 16일 후 각 식물체의 병변 길이(lesion length)를 측정한 결과이다.
도 6은 흰잎마름병 감수성 품종인 야생형 동진벼(Dongjin), 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼(Jinbaek) 및 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 과발현 벼 형질전환체(LOC_Os08g26230 OX-12, 20 및 23)에 흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae strain K2)을 접종하고 각 식물체에서 흰잎마름병에 대한 손상 정도를 관찰한 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 LOC_Os08g26230 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법은 상기 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 식물병에 대한 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 식물병은 흰잎마름병, 도열병, 줄무늬잎마름병, 잎집무늬병, 검은줄오갈병, 점무늬병, 무름병, 시들음병, 혹병 및 궤양병 등 광역의 식물병일 수 있고, 바람직하게는 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K2)에 의해 유발되는 흰잎마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 식물병 저항성을 조절하는 방법에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체는 LOC_Os08g26230 유전자의 코딩 서열(coding sequence, CDS; http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi?orf=LOC_Os08g26230.2)에서 93 bp 길이의 염기가 삽입(insertion)된 것이다(도 2 참고).
본 발명의 상기 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 범위는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 LOC_Os08g26230 유전자 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 제미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS) 터미네이터, 벼 α-아밀라아제(RAmy1 A) 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 범위는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법은 상기 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 식물병에 대한 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 식물병은 바람직하게는 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K2)에 의해 유발되는 흰잎마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985, Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 식물병 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 형질전환 식물체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 식물병에 대한 저항성이 비형질전환체에 비해 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 식물병은 바람직하게는 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K2)에 의해 유발되는 흰잎마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 유효성분으로 함유하는 식물병 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K2)에 의해 유발되는 흰잎마름병에 대한 저항성을 조절할 수 있는 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하며, 상기 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현이 증가되면 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. LOC_ Os08g26230 유전자 변이체 분리
흰잎마름병에 강한 벼 품종 '진백'의 어린 잎을 사용하여 RNAiso Plus extraction reagent(Takara Bio Inc., 일본)로 총 RNA를 추출한 후 추출된 RNA 약 1 ug을 주형으로 하여 Superscript III First-Strand cDNA Synthesis Kit(Invitrogen, 미국)로 cDNA를 합성하였고, 유전자의 PCR 증폭을 위해 표 1의 프라이머 세트를 사용하였다(표 1). PCR 과정은 전변성 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 2분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 10분;의 조건으로 수행하였다. PCR 산물 확인을 위해 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)가 포함된 1%(w/v) 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하였고, 예상된 크기의 PCR 산물은 아가로스 겔에서 추출하여 Gel purification kit(Bioneer, 미국)를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEMT-easy 벡터(Promega, 미국) 내부로 서브클로닝하고 마크로젠(Macrogen, 한국)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 계층적 군집분석으로 다중 염기서열 정렬을 통하여 염기서열 상동성을 확인하였다.
본 발명에 사용된 프라이머 정보
Gene ID Seq(5'→3')(서열번호) 제한효소
LOC_Os08g26230 F: ggatccATGGGATCACGCTACTGGTCGC (2) BamHI
R: ctgcagTTAGACACGCTTATCTTGATCCCTGG (3) PstI
소문자: 제한효소 인식자리
2. 과발현 재조합 벡터 제작
LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 전장 cDNA는 T4 ligase kit(Promega, 미국)를 사용하여 pCAMBIA1300 vector(Takara, 일본)의 제한효소 BamHI와 PstI 사이에 삽입하였다. 식물 선발 마커로 hptII(hygromycin phosphotransferase II) 유전자를 사용하였으며, 삽입 유전자의 과발현을 유도하기 위하여 35S 프로모터를 사용하였다(도 1).
3. 벼 형질전환체 제작
완성된 벡터는 아그로박테리움 튜메파시엔스 균주인 EHA105로 형질전환하였고, 형질전환 아그로박테리움은 카나마이신(kanamycin, 50 ㎎/L)이 포함된 1.5% AB 배지의 28℃ 암조건에서 배양하여 선발하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 AAM 배지에 현탁하여 최종 농도 OD600에서 0.01로 맞춘 후 실험에 사용하였다. 10일 동안 배양시킨 벼 종자 유래 캘러스를 아그로박테리움 현탁액에서 3분간 감염시키고 건조시킨 후 0.4% 젤라이트(gelrite)가 포함된 2N6-AS 배지에서 배양하였고, 아그로박테리아와 캘러스를 25℃의 암조건에서 공동배양한 후 캘러스에서 아그로박테리움을 제거하기 위해 카베니실린(carbenicillin, 500 ㎎/L)이 포함된 증류수를 이용하여 세척하였다. 세척이 끝난 캘러스는 하이그로마이신(hygromycin, 50 ㎎/L)과 카베니실린(400 ㎎/L)이 포함된 2N6-CP 배지에서 32℃의 연속 광조건으로 2주간 배양하였다. 이후 증식된 캘러스를 MSR-CP 배지로 옮겨 줄기와 뿌리의 신장을 유도하고 지속적인 계대배양을 실시하였으며, 캘러스에서 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 2주간 재배하였다. 조직배양과 형질전환에 사용한 배지의 조성은 한국등록특허 제2103189호의 표 2에 나타난 것과 같다.
4. 게놈 DNA 추출
총 게놈 DNA는 이앙 2주 후 어린 잎을 이용하여 TissueLyser II system(QIAGEN, 영국) 및 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)를 사용하여 추출하였다. DNA 추출 후 DNA의 순도와 농도는 분광광도계(NanoDropTM One, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 측정하였고, 추출된 DNA는 멸균수로 희석하여 -20℃에 보관 및 사용하였다.
5. TaqMan qPCR을 통한 Copy 수 분석
T0 형질전환체에 삽입된 유전자의 Copy 수를 확인하기 위하여 TaqMan assay(Applied Biosystems, 미국)를 수행하였다. 10 ng의 DNA에 목표유전자 염기서열 탐지용 FAM dye-labeled MGB probe, 레퍼런스 유전자 염기서열 탐지용 VIC dye-labeled TAMRA probe, AmpliTaq Gold DNA polymerase가 포함된 TaqMan Genotyping Master Mix와 dNTPs를 혼합하여 사용하였고, 모든 qPCR 반응은 ABI 7900HT 장비(Alpplied Biosystems, 미국)를 이용하여 3반복으로 진행하였으며, 95℃에서 10분 동안 변성 과정 후에 95℃에서 15초, 60℃에서 60초간 반응하였다. 데이터 분석을 위하여 CopyCaller Software v 2.0(Applied Biosystems, 미국)를 이용하였다.
6. LOC_ Os08g26230 의 발현 분석
형질전환체의 조직별 및 생육 시기별 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현 분석을 위하여 다양한 조직(뿌리, 줄기, 잎집, 잎, 지엽) 및 생육 시기(발아기, 3엽기, 최대분얼기, 이삭형성기)에서 RNA를 추출하였다.
7. 흰잎마름병에 대한 저항성 검증
LOC_Os08g26230 유전자 변이체 과발현 벼 형질전환체, 야생형 동진벼(흰잎마름병 감수성) 및 진백벼(흰잎마름병 저항성)의 파종 후 7주령 식물체에 흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae strain K2, 108 CFU/㎖)을 접종하고 8일, 12일, 16일 후에 잎 조직의 병변 길이를 측정하여 감염성 정도를 판단하였다. 각 5번 반복으로 진행하였다.
실시예 1. 클로닝된 LOC_ Os08g26230 유전자의 특성
진백벼에서 LOC_Os08g26230 유전자를 클로닝한 후 염기서열 분석을 진행한 결과, 주석(annotation)이 없는 비특이적 발현 단백질 코딩 유전자임을 확인하였다. 또한 본 발명에서 클로닝된 LOC_Os08g26230 유전자는 벼의 8번 염색체에 위치하며, 181개의 아미노산 잔기를 인코딩하는 543 bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 가지는 것을 확인하였다.
게다가, 벼 표준유전체(Nipponbare 품종) 내 LOC_Os08g26230 위치의 염기서열(http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/sequence_display.cgi?orf=LOC_Os08g26230.2)과 진백벼에서 클로닝된 LOC_Os08g26230 유전자의 염기서열을 비교한 결과, 본 발명에서 클로닝된 LOC_Os08g26230 유전자에서 93 bp의 염기가 삽입된 것이 확인되었다(도 2). 이에 본 발명에서 클로닝된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 유전자를 LOC_Os08g26230 유전자 변이체로 명명하였다.
실시예 2. 클로닝된 LOC_ Os08g26230 유전자 변이체의 시공간 특이적 발현
벼 형질전환 식물체의 조직별·생육 시기에 따른 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현 수준을 분석한 결과, 뿌리(root), 줄기(stem) 및 잎집(leaf sheath)에 비해 잎(leaf)과 지엽(flag leaf)에서 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현이 비교적 높음을 확인하였고, 생육 시기(발아, germination stage; 3엽 단계, 3-leaf stage; 최고분얼기 단계, maximum tillering stage; 유수분화기, panicle initiation stage)에 따라 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현이 증가함을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 과발현 벼 형질전환체 개발
LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 전장 cDNA가 삽입된 과발현 재조합 벡터로 자포니카 벼 품종인 '동진'에 형질전환한 후, 재조합 벡터의 삽입 여부를 확인하기 위해 T0 형질전환체를 이용하여 삽입 유전자 및 HPT 마커를 대상으로 PCR 분석을 수행하여 LOC_Os08g26230 유전자 변이체가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(데이터 미제시). 또한, T0 형질전환체로부터 추출된 gDNA를 이용하여 삽입 유전자의 카피 수를 확인하기 위해 TaqMan qPCR을 진행하여, 단일카피(sigle copy) 수를 보유하는 LOC_Os08g26230-12, 20 및 23 계통을 선발하였다(도 4).
실시예 4. 벼 형질전환체의 흰잎마름병에 대한 저항성 검정
LOC_Os08g26230 유전자 변이체가 과발현된 벼 형질전환체(LOC_Os08g26230-12, 20 및 23)에 흰잎마름병원균 K2를 접종한 후, 8일, 12일 및 16일째에 각 식물체의 병변 길이(lesion length)를 측정하여 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 과발현이 흰잎마름병 저항성에 미치는 영향을 분석하였다.
그 결과, 접종 8일째의 경우 야생형 동진벼(흰잎마름병 감수성)와 모든 형질전환체의 병변 길이가 유사한 수준임을 확인하였다. 그러나 접종 12일째의 경우 야생형 동진벼의 병변 길이는 약 13 cm, 형질전환체의 병변 길이는 약 5.5~7.2 cm로 확인되었고, 접종 16일째의 경우 야생형 동진벼의 병변 길이는 약 19 cm, 과발현 형질전환체의 병변 길이는 약 7.2~9.8 cm로 확인되어, 야생형 동진벼가 LOC_Os08g26230 유전자 변이체 과발현 벼 형질전환체에 비해 흰잎마름병에 대한 손상 정도가 매우 심각한 수준임을 확인하였다. 반면, 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼는 다른 실험군과 비교하여 병변 길이가 가장 짧았다(도 5 및 도 6).
상기 결과를 통해, 본 발명의 LOC_Os08g26230 유전자 변이체가 식물체에서 과발현되면 흰잎마름병에 대한 저항성이 증가되는 것을 알 수 있었고, LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현 조절을 통해 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> LOC_Os08g26230 gene mutant for controlling disease resistance of plant and uses thereof <130> PN20175 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 543 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgggatcac gctactggtc gcttggttct ccacatgctg gcaccgaaga aaacaatcaa 60 gccacaggag ggatgaaatg gggtgatccc aggacacaag gctcgcctgc cagcttgcaa 120 ggatatagtg ggccgtcttc agtgcatcag cccatcagca gagaacccgc agcgggttta 180 atacggggag atcccagggc tcaaggcgca caaggatatg tgcatgagta ctgcaaacca 240 acagatcaga catacatata tatctagact aatgatttgt aatttgtata tacttgcact 300 ttgacacttc agggtgggcc gtctttactg catcagccca tcagcagaga accggcagcg 360 ggtttaatcc ggggagatcc caggactcaa ggcgctccca ttacacaagg ggctcccgat 420 tggggtaatg tgaagcagcc aaacagtact gaaggacagc cacgggatag gggttcaggc 480 cacccgccac gggcacgcgg agcaatatgg ggtgatccca gggatcaaga taagcgtgtc 540 taa 543 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggatccatgg gatcacgcta ctggtcgc 28 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctgcagttag acacgcttat cttgatccct gg 32

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 LOC_Os08g26230 유전자 변이체의 발현을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성을 증가시키는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 LOC_Os08g26230 유전자를 과발현시키는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제4항의 방법에 의해 제조된 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
  7. 삭제
  8. 제6항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
  9. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 LOC_Os08g26230 유전자 변이체를 유효성분으로 함유하는 식물체의 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성 증가용 조성물.
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