WO2022045638A1 - 락토바실러스 속 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 속 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물 Download PDF

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WO2022045638A1
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fermented
nest
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strain
sdcm
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박설웅
박상용
원경화
이근하
서슬아
고은별
황정승
임태준
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(주)에스디생명공학
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    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving skin condition comprising, as an active ingredient, a bird's nest ferment extract using a new strain of the genus Lactobacillus, and more specifically, having antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activities. It relates to a composition for improving skin condition.
  • vitamin C retinoic acid
  • TGF transforming growth factor
  • arbutin It is well known as a substance that inhibits tyrosinase enzyme activity, such as arbutin).
  • Proteoglycan a major component contained in swallow's nest, plays an important role in binding or supporting individual cells such as the entire body, skin, and organs, and has excellent skin regeneration effect, so it can play a major role in moisturizing the skin and improving skin aging. .
  • swallow's nest The collection of swallow's nest is conducted under strict supervision to the extent that only authorized collectors are allowed to collect it in the field, and the annual collection amount is also limited, and it is used as a very expensive material.
  • efficacy of the extract extracted from swallowtail nest antiviral action, whitening effect, etc. are known.
  • Patent Application No. 10-2015-0053874 'Functional cosmetic composition containing sea swallow's nest extract as an active ingredient' is Although it is disclosed that it is effective and can be used in a functional cosmetic composition, compared to using a combination of expensive raw materials, there is a disadvantage in that the effect is not sufficient and the economical efficiency is lowered.
  • Patent Publication No. 10-2018-0086062 'Composition for improving skin condition of acne skin containing sea swallow's nest complex extract as an active ingredient' developed by the inventors, and Patent Registration No.
  • Patent Document 1 KR 10-2018-0086062 (2018.07.30)
  • Patent Document 2 KR 10-1754645 (2017.06.30)
  • the main object of the present invention is to contain, as an active ingredient, a seabird's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain, which has excellent effects in antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and promoting regeneration of damaged skin. to provide a composition.
  • the present invention provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, as an active ingredient, a bird's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP), a new strain of the genus Lactobacillus.
  • the present inventors have made diligent research efforts to increase the usability of materials by further increasing the functionality for improving the skin condition of the expensive swallow's nest, and to increase the content of functional ingredients contained in the swallow's nest through bioconversion technology, various As a result of a study on fermentation using strains, when fermented with Vietnamese mushrooms (Kefir grain), the content of ⁇ -acetylneuraminic acid in the fermented bird's nest fermented extract increased by 31.9 times, and antioxidant and anti-inflammatory properties , blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activities were improved, and it was confirmed that there was an excellent effect in improving the skin condition.
  • the term "bird's nest” refers to a nest built by Collocalia fuciphaga, a type of sea swallow, and the nest is constructed by weaving seaweed and fish fins as main materials with secretions secreted from the salivary glands of the swallowtail. .
  • the geumsayeon makes a nest by secreting undigested food when it builds a nest on a coastal cliff.
  • the term "improving skin condition” indicates antioxidant activity, improves symptoms of inflammatory skin disease, reduces the total amount of melanin pigment to exhibit a whitening effect, replenishes moisture to the skin, and helps improve skin blood circulation , is used in the meaning of promoting the regeneration of skin tissue or skin cells.
  • Lactobacillus brevis SDCM 1105" of the present invention is a novel Lactobacillus brevis strain newly isolated and identified by the present inventors from Vietnamese mushrooms (Kefir grain), in the present specification "Lactobacillus SDCM 1105" or “SDCM 1105" is used as the same meaning as “ Lactobacillus brevis SDCM 1105", which is a new strain of the genus Lactobacillus.
  • extract refers to an extract obtained by extraction of sea Swallow's nest fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP), a diluted or concentrated solution of the extract, and a dried product obtained by drying the extract. , including extracts of all formulations that can be formed using the extract itself and the extract, such as a prepared or purified product of the extract, or a mixture thereof.
  • the extract of the present invention may be prepared and used in the form of a dry powder after extraction.
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it has antioxidant activity.
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it suppresses the production of nitric oxide (NO) and suppresses the expression of inflammatory cytokines IL-1 ⁇ and TNF- ⁇ genes.
  • NO nitric oxide
  • the fermented bird's nest ferment extract had an excellent effect on the inhibition of nitric oxide production (see FIG. 5 ), and concentration-dependently inhibited the production of LPS-induced IL-6 and TNF- ⁇ proteins. It could be confirmed that (see FIGS. 6 and 7).
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it exhibits skin moisturizing activity by promoting the synthesis of hyaluronic acid.
  • the amount of hyaluronic acid (Hyaluronan) production is increased in a concentration-dependent manner by the treatment of the swallow's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain, and in the 10% concentration range, the retinoic acid treatment was further increased than that of the positive control group. It was confirmed that the hyaluronic acid production promoting effect was shown (see FIG. 8 ).
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it promotes the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) factor to exhibit skin blood circulation improvement activity.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it exhibits skin whitening activity by inhibiting the production of melanin pigment.
  • the experimental group treated with the Swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain was 0.1%, 1%, and 10% at concentrations compared to the ⁇ -melanocyte stimulating hormone alone treatment group (Con). It was confirmed that the melanin production was inhibited by 7.73%, 27.26%, and 69.48%, respectively (see FIG. 10).
  • the cosmetic composition of the present invention is characterized in that it promotes skin regeneration.
  • skin regeneration was stimulated in a concentration-dependent manner in the NHDF cells treated with the swallow's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (see FIG. 11 ).
  • the cosmetic composition of the present invention is harmless to the human body by using a fermented extract obtained by fermenting edible swallow's nest as a lactic acid bacteria material derived from edible Vietnamese mushrooms (Kefir grain), and does not impair the quality of cosmetic materials due to its addition Therefore, it is suitable for use in a cosmetic composition.
  • a fermented extract obtained by fermenting edible swallow's nest as a lactic acid bacteria material derived from edible Vietnamese mushrooms (Kefir grain)
  • it is suitable for use in a cosmetic composition.
  • it since it has functions related to antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activity, it is preferably included in a functional cosmetic composition.
  • the cosmetic composition of the present invention includes skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, hand cream, foundation, essence, nourishing essence, mask pack, It may be prepared in any one formulation selected from soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers to be formulated in general skin cosmetics, and common ingredients include, for example, oil, water, surfactant, humectant, lower alcohol, and thickener. , a chelating agent, a colorant, a preservative, a fragrance, and the like may be appropriately mixed, but the present invention is not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the formulation of the cosmetic composition.
  • the formulation of the present invention is an ointment, paste, cream or gel
  • a carrier component animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, etc. may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder, etc. may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additional chlorofluorohard propellants such as, but not limited to, locarbon, propane/butane or dimethyl ether. These may be used alone or in combination of two or more.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier may be used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, Propylene glycol, 1,3-butylglycol oil, etc. can be used, and in particular, cottonseed oil, peanut oil, corn germ oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic ester, fatty acid ester of polyethylene glycol or sorbitan may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters
  • Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth may be used, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • alkali metal salts of fatty acids When the formulation of the present invention is soap, alkali metal salts of fatty acids, fatty acid hemiester salts, fatty acid protein hydrolysates, isethionate, lanolin derivatives, aliphatic alcohols, vegetable oils, glycerol, sugar, etc. are used as carrier components may be, but is not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) fermented sea Swallow's nest extract is specifically, by dry weight, 0.0001% to 50% by weight of the total weight of the cosmetic composition. And, more specifically, it may be included in an amount of 0.0005 wt% to 10 wt%.
  • there is an advantage of exhibiting excellent efficacy for antioxidant, anti-inflammatory, skin wrinkle and blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activity there is an advantage in that the formulation of the composition is stabilized.
  • the present invention provides a food composition containing, as an active ingredient, a sea swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP).
  • the seabird's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) of the present invention exhibits excellent effects on antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration, and thus a food composition for improving skin condition can be usefully used as
  • the effect on the anti-oxidation, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration of the sea swallow's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) of the present invention is as described above.
  • the food composition may be used in the form of a health functional food, but is not limited thereto.
  • the food composition of the present invention may be included in the form of a swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP), and their processed products.
  • the composition may include a food pharmaceutically acceptable food additive in addition to the active ingredient.
  • food supplementary additive refers to a component that can be supplementally added to food, and is added to the manufacture of health functional food of each formulation, and those skilled in the art can appropriately select and use it.
  • food supplement additives include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavoring agents and flavoring agents such as natural flavoring agents, coloring agents and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjuster, stabilizer, preservative, glycerin, alcohol, carbonation agent used in carbonated beverages, etc., but the above examples are not limited to the type of the food additive of the present invention.
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • health functional food refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. using raw materials or ingredients useful for the human body.
  • functionality refers to obtaining useful effects for health purposes, such as regulating nutrients or physiological actions with respect to the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and at the time of manufacture, it can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food is also recognized as a health functional food, it may be manufactured without limitation.
  • the food composition of the present invention can be prepared in various forms, and unlike general drugs, it uses edible lactic acid bacteria and edible sea swallow's nest as raw materials, and has the advantage that there are no side effects that may occur when taking food for a long period of time, and it is portable. It is excellent and can be taken as a supplement to enhance the effects on antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activities.
  • the health functional food of the present invention can take, and it may include all foods in a conventional sense, and may be used in combination with terms known in the art, such as functional food.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by mixing known additives with other suitable auxiliary ingredients that may be included in food according to the selection of those skilled in the art. Examples of foods that can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, and There are vitamin complexes, and the like, and it can be prepared by adding to juice, tea, jelly, juice, etc. prepared mainly by using the swallow's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) according to the present invention. Also included are foods used as feed for animals.
  • the present invention provides a composition for improving skin condition comprising, as an active ingredient, a fermented sea bird's nest ferment extract using a new strain of Lactobacillus brevis.
  • the fermented bird's nest ferment extract of the present invention has an increased content of ⁇ -acetylneuraminic acid, and has improved antioxidant, anti-inflammatory, blood circulation improvement, moisturizing, whitening, and skin regeneration activity, which is excellent for improving skin condition. As it is effective, it can be usefully used in cosmetics and food fields.
  • composition of the present invention is not only very safe for the human body, but also has excellent stability.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of high-performance liquid chromatography analysis of a bird's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP).
  • Figure 2 shows the cell viability of human keratinocytes (HaCaT), skin fibroblasts (HDF) and mouse melanoma cells (B16F10) according to the fermented sea swallow's nest extract treatment with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP); It is a graph showing the measurement.
  • HaCaT human keratinocytes
  • HDF skin fibroblasts
  • B16F10 mouse melanoma cells
  • Figure 3 is a graph showing the measurement of the antioxidant activity change according to the treatment of the sea swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP).
  • FIG. 4 is a graph showing the cytoprotective effect measured by MTT assay after treatment of a swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) to RAW 264.7 cells.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in NO production after treatment with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) fermented sea bird's nest extract to RAW 264.7 cells.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in the expression level of IL-1 ⁇ protein measured by ELISA method after treatment with a swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) to RAW 264.7 cells.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in the expression level of TNF- ⁇ protein measured by ELISA after processing RAW 264.7 cells with a bird's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP).
  • FIG. 8 shows human keratinocytes (HaCaT) with fermented sea swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP), followed by measuring the change in the amount of hyaluronan synthesis by ELISA. This is the graph shown.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in the expression level of VEGF factors measured by the ELISA method after treatment of a sea Swallow's nest extract fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) to human keratinocytes (HaCaT); am.
  • FIG. 10 is a graph showing changes in melanin production after treatment with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP) fermented sea swallow's nest extract in mouse melanoma cells (B16F10) cells.
  • NHDF cells fermented with Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain (Accession No. KCTC 14200BP), after treatment with NHDF cells, MTT (methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) analysis method and deep quick stain (Diff quic stain) is the result of measuring the skin regeneration activity using the method.
  • MTT methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide
  • Diff quic stain deep quick stain
  • Each of the fermented bird's nest extract and the unfermented sea swallow's nest extract was diluted 10-fold and dissolved in a mobile phase solvent, then injected in a volume of 3uL and measured at a flow rate of 0.4ml/min (see FIG. 1 ).
  • ⁇ -acetylneuraminic acid N-Acetylneuraminic acid, Neu5Ac, formula C 11 H 19 NO 9, It was measured that the content of CAS NO.: 131-148-6) increased by 31.9 times.
  • HaCaT human keratinocytes
  • HDF dermal fibroblasts
  • B16F10 mouse melanoma cells
  • MTT Methyl thiazol tetrazolium
  • MTT Methyl thiazol tetrazolium
  • the three types of cells were cultured in the presence of 5% CO 2 and 95% O 2 at 37° C. for 3 hours to induce a reduction reaction.
  • the substrate-containing medium was removed and 500 ⁇ l of DMSO was added to each well to dissolve the formazan crystals.
  • the plate was shaken with an orbital shaker at room temperature for 30 minutes. Absorption of 100 ⁇ L aliquots was quantified by measuring absorption at 595 nm using a microplate reader (Molecular Devices E09090; San Francisco, CA, USA).
  • the relative cell viability (%) was calculated based on the 100% viability of the untreated group in which only cells were cultured without treatment of the specimen. In addition, all experiments were repeated three times.
  • the cytoprotective effect was confirmed by the effect of the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain fermented bird's nest extract on the growth of RAW 264.7 cells, the LPS-treated macrophage cell line, as follows.
  • RAW 264.7 cells a macrophage cell line
  • KTCC Korea Cell Line Bank
  • FBS penicillin
  • FBS Fetal bovine serum
  • the RAW 264.7 cells were inoculated into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mL (in DMEM), and after 24 hours incubation, the seabird nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain prepared in Example 1 was used. Samples diluted to 0.1, 1, and 10% (v/v) concentrations, respectively, and a fresh medium containing LPS (1 ⁇ g/mL), known as endotoxin, were simultaneously treated and cultured for 24 hours. Thereafter, the concentration of the MTT reagent was treated to be 0.1 mg/mL, and 3 hours later, formazan generated by MTT treatment was dissolved in DMSO in the cells to measure the absorbance at 595 nm. For the comparative experiment, 1 ⁇ g/mL of dexamethasone treated group was used as a positive control group. In addition, all experiments were repeated three times.
  • NO nitric oxide
  • RAW 264.7 cells a macrophage cell line
  • KTCC Korea Cell Line Bank
  • FBS FBS
  • 100 ⁇ g/ The cells were inoculated into a medium supplemented with mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin, and cultured at 37° C., 5% CO 2 conditions.
  • the RAW 264.7 cells were inoculated into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mL (in DMEM) and cultured for 24 hours, followed by fermentation with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain prepared in Example 1-2.
  • the positive control group reduced nitric oxide production by 33.76%
  • the fermented bird's nest extract (Hotwater BN) treated group showed a decrease in nitric oxide production at 0.1% and 1% concentrations, respectively. decreased by 7.13% and 9.8%.
  • the fermented bird's nest ferment extract of the present invention exhibited an excellent effect in inhibiting nitric oxide production (see FIG. 5 ).
  • RAW 264.7 cells were inoculated into a 24 well cell culture dish at a concentration of 1 ⁇ 10 5 cells/mL in DMEM (Dulbeccos modified Eagles medium) medium, which is a dedicated medium containing 10% FBS (fetal bovine serum), and then at 37°C. , 5% CO 2 Incubated for 24 hours under humid conditions. Thereafter, the medium was removed and the seabird's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain diluted with serum-free DMEM medium and the unfermented seabird's nest extract were prepared by concentration (0.1%, 1%, and 10%). The diluted sample and 1 mL of medium containing LPS (1 ⁇ g/mL) known as endotoxin were treated and cultured for 24 hours.
  • DMEM Dynabeccos modified Eagles medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the sea bird's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain has a remarkable effect in inhibiting the production of inflammatory mediators, IL-6 and TNF- ⁇ , compared to the non-fermented sea bird's nest extract, It was confirmed that it effectively blocks the inflammatory reaction and effectively improves the condition of the inflamed skin.
  • Hyaluronic acid (HA, Hyaluronan, Hyaluronic acid) is mainly synthesized by epidermal keratinocytes and dermal fibroblasts, and is a substance that plays an important role in creating an environment in which cells can function normally by combining with water.
  • a decrease in hyaluronic acid in the skin is one of the direct causes of a decrease in skin elasticity and a decrease in moisture content. Therefore, in this experimental example, the amount of hyaluronic acid produced in human keratinocytes was confirmed.
  • human keratinocytes were placed in 1 mL of a culture medium in a 24-well cell culture dish and inoculated at a concentration of about 1 ⁇ 10 5 cells/mL, and then cultured at 37° C., 5% CO 2 environment for 24 hours. Thereafter, a medium containing a bird's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain prepared in Example 1-2 and a bird's nest extract that was not fermented (0.1, 1, and 10% (v/v), respectively) was replaced and cultured for 24 hours.
  • Hyaluronan kit R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA
  • Hyaluronan kit R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA
  • a normal control group NaC and a sample untreated group
  • Veh 10% DW (solvent) + 90% DMEM medium
  • RA retinoic acid
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HaCaT human keratinocytes
  • VEGF antibody Human VEGF kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA
  • VEGF antibody Human VEGF kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA
  • the expression of VEGF factor was reduced in the scratch-only treatment group (Con) compared to the untreated normal control group (Nor), and even in the group treated with the sea swallow chip extract that was not fermented, the VEGF factor A pattern of overall decrease in expression was observed.
  • the fermented bird's nest extract increased the expression of the VEGF factor in a concentration-dependent manner, 0.1%, 1% compared to the control group (Con) with only scratch , and at 10% concentration, it was observed that the expression of VEGF factor increased by 21.95%, 107.59%, and 431.95%, respectively.
  • the fermented bird's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain of the present invention can be effectively used to improve skin blood circulation by promoting the expression of VEGF factors that promote blood vessel formation and increase microvascular permeability. was able to confirm
  • the swallowtail extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain of the present invention produced melanin pigment at 0.1%, 1%, and 10% concentrations, respectively. 7.73%, 27.26%, and 69.48% inhibition was observed, and it was confirmed that the 10% concentration treatment group had a better melanin production inhibitory effect than the positive control group (50.18% reduction in the arbutin treatment group).
  • the skin wound regeneration activity was evaluated according to the treatment of the swallow's nest extract fermented with the Lactobacillus brevis SDCM 1105 strain of the present invention.
  • NHDF normal human dermal fibroblast

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 브레비스 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바다제비집 발효 추출물은 Ν-아세틸뉴라민산의 함량이 증가하고, 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생의 활성이 개선되어, 피부상태를 개선하는데 뛰어난 효과가 있으므로 화장품과 식품 분야에서 유용하게 이용 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.

Description

락토바실러스 속 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물
본 발명은 락토바실러스 속 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생 활성을 갖는 피부상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다. 지금까지 수많은 생리 활성 물질에 관해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 미생물, 식물, 또는 동물체 등에서 분리된 생리 활성을 갖는 물질에 관한 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다.
종래 개발된 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF) 등은 피부 주름 개선, 미백, 항산화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 미백 성분으로는 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소 활성을 억제하는 물질로 잘 알려져 있다.
또한, 최근에는 천연물 등으로부터 얻은 생리 활성 물질을 화장료에 도입하여 피부 자체의 고유 방어 기능을 더욱 강화함으로써 피부에 작용하는 기능성을 증가시키는 화장품의 개발이 활발하게 진행되는 추세이다.
따라서, 생체에 안전하고, 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 피부 미백, 항산화, 보습, 및 피부 재생 효과가 있는 물질보다 효과가 더욱 우수한 천연소재의 개발이 절실히 요망되고 있다.
한편, 본초강목에는 바다제비집이 “피부를 윤택하게 하며 혈액에 유익해서 생기가 나게 한다.”라고 소개되고 있다. 또한, 제비집은 보양효과에 탁월하며, 중국의 황태후는 자신의 미용과 젊음을 유지하기 위해 바다제비집과 진주가루를 섞어 피부 미용에 사용하기도 하였다. 제비집에는 피부에 자양분을 주는 단백질이 함유되어 있어 건조한 피부를 더욱 부드럽게 가꾸어주며, 지친 피부에 탄력을 주는 비타민 C, 비타민 E, 알부틴, 콜라겐이 함유되어 있다. 제비집 속에 함유된 주요 성분인 프로테오글리칸(proteoglycan)은 몸 전체, 피부, 장기 등 각각의 세포를 결합하거나 지탱하는데 중요한 역할을 하고, 피부 재생 효과가 뛰어나서 피부 보습과 동시에 피부 노화 개선에 주요한 역할을 할 수 있다.
바다제비집의 채취는 현지에서도 허가받은 채취인에게만 채취를 허용할 만큼 엄중한 감시 아래 수행되며 연간 채취량도 제한되며, 매우 고가의 재료로 사용되고 있다. 바다제비집으로부터 추출한 추출물의 효능과 관련하여, 항바이러스 작용, 미백효과 등이 알려져 있다.
또한, 바다제비집과 관련한 종래 기술로, 특허출원 제10-2015-0053874호 ‘바다제비집 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물’은 바다제비집, 해삼추출물 및 캐비어 추출물이 피부 미백, 주름 개선 등의 효과가 있어 기능성 화장료 조성물에 사용될 수 있음을 개시하고 있으나, 고가의 원료들을 조합하여 사용하는데 비해 그 효과가 충분하지 않아 경제성이 떨어지는 문제가 발생하는 단점이 있었다. 또한, 발명자들에 의해 개발된 특허공개 제10-2018-0086062호 ‘바다제비집 복합 추출물을 유효성분으로 함유하는 여드름 피부의 피부 상태 개선용 조성물’과, 특허등록 제10-1754645호 ‘바다제비집 복합 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부주름 개선용 조성물, 이를 이용한 피부주름 개선용 패치, 및 마스크 팩’ 기술이 공개되어 있다. 그러나, 아직까지 고가의 바다제비집을 화장품이나 식품의 원료로 사용하는데 있어서 경제적인 문제로 소량 사용하는데 그치고 있으며, 이로 인해 기능적 효과도 충분치 않는 문제가 발생하는 단점이 있었다.
이러한 배경 아래서, 본 발명자들은 고가의 기능성 소재인 바다제비집의 기능성을 개선하여 그 활용 가치를 높이기 위해 예의 연구노력한 결과, 티베트버섯(Kefir grain)으로 발효시킨 바다제비집 추출물이 발효 과정을 통해 Ν-아세틸뉴라민산의 함량이 31.9배 가량 증가하고, 항산화, 항염증, 및 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생 활성을 획기적으로 증가하여, 피부상태를 개선시키는데 뛰어난 효과가 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
[선행특허기술문헌]
(특허문헌 1) KR 10-2018-0086062 (2018.07.30)
(특허문헌 2) KR 10-1754645 (2017.06.30)
따라서, 본 발명의 주된 목적은 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 손상된 피부의 재생 촉진에 뛰어난 효과가 있는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 속 신균주인 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 고가인 바다제비집의 피부 상태 개선에 대한 기능성을 더욱 증대시켜 소재의 활용성을 증대시키기 위해 예의 연구노력하였고, 생체전환 기술을 통해 바다제비집이 함유한 기능성 성분들의 함량을 증진시키기 위해 다양한 균주들을 이용하여 발효처리하는 연구를 수행한 결과, 티베트버섯(Kefir grain)으로 바다제비집을 발효시키는 경우 바다제비집 발효 추출물의 Ν-아세틸뉴라민산의 함량이 31.9배 가량 증가하고, 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생의 활성이 개선되어, 피부상태를 개선하는데 뛰어난 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어 "바다제비집"은 바다제비의 일종인 금사연(Collocalia fuciphaga)이 지은 둥지를 의미하며, 상기 바다제비집은 해초와 생선 지느러미 등을 주재료로 금사연이 침샘에서 분비한 분비물로 엮어서 지어지게 된다. 상기 금사연은 해안 절벽 위에 둥지를 트는데 아직 소화되지 않은 음식물을 분비해 둥지를 만들고, 이때의 제비집은 새하얗게 빛이 나기 때문에 백연으로도 불린다.
본 발명에서 용어, "피부 상태 개선"은 항산화 활성을 나타내고, 염증성 피부 질환 증상을 개선시키며, 멜라닌 색소 총량을 감소시켜 미백 효과를 나타내고, 피부에 수분을 보충해주며, 피부 혈행개선에 도움을 주고, 피부조직 또는 피부세포의 재생을 촉진하는 것을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 용어 "락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SDCM 1105"는 티베트버섯(Kefir grain)에서 본 발명자들에 의해 새롭게 분리 동정된 신규한 락토바실러스 브레비스 균주로, 본 명세서에서 "락토바실러스 SDCM 1105" 또는 "SDCM 1105"는 락토바실러스 속 신균주인 "락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SDCM 1105"와 같은 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "추출물"은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집의 추출 처리에 따라 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물이 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가되는 것을 확인한 바 있으며, 대조군인 아스코르브산과 비교하여도 동등 이상의 우수한 항산화능을 나타내는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 TNF-α 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 바다제비집 발효추출물이 산화질소 생성 억제에 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인할 수 있었고(도 5 참조), LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α 단백질의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 히알루론산 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 처리로 히알루론산(Hyaluronan) 생성량이 농도 의존적으로 증가하며, 10% 농도 구간에서는 레티노산 처리 양성대조군 보다 더욱 증가된 히알루론산 생성 촉진 효과를 나타내는 것을 확인한 바 있다(도 8 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 VEGF(vascular endothelial growth factor) 인자의 발현을 촉진하여 피부 혈행 개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 처리한 실험군은 스크레치만 낸 대조군(Con)과 비교하여 0.1%, 1%, 및 10% 농도에서 VEGF 인자의 발현이 각각 21.95%, 107.59%, 및 431.95% 증가하는 것을 확인한 바 있다(도 9 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 멜라닌 색소의 생성을 억제하여 피부미백 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 처리한 실험군은 α-멜라닌세포자극 호르몬 단독 처리군(Con)에 비해 0.1%, 1%, 및 10% 농도에서 멜라닌 색소 생성을 각각 7.73%, 27.26%, 및 69.48% 억제하는 것을 확인한 바 있다(도 10 참조).
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생을 촉진하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물이 처리된 NHDF 세포에서 피부 재생이 농도 의존적으로 촉진되는 것을 확인할 수 있었다(도 11 참조).
본 발명의 화장료 조성물은 식용 가능한 티베트버섯(Kefir grain)에서 유래한 유산균 소재로 식용 가능한 바다제비집을 발효시킨 발효 추출물을 사용하여 인체에 해가 없으며, 그 첨가로 인해 화장품의 물질의 품질을 손상하지 않으므로 화장료 조성물에 포함되어 사용되는데 적합하다. 특히, 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생 활성와 관련된 기능이 있으므로, 기능성 화장료 조성물에 포함되어 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 마스크팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면 활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 화장료 조성물의 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 등이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제 등이 이용될 수 있으며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일 등이 이용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 구체적으로는 건조 중량으로, 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 항산화, 항염증, 피부 주름 및 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생 활성에 대한 우수한 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생에 우수한 효과를 나타내어 피부 상태 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물과 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생에 대한 효과는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물과, 이들의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품 보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품 보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품 보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식용 유산균과 식용 바다제비집을 원료로 하여 식품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생 활성에 대한 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 락토바실러스 브레비스 신균주를 이용한 바다제비집 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 바다제비집 발효 추출물은 Ν-아세틸뉴라민산의 함량이 증가하고, 항산화, 항염증, 혈행 개선, 보습, 미백, 및 피부 재생의 활성이 개선되어, 피부상태를 개선하는데 뛰어난 효과가 있으므로 화장품과 식품 분야에서 유용하게 이용 가능하다.
(3) 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
도 1은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 고속 액체크로마토그래피 분석 결과 그래프이다.
도 2는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물 처리에 따른 인간각질형성세포(HaCaT), 피부섬유아세포(HDF) 및 마우스흑색종세포(B16F10)의 세포생존능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물 처리에 따른 항산화 활성 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후, MTT assay를 통해 세포 보호 효과를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후, NO 생성량의 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후, ELISA 방법에 의해 IL-1β 단백질의 발현량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 RAW 264.7 세포에 처리한 후, ELISA 방법에 의해 TNF-α 단백질의 발현량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 인간각질형성세포(HaCaT)에 처리한 후, ELISA 방법에 의해 히알루론산(Hyaluronan) 합성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 인간각질형성세포(HaCaT)에 처리한 후, ELISA 방법에 의해 VEGF 인자의 발현량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 마우스흑색종세포(B16F10) 세포에 처리한 후, 멜라닌 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 NHDF 세포에 처리한 후, MTT(methylthiazole-2-yl-2.5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석 방법과 디프 퀵 스테인(Diff quic stain) 방법을 이용하여 피부 재생 활성을 측정하여 나타낸 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 유산균 발효 바다제비집 추출물의 제조
1-1. 균주 분리 동정
티베트버섯(Kefir grain) 1g을 정량하고, 0.85% NaCl 9mL를 넣어 완전히 섞어 희석한 후, BCP 고체 배지에 도말한 후, 37℃에서 1 내지 3일 배양하였다. 배양 후 노랗게 변한 단일 콜로니를 분리하여 MRS(OXOID, UK) 배지에 같은 배양 조건으로 배양하였다.
배양한 균주의 분자생물학적 동정을 위해 518F 프라이머와 805R 프라이머를 사용하여 16S rRNA 시퀀싱을 수행하였고, 서열분석하였다. NCBI GeneBank 데이터베이스에 등록된 균주들의 16S rRNA 염기서열과 상동성을 알아본 결과, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) ATCC14869 균주와 99.52%의 유사성을 보인 것으로 나타났으며, 상기 분리 유산균은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) SDCM 1105 균주로 명명하였고, 2020년 6월 3일자로 한국생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14200BP를 부여받았다.
1-2. 유산균 발효 바다제비집 추출물의 제조
바다제비집 원물 100g에 20배수의 멸균된 증류수를 넣고, 멸균된 MRS 배지 5.2%(w/v) 농도로 추가하였다. 이렇게 제조된 시료에 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주를 1%(v/v) 농도로 접종하여 37℃, 24시간 배양한 후, 상기 균주를 가열하여 실활시켰다. 이후, 배지를 원심분리하여 상층액을 모은 후, 0.45um 필터로 여과하고, 감압농축기로 농축하여 바다제비집 추출물을 제조하였다(제조예).
바다제비집 원물 100g에 20배수의 멸균된 증류수를 넣고, 발효과정을 거치지 않고, 80℃에서 3시간 추출하였다. 이렇게 추출된 추출액을 원심분리한 후, 상층액을 0.45um 필터로 여과하고, 감압농축기로 농축하여 바다제비집 추출물(비교예)을 제조하였다.
실시예 2. 균주 발효에 따른 바다제비집 추출물의 성분 변화
상기 실시예 1-2에서 준비한 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주 발효 바다제비집과 발효처리 하지 않은 바다제비집의 지표 성분 함량을 비교하기 위하여 고속 액체크로마토그래피 분석을 수행하였다.
고속 액체크로마토그래피 분석은 ACQUITY UPLC I-Class(Waters, Xevo TQ-S micro with ESI probe MassLynx™ software, version 4.1) 기기를 사용하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Unison UK-Amino(Imtakt, 100x2.1mm, 3μm)를 이용하였으며, 컬럼 온도는 30℃로 하였다. 이동상은 0.1% 포름산이 포함된 물과 아세토나이트릴(gradient mode)[A:B=Water:ACN(Gradient, 17min, 0.1% F.A.)]을 사용하였다. 발효 바다제비집 추출물과 발효되지 않은 바다제비집 추출물 각각 10배로 희석하여 이동상 용매에 용해한 후, 3uL 부피로 주입하고 유속 0.4ml/min으로 측정하였다(도 1 참조).
[표 1]
Figure PCTKR2021010531-appb-I000001
측정 결과, 발효되지 않은 바다제비집 추출물에 비해 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 본 발명의 바다제비집 추출물에서 Ν-아세틸뉴라민산(N-Acetylneuraminic acid, Neu5Ac, 화학식 C11H19NO9, CAS NO.: 131-48-6)의 함량이 31.9배 가량 증가한 것으로 측정되었다.
실시예 3. 바다제비집 발효 추출물의 세포 독성 평가
실시예 1에서 준비한 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 인간각질형성세포(HaCaT), 피부섬유아세포(HDF) 및 마우스흑색종세포(B16F10)에 대한 세포 독성을 시험하였다.
세포독성은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 비색정량분석법(colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. MTT(Methyl thiazol tetrazolium) 분석은 세포 생존 능력을 측정하기 위해 사용되는 것으로, MTT가 보라색을 생성하는 포마잔 염색으로 바꾸는 것이다. 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물(시험예)과 발효 처리하지 않은 바다제비집 추출물(비교예)을 농도별로 첨가하여 각 세포들을 24~72시간 동안 배양하였고, MTT의 농도가 0.1mg.mL이 되도록 각 well에 첨가하였다. 이후, 상기 3종 세포를 37℃에서 3시간 동안 5%의 CO2 및 95%의 O2 존재 하에 배양하여 환원반응을 유도하였다. 기질-함유 배지는 제거되었고, 포마잔 결정을 용해하기 위해 500㎕의 DMSO를 각 well에 첨가하였다. 또한, 상온에서 30분 동안 오비탈 셰이커로 플레이트를 흔들었다. 100μL의 부분 표본의 흡수율은 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices E09090; 샌프란시스코, CA, 미국)를 사용하여 595㎚에서 흡수율을 측정함으로써 정량화하였다. 세포독성은 검체를 처리하지 않고 세포만 배양한 무처리군의 100% 생존율을 기준으로 상대적인 세포생존도(cell viability, %)를 계산하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 처리는 인간각질형성세포(HaCaT), 피부섬유아세포(HDF) 및 마우스흑색종세포(B16F10)의 3종 세포에 독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 인체에 독성을 나타내지 않아 안전하세 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 바다제비집 발효 추출물의 항산화 활성
DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma, USA)의 환원력을 이용하는 상 등의 문헌(Sang S et al., J.Agric. Food Chem. 50(8), p2459-2463, 2002)에 기재된 방법에 따라, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 항산화 활성을 측정하였다. DPPH는 항산화 활성이 있는 물질과 반응하면 라디칼이 소거되어 짙은 자색으로 탈색되기 때문에, 흡광도 측정을 통하여 항산화 물질의 수소 공여능을 측정하는데 널리 이용되고 있다.
메탄올에 녹인 0.2mM DPPH 용액 160μL와 증류수 40μL에 녹인 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물(시험예) 및 발효처리 하지 않은 바다제비집 추출물(비교예)을 각각 0.1, 1, 및 10%(v/v) 농도로 96-웰 마이크로플레이트에 넣고 37℃에서 30분간 배양한 후, 환원된 DPPH의 양을 분광 광도계(Molecular Devices FilterMax F5; San Francisco, CA, USA)를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 항산화 활성을 비교하였다. 비교실험을 위해 아스코르브산(ascorbic acid)을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
측정 결과, 발효처리 하지 않은 바다제비집 추출물의 항산화 활성은 미약한 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 것으로 나타났으며, 대조군인 아스코르브산과 비교하여도 동등 이상의 우수한 항산화능을 나타내는 것으로 관찰되었다(도 3 참조).
실시예 5. 바다제비집 발효 추출물의 항염증 활성
5-1. 세포 보호 효과
락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물이 LPS 처리된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 생장에 미치는 영향을 통해 세포 보호 효과를 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS, 100μg/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기 RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL의 농도(in DMEM)로 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, 실시예 1에서 제조된 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 각각 0.1, 1, 및 10%(v/v) 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, MTT 시약의 농도가 0.1 mg/mL이 되도록 처리하고 3시간 후, 세포에 MTT 처리로 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 595nm에서 흡광도를 측정하였다. 비교실험을 위해 덱사메타손(Dexamethasone) 1μg/mL 처리군을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 4를 참조하면, 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물 처리군 모두에서 발효처리하지 않은 바다제비집 추출물에 비해 세포 보호 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다. 또한, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 덱사메타손을 처리한 양성대조군에 비해 세포 보호 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다.
5-2. 산화질소 생성 억제능
락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해, 염증 유발에 관여하는 대표적인 세포 독성물질인 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 억제율을 측정하였다.
먼저, 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS, 100μg/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
구체적으로, 상기 RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL의 농도(in DMEM)로 96 웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, 실시예 1-2에서 제조된 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 각각 0.1, 1, 및 10%(v/v) 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/mL)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양 상등액 100μL와 Griess reagent[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphtylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 100μL를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시키고, ELISA 리더를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 산화질소의 양을 측정하였다. 생성된 아질산염(nitrite)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite)을 DMEM 배지에 용해한 표준 곡선을 이용하여 계산하였다. LPS를 처리한 대조군과 LPS를 처리하지 않은 대조군에서 생성된 아질산염의 생성량 차이를 기준으로 각 시료의 일산화질소 생성 저해 활성을 확인하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 5를 참조하면, 발효처리 하지 않은 바다제비집 추출물에 비해 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 산화질소 생성 억제 효과가 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, LPS(1μL/mL) 처리군 대비 양성대조군은 산화질소 생성이 33.76% 감소하였고, 발효 처리하지 않은 바다제비집 추출물(Hotwater BN) 처리군은 각각 0.1% 및 1% 농도에서 산화질소 생성량이 7.13% 및 9.8% 감소하였다. 이에 반해 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물 처리군은 0.1%, 1% 및 10% 농도에서 산화질소 생성량이 각각 8.58%, 12.62%, 및 30.23% 감소하는 것으로 관찰되었고, 본 발명의 바다제비집 발효추출물이 산화질소 생성 억제에 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인할 수 있었다(도 5 참조).
5-3. 염증 유발인자의 발현 억제
염증 유발 인자인 IL-1β 및 TNF-α 유전자의 발현 조절과 관련하여 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 효과를 검증하였다.
우선, 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 전용 배지인 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에 RAW 264.7 세포를 24 well 세포 배양 접시에 1×105 cells/mL 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 습윤 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 무혈청 DMEM 배지로 희석한 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물과, 발효처리 하지 않은 바다제비집 추출물을 농도별(0.1%, 1%, 및 10%)로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/mL)를 함유한 배지 1mL를 처리하여 24시간 배양하였다.
배양이 끝나고, 상등액을 취하여 7,500rpm, 5min, 4℃ 조건에서 원심분리한 후, IL-6 및 TNF-α 항체(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 ELISA 방법으로 IL-6 및 TNF-α 단백질의 발현량 변화를 확인하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 6 및 도 7을 참조하면, 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 LPS로 유도된 IL-6 및 TNF-α 단백질의 생성을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과를 통해, 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 발효 처리되지 않은 바다제비집 추출물에 비해 염증매개 물질인 IL-6 및 TNF-α의 생성 억제에 현저한 효과가 있으며, 염증반응을 효과적으로 차단하여 염증성 피부의 상태개선에 효과적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 피부 보습 활성
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 피부 보습 효과를 검증하기 위해 히알루론산(Hyaluronan) 합성 촉진에 미치는 영향을 실험하였다.
히알루론산(HA, Hyaluronan, Hyaluronic acid)은 주로 표피 각질형성세포와 진피 섬유아세포에 의해 합성되며, 수분과 결합하여 세포가 정상적으로 활동할 수 있는 환경을 조성하는 중요한 역할을 하는 물질이다. 피부에서 히알루론산의 감소는 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나이다. 따라서 본 실험예에서는 인간각질형성세포 내에서 히알루론산의 생성량을 확인하였다.
먼저, 인간각질형성세포를 24 well 세포배양 접시에 1mL의 배양액을 넣고 약 1×105 cells/mL의 농도로 세포를 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1-2에서 제조한 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물과 발효 처리하지 않은 바다제비집 추출물(각각 0.1, 1, 및 10%(v/v))을 포함한 배지로 교체하여 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)한 뒤, ELISA 방법을 이용하여 Hyaluronan(Hyaluronan kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 발현량을 확인하였다. 비교실험을 위해, 정상대조군(Nor, 100% DMEM)과 시료 무처리군(Veh, 10% DW(용매)+90% DMEM 배지)을 사용하였고, 레티노산(RA, retinoic acid) 처리군을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 8을 참조하면, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 처리한 시험군에서는 히알루론산(Hyaluronan)의 생성량이 농도 의존적으로 증가하는 양상을 확인하였고, 시료 무처리군에 비해 0.1, 1, 및 10% 농도에서 히알루론산의 생성량이 각각 16.52%, 98.17%, 및 251.24% 증가한 것으로 관찰되었다. 또한, 발효 처리된 바다제비집 추출물을 10% 농도로 처리한 시험군에서는 레티노산 처리군 보다 더욱 증가된 히알루론산 생성량(192.31% 증가)이 측정되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 피부 세포에서 히알루론산 생성을 효과적으로 증가시켜 피부 보습과 관련된 용도로 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 피부 혈행 개선 활성
혈행 개선 인자인 VEGF(vascular endothelial growth factor) 인자의 발현 조절과 관련하여 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 효과를 검증하였다.
먼저, 24 well 세포배양 접시에 1 mL 용량의 DMEM 배양액을 넣고, 인간각질형성세포(HaCaT) 세포를 약 1.2x105 cells/mL 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 실시예 1-2에서 제조된 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 0.1, 1, 및 10%(v/v) 농도로 희석한 시료를 포함한 배지로 교체하여 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)하고, VEGF 항체(Human VEGF kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 ELISA 방법으로 VEGF 단백질의 발현량 변화를 확인하였다. 이때, 무처리 정상대조군(Nor)을 제외한 모든 군은 스크레치를 낸 후 시료를 처리하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 9를 참조하면, 스크레치만 낸 처리군(Con)에서는 무처리 정상대조군(Nor)에 비해 VEGF 인자의 발현이 감소하였고, 발효 처리하지 않은 바다제비칩 추출물을 처리한 군에서도 VEGF 인자의 발현이 전체적으로 감소하는 양상이 관찰되었다. 이와 달리, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 처리한 실험군에서는 농도 의존적으로 VEGF 인자의 발현이 증가하였으며, 스크레치만 낸 대조군(Con)과 비교하여 0.1%, 1%, 및 10% 농도에서 VEGF 인자의 발현이 각각 21.95%, 107.59%, 및 431.95% 증가한 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 혈관 형성을 촉진하고 미세 혈관 투과성을 증가시키는 VEGF 인자의 발현 촉진을 통해 피부 혈행 개선에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 피부 미백 활성
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 미백효과를 검증하기 위해, 선행문헌(Hosoi et al., 1985)에 보고된 방법을 수정하여 멜라닌 함량을 측정하였다. 먼저, 마우스 흑색종 세포를 접종하여 24시간 배양한 후, 상기 실시예 1-2에서 제조한 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 0.1, 1, 및 10%(v/v) 농도로 희석한 시료와 α-멜라닌세포자극 호르몬(α-MSH, Alpha Melanocyte stimulating hormone) 100nM 농도를 처리한 후 72시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고, PBS(phosphate buffer saline)로 두 번씩 세척하였고, 멜라닌을 용해하기 위해, 1N의 NaOH 200μL를 첨가하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 405㎚ 흡수 파장에서 멜라닌 함량을 측정하였다. 비교실험을 위해 알부틴(arbutin) 50μg/mL 처리군을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 10을 참조하면, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물 처리군은 농도 의존적으로 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 모든 구간에서 발효 처리되지 않은 바다제비집 처리군에 비해 우수한 멜라닌 색소 생성 억제 효과를 나타내었다.
구체적으로, α-멜라닌세포자극 호르몬 단독 처리군(Con)에 비해 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 0.1%, 1%, 및 10% 농도에서 멜라닌 색소 생성을 각각 7.73%, 27.26%, 및 69.48% 억제하는 것으로 관찰되었으며, 10% 농도 처리군은 양성대조군(알부틴처리군 50.18% 감소]에 비해 멜라닌 색소 생성 억제 효과가 더욱 우수한 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물은 피부 세포에서 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 피부 미백과 관련된 용도로 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 9. 피부 재생 활성
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물의 처리에 따른 피부 상처 재생 활성을 평가하였다.
먼저, Wound 제작용 인서트(insert)를 사용하여 24well 배양접시에 NHDF(normal human dermal fibroblast) 세포를 분주한 후, 24시간 배양하였다. 24시간 후, 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효한 바다제비집 추출물을 각각 0.1 및 1%(v/v) 농도로 주입한 후 세포재생 효과를 확인하였다.
세포염색 후 현미경으로 확인하고 추출물 처리 전과 비교 정량하여 측정하였다. 비교실험을 위해 알란토인(Allantoin) 10ug/ml 처리군을 양성대조군으로 사용하였다. 또한, 모든 실험은 3회 반복하여 측정되었다.
실험 결과, 도 11을 참조하면, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물이 처리된 NHDF 세포에서 피부 재생이 농도 의존적으로 촉진되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 처리군은 발효되지 않은 바다제비집 처리군에 비해 모든 농도 구간에서 우수한 세포 재생 효과가 관찰되었는데, 발효되지 않은 바다제비집 처리군은 0.1% 및 1%(v/v) 농도에서 각각 56.02% 및 74.57% 개선된 세포 증식이 관찰된 반면, 발효처리한 바다제비집 추출물을 0.1% 및 1%(v/v) 농도에서 각각 96.75% 및 112.88% 개선된 세포 증식이 관찰되었다. 또한, 알란토인 10μg/mL 처리군은 대조군 대비 105.23% 세포 증식이 관찰되어 발효한 바다제비집 추출물과 동등한 수준의 피부 재생 촉진 효과를 나타내었다. 또한, 재생된 피부세포의 형태적인 모양에 있어서도 무처리군의 피부 세포보다 세포 증식(proliferation) 및 분화(differentiation)가 원활하며 상처(wound) 부위의 세포 밀도가 더욱 높은 것으로 관찰되었다(도 11 참조).
상기와 같은 결과를 토대로 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 손상된 피부에 적용하는 경우, 재생된 피부조직이 주변의 정상 피부조직과 차이가 발생하지 않으므로, 성형학적으로도 피부 상처부위가 덧나지 않게 하면서도 피부 세포의 재생을 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC14200BP
수탁일자 : 20200603

Figure WO-DOC-FIGURE-1

Claims (8)

  1. 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성을 억제하고, 염증성 사이토카인인 IL-1β 및 TNF-α 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 히알루론산 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 VEGF(vascular endothelial growth factor) 인자의 발현을 촉진하여 피부 혈행 개선 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 멜라닌 색소의 생성을 억제하여 피부미백 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 피부 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 피부상태 개선용 화장료 조성물.
  8. 락토바실러스 브레비스 SDCM 1105 균주(기탁번호 KCTC 14200BP)로 발효 처리된 바다제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물.
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