KR101997231B1 - 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 효소반응을 이용하여 제조된 본 발명의 꿀 추출물은 우수한 피부 각질제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름 개선 및 피부 톤 개선 효과를 가질 뿐 아니라, 제형 내에서 함께 사용되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과가 우수하다.

Description

효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing enzyme-treated honey extract}

본 발명은 꿀 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것으로서, 구체적으로는 효소반응에 의한 꿀 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 함유하여 피부 각질 제거효과, 피부 보습효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과 및 피부 유용성분의 활성을 상승시키는 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다. 이 중에서 우리가 가장 쉽게 느낄 수 있는 것이 피부 노화로 이는 당뇨병, 심장병, 동맥경화, 치매, 암 등에 못지않게 중요한 것으로 인식이 되고 있으며, 개인차가 있지만 피부노화는 대개 20대 초반을 전후해서 시작되어 나이가 많아지면서 증가하는 것으로 나타난다.

이러한 노화 현상을 지연하기 위해 다양한 기능을 나타내는 피부개선물질들이 개발되어지고 사용하고 있다. 하지만 화장료의 경우 화장료에 포함된 생리활성 물질이 그 효능을 나타내기 위해서는 피부의 최외각층인 각질층을 통과하여만 하나, 피부장벽기능으로 인해 화장품에 포함된 피부유용성분인 피부개선물질이 각질층을 통과하기 어렵고, 따라서 그 활성을 나타내지 못하는 문제점을 가진다. 이러한 피부 개선물질이 그 기능을 나타내도록 하려면 고농도로 포함시켜야 하는데, 이 경우 제품의 가격 상승 요인이 되며 고농도에 의해 피부 자극 유발 가능성이 높아진다. 따라서 이러한 문제점을 극복하기 위해서 소량의 피부 개선물질을 안정적으로 화장료에 첨가하여 그 기능이 효과적으로 발휘될 수 있도록 하는 피부 흡수촉진용 화장료의 개발이 필요하다.

다양한 연구를 통해 활성물질의 피부 투과를 촉진하는 피부 투과 촉진제들이 보고되어 왔으며, 이들의 투과 촉진은 크게 i)세포간 지질 이중층(Intercellular lipid bilayer)에 작용, ii)세포간 결합에 관여하는 데스모좀(desmosome) 및 관련 단백질에 작용, iii)각질세포 내부 구조에 직접 작용하는 기작으로 나눌 수 있다. 이들은 피부 최외각층인 각질층의 구조를 변경시켜 생리활성 물질의 피부 투과를 촉진하게 된다. 이로 인해 대부분의 피부 투과 촉진제의 경우, 피부 세포에 대한 세포 독성이 높고 도포 시 피부 작열감 및 홍반을 유발하는 등의 피부 자극 유발 가능성이 매우 높은 특징을 가진다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 개선 효과를 나타내는 피부유용성분들의 활성을 상승시킬 수 있는 방법을 연구하였으며, 그 결과 특정한 방법으로 효소 처리하여 제조된 꿀 추출물을 사용하는 경우, 피부 각질 제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과가 우수할 뿐 아니라, 피부 자극 없이 화장료 조성물 내의 피부 유용성분의 활성을 상승시키는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(001)대한민국 공개특허 제10-2016-0049812호(2016.05.10.) (002)대한민국 공개특허 제10-2018-0063394호(2018.06.12.)

본 발명은 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물을 함유하여 피부각질 제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름개선효과, 피부 톤 개선효과 및 피부 개선물질의 활성을 상승시키는 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 꿀에 특정 효소를 처리한 후 추출물을 제조하는 꿀 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이다.

더욱 바람직하게는 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것이다.

상기 꿀 추출물은 화장료 조성물에 함께 포함되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 피부유용성분은 아데노신, 알부틴 및 히알루론산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이다.

상기 화장료 조성물은 피부각질 제거용, 피부 보습용, 미백용, 피부 주름개선용 또는 피부 톤 개선용인 것을 특징으로 한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계; (B) 여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계; (C) 상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계; (D) pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및 (E) 살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법이 제공된다.

효소반응을 이용하여 제조된 본 발명의 꿀 추출물은 우수한 피부 각질제거효과, 피부 보습효과, 미백효과, 주름 개선 및 피부 톤 개선 효과를 가질 뿐 아니라, 제형 내에서 함께 사용되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과가 우수하므로 피부 유용성분의 함량을 줄여도 우수한 피부개선효과를 기대할 수 있다는 장점을 가진다. 그러므로 본 발명의 효소반응을 이용하여 제조된 꿀 추출물은 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 히알루론산 생성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 HAS mRNA 발현 촉진 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 꿀 추출물의 피부 각질 개선 효과를 나타내는 사진도이다.

이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

"꿀"은 꿀벌이 여러 식물의 꽃으로부터 수집한 화밀과 화분을 그들의 식량으로 전환하여 저장한 것을 지칭하는 것으로, 글루코오스(glucose)와 프락토오스(fructose), 탄수화물, 무기질, 단백질, 펩타이드, 유기산, 효소 및 효모 등을 함유하고 있다. 꿀은 오랜 기간 자양 강장, 진정, 해독, 피로회복, 위장장애, 기침, 피부 건조, 습진, 변비, 신경쇠약, 혈당 감소, 대사 균형 유지 등에 사용되어 왔다. 미용 및 건강에 유익한 효과를 가지며, 비타민 B군, 특히 B6이 풍부하게 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 효소반응을 이용하여 꿀 추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하는 기술에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다. 상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이며, 더욱 바람직하게는 각각 1:2~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것이며, 가장 바람직하게는 1:2의 중량비율로 이루어지는 것이다.

더욱 바람직하게는 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것이다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 효소처리 꿀 추출물은 다음과 같이 제조된다. 먼저, 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출한다. 상기 꿀 용매 추출물을 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소로 처리하고 반응시켜 꿀 추출물을 제조한다. 이때, 상기 혼합효소는 나린지나아제와 펙티나아제를 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합하여 이루어진다. 더욱 바람직하게는 상기 꿀 용매추출물에 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 가하고, 반응pH 4.5, 반응온도 48℃, 반응시간 48시간의 조건하에서 교반하면서 효소반응을 진행하는 효소 반응 단계를 통해 꿀 추출물이 제조된다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 (A) 꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계; (B) 여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계; (C) 상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계; (D) pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및 (E) 살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 제조방법에 의하여 제조된 꿀 추출물은 단순 꿀 추출물이나 유산균발효 꿀 추출물, 효모발효 꿀 추출물과 비교해 볼 때, 더욱 우수한 보습효과, 주름개선 및 피부 톤 개선 효과, 각질제거 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

더욱이, 상기 제조방법에 의하여 제조된 꿀 추출물은 제형 내에 함께 포함되는 다른 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내었다.

화장품에 사용되는 피부개선 활성성분이 피부에 작용하는 효율이 떨어지는 경우에는 원하는 피부개선효과를 얻기 위해서 많은 양을 사용할 수밖에 없으며, 이는 비용 상승과 함께 피부의 자극을 유발할 수 있다는 문제점이 있다. 상기 효소반응을 이용하여 제조되는 본 발명의 꿀 추출물은 함께 사용되는 아데노신, 알부틴, 히알루론산과 같은 피부유용성분의 피부흡수를 촉진하고 그 활성을 증진시키는 효과가 있음이 확인되었다. 이는 활성성분을 적은 양으로 사용하여도 원하는 피부개선효과를 얻을 수 있다는 것을 의미한다.

상기 효소반응에 의해 제조된 꿀 추출물은 활성성분으로서 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01~15 중량% 함유된다.

본 발명의 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 및 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 및 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

제조예 1: 꿀 용매 추출물의 제조

아카시아 꿀 원액을 중량 대비 10배의 정제수에 넣고 교반하면서 90℃에서 2시간동안 추출하고, 냉각 후 여과하였다. 그리고 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축 한 후 동결건조기로 동결 건조하여 추출분말을 제조하였다.

제조예 2: 유산균 발효 꿀 추출물의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 넣고, 유산균 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 배양액을 2%(v/v)되게 접종한 다음 27℃에서 48시간 반응시켰다. 이어서 90℃에서 5분간 살균하고, 냉각 및 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축하였다. 동결건조기로 동결 건조하여 유산균 발효 꿀 추출물을 제조하였다.

제조예 3: 효모 발효 꿀 추출물의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 가하고, 효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 2%(v/v)되게 접종한 다음 35℃에서 48시간 반응시켰다. 반응물을 90℃에서 5분간 살균하고 냉각 및 여과한 후 감압 농축기를 이용하여 50~60℃의 온도에서 농축하였다. 동결건조기로 동결 건조하여 효모 발효 꿀 추출물을 제조하였다.

실시예 1~7: 효소반응 꿀 추출물의 제조

상기 제조예 1에서 제조된 꿀 용매 추출물에 중량 대비 8배의 정제수를 가하고, 1배의 하기 표 1의 비율별 효소액을 혼합하여 pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시켰다. 이후, 반응물을 90℃에서 5분간 살균하고 감압 농축 및 동결 건조하여 꿀 추출물을 제조하였다.

구분(중량비)	효소(Enzyme)
	나린지나아제(naringinase)	펙티나아제(pectinase)
실시예 1	1	-
실시예 2	-	1
실시예 3	1	1
실시예 4	1	2
실시예 5	1	3
실시예 6	2	1
실시예 7	3	1

시험예 1: 세포독성 확인 시험

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 피부 세포의 세포독성을 확인하였다. 사람 유래 섬유아세포 1×10⁶ cells/well의 농도로 96 well plate에 배양하고 10% FBS를 함유하는 IMDM 배지 0.2㎖를 공급한 후 24시간 동안 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 여기에 DMSO에 녹인 시료용액을 처리 한 다음 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포의 생존력을 알아보기 위하여 MTT assay를 수행하였다. MTT assay는 배양한 세포에 MTT 용액 0.1㎖을 가한 후, 4시간 동안 배양한 다음 배지는 제거하고 DMSO 0.5㎖를 넣어 형성된 포마잔을 ELISA를 사용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율(%)은 하기 식에 의해 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

세포 생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)] ×100

Bo : 세포배양 배지만을 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 570nm 흡광도

구분	세포 생존율(%)
	0.1%	0.5%	1.0%
제조예 1	100	95	88
제조예 2	100	97	94
제조예 3	100	98	95
실시예 1	100	95	91
실시예 2	100	99	96
실시예 3	100	97	92
실시예 4	100	100	99
실시예 5	100	100	97
실시예 6	100	100	93
실시예 7	100	100	91

상기 표 2에서 알 수 있듯이 상기 제조예 및 실시예 추출물을 적용한 시료 모두 높은 세포 생존률이 확인되었으며, 이는 세포 독성에 미치는 영향이 낮아 상대적으로 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 것으로 확인되었다.

시험예 2: Hyaluronic acid 생성량 측정

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 Hyaluronic acid 생성량을 측정하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0% 씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 회수한 배양액은 ELISA kit를 이용하여 hyaluronic acid(HA)의 생성량을 측정하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 높은 HA 생성량을 나타내었으며, 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다. 그 중에서도, 나린지나아제와 펙티나아제를 1:2로 혼합하여 효소 반응한 실시예 4의 시료에서 가장 우수한 히알루론산 생성 효과를 나타냈다.

시험예 3: HAS mRNA 발현 증가 효과

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 HAS mRNA 발현량을 측정하였다. HaCaT 세포를 96 well plate에 1×10⁶cells/well의 농도로 분주하여 배양한 후, FBS가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 18시간 starvation 시키고, 24시간 동안 배양하였다. HaCaT 세포에 각 시료 1.0%씩 처리하고, 24시간 배양 한 후 세포는 RT-PCR을 이용하여 hyaluronic acid synthase(HAS) mRNA 발현량을 조사하였다. HAS-3 발현 증가율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 도 2에 나타내었다.

HAS-3 발현증가율(%)=(시료 HAS-3 발현양/대조군 HAS-3 발현양)×100

도 2에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 높은 HAS-3 발현증가율을 나타내었으며, 나린지나아제와 펙티나아제를 1 : 2~3으로 혼합하여 효소 반응한 실시예 4, 5의 시료에서는 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 4: MMP-1 생성 억제 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 96-well plate에 1×10⁶cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 시료를 serum이 없는 DMEM 배지에 농도 별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit(Amersham, USA)를 사용하여 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 adenosine을 사용하였다.

시료 농도 (%)	MMP-1 생성 억제율(%)
	제조예			실시예							Adenosine
	1	2	3	1	2	3	4	5	6	7
0.1	12.1	18.9	19.4	26.5	45.7	40.7	47.7	46.8	44.1	32.3	46.8
0.5	23.8	35.7	40.4	44.1	61.8	60.0	68.9	64.5	58.6	44.4	64.2
1.0	35.9	44.0	53.8	60.6	80.2	78.9	85.7	83.5	80.8	67.8	83.3

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제 2종의 효소를 혼합하여 처리한 실시예의 시료에서 전반적으로 우수한 MMP-1 발현 억제 효과를 나타내었다.

시험예 5: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 96-well plate에 1×10⁶cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 제조예 및 실시예의 추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 대조군으로는 아데노신(Adenosine)을 사용하였다.

시료 농도 (%)	procollagen 발현율(%)
	제조예			실시예							Adenosine
	1	2	3	1	2	3	4	5	6	7
0	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6	2.6
0.1	8.7	9.9	11.3	18.4	22.9	13.8	24.7	23.1	22.3	20.8	27.4
0.5	18.4	17.7	25.2	33.1	38.0	28.4	42.9	41.0	36.7	31.5	43.9
1.0	28.8	34.9	48.2	47.8	50.4	44.7	58.3	54.8	48.4	41.0	59.7

상기 표 4에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제 2종의 효소를 혼합하여 처리한 실시예의 시료에서 전반적으로 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타내었으며, 그 중에서도 나린지나아제와 펙티나아제 효소를 1:2로 혼합하여 처리한 실시예 4의 시료에서 가장 우수한 콜라겐 생성 촉진 효과를 나타냈다.

시험예 6: 피부 세포 재생 효과

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물의 피부 재생 효과를 확인하기 위해 wound healing assay를 수행하였다. 각질형성세포(HACAT)를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1×10⁶ cell/well로 조절한 후, 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 18시간 동안 배양하였다. 6 웰 플레이트(well plate)에 가득 자란 세포에 스크래치를 내어 세포의 일부분을 플레이트 바닥에서 떨어지게 한 다음, 실시예 및 제조예 각각의 시료를 0.5(w/v%)씩 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 세포가 재생된 정도를 확인하였고, 세포재생율을 하기 수학식에 의하여 산출하였다.

세포재생율(%) = (시료 세포 재생율/대조군 세포 재생율) × 100

산출된 세포재생율을 하기 표 5에 나타내었다. 대조군으로는 덱사메타손(Dexamethason)을 사용하였다.

구분	처리농도(w/v%)	세포재생율(%)
제조예 1	1.0	57.9
제조예 2	1.0	60.6
제조예 3	1.0	66.3
실시예 1	1.0	69.7
실시예 2	1.0	79.9
실시예 3	1.0	71.4
실시예 4	1.0	82.5
실시예 5	1.0	80.1
실시예 6	1.0	79.5
실시예 7	1.0	77.8
덱사메타손(Dexamethason)	1.0	83.2

상기 표 5에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물에 비하여 훨씬 우수한 세포 재생효과를 나타내었으며, 유산균이나 효모 발효 추출물에 비해서도 우수한 효과를 나타내었다.

시험예 7: 티로시나아제 활성 억제 효과 시험

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 티로시나아제 저해 활성을 측정하였다. B16F10 세포에 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)와 상기 제조예 및 실시예의 시료를 처리하여 72시간 배양하였다. 배양 후, 인산 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 얻어 1%(w/v) triton X-100을 함유한 10 mM phosphate buffer(pH 6.8)를 100 μL를 가하고 5분간 shaking 한 후 세포와 용액을 모두 eppendorf tube로 이전시키고 원심분리하여 상층액을 tyrosinase 활성 측정에 이용하였다. 시료 처리 후 얻은 상층액은 96-well plate에 40 μL를 분주하고, 0.1M sodium phosphate buffer(pH 7.2)에 녹인 10 mM L-DOPA 40 μL를 가하여 37℃에서 30분 동안 배양하였다. Tyrosinase에 의해 생성된 DOPA chrome은 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정결과를 양성대조군인 아스코빅애씨드(Ascorbic acid)를 처리한 대조군(con)의 티로시나아제 저해 활성 대비 각 추출물의 저해활성을 확인하여 표 6에 나타내었다.

시료 농도 (%)	Inhibition ratio(%)
	제조예			실시예							Ascorbic acid
	1	2	3	1	2	3	4	5	6	7
0.1	13.7	19.9	18.4	28.4	32.9	21.3	35.2	33.2	23.9	20.1	48.7
0.5	18.8	27.7	24.5	36.1	48.0	33.8	53.4	50.0	43.6	31.5	59.4
1.0	32.8	32.9	40.4	56.3	58.2	44.4	61.8	59.7	49.9	47.0	70.1

상기 표 6에서 확인되는 바와 같이, 나린지나아제와 펙티나아제의 혼합효소를 처리하여 반응시킨 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물이나 유산균, 효모 발효 추출물에 비하여 우수한 티로시나아제 저해활성을 나타내었다.

시험예 8: 멜라닌 생성 억제 효과 시험

상기 제조예 및 실시예에서 제조된 꿀 추출물 시료 처리에 의한 멜라닌 생성량을 측정하였다. 멜라닌 생성량 측정을 위해 melanoma cell B16F10을 각각의 시료와 positive control인 ascorbic acid를 농도별로 처리하여 미백 활성을 측정하였다. Melanoma cell B16F10을 96-well plate에 1.0×10⁶ cells/well 농도로 접종한 후 시료를 3일간 처리하였다. 3일 후에 각 well의 배지를 제거한 후에 PBS로 세척하고, 각 well 당 1 mL의 1 N NaOH를 가한 다음 교반시켜 멜라닌 성분이 용출되도록 하였다. 용출된 멜라닌의 함량을 측정하기 위하여 microplate reader를 이용하여 400 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

시료 농도 (%)	Melanin production(%)
	제조예			실시예							Ascorbic acid
	1	2	3	1	2	3	4	5	6	7
0.1	99.6	96.2	94.4	94.3	90.3	92.3	88.3	90.0	93.9	92.0	88.7
0.5	91.3	89.9	89.7	83.1	79.4	88.5	73.6	78.8	85.2	84.7	74.1
1.0	79.8	74.4	76.5	68.7	62.1	73.9	59.7	63.4	70.6	69.4	60.3

상기 표 7에서 확인되는 바와 같이, 본 발명 실시예의 꿀 추출물은 일반 용매추출물이나 유산균, 효모 발효 추출물에 비하여 우수한 미백활성을 나타내었으며, 실시예 4에서 가장 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 8: 효소전환 꿀 추출물을 함유하는 크림 제조

상기 실시예 4의 추출물을 포함한 크림을 하기 표 8의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	대조예 1	실시예 8
꿀 추출물(실시예 4)	-	2.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량
정제수	잔량	잔량
합계	100	100

시험예 9: 피부 각질 개선 효과 확인

피부 각질 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 8과 대조예 1의 제형을 이용하여 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 각질의 개선 정도를 영상 분석을 통해 평가하였다.

실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 안면부의 각질을 측정한 후 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 각질 개선도를 영상분석을 통해 각질의 명암 분석으로 각질 상태를 측정하였다. 영상분석에 의한 피부 각질 상태의 측정 결과를 도 3에 도시하였다.

도 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소 전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8의 크림에서 우수한 각질 개선 효과를 나타내었다.

시험예 10: 피부 보습 개선 효과 확인

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부 수분 측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 실시예 8과 대조예 1의 크림을 10명의 피검자 얼굴을 반으로 나누어 한쪽에는 실시예의 제품을 다른 한쪽에는 대조예의 제품을 2회/1일 도포하면서 사용 전 및 2주 후의 수분 함유량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균	수분 증가량(%)
대조예 1	32	36	13
실시예 8	33	44	33

상기 표 9에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 보습효과를 나타내었다.

시험예 11: 피부 주름 개선 효과 확인

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 8과 대조예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 10에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
대조예 1	4
실시예 8	21

상기 표 10에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 주름개선 효과를 나타내었다.

시험예 12: 피부 톤 개선 효과 확인

피부 톤 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예8, 대조예 1의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 피부의 톤 을 측정한 후 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 톤 개선도를 색차계를 사용하여 측정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*, a*, b* 표색계를 쓰며 본 실험에서는 주로 L*값(명도)을 지표로 하였다. L*값은 검정색(L*=0)으로부터 흰색(L*=100) 까지를 나타내며 4주 후의 ΔL*를 구하여, 그 결과를 하기 표 11에 정리하였다.

구분	ΔL*
대조예 1	0.43
실시예 8	7.97

상기 표 11에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물을 함유한 실시예 8에서 높은 피부 톤 개선 효과를 나타내었다.

실시예 9~11: 효소 전환 꿀 추출물과 피부유용성분을 함유하는 크림 제조

상기 실시예 4의 추출물과 피부유용성분인 기능성 원료를 포함한 크림을 하기 표 12의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
	비교예			실시예
	1	2	3	9	10	11
꿀 추출물(실시예 4)	-	-	-	1.0	1.0	1.0
히알루론산	2.5	-	-	1.5	-	-
아데노신	-	1.5	-	-	0.5	-
알부틴	-	-	2.5	-	-	1.5
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
스테아릴알콜	2.2	2.2	2.2	2.2	2.2	2.2
스테아린산	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
밀납	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6	0.6
정화식물유	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
광물유	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
디메치콘	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
베타인	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
소듐히아루로네이트	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

시험예 13: 피부 보습 개선활성 증진 효과

피부 보습에 대한 임상시험으로 피부수분측정기(Corneometer, Courage+Khazaka, GmbH, Germany)를 이용하여 피부전도도를 측정함으로써 피부 보습력을 평가하였다. 피부 수분 측정은 실내온도 20 내지 25 ℃, 상대습도 40 내지 55%로 유지시킨 항온항습 조건 하에서 실시예 9와 비교예 1의 화장료를 10명의 피검자 얼굴을 반으로 나누어 한쪽에는 실시예의 제품을 다른 한쪽에는 비교예의 제품을 도포(2회/1일)하면서 사용 전 및 2주후의 수분 함유량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

구분	초기(D0) 평균	2주(D14) 평균	수분 증가량(%)
비교예 1	32	44	37
실시예 9	31	47	52

상기 표 13에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 히알루론산을 함께 함유한 실시예 9는 히알루론산만을 함유한 비교예 1에 비하여 수분증가량이 높게 나타나, 본 발명의 꿀 추출물은 제형 내에서 함께 사용되는 보습성분인 히알루론산의 활성을 크게 상승시키는 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

시험예 14: 피부 주름 개선활성 증진 효과

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 10과 비교예 2의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 14에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
비교예 2	17
실시예 10	29

상기 표 14에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 아데노신을 함께 함유한 실시예 10은 아데노신만을 함유한 비교예 2에 비하여 주름 밀도 감소율이 높게 나타났다. 본 발명의 꿀 추출물을 주름개선활성성분인 아데노신과 함께 사용하는 경우, 피부유용성분인 아데노신을 더 적게 함유하여도 더 우수한 주름개선효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

시험예 15: 피부 톤 개선에 대한 상승 효과

피부 톤 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 실시예 11과 비교예 3의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 피부의 톤 을 측정하였다. 4주간 도포(2회/일) 한 후, 피부의 톤 개선도를 색차계를 사용하여 측정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*, a*, b*표색계를 쓰며 본 실험에서는 L*값(명도)을 지표로 하였다. L*값은 검정색(L*=0)으로부터 흰색(L*=100) 까지를 나타내며 4주 후의 ΔL*를 구하여, 그 결과를 하기 표 15에 정리하였다.

구분	ΔL*
비교예 3	8.42
실시예 11	10.70

상기 표 15에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 효소전환 꿀 추출물과 알부틴을 함께 함유한 실시예 11에서 더 우수한 피부 톤 개선효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Claims (7)

1. 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)의 혼합효소를 처리하여 제조되는 꿀 추출물을 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.01 ~ 15 중량% 함유하는 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 혼합효소는 나린지나아제(naringinase)와 펙티나아제(pectinase)가 각각 1~3:1~3의 중량비율로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합효소의 처리는 반응 pH 4.5, 반응온도 48℃ 및 반응시간 48시간의 조건하에서 효소 반응을 진행하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 꿀 추출물은 화장료 조성물에 함께 포함되는 피부유용성분의 활성을 증진시키는 효과를 나타내는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 피부유용성분은 아데노신, 알부틴 및 히알루론산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부각질 제거용, 피부 보습용, 미백용 또는 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. (A)꿀을 물, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매로 추출하는 단계;
   (B)여과 후 감압 농축하고 건조하여 꿀 용매추출 분말을 제조하는 단계;
   (C)상기 꿀 용매추출 분말에 정제수를 가하고, 나린지나아제와 펙티나아제가 각각 1~3:1~3의 중량 비율로 혼합되어 이루어지는 혼합효소를 첨가하는 단계;
   (D)pH 4.5, 48℃조건에서 48시간 교반하면서 효소반응을 진행시키는 단계; 및
   (E)살균 후 감압 농축 및 동결 건조하는 단계를 포함하는 꿀 추출물의 제조방법.
   
   
   
   
   
   

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