WO2022080839A1 - 피부 유래 유산균을 포함하는 항산화, 항염 및 미백용 조성물 - Google Patents

피부 유래 유산균을 포함하는 항산화, 항염 및 미백용 조성물 Download PDF

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임혜원
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for antioxidant, anti-inflammatory and whitening comprising skin-derived lactic acid bacteria.
  • ROS reactive oxygen species
  • antioxidants such as SuperOxide Dismutase (SOD), Catalase, Vitamin E, Vitamin C, Ubiquinol, etc.
  • SOD SuperOxide Dismutase
  • Catalase Vitamin E
  • Vitamin C Vitamin C
  • Ubiquinol Ubiquinol
  • the increased radicals destroy the connective tissues of the dermis, such as collagen, elastin, and hyaluronic acid, causing skin subsidence (wrinkle), and oxidizing the lipid part of the cell membrane to destroy cells, resulting in dermatitis and acne. , causing diseases such as skin cancer.
  • these radicals are involved in the spontaneous oxidation reaction during the melanin formation process, causing spots, freckles, etc., and also the cause of wrinkles.
  • the human skin color is affected by environment, race, gender, etc., but is generally determined by the content of melanin (Melanin) of dark brown color present in skin, hair, eyes, etc.
  • Melanin blocks the penetration of UV rays by absorbing more than a certain amount of UV rays, maintains body temperature, and skin color is determined by the amount of melanin. This is not because the number of melanocytes is different, but because the size of melanocytes and the amount of melanin produced are different. Melanin absorbs more than a certain amount of UV rays and blocks harmful UV rays from penetrating into the human body to protect the human body.
  • tyrosine a type of amino acid
  • melaninase is oxidized by tyrosinase in the melanosome of melanocytes to form dihydroxy phenylalanine. It is formed into brown and black polymers through a series of enzymatic and non-enzymatic oxidation processes starting with conversion to .
  • Melanosomes containing melanin granules move from the perinuclear region to the end of the dendrites, move into the cytoplasm by the phagocytosis of keratinocytes (keratinocytes), and are accumulated around the nucleus of the keratinocytes.
  • Hyperpigmentation of the skin with melanin can result in post-inflammatory hyperpigmentation, phototoxic reactions, or other similar minor blemishes due to wounds or dermatitis, including unwanted freckles, age spots, melasma, melasma, brown or dark spots, solar pigmentation, abrasions and burns. It can cause fixed pigmented lesions.
  • lactic acid bacteria are bacteria that play a beneficial role in the human body and produce lactic acid (lactic acid) using sugars such as carbohydrates.
  • sugars such as carbohydrates.
  • About 400 species have been discovered so far and they are being applied to the manufacture of cosmetics.
  • the fermentation broth obtained by culturing these lactic acid bacteria in a general culture medium, for example, a medium containing skim milk, whey, sugar, etc. ), skin wrinkles, etc. are reported to be effective, but in reality, these functional effects of cosmetics containing these fermented liquids are mostly expressed through other raw materials added to cosmetics rather than by active ingredients in the fermented liquid.
  • the present inventors have isolated and identified lactic acid bacteria derived from human skin, and completed the present invention by confirming that the identified lactic acid bacteria have excellent antioxidant, anti-inflammatory and whitening activities and can be used in the production of functional cosmetics and functional foods.
  • an object of the present invention is a Lactobacillus sp. strain derived from the skin, Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus Paraplatanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) containing one or more strains selected from the group consisting of (modified later), a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient, antioxidant, anti-inflammatory or whitening It relates to a functional cosmetic composition.
  • Another object of the present invention relates to a food composition for antioxidant, anti-inflammatory or whitening comprising the Lactobacillus sp. strain derived from the skin of the present invention, a culture thereof, a lysate thereof, or an extract thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation-related skin diseases, comprising the Lactobacillus sp. strain derived from the skin of the present invention, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient. .
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease of melanin hyperpigmentation comprising the Lactobacillus sp. strain derived from the skin of the present invention, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient. will be.
  • the present invention provides a Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (accession number: KCTC14087BP) strain, which is a Lactobacillus sp. Accession number: KCTC14086BP) strain and one or more strains selected from the group consisting of Lactobacillus paraplatanum subspecies seba-401 (Accession number: KCTC14088BP) strain, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient. , to provide an anti-inflammatory or whitening functional cosmetic composition.
  • the composition inhibits the production of active oxygen species; inhibition of nitric oxide (NO) production; inhibition of tyrosinase activity; inhibition of melanogenesis; and collagen synthesis ability.
  • NO nitric oxide
  • the composition is skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, hand cream, essence, nourishing essence , pack, soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, lipstick, makeup base, foundation, press powder, and loose powder may be formulated with one selected from the group consisting of there is.
  • the present invention is a Lactobacillus sp. strain derived from the skin, Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus parapla It provides a food composition for antioxidant, anti-inflammatory or whitening, comprising one or more strains selected from the group consisting of Tanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) strain, a culture thereof, a lysate thereof, or an extract thereof as an active ingredient.
  • Tanum subspecies seba-401 accesion No.: KCTC14088BP
  • the composition inhibits the production of active oxygen species; inhibition of nitric oxide (NO) production; inhibition of tyrosinase activity; inhibition of melanogenesis; and collagen synthesis ability.
  • NO nitric oxide
  • the skin-derived Lactobacillus sp. strain Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus para Platanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) comprising one or more strains selected from the group consisting of strains, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient, a pharmaceutical for the prevention or treatment of inflammation-related skin diseases
  • a composition is provided.
  • the skin-derived Lactobacillus sp. strain Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus para Platanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) comprising one or more strains selected from the group consisting of strains, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient, a pharmaceutical for preventing or treating melanin hyperpigmentation disease Provides an enemy composition.
  • the melanin hyperpigmentation disease may be melasma, freckles, senile pigmentation spots or solar lentigines.
  • the new skin-derived lactic acid bacteria and the culture medium of the new lactic acid bacteria according to the present invention suppress all of the production of reactive oxygen species, the production of nitric oxide (NO), the inhibition of tyrosinase activity, the inhibition of melanin production, and the collagen synthesis ability. It has the effect of being useful not only for functional cosmetics and foods with antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity, but also for the development of therapeutic agents for inflammation-related skin diseases and diseases related to melanin hyperpigmentation. In addition, these novel lactic acid bacteria do not cause cytotoxicity, so they can be safely used without side effects.
  • NO nitric oxide
  • LP202 is Lactobacillus plantarum subspecies Seva-202
  • LF101 is Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101
  • LPP401 is Lactobacillus paraplatanum subspecies Seva-401 strain.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the nitrogen monoxide (NO) scavenging ability of the novel lactic acid bacteria isolated and identified in the present invention.
  • ROS reactive oxygen species
  • nitric oxide (NO) is a mouse macrophage RAW 264.7 cell line treated with LPS to induce the production of nitric oxide (NO), the results of analyzing the nitric oxide (NO) inhibitory ability according to the treatment of the culture solution of the novel lactic acid bacteria of the present invention will be.
  • Figure 6 shows the results of analyzing the melanin production inhibitory ability according to the treatment of the culture medium of the novel lactic acid bacteria of the present invention after increasing the melanin content by treating the B16F10 melanoma cell line of the mouse with alpha-MSH.
  • FIG. 7 shows the results of analyzing the synthesizing ability of collagen using a collagen ELISA kit after the skin fibroblasts were treated with the culture solution of the novel lactic acid bacteria of the present invention.
  • the present invention is characterized by providing a novel use for a novel lactic acid bacteria derived from human skin having antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity.
  • lactic acid bacteria that can be raw materials for functional cosmetics and foods having antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity
  • lactic acid bacteria as a main component, Lactobacillus planta, a novel strain derived from human skin Room subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus paraplatanum subspecies Seva-401 (Accession No.: KCTC14088BP) strain were isolated and identified. , by confirming its antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity, it was confirmed that the new strains can be used in the manufacture of functional cosmetics and food.
  • the present inventors isolated a novel microorganism present in the skin from the obtained human skin sample, and as a result of analyzing the 16s rRNA sequence of the identified strains, a novel lactic acid bacteria that did not exist before Three species were identified, and these strains were named as 'Lactobacillus plantarum subspecies seva-202', 'Lactobacillus fermentum subspecies seva-101' and 'Lactobacillus paraplatanum subspecies seva-401', respectively.
  • the Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 strain received the accession number KCTC14087BP
  • the Lactobacillus fermentum subspecies seva-101 strain received the accession number KCTC14086BP
  • the Lactobacillus para Platanum subspecies seba-401 strain was given accession number KCTC14088BP.
  • the present inventors measured the ability to inhibit the production of reactive oxygen species in the culture medium in which the three strains were cultured, respectively, in order to confirm the antioxidant activity against the novel lactic acid bacteria isolated in the present invention. It was found that all of the strain cultures have superoxide radical scavenging ability, and have activity that can effectively inhibit the generation of reactive oxygen species.
  • the present inventors found that the novel lactic acid bacteria of the present invention have antioxidant activity.
  • the present inventors performed an experiment to confirm whether the lactic acid bacteria of the present invention have anti-inflammatory activity through another embodiment. All of the cultures of eggplant strains were found to have nitric oxide inhibitory activity, and it was found that there was an activity of effectively inhibiting both LPS-induced reactive oxygen species and nitric oxide in mouse macrophage cell lines.
  • the present inventors could see that the novel lactic acid bacteria of the present invention have anti-inflammatory activity.
  • the present inventors performed an experiment to confirm whether the novel lactic acid bacteria of the present invention have skin whitening activity, and confirmed whether they have the ability to inhibit tyrosinase activity and melanin production.
  • melanin uses tyrosine, a kind of amino acid, as a precursor, through dopa, dopaquinone, and indole-5,6-dihydroquinone to indole-5,6-dihydroquinone. It is biosynthesized into melanin, a polymer of 5,6-dihydroquinone.
  • melanin a polymer of 5,6-dihydroquinone.
  • Melanin is produced in melanocytes and moves to the boundary between the epidermis and the dermis in the form of granules called melanosomes and is deposited. Melanin is not only a direct cause of dark skin, but also causes serious problems in terms of skin beauty, such as promoting the formation of spots and freckles. In addition, it has been found that excessive production of melanin is the cause of skin aging and skin cancer.
  • tyrosinase is an enzyme that plays a key role in the process of melanin biosynthesis and acts in the first stage of pigment formation. Therefore, when inhibiting the activity of tyrosinase, it is possible to induce whitening activity by inhibiting the formation of melanin pigment.
  • novel lactic acid bacteria of the present invention have both tyrosinase and melanin production inhibitory activity, and thus can induce a skin whitening effect.
  • the present invention is a novel Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain derived from the skin, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain or Lactobacillus paraplatanum subspecies Seva -401 (Accession No.: KCTC14088BP) strain can be provided.
  • KCTC14087BP Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101
  • Lactobacillus paraplatanum subspecies Seva -401 accesion No.: KCTC14088BP
  • the present invention can provide an antioxidant, anti-inflammatory or whitening functional cosmetic composition comprising the novel strain of the present invention, its culture, its lysate, or its extract as an active ingredient.
  • novel lactic acid bacteria of the present invention have all the characteristics of inhibiting the production of reactive oxygen species, inhibiting the production of nitric oxide (NO), inhibiting tyrosinase activity, inhibiting melanin production, and synthesizing collagen. there is.
  • NO nitric oxide
  • the term “cultivation” refers to all actions performed to grow microorganisms in an appropriately artificially controlled environmental condition.
  • the "culture” includes not only the live cells obtained from the culture medium, but also any processed form for lactic acid bacteria known to those skilled in the art, for example, cell lysate, dried material, frozen material, etc., but is not limited thereto.
  • the culture medium obtained by culturing the new strain of the present invention was used.
  • ingredients included in the cosmetic composition of the present invention may include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the new strain, culture, lysate or extract thereof of the present invention as an active ingredient, for example, antioxidant, stabilizer , solubilizing agents, conventional adjuvants such as vitamins, pigments and fragrances, and carriers.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solution, suspension, emulsion, paste, gel, cream, lotion, powder, soap, surfactant-containing cleansing , oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, etc., but is not limited thereto. More specifically, the cosmetic composition of the present invention is a skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, hand cream, essence, nourishing essence, It can be prepared in the form of pack, soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, lipstick, makeup base, foundation, press powder, and loose powder.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as a carrier component, for example, water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1 ,3-butylglycol oil, glycerol fatty esters, fatty acid esters of polyethylene glycol or sorbitan.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, and microcrystals
  • cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth may be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • additional chlorofluorohydrocarbon propane /may contain propellants such as butane or dimethyl ether.
  • propellants such as butane or dimethyl ether.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate, fatty acid amide ether as carrier components Sulfate, alkylamidobetaine, aliphatic alcohol, fatty acid glyceride, fatty acid diethanolamide, vegetable oil, lanolin derivative or ethoxylated glycerol fatty acid ester may be used.
  • the cosmetic composition of the present invention is a soap, a surfactant-containing cleansing formulation, or a surfactant-free cleansing formulation
  • the soap is liquid soap, powder soap, solid soap, and oil soap
  • the surfactant-containing cleansing formulation is a cleansing foam, cleansing water, cleansing towel, and cleansing pack
  • the surfactant-free cleansing formulation is a cleansing cream , cleansing lotion, cleansing water, and cleansing gel, but not limited thereto.
  • the present invention can provide a food composition for antioxidant, anti-inflammatory or whitening comprising the novel strain of the present invention, its culture, its lysate, or its extract as an active ingredient.
  • the three new strains identified in the present invention are lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus plantarum, the genus Lactobacillus permentum and the genus Lactobacillus paraplatanum, and these lactic acid bacteria have probiotic activity, so they can be ingested into the body.
  • novel strains of the present invention can be used not only as a functional cosmetic composition having antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity, but also as a functional food composition having antioxidant, anti-inflammatory or whitening activity.
  • the food composition of the present invention includes all types of functional food, nutritional supplement, health food, and food additives.
  • Food compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • health food the new strain of the present invention itself, its lysate, and one or more of the strain culture group are prepared and consumed in the form of tea, juice and drink, or granulated, encapsulated and powdered for consumption. can do.
  • it can be prepared in the form of a composition by mixing one or more of the new strain of the present invention, a lysate thereof, and a culture group with a known substance or active ingredient known to have an anti-wrinkle or skin barrier function improvement effect.
  • functional foods include beverages (including alcoholic beverages), fruits and their processed foods (eg, canned fruit, bottled, jam, marmalade, etc.), fish, meat and their processed foods (eg, ham, sausage corn beef) etc.), breads and noodles (eg udon noodles, soba noodles, ramen, spaghetti, macaroni, etc.), fruit juice, various drinks, cookies, syrup, dairy products (eg butter, cheese, etc.), edible vegetable oils and fats, margarine, vegetable protein , retort food, frozen food, various seasonings (eg, soybean paste, soy sauce, sauce, etc.) can be prepared by adding at least one of the new strain of the present invention, a lysate thereof, and a culture group.
  • the preferred content of the novel strain of the present invention, its lysate and culture is not limited thereto, but is preferably 0.01 to 50% by weight of the finally prepared food.
  • a lysate thereof and a culture thereof as an active ingredient in the form of a food additive, it may be prepared and used in the form of a powder or a concentrate.
  • the present invention is a skin-derived Lactobacillus sp. strain, Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus parapla
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammation-related skin diseases comprising at least one strain selected from the group consisting of Tanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) strain, a culture thereof, a lysate thereof, or an extract thereof as an active ingredient can provide
  • the novel lactic acid bacteria of the present invention have excellent anti-inflammatory activity against skin cells, thereby preventing, improving or treating inflammation-related skin diseases that may be caused by skin inflammation.
  • the inflammation-related skin disease according to the present invention is not limited thereto, but may be atopic dermatitis, contact dermatitis, seborrhea, and acne.
  • the present invention is a Lactobacillus sp. strain derived from the skin, Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain, Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain and Lactobacillus parapla Tanum subspecies seba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) comprising one or more strains selected from the group consisting of strains, a culture thereof, a lysate thereof or an extract thereof as an active ingredient, a pharmaceutical for the prevention or treatment of melanin hyperpigmentation disease compositions may be provided.
  • the "melanin hyperpigmentation (hyperpigmentation)" means to become black or dark compared to other areas due to an excessive increase in melanin in a specific area of the skin or nail.
  • the melanin hyperpigmentation disease includes, but is not limited to, melasma, freckles, senile pigmentation spots, or solar lentigines.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit or risk ratio applicable to medical treatment, which is the type, severity, activity of the drug, and the drug. Sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field may be determined.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared by using a pharmaceutically suitable and physiologically acceptable adjuvant in addition to the active ingredient of the present invention, and the adjuvant includes an excipient, a disintegrant, a sweetener, a binder, a coating agent, and a swelling agent. , lubricants, lubricants or flavoring agents may be used.
  • the pharmaceutical composition may be preferably formulated into a pharmaceutical composition including one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the active ingredient of the present invention for administration.
  • Formulations of the pharmaceutical composition may be granules, powders, tablets, coated tablets, capsules, suppositories, solutions, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectables.
  • the active ingredient may be combined with an orally, non-toxic, pharmaceutically acceptable inert carrier such as ethanol, glycerol, water, and the like.
  • suitable binders, lubricants, disintegrants and color-developers may also be included in the mixture.
  • Suitable binders include, but are not limited to, starch, gelatin, natural sugars such as glucose or beta-lactose, corn sweeteners, natural and synthetic gums such as acacia, tracacanth or sodium oleate, sodium stearate, magnesium stearate, sodium benzoate, sodium acetate, sodium chloride, and the like.
  • Disintegrants include, but are not limited to, starch, methyl cellulose, agar, bentonite, xanthan gum, and the like.
  • acceptable pharmaceutical carriers are sterile and biocompatible, and include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostats may be added as needed.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to form an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, etc., pills, capsules, granules or tablets.
  • the active ingredient of the present invention may be included in an amount of 0.001 to 99% by weight based on the total weight of the composition.
  • the present inventors also analyzed the anti-inflammatory, antioxidant and whitening activities of the mixed culture medium of the novel lactic acid bacteria of the present invention.
  • the group using the mixed culture medium showed better anti-inflammatory, antioxidant and whitening activities, and the group mixed in a different ratio showed lower efficacy than the group mixed in a ratio of 1:1:1.
  • 16S rRNA sequencing was performed for identification of the purely isolated strains in the process of ⁇ 1-1>.
  • genomic DNA was isolated using a chromosomal DNA extraction kit, and universal primers [27F:5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3', 1492R: 5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT TC 3'] was used to perform PCR to analyze the nucleotide sequence.
  • the homology test for the results obtained by performing 16s rRNA sequencing was performed through the BLAST search database provided by NCBI.
  • the lactic acid bacteria isolated in the present invention were novel lactic acid bacteria that were not previously known, and as a result of the nucleotide sequence homology analysis, the novel lactic acid bacteria of the present invention were found to have more than 90% sequence homology with the genus Lactobacillus.
  • the present inventors identified three new lactic acid bacteria isolated in the present invention as “Lactobacillus plantarum subsp. shebah-202”, “Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101” and “Lactobacillus paraplantarum subsp.
  • Shebah-401 was named, and these strains were deposited with the Center for Biological Resources (KCTC) on December 20, 2019, and the Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 strain received accession number KCTC14087BP, and Lactobacillus Fermentum subspecies seva The -101 strain was given accession number KCTC14086BP, and the Lactobacillus paraplatanum subspecies Seba-401 strain was given accession number KCTC14088BP, respectively.
  • 16s rRNA sequences of these new strains are shown in SEQ ID NOs: 1 to 3, Lactobacillus plantarum subsp. 16s rRNA sequence of shebah-202 is shown in SEQ ID NO: 1, Lactobacillus fermentum subsp. 16s rRNA sequence of shebah-101 is shown in SEQ ID NO: 2, Lactobacillus paraplantarum subsp. The 16s rRNA sequence of shebah-401 is shown in SEQ ID NO:3.
  • the present inventors registered the sequences of these strains newly identified in the present invention in the NCBI GenBank sequence database, and the registration numbers are MN625238.1 (Lactobacillus plantarum strain shebah-202 16S ribosomal RNA gene, partial sequence), MN625236.1, respectively. (Lactobacillus fermentum strain shebah-101 16S ribosomal RNA gene, partial sequence) and MN602521.1 (Lactobacillus paraplantarum strain shebah-401 16S ribosomal RNA gene, partial sequence).
  • a culture medium was obtained as follows. First, single colonies were collected from the MRS agar plate, inoculated in MRS liquid medium, and cultured in a stirred incubator at 37° C. and 100 rpm while stirring. After three passages, the main culture was performed for 5 days. Thereafter, the culture medium was centrifuged to obtain a supernatant, and then the supernatant was filtered using a 0.2 ⁇ m pore size filter to obtain new strains, Lactobacillus plantarum subsp. shebah-202 (LP202), Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101 (LF101) and “Lactobacillus paraplantarum subsp. A culture solution of shebah-401 (LPP401) was obtained, respectively.
  • Superoxide radical known as one of reactive oxygen species (ROS)
  • ROS reactive oxygen species
  • Nitric oxide is known to be produced in the process of decomposition of L-arginine and L-citrulline by inducible NO synthase (iNOS) as a mediator of inflammation in vivo.
  • iNOS inducible NO synthase
  • the present inventors analyzed the anti-inflammatory activity by measuring the nitrite scavenging ability against the three types of lactic acid bacteria of the present invention as follows.
  • the RAW 264.7 cell line which is a macrophage of a mouse, was treated with LPS (lipopolysaccharide), known as an inflammatory factor, to increase the ROS level, and then the effect of the novel lactic acid bacteria of the present invention on the elevated ROS level was analyzed.
  • LPS lipopolysaccharide
  • RAW 264.7 was cultured for 24 hours in a 6-well plate at 2 ⁇ 10 5 cells/well condition, 10 ⁇ L of culture solution (sample) for each lactic acid bacteria of the present invention was pretreated for 30 minutes, and LPS (10 ng/mL) for 24 hours. After removing the supernatant, the remaining cells were washed twice with 1 mL/well of 1X PBS, and then treated with 500 ⁇ L/well of a 100 ⁇ M DCFH-DA solution dissolved in 1X PBS.
  • Nitric oxide is known to be produced in the process of decomposition of L-arginine and L-citrulline by inducible NO synthase (iNOS) as a mediator that induces inflammation in vivo, and suppresses the production of such NO is known to alleviate dermatitis.
  • iNOS inducible NO synthase
  • the present inventors incubated RAW 264.7 at 2 ⁇ 10 5 cells/well for 24 hours in a 6-well plate, and then pre-treated with 10 ⁇ L of each of the three novel lactic acid bacteria of the present invention for 30 minutes. , and then LPS (10 ng/mL) was treated for 24 hours, and then 500 ⁇ L of the culture supernatant was taken to measure nitrite. 50 ⁇ L of Griess reagent was added to 50 ⁇ L of RAW 264.7 culture supernatant, and after reacting at room temperature for 10 minutes, absorbance was measured at 540 nm using a spectrophotometer. The total amount of nitrite was calculated by substituting it into the standard curve obtained after measuring the absorbance in the same way as above using a NaNO 2 (0 ⁇ M ⁇ 64 ⁇ M) solution.
  • the reaction product L-dopaquinone
  • 1X PBS pH 7.4
  • the enzyme mushroom tyrosinase were mixed with 1X PBS ( After dissolving in pH 7.4) and adding 20 ⁇ L of each culture medium and PBS mixture of the new strain of the present invention to 2 ⁇ L of mushroom tyrosinase solution made to a concentration of 7500 U/mL, pre-cultured at 37°C for 90 minutes.
  • 40 ⁇ L of a solution made by dissolving L-DOPA in 1X PBS (pH 7.4) to a concentration of 2.5 mM was added to the pre-cultured solution, and absorbance was measured at 450 nm.
  • melanin An important factor determining the color of human skin is melanin, which is produced in melanocytes and spreads to other skin tissues such as the epidermis. Therefore, if it is possible to inhibit the production of melanin in melanocytes, it will have a whitening effect on the skin.
  • the present inventors treated the B16F10 mouse melanoma cell line with alpha-MSH (alpha-melanocyte-stimulating hormone) to measure the degree of decrease in melanin content according to the treatment of the strain of the present invention under the condition that the melanin content was increased.
  • alpha-MSH alpha-melanocyte-stimulating hormone
  • NHDF 5x10 5 cells/well cells were dispensed in a 6-well plate and cultured for 24 hours. After obtaining the solution, the collagen content was quantified using a collagen ELISA kit.
  • Lactobacillus plantarum subspecies seva-202 (Accession No.: KCTC14087BP) strain
  • Lactobacillus Fermentum subspecies Seva-101 (Accession No.: KCTC14086BP) strain
  • Lactobacillus paraplatanum subspecies Ceba-401 (Accession No.: KCTC14088BP) strain
  • KCTC14088BP Lactobacillus paraplatanum subspecies Ceba-401
  • KCTC14088BP has all of the excellent antioxidant activity, anti-inflammatory activity, skin whitening activity and wrinkle improvement effect through collagen synthesis, so it is useful for the production of functional cosmetics and functional foods found that it could be used.

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Abstract

본 발명은 피부 유래 유산균을 포함하는 항산화, 항염 및 미백용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 인간 피부로부터 분리 및 동정한 신규한 유산균인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 또는 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물, 식품 조성물, 염증 관련 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

피부 유래 유산균을 포함하는 항산화, 항염 및 미백용 조성물
본 발명은 피부 유래 유산균을 포함하는 항산화, 항염 및 미백용 조성물에 관한 것이다.
인체는 산화 촉진물질과 산화 억제물질이 균형을 이루고 있으나, 여러 가지 요인들로 인하여 이러한 균형 상태를 잃고 산화를 촉진하는 방향으로 기울게 되면, 생체 내 산화적 스트레스 (oxidative stress)가 유발되어 세포손상 및 병리적 질환을 유발하게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)은 화학적으로 불안정하고 반응성이 높아 DNA, 단백질, 지질 및 탄수화물과 같은 여러 생체 물질과 쉽게 반응할 수 있으며, 생체 내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나, 돌연변이, 세포 독성 및 암 등을 초래하게 된다.
산화에 의한 피부 노화는 자유 라디칼 (free radical)에 기인한 것으로서, 자유 라디칼은 백혈구의 식작용, 미토콘드리아에서의 ATP 생산과정 중 전자 전달계, 마이엘로 퍼옥사이드 (Myeloperoxide, MPO)의 작용, 자외선, 담배, 정상적인 대사 과정, 스트레스, 공해 물질, 세균에 의해 생성되며, 이러한 원인에 의해 라디칼이 인체에 잔류하게 되는 경우 체내에서 세포의 파괴, 결합 조직의 절단, 교차 결합 유도 등을 통하여 주름형성, 피부암, 세포 살상, 류마티스성 관절염, 아토피성 피부염, 여드름 등 여러 가지 문제를 발생시킨다.
또한 인체에는 천연 항산화 물질 (라디칼 소거제)인 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 (SuperOxide Dismutase, SOD), 카탈라제 (Catalase), 비타민 E, 비타민 C, 유비퀴놀 (Ubiquinol) 등이 존재하여 자유 라디칼을 제거할 수 있지만, 이러한 체내 항산화 체계는 나이, 공해, 자외선, 스트레스 등에 의해 점차적으로 그 기능이 쇠퇴하기 시작하여 항산화 체계가 무력화되고, 이는 결국 체내 자유라디칼의 증가로 이어진다. 증가된 라디칼은 진피의 결합조직인 콜라겐 (Collagen), 엘라스틴 (Elastin), 히아루론산 (Hyaluronic aicd) 등을 파괴하여 피부 침하 현상(주름)을 일으키고, 세포막의 지질 부분을 산화시켜 세포를 파괴함으로써 피부염, 여드름, 피부암 등의 질병을 유발한다. 또한, 이 라디칼은 멜라닌 형성과정 중 자발적 산화반응에 관여하여 기미, 주근깨 등의 원인 및 주름생성의 원인이 되기도 한다.
최근에는 산업화 발전에 따른 환경공해, 스트레스, 자외선 등 각종 자극에 의해 피부가 민감해져 가는 사람들이 증가하고 있으며, 외부 자극에 의해 민감해진 피부는 홍반과 같이 단순히 눈에 보이는 경우도 있으나, 가려움, 따가움 등과 같이 격심하고 불쾌한 염증 반응을 나타내는 경우가 있어서 대중적인 피부 화장료 조성물을 사용하기에는 부담스러우며, 지속적으로 사용하는 것이 꺼려지게 된다.
또한, 인간의 피부 색깔은 환경, 인종, 성별 등의 영향을 받으나 일반적으로 피부, 털, 눈 등에 존재하는 흑갈색의 멜라닌 (Melanin)의 함량에 의해 결정된다. 멜라닌은 일정량 이상의 자외선을 흡수하는 방식으로 자외선의 침투를 차단하고, 체온을 유지해 주며, 멜라닌의 양에 의해 피부색이 결정된다. 이는 멜라닌 세포의 수가 다르기 때문이 아니라, 멜라닌 세포의 크기와 만들어지는 멜라닌의 양이 다르기 때문이다. 멜라닌은 일정량 이상의 자외선을 흡수하여 유해한 자외선이 인체 내로 침투하는 것을 차단하여 인체를 보호하는 역할을 한다.
멜라닌 (Melanin)의 생합성 (Biosynthesis)은 아미노산의 일종인 타이로신 (Tyrosine)이 멜라닌세포(Melanocyte)의 멜라노좀 (Melanosome)에서 타이로시나제 (Tyrosinase)에 의해 산화되어 다이히드록시 페닐알라닌 (Dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 효소적 산화 과정 및 비효소적 산화 과정을 거쳐 갈색, 흑색의 중합체로 형성된다. 멜라닌 과립을 포함하는 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상돌기 끝부분으로 이동하여 각질형성세포(케라티노사이트; keratinocyte)의 식세포 작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들이 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 피부에 멜라닌 색소가 과다 침착되면 원하지 않는 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 찰상 및 화상을 비롯한 상처 또는 피부염으로 인한 염증 후 과색소 침착, 광독성 반응 또는 다른 유사한 소형의 고정 색소성 병변을 일으킬 수 있다.
한편, 유산균은 인체 내에서 유익한 역할을 하는 세균으로서 탄수화물과 같은 당을 이용하여 유산(젖산)을 생성하는 균이다. 지금까지 400여종이 발견되었으며 화장품의 제조에도 응용되고 있다. 이러한 유산균들을 일반적인 배양액, 예를 들어 스킴밀크, 웨이, 당류 등을 주성분으로 하는 배지 중에서 배양하여 얻어지는 발효액은, 미백, 보습, 각질층의 턴오버(turn over) 속도 증가에 의한 피부의 소프트닝(skin softening), 피부 주름 완화 등에 효과가 있는 것으로 보고되고 있으나, 실제 이들 발효액을 함유하는 화장품의 이러한 기능성 효과는 발효액 중의 유효성분에 의하기 보다는 화장품에 첨가된 다른 원료를 통하여 나타내는 경우가 대부분이다.
그러나 아직까지 항산화, 항염 및 미백활성을 위한 기능성 화장품으로서 주원료를 유산균으로 하여 개발된 예가 없다.
이에 본 발명자들은 사람의 피부로부터 유래된 유산균들을 분리 및 동정하였고, 상기 동정된 유산균들이 항산화, 항염 및 미백활성이 우수하여 기능성 화장품 및 기능성 식품의 제조에 사용 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주(이후 모두 수정)로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염 또는 미백용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 관련 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 본 발명의 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은, 활성산소종의 생성억제; 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제; 티로시나제(tyrosinase) 활성억제; 멜라닌 생성억제; 및 콜라겐 합성능을 모두 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 항산화, 항염 또는 미백용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은, 활성산소종의 생성억제; 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제; 티로시나제(tyrosinase) 활성억제; 멜라닌 생성억제; 및 콜라겐 합성능을 모두 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증 관련 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시에에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 또는 일광흑색증(solar lentigines)일 수 있다.
본 발명에 따른 피부 유래 신규 유산균 및 상기 신규 유산균의 배양액은 활성산소종의 생성억제, 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제, 티로시나제(tyrosinase) 활성억제, 멜라닌 생성억제 및 콜라겐 합성능을 모두 가지고 있어 항산화, 항염 또는 미백 활성을 갖는 기능성 화장품 및 식품에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 염증관련 피부질환 및 멜라닌 색소과다 침착관련 질환의 치료제 개발에도 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다. 또한 이들 신규 유산균은 세포독성을 유발하지 않아 부작용 없이 안전하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 유산균에 대한 슈퍼옥사이드 라디칼 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 본 발명의 도면에서 LP202는 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202를, LF101은 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101을, LPP401은 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401 균주를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 유산균에 대한 일산화질소(NO) 소거능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 LPS를 처리하여 활성산소종(ROS)의 생성을 유도한 후, 본 발명의 신규 유산균의 배양액 처리에 따른 활성산소종(ROS) 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 LPS를 처리하여 일산화질소(NO) 의 생성을 유도한 후, 본 발명의 신규 유산균의 배양액 처리에 따른 일산화질소(NO) 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 신규 유산균의 배양액 처리에 따른 티로시나제 활성 억제능 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 마우스의 B16F10 멜라노마 세포주에 alpha-MSH를 처리하여 멜라닌 함량을 증가시킨 후, 본 발명의 신규 유산균의 배양액 처리에 따른 멜라닌 생성 억제능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 피부 섬유아세포에 대하여 본 발명의 신규 유산균의 배양액을 처리한 후, 콜라겐의 합성능을 콜라겐 ELISA 키트를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 항산화, 항염 또는 미백용 활성을 갖는 인간 피부 유래의 신규 유산균에 대한 신규한 용도를 제공함에 특징이 있다.
본 발명자들은 유산균 자체를 주요성분으로 하는 항산화, 항염 또는 미백용 활성을 갖는 기능성 화장품 및 식품의 원료가 될 수 있는 새로운 유산균을 동정하기 위해 연구하던 중, 인간의 피부 유래 신규 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주를 분리 및 동정하였고, 이의 항산화, 항염 또는 미백 활성을 확인함으로써, 상기 신균주들을 기능성 화장품 및 식품의 제조에 사용할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 수득한 인체의 피부시료로부터 피부에 존재하는 신규 미생물을 분리하였고, 동정된 균주들의 16s rRNA 서열을 분석한 결과, 종래 존재하지 않았던 신규한 유산균 3종을 동정하였으며, 이들 균주들을 ‘락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202’, ‘락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101’ 및 ‘락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401’로 각각 명명하였고, 이들을 생물자원센터(KCTC)에 2019년 12월 20일자로 기탁하여, 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202 균주는 기탁번호 KCTC14087BP를, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주는 기탁번호 KCTC14086BP를, 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401 균주는 기탁번호 KCTC14088BP를 부여받았다.
한편, 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신규 유산균에 대한 항산화 활성을 확인하기 위해 상기 3가지 균주를 각각 배양한 배양액에 대한 활성산소종의 생성 억제능을 측정하였는데, 그 결과, 본 발명의 3가지 신균주 배양액 모두가 수퍼옥사이드 라디칼 소거능이 있으며, 활성산소종의 생성을 효과적으로 억제할 수 있는 활성이 있는 것으로 나타났다.
이를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신규 유산균들이 항산화 활성이 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 다른 일실시예를 통해 본 발명의 유산균이 항염 활성이 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 생체 내 염증유발 인자인 일산화질소(NO)를 억제할 수 있는지 분석한 결과, 3가지 균주의 배양액이 모두 일산화질소의 억제능이 있는 것으로 나타났고, 마우스 대식 세포주를 대상으로 LPS로 유도된 활성산소종 및 일산화질소 모두 효과적으로 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
그러므로 이를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신규 유산균들이 항염 활성이 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 신규 유산균들이 피부 미백활성을 갖는지 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 티로시나제 활성 억제능 및 멜라닌 생성 억제능이 있는지를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 3가지 신균주의 배양액 모두가 티로시나제 활성을 억제하면서 동시에 멜라닌 생성을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosin)을 전구물질로 하여, 도파(DOPA), 도파 퀴논(DOPAquinone) 및 인돌-5,6-디히드로퀴논(indole-5,6-dihydroquinone)을 거쳐 인돌-5,6-디히드로퀴논의 중합체인 멜라닌으로 생합성 된다. 멜라닌은 멜라노사이트(melanocyte) 내에서 생성되며, 멜라노솜(melanosome)이라는 과립형태로 표피와 진피의 경계부로 이동하여 침착된다. 멜라닌은 검은 피부의 직접적인 원인이 될 뿐만 아니라, 기미, 주근깨의 형성을 촉진하는 등 피부 미용 측면에서 심각한 문제를 일으킨다. 또한 과잉 생산된 멜라닌은 피부노화 및 피부암을 유발하는 원인이 되는 것으로 밝혀졌다.
또한, 티로시나제(tyrosinase)는 멜라닌 생합성 과정에 핵심적으로 작용하는 효소로 색소 형성의 첫 단계에 작용한다. 따라서 티로시나제의 활성을 억제할 경우, 멜라닌 색소 형성을 억제하여 미백 활성을 유도할 수 있다.
이러한 점에서 본 발명의 신규 유산균은 티로시나제 및 멜라닌 생성 억제 활성을 모두 가지고 있어 피부 미백 효과를 유도할 수 있다.
그러므로 본 발명은 피부에서 유래된 신규한 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 또는 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물을 제공할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 신규 유산균은 활성산소종의 생성억제, 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제, 티로시나제(tyrosinase) 활성억제, 멜라닌 생성억제 및 콜라겐 합성능을 모두 갖는 특징이 있다.
본 발명에서 상기 “배양”이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미한다. 또한 상기 “배양물”은 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 신균주를 배양하고 수득한 배양액을 사용하였다.
나아가 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
나아가 본 발명은 본 발명의 신균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염 또는 미백용 식품 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 동정한 3가지 신균주는 락토바실러스 플란타룸속, 락토바실러스 퍼멘텀속 및 락토바실러스 파라플라타눔속에 속하는 유산균들로 이들 유산균들은 프로바이오틱스 활성을 가지고 있는 바, 체내 섭취가 가능하다.
따라서 본 발명의 신균주들은 항산화, 항염 또는 미백 활성을 갖는 기능성 화장료 조성물로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항산화, 항염 또는 미백 활성을 갖는 기능성 식품 조성물로도 사용이 가능하다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 신균주 자체, 이의 파쇄물 및 상기 균주 배양물 군 중 하나 이상을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화 하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 군 중 하나 이상을 항주름 또는 피부장벽 기능개선 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말 레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 군 중 하나 이상을 를 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물 등의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다. 또한, 본 발명의 신균주, 이의 파쇄물 및 배양물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로서 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
나아가 본 발명은 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증 관련 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 신규 유산균은 피부 세포에 대한 항염 활성이 우수하여 피부 염증으로 유발될 수 있는 염증 관련 피부질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 상기 염증 관련 피부질환은 이에 제한되지는 않으나, 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름일 수 있다.
또한 본 발명은 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 상기 "멜라닌 색소 과다 침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다.
상기 멜라닌 색소 과다침착 질환은 이에 제한되지는 않으나, 기미, 주근깨, 노인성 색소반, 또는 일광 흑색증(solar lentigines) 등을 포함한다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 본 발명의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~ 99중량%로 포함될 수 있다.
나아가 본 발명자들은 이들 본 발명의 신규 유산균의 혼합균주 배양액에 대대서도 항염, 항산화 및 미백활성을 분석하였는데, 그 결과, 이들 균주의 단독 배양액에 비해 3가지 균주 배양액을 1:1:1의 비율로 혼합한 혼합균주 배양액을 사용한 군에서 항염, 항산화 및 미백활성이 더 우수한 것으로 나타났으며, 다른 비율로 혼합한 군은 1:1:1의 비율로 혼합한 군에 비해 그 효능이 낮은 것으로 나타났다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
사람 피부 유래 신균주들의 분리 및 동정
<1-1> 시료 채취 및 유산균 분리
춘천에서 거주하는 30명의 피험자들의 동의하에 온도와 습도가 일정한 상태에서(온도 22 ± 2 ℃. 습도 50 ± 5%) 안면의 양쪽 볼 부분, 이마 부분 및 손바닥 부분의 피부 표면 미생물을 스왑하였다. 스왑은 Quick Swab kit를(3M Microbiology, USA) 이용하였고, swab 방법은 swab kit 제조사에서 권장하는 방법을 기준으로 검사대상의 표면적 약 12 cm2를 기준으로 채취하였다. 스왑된 각 샘플들은 한천이 함유된 고형 아가 플레이트에 화염멸균한 백금이를 이용하여 획선 도말하여 접종하였고 싱글 콜로니가 확인될 때까지 3일간 37℃의 온도에서 배양한 뒤 다시 독립된 집락인 싱글 콜로니 50개를 개별적으로 취한 후, de Man, Rogosa 및 Sharpe (MRS) 아가 플레이트에 획선 도말하는 방법으로 계대배양하여 균주의 생육 활성을 높였으며, 상기 과정으로 배양된 싱글 콜로니를 분리하여 분리된 균주의 16s RNA 염기서열을 분석하였다.
<1-2> 염기서열분석을 통한 신균주들의 동정
상기 <1-1>의 과정에서 순수 분리된 균주들에 대한 동정을 위해 16S rRNA의 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 염색체 DNA 추출키트를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였고 얻어진 gDNA로부터 유니버설 프라이머[27F :5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3', 1492R: 5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT TC 3']를 이용하여 PCR을 수행하여 염기서열을 분석하였다. 16s rRNA 시퀀싱 수행으로 얻어진 결과에 대한 상동성 검사는 NCBI에서 제공하는 BLAST 서치 데이터베이스를 통해 수행하였다.
염기서열 분석 결과, 본 발명에서 분리한 유산균들은 종래 알려지지 않은 신규 유산균임을 알 수 있었으며, 염기서열 상동분석 결과 본 발명의 신규 유산균들은 락토바실러스 속과 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로 나타났다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 분리한 신규 유산균 3가지를 각각 “Lactobacillus plantarum subsp. shebah-202”, “Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101” 및 “Lactobacillus paraplantarum subsp. shebah-401”로 명명하였고, 이들 균주를 생물자원센터(KCTC)에 2019년 12월 20일자로 기탁하여, 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202 균주는 기탁번호 KCTC14087BP를, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101 균주는 기탁번호 KCTC14086BP를, 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401 균주는 기탁번호 KCTC14088BP를 각각 부여받았다.
또한, 이들 신균주들의 16s rRNA 서열은 서열번호 1~3에 나타내었는데, Lactobacillus plantarum subsp. shebah-202의 16s rRNA 서열은 서열번호 1에 나타내었고, Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101의 16s rRNA 서열은 서열번호 2에 나타내었으며, Lactobacillus paraplantarum subsp. shebah-401의 16s rRNA 서열은 서열번호 3에 나타내었다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에서 새롭게 동정한 이들 균주의 서열들을 NCBI GenBank sequence database에 등록하였으며, 등록번호는 각각 MN625238.1(Lactobacillus plantarum strain shebah-202 16S ribosomal RNA gene, partial sequence), MN625236.1(Lactobacillus fermentum strain shebah-101 16S ribosomal RNA gene, partial sequence) 및 MN602521.1(Lactobacillus paraplantarum strain shebah-401 16S ribosomal RNA gene, partial sequence) 이다.
<실시예 2>
신균주들의 배양액 제조
상기 실시예 1에서 분리 및 동정한 신규 유산균 3종에 대해 아래와 같은 방법을 통해 균주 배양액을 수득하였다. 먼저, MRS 아가 플레이트에서 단일 콜로니들을 채취 후, MRS 액체 배지에 접종하고 교반 배양기에서 37℃의 온도 및 100rpm으로 교반하면서 배양을 하였다. 3회 계대 배양 후, 본 배양을 5일 동안 수행하였다. 이후 배양액을 원심분리하여 상층액을 수득한 다음, 0.2 μm pore size 필터를 이용하여 상층액을 여과시켜 신균주들인 Lactobacillus plantarum subsp. shebah-202(LP202), Lactobacillus fermentum subsp. shebah-101(LF101) 및 “Lactobacillus paraplantarum subsp. shebah-401(LPP401)의 배양액을 각각 수득하였다.
<실시예 3>
신균주들에 대한 항산화 활성분석
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 하나로 알려지 있는 superoxide radical은 다른 활성산소종의 전구체로서 superoxide radical 소거능을 통해서 다른 활성산소종의 생성을 억제할 수 있다. 이에 본 발명자들은 상기 본 발명에서 동정한 3종류의 유산균에 대하여 superoxide radical 소거능을 통한 항산화 활성 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
이를 위해, 156 μM NADH (60 μL), 100 μM nitroblue tetrazolium (60 μL), 20 μM phenazine methosulfate (60 μL) 혼합 용액에 상기 실시예 2에서 제조한 균주의 배양액(시료) 및 0.2 M Tris-HCl 혼합액 20 μL 첨가한 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3가지 신규 유산균들은 모두 superoxide radical의 소거능이 있는 것으로 나타났고, 특히 락토바실러스 파라플라타눔속 세바-401 균주가 가장 우수한 항산화 활성이 있는 것으로 나타났다.
<실시예 4>
신균주들에 대한 항염 활성분석
<4-1> 일산화질소(nitric oxide, NO) 소거능 분석
일산화질소(nitric oxide, NO)는 생체 내에서 염증을 유발하는 매개인자로써, inducible NO synthase (iNOS)에 의해 L-arginine이 L-citrulline 분해되는 과정에서 생성되는 것으로 알려지고 있다. 인체 내에서 염증을 유발하는 NO를 효과적으로 제거할 수 있는 항염증 소재의 천연물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. NO는 수용액 내에서 nitrite와 평형을 이루어 존재하기 때문에 nitrite 수준을 정량함으로써 NO 수준을 알 수 있고, 또한 nitrite 소거능을 통하여 NO 소거능의 추정이 가능하다. 나아가 nitrite 소거능은 시료의 항염증 효과를 확인하는 수단이 될 수 있으므로, 본 발명자들은 다음과 같이 본 발명의 3 종류 유산균에 대한 nitrite 소거능을 측정하여 항염증 활성을 분석하였다.
이를 위해, 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) 30 μL와 50 ㎍/mL NaNO2 6 μL를 혼합한 후, 여기에 상기 실시예 2에서 제조한 각 균주의 배양액(시료)과 0.1 M citrate buffer (pH 3.0) 혼합액 60 μL를 Griess reagent 150 μL과 혼합하여 첨가한 다음, 538 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3가지 신규 유산균들은 모두 nitrite 소거능이 있는 것으로 나타났고, 특히 락토바실러스 파라플라타눔속 세바-401 균주가 가장 우수한 항염 활성이 있는 것으로 나타났다.
<4-2> RAW 264.7 세포주에서 LPS에 의해 증가된 활성산소종(ROS) 억제능 분석
마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포주에 염증반응의 유발인자로 알려진 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 ROS 수준을 상승시킨 다음, 상승된 ROS 수준에 대한 본 발명의 신규 유산균이 미치는 영향을 분석하였다.
이를 위해, RAW 264.7을 2×105 cells/well 조건으로 6-well plate에서 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 각 유산균에 대한 배양액(시료) 10 μL를 30분 동안 전처리하고, LPS (10 ng/mL) 24시간 동안 처리하였다. 이후 상층액을 제거한 후에 남은 세포를 1X PBS 1 mL/well로 2 번 세척한 후, 1X PBS에 녹인 100 μM DCFH-DA 용액 500 μL/well로 처리하였다. 37℃ CO2 배양기에서 30분 반응 후에 1X PBS 1 mL/well로 두 번 세척 후, 1X PBS 500 μL/well로 세포를 수집한 다음, 96-well 플레이트에 200 μL 로딩하여 multi-mode microplate reader (excitation, 488 nm; emission, 535 nm)기로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7에 LPS한 처리한 경우, ROS 수준이 LPS를 처리하지 않은 군에 비해 2배 이상 현저히 증가한 것으로 나타났고, 반면, 증가된 ROS 수준은 본 발명의 신규 유산균 배양액을 처리한 경우, 현저하게 감소하는 것으로 나타났다. 또한, LPS에 의한 ROS 생성 억제 효과는 LP202 < LF101 < LPP401으로 나타나, LPP401 균주가 가장 우수한 ROS 생성 억제 효과가 있는 것으로 확인되었다.
<4-3> RAW 264.7 세포주에서 일산화질소 (nitric oxide, NO) 억제능 분석
일산화질소 (nitric oxide, NO)는 생체 내에서 염증을 유발하는 매개인자로써, inducible NO synthase (iNOS)에 의해 L-arginine이 L-citrulline 분해되는 과정에서 생성되는 것으로 알려져 있고, 이러한 NO의 생성억제는 피부염을 완화시킬 수 있음이 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 RAW 264.7을 2×105 cells/well로 6-well plate에서 24시간 동안 배양한 후, 여기에 상기 본 발명의 3종 신규 유산균의 배양액을 각각 10 μL씩 30분 동안 전 처리 하였으며, 이후 LPS (10 ng/mL)를 24시간 동안 처리한 후에 nitrite를 측정하기 위해서 배양 상층액을 500 μL 취하였다. RAW 264.7 배양 상층액 50 μL에 Griess reagent 50 μL 첨가하고 상온에서 10분간 반응시킨 후, 분광광도계를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 nitrite 양은 NaNO2 (0 μM ~ 64 μM) 용액을 이용하여 위와 같은 방법으로 흡광도를 측정한 후에 얻어진 표준 검량선 (standard curve)에 대입하여 nitrite 양을 산출하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7에 LPS를 처리하여 증가된 nitrite는 본 발명의 균주의 배양액을 처리하였을 때 유의성 있게 감소되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 신규 유산균들 모두가 우수한 항염 활성이 있음을 알 수 있었다.
<실시예 5>
신균주들에 대한 미백 활성분석
<5-1> 티로시나아제 억제 활성
멜라닌 생성 경로의 rate-limiting step을 촉매한다고 알려져 있는 티로시나제(tyrosinase)의 2가지 활성 중에 3,4-dihydroxy-L-phenyalanine (L-DOPA)에서 L-dopaquinone으로 전환하는 DOPA oxidase 활성에 대한 저해 효과에 대하여 본 발명의 신균주의 미백 활성을 분석하였다.
이를 위하여, L-DOPA를 기질로 하고 정제된 mushroom tyrosinase를 사용하여 반응 생성물인 L-dopaquinone을 분광광학적인 방법을 측정하였는데, 우선, 1X PBS (pH 7.4) 138 μL와 효소 mushroom tyrosinase 을 1X PBS (pH 7.4)에 용해시켜 7500 U/mL 농도로 만든 mushroom tyrosinase 용액 2 μL에 본 발명의 신균주 각각의 배양액과 PBS 혼합물 20 μL를 첨가한 후 37℃에서 90분간 전배양 하였다. 이후 L-DOPA를 1X PBS (pH 7.4) 에 용해시켜 2.5 mM 농도로 만든 용액 40 μL를 전배양이 끝난 용액에 첨가하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 유산균 3종류 모두 티로시나제 억제 활성이 있는 것으로 나타났고, LPP401 균주가 가장 우수한 활성이 있는 것으로 나타났다.
<5-2> 멜라닌세포 (melanocyte)의 멜라닌 함량에 미치는 영향분석
인간 피부의 색깔을 결정하는 중요한 요소는 멜라닌세포에서 생성되어 표피 등 다른 피부 조직으로 전파되는 멜라닌이다. 따라서, 멜라닌세포에서 멜라닌 생성을 억제할 수 있다면, 피부에 대한 미백 효능을 갖게 된다.
이에 본 발명자들은 B16F10 마우스 멜라노마 세포주에 alpha-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone)를 처리하여 멜라닌 함량을 증가시키는 조건에서 본 발명의 균주 처리에 따른 멜라닌 함량 감소 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3가지 신규 유산균의 배양액을 처리한 군들에서 alpha-MSH 처리에 의해 증가된 멜라닌 함량이 모두 유의적으로 억제되는 것으로 나타났고, 특히 LF101 및 LPP401 균주가 매우 우수한 멜라닌 억제 활성이 있는 것으로 나타났다.
<실시예 6>
피부섬유아세포에서 신균주들에 의한 콜라겐 합성능 분석
피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성은 피부의 주름 형성과 밀접하게 연관되어 있으므로, 콜라겐 합성이 감소되면 주름 형성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 신규 유산균이 피부 섬유아세포에 대하여 콜라겐 합성을 증진시킬 수 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
이를 위해, NHDF (5x105 cells/well)세포를 6-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 신규 유산균 3종의 배양액을 NHDF 세포에 처리한 다음, 48시간 동안 배양하여 상층액을 수득한 후, 콜라겐 ELISA kit를 사용하여 콜라겐 함량을 정량하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 신규 유산균 3종의 배양액을 처리한 군 모두 콜라겐의 합성이 유의적으로 증진되어 있는 것으로 나타났다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규 유산균인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주는 우수한 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백활성 및 콜라겐 합성능을 통한 주름개선 효과를 모두 가지고 있어, 기능성 화장품 및 기능성 식품의 제조에 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
기탁기관 주소 : 56212 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181(신정동)
수탁번호 : KCTC14086BP
기탁일자 : 20191220
기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
기탁기관 주소 : 56212 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181(신정동)
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기탁기관명 : 한국생명공학연구원 생물자원센터
기탁기관 주소 : 56212 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 181(신정동)
수탁번호 : KCTC14088BP
기탁일자 : 20191220
　
Figure WO-DOC-FIGURE-1
　
Figure WO-DOC-FIGURE-2

Claims (8)

  1. 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은,
    활성산소종의 생성억제;
    일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제;
    티로시나제(tyrosinase) 활성억제;
    멜라닌 생성억제; 및
    콜라겐 합성능을 모두 갖는 것을 특징으로 하는, 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택된 1종으로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염 또는 미백 기능성 화장료 조성물.
  4. 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    항산화, 항염 또는 미백용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은,
    활성산소종의 생성억제;
    일산화질소(nitric oxide, NO)의 생성억제;
    티로시나제(tyrosinase) 활성억제;
    멜라닌 생성억제; 및
    콜라겐 합성능을 모두 갖는 것을 특징으로 하는, 항산화, 항염 또는 미백용 식품 조성물.
  6. 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    염증 관련 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 피부에서 유래된 락토바실러스속 균주인 락토바실러스 플란타룸 아종 세바-202(기탁번호: KCTC14087BP) 균주, 락토바실러스 퍼멘텀 아종 세바-101(기탁번호: KCTC14086BP) 균주 및 락토바실러스 파라플라타눔 아종 세바-401(기탁번호: KCTC14088BP) 균주로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 기미, 주근깨, 노인성 색소반 또는 일광흑색증(solar lentigines)인 것을 특징으로 하는, 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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