WO2022024925A1 - シグナルの低下を改善した検査試薬 - Google Patents

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WO2022024925A1
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reaction
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江里子 吉澤
友樹 篠原
志野 村松
三和 桑原
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デンカ株式会社
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Definitions

  • a substance to be detected such as a virus / bacterium or a protein to be detected can be obtained from a sample derived from a body fluid such as a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal cleaning sample, a nasal bite nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, and a saliva sample.
  • False-negative and false-positive reactions that could not be suppressed by conventional methods by using a chelating agent in the sample extract for detection with a detection reagent that uses an antigen-antibody reaction or a binding reaction between substances with interactions.
  • a detection reagent that uses an antigen-antibody reaction or a binding reaction between substances with interactions.
  • test reagents and kits have been developed one after another to detect the presence or absence of pathogen infection such as viruses and bacteria, and the presence or absence of pregnancy, using the antigen-antibody reaction and the binding reaction between substances having an interaction.
  • Each test reagent includes a pretreatment step to create conditions suitable for the detection reaction after the sample is taken from the patient, and this step is important for obtaining accurate results.
  • many of the simple test reagents have the characteristics of being easy to operate and inexpensive without the need for special equipment, and are widely used in general hospitals and clinics in addition to large hospitals and medical testing centers. It is often used by users other than inspection specialists. Therefore, it is very important that the test accuracy of the reagent is high.
  • test reagents examples include simple test reagents for testing pathogen infections and simple test reagents for pregnancy diagnosis. These test reagents are often carried out at the medical institution that the patient first visits, and it is possible to determine the presence or absence of infection or pregnancy on the spot from the sample collected from the patient, and to take treatment measures at an early stage. Therefore, the importance of simple test reagents in medical treatment is increasing. With the increasing use of simple test reagents, users are demanding more reproducible test results and test accuracy as reagent performance.
  • an immunoassay method using an antigen-antibody reaction is generally known as a typical reagent for a simple test method.
  • a complex of a trapping substance (capturing substance) that specifically binds to the substance to be detected and a labeled substance that specifically binds to the substance to be detected is formed on the membrane, and the label is detected / quantified.
  • Detect (measure or quantify) the substance to be detected.
  • the immunochromatography method is widely used for detecting a wide variety of substances to be detected because the measuring device is simple and the cost is excellent.
  • a sample sample containing a substance to be detected is dropped onto an inspection device provided with a labeled substance containing a substance, and the complex is developed while forming a substance-labeled complex to be detected, and the complex is captured by the detection unit. Detect or quantify the label with.
  • test reagent is a test reagent having high sensitivity and specificity and less likely to cause erroneous determination.
  • specificity there is always a technical issue of how reagent design can respond to the diversity of sample components derived from the different backgrounds of each patient, and more effective non-specificity. Eliminating the reaction is an extremely important issue in the simple test method.
  • Antibodies and antibodies to detect substances such as viruses, bacteria, and proteins to be detected from body fluid-derived samples such as nasal swab samples, nasal suction samples, nasal lavage samples, nasal swab nasal juice samples, pharyngeal swab samples, and saliva samples. False positive reactions and false negative reactions that could not be suppressed by conventional methods still exist when detecting with a detection reagent that utilizes the binding reaction between substances with interactions, which is one of the factors that hinder accurate diagnosis.
  • the present invention provides a sample extract containing a component capable of strongly suppressing a false negative reaction and a false positive reaction without lowering the sensitivity, or a test reagent using a sample extraction method.
  • the present inventors have developed a non-specific reaction that occurs when a sample derived from a body fluid such as a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal lavage sample, a nasal bite nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, or a saliva sample is used as a test sample.
  • a sample derived from a body fluid such as a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal lavage sample, a nasal bite nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, or a saliva sample.
  • the present invention is as follows.
  • the test reagent of [1] that suppresses a decrease in signal.
  • sample extract contains a chelating agent of 8 mM to 300 mM.
  • sample extract contains a chelating agent of 25 mM to 300 mM.
  • the chelating agent is selected from the group consisting of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), 1,3-propanediaminetetraacetic acid (PDTA) and nitrilotriacetic acid (NTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • PDTA 1,3-propanediaminetetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • the test reagent according to any one of 1] to [7].
  • Select from the group consisting of viral antigens, bacterial antigens, and protein antigens in the sample selected from the group consisting of a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal cleaning sample, a nasal swab nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, and a saliva sample.
  • the method for detecting a substance to be detected is an immunochromatographic method, which comprises putting a sample in a sample extract containing a chelating agent and adding the sample extract to an immunochromatographic test device [9].
  • the method for detecting a substance to be detected is an immunochromatographic method, which is a method of [9] in which a sample is added to an immunochromatographic test device including a site impregnated with a sample extract containing a chelating agent.
  • [12] The method of [10] or [11], wherein the sample extract further contains a surfactant.
  • 13] The method according to any one of [9] to [12], using a sample extract containing 8 mM to 300 mM of a chelating agent.
  • the chelating agent is selected from the group consisting of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), 1,3-propanediaminetetraacetic acid (PDTA) and nitrilotriacetic acid (NTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGTA glycol etherdiaminetetraacetic acid
  • PDTA 1,3-propanediaminetetraacetic acid
  • NTA nitrilotriacetic acid
  • binding between substances having an antigen-antibody reaction or interaction from a sample derived from a body fluid such as a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal lavage sample, a nasal swab nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, or a saliva sample.
  • a sample derived from a body fluid such as a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal lavage sample, a nasal swab nasal juice sample, a pharyngeal swab sample, or a saliva sample.
  • a false negative reaction and a false positive are caused by contacting the chelating agent with the sample. It is a method of suppressing a reaction and preventing a decrease in signal, that is, a decrease in sensitivity.
  • the antibody also includes an antigen-binding fragment of the antibody.
  • sample The sample used is not limited. Examples of the sample include pharyngeal swab, nasal swab, nasal suction, pharyngeal lavage, nasal lavage, nasal nasal discharge, saliva and the like. These are referred to as a pharyngeal swab sample, a nasal swab sample, a nasal suction sample, a pharyngeal lavage sample, a nasal lavage sample, a nasal mucus sample, a saliva sample, and the like. These samples can be diluted with a buffer solution and used as they are without being diluted.
  • the substance to be detected is not limited to any substance, and may be any substance to be detected. Specific examples include influenza virus, adenovirus, RS (respiratory syncytial) virus, human metapneumovirus (hMPV), hepatitis A virus (HAV), hepatitis B virus (HBV), human immunodeficiency virus (HIV), and norovirus. , Virus antigens such as coronavirus such as SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV2, Bacterial antigens such as methicillin-resistant yellow staphylococcus (MRSA), group A lytic bacterium, group B lytic bacterium, and genus Regionella; produced by bacteria, etc.
  • MRSA methicillin-resistant yellow staphylococcus
  • Toxins Mycoplasma antigens; Chlamydia antigens such as Chlamydia trachomatis; Protozoan antigens; Fungal antigens; Hormones such as human chorionic gonadotropin; C-reactive proteins, myoglobins, myocardial troponins, procalcitonin and other proteins; Markers; antigens such as pesticides and environmental hormones can be mentioned, and antibodies against the above bacteria, viruses and the like can be mentioned.
  • the method of collecting the sample is not limited, but a pharyngeal swab sample, a nasal swab sample, a nasal suction sample, a nasal cavity cleaning sample, a nasal cavity cleaning sample, a nasal bite nasal juice sample, and a saliva sample are collected using a sample collection device such as a cotton swab. Examples thereof include a method and a method of collecting by using suction with a suction device.
  • the sample and the chelating agent are brought into contact with each other.
  • the sample and the chelating agent are brought into contact with each other.
  • the substance to be detected and the chelating agent are also brought into contact with each other.
  • contacting the sample with the chelating agent may mean treating the sample with the chelating agent.
  • the sample extract is a liquid that floats the substance to be detected in the sample and makes it easier to measure.
  • it is not necessary to extract a specific substance to be detected from cells or the like by lysis or the like, and it is simply a sample treatment solution or It can also be called a sample diluent or a sample suspension.
  • the term "before subjecting to the test” refers to before the reaction between the substance to be detected in the sample and the antibody or antigen thereof, or before the substance to be detected in the sample reacts with the substance having an interaction.
  • a reaction with an antibody or an antigen means a binding with an antibody or an antigen
  • a reaction with a substance having an interaction with a substance to be detected in a sample means a binding with a substance having an interaction.
  • a method of contacting the chelating agent of the present invention with the sample a method of putting the sample in a solution containing the chelating agent, mixing and contacting the sample, and a test device used for measurement include a sample extract containing the chelating agent. Examples thereof include a method of contacting a sample with a chelating agent by adding the sample to a test device used for the test.
  • a method of mixing a sample with a solution containing a chelating agent and contacting the sample when the chelating agent is contained in the sample extract in which the collected sample is suspended and dispersed, and the sample is added to the sample extract and mixed.
  • a sample extract containing a chelating agent if the sample is a nasal swab, a cotton swab is used to collect the nasal swab, and a cotton swab impregnated with the collected sample is used as the sample extract.
  • the sample can be brought into contact with the chelating agent by floating, dispersing and extracting the sample.
  • a sample extract containing a chelating agent is contained in a test device used for measurement and the sample is brought into contact with the chelating agent by adding the sample to the test device
  • fibers such as a filtration filter possessed by the test device are used.
  • the sample extract containing the chelating agent is contained in the form or porous substrate and the collected sample is added to the test device, the sample is contained in the fibrous or porous substrate with the chelating agent.
  • the method of contacting is mentioned.
  • examples of the inspection device include a device for the later-described immunochromatography method.
  • the material of the porous base material of the inspection device is not limited in any way, and examples thereof include pulp, cotton, wool, polyester, polypropylene, nylon, acrylic glass fiber, and nitrocellulose.
  • the test device used for measurement contains a sample extract containing a chelating agent and the sample is brought into contact with the chelating agent by adding the sample to the test device, for example, the sample extract containing the chelating agent is porous.
  • the substrate may be impregnated and dried, and the sample may be brought into contact with the porous substrate in a step before or at the same time as a reaction for detecting the substance to be detected on the inspection device.
  • the sample when a sample is added to a test device, the sample expands on the test device, reaches a site where a reaction occurs on the device, and a reaction such as an antibody-antigen reaction occurs.
  • a porous substrate containing the sample extract containing the chelating agent at the site before the reaction on the test device, the sample comes into contact with the chelating agent before the reaction.
  • a filtration filter may be used as the porous substrate, and a filtration filter containing a sample extract containing a chelating agent may be provided at a site to which the sample is added.
  • a nasal swab when used as the sample, a cotton swab is used to collect the nasal swab, and the cotton swab impregnated with the collected sample is used as a sample extract having an arbitrary composition that does not contain a chelating agent.
  • the sample and the chelating agent can be brought into contact with each other by impregnating the filtration filter containing the chelating agent, which is a component of the inspection device, with the above-mentioned sample extract. ..
  • chelating agent and its concentration examples include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA), 1,3-propanediaminetetraacetic acid (PDTA), nitrilotriacetic acid (NTA) and the like. These chelating agents also include sodium and potassium salts.
  • the chelating agent is contained as a sample extract in a sample extract, a filtration filter, or the like.
  • the concentration of the chelating agent is preferably 8 mM or more, more preferably 10 mM or more, still more preferably 50 mM or more.
  • a plurality of types of these chelating agents can be used at the same time, and the total concentration of the chelating agents in that case is preferably 8 mM or more, more preferably 10 mM or more, still more preferably 50 mM or more.
  • the concentration of the chelating agent is preferably 25 mM or more, more preferably 40 mM or more, still more preferably 50 mM or more.
  • the upper limit of the concentration of the chelating agent does not need to be set, but is, for example, 1000 mM or less, 500 mM or less, 300 mM or less, or 150 mM or less.
  • the concentration of the chelating agent when used at 150 mM or less, it is possible to suppress a decrease in color development intensity.
  • the sample extract containing the chelating agent is contained in the porous base material such as a filtration filter, the chelating agent having the above concentration may be contained in the porous base material.
  • the sample extract in the present invention and the sample extract impregnated with a member such as a porous substrate that comes into contact with the sample in the step prior to the detection reaction are known substances that can reduce non-specific reactions. It may contain a surfactant, a pH-buffering component, various proteins, salts, and sugars.
  • a surfactant e.g., sodium bicarbonate
  • a pH-buffering component e.g., sodium bicarbonate
  • various proteins e.glycine ethyl ester
  • glycine methyl ester glysine and various isomers of the above-mentioned compounds.
  • the surfactant examples include nonionic surfactants such as polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether and polyoxyethylene sorbitan monolaurate, and amphoteric surfactants such as CHAPS and laurylamide sulfobetaine, and dodecyl.
  • examples thereof include anionic surfactants such as sodium sulfate and cationic surfactants such as dodecyltrimethylammonium chloride.
  • the concentration of the surfactant in the sample extract is preferably 0.5 to 5 (w / v)%, more preferably 1 to 3 (w / v)%, still more preferably 1.5 to 2.5 (w / v)%.
  • Surfactants have a virus-destroying effect, and the presence of a chelating agent when the surfactant destroys the virus enhances the effect. Therefore, it is preferable that the surfactant and the chelating agent coexist in the sample extract.
  • buffering component examples include phosphate buffer, Tris buffer, Good's buffer and the like.
  • protein component examples include BSA (bovine serum albumin), casein, gelatin, IgG and the like.
  • salts include lithium chloride, sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, potassium bromide, sodium iodide, potassium iodide and the like.
  • detection is carried out by a method utilizing an antigen-antibody reaction or a binding reaction between substances having an interaction.
  • the combination of substances having an interaction include a combination of a ligand and a receptor, a combination of a receptor and a receptor, a combination of biotin and avidin, or a combination of streptavidin.
  • the detection method is not particularly limited as long as it is a detection method using an antigen-antibody reaction or a substance having an interaction with each other, but is not particularly limited, but is limited to an immunochromatography method, a latex aggregation method, an immunoturbidimetric method, an immunoassay method, a chemoluminescence enzyme-linked immunosorbent assay (CLEIA), and the like.
  • Enzymatic immunoassays Examples include enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) such as assay (ELISA), including latex agglutination, immunoturbidimetric methods, and immunobroading methods.
  • the sandwich method is preferable.
  • a first substance that binds to a substance to be detected is immobilized on a specific carrier as a substance to capture the substance to be detected, the substance to be detected is bound to the substance, and the substance to be detected is further bound to the substance to be detected.
  • the second substance to be labeled which binds the labeled substance to the substance to be detected, and "the first substance to be bound to the substance to be detected-the substance to be detected-the second substance to be bound to the substance to be detected and labeled.
  • the substance to be detected is measured by forming a complex of "substances" (where "-" indicates a bond) and measuring the signal emitted from the labeling substance.
  • the first substance that binds to the substance to be detected and the second substance that binds to the substance to be detected may be the same substance.
  • the substance that binds to the substance to be detected and the substance to be detected may be an antigen and an antibody, an antibody and an antigen, or a substance that interacts with each other.
  • any substance such as a protein that can be immobilized by a known technique can be used.
  • a porous thin film (membrane) having a capillary action can be used.
  • Particulate matter can be arbitrarily selected.
  • an enzyme a radioisotope, a fluorescent substance, a luminescent substance, colored particles, colloidal particles and the like can be used.
  • the immunochromatography method which is a lateral flow type immunoassay method using a membrane, is particularly preferable from the viewpoint of simplicity and speed of clinical examination.
  • a general immunochromatographic method using an antigen-antibody reaction will be described.
  • the inspection device for the immunochromatography method is shown in FIG.
  • FIG. 1 The upper part of FIG. 1 is a top view, and the lower part is a cut sectional view.
  • various parts are laminated on the nitrocellulose membrane (1) laminated on the plastic plate (6).
  • a nitrocellulose membrane (1) in which two detection portions (3) are formed of a substance to be detected such as an antibody on a plastic plate (6), and an absorption pad formed of filter paper.
  • the part (5), the labeled body part (2), and the sample addition part (4) formed by the glass fiber filter are laminated.
  • one end region of the absorption pad portion (5), one end region of the nitrocellulose membrane (1), the other end region of the nitrocellulose membrane (1), and the labeled body portion are overlapped with each other, whereby a continuous lateral flow can be obtained.
  • a flow path is formed.
  • the labeled substance (2) contains a labeled substance in which the labeling substance is chemically or physically bound to the substance to be detected such as an antibody.
  • the labeling substance include gold colloidal particles, platinum colloidal particles, color latex particles, magnetic particles, enzymes, quantum dots, fluorescent dyes and phosphors, and quantum dots.
  • the labeled body portion is made of a porous base material containing the above-mentioned labeled body, and the material of the base material can be glass fiber (glass fiber), non-woven fabric or the like which are generally used.
  • the porous substrate impregnated with the labeled body and dried is also referred to as a stabilized dried labeled body pad. That is, the labeled body portion is a site containing the stabilized dry labeled body pad, which is an antibody that binds to the substance to be detected by an antigen-antibody reaction and is labeled with colored latex particles.
  • the detection unit (3) is a site solid-phased in a line shape using an antibody that binds to the substance to be detected by an antigen-antibody reaction as a capture substance.
  • Examples of members that come into contact with the sample in the process prior to the detection reaction of the substance to be detected or in the process at the same time as the detection reaction include the above (1), (2), and (4).
  • the member is not limited to this as long as it is a member that comes into contact with the sample in the step prior to the reaction or the step at the same time as the detection reaction.
  • the sample is suspended in the sample extract to prepare a sample sample from which the substance to be detected is extracted.
  • Membrane the sample sample is dropped onto the sample addition portion (4) of the inspection device.
  • the sample sample containing the substance to be detected is impregnated into the labeled body portion (2) while moving horizontally on the membrane to dissolve the labeled body and develop it. If the substance to be detected is present in the sample, a complex of the substance to be detected and the labeled substance is formed. When the complex reaches the detection unit (3), a capture antibody-detected substance-labeled complex is formed on the line.
  • the presence or absence of the detected substance in the sample can be determined by detecting the presence of the complex from the signal emitted from the labeling substance in the complex.
  • Other components and the like that did not participate in the reaction are absorbed by the absorption pad portion (5).
  • a chelating agent may be contained in the sample extract for mixing with the sample and extracting the substance to be detected, or the nitrocellulose membrane (1) of the inspection device for the immunochromatography method, the labeled body portion.
  • the chelating agent may be contained in (2) and / or the sample addition part (4).
  • the present invention includes a test reagent utilizing an antigen-antibody reaction and a binding reaction between substances having an interaction.
  • the test reagent may refer to the test device itself, or may refer to a test kit containing the test device and other reagents.
  • the test reagent of the present invention includes, for example, a test kit containing a sample extract containing an immunochromatographic test device and a chelating agent.
  • the test reagent of the present invention includes an immunochromatographic test device including a site containing a sample extract containing a chelating agent.
  • Preparation example 1 Preparation of anti-hMPV monoclonal antibody
  • the hMPV antigen was immunized in BALB / c mice, and the spleen was removed from the mice bred for a certain period of time.
  • Fused with mouse myeloma cells P3 ⁇ 63).
  • the obtained fusion cells (hybridoma) were maintained in an incubator at 37 ° C., and the cells were purified (monocloned) while confirming the antibody activity of the supernatant by ELISA using a plate on which the hMPV antigen was immobilized. ..
  • the obtained two strains of the cells were intraperitoneally administered to BALB / c mice treated with pristane, and about 2 weeks later, antibody-containing ascites was collected.
  • IgG was purified from the obtained ascites by an affinity chromatography method using a protein A column to obtain two types of purified anti-hMPV antibodies.
  • antibody-immobilized membrane A solution of purified anti-hMPV antibody diluted with purified water to 1.0 mg / mL is linearly applied to a predetermined position on a nitrocellulose membrane lined with PET film. Then, it was dried at 45 ° C. for 30 minutes to obtain an anti-hMPV antibody-immobilized membrane (hereinafter referred to as antibody-immobilized membrane).
  • step 1 Bonding with immobilized membrane, drying pad, and other members 2. And 4.
  • the antibody-immobilized membrane and the drying pad prepared in step 1 were laminated with other members (backing sheet, absorption band, sample pad) and cut to a width of 5 mm to obtain an hMPV test piece (inspection device).
  • Example 1 Verification of false negative suppression effect by nasal suction sample in hMPV antigen detection immunochromatography 50 mM Tris buffer (pH 8.0), 2% (w / v) Polyoxyethylene octylphenyl ether (trade name: Triton X-100) A mixed solution containing (manufactured by Nakarai Co., Ltd.), hereinafter Triton X-100) was prepared and used as a sample extract for control 1. Next, in order to verify EDTA and EGTA as chelating agents, sample extracts of each composition were prepared (see Table 1 for details).
  • a cotton swab (Ex Swab-002; manufactured by Denka Co., Ltd.) was made to suck the nasal suction solution, and this was suspended in 400 ⁇ L of the sample extract of each composition. 30 ⁇ L of inactivated hMPV was added thereto and mixed. 50 ⁇ L of the mixture was added dropwise to the sample pad portion of the hMPV test piece, and visual judgment was performed 5 minutes later.
  • Example 2 Verification of the effect of suppressing false negatives by hMPV-positive nasal suction sample in the hMPV antigen detection immunochromatography method HMPV antigen detection using sample extract No. 5 containing a 50 mM chelating agent, which was highly effective in Example 1.
  • HMPV antigen detection using sample extract No. 5 containing a 50 mM chelating agent which was highly effective in Example 1.
  • a cotton swab (Ex Swab-002; manufactured by Denka Co., Ltd.) was made to suck the hMPV-positive nasal suction solution, and this was suspended in 400 ⁇ L of the sample extract of each composition. 50 ⁇ L of the mixture was added dropwise to the sample pad portion of the hMPV test piece, and visual judgment was performed 5 minutes later.
  • Example 3 Verification of False Negative Suppression Effect by Saliva Specimen in hMPV Antigen Detection Immunochromatography Using the sample extracts of each composition in Table 1, verification of false negative suppression effect by saliva sample in hMPV antigen detection immunochromatographic method was performed. rice field.
  • a cotton swab (Ex Swab-001; manufactured by Denka Co., Ltd.) was included in the mouth, and saliva was sucked well, and this was suspended in 400 ⁇ L of the sample extract of each composition. 30 ⁇ L of inactivated hMPV was added thereto and mixed. 50 ⁇ L of the mixture was added dropwise to the sample pad portion of the hMPV test piece, and visual judgment was performed 5 minutes later.
  • the chelating agent EDTA was able to suppress false negative at a concentration of 10 mM or more, and the effect was particularly high in the range of 50 mM to 300 mM.
  • Table 4 The obtained results are shown in Table 4.
  • Example 4 Verification of False Positive Suppression Effect by Saliva Specimen in hMPV Antigen Detection Immunochromatography Using the sample extracts of each composition in Table 1, verification of false positive suppression effect by saliva sample in hMPV antigen detection immunochromatography method was performed. rice field.
  • a cotton swab (Ex Swab-001; manufactured by Denka Co., Ltd.) was included in the mouth, and saliva was sucked well, and this was suspended in 400 ⁇ L of the sample extract of each composition. 30 ⁇ L of inactivated hMPV was added thereto and mixed. 50 ⁇ L of the mixture was added dropwise to the sample pad portion of the hMPV test piece, and visual judgment was performed 5 minutes later.
  • Example 5 Verification of false negative suppression effect in hMPV-positive nasal aspiration sample by the timing of contact between the sample and the antigen in the sample in the hMPV antigen detection immunochromatography method. The effect of suppressing false negatives in the hMPV-positive nasal suction sample according to the contact timing of the agent was verified under each condition shown in Table 6.
  • a cotton swab (Ex Swab-002; manufactured by Denka Co., Ltd.) was made to suck the hMPV-positive nasal suction solution, and this was suspended in 400 ⁇ L of the sample extract of each composition.
  • 2% (w / v) TritonX-100 and 50 mM EDTA were added to the suspension under the conditions shown in Table 6, and false negatives were caused by the presence or absence of EDTA when the virus was destroyed by 2% (w / v) TritonX-100. We verified whether it had an effect on the effect of suppressing the change. 50 ⁇ L of the mixed solution under each condition was added dropwise to the sample pad portion of the hMPV test piece, and visual judgment was performed 5 minutes later.
  • Example 6 Comparison of Color Development Intensity of Specimen Extract and Control Specimen Extract in hMPV Antigen Detection Immunochromatography Using the sample extract of each composition in Table 1, the color development of the sample extract and the conventional sample extract in the hMPV antigen detection immunochromatography method. A comparative test of strength was performed.
  • the method of the present invention can be used for accurate detection of various substances.

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Abstract

鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体、唾液検体等の体液に由来する検体からウイルス、細菌、検出対象とするタンパク質等の抗原を抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の反応を利用した検出試薬で検出するにあたり、従来の方法では抑制しきれなかった偽陰性反応および偽陽性反応を強く抑制することを目的とする。　抗原抗体反応または相互作用を有する物質同士の結合反応を利用して検体中の被検出物質を検出する検査試薬であって、キレート剤を含有する検体抽出液を含む検査試薬。

Description

シグナルの低下を改善した検査試薬
　本発明は、鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体、唾液検体等の体液に由来する検体からウイルス・細菌、検出対象とするタンパク質等の被検出物質を抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した検出試薬で検出するにあたり、検体抽出液にキレート剤を使用することで、従来の方法では抑制しきれなかった偽陰性反応および偽陽性反応を強く抑制できる技術に関する。
　近年、抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した、ウイルスや細菌等の病原体感染の有無、妊娠の有無などを検出する様々な検査試薬やキットが次々と開発されている。いずれの検査試薬も患者から検体を採取した後、検出反応に適した条件を作り出すための前処理工程が含まれており、この工程は正確な結果を得るために重要である。特に簡易検査試薬の多くは、特別な設備を必要とせず操作も簡単で安価であるという特徴を有し、大病院や医療検査センター以外にも一般の病院や診療所で広く使用されており、検査の専門家以外のユーザーが使用することも多い。そのため、試薬の検査精度が高いことが非常に重要となっている。現在市場にある簡易検査試薬の例としては、病原体の感染を検査する簡易検査試薬や妊娠診断のための簡易検査試薬が挙げられる。これらの検査試薬は患者が最初に訪れる医療機関で実施される場合が多く、患者から採取した検体についてその場で感染の有無や妊娠の有無が判別でき、早い段階で治療措置等を施すことができるため、簡易検査試薬の医療における重要性は益々高まっている。そして簡易検査試薬の利用増に伴い、ユーザーからは試薬の性能として、より再現性の高い検査結果や検査精度が求められている。
　現在、簡易検査方法の代表的な試薬として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法、特にイムノクロマト法が一般に知られている。イムノクロマト法は被検出物質に特異的に結合する捕捉体(捕捉物質)、および被検出物質に特異的に結合する標識体の複合体をメンブレン上に形成させて、標識を検出／定量することで、被検出物質の検出（測定あるいは定量）を行う。イムノクロマト法は測定装置が簡単で、またコストの点でも優れているため多種多様の被検出物質の検出に広く用いられている。
　イムノクロマト法の一つの形態においては、ニトロセルロース等のメンブレンストリップ上に被検出物質に特異的に結合する抗体を捕捉物質として固相化した検出部、および被検出物質に特異的に結合する標識体を含む標識体部を備えた検査デバイスに、被検出物質を含む検体試料を滴下して、被検出物質－標識体の複合体を形成させながら展開して検出部でこの複合体を捕捉することで標識を検出あるいは定量する。
　近年、イムノクロマト法を含む臨床診断薬に関しては、診断結果がより信頼性の高いものとなることが臨床現場から望まれており、試薬の信頼性のさらなる向上が課題となっている。信頼性の高い検査試薬とは、感度と特異性が高く、誤判定を引き起こしにくい検査試薬である。特に特異性に関しては、患者それぞれのバックグラウンドの違いに由来する検体成分の多様性に、いかに試薬設計で対応することができるかという技術的課題が常に存在しており、より効果的な非特異反応の解消は簡易検査法において極めて重要な課題である。これらの課題を解決するためにアルギニンやリジンなどの塩基性アミノ酸や、無機塩類、グリシンエチルエステル、界面活性剤、動物由来免疫グロブリンなどを検体に接触させることで、特異性の改善に一定の効果が見られることが報告されているが（特許文献１、２および３を参照）、いずれも効果が限定的であり、抑制できない非特異反応が未だ存在する。そのためより強く特異性を改善し、感度も低下させない技術が望まれている。
特開２００３－２７９５７７号公報 特開２００５－２４３２３号公報 特開２００４－３０１６８４号公報
　鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体、唾液検体等の体液に由来する検体からウイルス、細菌、検出対象とするタンパク質等の被検出物質を抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した検出試薬で検出するにあたり、従来の方法では抑制しきれなかった偽陽性反応や偽陰性反応がいまだに存在し、正確な診断を妨げる一因となっている。本発明では、感度を低下させることなく、偽陰性反応および偽陽性反応を強く抑制できる成分を含む検体抽出液や検体抽出方法を使用した検査試薬を提供する。
　本発明者らは、鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体、唾液検体等の体液に由来する検体を試験試料とした際に発生する非特異反応をより強く抑制する方法を鋭意探索した結果、従来の方法よりも顕著にシグナルの低下を抑制しうる成分を見出し、さらにこれを検体抽出液や検出反応より前の工程や検出反応と同時の工程で検体と接触する部材等に添加することによって、従来法で検出されていた偽陰性反応を抑制できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下のとおりである。
[１]　抗原抗体反応または相互作用を有する物質同士の結合反応を利用して検体中の被検出物質を検出する検査キットであって、キレート剤を含有する検体抽出液を含む検査試薬。
[２]　シグナルの低下を抑制する、[１]の検査試薬。
[３]　検体抽出液に、さらに界面活性剤が含まれる、[１]または[２]の検査試薬。
[４]　イムノクロマト用検査試薬であり、イムノクロマト用検査デバイスとキレート剤を含有する検体抽出液を含む、[１]～[３]のいずれかの検査試薬。
[５]　キレート剤を含有する検体抽出液を含浸した部位を含むイムノクロマト用検査デバイスである、[１]～[３]のいずれかの検査試薬。
[６]　検体抽出液が8 mM～300 mMのキレート剤を含む、[１]～[５]のいずれかの検査試薬。
[７]　検体抽出液が25 mM～300 mMのキレート剤を含む、[６]の検査試薬。
[８]　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（PDTA）およびニトリロ三酢酸（NTA）からなる群から選択される、[１]～[７]のいずれかの検査試薬。
[９]　鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体および唾液検体からなる群から選択される検体中のウイルス抗原、細菌抗原、およびタンパク質抗原からなる群から選択される被検出物質を、抗原抗体反応または相互作用を有する物質同士の反応を利用して検出する方法において、検体を予めキレート剤と接触させることによって、シグナルの低下を抑制して検出する方法。
[１０]　被検出物質を検出する方法が、イムノクロマト法であり、キレート剤を含む検体抽出液に検体を入れ、該検体抽出液をイムノクロマト用検査デバイスに添加する、[９]の方法。
[１１]　被検出物質を検出する方法が、イムノクロマト法であり、検体をキレート剤を含む検体抽出液を含浸した部位を含むイムノクロマト用検査デバイスに添加する、[９]の方法。
[１２]　検体抽出液に、さらに界面活性剤が含まれる、[１０]または[１１]の方法。
[１３]　キレート剤を8 mM～300 mM含む検体抽出液を用いる、[９]～[１２]のいずれかの方法。
[１４]　キレート剤を25 mM～300 mM含む検体抽出液を用いる、[１３]の方法。
[１５]　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（PDTA）およびニトリロ三酢酸（NTA）からなる群から選択される、[９]～[１４]のいずれかの方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2020-126241号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体、唾液検体等の体液に由来する検体などから抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用して特定のウイルス、細菌、タンパク質、低分子化合物等を検出する検出試薬において、検体の混入により発生するシグナルの低下をより強く抑制し、再現性が高く検査精度の高い検査試薬を提供できる。また非特異反応による誤った臨床診断をより防ぐことができ、患者およびユーザーである医師、検査技師および看護師の双方にとって有益である。
本発明で用いる検査デバイスの構造を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、検体中の被検出物質を抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した検出試薬で検出するにあたり、キレート剤と検体を接触させることにより、偽陰性反応および偽陽性反応を抑制し、シグナルの低下、すなわち感度の低下を防止する方法である。
　本発明において、抗体は抗体の抗原結合性断片も含む。
（検体）
　用いる検体は限定されない。例えば、検体として、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、咽頭洗浄液、鼻腔洗浄液、鼻かみ鼻汁液、唾液等が挙げられる。これらを咽頭ぬぐい検体、鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、咽頭洗浄検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、唾液検体等と呼ぶ。これらの検体は、緩衝液で希釈して用いることもでき、希釈せずにそのまま用いることができる。
（検出対象物質）
　被検出物質も何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。具体例として、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RS(respiratory syncytial)ウイルス、ヒトメタニューモウイルス（hMPV）、A型肝炎ウイルス（HAV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ノロウイルス、SARS-CoVやMERS-CoVやSARS-CoV2などのコロナウイルス等のウイルス抗原、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、A群溶連菌、B群溶連菌、レジオネラ属菌等の細菌抗原；細菌等が産生する毒素；マイコプラズマ抗原；クラミジア・トラコマティス等のクラミジア抗原；原生動物の抗原；真菌の抗原；ヒト絨毛性ゴナドトロピン等のホルモン；C反応性タンパク質、ミオグロビン、心筋トロポニン、プロカルシトニン等のタンパク質；各種腫瘍マーカー；農薬、環境ホルモン等の抗原を挙げることができ、さらに、上記細菌、ウイルス等に対する抗体を挙げることができる。
（検体の採取）
　検体の採取方法も何ら限定されないが、咽頭ぬぐい検体、鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、咽頭洗浄検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、唾液検体を、綿棒等の検体採取器具を用いて採取する方法や吸引器による吸引等を利用して採取する方法が挙げられる。
（キレート剤と採取した検体の接触）
　本発明の方法においては、検体とキレート剤とを接触させる。ここで、検体をキレート剤と接触させることにより、その結果、検体を測定した場合に、偽陰性および偽陽性を抑制することができる。なお、検体とキレート剤と接触させるときに、被検物質とキレート剤が接触するので、本発明の方法においては、被検出物質とキレート剤とを接触させるともいう。また、検体をキレート剤と接触させることを、検体をキレート剤で処理するということもある。
　また、検体抽出液は、検体中の被検出物質を浮遊させ測定しやすくする液体をいうが、例えば、細胞等から特定の被検出物質を溶解等により抽出する必要はなく、単に検体処理液や検体希釈液、検体浮遊液ということもできる。
　本発明において検体とキレート剤を試験に供する前に予め接触する必要がある。ここで、試験に供する前とは、検体中の被検出物質とそれに対する抗体または抗原と反応する前、または検体中の被検出物質が相互作用を有する物質と反応する前をさす。抗体または抗原との反応は、抗体または抗原との結合をいい、検体中の被検出物質と相互作用を有する物質との反応は、相互作用を有する物質との結合をいう。
　本発明のキレート剤と検体との接触方法として、検体をキレート剤を含む溶液に入れて混合して接触させる方法、および測定に用いる検査デバイスにキレート剤を含む検体抽出液を含ませておき、検体を検査に用いる検査デバイスに添加することにより検体をキレート剤と接触させる方法が挙げられる。
　検体をキレート剤を含む溶液と混合して接触させる方法の具体例として、採取した検体を浮遊、分散させる検体抽出液にキレート剤を含ませておき、検体を検体抽出液に添加し混合するときに検体とキレート剤と接触させる方法が挙げられる。例えばキレート剤を含有した検体抽出液を使用する場合、検体が鼻腔ぬぐい液の場合、綿棒を使用して鼻腔ぬぐい液を採取し、採取した検体を浸み込ませた綿棒を前記検体抽出液に入れて検体を浮遊、分散させ抽出することにより、検体とキレート剤とを接触させることができる。
　測定に用いる検査デバイスにキレート剤を含む検体抽出液を含ませておき、検体を検査デバイスに添加することにより検体をキレート剤と接触させる方法の具体例として、検査デバイスが有するろ過フィルターなどの繊維状または多孔性基材にキレート剤を含む検体抽出液を含ませておき、採取した検体を検査デバイスに添加したときに、検体を繊維状または多孔性基材に含ませておいたキレート剤と接触させる方法が挙げられる。このように検査デバイスとして、後述のイムノクロマト法用デバイスが挙げられる。
　検査デバイスの多孔性基材の材質は、何ら限定されるものではないが、パルプ、綿、羊毛、ポリエステル、ポリプロピレン、ナイロン、アクリルガラス繊維、ニトロセルロース等が挙げられる。測定に用いる検査デバイスにキレート剤を含む検体抽出液を含ませておき、検体を検査デバイスに添加することにより検体をキレート剤と接触させる場合は、例えば、キレート剤を含む検体抽出液を多孔性基材に含浸させ乾燥させておき、検査デバイス上で被検出物質を検出するための反応が起こる前の工程または同時の工程で検体と該多孔性基材と接触させればよい。例えば、検査デバイスに検体を添加した場合、検体は検査デバイス上を展開し、デバイス上の反応が起こる部位に達して抗体抗原反応等の反応が起こる。検査デバイス上の反応が起こる部位より前の部位にキレート剤を含む検体抽出液を含ませた多孔性基材を設けておくことにより、検体は反応前にキレート剤と接触する。例えば、多孔性基材としてろ過フィルターを用い、検体を添加する部位にキレート剤を含む検体抽出液を含むろ過フィルターを設ければよい。この場合においては、検体として鼻腔ぬぐい液を用いる場合、綿棒を使用して鼻腔ぬぐい液を採取し、採取した検体を浸み込ませた綿棒をキレート剤を含まない任意の組成の検体抽出液に入れて検体を分散、溶解させた後、検査デバイスの構成部材である、キレート剤を含ませたろ過フィルターに上述の検体抽出液を含浸させておくことにより検体とキレート剤を接触させることができる。
（キレート剤およびその濃度）
　本発明の方法で用いるキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（PDTA）、ニトリロ三酢酸（NTA）等が挙げられる。これらのキレート剤は、ナトリウム塩やカリウム塩も含む。
　前述のように、キレート剤は、検体抽出液やろ過フィルター等に検体抽出液として含有される。偽陰性反応の抑制のためには、キレート剤の濃度は8 mM以上が好ましく、10 mM以上がさらに好ましく、50 mM以上がさらに好ましい。またこれらのキレート剤を同時に複数種類使用することもでき、その場合のキレート剤のトータル濃度も8 mM以上が好ましく、10 mM以上がさらに好ましく、50 mM以上がさらに好ましい。また、偽陽性反応の抑制のためには、キレート剤の濃度は25 mM以上が好ましく、40 mM以上がさらに好ましく、50 mM以上がさらに好ましい。キレート剤の濃度の上限は定める必要はないが、例えば、1000mM以下、500 mM以下、300 mM以下、または150 mM以下である。例えば、25mM～300mM、40mM～300ｍM、もしくは50mM～300mMの範囲で用いることにより、偽陰性反応と偽陽性反応の両方を良好に抑制することができる。また、150 mM以下で用いる場合、発色強度の低下を抑えることができる。なお、ろ過フィルター等の多孔性基材にキレート剤を含む検体抽出液を含ませる場合も上記の濃度のキレート剤を多孔性基材に含ませればよい。
（キレート剤以外のその他の成分）
　本発明における検体抽出液や検出反応より前の工程で検体と接触する多孔性基材等の部材等に含侵させる検体抽出液には、キレート剤以外に、非特異反応を軽減できる既知の物質や、界面活性剤、pH緩衝性の成分、各種タンパク質、塩類、糖類を含んでもよい。例えば、非特異反応を軽減できる成分として、アルギニン、アルギニンエチルエステル、アルギニンメチルエステル、グリシンエチルエステル、グリシンメチルエステル、リジンおよび上述の化合物の各種異性体等が挙げられる。また界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコールモノ‐p-イソオクチルフェニルエーテルやモノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタンなどの非イオン性界面活性剤、CHAPSやラウリルアミドスルホベタインなどの両イオン性界面活性剤、ドデシル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤が挙げられる。検体抽出液中の界面活性剤の濃度は0.5～５(w/v)％が好ましく、１～３(w/v)％がさらに好ましく、1.5～2.5(w/v)％がさらに好ましい。界面活性剤はウイルス破壊作用があり、界面活性剤によるウイルスの破壊時にキレート剤が存在すると効果が高まる。従って、検体抽出液に界面活性剤とキレート剤が共存していることが好ましい。
　緩衝性成分としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などが挙げられる。タンパク質成分としては、BSA（ウシ血清アルブミン）、カゼイン、ゼラチン、IgG等が挙げられる。塩類としては塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどが挙げられる。
（検出方法）
　本発明の方法においては、抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した方法により検出する。相互作用を有する物質同士の組合せとしては、リガンドとレセプターの組合せ、受容体とレセプターの組合せ、ビオチンとアビジン若しくはストレプトアビジンの組合せ等が挙げられる。
　抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士を利用した検出方法であれば特に限定されないが、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、免疫比濁法、免疫比ろう法、化学発光酵素免疫測定法（CLEIA）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）などの酵素免疫測定法（EIA）等が挙げられ、ラテックス凝集法、免疫比濁法、免疫比ろう法が挙げられる。これらの多くは免疫学的手法であり、抗原抗体反応を利用するが、抗原抗体反応の代わりに相互作用を有する物質同士の反応を利用することもできる。これらの方法の中でも、サンドイッチ法が好ましい。典型的なサンドイッチ法においては、被検出物質と結合する第１の物質を特定の担体に被検出物質捕捉物質として固相化しておき該物質に被検出物質を結合させ、さらに被検出物質に結合する第２の物質であって、標識した物質を被検出物質に結合させ、「被検出物質と結合する第１の物質-被検出物質-被検出物質と結合する第２の物質であって標識した物質」（「-」は結合を示す）の複合体を形成させ、標識物質から発せられるシグナルを測定することにより、被検出物質を測定する。被検出物質と結合する第１の物質と被検出物質と結合する第２の物質は同じ物質でもよい。被検出物質と被検出物質と結合する物質は抗原と抗体または抗体と抗原であってもよいし、互いに相互作用を有する物質であってもよい。被検出物質と結合する第１の物質が固定化される固相としては、タンパク質等の物質を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、被検出物質と結合する第２の物質を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。
　サンドイッチ法の中でも臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法であるイムノクロマト法が特に好ましい。以下に、抗原抗体反応を利用した一般的なイムノクロマト法について説明する。イムノクロマト法用検査デバイスを図１に示す。
　図１の上が上面図、下が切断断面図である。検査デバイスは、プラスチック板（６）上に積層されたニトロセルロースメンブレン（１）上に種々の部位が積層されている。図示の具体例では、プラスチック板（６）上に、抗体等の被検出物質捕捉物質等で２個の検出部（３）が形成されたニトロセルロースメンブレン（１）、濾紙で形成された吸収パッド部（５）、標識体部（２）、およびガラス繊維フィルターで形成された試料添加部（４）がそれぞれ積層されている。
　そして、図示のように、吸収パッド部（５）の一方の端部領域と、ニトロセルロースメンブレン（１）の一方の端部領域、ニトロセルロースメンブレン（１）の他方の端部領域と標識体部（２）の一方の端部領域、標識体部（２）の他方の端部領域と試料添加部（４）の一方の端部領域がそれぞれ重ね合わされており、これにより、連続したラテラルフローの流路が形成されている。
　標識体部（２）には、抗体等の被検出物質捕捉物質に標識物質が化学的または物理的に結合した標識体が含まれている。標識物質としては、金コロイド粒子、白金コロイド粒子、カラーラテックス粒子、磁性粒子、酵素、量子ドット、蛍光色素や蛍光体、量子ドットなどが挙げられる。標識体部は、上記標識体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維（グラスファイバー）や不織布等を用いることができる。前記標識体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を安定化乾燥標識体パッドとも呼ぶ。すなわち、標識体部は、被検出物質と抗原抗体反応により結合する抗体であって着色ラテックス粒子で標識した抗体を含む、上記の安定化乾燥標識体パッドを含む部位である。
　また、検出部（３）は、被検出物質と抗原抗体反応により結合する抗体を捕捉物質としてライン状に固相化された部位である。
　被検出物質の検出反応より前の工程や検出反応と同時の工程で検体と接触する部材等の例として、上記の（１）（２）（４）などが挙げられるが、被検出物質の検出反応より前の工程や検出反応と同時の工程で検体と接触する部材であればこれに限定されるものではない。検体を試料添加部（４）に添加すると、検体は試料添加部（４）から吸収パッド部（５）に向かって流れる。試料添加部（４）から吸収パッド部（５）への流れを上流から下流への流れと表現した場合、被検出物質の検出反応より前の工程や検出反応と同時の工程で検体と接触する部材は、検出反応が起こる部位よりも上流に存在するということができる。
　次にこの検査デバイスを用いた免疫測定法について説明する。先ず、検体を検体抽出液に浮遊し、被検出物質を抽出させた検体試料を調製する。メンブレン次いで、検査デバイスの試料添加部（４）に前記検体試料を滴下する。被検出物質を含む検体試料は、メンブレン上を水平方向に移動しながら標識体部（２）に含浸されて標識体を溶解させ、展開する。検体試料中に被検出物質が存在すれば、被検出物質－標識体の複合体を形成する。該複合体が検出部（３）に到達するとそのライン上に、捕捉抗体－被検出物質－標識体の複合体が形成される。この複合体中の標識物質から発せられるシグナルにより、複合体の存在を検出することにより検体中の被検出物質の有無を判定することができる。反応に関与しなかった他の成分等は、吸収パッド部（５）に吸収される。なお、図１に示す例では、検出部（３）が２個存在するが、これは、例えばA型インフルエンザウイルスとB型インフルエンザウイルスのような２種類の被検出物質をそれぞれ捕捉するためのものである。このような検出部（３）を複数設けることにより、複数種類の被検出物質を同時に免疫測定することが可能である。
　上記のイムノクロマト法において、検体と混合し被検出物質を抽出するための検体抽出液にキレート剤を含ませておいてもよいし、イムノクロマト法用検査デバイスのニトロセルロースメンブレン（１）、標識体部（２）、および／または試料添加部（４）にキレート剤を含ませておいてもよい。
　本発明は、抗原抗体反応や相互作用を有する物質同士の結合反応を利用した検査試薬を含む。該検査試薬は検査デバイス自体をいうこともあり、検査デバイスとその他の試薬を含む検査キットをいうこともある。本発明の検査試薬は、例えば、イムノクロマト法検査デバイスとキレート剤を含む検体抽出液を含む検査キットを含む。また、本発明の検査試薬はキレート剤を含む検体抽出液を含む部位を備えたイムノクロマト法検査デバイスを含む。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例では、本発明の検体抽出液を用いた場合に、hMPV（ヒトメタニューモウイルス）を検出するイムノクロマト法キットにおいて検体での非特異反応が抑制された実施例について説明する。
調製例
１．抗hMPVモノクローナル抗体の作製
　hMPV抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol. 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、hMPV抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
　得られた腹水からプロテインAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィー法により、それぞれIgGを精製し、2種類の精製抗hMPV抗体を得た。
２．抗hMPV抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
　精製した抗hMPV抗体を1.0 mg/mLになるように精製水で希釈した液をPETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、45℃、30分間乾燥させ、抗hMPV抗体固定化メンブレンを得た(以下抗体固定化メンブレンとする)。
３．抗hMPV抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　ニトロセルロースメンブレンへの固定化に使用しなかったもう一つの精製した抗hMPV抗体を1.0 mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子(Thermo scientific社製)を0.1(w/v)％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1(w/v)%になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50 mM Tris(pH9.0)、3(w/v)%BSAに再浮遊し、抗hMPV抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。
４．抗hMPV抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
　３．で得た抗hMPV抗体結合着色ポリスチレン粒子をグラスファイバー不織布に所定量1.0 μgを塗布し、45℃、30分間乾燥させた。
５．固定化メンブレン、乾燥パッド、他部材との貼り合わせ
　２．および４．で調製した抗体固定化メンブレンと乾燥パッドを他部材(バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド)と貼り合せて5 mm幅に切断し、hMPV試験片（検査デバイス）とした。
６．検体抽出液の作製
　以下のそれぞれの実施例に記載する。
実施例１　hMPV抗原検出イムノクロマト法における鼻腔吸引検体による偽陰性化抑制効果の検証
　50 mMトリス緩衝液(pH8.0)、2%(w/v)ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（商品名TritonX-100（ナカライ社製）、以下TritonX-100）を含む混合液を作製し、対照１の検体抽出液とした。次にキレート剤としてEDTA、EGTAについて検証を行うべく、各組成の検体抽出液を調製した(詳細は表１参照)。
　綿棒(Exスワブ-002；デンカ社製)に鼻腔吸引液を吸わせて、これを各組成の検体抽出液400μLにそれぞれ浮遊させた。これに不活化hMPVを30μL加え、混合した。混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　結果、対照が鼻腔吸引液により偽陰性化してしまうのに対して、キレート剤であるEDTA、EGTAは10 mM以上の濃度で偽陰性化を抑制でき、特に50 mMから300 mMの範囲で効果が高かった。得られた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　hMPV抗原検出イムノクロマト法におけるhMPV陽性鼻腔吸引検体による偽陰性化抑制効果の検証
　実施例１で効果の高かった50 mMのキレート剤を含む検体抽出液No.5を用いて、hMPV抗原検出イムノクロマト法におけるhMPV陽性鼻腔吸引液検体による偽陰性化抑制効果の検証を行った。
　綿棒(Exスワブ-002；デンカ社製)にhMPV陽性鼻腔吸引液を吸わせて、これを各組成の検体抽出液400μLにそれぞれ浮遊させた。混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
　結果、実施例１と同様に検体抽出液No.5を使用することで、hMPV陽性鼻腔吸引検体においても偽陰性化を抑制することが出来た。結果を表３にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例３　hMPV抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陰性化抑制効果の検証
　表１の各組成の検体抽出液を用いて、hMPV抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陰性化抑制効果の検証を行った。
　綿棒(Exスワブ-001；デンカ社製)を口に含み、よく唾液を吸わせて、これを各組成の検体抽出液400μLにそれぞれ浮遊させた。これに不活化hMPVを30μL加え、混合した。混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
　結果、対照が唾液により偽陰性化してしまうのに対して、キレート剤であるEDTAは10 mM以上の濃度で偽陰性化を抑制でき、特に50 mMから300 mMの範囲で効果が高かった。得られた結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例４　hMPV抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陽性化抑制効果の検証
　表１の各組成の検体抽出液を用いて、hMPV抗原検出イムノクロマト法における唾液検体による偽陽性化抑制効果の検証を行った。
　綿棒(Exスワブ-001；デンカ社製)を口に含み、よく唾液を吸わせて、これを各組成の検体抽出液400μLにそれぞれ浮遊させた。これに不活化hMPVを30μL加え、混合した。混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
　結果、対照が唾液により偽陽性化してしまうのに対して、キレート剤であるEDTAは50 mM以上の濃度で偽陽性化を抑制できた。得られた結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例５　hMPV抗原検出イムノクロマト法において検体、検体内の抗原とキレート剤の接触するタイミングによるhMPV陽性鼻腔吸引検体における偽陰性化抑制効果の検証
　hMPV抗原検出イムノクロマト法において検体、検体内の抗原とキレート剤の接触するタイミングによるhMPV陽性鼻腔吸引検体における偽陰性化抑制効果の検証を、表６に示す各条件で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　綿棒(Exスワブ-002；デンカ社製)にhMPV陽性鼻腔吸引液を吸わせて、これを各組成の検体抽出液400μLにそれぞれ浮遊させた。浮遊液にそれぞれ表６に記す条件で2%(w/v)TritonX-100、50 mM EDTAを添加し、2%(w/v)TritonX-100によるウイルスの破壊時のEDTAの有無によって偽陰性化抑制効果に影響があるかの検証を行った。各条件の混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
　その結果、条件1、2が鼻腔吸引液により偽陰性化してしまうのに対して、条件3、4では偽陰性化を抑制できた。得られた結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　このことから、TritonX-100によるウイルスの破壊時にEDTAが存在することでhMPV陽性鼻腔吸引検体における偽陰性化の抑制効果が得られると考えられた。
実施例６　hMPV抗原検出イムノクロマト法における検体抽出液と対照検体抽出液の発色強度比較
　表１の各組成の検体抽出液を用いて、hMPV抗原検出イムノクロマト法における検体抽出液と従来検体抽出液の発色強度の比較試験を行った。
　各組成の検体抽出液400μLに、不活化hMPVを30μL加え、混合する。混合液50μLをhMPV試験片のサンプルパッド部分に滴加し、5分後に目視判定を行った。
　結果、対照の検体抽出液と検体抽出液No.1～7では発色が見られたが、検体抽出液No.8では発色は見られなかった。また、発色強度は検体抽出液No.7で低下しており、EDTAが10～150 mMの範囲ではシグナル強度を低下させずに特異性を向上させることができた。得られた結果を表８に示す。なお発色強度の数値は＋、＋＋、＋＋＋の順に、シグナルが強く出ていることを示し、0は発色が見られなかったことを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　本発明の方法は、種々の物質の正確な検出に利用することができる。
１　ニトロセルロースメンブレン
２　標識体部
３　検出部
４　試料添加部
５　吸収パッド部
６　プラスチック板
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　抗原抗体反応または相互作用を有する物質同士の結合反応を利用して検体中の被検出物質を検出する検査キットであって、キレート剤を含有する検体抽出液を含む検査試薬。
  2. 　シグナルの低下を抑制する、請求項１記載の検査試薬。
  3. 　検体抽出液に、さらに界面活性剤が含まれる、請求項１または２に記載の検査試薬。
  4. 　イムノクロマト用検査試薬であり、イムノクロマト用検査デバイスとキレート剤を含有する検体抽出液を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の検査試薬。
  5. 　キレート剤を含有する検体抽出液を含浸した部位を含むイムノクロマト用検査デバイスである、請求項１～３のいずれか１項に記載の検査試薬。
  6. 　検体抽出液が8 mM～300 mMのキレート剤を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の検査試薬。
  7. 　検体抽出液が25 mM～300 mMのキレート剤を含む、請求項６記載の検査試薬。
  8. 　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（PDTA）およびニトリロ三酢酸（NTA）からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の検査試薬。
  9. 　鼻腔ぬぐい検体、鼻腔吸引検体、鼻腔洗浄検体、鼻かみ鼻汁検体、咽頭ぬぐい検体および唾液検体からなる群から選択される検体中のウイルス抗原、細菌抗原、およびタンパク質抗原からなる群から選択される被検出物質を、抗原抗体反応または相互作用を有する物質同士の反応を利用して検出する方法において、検体を予めキレート剤と接触させることによって、シグナルの低下を抑制して検出する方法。
  10. 　被検出物質を検出する方法が、イムノクロマト法であり、キレート剤を含む検体抽出液に検体を入れ、該検体抽出液をイムノクロマト用検査デバイスに添加する、請求項９記載の方法。
  11. 　被検出物質を検出する方法が、イムノクロマト法であり、検体をキレート剤を含む検体抽出液を含浸した部位を含むイムノクロマト用検査デバイスに添加する、請求項９記載の方法。
  12. 　検体抽出液に、さらに界面活性剤が含まれる、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 　キレート剤を8 mM～300 mM含む検体抽出液を用いる、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　キレート剤を25 mM～300 mM含む検体抽出液を用いる、請求項１３記載の方法。
  15. 　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、１，３－プロパンジアミン四酢酸（PDTA）およびニトリロ三酢酸（NTA）からなる群から選択される、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
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