CN116157683A - 改善了信号降低的检查试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于由利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的反应的检测试剂从鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本、唾液样本等来自体液的样本中检测病毒、细菌、作为检测对象的蛋白质等抗原时,强烈抑制现有的方法无法完全抑制的假阴性反应及假阳性反应。一种检查试剂,是利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应来检测样本中的被检测物质的检查试剂,包含含有螯合剂的样本提取液。
Description
技术领域
本发明涉及一种由利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应的检测试剂从鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本、唾液样本等来自体液的样本中检测病毒及细菌、作为检测对象的蛋白质等被检测物质时,通过在样本提取液中使用螯合剂,能够强烈抑制现有的方法无法完全抑制的假阴性反应及假阳性反应的技术。
背景技术
近年来,陆续开发了各种用于检测有无病毒、细菌等病原体感染、有无妊娠等的检查试剂及试剂盒,这些检查试剂及试剂盒利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应。这些检查试剂均包括从患者采集样本之后用于形成适合检测反应的条件的预处理工序,该工序对于获得准确的结果至关重要。特别是简易检查试剂大多具有无需特殊器件且操作简单廉价的特点,除大医院及医疗检查中心以外,在普通医院及诊所中也得到广泛使用,检查专家以外的用户也经常使用。因此,试剂的检查精度高是非常重要的。作为目前市场上的简易检查试剂,包括检查病原体感染的简易检查试剂及用于诊断妊娠的简易检查试剂等。这些检查试剂多在患者最初去往的医疗机构实施,对于从患者采集到的样本当场判断有无感染或妊娠,能够在较早阶段实施治疗措施等,因此,简易检查试剂在医疗中的重要性日益显著。并且,随着简易检查试剂的使用增加,就试剂的性能而言,用户方面也要求更高的重现性的检查结果及检查精度。
目前,作为简易检查方法的代表性试剂,已知有利用抗原抗体反应的免疫测定法、特别是免疫色谱法。免疫色谱法在薄膜上形成特异性结合被检测物质的捕捉体(捕捉物质)及特异性结合被检测物质的标记物的复合物,并对标记进行检测/定量,从而检测(测定或者定量)被检测物质。免疫色谱法的测定装置简单,并且在成本方面也很优异,因此被广泛用于各种被检测物质的检测。
在免疫色谱法的一种方式中,向检查器件中滴加包含被检测物质的样本样品,形成被检测物质-标记物的复合物使其展开,并通过检测部捕捉该复合物,从而对标记进行检测或者定量,其中,检查器件具备硝酸纤维素等膜条上固相化有特异性结合被检测物质的抗体作为捕捉物质的检测部、及包含特异性结合被检测物质的标记物的标记物部。
近年来,临床实践中希望包括免疫色谱法在内的临床诊断药物的诊断结果更为可靠,进一步提高试剂的可靠性成为课题。可靠性高的检查试剂是指灵敏度和特异性高,从而不易引起误判的检查试剂。特别是在特异性方面,一直存在怎样能够通过试剂设计来应对由于不同患者的背景差异所导致的样本成分的多样性的技术课题,更有效地消除非特异反应在简易检查法中是非常重要的课题。为了解决这些技术问题,有报道指出通过使精氨酸及赖氨酸等碱性氨基酸、无机盐类、甘氨酸乙酯、表面活性剂、来自动物的免疫球蛋白等与样本接触对于改善特异性具有一定效果(参见专利文献1、2及3),但效果均有限,仍存在无法抑制的非特异反应。因此,需要一种更有效改善特异性,且不会降低灵敏度的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2003-279577号公报
专利文献2:日本特开2005-24323号公报
专利文献3:日本特开2004-301684号公报
发明内容
本发明所要解决的技术问题
使用利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应的检测试剂从鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本、唾液样本等来自体液的样本中检测病毒、细菌、作为检测对象的蛋白质等被检测物质时,至今仍存在现有的方法无法完全抑制的假阳性反应及假阴性反应,从而影响准确诊断。本发明中提供一种使用包含不会降低灵敏度、且能够有效抑制假阴性反应及假阳性反应的成分的样本提取液及样本提取方法的检查试剂。
用于解决技术问题的技术方案
本发明人等对更有效抑制将鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本、唾液样本等来自体液的样本作为测试样品时发生的非特异反应的方法进行了潜心研究,结果发现了能够比现有的方法更显著抑制信号降低的成分,进而发现,通过将这种成分添加于样本提取液或在检测反应前的工序或与检测反应同时进行的工序中和样本接触的部件等,能够抑制现有方法中检测到的假阴性反应,从而完成了本发明。
即,本发明如下所述。
[1]一种检查试剂,是利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应来检测样本中的被检测物质的试剂盒,其中,所述检查试剂包含含有螯合剂的样本提取液。
[2]根据[1]的检查试剂,其中,所述检查试剂抑制信号降低。
[3]根据[1]或[2]的检查试剂,其中,样本提取液中进一步包含表面活性剂。
[4]根据[1]~[3]中任一项的检查试剂,其中,所述检查试剂是免疫色谱用检查试剂,包括免疫色谱用检查器件和含有螯合剂的样本提取液。
[5]根据[1]~[3]中任一项的检查试剂,其中,所述检查试剂为包括含浸有含有螯合剂的样本提取液的部位的免疫色谱用检查器件。
[6]根据[1]~[5]中任一项的检查试剂,其中,样本提取液包含8mM~300mM的螯合剂。
[7]根据[6]的检查试剂,其中,样本提取液包含25mM~300mM的螯合剂。
[8]根据[1]~[7]中任一项的检查试剂,其中,螯合剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)及硝基三乙酸(NTA)构成的组。
[9]一种利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的反应来检测选自由鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本及唾液样本构成的组的样本中的选自由病毒抗原、细菌抗原及蛋白质抗原构成的组的被检测物质的方法,所述方法通过预先使样本与螯合剂接触来抑制信号降低并进行检测。
[10]根据[9]的方法,其中,检测被检测物质的方法为免疫色谱法,将样本放入包含螯合剂的样本提取液,将该样本提取液体添加于免疫色谱用检查器件。
[11]根据[9]的方法,其中,检测被检测物质的方法为免疫色谱法,将样本添加于包括含浸有包含螯合剂的样本提取液的部位的免疫色谱用检查器件。
[12]根据[10]或[11]的方法,其中,样本提取液中进一步包含表面活性剂。
[13]根据[9]~[12]中任一项的方法,其中,使用包含8mM~300mM螯合剂的样本提取液。
[14]根据[13]的方法,其中,使用包含25mM~300mM螯合剂的样本提取液。
[15]根据[9]~[14]中任一项的方法,其中,螯合剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)及硝基三乙酸(NTA)构成的组。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2020-126241号的公开内容。
发明效果
根据本发明,能够提供一种利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应来从鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本、唾液样本等来自体液的样本等中检测特定的病毒、细菌、蛋白质、低分子化合物等的检测试剂,该检测试剂更有效抑制因样本的混入所产生的信号的降低,重现性高,检查精度高。另外,能够进一步防止非特异反应导致的错误临床诊断,对于患者及作为使用者的医生、检查人员及护士双方均有利。
附图说明
图1是示出本发明中使用的检查器件的结构的图。
具体实施方式
下面,对本发明进行详细说明。
本发明是一种在由利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应的检测试剂来检测样本中的被检测物质时,通过使螯合剂与样本接触,抑制假阴性反应及假阳性反应,并防止信号降低、即灵敏度的降低的方法。
在本发明中,抗体也包括抗体的抗原结合片段。
(样本)
所使用的样本不受限定。例如,作为样本,可列举:咽拭子液、鼻拭子液、鼻腔吸引液、咽喉清洗液、鼻腔清洗液、鼻涕液、唾液等。将以上称为咽拭子样本、鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、咽喉清洗样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、唾液样本等。这些样本也可以用缓冲液稀释后使用,还可以不稀释而直接使用。
(待检测物质)
被检测物质也不受任何限制,可以为想要检测的任何物质。作为具体例,能够列举:流感病毒、腺病毒、RS(respiratory syncytial,呼吸道合胞)病毒、人偏肺病毒(hMPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、诺如病毒、SARS-CoV、MERS-CoV及SARS-CoV2等冠状病毒等病毒抗原、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、A群链球菌、B群链球菌、军团菌属菌等细菌抗原;细菌等所产生的毒素;支原体抗原;沙眼衣原体等衣原体抗原;原生动物的抗原;真菌的抗原;人绒毛膜***等激素;C反应蛋白、肌红蛋白、心肌肌钙蛋白、降钙素等蛋白质;各种肿瘤标志物;农药、环境激素等抗原;以及针对上述细菌、病毒等的抗体。
(样本的采集)
样本的采集方法不受任何限制,可列举如下方法:使用棉签等样本采集器具采集咽拭子样本、鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、咽喉清洗样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、唾液样本的方法、及利用吸引器产生的吸引等采集这些样本的方法。
(螯合剂与所采集样本的接触)
在本发明的方法中,使样本和螯合剂接触。在此,通过使样本与螯合剂接触,其结果是,在测定样本的情况下,能够抑制假阴性及假阳性。需要说明的,由于样本和螯合剂接触时,被测物质与螯合剂接触,因此,在本发明的方法中,也可以称为使被检测物质与螯合剂接触。另外,也将使样本与螯合剂接触称为用螯合剂处理样本。
另外,样本提取液是指使样本中的被检测物质悬浮以便于测定的液体,例如,也可以无需通过溶解等从细胞等中提取特定的被检测物质,而是简单表示样本处理液及样本稀释液、样本悬浮液。
本发明中,需要将样本和螯合剂在用于测试之前预先接触。其中,用于测试之前是指,样本中的被检测物质和针对其的抗体或抗原发生反应之前、或样本中的被检测物质与具有相互作用的物质反应之前。与抗体或抗原的反应称为与抗体或抗原结合,样本中的被检测物质与具有相互作用的物质的反应称为与具有相互作用的物质结合。
作为本发明的螯合剂与样本的接触方法,可列举:将样本放入包含螯合剂的溶液,并混合使其接触的方法、及预先使用于测定的检查器件中含有包含螯合剂的样本提取液,并将样本添加于用于检查的检查器件,从而使样本与螯合剂接触的方法。
作为使样本与包含螯合剂的溶液混合接触的方法的具体例,可列举如下方法:使采集到的样本悬浮分散而成的样本提取液中预先包含螯合剂,将样本添加于样本提取液并混合时,使样本与螯合剂接触。例如在使用含有螯合剂的样本提取液的情况下,当样本为鼻拭子液时,使用棉签采集鼻拭子液,将浸入所采集的样本后的棉签放入所述样本提取液中,使样本悬浮分散以进行提取,由此能够使样本与螯合剂接触。
作为通过预先使用于测定的检查器件中包含含有螯合剂的样本提取液,并将样本添加于检查器件来使样本与螯合剂接触的方法的具体例,可列举如下方法:预先使检查器件所具有的过滤片等纤维状或多孔基材中包含含有螯合剂的样本提取液,将所采集的样本添加于检查器件之后,使样本与预先包含在纤维状或多孔基材中的螯合剂接触。作为这样的检查器件,可列举后述的免疫色谱法用器件。
检查器件的多孔基材的材质不受丝毫限制,可列举:纸浆、棉花、羊毛、聚酯、聚丙烯、尼龙、丙烯酸玻璃纤维、硝酸纤维素等。在通过预先使用于测定的检查器件中包含含有螯合剂的样本提取液,并将样本添加于检查器件来使样本与螯合剂接触的情况下,例如,预先将包含螯合剂的样本提取液含浸于多孔基材并干燥,在检查器件上发生用于检测被检测物质的反应之前的工序或与反应同时进行的工序中使样本与该多孔基材接触即可。例如,在向检查器件中添加样本的情况下,样本在检查器件上展开,到达器件上发生反应的部位,从而产生抗体抗原反应等反应。预先在检查器件上发生反应的部位之前的部位设置包含含有螯合剂的样本提取液的多孔基材,由此使样本在反应前与螯合剂接触。例如,多孔基材使用过滤片,将包含含有螯合剂的样本提取液的过滤片设于供添加样本的部位即可。在该情况下,当使用鼻拭子液作为样本时,使用棉签采集鼻拭子液,将浸入所采集的样本后的棉签放入不包含螯合剂的任意组成的样本提取液中,使样本分散、溶解之后,预先在检查器件的组件即包含螯合剂的过滤片中含浸上述样本提取液,由此能够使样本与螯合剂接触。
(螯合剂及其浓度)
作为本发明的方法中使用的螯合剂,可列举:乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)、硝基三乙酸(NTA)等。这些螯合剂也包括钠盐及钾盐。
如前所述,螯合剂作为样本提取液包含在样本提取液或过滤片等中。为了抑制假阴性反应,螯合剂的浓度优选8mM以上,进一步优选10mM以上,进一步优选50mM以上。另外,也可以同时使用多种螯合剂,这种情况下的螯合剂的总浓度也优选8mM以上,进一步优选10mM以上,进一步优选50mM以上。另外,为了抑制假阳性反应,螯合剂的浓度优选25mM以上,进一步优选40mM以上,进一步优选50mM以上。无需设置螯合剂的浓度的上限,例如,可以为1000mM以下、500mM以下、300mM以下或150mM以下。通过在例如25mM~300mM、40mM~300mM或50mM~300mM的范围内使用,能够良好地抑制假阴性反应和假阳性反应两者。另外,在以150mM以下使用的情况下,能够抑制显色强度降低。需要说明的,在使过滤片等多孔基材中包含含有螯合剂的样本提取液的情况下,在多孔基材中也包含上述浓度的螯合剂即可。
(螯合剂以外的其他成分)
在本发明中的样本提取液或在检测反应之前的工序中与样本接触的多孔基材等部件等中含浸的样本提取液中,除螯合剂以外,还可以包含能够降低非特异反应的已知的物质、及表面活性剂、pH缓冲性成分、各种蛋白质、盐类、糖类。例如,作为能够降低非特异反应的成分,可列举:精氨酸、精氨酸乙酯、精氨酸甲酯、甘氨酸乙酯、甘氨酸甲酯、赖氨酸及上述化合物的各种异构体等。另外,作为表面活性剂,可列举例如:聚乙二醇单对异辛基苯醚及聚氧乙烯山梨醇单月桂酸酯等非离子型表面活性剂、CHAPS及月桂基酰胺硫代甜菜碱等双离子型表面活性剂、十二烷基硫酸钠等阴离子型表面活性剂、十二烷基三甲基氯化铵等阳离子型表面活性剂。样本提取液中的表面活性剂的浓度优选0.5~5(w/v)%,进一步优选1~3(w/v)%,进一步优选1.5~2.5(w/v)%。表面活性剂具有病毒破坏作用,如果在表面活性剂破坏病毒时存在螯合剂,则效果提升。因此,优选样本提取液中共存表面活性剂和螯合剂。
作为缓冲性成分,可列举:磷酸缓冲液、Tris缓冲液、Good’s缓冲液等。作为蛋白质成分,可列举:BSA(牛血清白蛋白)、酪蛋白、明胶、IgG等。作为盐类,可列举:氯化锂、氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、碘化钠、碘化钾等。
(检测方法)
在本发明的方法中,通过利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应的方法来进行检测。作为具有相互作用的物质的组合,可列举:配体和受体的组合、受体和受体的组合、生物素和亲和素或者链霉亲和素的组合等。
只要为利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质的检测方法,则不受特别限制,可列举:免疫色谱法、胶乳凝聚法、免疫比浊法、免疫浊度测定法、化学发光酶免疫测定法(CLEIA)、酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)等酶免疫测定法(EIA)等,可列举:胶乳凝聚法、免疫比浊法、免疫浊度测定法。这些大多是免疫学方法,利用抗原抗体反应,但也可以利用具有相互作用的物质之间的反应来代替抗原抗体反应。在这些方法中,优选夹心法。在典型的夹心法中,将与被检测物质结合的第一物质作为被检测物质捕捉物质而固相化于特定的载体,使被检测物质结合于该物质,再将结合于被检测物质的第二物质即经标记的物质结合于被检测物质,从而形成“与被检测物质结合的第一物质-被检测物质-与被检测物质结合的第二物质即经标记的物质”(“-”表示结合)的复合物,测定由标记物质发出的信号,由此测定被检测物质。与被检测物质结合的第一物质和与被检测物质结合的第二物质可以为相同物质。被检测物质和与被检测物质结合的物质可以为抗原和抗体或抗体和抗原,也可以为彼此具有相互作用的物质。作为供与被检测物质结合的第一物质固定的固相,可以使用所有可通过公知技术固定蛋白质等物质的物品,例如,可任选具有毛细管作用的多孔薄膜(薄膜)、粒子状物质、试管、树脂平板等公知的物品。另外,作为标记与被检测物质结合的第二物质的物质,能够使用酶、放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色粒子、胶体粒子等。
在夹心法中,从临床检查的简便性和快速性的观点出发,特别优选使用薄膜的作为横向流动式免疫测定法的免疫色谱法。下面,对利用抗原抗体反应的普通免疫色谱法进行说明。免疫色谱法用检查器件示于图1。
图1的上方为俯视图,下方为切割剖视图。检查器件在层叠于塑料板(6)上的硝酸纤维素薄膜(1)上层叠有各种部位。在图中所示的具体例中,塑料板(6)上分别层叠有由抗体等被检测物质捕捉物质等形成有两个检测部(3)的硝酸纤维素薄膜(1)、由滤纸形成的吸收垫部(5)、标记物部(2)及由玻璃纤维过滤片形成的样品添加部(4)。
此外,如图所示,吸收垫部(5)的一个端部区域和硝酸纤维素薄膜(1)的另一个端部区域、硝酸纤维素薄膜(1)的另一个端部区域和标记物部(2)的一个端部区域、标记物部(2)的另一个端部区域和样品添加部(4)的一个端部区域分别重合,从而形成连续的横向流动流道。
标记物部(2)上包含标记物,该标记物是标记物质化学或物理结合于抗体等被检测物质捕捉物质而成的。作为标记物质,可列举:胶体金粒子、胶体铂粒子、彩色胶乳粒子、磁性粒子、酶、量子点,荧光色素及荧光体、量子点等。标记物部由包含上述标记物的多孔基材构成,基材的材质能够使用常用的玻璃纤维(glassfiber)及无纺布等。含浸所述标记物并使其干燥后的多孔基材也可以称作稳定化干燥标记物垫。即,标记物部是包含上述稳定化干燥标记物垫的部位,该上述稳定化干燥标记物垫包括通过抗原抗体反应与被检测物质的结合的抗体,该抗体被着色胶乳粒子标记。
另外,检测部(3)是通过抗原抗体反应与被检测物质的结合的抗体作为捕捉物质而固相化为线形而成的部位。
作为在被检测物质的检测反应之前的工序或与检测反应同时进行的工序中与样本接触的部件等的示例,可列举上述的(1)、(2)、(4)等,但只要是能够在被检测物质的检测反应之前的工序或与检测反应同时进行的工序中与样本接触的部件,则不受特别限定。将样本添加于样品添加部(4)后,样本从样品添加部(4)流向吸收垫部(5)。在将从样品添加部(4)向吸收垫部(5)的流动表述为从上游到下游的情况下,可以认为在被检测物质的检测反应之前的工序或与检测反应同时进行的工序中与样本接触的部件存在于产生检测反应的部位的上游。
接着,对使用该检查器件的免疫测定法进行说明。首先,将样本悬浮于样本提取液,制备提取了被检测物质后的样本样品。接着,向检查器件的样品添加部(4)滴加所述样本样品。包含被检测物质的样本样品在薄膜上沿着水平方向移动的同时,含浸于标记物部(2)使标记物溶解并展开。如果样本样品中存在被检测物质,则会形成被检测物质-标记物的复合物。该复合物到达检测部(3)后,检测部(3)的线上形成捕捉抗体-被检测物质-标记物的复合物。通过由该复合物中的标记物质发出的信号检测是否存在复合物,由此能够判断样本中有无被检测物质。不参与反应的其它成分等则被吸收垫部(5)吸收。需要说明的,在图1所示的示例中,存在两个检测部(3),这是为了分别捕捉例如甲型流感病毒和乙型流感病毒之类的两种被检测物质。通过设置多个这样的检测部(3),可以同时对多种被检测物质进行免疫测定。
在上述免疫色谱法中,可以使用于与样本混合以提取被检测物质的样本提取液中预先包含螯合剂,也可以使免疫色谱法用检查器件的硝酸纤维素薄膜(1)、标记物部(2)和/或样品添加部(4)中包含螯合剂。
本发明包含利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应的检查试剂。该检查试剂有时表示检查器件本身,有时表示包含检查器件和其它试剂的检查试剂盒。本发明的检查试剂例如包括检查试剂盒,该检查试剂盒包含免疫色谱法检查器件和包含螯合剂的样本提取液。另外,本发明的检查试剂还包括免疫色谱法检查器件,该免疫色谱法检查器件具备包含含有螯合剂的样本提取液的部位。
实施例
通过下面的实施例对本发明进行具体说明,但本发明并不受这些实施例限定。
在下面的实施例中,将对在使用本发明的样本提取液的情况下,检测hMPV(人偏肺病毒)的免疫色谱法试剂盒中抑制样本的非特异反应的实施例进行说明。
制备例
1.抗hMPV单克隆抗体的制作
用hMPV抗原免疫BALB/c小鼠,从饲养一段时间后的小鼠中切除脾,通过凯勒等人的方法(Kohler et al.,Nature,vol.256,p495-497(1975))与小鼠骨髓癌细胞(P3×63)融合。将得到的融合细胞(杂交瘤)保持在37℃培养器中,通过ELISA确认上清的抗体活性,同时精制细胞(单克隆化),其中,ELISA使用固相化有hMPV抗原的平板。将获得的2株该细胞分别腹腔给药于经降植烷处理的BALB/c小鼠,约2周后,采集含抗体腹水。
通过使用蛋白A柱的亲和色谱法从得到的腹水中分别精制IgG,得到两种精制抗hMPV抗体。
2.将抗hMPV抗体向硝酸纤维素薄膜固定化
将精制后的抗hMPV抗体用精制水稀释至1.0mg/mL,并将获得的液体线形涂布于背衬有PET膜的硝酸纤维素薄膜的规定位置,在45℃下干燥30分钟,得到抗hMPV抗体固定薄膜(下面称为抗体固定薄膜)。
3.抗hMPV抗体向彩色聚苯乙烯粒子固定化
将未用于向硝酸纤维素薄膜固定的另一个精制后的抗hMPV抗体用精制水稀释至1.0mg/mL,向其中加入彩色聚苯乙烯粒子(Thermo scientific公司制)至0.1(w/v)%,搅拌后,加入碳二亚胺至1(w/v)%,并进一步搅拌。通过离心操作除去上清,并重新悬浮于50mMTris(pH9.0)、3(w/v)%BSA,得到抗hMPV抗体结合彩色聚苯乙烯粒子。
4.抗hMPV抗体结合彩色聚苯乙烯粒子的涂布及干燥
将3.中得到的抗hMPV抗体结合彩色聚苯乙烯粒子按照规定量1.0μg涂布于玻璃纤维无纺布,并在45℃下干燥30分钟。
5.固定化薄膜、干燥垫与其他部件粘贴
将2.及4.中制备的抗体固定薄膜和干燥垫与其它部件(垫板、吸收带、样品垫)贴合并切割为5mm宽,得到hMPV测试片(检查器件)。
6.样本提取液的制作
参见下面的各实施例。
实施例1验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中的鼻腔吸引样本的假阴性化的抑制效果
制作包含50mM Tris缓冲液(pH8.0)、2%(w/v)聚氧乙烯辛基苯基醚(商品名TritonX-100(NACALAI公司制),以下称为TritonX-100)的混合液,将其作为对照1的样本提取液。接着,为了对作为螯合剂的EDTA、EGTA进行验证,制备各组成的样本提取液(详见表1)。
用棉签(Ex swab-002;Denka公司制)吸收鼻腔吸引液,将其分别悬浮于400μL各组成的样本提取液。向其中加入30μL惰性hMPV并混合。将50μL混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
【表1】
样本提取液组成
No. | 样本提取液的组成 |
对照 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100 |
1 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、5mM EDTA |
2 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、10mM EDTA |
3 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、20mM EDTA |
4 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、30mM EDTA |
5 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、50mM EDTA |
6 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、150mM EDTA |
7 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、300mM EDTA |
8 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、500mM EDTA |
9 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100、50mM EGTA |
结果表明,相对于对照通过鼻腔吸引液产生了假阴性,作为螯合剂的EDTA、EGTA能够在10mM以上的浓度时抑制假阴性化,特别是在50mM~300mM的范围内效果高。得到的结果示于表2。
【表2】
螯合剂对鼻腔吸引液样本的假阴性化的抑制效果(hMPV)
样本处理液No. | 对照 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 |
螯个剂浓度(mM) | 0 | 5 | 10 | 20 | 30 | 50 | 150 | 300 | 50 |
假阴性化抑制效果 | × | × | △ | △ | ○ | ◎ | ◎ | ◎ | ◎ |
×:无假阴性化抑制效果
△:稍有假阴性化抑制效果
○:具有假阴性化抑制效果
◎:抑制假阴性化
实施例2验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中hMPV阳性鼻腔吸引样本的假阴性化的抑制效果
使用包含实施例1中效果高的50mM螯合剂的样本提取液No.5,验证hMPV抗原检测免疫色谱法中对于hMPV阳性鼻腔吸引液样本的假阴性化的抑制效果。
用棉签(Ex swab-002;Denka公司制)吸收hMPV阳性鼻腔吸引液,将其分别悬浮于400μL各组成的样本提取液。将50μL混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
结果表明,通过与实施例1同样地使用样本提取液No.5,在hMPV阳性鼻腔吸引样本中也能够抑制假阴性化。结果总结于表3。
【表3】
螯合剂对于hMPV阳性鼻腔吸引液样本的假阴性化的抑制效果
样本处理液No. | 对照 | 5 |
螯合剂浓度(mM) | 0 | 50 |
假阴性化抑制效果 | × | ◎ |
×:无假阴性化抑制效果
◎:抑制假阴性化
实施例3验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中唾液样本的假阴性化的抑制效果
使用表1的各组成的样本提取液,验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中唾液样本的假阴性化的抑制效果。
将棉签(Ex swab-001;Denka公司制)放入口中,充分吸收唾液,将其分别悬浮于400μL各组成的样本提取液。向其中加入30μL惰性hMPV并混合。将50μL混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
结果表明,相对于对照通过唾液产生了假阴性,作为螯合剂的EDTA在10mM以上的浓度时能够抑制假阴性化,特别是在50mM~300mM的范围内效果高。得到的结果示于表4。
【表4】
螯合剂对唾液样本的假阴性化的抑制效果(hMPV)
样本提取液No. | 对照 | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 |
螯合剂浓度(mM) | 0 | 5 | 10 | 50 | 150 | 300 |
假阴性化抑制效果 | × | × | △ | ○ | ◎ | ○ |
×:无假阴性化抑制效果
△:稍有假阴性化抑制效果
○:具有假阴性化抑制效果
◎:抑制假阴性化
实施例4验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中唾液样本的假阳性化的抑制效果
使用表1的各组成的样本提取液,验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中唾液样本的假阳性化的抑制效果。
将棉签(Ex swab-001;Denka公司制)放入口中,充分吸收唾液,将其分别悬浮于400μL各组成的样本提取液。向其中加入30μL惰性hMPV并混合。将50μL混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
结果表明,相对于对照通过唾液产生假阳性化,作为螯合剂的EDTA能够在50mM以上浓度时抑制假阳性化。得到的结果示于表5。
【表5】
螯合剂对唾液样本的假阳性化的抑制效果(hMPV)
样本处理液No. | 对照 | 1 | 2 | 5 | 6 | 7 |
螯合剂浓度(mM) | 0 | 5 | 10 | 50 | 150 | 300 |
假阳性化抑制效果 | × | × | × | ◎ | ◎ | ◎ |
×:无假阳性化抑制效果
△:稍有假阳性化抑制效果
○:具有假阳性化抑制效果
◎:抑制假阳性化
实施例5验证对hMPV抗原检测免疫色谱法中由样本及样本内的抗原与螯合剂接触的时间所导致的hMPV阳性鼻腔吸引样本的假阴性化的抑制效果
在表6所示的各条件下,对hMPV抗原检测免疫色谱法中由样本及样本内的抗原与螯合剂接触的时间所导致的hMPV阳性鼻腔吸引样本的假阴性化的抑制效果进行验证。
【表6】
hMPV阳性鼻腔吸引样本中的假阴性化抑制效果的验证条件
样本悬浮时样本提取液的组成(最终浓度) | 样本悬浮后的添加液的组成(最终浓度) | |
条件1 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100 | 无 |
条件2 | 50mM Tris(pH8.0)、2%TritonX-100 | 50mM EDTA |
条件3 | 50mM Tris(pH8.0) | 2%TritonX-100、50mM EDTA |
条件4 | 50mM Tris(pH8.0)、50mM EDTA | 2%TritonX-100 |
使棉签(Ex swab-002;Denka公司制)吸收hMPV阳性鼻腔吸引液,将其分别悬浮于400μL各组成的样本提取液。分别在表6所示的条件下向悬浮液中添加2%(w/v)TritonX-100、50mM EDTA,并验证2%(w/v)TritonX-100破坏病毒时有无EDTA是否会影响假阴性化抑制效果。将50μL各条件的混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
结果表明,相对于条件1、2通过鼻腔吸引液产生了假阴性,在条件3、4时能够抑制假阴性化。得到的结果示于表7。
【表7】
样本处理液No. | 条件1 | 条件2 | 条件3 | 条件4 |
假阳性化抑制效果 | × | × | ○ | ○ |
×:无假阳性化抑制效果
○:具有假阳性化抑制效果
综上所述可知,通过在TritonX-100破坏病毒时存在EDTA,获得了抑制hMPV阳性鼻腔吸引样本的假阴性化的效果。
实施例6比较hMPV抗原检测免疫色谱法中样本提取液和对照样本提取液的显色强度
使用表1的各组成的样本提取液,比较并测试hMPV抗原检测免疫色谱法中样本提取液和现有样本提取液的显色强度。
向400μL各组成的样本提取液中加入30μL惰性hMPV并混合。将50μL混合液滴加于hMPV测试片的样品垫部分,5分钟后进行目测判定。
结果表明,相对于在对照的样本提取液和样本提取液No.1~7中可见显色,在样本提取液No.8中未见显色。另外,样本提取液No.7的显色强度降低,当EDTA在10~150mM的范围时,能够提高特异性,同时不会降低信号强度。得到的结果示于表8。需要说明的,显色强度的数值按照+、++、+++的顺序依次表示信号变强,0表示未见显色。
【表8】
样本提取液和现有样本提取液的显色强度的比较(hMPV)
样本处理液No. | 对照 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
螯合剂浓度(mM) | 0 | 5 | 10 | 20 | 30 | 50 | 150 | 300 | 500 |
信号强度 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | 0 |
工业适用性
本发明的方法能够用于准确检测各种物质。
附图标记说明
1:硝酸纤维素薄膜;2:标记物部;3:检测部;4:样品添加部;5:吸收垫部;6:塑料板。
本说明书中引用的全部刊物、专利及专利申请直接通过引用并入本说明书。
Claims (15)
1.一种检查试剂,是利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的结合反应来检测样本中的被检测物质的试剂盒,其中,
所述检查试剂包含含有螯合剂的样本提取液。
2.根据权利要求1所述的检查试剂,其中,
所述检查试剂抑制信号降低。
3.根据权利要求1或2所述的检查试剂,其中,
样本提取液中进一步包含表面活性剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检查试剂,其中,
所述检查试剂是免疫色谱用检查试剂,包括免疫色谱用检查器件和含有螯合剂的样本提取液。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的检查试剂,其中,
所述检查试剂是免疫色谱用检查器件,所述免疫色谱用检查器件包括含浸有含有螯合剂的样本提取液的部位。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的检查试剂,其中,
样本提取液包含8mM~300mM的螯合剂。
7.根据权利要求6所述的检查试剂,其中,
样本提取液包含25mM~300mM的螯合剂。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的检查试剂,其中,
螯合剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)及硝基三乙酸(NTA)构成的组。
9.一种利用抗原抗体反应或具有相互作用的物质之间的反应来检测选自由鼻拭子样本、鼻腔吸引样本、鼻腔清洗样本、鼻涕样本、咽拭子样本及唾液样本构成的组的样本中的选自由病毒抗原、细菌抗原及蛋白质抗原构成的组的被检测物质的方法,
所述方法通过预先使样本与螯合剂接触来抑制信号降低并进行检测。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,
检测被检测物质的方法为免疫色谱法,将样本放入包含螯合剂的样本提取液,将该样本提取液添加于免疫色谱用检查器件。
11.根据权利要求9所述的方法,其中,
检测被检测物质的方法为免疫色谱法,将样本添加于包括含浸有包含螯合剂的样本提取液的部位的免疫色谱用检查器件。
12.根据权利要求10或11所述的方法,其中,
样本提取液中进一步包含表面活性剂。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法,其中,
使用包含8mM~300mM螯合剂的样本提取液。
14.根据权利要求13所述的方法,其中,
使用包含25mM~300mM螯合剂的样本提取液。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法,其中,
螯合剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(EGTA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)及硝基三乙酸(NTA)构成的组。
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