JP2004301684A - ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液及びウイルス検出試薬 - Google Patents
ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液及びウイルス検出試薬 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】糞便、嘔吐物、体液、血液、体組織、食品等のノロウイルス又はサポウイルス含有検体から、簡便で、遠心分離機等の特別な機器を必要とすることなく、検出感度を向上させ、また非特異因子を完全に除去することを目的とする。
【解決手段】ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液。
【選択図】 なし
【解決手段】ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、便、嘔吐物、体液、血液、体組織、食品等の検体中のノロウイルス又はサポウイルスを免疫学的測定法により検出する際の検出感度を向上させるための手段及び非特異的反応を除去するための手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ（旧名称 Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ））及びサポウイルス（Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ（旧名称 Ｓａｐｐｏｒｏ ｖｉｒｕｓ））のヒトカリシウイルスに属するウイルスは、ヒトに急性胃腸炎を起こすため、これらのウイルスを検出するための検体は、糞便の場合が多い。一般的に、糞便を検体に用いたＥＬＩＳＡ等では検出感度が低く、また非特異的反応も多いことから、結果の判定に苦慮していた。検出感度を向上させるための手段としては、抗原に反応性の高い抗体を見出す等の手段があるが、そのような抗体の作製は困難である。また、糞便検体から非特異的反応を除去する方法として前処理法として行われていた。例えば、遠心分離して非特異因子を沈殿除去する方法、有機溶剤等を用いた脂質の除去法があるが、これらの方法は煩雑であり遠心分離機という特別な機器が必要であった。また、界面活性剤を加えた緩衝液で検体を懸濁する方法があるが、これらの方法は、非特異反応を完全に除去した場合には特異反応も低下したり、特異反応を低下させない場合は非特異反応が完全に除去しきれないという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、糞便、嘔吐物、体液、血液、体組織、食品等のノロウイルス又はサポウイルス含有検体から、簡便で、遠心分離機等の特別な機器を必要とすることなく、検出感度を向上させる手段、また特異反応を向上させ、かつ非特異因子を完全に除去する手段が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、糞便等の検体を用いた免疫学的方法によるノロウイルス又はサポウイルスの検出法について種々検討した結果、検体をｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有する検体希釈液で処理すれば、簡便に検出感度が向上することを見出した。また、この検体希釈液に動物グロブリン、界面活性剤、水溶性高分子等を添加するか、塩濃度の至適化をすれば、遠心分離等の操作をすることなく、非特異的反応も除去でき、正確なノロウイルス又はサポウイルスの免疫学的測定が可能となることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を提供するものである。
また本発明は、ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤及び動物グロブリン、界面活性剤又は水溶性高分子を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を提供するものである。
また本発明は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体及び上記ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を含有するノロウイルス又はサポウイルス検出用試薬を提供するものである。
さらに、本発明は、検体に上記ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を加え、得られた検体含有液を固定化された抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と反応させることを特徴とする検体中のノロウイルス又はサポウイルスの検出方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における検体は、ノロウイルス又はサポウイルスの存在が疑われる糞便、嘔吐物、食品、体液、血液、体組織等であり、このうち糞便、嘔吐物、食品が好ましく、特に糞便が好ましい。
【０００７】
本発明における検出対象は、ノロウイルス又はサポウイルスであるが、特にノロウイルスが好ましい。
【０００８】
本発明のノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液に用いられるアルカリ性緩衝剤は、ｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液を形成できるものである。ｐＨ９．０未満及びｐＨ１０．０を超えた緩衝液では検出感度が十分に向上しない。
【０００９】
ｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液としてはトリス緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液が挙げられるが、トリス緩衝液、グッド緩衝液が特に好ましい。
【００１０】
本発明において検体をｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液で希釈することにより検出感度が向上する理由は、明らかではないが、ウイルス粒子の開裂が起こり、ウイルス粒子内部のエピトープが露出され、抗原抗体反応が向上することによると考えられる。すなわち、例えばノロウイルスの株間共通エピトープはウイルス粒子の内部にあり、通常そのエピトープは粒子外部に露出されていない。ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ緩衝液処理を行うことにより、ウイルス粒子中の株間エピトープが露出されることにより、反応性が向上し、検出感度が向上する。
【００１１】
また、前記検体用希釈液には、動物グロブリンを０．０１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、さらに０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬ、特に０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。ここで動物グロブリンとしては、マウス、ウサギ、ヒツジ又はヒト由来のグロブリンが好ましい。
【００１２】
また、前記検体用希釈液には、界面活性剤を含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）等のポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）等のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルが挙げられる。両イオン性界面活性剤としては、３−［（３−コラシドプロピル）ジメチルアミノ］１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）等のスルホベタイン型両イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの界面活性剤は、非特異的反応除去効果の点から検体用希釈液中に０．０１〜５．０質量％、特に０．０２〜２．０質量％含有するのが好ましい。ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの場合には０．５〜５．０質量％、特に１．０〜２．０質量％が好ましい。またポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの場合には０．０１〜０．１質量％、特に０．０２〜０．０８質量％が好ましい。また、スルホベタイン型両イオン性界面活性剤の場合には０．０５〜２．０質量％、特に０．１〜０．５質量％が好ましい。
【００１３】
また前記検体用希釈液には、水溶性高分子を含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。用いられる水溶性高分子としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等が挙げられ、このうちポリビニルピロリドンが特に好ましい。これらの水溶性高分子は、非特異的反応除去効果の点から、０．１〜８．０質量％、特に０．２〜５．０質量％含有するのが好ましい。
【００１４】
また前記検体用希釈液には、血清アルブミン、特に牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させるのが好ましい。血清アルブミンは、０．１〜１．０質量％、特に０．５質量％含有させるのが好ましい。
【００１５】
また、さらに検体用希釈液中の塩濃度を１〜８質量％、特に２〜４質量％とすると、非特異的反応の除去効果がさらに向上する。当該塩濃度は、前記アルカリ性緩衝剤の塩濃度を含めた濃度である。塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等のアルカリ金属塩、ＣａＣｌ２等のアルカリ土類金属塩、さらにはアルギニン塩酸塩等のアミノ酸塩等が用いられる。
【００１６】
検体を検体用希釈液で処理するには、検体に検体用希釈液を加え、５分以上、より好ましくは１０分以上、さらに好ましくは１０分〜２時間放置すればよい。処理温度は４〜３７℃、特に２０〜２５℃が好ましい。当該処理後に、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体を用いた通常の免疫学的測定をすれば、検出感度が向上し、また非特異的反応が除去され、正確にノロウイルス又はサポウイルスの検出が可能となる。
【００１７】
ノロウイルス又はサポウイルスの検出方法は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体を用いた免疫学的測定法であれば特に制限されないが、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。また、固定化抗ノロウイルス抗体又は固定化抗サポウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体を用いる方法がさらに好ましい。
【００１８】
抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。モノクローナル抗体としては、例えば、第４７回日本ウイルス学会（１９９９年１１月７日）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１７， ２５２−２６１（１９９６）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３８， １６５６−１６６０（２０００）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ４０， ２４５９−２４６５（２００２）、特開２００２−２０３９９号、特開２００２−１７３９７号に記載のノロウイルスに対するモノクローナル抗体が用いられる。またポリクローナル抗体としては、再公表特許ＷＯ００／０７９２８０に記載のノロウイルスに対するポリクローナル抗体が用いられる。
【００１９】
これらの抗体は、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体に固定化するのが好ましい。
【００２０】
また、標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体の標識体としては、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム）、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
【００２１】
検体中のノロウイルス又はサポウイルスの検出は、検体に前記検体用希釈液を加え、得られた検体含有液に固定化された抗体と反応させることにより行われる。サンドイッチ法による場合には、通常該検体含有液と固定化された抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させることにより行われるが、本発明の前記検体希釈液で処理された検体含有液を用いる場合には、固定化された抗体と標識抗体とを同時に反応させても正確な測定が可能である。当該同時法の操作は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体が固相化されているプレートに希釈検体を加え、直ちに標識抗体を加えることにより行われる。この同時法は、通常法が、抗体固相化プレートに希釈検体を加えて反応させ、洗浄後標識抗体を加える操作を行うのとは異なる。本発明では、この同時法を用いることにより通常法よりも簡便に測定できるだけでなく非特異反応も軽減される。
【００２２】
反応終了後、検体中のノロウイルス又はサポウイルスと固定化抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、検体中のノロウイルス又はサポウイルス量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
【００２３】
本発明の検出方法としてはＥＬＩＳＡ及びイムノクロマトグラフ法がより好ましく、特にＥＬＩＳＡが好ましい。
【００２４】
本発明の検出試薬は、基本的に前記検体用希釈液及び前記抗体により構成されるが、これに前記標識抗体を含めるのが好ましい。より具体的には、前記検体用希釈液、固定化抗ノロウイルス抗体又は固定化抗サポウイルス抗体、及び標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体により構成されるのが好ましい。
【００２５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ アルカリ性緩衝液による感度向上
ノロウイルスの遺伝子型Ｉ（ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ：ＧＩ）を広く認識する抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＶ３９１２（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３８， １６５６−１６６０（２０００））、ノロウイルスの遺伝子型ＩＩ（ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ：ＧＩＩ）を広く認識する抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＳ１４（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ４０， ２４５９−２４６５（２００２））を炭酸バッファー（ｐＨ９．４）で各々５μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置後、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルでマイクロプレートを２回洗浄し、最終濃度０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） と０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静置して、抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートを作製した。
【００２７】
ＧＩに属するノロウイルス１２４株の組換え抗原、ＧＩＩに属するノロウイルス１８７６株の組換え抗原にアルカリ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）又は中性緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、抗原濃度０．１、１．０、１０．０ｎｇ／ｍＬに希釈した抗原液を１０分間又は６０分間静置した。
【００２８】
この抗原希釈液を、ＧＩ組換えノロウイルス抗原（１２４株）は抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＶ３９１２固相マイクロプレートのウェルに、ＧＩＩ組換えノロウイルス抗原（１８７６株）は抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＳ１４固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ （ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ＧＩノロウイルスポリクローナル抗体をＧＩ組換え抗原希釈液が入っているウェルに、ＰＯＤ標識抗ＧＩＩポリクローナル抗体をＧＩＩ組換え抗原希釈液が入っているウェルに加え、２５℃、１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００２９】
【表１】
【００３０】
表１から、緩衝液のｐＨが９．０以上の場合、ｐＨ７．２に比べ約２倍以上の吸光度上昇が見られた。この吸光度の上昇は、反応時間６０分間でも見られ、株によっては反応時間が長い方が吸光度の上昇が大きかった。
【００３１】
実施例２ 界面活性剤の効果
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を０、１、２、３％となるようにアルカリ緩衝液に加えて検体希釈液を作製した。
【００３２】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。その後最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体をウェルに加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００３３】
【表２】
【００３４】
表２から、ＮＶ３９１２固相プレートを用いた場合、界面活性剤を含まない検体希釈液で調製した便懸濁液は、健常人の便検体及びＧＩＩに分類されるノロウイルスに感染した患者便に対して、吸光度がブランクに比べ高く非特異反応が見られた。しかし、１％以上のＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加した検体希釈液で調製した場合、健常人及びＧＩＩ感染患者の吸光度はブランク並となり、非特異反応の軽減が見られた。同様に、ＮＳ１４固相プレートを用いた場合、健常人及びＧＩ感染患者の吸光度はブランク以下となり、非特異反応の軽減が見られた。
【００３５】
実施例３ マウスグロブリンの効果
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液に、マウスグロブリンを０、０．１、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍＬ加えて検体希釈液を作製した。
【００３６】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。次いで最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００３７】
【表３】
【００３８】
表３から、マウスグロブリンを添加した検体希釈液を用いた場合、ＧＩＩに分類されたノロウイルス感染患者便、健常人便検体、ブランクの吸光度は、マウスグロブリンを添加しない検体希釈液を用いた場合よりも最大で約２倍吸光度が低くなっている。ＮＳ１４固相プレートを用いた場合も同様に、マウスグロブリンを添加した方が無添加よりも吸光度が低くなっている。このことは、マウスグロブリン画分を添加した方が非特異反応を軽減できると考えられた。
【００３９】
実施例４ 塩濃度の至適化
マウスグロブリンを０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液の塩濃度を、１、２、８％加えて検体希釈液を作製した。
【００４０】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体をウェルに加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４１】
【表４】
【００４２】
表４から、ノロウイルス感染患者便の反応性に影響が少なく、健常人便検体の反応性を軽減する検体希釈液の塩濃度は最終２％であると考えられた。
【００４３】
実施例５ 水溶性高分子の効果
アルカリ緩衝液に水溶性高分子であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を最終濃度０．２、１．０、５．０％になるように加えて検体希釈液を作製した。
【００４４】
ノロウイルス組換え抗原に各検体希釈液を加え（１ｎｇ／ｍＬ）１０分間静置し抗原希釈液とした。また健常人の糞便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この希釈抗原液及び１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加えた。その直後、最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を１０％便懸濁液が入っているウェルに加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４５】
【表５】
【００４６】
表５から、ＰＶＰを添加することにより非特異反応は軽減し、ＰＶＰを最終濃度５．０％になるように添加すると、健常人の便検体の吸光度がＰＶＰを添加しない場合に比べ最大２倍も低下した。従って、ＰＶＰ添加は非特異反応軽減に効果があると考えられた。
【００４７】
実施例６ 検体とＰＯＤ標識抗体を同時にマイクロプレートのウェルに加える方法マウスグロブリンを０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液の塩濃度を、１、２、８％加えて検体希釈液を作製した。
【００４８】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加えた。その直後、最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を１０％便懸濁液が入っているウェルに加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４９】
【表６】
【００５０】
表６から、同時にマイクロプレートに加える方法（検体とＰＯＤ標識抗体を同時にマイクロプレートのウェルに加える方法）は、通常法（検体と固相ＭＡｂｓとの反応後洗浄し、ＰＯＤ標識抗体を加える方法）に比べると、健常人便検体及びブランクともに吸光度が低かった。従って、ＥＬＩＳＡの操作方法としては同時マイクロプレートのウェルに加える方法の方が非特異反を軽減させると考えられた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、便、嘔吐物、体液、血液、体組織、食品等の検体中のノロウイルス又はサポウイルスを免疫学的測定法により検出する際の検出感度を向上させるための手段及び非特異的反応を除去するための手段に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ（旧名称 Ｎｏｒｗａｌｋ ｖｉｒｕｓ））及びサポウイルス（Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ（旧名称 Ｓａｐｐｏｒｏ ｖｉｒｕｓ））のヒトカリシウイルスに属するウイルスは、ヒトに急性胃腸炎を起こすため、これらのウイルスを検出するための検体は、糞便の場合が多い。一般的に、糞便を検体に用いたＥＬＩＳＡ等では検出感度が低く、また非特異的反応も多いことから、結果の判定に苦慮していた。検出感度を向上させるための手段としては、抗原に反応性の高い抗体を見出す等の手段があるが、そのような抗体の作製は困難である。また、糞便検体から非特異的反応を除去する方法として前処理法として行われていた。例えば、遠心分離して非特異因子を沈殿除去する方法、有機溶剤等を用いた脂質の除去法があるが、これらの方法は煩雑であり遠心分離機という特別な機器が必要であった。また、界面活性剤を加えた緩衝液で検体を懸濁する方法があるが、これらの方法は、非特異反応を完全に除去した場合には特異反応も低下したり、特異反応を低下させない場合は非特異反応が完全に除去しきれないという問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、糞便、嘔吐物、体液、血液、体組織、食品等のノロウイルス又はサポウイルス含有検体から、簡便で、遠心分離機等の特別な機器を必要とすることなく、検出感度を向上させる手段、また特異反応を向上させ、かつ非特異因子を完全に除去する手段が望まれていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、糞便等の検体を用いた免疫学的方法によるノロウイルス又はサポウイルスの検出法について種々検討した結果、検体をｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有する検体希釈液で処理すれば、簡便に検出感度が向上することを見出した。また、この検体希釈液に動物グロブリン、界面活性剤、水溶性高分子等を添加するか、塩濃度の至適化をすれば、遠心分離等の操作をすることなく、非特異的反応も除去でき、正確なノロウイルス又はサポウイルスの免疫学的測定が可能となることを見出した。
【０００５】
すなわち、本発明は、ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を提供するものである。
また本発明は、ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤及び動物グロブリン、界面活性剤又は水溶性高分子を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を提供するものである。
また本発明は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体及び上記ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を含有するノロウイルス又はサポウイルス検出用試薬を提供するものである。
さらに、本発明は、検体に上記ノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液を加え、得られた検体含有液を固定化された抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と反応させることを特徴とする検体中のノロウイルス又はサポウイルスの検出方法を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における検体は、ノロウイルス又はサポウイルスの存在が疑われる糞便、嘔吐物、食品、体液、血液、体組織等であり、このうち糞便、嘔吐物、食品が好ましく、特に糞便が好ましい。
【０００７】
本発明における検出対象は、ノロウイルス又はサポウイルスであるが、特にノロウイルスが好ましい。
【０００８】
本発明のノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液に用いられるアルカリ性緩衝剤は、ｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液を形成できるものである。ｐＨ９．０未満及びｐＨ１０．０を超えた緩衝液では検出感度が十分に向上しない。
【０００９】
ｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液としてはトリス緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液が挙げられるが、トリス緩衝液、グッド緩衝液が特に好ましい。
【００１０】
本発明において検体をｐＨ９．０〜１０．０の緩衝液で希釈することにより検出感度が向上する理由は、明らかではないが、ウイルス粒子の開裂が起こり、ウイルス粒子内部のエピトープが露出され、抗原抗体反応が向上することによると考えられる。すなわち、例えばノロウイルスの株間共通エピトープはウイルス粒子の内部にあり、通常そのエピトープは粒子外部に露出されていない。ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ緩衝液処理を行うことにより、ウイルス粒子中の株間エピトープが露出されることにより、反応性が向上し、検出感度が向上する。
【００１１】
また、前記検体用希釈液には、動物グロブリンを０．０１〜１．０ｍｇ／ｍＬ、さらに０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬ、特に０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬ含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。ここで動物グロブリンとしては、マウス、ウサギ、ヒツジ又はヒト由来のグロブリンが好ましい。
【００１２】
また、前記検体用希釈液には、界面活性剤を含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）等のポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）等のポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルが挙げられる。両イオン性界面活性剤としては、３−［（３−コラシドプロピル）ジメチルアミノ］１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）等のスルホベタイン型両イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの界面活性剤は、非特異的反応除去効果の点から検体用希釈液中に０．０１〜５．０質量％、特に０．０２〜２．０質量％含有するのが好ましい。ポリエチレングリコールアルキルフェニルエーテルの場合には０．５〜５．０質量％、特に１．０〜２．０質量％が好ましい。またポリオキシエチレンソルビタンモノ脂肪酸エステルの場合には０．０１〜０．１質量％、特に０．０２〜０．０８質量％が好ましい。また、スルホベタイン型両イオン性界面活性剤の場合には０．０５〜２．０質量％、特に０．１〜０．５質量％が好ましい。
【００１３】
また前記検体用希釈液には、水溶性高分子を含有させるのが、非特異的反応を効率良く除去するうえで好ましい。用いられる水溶性高分子としては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール等が挙げられ、このうちポリビニルピロリドンが特に好ましい。これらの水溶性高分子は、非特異的反応除去効果の点から、０．１〜８．０質量％、特に０．２〜５．０質量％含有するのが好ましい。
【００１４】
また前記検体用希釈液には、血清アルブミン、特に牛胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有させるのが好ましい。血清アルブミンは、０．１〜１．０質量％、特に０．５質量％含有させるのが好ましい。
【００１５】
また、さらに検体用希釈液中の塩濃度を１〜８質量％、特に２〜４質量％とすると、非特異的反応の除去効果がさらに向上する。当該塩濃度は、前記アルカリ性緩衝剤の塩濃度を含めた濃度である。塩としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等のアルカリ金属塩、ＣａＣｌ２等のアルカリ土類金属塩、さらにはアルギニン塩酸塩等のアミノ酸塩等が用いられる。
【００１６】
検体を検体用希釈液で処理するには、検体に検体用希釈液を加え、５分以上、より好ましくは１０分以上、さらに好ましくは１０分〜２時間放置すればよい。処理温度は４〜３７℃、特に２０〜２５℃が好ましい。当該処理後に、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体を用いた通常の免疫学的測定をすれば、検出感度が向上し、また非特異的反応が除去され、正確にノロウイルス又はサポウイルスの検出が可能となる。
【００１７】
ノロウイルス又はサポウイルスの検出方法は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体を用いた免疫学的測定法であれば特に制限されないが、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体を用いたサンドイッチ法がより好ましい。また、固定化抗ノロウイルス抗体又は固定化抗サポウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体を用いる方法がさらに好ましい。
【００１８】
抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよい。モノクローナル抗体としては、例えば、第４７回日本ウイルス学会（１９９９年１１月７日）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２１７， ２５２−２６１（１９９６）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３８， １６５６−１６６０（２０００）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ４０， ２４５９−２４６５（２００２）、特開２００２−２０３９９号、特開２００２−１７３９７号に記載のノロウイルスに対するモノクローナル抗体が用いられる。またポリクローナル抗体としては、再公表特許ＷＯ００／０７９２８０に記載のノロウイルスに対するポリクローナル抗体が用いられる。
【００１９】
これらの抗体は、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体に固定化するのが好ましい。
【００２０】
また、標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体の標識体としては、公知の標識体、例えば、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム）、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
【００２１】
検体中のノロウイルス又はサポウイルスの検出は、検体に前記検体用希釈液を加え、得られた検体含有液に固定化された抗体と反応させることにより行われる。サンドイッチ法による場合には、通常該検体含有液と固定化された抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させることにより行われるが、本発明の前記検体希釈液で処理された検体含有液を用いる場合には、固定化された抗体と標識抗体とを同時に反応させても正確な測定が可能である。当該同時法の操作は、抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体が固相化されているプレートに希釈検体を加え、直ちに標識抗体を加えることにより行われる。この同時法は、通常法が、抗体固相化プレートに希釈検体を加えて反応させ、洗浄後標識抗体を加える操作を行うのとは異なる。本発明では、この同時法を用いることにより通常法よりも簡便に測定できるだけでなく非特異反応も軽減される。
【００２２】
反応終了後、検体中のノロウイルス又はサポウイルスと固定化抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、検体中のノロウイルス又はサポウイルス量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素、アビジンを用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
【００２３】
本発明の検出方法としてはＥＬＩＳＡ及びイムノクロマトグラフ法がより好ましく、特にＥＬＩＳＡが好ましい。
【００２４】
本発明の検出試薬は、基本的に前記検体用希釈液及び前記抗体により構成されるが、これに前記標識抗体を含めるのが好ましい。より具体的には、前記検体用希釈液、固定化抗ノロウイルス抗体又は固定化抗サポウイルス抗体、及び標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルス抗体により構成されるのが好ましい。
【００２５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２６】
実施例１ アルカリ性緩衝液による感度向上
ノロウイルスの遺伝子型Ｉ（ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩ：ＧＩ）を広く認識する抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＶ３９１２（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ３８， １６５６−１６６０（２０００））、ノロウイルスの遺伝子型ＩＩ（ＧｅｎｏｇｒｏｕｐＩＩ：ＧＩＩ）を広く認識する抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＳ１４（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， Ｖｏｌ． ４０， ２４５９−２４６５（２００２））を炭酸バッファー（ｐＨ９．４）で各々５μｇ／ｍＬ濃度に希釈し、ポリスチレン平型マイクロプレート（ヌンク社製）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。１８時間以上静置後、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ ２００μｌ／ウェルでマイクロプレートを２回洗浄し、最終濃度０．５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ） と０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）２００μｌ／ウェル加えて４℃一晩静置して、抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートを作製した。
【００２７】
ＧＩに属するノロウイルス１２４株の組換え抗原、ＧＩＩに属するノロウイルス１８７６株の組換え抗原にアルカリ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）又は中性緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．２、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を加え、抗原濃度０．１、１．０、１０．０ｎｇ／ｍＬに希釈した抗原液を１０分間又は６０分間静置した。
【００２８】
この抗原希釈液を、ＧＩ組換えノロウイルス抗原（１２４株）は抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＶ３９１２固相マイクロプレートのウェルに、ＧＩＩ組換えノロウイルス抗原（１８７６株）は抗ノロウイルスモノクローナル抗体ＮＳ１４固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ （ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ＧＩノロウイルスポリクローナル抗体をＧＩ組換え抗原希釈液が入っているウェルに、ＰＯＤ標識抗ＧＩＩポリクローナル抗体をＧＩＩ組換え抗原希釈液が入っているウェルに加え、２５℃、１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００２９】
【表１】
表１から、緩衝液のｐＨが９．０以上の場合、ｐＨ７．２に比べ約２倍以上の吸光度上昇が見られた。この吸光度の上昇は、反応時間６０分間でも見られ、株によっては反応時間が長い方が吸光度の上昇が大きかった。
【００３１】
実施例２ 界面活性剤の効果
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を０、１、２、３％となるようにアルカリ緩衝液に加えて検体希釈液を作製した。
【００３２】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。その後最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体をウェルに加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００３３】
【表２】
表２から、ＮＶ３９１２固相プレートを用いた場合、界面活性剤を含まない検体希釈液で調製した便懸濁液は、健常人の便検体及びＧＩＩに分類されるノロウイルスに感染した患者便に対して、吸光度がブランクに比べ高く非特異反応が見られた。しかし、１％以上のＴｒｉｔｏｎＸ１００を添加した検体希釈液で調製した場合、健常人及びＧＩＩ感染患者の吸光度はブランク並となり、非特異反応の軽減が見られた。同様に、ＮＳ１４固相プレートを用いた場合、健常人及びＧＩ感染患者の吸光度はブランク以下となり、非特異反応の軽減が見られた。
【００３５】
実施例３ マウスグロブリンの効果
界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液に、マウスグロブリンを０、０．１、０．０１、０．００１ｍｇ／ｍＬ加えて検体希釈液を作製した。
【００３６】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。次いで最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００３７】
【表３】
表３から、マウスグロブリンを添加した検体希釈液を用いた場合、ＧＩＩに分類されたノロウイルス感染患者便、健常人便検体、ブランクの吸光度は、マウスグロブリンを添加しない検体希釈液を用いた場合よりも最大で約２倍吸光度が低くなっている。ＮＳ１４固相プレートを用いた場合も同様に、マウスグロブリンを添加した方が無添加よりも吸光度が低くなっている。このことは、マウスグロブリン画分を添加した方が非特異反応を軽減できると考えられた。
【００３９】
実施例４ 塩濃度の至適化
マウスグロブリンを０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液の塩濃度を、１、２、８％加えて検体希釈液を作製した。
【００４０】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも３回行った。最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体をウェルに加え、２５℃１時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４１】
【表４】
表４から、ノロウイルス感染患者便の反応性に影響が少なく、健常人便検体の反応性を軽減する検体希釈液の塩濃度は最終２％であると考えられた。
【００４３】
実施例５ 水溶性高分子の効果
アルカリ緩衝液に水溶性高分子であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を最終濃度０．２、１．０、５．０％になるように加えて検体希釈液を作製した。
【００４４】
ノロウイルス組換え抗原に各検体希釈液を加え（１ｎｇ／ｍＬ）１０分間静置し抗原希釈液とした。また健常人の糞便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この希釈抗原液及び１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加えた。その直後、最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を１０％便懸濁液が入っているウェルに加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４５】
【表５】
表５から、ＰＶＰを添加することにより非特異反応は軽減し、ＰＶＰを最終濃度５．０％になるように添加すると、健常人の便検体の吸光度がＰＶＰを添加しない場合に比べ最大２倍も低下した。従って、ＰＶＰ添加は非特異反応軽減に効果があると考えられた。
【００４７】
実施例６ 検体とＰＯＤ標識抗体を同時にマイクロプレートのウェルに加える方法マウスグロブリンを０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を１％含むアルカリ緩衝液の塩濃度を、１、２、８％加えて検体希釈液を作製した。
【００４８】
ノロウイルス患者便（０．５〜１．０ｇ）に各検体希釈液１０ｍＬをそれぞれ加え、懸濁後１０分間静置し、その上清を取り１０％便懸濁液とした。この１０％便懸濁液を抗ノロウイルスモノクローナル抗体固相マイクロプレートのウェルに１００μｌ加えた。その直後、最終濃度０．５％ ＢＳＡ 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で至適濃度に希釈したＰＯＤ標識抗ノロウイルスポリクローナル抗体を１０％便懸濁液が入っているウェルに加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、ウェルの反応液を吸引除去し、最終濃度０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ を含む１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）をウェルに２００μｌ加え、同様に吸引除去した。この操作を少なくとも５回行った。次いで過酸化水素を含むＴＭＢ溶液を１００μｌ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。反応後０．６Ｎの硫酸を１００μｌ／ウェル加え、ＥＬＩＳＡオートリーダーでウェルの吸光度（４５０ｎｍ／６３０ｎｍ）を測定した。
【００４９】
【表６】
表６から、同時にマイクロプレートに加える方法（検体とＰＯＤ標識抗体を同時にマイクロプレートのウェルに加える方法）は、通常法（検体と固相ＭＡｂｓとの反応後洗浄し、ＰＯＤ標識抗体を加える方法）に比べると、健常人便検体及びブランクともに吸光度が低かった。従って、ＥＬＩＳＡの操作方法としては同時マイクロプレートのウェルに加える方法の方が非特異反を軽減させると考えられた。
Claims (9)
- ｐＨ９．０〜１０．０のアルカリ性緩衝剤を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用希釈液。
- さらに動物グロブリンを含有する請求項１記載の検体用希釈液。
- さらに界面活性剤を含有する請求項１又は２記載の検体用希釈液。
- さらに水溶性高分子を含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の検体用希釈液。
- 塩濃度が１〜８質量％である請求項１〜４のいずれか１項記載の検体用希釈液。
- 抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体及び請求項１〜５のいずれか１項記載の検体用希釈液を含有するノロウイルス又はサポウイルス検体用試薬。
- さらに標識抗ノロウイルス抗体又は標識サポウイルス抗体を含有する請求項６記載の検出試薬。
- 検体に請求項１〜５のいずれか１項記載の検体用希釈液を加え、得られた検体含有液を固定化された抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と反応させることを特徴とする検体中のノロウイルス又はサポウイルスの検出方法。
- 前記検体含有液に、固定化された抗ノロウイルス抗体又は抗サポウイルス抗体と標識抗ノロウイルス抗体又は標識抗サポウイルスとを同時に反応させる請求項８記載の検出方法。
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