WO2021241446A1 - 検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット - Google Patents

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    • G01N2470/04—Sandwich assay format

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a target molecule in a sample and a target molecule detection kit.
  • Immunoassays are widely used as a method for detecting targets such as viruses in human body fluids and allergens in foods.
  • Immunochromatography is an immunoassay method that applies the property of a sample flowing slowly on a cellulose membrane while dissolving a reagent (capillary phenomenon), and is applied to pregnancy diagnosis, influenza test, and the like.
  • immunochromatography has an advantage that it can be measured very easily, it has low sensitivity because it uses a determination method based on coloration. In the determination of influenza, etc., if the amount of virus in the sample immediately after the onset is small, the virus cannot be detected, and it is necessary to wait for a while until the amount of virus increases sufficiently before remeasurement. There is.
  • ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay
  • ELISA uses a substrate whose absorption spectrum changes due to an enzymatic reaction (colorimetric method), a substrate that emits a fluorescence signal (fluorescence method), a substrate that emits light (chemiluminescence method, bioluminescence method), etc., and uses a plate reader or lumino. Enzyme activity is quantified by a measuring device such as a meter, and target molecules can be detected and quantified.
  • Patent Document 1 a method for quantifying ATP by using an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, causing the produced ATP to emit light using luciferase, and measuring the amount of emitted light is known (Patent Document). 1). Further, a method of amplifying ATP in a sample and quantifying the amplified ATP by using a bioluminescence method is known (Patent Document 2). However, all of these quantification methods are quantification methods for molecules used in ATP conversion reactions such as ATP, and target molecules that are not involved in the ATP conversion reaction in a sample are labeled with an enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP. It is not an immunoassay method that is detected by using it as an enzyme.
  • Non-Patent Document 1 discloses an immunoassay method for a target molecule using acetate kinase or pyruvate phosphate dikinase as a labeling enzyme. Has been done. However, with this method, only a luminescence signal based on the ATP production amount depending only on the turnover number of acetic acid kinase or pyruvate phosphate dikinase can be obtained, and a trace amount of ATP cannot be detected. Further, this method uses ATP supply by acetate kinase using ADP, which is easily decomposed, as a first-stage reaction, and is not suitable for commercial use such as a detection kit.
  • the sensitivity is determined by the antibody label and its detection method.
  • the bioluminescence method that can detect molecules with the highest sensitivity is capable of detecting about 10-20 mol (thousands of molecules) in one assay. This bioluminescence method
  • an object of the present invention is a method for detecting a target molecule in a sample, which can be measured even when the amount of the target molecule in the sample is below the detection limit and cannot be measured by the conventional immunoassay method.
  • the purpose is to provide a target molecule detection kit.
  • Step (1) A target molecule in a sample, a capture molecule that binds to the target molecule, and a labeled binding molecule that binds to the target molecule labeled with an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP.
  • a complex consisting of the target molecule, the labeled binding molecule, and the trapping molecule hereinafter referred to as a target molecule / labeled binding molecule / trapping molecule complex).
  • Step (2) In the step (1), a step of removing the labeled binding molecule that did not bind to the target molecule, and a step of removing the labeled binding molecule.
  • Step (3) An ATP production step of reacting the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex with a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP to produce ATP.
  • Step (4) ATP amplification step of amplifying ATP produced in the step (3)
  • Step (5) An ATP detection step of detecting the ATP amplified in the step (4), and A method for detecting a target molecule in a sample, including.
  • the labeled binding molecule is an antibody or antibody fragment or aptamer that specifically binds to a target molecule and is labeled with an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP [1] to [3].
  • the detection method according to any one of the above.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is pyruvate phosphate dikinase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are phosphoenolpyruvate, pyrophosphate, and AMP.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is acetyl-CoA synthetase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are AMP, pyrophosphate, and acetyl-CoA. 1] The detection method according to any one of [4].
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is ATP sulfulylase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are adenosine 5'-phosphosulfate and pyrophosphate. [1] ] To the detection method according to any one of [4]. [8] The enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is type II polyphosphoric acid kinase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are AMP and polyphosphoric acid. [1] to [ 4] The detection method according to any one of the items.
  • a target molecule detection kit in a sample which comprises a substrate of an enzyme that catalyzes ATP, a reagent that amplifies ATP, and a reagent that detects ATP.
  • the labeled binding molecule is an antibody or antibody fragment or aptamer that specifically binds to the target molecule, labeled with an enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP, [13] or [14].
  • Detection kit described in. [16] The enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is pyruvate phosphate dikinase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are phosphoenolpyruvate, pyrophosphate, and AMP.
  • the detection kit according to any one of [13] to [15].
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is acetyl-CoA synthetase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are AMP, pyrophosphate, and acetyl-CoA.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is ATP sulfulylase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are adenosine 5'-phosphosulfate and pyrophosphate. [13] ] To the detection kit according to any one of [15].
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is type II polyphosphoric acid kinase, and the substrates of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are AMP and polyphosphoric acid, [13] to [ 15]
  • the reagent for amplifying ATP is AMP, phosphoenolpyruvate, magnesium ion, adenylate kinase and pyruvate kinase.
  • the reagent for amplifying ATP is AMP, acetyl phosphate, magnesium ion, adenylate kinase and acetate kinase.
  • the reagent for detecting the ATP is D-luciferin and luciferase.
  • the target molecule in the sample can be detected. Can be detected.
  • the target molecule detection kit in the sample of the present invention even if the conventional immunomeasurement kit cannot measure the target molecule in the sample because the amount of the target molecule in the sample is below the detection limit, the target molecule in the sample cannot be measured.
  • a target molecule detection kit capable of detecting a target molecule is provided.
  • the target molecule 10 in the sample is reacted with the capture molecule 20 immobilized on the insoluble carrier 40 and bound to the target molecule 10 and the labeled binding molecule 30 labeled with an enzyme that catalyzes the reaction to produce ATP.
  • FIG. 1 It is a graph which showed the emission intensity of the sample of the sample No. 1 to 7 of Example 1.
  • FIG. When the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody of Example 2 and the reagent for amplifying ATP are used in combination, when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody is used alone, negative control (when ATP amplification is performed and ATP amplification is performed). It is a graph which showed the emission intensity of). Negative when ATP is amplified when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody of Example 2 is used in combination and when the reagent for amplifying ATP is used alone and when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody is used alone. It is a graph which showed the emission intensity which subtracted the emission intensity of a control and the emission intensity of a negative control when ATP was not amplified, respectively, as a background.
  • the method for detecting a target molecule in a sample of the present invention is Step (1): The target molecule in the sample, the capture molecule that binds to the target molecule, and the labeled binding molecule that binds to the target molecule labeled with the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are reacted. , Target molecule / labeled bound molecule / trapped molecule complex forming step to form target molecule / labeled bound molecule / trapped molecule complex, Step (2): In the step (1), a step of removing the labeled binding molecule that did not bind to the target molecule, and a step of removing the labeled binding molecule.
  • Step (3) An ATP production step of reacting the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex with a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP to produce ATP.
  • Step (4) ATP amplification step of amplifying ATP produced in the step (3), and
  • Step (5) An ATP detection step of detecting the ATP amplified in the step (4), and It is characterized by including.
  • step (1) the capture molecule and the labeled binding molecule are bound to the target molecule labeled with the capture molecule that binds to the target molecule and the reaction that catalyzes the reaction that produces ATP, respectively. Means a labeled binding molecule.
  • step (1) the target molecule, the captive molecule, and the labeled binding molecule are reacted with each other to form the target molecule, the labeled binding molecule, and the captive molecule complex. This is a step of forming a capture molecule complex.
  • step (1) as a method of reacting the target molecule in the sample, the capture molecule, and the labeled binding molecule, a method of simultaneously reacting the target molecule, the capturing molecule, and the labeled binding molecule in the sample.
  • the method may be a method in which the target molecule and the capture molecule are reacted to form a target molecule / capture molecule complex composed of the target molecule and the capture molecule, and then the labeled binding molecule is reacted.
  • a method may be used in which the target molecule and the labeled binding molecule are reacted to form a target molecule / labeled binding molecule complex composed of the target molecule and the labeled binding molecule, and then the capture molecule is reacted. ..
  • the trapping molecule may or may not be immobilized on the insoluble carrier, but is preferably immobilized.
  • the target molecule 10 in the sample, the capture molecule 20 immobilized on the insoluble carrier 40, and the labeled binding molecule 30 are reacted and targeted on the insoluble carrier 40.
  • the state in which the molecule / labeled bound molecule / trapped molecule complex is formed is shown.
  • the target molecule / labeled binding molecule formed in the step (1) is formed by washing the insoluble carrier 40 with a washing solution in the step (2) described later.
  • the trapped molecule complex can be easily separated from the unreacted component (component derived from the sample, labeled bound molecule 30 that did not bind to the target molecule 10, etc.).
  • Examples of the cleaning solution include phosphate buffered saline (hereinafter, also referred to as PBS), PBS containing a surfactant, an aqueous medium described later, and the like.
  • PBS phosphate buffered saline
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as Tween 20 and the like.
  • the insoluble carrier 40 is not particularly limited as long as it can immobilize the trapping molecule 20.
  • Preferred materials for the insoluble carrier 40 include polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, agarose, cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, cellulose acetate, cycloolefin polymer, polyethylene terephthalate and the like.
  • Examples thereof include polymer materials, glass, ceramics, magnetic particles, metals, etc., but cellulose acetate, cycloolefin polymers, etc., which do not adsorb proteins and can suppress non-specific binding of the labeled binding molecule 30 to the insoluble carrier. Is preferable.
  • Preferred shapes of the insoluble carrier include tubes; beads; plates; substrates; fine particles such as latex; sticks and the like.
  • a known method such as a method using a physical bond, a method using a chemical bond, or a combination thereof is used.
  • the physical bond include an electrostatic bond, a hydrogen bond, a hydrophobic bond and the like.
  • the chemical bond include a covalent bond and a coordination bond.
  • a substrate made of a cyclopolyolefin polymer is used as the insoluble carrier 40, a solution of the capture molecule 20 is added to the substrate and incubated at 4 ° C to 30 ° C for 1 hour to 1 day. Examples thereof include a method of physically adsorbing and immobilizing.
  • the capture molecule 20 may be directly immobilized on the insoluble carrier 40 or indirectly on the insoluble carrier 40.
  • an indirect immobilization method for example, a solution of the biotinylated capture molecule 20 is added to the insoluble carrier 40 on which avidin is immobilized, and the capture molecule 20 is transferred to the insoluble carrier via a specific bond between biotin and avidin.
  • a method of immobilizing to 40 can be mentioned.
  • an antibody that specifically binds to the capture molecule 20 may be immobilized on the insoluble carrier 40, and the capture molecule 20 may be immobilized on the insoluble carrier 40 via this antibody.
  • the capture molecule 20 may be immobilized on the insoluble carrier 40 by covalent bonding via a linker.
  • Examples of the linker include molecules that can be covalently bonded to both the functional group of the capture molecule 20 and the functional group held on the surface of the insoluble carrier 40.
  • the molecules include a first reactive active group capable of reacting with the functional group of the capture molecule 20 and a second reactive active group capable of reacting with the functional group held on the surface of the insoluble carrier 40.
  • a molecule having the above in the same molecule is preferable. Among them, a molecule in which the first reaction-active group and the second reaction-active group are different is particularly preferable.
  • the functional group of the capture molecule 20 and the functional group retained on the surface of the insoluble carrier 40 include a carboxyl group, an amino group, a glycidyl group, a sulfhydryl group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, an N-hydroxysuccinyl group and a maleimide.
  • the group etc. can be mentioned.
  • Active reactive groups in the linker include allyl azide, carbodiimide, hydrazide, aldehyde, hydroxymethylphosphine, imide ester, isocyanate, maleimide, N-hydroxysuccinimide (NHS) ester, pentafluorophenyl (PFP) ester, solarene, pyridyl disulfide. , Vinyl sulfone and the like.
  • the sample is not particularly limited, and for example, body fluids and tissues such as blood, blood cells, serum, plasma, spinal fluid, urine, sweat, saliva, sheep's water, and pancreatic fluid of mammals such as humans are not particularly limited. Examples thereof include foods, extracts from foods, animal cells, plant cells, insect cells, cell culture fluids of microbial cells, and cleaning fluids for medical devices and the like.
  • the sample may be one collected from the object to be detected, or may be one obtained by subjecting the collected sample to a treatment such as dilution or concentration that is usually performed. Further, the sample used in the detection method of the present embodiment may be one collected or prepared at the time of carrying out the detection method of the present embodiment, or may be previously collected or prepared and stored.
  • the target molecule 10 is not particularly limited as long as it is a molecule to be detected in the detection method of the present embodiment and can be detected by the detection method of the present embodiment.
  • examples include proteins, nucleic acids, lipids, vitamins, polysaccharides, small molecule compounds and the like.
  • the nucleic acid include DNA, RNA and the like.
  • proteins include enzymes, hormones, various peptides and the like.
  • the capture molecule 20 is not particularly limited as long as it is a molecule that can specifically bind to the target molecule 10 in the sample, and for example, it specifically binds to the target molecule 10.
  • examples thereof include an antibody or an antibody fragment, an aptamer that specifically binds to the target molecule 10, and the like.
  • the antibody either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but a monoclonal antibody is preferable.
  • the antibody fragment include F (ab') 2 , F (ab) 2 , Fab', Fab, Fv, scFv, variants thereof, fusion proteins or fusion peptides containing an antibody moiety, and the like.
  • a heavy chain variable region antibody (hereinafter, also referred to as VHH antibody) of a camelid animal antibody can also be used.
  • VHH antibody can bind to the antigen only in the heavy chain variable region.
  • the VHH antibody can be used in tandem, and by tandemizing, the binding affinity with the antigen as the target molecule can be improved, and the non-specific binding with the molecule other than the antigen can be reduced. Can be done.
  • These antibodies and antibody fragments can be prepared by known methods.
  • the aptamer that specifically binds to the target molecule in the sample may be a nucleic acid aptamer such as a DNA aptamer or an RNA aptamer, or a peptide aptamer.
  • Nucleic acid aptamers can be produced by known methods such as in vitro selection method and SELEX method. Further, the nucleic acid aptamer may be molecularly modified with 2'-pyrimidine fluoride, PEG chain, or the like, and the molecular modification can prolong the half-life of the nucleic acid aptamer.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is not particularly limited as long as it is an enzyme that can catalyze the reaction that produces ATP, and is, for example, pyruvate phosphate dikinase (Pyrubate).
  • Phosphate dikinase hereinafter also referred to as PPDK
  • acetyl-CoA synthetase Acetyl-CoA synthetase
  • ATP-Sulfurylase type II polyphosphate kinase and the like can be mentioned, but PPDK is preferable.
  • PPDK acts on AMP, phosphoenoral pyruvate and pyrophosphate (PPi) in the presence of magnesium ion as a cofactor to produce ATP, pyruvate and phosphate (Pi). It is a known enzyme that catalyzes and vice versa, and is also called pyruvate orthophosphate dikinase.
  • the labeled binding molecule 30 is not particularly limited as long as it is a molecule that binds to the target molecule 10 labeled with an enzyme that catalyzes the reaction that produces the ATP.
  • the ATP examples thereof include an antibody or an antibody fragment, an aptamer, etc., which are labeled with an enzyme that catalyzes a reaction for producing the above-mentioned target molecule 10 and specifically bind to the target molecule 10.
  • the labeled binding molecule 30 may bind to the target molecule 10 at a portion different from that of the capture molecule 20, or may bind to the target molecule 10 at the same portion as the capture molecule 20.
  • Examples of the antibody, antibody fragment, and aptamer in the labeled binding molecule 30 include the antibody, antibody fragment, and aptamer in the capture molecule 20 described above, respectively.
  • the combination of the labeled binding molecule 30 and the capture molecule 20 may be antibodies to each other, an antibody to an antibody fragment, an antibody to an aptamer, an antibody fragment to an aptamer, or the like. ..
  • Labeling of the labeled binding molecule 30 creates a covalent bond between the functional group of the molecule that binds to the target molecule 10 and the functional group of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP, with or without a linker. It can be done by the reaction that occurs.
  • the functional group include a carboxyl group, an amino group, a glycidyl group, a sulfhydryl group, a hydroxyl group, an amide group, an imino group, a hydroxysuccinyl ester group, a maleimide group, an isothiocyanate group and the like. It is possible to carry out a condensation reaction between these functional groups.
  • Examples of the bonding method not via a linker include a method using a carbodiimide compound such as EDC. In this case, it is also possible to use an active ester such as NHS or a derivative thereof.
  • the condensation reaction between the isothiocyanate group and the amino group is preferable because it does not require other reagents and proceeds only by mixing under neutral to weakly alkaline conditions.
  • the linker has, for example, both a functional group that reacts with the functional group of the molecule that binds to the target molecule 10 and a functional group that reacts with the functional group of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP. Things can be mentioned.
  • Those having both of the functional groups in the molecule include the first functional group capable of reacting with the amino acid residue of the molecule that binds to the target molecule 10 and the functionality of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP.
  • a molecule having a second functional group capable of reacting with the group in the same molecule is preferable. Among them, a molecule in which the first functional group and the second functional group are different is particularly preferable.
  • the functional group of the linker include the above-mentioned functional groups.
  • the molecule that binds to the target molecule 10 is a protein such as an antibody or an antibody fragment
  • the molecule that binds to the target molecule 10 and the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP are produced as one fusion protein. You can also do it.
  • a linker peptide having several to several tens of residues may be inserted between the molecule that binds to the target molecule 10 and the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP may be fused to either the N-terminal side or the C-terminal side of the molecule that binds the target molecule 10.
  • step (1) it is preferable to remove ATP in the sample in advance before forming the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex.
  • ATP ATP can be amplified and the occurrence of false positives can be suppressed, and the target molecule 10 in the sample can be accurately detected.
  • the method for removing ATP in the sample before forming the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex is not particularly limited as long as it can remove ATP in the sample.
  • a method of removing ATP by washing, a method of decomposing and removing ATP by acting an enzyme that decomposes ATP such as adenosine triphosphate deaminase, apyrase, and hexokinase can be mentioned.
  • the step (2) is a step of removing the labeled binding molecule 30 that did not bind to the target molecule 10 in the step (1).
  • the occurrence of false positives can be suppressed and the target molecule can be detected accurately.
  • components derived from the sample other than the target molecule 10 can be removed.
  • the method for removing the labeled bound molecule 30 that did not bind to the target molecule in the step (2) is not particularly limited, and examples thereof include washing and centrifugation, but washing is preferable.
  • a method of washing an insoluble carrier on which a capture molecule, a target molecule, and a labeled binding molecule complex are immobilized with a washing liquid can be mentioned.
  • the cleaning liquid include PBS, PBS containing a surfactant, an aqueous medium described later, and the like.
  • the surfactant include nonionic surfactants such as Tween 20 and the like.
  • the step (3) is an ATP production step in which the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex is reacted with a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP to produce ATP.
  • the substrate of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP can be appropriately determined depending on the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP. For example, when the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is PPDK, phosphoenolpyruvate, pyrophosphate and AMP can be mentioned.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is acetyl-CoA synthetase, AMP, pyrophosphate and acetyl-CoA can be mentioned.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is ATP-Sulfyllase, adenosine 5'-phosphosulfate and pyrophosphate can be mentioned.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is type II polyphosphoric acid kinase, AMP and polyphosphoric acid can be mentioned.
  • the reaction between the substrate of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP and the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is performed in the presence of a cofactor such as magnesium ion, depending on the enzyme used.
  • the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex produced in the above step (1) is used as a cofactor.
  • Pyruvic acid, phosphoric acid (Pi) and ATP are produced by reacting phosphoenolpyruvate, pyrophosphate (PPi) and AMP in the presence of magnesium ions.
  • the produced ATP is subjected to the ATP amplification step of the next step (4).
  • the step (4) is an ATP amplification step for amplifying the ATP produced in the step (3).
  • the method for amplifying ATP is not particularly limited, but a method using a reagent for amplifying ATP is preferable.
  • the reagent that amplifies ATP include an enzyme that amplifies ATP and a substrate thereof. When an enzyme that amplifies ATP and a substrate thereof are used, the reagent that amplifies ATP contains a cofactor necessary for the enzymatic reaction.
  • Examples of the enzyme that amplifies ATP include a combination of adenylate kinase (hereinafter, also referred to as AK) and pyruvate kinase (hereinafter, also referred to as PK), a combination of AK and polyphosphate kinase, a combination of AK and creatin kinase, and AK. And the combination of acetate kinase and the like, but the combination of AK and PK is preferable.
  • AK adenylate kinase
  • PK pyruvate kinase
  • the substrate and cofactor of the enzyme that amplifies ATP can be appropriately determined according to the enzyme that amplifies ATP.
  • the enzyme that amplifies ATP is a combination of AK and PK
  • the substrate of the enzyme that amplifies ATP includes AMP and phosphoenolpyruvate
  • the cofactor includes magnesium ion.
  • the enzyme that amplifies ATP is a combination of AK and polyphosphoric acid kinase
  • the substrate of the enzyme that amplifies ATP includes AMP and polyphosphoric acid
  • the cofactor includes magnesium ion.
  • the substrate of the enzyme that amplifies ATP includes AMP and creatine phosphate
  • the cofactor includes magnesium ion.
  • the substrate of the enzyme that amplifies ATP includes AMP and acetylphosphate
  • the cofactor includes magnesium ion.
  • the method of amplifying ATP using a combination of AK and PK is shown by the following reaction formula.
  • the step (4) may be performed at the same time as the step (3).
  • the target molecule, the labeled binding molecule, and the capture molecule complex are charged with the substrate of the enzyme that catalyzes the reaction for producing ATP and the ATP.
  • a reagent that amplifies ATP By adding a reagent that amplifies ATP, ATP production and ATP amplification can be performed at the same time.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is PPDK, and when ATP is amplified using AK and PK, phosphoenolpyruvate is added to the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex.
  • pyrophosphate (PPi) phosphoenolpyruvate
  • PPi pyrophosphate
  • AMP AMP
  • AK AK
  • PK magnesium ion
  • the step (5) is an ATP detection step of detecting the ATP amplified in the step (4).
  • the method for detecting ATP is not particularly limited, but a method using a reagent for detecting ATP is preferable.
  • the reagent for detecting ATP include an enzyme that reacts with ATP to generate a dye or luminescence and a substrate thereof, an enzyme that reacts with ATP to produce hydrogen peroxide, and a substrate thereof.
  • luciferase is used to measure the luminescence produced by ATP and D-luciferin, and glucokinase and acetate kinase are used in combination as an enzyme to detect ATP, and ATP and glucose are used.
  • a method of amplifying the reaction of producing glucose-6-phosphate from, and further combining glucose-6-phosphate dehydrogenase and diaphorase to carry out a visual coloring reaction Japanese Patent Laid-Open No. 2003-225098
  • hexoxinase and pyruvate Japanese Patent Laid-Open No. 2003-225098
  • a method of amplifying the reaction of producing glucose 6-phosphate from ATP and D-glucose in combination with a kinase and quantifying it by chemical luminescence using 1-methoxy-5-phenazinemethylsulfate and isolminol (specially).
  • Kaisho 64-23900) a method of adding nucleoside phosphorylase and xanthin oxidase to ATP to quantify hydrogen peroxide generated in the reaction
  • Japanese Patent Laid-Open No. 63-11848 Japanese Patent Laid-Open No. 63-11848
  • the phosphoric acid produced by allowing ATP-degrading enzyme to act on ATP Japanese Patent Laid-Open No. 63-11848
  • a method for measuring molybdenum blue generated by a reaction with molybdenum Japanese Patent Laid-Open No.
  • ATP is allowed to act on nicotinic acid amide mononucleotide and adenyryl transferase, and the resulting NAD is used as a coenzyme.
  • examples thereof include an oxidation-reduction reaction system and a method of performing and quantifying a coenzyme cycling reaction using reduced NAD as a coenzyme (Japanese Patent Laid-Open No. 59-166099). It is produced by ATP and D-luciferin using luciferase. A method of measuring luminescence is preferred.
  • a commercially available kit for detecting the amount of ATP using colorimetry or fluorescence for example, ATP Colorimetric / Fluorometric Assay Kit, manufactured by BioVision
  • ATP Colorimetric / Fluorometric Assay Kit manufactured by BioVision
  • the reaction formula in which luciferase is used as an enzyme for detecting ATP and luminescence is generated by ATP amplified in step (4) and D-luciferin is shown below.
  • luciferase examples include beetle luciferase derived from fireflies such as Hotinus pyraris and click beetle, recombinants of beetle luciferase, variants of beetle luciferase imparted with heat resistance and / or chemical resistance, or ATP and luciferin. , Molecular oxygen, and any luciferase that reacts with magnesium as a cofactor or any other divalent cation to produce luminescence. Further, as the substrate of luciferase, in addition to D-luciferin, luciferin analogs such as aminoluciferin and AkaLumine can also be used.
  • the step (5) is the step (3) and the step. (4) ATP can be detected even if it is performed at the same time.
  • the reaction for producing ATP is catalyzed on the target molecule, the labeled binding molecule, and the capture molecule complex.
  • the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP is PPDK
  • AK and PK are used for amplification of ATP
  • ATP is detected by luciferase
  • PPDK kinase
  • AK and PK are used for amplification of ATP
  • ATP is detected by luciferase
  • the target molecule / labeled binding molecule / Simultaneous production, amplification and detection of ATP by adding phosphoenolpyruvate, pyrophosphate, AMP, AK, PK, D-luciferase, luciferase and magnesium ion as
  • a calibration curve showing the relationship between the concentration of the target molecule and the signal in the ATP detection step is created and created.
  • steps (1) to (5) are performed, and the concentration of the target molecule in the sample can be quantified from the measured value of the signal detected in the step (5). can.
  • steps (1) to (5) are performed, the change over time of the signal intensity from the signal generation in the ATP detection step is measured, and an increase curve of the signal intensity is created. It is also possible to quantify the concentration of the target molecule in the sample by performing steps (1) to (5) from the sample and performing curve fitting with the increase curve of the signal intensity in the step (5).
  • the step (1) and the steps (3) to (5) are carried out in an aqueous medium.
  • the aqueous medium include deionized water, distilled water, a buffer solution and the like, and a buffer solution is preferable.
  • the buffer used for preparing the buffer is not particularly limited as long as it has a buffering ability, but for example, a lactic acid buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, a succinic acid buffer, and a phthalic acid having a pH of 1 to 11 are not particularly limited.
  • Buffers phosphate buffers, triethanolamine buffers, diethanolamine buffers, lysine buffers, barbitur buffers, imidazole buffers, apple acid buffers, oxalate buffers, glycine buffers, borate buffers, Examples thereof include a carbon dioxide buffer, a glycine buffer, a Tris buffer, and a good buffer.
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for detecting the target molecule, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L, and 0. 01 to 0.1 mol / L is particularly preferable.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an operation procedure of a target molecule detection method when the ATP amplification step and the ATP detection step are performed separately.
  • the sample and the labeled binding molecule 30 are mixed, and the mixture of the obtained sample and the labeled binding molecule 30 is captured.
  • the antibody 20 is added onto the immobilized insoluble carrier 40.
  • the target molecule / labeled binding molecule complex is bound to the capture antibody 20 immobilized on the insoluble carrier 40, and the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex is formed on the insoluble carrier 40.
  • the insoluble carrier 40 is washed with a washing solution to remove the labeled binding molecule 30 that did not bind to the target molecule 10. If cleaning is inadequate, repeat cleaning.
  • Sufficient washing can be determined, for example, by the presence or absence of the labeled binding molecule 30 that did not bind to the target molecule 10 in the washing liquid. If the labeled binding molecule 30 is no longer present in the cleaning solution, it can be determined that cleaning is sufficient.
  • an enzyme containing a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, a reagent that amplifies ATP, an enzyme that detects ATP, and, if necessary, a cofactor of the enzyme A reagent for amplifying ATP by adding a reaction solution (hereinafter, also referred to as enzyme reaction solution 1) to an insoluble carrier 40 and using an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP labeled on a labeled binding molecule 30. Amplifies by. When a sufficient time has elapsed for the ATP production reaction and the ATP amplification reaction, the process proceeds to the ATP detection step.
  • the reaction time is extended. Whether or not the amplified amount of ATP is sufficient can be determined by whether or not the amplified ATP can be detected.
  • a substrate for detecting ATP (hereinafter, also referred to as enzyme reaction solution 2) is added.
  • Measure the generated signal For example, if the generated signal is luminescence, the luminescence signal intensity is measured. When the generated signal intensity exceeds a certain threshold value, it can be determined that the target molecule 10 is contained in the sample. When the generated signal intensity does not exceed a certain threshold value, it can be determined that the target molecule 10 is not contained in the sample.
  • the threshold value of the signal intensity for determining that the sample contains the target molecule 10 can be appropriately set depending on the purpose of detection, the detection sensitivity, and the like.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an operation procedure of a target molecule detection method when the ATP amplification step and the detection step are performed at the same time.
  • the insoluble carrier 40 is washed with a washing solution to remove the labeled binding molecule 30 that has not bound to the target molecule 10.
  • the steps up to the step are the same as in the case where the ATP amplification step and the ATP detection step are performed separately.
  • the enzyme reaction solution 1 and the enzyme reaction solution 2 are added to the insoluble carrier 40 and labeled with the labeled binding molecule 30.
  • a reaction for amplifying ATP produced by an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP and a reaction for detecting amplified ATP are performed at the same time. If sufficient time has passed for the reaction, the signal generated by the reaction is measured. If sufficient time has not passed for the reaction and the amount of ATP detected is insufficient, the reaction time is extended. Whether or not the reaction time is sufficient can be determined by the intensity of the signal generated in the reaction.
  • the reaction time is sufficient and a signal is generated, measure the signal intensity.
  • the generated signal intensity exceeds a certain threshold value, it can be determined that the target molecule 10 is contained in the sample.
  • the generated signal intensity does not exceed a certain threshold value, it can be determined that the target molecule 10 is not contained in the sample.
  • FIG. 4 is a diagram showing an example of an operation procedure of a method for quantifying a target molecule when the ATP amplification step and the ATP detection step are performed at the same time.
  • the insoluble carrier 40 is washed with a washing solution to remove the labeled binding molecule 30 that did not bind to the target molecule 10.
  • the steps up to this step are the same as in the case of the target molecule detection method in which the ATP amplification step and the ATP detection step are separately performed.
  • the enzyme reaction solution 1 and the enzyme reaction solution 2 are added to the insoluble carrier 40, and the labeled binding molecule is added.
  • a reaction for detecting the amplified ATP at the same time as amplifying the ATP produced by the enzyme that catalyzes the reaction for producing the ATP labeled with 30 is performed, and the intensity of the signal generated in the ATP detection reaction is measured from the signal generation start time. Measure changes over time. If sufficient time has not passed for the reaction and the signal intensity is insufficient for quantification, the reaction time is extended.
  • reaction time is sufficient and the signal intensity is sufficient for quantification, fitting with the time-dependent change data of the signal intensity prepared in advance by generating a signal in the same manner using a target molecule having a known concentration. To calculate the amount of target molecule contained in the sample.
  • FIG. 5A shows a side view of a configuration example of immunochromatography using the method for detecting a target molecule of the present embodiment.
  • FIG. 5B shows a top view of a configuration example of immunochromatography using the method for detecting a target molecule of the present embodiment.
  • Lateral flow using the method for detecting a target molecule of the present embodiment includes a sample addition unit 50, a first reagent storage unit 51, a second reagent storage unit 52, a flow path 53, a mixing / reaction unit 54, a detection unit 55, and a waste liquid. It is composed of a housing portion 56.
  • the labeled binding molecule 30 (hereinafter, also referred to as reagent 1) is contained in the first reagent accommodating unit 51.
  • the second reagent storage unit 52 contains a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, a reagent that amplifies ATP, and an enzyme that detects ATP (hereinafter, also referred to as reagent 2).
  • the mixing / reaction unit 54 contains an insoluble carrier 40 on which the capture molecule 20 is immobilized.
  • the mixing / reaction unit 54 can also serve as the detection unit 55.
  • the sample is added to the sample addition section 50 using a pipette or the like, and the liquid is sent to the flow path 53.
  • an automatic liquid feeding using a machine can also be used.
  • the automatic liquid feeding can also be performed by using, for example, a cartridge that feeds the elastic container by applying an external force to the elastic container with a pump or a roller.
  • 5A and 5B show an example of liquid feeding using the roller 57.
  • the reagent 1 stored in the first reagent storage section 51 is sent to the flow path 53 by the roller 57 and mixed with the sample to form a target molecule / labeled binding molecule complex, and the mixing / reaction section is formed. It is supplied to 54.
  • the target molecule / labeled binding molecule complex supplied to the mixing / reaction unit 54 is captured by the capture molecule 20 immobilized on the insoluble carrier 40 contained in the mixing / reaction unit 54, and is captured by the target molecule / label.
  • a compound-bonded molecule / capture molecule complex is formed on the insoluble carrier 40.
  • the reagent 2 contained in the second reagent storage unit 52 is sent to the mixing / reaction unit 54 through the flow path 53 by the roller 57, and the mixing / reaction unit 54 is fed. It is added to the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex immobilized on the insoluble carrier 40 contained in the ATP, and ATP is produced and amplified.
  • a substrate for detecting ATP is added to the mixing / reaction unit 54, the amplified ATP, the enzyme for detecting ATP, and the substrate for the enzyme for detecting ATP react with each other to generate a signal.
  • the generated signal is measured by the detector 55 according to the signal in the detection unit 55.
  • the detector examples include a plate reader, a luminometer, a photomultiplier tube (PMT), a charge-coupled device (CCD), CMOS, a photosensitive material (photographic film, instant film, photographic paper, etc.) and the like.
  • the reaction liquid and the cleaning liquid after the signal measurement are stored in the waste liquid storage unit 56 and discarded.
  • a virus is used as the target molecule 10
  • a PPDK-labeled VHH antibody is used as the labeled binding substance 30
  • a DNA aptamer is used as the capture antibody 20
  • an insoluble carrier is used.
  • COP cycloolefin polymer
  • sample A sample is added to the cartridge from the sample addition unit 50.
  • saliva containing a virus is shown as an example as a sample.
  • virus-PPDK-labeled VHH antibody complex of DNA aptamer
  • the virus-PPDK-labeled VHH antibody complex is captured by DNA aptamer, which is a capture molecule 20 immobilized on the insoluble carrier 40, and virus-PPDK.
  • a labeled VHH antibody-DNA aptamer complex is formed.
  • a virus / PPDK-labeled VHH antibody / DNA aptamer complex formed on the COP contained in the mixing / reaction unit 54 by sending the cleaning liquid contained in the cleaning liquid storage unit 58 by the cleaning roller 57. Wash your body. Wash multiple times. This washing removes the PPDK-labeled VHH antibody that did not bind to ATP or virus in the sample.
  • Reagent 2 containing phosphoenolpyruvate, pyrophosphate (PPi), AMP, AK, PK and luciferase (Luc) contained in the second reagent container 52 is mixed / reacted with a roller 57. The liquid is sent to the part 54.
  • PPi pyrophosphate
  • AMP pyrophosphate
  • AK pyrophosphate
  • PK luciferase
  • ATP production and amplification Reagent 2 reacts with the virus, PPDK-labeled VHH antibody, and DNA aptamer formed on the COP, resulting in ATP production and ATP amplification. Let stand until the reaction progresses sufficiently.
  • D-luciferin which is a substrate for luciferase, which is an enzyme that detects ATP
  • D-luciferin is added to the mixing / reaction unit 54.
  • the luciferase in the reagent 2 reacts with the amplified ATP and D-luciferin to generate a luminescence signal.
  • the emission signal generated in (7) is measured using a detector such as a photomultiplier tube (PMT), a charge-coupled device (CCD), or CMOS.
  • PMT photomultiplier tube
  • CCD charge-coupled device
  • CMOS complementary metal-oxide-semiconductor
  • the kit for detecting the target molecule of the present embodiment is a kit used for the method for detecting the target molecule of the present embodiment, and is a capture molecule, a labeled binding molecule, a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction for producing ATP, and the like. It contains a reagent that amplifies ATP and a reagent that detects ATP.
  • the capture molecule, the labeled binding molecule, the substrate of the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP, the reagent that amplifies ATP, and the reagent that detects ATP are described above.
  • Examples thereof include a capture molecule, a labeled binding molecule, a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, a reagent that amplifies ATP, and a reagent that detects ATP, which are mentioned in the method for detecting a target molecule of the present embodiment. ..
  • the kit of the present embodiment may further include reagents and devices necessary for detecting the target molecule by the method of detecting the target molecule of the present embodiment.
  • the kit of this embodiment includes a capture molecule, a labeled binding molecule, a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, a reagent that amplifies ATP, a reagent that detects ATP, and an insoluble carrier such as a substrate.
  • the capture antibody 20 is immobilized on an insoluble carrier 40 such as a substrate.
  • the sample addition section 50, the first reagent storage section 51, the second reagent storage section 52, the flow path 53, and the mixing / reaction section are shown in FIG.
  • Examples include kits containing reagents for amplification and reagents for detecting ATP.
  • the labeled binding molecule 30 (reagent 1) can be stored in the first reagent storage unit 51.
  • the second reagent accommodating unit 52 can accommodate a reagent (reagent 2) containing a substrate of an enzyme that catalyzes a reaction that produces ATP, a reagent that amplifies ATP, and an enzyme that detects ATP.
  • the mixing / reaction unit 54 contains an insoluble carrier 40 on which the capture molecule 20 is immobilized.
  • the reagent 1 and the reagent 2 may be stored in advance in the first reagent storage unit 51 and the second reagent storage unit 52, respectively.
  • the sample is added to the sample addition section 50 using a pipette or the like, and the liquid is sent to the flow path 53.
  • the liquid feeding automatic liquid feeding using a machine can also be used.
  • the automatic liquid feeding can be performed by applying a force from the outside to the elastic container by, for example, a pump or a roller.
  • the kit of this embodiment may further include a necessary buffer solution, an enzyme reaction stop solution, a detector such as a plate reader or a luminometer, a product manual, and the like.
  • the reagent 1 stored in the first reagent storage section 51 is sent to the flow path 53 by a roller 57 and mixed with the sample to form a target molecule / labeled binding molecule complex, and the mixing / reaction section. Supply to 54.
  • the target molecule / labeled binding molecule complex supplied to the mixing / reaction unit 54 is captured by the capture molecule 20 immobilized on the insoluble carrier 40 contained in the mixing / reaction unit 54, and is captured by the target molecule / label.
  • a compound-bonded molecule / capture molecule complex is formed on the insoluble carrier 40.
  • the reagent 2 contained in the second reagent storage unit 52 is sent to the mixing / reaction unit 54 through the flow path 53 by the roller 57.
  • the reagent 2 is added to the target molecule / labeled binding molecule / capture molecule complex formed on the insoluble carrier 40 contained in the mixing / reaction unit 54 to produce and amplify ATP.
  • a substrate for detecting ATP is added to the mixing / reaction unit 54, and the amplified ATP is reacted with the substrate of the enzyme for detecting ATP and the substrate of the enzyme for detecting ATP to generate a signal.
  • the generated signal is measured by the detection unit 55 with a detector corresponding to the signal. Examples of the detector include a plate reader, a luminometer, and the like.
  • the reaction liquid and the cleaning liquid after the signal measurement are stored in the waste liquid storage unit 56 and discarded.
  • the scope of application of the present invention is not limited to the above embodiment.
  • the present invention can be widely applied to a method and a kit for detecting a target molecule contained in a sample by an immunoassay method.
  • Example 1 The signal intensities were compared between the case where the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP was used alone and the case where the enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP and the reagent that amplifies ATP were used in combination.
  • PPDK was used as an enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP.
  • AK and PK were used as the enzyme for amplifying ATP.
  • As a reagent for detecting ATP beetle luciferase and its substrate were used. The reagents used in this example are shown below.
  • the average values of the emission intensities of the samples of sample No. 4 and sample No. 5 when PPDK was used alone and the ATP amplification reaction using AK and PK were not performed were 152520 and 28410, respectively. there were.
  • the average values of the emission intensities of the samples of sample No. 1 and sample No. 2 were 49522945 and 3451598, respectively.
  • the sample of sample number 1 shows 32.5 times the emission intensity of the sample of sample number 4, and the sample of sample number 2 shows 121.5 times the emission intensity of the sample of sample number 5, and the condition that PPDK has a lower concentration is satisfied. It was shown that the combination of the ATP production reaction and the ATP amplification reaction favorably enhances the signal.
  • the method of the present invention uses a combination of an enzyme that catalyzes an ATP-producing reaction and a reagent that amplifies ATP, as compared with a method that uses an enzyme that catalyzes an ATP-producing reaction alone.
  • a method that uses an enzyme that catalyzes an ATP-producing reaction alone has been shown to have a significant effect on the detection of ATP.
  • the efficiency of signal enhancement increases when the amount of PPDK, which is an enzyme that catalyzes the reaction that produces ATP, is small, the amount of labeled binding molecule that binds to the target molecule is small, that is, the target molecule is small. Even so, it is considered that the target molecule detection method of the present invention can detect the target molecule.
  • Example 2 BSA was detected using a heavy chain variable region antibody (hereinafter, also referred to as PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody) of an anti-BSA-camera animal antibody labeled with PPDK, and the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody was used alone.
  • PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody a heavy chain variable region antibody
  • the signal intensities when used and when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody and the reagent for amplifying ATP were used in combination were compared.
  • AK and PK were used as enzymes for amplifying ATP.
  • As the reagent to be detected by BSA beetle luciferase and its substrate were used. The reagents used in this example are shown below.
  • BSA was detected by the following procedure.
  • the 96-well plate obtained above was set in a luminometer GloMAX navigator (manufactured by Promega) and allowed to stand for 15 minutes.
  • Reagent B (5 ⁇ g / ml Luc, PBS containing 200 ⁇ M D-luciferin) was added to each well in an amount of 50 ⁇ l each using a luminometer pump, and the emission intensity of each sample was measured immediately after the addition.
  • the emission intensity was measured by measuring the amount of emission (counts / seconds; cps) per second for each well of the 96-well plate. The measurement results are shown in FIG.
  • the luminescence intensity when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody was used alone was 1226 cps on average, which was 1187 cps, which was the luminescence intensity of the negative control when ATP was not amplified. In comparison, the difference was small.
  • the luminescence intensity when the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody and the reagent for amplifying ATP were used in combination was 19290 cps, which was compared with the luminescence intensity of 3409 cps which was the negative control luminescence intensity when ATP was amplified. The intensity was greatly amplified.
  • FIG. 9 shows a graph of the emission intensity obtained by subtracting the emission intensity of the negative control when ATP is not amplified and the emission intensity of the negative control as the background.
  • the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody and the reagent for amplifying ATP are combined as compared with the case where the PPDK-labeled anti-BSA-VHH antibody is used alone and ATP is not amplified. It was found that when ATP was amplified, the emission intensity was greatly increased. From the above, it was shown that the method of the present invention has a remarkable effect in detecting the target molecule contained in the sample. Even when the number of target molecules is small and signal detection is difficult when an antibody labeled with an ATP-producing enzyme is used alone, the method for detecting a target molecule of the present invention amplifies a signal to obtain a target molecule. It is thought that it can be detected.
  • Target molecule 10
  • Capture molecule 10
  • Capture molecule 30
  • Labeled binding molecule 40
  • Insoluble carrier 50
  • Specimen addition part 51
  • First reagent storage part 52
  • Second reagent storage part 53
  • Flow path 54
  • Mixing / reaction part 55
  • Detection part 56
  • Waste liquid storage part 56
  • Roller 58 Cleaning liquid storage Department

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Abstract

検体中の標的分子と、前記標的分子と結合する捕捉分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子とを反応させ、前記標的分子と前記捕捉分子と前記標識化結合分子とからなる複合体を形成させる、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体形成工程と、標的分子と結合しなかった前記標識化結合分子を除去する工程と、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体とＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質とを反応させＡＴＰを産生させる、ＡＴＰ産生工程と、産生されたＡＴＰを増幅する、ＡＴＰ増幅工程と、増幅したＡＴＰを検出する、ＡＴＰ検出工程と、を含む、検体中の標的分子の検出方法。

Description

検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット
　本発明は、検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キットに関する。
　免疫測定法は、ヒトの体液中のウィルスや食品中のアレルゲンなどの標的物を検出する手法として広く用いられている。イムノクロマトグラフィは、セルロース膜上を検体が試薬を溶解しながらゆっくりと流れる性質（毛細管現象）を応用した免疫測定法であり、妊娠診断、インフルエンザ検査等に応用されている。
　しかしながら、イムノクロマトグラフィは、非常に簡便に測定が可能というメリットがあるが、呈色による判定方法を使用しているため、低感度である。インフルエンザなどの判定においては、発症直後の検体中のウィルス量が少ない場合などに、ウィルスを検出することができず、ウィルス量が十分に増えるまで時間をおいてからの再測定が必要になることがある。
　ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）は種々の抗原抗体反応の組合せを利用し、酵素標識した抗原あるいは抗体を反応系に組込んで、酵素活性を検出することによって、検体中の標的分子を検出する手法であり、イムノクロマトグラフィで一般的に採用されている金属コロイドによる呈色を目視判定する方法と比較して、高感度に標的分子を検出することが可能である。ＥＬＩＳＡは、酵素反応によって吸光スペクトルが変化する基質（比色法）、蛍光シグナルを出す基質（蛍光法）、発光する基質（化学発光法、生物発光法）などを利用して、プレートリーダーやルミノメーターなどの測定装置で酵素活性が数値化され、標的分子を検出・定量することができる。
　一方、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素を用いて、産生するＡＴＰを、ルシフェラ－ゼを用いて発光させ、生成する発光量を測定することによるＡＴＰの定量法が知られている（特許文献１）。また、検体中のＡＴＰを増幅させ、増幅したＡＴＰを、生物発光法を用いて定量する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、これらの定量方法は、いずれもＡＴＰ等のＡＴＰ変換反応に用いられる分子の定量方法であり、検体中のＡＴＰ変換反応に関与しない標的分子を、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素を標識酵素として用いて検出する免疫測定方法ではない。
　ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素を標識酵素として用いて検出する免疫測定方法として、非特許文献１に、酢酸キナーゼ又はピルビン酸リン酸ジキナーゼを標識酵素として用いる、標的分子の免疫測定方法が開示されている。しかしながら、この方法では、酢酸キナーゼ又はピルビン酸リン酸ジキナーゼの代謝回転数のみに依存したＡＴＰ産生量に基づく発光シグナルしか得ることができず、微量のＡＴＰの検出はできない。また、この方法は、分解しやすいＡＤＰを用いた酢酸キナーゼによるＡＴＰ供給を初段反応としており、検出キットなどの商業的利用には適していない。
特開平９－２３４０９９号公報 特開２００１－２９９３９０号公報
Ａｎａｌ　Ｓｃｉ．　２００３　Ｊａｎ；１９（１）：１０５－９．
　イムノクロマトグラフィやＥＬＩＳＡのような免疫測定法では、抗体の標識物とその検出法で感度が決定される。免疫測定法の中で、最も高感度に分子を検出できる生物発光法は、１アッセイにおいて１０－２０ｍｏｌ（分子数で数千個）程度の分子の検出が可能であるが、この生物発光法を用いても、１アッセイあたりで数千分子以上の標的分子が検体に含まれている必要があり、それ以下の分子数では標的分子を検出することができない。
　したがって、本発明の目的は、従来の免疫測定方法では、検体中の標的分子の量が検出限界以下であるため測定できない場合であっても測定可能な、検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キットを提供することにある。
　上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］　工程（１）：検体中の標的分子と、前記標的分子と結合する捕捉分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子とを反応させ、前記標的分子と前記標識化結合分子と前記捕捉分子とからなる複合体（以下、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と称する）を形成させる、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体形成工程と、
　工程（２）：前記工程（１）において、標的分子と結合しなかった前記標識化結合分子を除去する工程と、
　工程（３）：前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質とを反応させＡＴＰを産生させる、ＡＴＰ産生工程と、
　工程（４）：前記工程（３）で産生されたＡＴＰを増幅する、ＡＴＰ増幅工程と、
　工程（５）：前記工程（４）で増幅したＡＴＰを検出する、ＡＴＰ検出工程と、
を含む、検体中の標的分子の検出方法。
［２］　前記工程（１）において、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる前に、予め、検体中のＡＴＰを除去する工程を含む、［１］に記載の検出方法。
［３］　前記捕捉分子が、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］　前記標識化結合分子が、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸及びＡＭＰである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［６］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、アセチル－ＣｏＡシンテターゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ、ピロリン酸、及びアセチル－ＣｏＡである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［７］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、アデノシン５’－ホスホスルフェート及びピロリン酸である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［８］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、II型ポリリン酸キナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ及びポリリン酸である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［９］　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼとを用いることにより行う、［１］～［８］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１０］　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼとポリリン酸キナーゼとを用いることにより行う、［１］～［８］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１１］　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼと酢酸キナーゼとを用いることにより行う、［１］～［８］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１２］　前記工程（５）において、ＡＴＰの検出を、ルシフェラーゼを用いることにより行う、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１３］　標的分子と結合する捕捉分子が固定化された不溶性担体と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と、ＡＴＰを増幅する試薬と、ＡＴＰを検出する試薬と、を含む、検体中の標的分子検出キット。
［１４］　前記捕捉分子が、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、［１３］に記載の検出キット。
［１５］　前記標識化結合分子が、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、［１３］又は［１４］に記載の検出キット。
［１６］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸及びＡＭＰである、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の検出キット。
［１７］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、アセチル－ＣｏＡシンテターゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ、ピロリン酸及びアセチル－ＣｏＡである、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の検出キット。
［１８］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、アデノシン５’－ホスホスルフェート及びピロリン酸である、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の検出キット。
［１９］　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、II型ポリリン酸キナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ及びポリリン酸である、［１３］～［１５］のいずれか一項に記載の検出キット。
［２０］　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及びピルビン酸キナーゼである、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の検出キット。
［２１］　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、ポリリン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼである、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の検出キット。
［２２］　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、アセチルリン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及び酢酸キナーゼである、［１３］～［１９］のいずれか一項に記載の検出キット。
［２３］　前記ＡＴＰを検出する試薬が、Ｄ－ルシフェリン及びルシフェラーゼである、［１３］～［２２］のいずれか一項に記載の検出キット。
　本発明の検体中の標的分子の検出方法によれば、従来の免疫測定方法では、検体中の標的分子の量が検出限界以下であるため測定できない場合であっても、検体中の標的分子を検出することができる。また、本発明の検体中の標的分子検出キットによれば、従来の免疫測定キットでは、検体中の標的分子の量が検出限界以下であるため測定できない場合であっても、検体中の標的分子を検出することができる、標的分子検出キットが提供される。
検体中の標的分子１０と、不溶性担体４０に固定化された、標的分子１０と結合する捕捉分子２０と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された標識化結合分子３０とを反応させ、不溶性担体４０上に、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させた状態を示した図である。 ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程とを分けて行う場合の標的分子の検出方法の操作手順の一例を示した図である。 ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程とを同時に行う場合の標的分子の検出方法の操作手順の一例を示した図である。 ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程とを同時に行う場合の標的分子の定量方法の操作手順の一例を示した図である。 本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィの構成例の側面を示した図である。 本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィの構成例の上面を示した図である。 ローラーで弾性容器に外から力をかけて送液を行うカートリッジを用いて、標的分子１０としてウィルス、標的分子１０に結合する捕捉抗体２０としてＤＮＡアプタマー、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された標識化結合物質３０としてピルビン酸リン酸ジキナーゼ標識化重鎖可変領域抗体、ＡＴＰを増幅する酵素としてアデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼ、ＡＴＰを検出する酵素としてルシフェラーゼ、不溶性担体４０としてシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）をそれぞれ用いたイムノクロマトグラフィの構成例と動作の一例を示した図である。 実施例１のサンプル番号１～７のサンプルの発光強度を示したグラフである。 実施例２のＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて用いた場合、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用した場合、ネガティブコントロール（ＡＴＰ増幅を行った場合とＡＴＰ増幅を行わなかった場合）の発光強度を示したグラフである。 実施例２のＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて用いた場合と、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用した場合とにおいて、ＡＴＰの増幅を行った場合のネガティブコントロールの発光強度と、ＡＴＰの増幅を行わなかった場合のネガティブコントロールの発光強度とをバックグラウンドとしてそれぞれ減算した発光強度を示したグラフである。
　本発明の検体中の標的分子の検出方法は、
　工程（１）：検体中の標的分子と、前記標的分子と結合する捕捉分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子とを反応させ、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体形成工程と、
　工程（２）：前記工程（１）において、標的分子と結合しなかった前記標識化結合分子を除去する工程と、
　工程（３）：前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質とを反応させＡＴＰを産生させる、ＡＴＰ産生工程と、
　工程（４）：前記工程（３）で産生されたＡＴＰを増幅する、ＡＴＰ増幅工程と、
　工程（５）：前記工程（４）で増幅したＡＴＰを検出する、ＡＴＰ検出工程と、
を含むことを特徴とする。
　以下、本発明の検体中の標的分子の検出方法の実施形態について説明する。
　なお、以下の記載において、特に断らない限り、捕捉分子、標識化結合分子とは、それぞれ、標的分子と結合する捕捉分子、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子と結合する標識化結合分子を意味する。
［工程（１）］
　工程（１）は、検体中の標的分子と、捕捉分子と、標識化結合分子とを反応させ、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体形成工程である。
　工程（１）において、検体中の標的分子と、捕捉分子と、標識化結合分子とを反応させる方法としては、検体中の標的分子と、捕捉分子と、標識化結合分子とを同時に反応させる方法であっても、標的分子と捕捉分子とを反応させ、標的分子と捕捉分子とからなる標的分子・捕捉分子複合体を形成させた後に、標識化結合分子を反応させる方法であってもよい。また、標的分子と標識化結合分子とを反応させ、標的分子と標識化結合分子とからなる標的分子・標識化結合分子複合体を形成させた後に、捕捉分子を反応させる方法であってもよい。
　前記捕捉分子は、不溶性担体に固定化されていなくても、固定化されていてもよいが、固定化されていることが好ましい。
　図１に、前記工程（１）において、検体中の標的分子１０と、不溶性担体４０に固定化されている捕捉分子２０と、標識化結合分子３０とを反応させ、不溶性担体４０上に、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させた状態を示す。捕捉分子２０が不溶性担体４０に固定化されている場合、後述する工程（２）において、不溶性担体４０を洗浄液で洗浄することにより、工程（１）において形成された標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を、未反応成分（検体由来の成分、標的分子１０に結合しなかった標識化結合分子３０等）から容易に分離することができる。洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（以下、ＰＢＳとも称する）、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等が挙げられる。前記界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
　前記不溶性担体４０としては、前記捕捉分子２０を固定化できるものであれば特に制限はない。不溶性担体４０の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等が挙げられるが、タンパク質を吸着せず、標識化結合分子３０の不溶性担体への非特異的結合を抑制できる、酢酸セルロース、シクロオレフィンポリマー等が好ましい。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ；ビーズ；プレート；基板；ラテックス等の微粒子；スティック等が挙げられる。
　捕捉分子２０の不溶性担体４０への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。例えば、シクロポリオレフィン系ポリマー製の基板を不溶性担体４０として使用する場合には、前記基板に捕捉分子２０の溶液を添加して、１時間から１日間、４℃～３０℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法を挙げることができる。
　捕捉分子２０は、直接、不溶性担体４０に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体４０に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体４０に、ビオチン化した捕捉分子２０の溶液を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、捕捉分子２０を不溶性担体４０に固定化する方法が挙げられる。また、不溶性担体４０に、捕捉分子２０に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介して捕捉分子２０を不溶性担体４０に固定化してもよい。あるいは、捕捉分子２０は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体４０に固定化してもよい。リンカーとしては、例えば、捕捉分子２０の官能基と不溶性担体４０がその表面に保持している官能基の両者と共有結合できる分子等が挙げられる。前記分子としては、捕捉分子２０の官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体４０がその表面に保持している官能基と反応することができる第２の反応活性基とを同一分子内に持つ分子が好ましい。その中でも、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基である分子が特に好ましい。捕捉分子２０の官能基および不溶性担体４０がその表面に保持している官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ－ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
　本実施形態における検出方法において、検体としては特に制限はなく、例えば、ヒト等の哺乳動物の血液、血球、血清、血漿、髄液、尿、汗、唾液、羊水、膵液等の体液や組織等、食品や食品からの抽出物、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物細胞の細胞培養液等、医療機器等の洗浄液等が挙げられる。検体は、検出対象物から採取されたものであっても、採取した検体に通常行われる希釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。また、本実施形態の検出方法に用いる検体は、本実施形態の検出方法の実施時に採取または調製されたものであっても、予め採取又は調製され保存されたものであってもよい。
　本実施形態における検出方法において、標的分子１０としては、本実施形態の検出方法において検出の対象となる分子であって、本実施形態の検出方法により検出可能であれば特に制限はなく、例えば、タンパク質、核酸、脂質、ビタミン、多糖類、低分子化合物等が挙げられる。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。また、タンパク質としては、酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げられる。
　本実施形態における検出方法において、捕捉分子２０としては、検体中の標的分子１０と特異的に結合することができる分子であれば特に制限はなく、例えば、前記標的分子１０と特異的に結合する抗体若しくは抗体フラグメント、前記標的分子１０と特異的に結合するアプタマー等が挙げられる。前記抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも用いることができるが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、これらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質又は融合ペプチド等が挙げられる。
　前記抗体フラグメントとしては、ラクダ科動物抗体の重鎖可変領域抗体（以下、ＶＨＨ抗体とも称する）を用いることもできる。ＶＨＨ抗体は、重鎖可変領域のみで抗原と結合することができる。また、ＶＨＨ抗体は、タンデム化して用いることができ、タンデム化することにより、標的分子である抗原との結合親和性を向上させることができ、抗原以外の分子との非特異結合を軽減することができる。
　これらの抗体及び抗体フラグメントは、公知の方法により作製することができる。
　検体中の標的分子と特異的に結合するアプタマーとしては、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等の核酸アプタマーであっても、ペプチドアプタマーであってもよい。核酸アプタマーは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法、ＳＥＬＥＸ法等の公知の方法により作製することができる。また、核酸アプタマーは、２’－フッ化ピリミジンやＰＥＧ鎖等による分子修飾がされたものであってもよく、前記分子修飾により、核酸アプタマーの半減期を長くすることができる。
　本実施形態における検出方法において、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素としては、ＡＴＰを産生する反応を触媒することができる酵素であれば、特に制限はなく、例えば、ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（Ｐｙｒｕｖａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｉｋｉｎａｓｅ；以下、ＰＰＤＫとも称する）、アセチル－ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ－Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）、II型ポリリン酸キナーゼ等が挙げられるが、ＰＰＤＫが好ましい。
　ＰＰＤＫは、下記式に示すように、補因子としてのマグネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノ－ルピルビン酸及びピロリン酸（ＰＰｉ）に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸及びリン酸（Ｐｉ）を生じる反応を触媒し、その逆の反応も触媒する公知の酵素であり、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼともいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本実施形態における検出方法において、標識化結合分子３０としては、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子１０と結合する分子であれば特に制限はなく、例えば、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子１０と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマー等が挙げられる。標識化結合分子３０は、捕捉分子２０とは異なる部分で標的分子１０と結合してもよいし、捕捉分子２０と同一の部分で標的分子１０と結合してもよい。
　前記標識化結合分子３０における抗体、抗体フラグメント、及びアプタマーとしては、それぞれ前述した捕捉分子２０における抗体、抗体フラグメント、及びアプタマーが挙げられる。前記標識化結合分子３０と前記捕捉分子２０の組み合わせとしては、抗体同士であってもよく、抗体と抗体フラグメントの組み合わせ、抗体とアプタマーの組み合わせ、抗体フラグメントとアプタマーの組み合わせ等いずれであってもよい。
　前記標識化結合分子３０の標識化は、標的分子１０と結合する分子の官能基と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の官能基との間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等が挙げられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。
　リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等が挙げられる。この場合、ＮＨＳまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性～弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
　リンカーとしては、例えば、標的分子１０と結合する分子の官能基に反応する官能基と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の官能基に反応する官能基の両方の官能基を分子内に有するものが挙げられる。前記両方の官能基を分子内に有するものとしては、前記標的分子１０と結合する分子のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子が好ましい。その中でも、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基である分子が特に好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基が挙げられる。
　また、標的分子１０と結合する分子が、抗体、抗体フラグメント等のタンパク質である場合は、標的分子１０と結合する分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素とを、一つの融合タンパク質として製造することもできる。前記融合タンパク質において、標的分子１０と結合する分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素との間には数残基から数十残基のリンカーペプチドを挿入してもよい。また、前記融合タンパク質において、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素は、標的分子１０を結合する分子のＮ末側とＣ末側のいずれに融合させてもよい。
　工程（１）において、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる前に、予め、検体中のＡＴＰを除去することが好ましい。工程（１）において、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる前に、予め、検体中のＡＴＰを除去することにより、後述する工程（４）において、検体中に存在するＡＴＰにより、ＡＴＰが増幅し、擬陽性が発生することを抑制でき、正確に検体中の標的分子１０を検出することができる。
　前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる前に、予め、検体中のＡＴＰを除去する方法としては、検体中のＡＴＰを除去できる方法であれば、特に制限はないが、例えば、洗浄によりＡＴＰを除去する方法、アデノシンリン酸デアミナーゼ、アピラーゼ、ヘキソキナーゼ等のＡＴＰを分解する酵素を作用させることにより、ＡＴＰを分解除去する方法等が挙げられる。
［工程（２）］
　工程（２）は、工程（１）において、標的分子１０と結合しなかった標識化結合分子３０を除去する工程である。工程（１）において、標的分子と結合しなかった標識化結合分子３０を除去することにより、擬陽性の発生を抑制でき、正確に標的分子を検出することができる。また、工程（１）において、標的分子と結合しなかった標識化結合分子３０以外にも、標的分子１０以外の検体由来の成分も除去することができる。
　工程（２）において、標的分子と結合しなかった前記標識化結合分子３０を除去する方法としては、特に制限はなく、例えば、洗浄、遠心分離等が挙げられるが、洗浄が好ましい。例えば、捕捉分子・標的分子・標識化結合分子複合体が固定化されている不溶性担体を洗浄液を用いて洗浄する方法が挙げられる。洗浄液としては、ＰＢＳ、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等が挙げられる。前記界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
［工程（３）］
　工程（３）は、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質とを反応させＡＴＰを産生させる、ＡＴＰ産生工程である。
　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質としては、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素に応じて、適宜決定することができる。例えば、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＰＰＤＫである場合は、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸及びＡＭＰが挙げられる。前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、アセチル－ＣｏＡシンテターゼ（Ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）である場合は、ＡＭＰ、ピロリン酸及びアセチル－ＣｏＡが挙げられる。前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ－Ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）である場合は、アデノシン５’－ホスホスルフェート及びピロリン酸が挙げられる。前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素がII型ポリリン酸キナーゼである場合は、ＡＭＰ及びポリリン酸が挙げられる。なお、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素との反応は、使用する酵素に応じ、マグネシウムイオン等の補因子存在下で行う。
　ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素としてＰＰＤＫで標識した標識化結合分子を用いた場合は、前記工程（１）で生成した標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に、補因子としてのマグネシウムイオン存在下、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸（ＰＰｉ）及びＡＭＰを反応させることにより、ピルビン酸、リン酸（Ｐｉ）及びＡＴＰが産生する。この産生したＡＴＰを、次の工程（４）のＡＴＰ増幅工程に供する。
［工程（４）］
　工程（４）は、前記工程（３）で産生されたＡＴＰを増幅する、ＡＴＰ増幅工程である。ＡＴＰを増幅する方法としては、特に制限はないが、ＡＴＰを増幅する試薬を用いる方法が好ましい。ＡＴＰを増幅する試薬としては、ＡＴＰを増幅する酵素とその基質が挙げられる。ＡＴＰを増幅する酵素とその基質とを用いる場合は、ＡＴＰを増幅する試薬には、その酵素反応に必要な補因子を含む。ＡＴＰを増幅する酵素としては、例えば、アデニル酸キナーゼ（以下、ＡＫとも称する）とピルビン酸キナーゼ（以下、ＰＫとも称する）の組み合わせ、ＡＫとポリリン酸キナーゼの組み合わせ、ＡＫとクレアチンキナーゼの組み合わせ、ＡＫと酢酸キナーゼとの組み合わせ等が挙げられるが、ＡＫとＰＫの組み合わせが好ましい。
　ＡＴＰを増幅する酵素の基質及び補因子としては、ＡＴＰを増幅する酵素に応じて適宜決定することができる。例えば、ＡＴＰを増幅する酵素が、ＡＫとＰＫの組み合わせである場合は、ＡＴＰを増幅する酵素の基質としては、ＡＭＰ及びホスホエノールピルビン酸が挙げられ、補因子としてはマグネシウムイオンが挙げられる。ＡＴＰを増幅する酵素が、ＡＫとポリリン酸キナーゼの組み合わせである場合は、ＡＴＰを増幅する酵素の基質としては、ＡＭＰ及びポリリン酸が挙げられ、補因子としてはマグネシウムイオンが挙げられる。ＡＴＰを増幅する酵素が、ＡＫとクレアチニンキナーゼの組み合わせである場合は、ＡＴＰを増幅する酵素の基質としては、ＡＭＰ及びクレアチンリン酸が挙げられ、補因子としてはマグネシウムイオンが挙げられる。ＡＴＰを増幅する酵素が、ＡＫと酢酸キナーゼの組み合わせである場合は、ＡＴＰを増幅する酵素の基質としては、ＡＭＰ及びアセチルリン酸が挙げられ、補因子としてはマグネシウムイオンが挙げられる。
　ＡＫとＰＫの組み合わせを用いてＡＴＰを増幅する方法を、下記の反応式で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　ＡＫとＰＫとを用いるＡＴＰの増幅方法では、補因子としてのマグネシウムイオンの存在下、ＡＫを用いて、工程（３）で産生した１分子のＡＴＰと、１分子のＡＭＰとから、２分子のＡＤＰが産生する。次に、補因子としてのマグネシウムイオンの存在下、ＰＫを用いて、産生した２分子のＡＤＰと２分子のホスホエノールピルビン酸とから、２分子のピルビン酸と２分子のＡＴＰが産生する(第１サイクル)。第１サイクルで産生した２分子のＡＴＰを、再度上記ＡＫとＰＫとを用いる反応系により、４分子のＡＴＰを産生させる(第２サイクル)。このサイクルをｎ回繰り返すことにより、第ｎサイクルでは２ｎ倍にＡＴＰが増幅される。
　工程（４）は、前記工程（３）と同時に行ってもよい。工程（４）を工程（３）と同時に行う場合は、工程（３）において、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と、ＡＴＰを増幅する試薬とを添加することにより、ＡＴＰの産生とＡＴＰの増幅を同時に行うことができる。例えば、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素がＰＰＤＫであり、ＡＫとＰＫとを用いて、ＡＴＰを増幅させる場合、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸（ＰＰｉ）、ＡＭＰ、ＡＫ、ＰＫ及びマグネシウムイオンを添加することにより、ＡＴＰの産生と増幅とを同時に行うことができる。
［工程（５）］
　工程（５）は、前記工程（４）で増幅したＡＴＰを検出する、ＡＴＰ検出工程である。ＡＴＰを検出する方法としては、特に制限はないが、ＡＴＰを検出する試薬を用いる方法が好ましい。ＡＴＰを検出する試薬としては、ＡＴＰと反応して色素や発光を生じさせる酵素とその基質やＡＴＰと反応して過酸化水素を産生する酵素とその基質等が挙げられる。
　ＡＴＰを検出する試薬を用いる方法としては、ルシフェラーゼを用い、ＡＴＰと、Ｄ－ルシフェリンにより生成する発光を測定する方法、ＡＴＰを検出する酵素としてグルコキナーゼとアセテートキナーゼを併用して、ＡＴＰとグルコースとからグルコース－６－リン酸の生成する反応を増幅し、さらにグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジアホラーゼを組み合わせて目視可能な呈色反応を行う方法（特開２００３－２２５０９８）、ヘキソキナーゼとピルベートキナーゼとを併用して、ＡＴＰとＤ－グルコースとからグルコース６－リン酸の生成する反応を増幅し、１－メトキシ－５－フェナジンメチルサルフェート及びイソルミノールを使用した化学発光によって定量する方法（特開昭６４－２３９００）、ＡＴＰにヌクレオシドホスホリラーゼとキサンチンオキシダーゼを加え、反応で生じる過酸化水素を定量する方法（特開昭６３－１１８４８）、ＡＴＰにＡＴＰ分解酵素を作用させ、生じたリン酸とモリブデンとの反応により生じるモリブデン青を測定する方法（特開平４－３６０７００号等）、ＡＴＰに、ニコチン酸アミドモノヌクレオチドとアデニリルトランスフェラーゼを作用させ、生じたＮＡＤを、ＮＡＤを補酵素とする酸化還元反応系と、還元型ＮＡＤを補酵素とする補酵素サイクリング反応を行い定量する方法（特開昭５９－１６６０９９）等が挙げられるが、ルシフェラーゼを用い、ＡＴＰと、Ｄ－ルシフェリンにより生成する発光を測定する方法が好ましい。その他、ＡＴＰを検出する方法として、比色または蛍光を用いてＡＴＰ量を検出する市販のキット（例えば、ＡＴＰ　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いることもできる。
　ＡＴＰを検出する酵素としてルシフェラーゼを用い、工程（４）で増幅したＡＴＰと、Ｄ－ルシフェリンとにより発光が発生する反応式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　ルシフェラーゼとしては、例えば、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓなどのホタルやクリックビートルなどに由来する甲虫ルシフェラーゼ、甲虫ルシフェラーゼの組換え体、耐熱性及び／又は耐薬品性を付与した甲虫ルシフェラーゼの変異体、又は、ＡＴＰ、ルシフェリン、分子状酸素、及び補因子としてのマグネシウム若しくは他の任意の２価陽イオンと反応して発光を生成する任意のルシフェラーゼを使用することができる。また、ルシフェラーゼの基質としては、Ｄ－ルシフェリンの他に、アミノルシフェリンやＡｋａLｕｍｉｎｅ等のルシフェリンアナログを用いることもできる。
　工程（５）におけるＡＴＰの検出反応は、工程（３）におけるＡＴＰ産生反応、及び工程（４）におけるＡＴＰ増幅反応よりも、反応速度が遅いため、工程（５）は、工程（３）と工程（４）と同時に行ってもＡＴＰを検出することができる。工程（３）と工程（４）と工程（５）とを同時に行う場合は、工程（３）において、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質を添加すると同時に、ＡＴＰを増幅する試薬と、ＡＴＰを検出する試薬とを添加することにより、ＡＴＰの産生と増幅と検出とを同時に行うことができる。例えば、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素がＰＰＤＫであり、ＡＴＰの増幅にＡＫとＰＫとを用い、ルシフェラーゼでＡＴＰを検出する場合、工程（３）において、前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸、ＡＭＰ、ＡＫ、ＰＫ、Ｄ－ルシフェリン、ルシフェラーゼ及び補因子としてのマグネシウムイオンを添加することにより、ＡＴＰの産生と増幅と検出とを同時に行うことができる。
　検体の代わりに、既知濃度の標的分子を用いて、工程（１）から工程（５）を行うことにより、標的分子の濃度とＡＴＰ検出工程におけるシグナルとの関係を表す検量線を作成し、作成された検量線と、検体を用いて、工程（１）から工程（５）を行い、工程（５）で検出されたシグナルの測定値とから、検体中の標的分子の濃度を定量することができる。
　また、既知濃度の標的分子を用いて、工程（１）から工程（５）を行い、ＡＴＰの検出工程におけるシグナル発生からのシグナル強度の経時変化を測定してシグナル強度の増加曲線を作成し、検体を用いて、工程（１）から工程（５）を行い、工程（５）におけるシグナル強度の増加曲線とのカーブフィッティングを行うことにより、検体中の標的分子の濃度を定量することもできる。
　本実施形態の標的分子の検出方法において、工程（１）及び工程（３）～工程（５）は水性媒体中で行うことが好ましい。前記水性媒体としては、例えば、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１～１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、トリス緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、標的分子の検出に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１～２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５～１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１～０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
　次に、本実施形態の標的分子の検出方法により標的分子を検出及び定量する操作手順について説明する。図２は、ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を分けて行う場合の標的分子の検出方法の操作手順の一例を示した図である。
　ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を分けて行う場合の標的分子の検出方法においては、まず、検体と標識化結合分子３０を混合し、得られた検体と標識化結合分子３０の混合物を捕捉抗体２０が固定化された不溶性担体４０上に添加する。その結果、不溶性担体４０上に固定化された捕捉抗体２０に、標的分子・標識化結合分子複合体が結合し、不溶性担体４０上に標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体が形成される。次に、不溶性担体４０を、洗浄液を用いて洗浄し、標的分子１０と結合しなかった標識化結合分子３０を除去する。洗浄が不十分である場合は、洗浄を繰り返す。洗浄が十分であるかは、例えば、洗浄液に標的分子１０に結合しなかった標識化結合分子３０が存在するか否かによって判断することができる。洗浄液に標識化結合分子３０が存在しなくなれば、洗浄が十分であると判断することができる。
　洗浄が十分であれば、次に、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と、ＡＴＰを増幅する試薬と、ＡＴＰを検出する酵素と、必要に応じ、前記酵素の補因子とを含む酵素反応液（以下、酵素反応液１とも称する）を不溶性担体４０に添加し、標識化結合分子３０に標識されているＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素により産生したＡＴＰを、ＡＴＰを増幅する試薬により増幅させる。ＡＴＰ産生反応及びＡＴＰ増幅反応に十分な時間が経過した場合は、ＡＴＰ検出工程に進む。ＡＴＰ産生反応及びＡＴＰ増幅反応に十分な時間が経過せずに、ＡＴＰの増幅量が不十分である場合は、反応時間を延長する。ＡＴＰの増幅量が十分であるか否かは、増幅したＡＴＰを検出できるか否かで判断することができる。
　ＡＴＰの産生反応及び増幅反応時間が十分であり、検出するのに十分な量のＡＴＰが増幅された場合は、ＡＴＰを検出するための基質（以下、酵素反応液２とも称する）を添加し、発生するシグナルを測定する。例えば、発生するシグナルが発光であれば、発光シグナル強度を測定する。発生するシグナル強度が一定の閾値を超えた場合は、検体中に標的分子１０が含まれていると判定することができる。発生するシグナル強度が一定の閾値を超えない場合は、検体中に標的分子１０が含まれていないと判定することができる。検体に標的分子１０が含まれていると判定するシグナル強度の閾値は、検出の目的や検出感度等により適宜設定することができる。
　図３は、ＡＴＰの増幅工程と検出工程を同時に行う場合の標的分子の検出方法の操作手順の一例を示す図である。
　ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を同時に行う場合の標的分子の検出方法においては、不溶性担体４０を、洗浄液を用いて洗浄し、標的分子１０と結合しなかった標識化結合分子３０を除去する工程までは、前記ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を分けて行う場合と同じである。ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を同時に行う場合は、不溶性担体４０の洗浄後、酵素反応液１と酵素反応液２とを不溶性担体４０に添加し、標識化結合分子３０に標識されているＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素により産生したＡＴＰを増幅させる反応と同時に増幅したＡＴＰを検出する反応を行う。反応に十分な時間が経過した場合は、反応で発生したシグナルを測定する。反応に十分な時間が経過せずに、ＡＴＰの検出量が不十分である場合は、反応時間を延長する。反応時間が十分であるか否かは、反応で発生したシグナルの強度で判断することができる。
　反応時間が十分であり、シグナルが発生する場合は、シグナル強度を測定する。発生するシグナル強度が一定の閾値を超えた場合は、検体中に標的分子１０が含まれていると判定することができる。発生するシグナル強度が一定の閾値を超えない場合は、検体中に標的分子１０が含まれていないと判定することができる。
　図４は、ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を同時に行う場合の標的分子の定量方法の操作手順の一例を示す図である。
　ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程とを同時に行う場合の標的分子の定量方法においては、不溶性担体４０を、洗浄液を用いて洗浄し、標的分子１０と結合しなかった標識化結合分子３０を除去する工程までは、前記ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を分けて行う標的分子の検出方法の場合と同じである。ＡＴＰの増幅工程とＡＴＰの検出工程を同時に行う標的分子の定量方法の場合は、不溶性担体４０の洗浄後、酵素反応液１と酵素反応液２とを不溶性担体４０に添加し、標識化結合分子３０に標識されているＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素により産生したＡＴＰを増幅させると同時に増幅したＡＴＰを検出する反応を行い、ＡＴＰ検出反応で発生したシグナルの強度のシグナル発生開始時間からの経時変化を測定する。反応に十分な時間が経過せずに、シグナル強度が定量に不十分である場合は、反応時間を延長する。
　反応時間が十分であり、シグナル強度が定量に十分である場合は、予め、既知濃度の標的分子を用いて同様にシグナルを発生させて作成しておいた、シグナル強度の経時変化データとのフィッティングを行い、検体中に含まれる標的分子の量を算出する。
　次に、本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィの具体例について説明する。本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィは、ＥＬＩＳＡ法で広く用いられている装置を用いることができる。
　図５Ａに、本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィの構成例の側面図を示す。図５Ｂに、本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィの構成例の上面図を示す。本実施形態の標的分子の検出方法を用いたイムノクロマトグラフィは、検体添加部５０、第１試薬収容部５１、第２試薬収容部５２、流路５３、混合／反応部５４、検出部５５及び廃液収容部５６から構成されている。第１試薬収容部５１には、標識化結合分子３０（以下、試薬１とも称する）が収容されている。第２試薬収容部５２には、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬及びＡＴＰを検出する酵素（以下、試薬２とも称する）が収容されている。混合／反応部５４には、捕捉分子２０が固定化された不溶性担体４０が収容されている。なお、混合／反応部５４は、検出部５５を兼ねることもできる。
　まず、検体は、ピペット等を用いて検体添加部５０に添加され、流路５３に送液される。検体の送液は、機械を用いた自動送液を用いることもできる。自動送液は、例えば、ポンプやローラーで弾性容器に外から力を加えて送液を行うカートリッジを使用して行うこともできる。図５Ａ、図５Ｂでは、ローラー５７を用いた送液の例を示している。
　次に、第１試薬収容部５１に収容されている試薬１がローラー５７により流路５３に送液され、検体と混合され、標的分子・標識化結合分子複合体が形成され、混合／反応部５４に供給される。混合／反応部５４に供給された標的分子・標識化結合分子複合体は、混合／反応部５４に収容されている不溶性担体４０に固定化されている捕捉分子２０に捕捉され、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体が不溶性担体４０上に形成される。
　次いで、混合／反応部５４を洗浄液で洗浄した後、第２試薬収容部５２に収容されている試薬２がローラー５７により流路５３を通じて混合／反応部５４に送液され、混合／反応部５４に収容されている不溶性担体４０上に固定化されている標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に添加され、ＡＴＰが産生し、増幅される。次に、混合／反応部５４にＡＴＰを検出する基質を添加すると、増幅したＡＴＰとＡＴＰを検出する酵素とＡＴＰを検出する酵素の基質とが反応しシグナルが発生する。発生したシグナルは、検出部５５でシグナルに応じた検出器により測定される。前記検出器としては、プレートリーダー、ルミノメーター、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＭＯＳ、感光素材（写真フィルム、インスタントフィルム、印画紙等）等を挙げることができる。シグナル測定後の反応液や洗浄液は、廃液収容部５６に収容され、廃棄される。
　次に、ローラーで弾性容器に外から力をかけて送液を行うカートリッジを用いて、標的分子１０としてウィルス、標識化結合物質３０としてＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体、捕捉抗体２０としてＤＮＡアプタマー、不溶性担体４０としてシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ＡＴＰを増幅する酵素としてＡＫとＰＫの組み合わせ、ＡＴＰを検出する酵素としてルシフェラーゼ、ＡＴＰを検出する基質としてＤ－ルシフェリンをそれぞれ用いたイムノクロマトグラフィの構成例と動作の一例を、図６を用いて説明する。
（１）検体添加
　検体が検体添加部５０からカートリッジに添加される。図６では、検体としてウィルスを含む唾液を例として示している。
（２）ウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体複合体の形成
　検体と、第１試薬収容部５１に収容されているＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体（試薬１）がローラー５７により送液され、検体とＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体とが混合される。ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体は検体中のウィルスと複合体を形成する。
（３）ＤＮＡアプタマーのウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体複合体の捕捉
　ウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体複合体は、不溶性担体４０に固定化された捕捉分子２０であるＤＮＡアプタマーに捕捉され、ウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体・ＤＮＡアプタマー複合体が形成される。
（４）洗浄
　ローラー５７で洗浄液収容部５８に収容されている洗浄液を送液し、混合／反応部５４に収容されているＣＯＰ上に形成されているウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体・ＤＮＡアプタマー複合体を洗浄する。洗浄は複数回行う。この洗浄により、検体中のＡＴＰやウィルスと結合しなかったＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体が除去される。
（５）試薬２の添加
　第２試薬収容部５２に収容されているホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸（ＰＰｉ）、ＡＭＰ、ＡＫ、ＰＫ及びルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を含む試薬２をローラー５７で混合／反応部５４に送液する。
（６）ＡＴＰの産生と増幅
　試薬２とＣＯＰ上に形成されているウィルス・ＰＰＤＫ標識化ＶＨＨ抗体・ＤＮＡアプタマーとが反応し、ＡＴＰの産生とＡＴＰの増幅が生じる。反応が十分に進むまで静置する。
（７）ＡＴＰを検出する酵素の基質の添加
　混合／反応部５４にＡＴＰを検出する酵素であるルシフェラーゼの基質であるＤ－ルシフェリンを添加する。Ｄ－ルシフェリンを添加すると、試薬２中のルシフェラーゼと、増幅したＡＴＰと、Ｄ－ルシフェリンが反応し、発光シグナルが発生する。
（８）発光シグナルの検出
　（７）で発生した発光シグナルを光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、ＣＭＯＳ等の検出器を用いて測定する。発光シグナルが予め設定した閾値より高い場合、検体（唾液）中にウィルスが存在すると判定することができる。発光シグナルが予め設定した閾値より低い場合、検体（唾液）中にウィルスが存在しないと判定される。
　次に、本実施形態の標的分子を検出するキットについて説明する。
　本実施形態の標的分子を検出するキットは、本実施形態の標的分子を検出する方法に用いられるキットであって、捕捉分子、標識化結合分子、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬、及びＡＴＰを検出する試薬を含む。
　本実施形態の標的分子を検出するキットにおける、捕捉分子、標識化結合分子、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬、及びＡＴＰを検出する試薬としては、それぞれ前述の本実施形態の標的分子を検出する方法で挙げられた、捕捉分子、標識化結合分子、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬、及びＡＴＰを検出する試薬が挙げられる。
　本実施形態のキットは、本実施形態の標的分子を検出する方法によって、標的分子を検出するために必要な試薬及び装置をさらに含んでいてもよい。
　本実施形態のキットは、捕捉分子、標識化結合分子、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬、及びＡＴＰを検出する試薬の他、基板等の不溶性担体を含んでいてもよい。このようなキットの場合、基板等の不溶性担体４０に捕捉抗体２０を固定化する。捕捉抗体２０を固定化した不溶性担体４０を含むキットとしては、前記図５で示した、検体添加部５０、第１試薬収容部５１、第２試薬収容部５２、流路５３、混合／反応部５４、検出部５５及び廃液収容部５６から構成されているカートリッジ、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された標識化結合分子３０、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質、ＡＴＰを増幅する試薬、及びＡＴＰを検出する試薬を含むキットが挙げられる。第１試薬収容部５１には、標識化結合分子３０（試薬１）を収容することができる。第２試薬収容部５２には、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と、ＡＴＰを増幅する試薬と、ＡＴＰを検出する酵素とを含む試薬（試薬２）を収容することができる。混合／反応部５４には、捕捉分子２０が固定化された不溶性担体４０が収容されている。なお、第１試薬収容部５１、第２試薬収容部５２には、それぞれ試薬１、試薬２を予め、収容しておいてもよい。
　このようなキットの場合、検体は、ピペット等を用いて検体添加部５０に添加され、流路５３に送液される。送液は、機械を用いた自動送液を用いることもできる。自動送液は、例えば、ポンプやローラーで弾性容器に外から力を加えて送液を行うこともできる。
　本実施形態のキットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、プレートリーダーやルミノメーター等の検出器、製品説明書等を含んでいてもよい。
　次に、本実施形態のキットの使用方法の一例について説明する。
　まず、第１試薬収容部５１に収容されている試薬１をローラー５７により流路５３に送液し、検体と混合して、標的分子・標識化結合分子複合体を形成し、混合／反応部５４に供給する。混合／反応部５４に供給された標的分子・標識化結合分子複合体は、混合／反応部５４に収容されている不溶性担体４０に固定化されている捕捉分子２０に捕捉され、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体が不溶性担体４０上に形成される。
　次いで、混合／反応部５４を洗浄液で洗浄した後、第２試薬収容部５２に収容されている試薬２をローラー５７により流路５３を通じて混合／反応部５４に送液する。次に、混合／反応部５４に収容されている不溶性担体４０上に形成されている標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体に試薬２を添加し、ＡＴＰを産生し、増幅する。次に、混合／反応部５４にＡＴＰを検出する基質を添加し、増幅したＡＴＰとＡＴＰを検出する酵素とＡＴＰを検出する酵素の基質とを反応させシグナルを発生させる。発生したシグナルを、検出部５５でシグナルに応じた検出器により測定する。前記検出器としては、プレートリーダーやルミノメーター等を挙げることができる。シグナル測定後の反応液や洗浄液は、廃液収容部５６に収容し、廃棄する。
　本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、免疫測定方法により検体に含まれる標的分子を検出する方法及びキットに対し、広く適用することができる。
　以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
（実施例１）
　ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素を単独で使用した場合と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素とＡＴＰを増幅する試薬とを組み合わせて使用した場合のシグナル強度を比較した。ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素としては、ＰＰＤＫを用いた。ＡＴＰを増幅する酵素としては、ＡＫ及びＰＫを用いた。ＡＴＰを検出する試薬としては、甲虫ルシフェラーゼと、その基質を用いた。以下に本実施例で用いた試薬を示す。
・ピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）
・アデニル酸キナーゼ（ＡＫ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、Ｓｉｇｍａ社製）
・甲虫ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ＡＭＰ（富士フィルム和光純薬社製）
・ピロリン酸（ＰＰｉ、富士フィルム和光純薬社製）
・Ｄ－ルシフェリン（富士フィルム和光純薬社製）
・ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ、富士フィルム和光純薬社製）
・ＡＴＰ（富士フィルム和光純薬社製）
・ＭｇＣｌ２（富士フィルム和光純薬社製）
　次に、これらの試薬を以下の表１に示す最終濃度となるようにＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、サンプル番号１～７のサンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　各サンプルは９６ウェルプレート（パーキンエルマー社製）の各ウェル内において、それぞれ５０μｌになるように調製した（Ｎ＝４）。サンプル調製後、ＡＴＰ産生反応およびＡＴＰ増幅反応を進行させるため、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後、最終濃度２ｍＭとなるようにＤ－ルシフェリンを添加し、各サンプルの発光強度を、マルチモードプレートリーダーＥｎｖｉｓｉｏｎ（パーキンエルマー社製）を用いて測定した。発光強度の測定は、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１秒間の発光量（ｃｏｕｎｔ　ｐｅｒ　ｓｅｃ；ｃｐｓ）を測定する方法で行った。その結果を図７に示す。
　図７に示すように、ＰＰＤＫを単独で用い、ＡＫとＰＫを用いたＡＴＰ増幅反応を行わなかった場合のサンプル番号４およびサンプル番号５のサンプルの発光強度の平均値は、それぞれ１５２５２０、２８４１０であった。それに対して、ＰＰＤＫに、ＡＫとＰＫを用いたＡＴＰ増幅反応を組み合わせて用いた場合のサンプル番号１およびサンプル番号２のサンプルの発光強度の平均値は、それぞれ４９５２９４５、３４５１５９８であった。サンプル番号１のサンプルは、サンプル番号４のサンプルの３２．５倍、サンプル番号２のサンプルは、サンプル番号５のサンプルの１２１．５倍の発光強度を示しており、ＰＰＤＫがより低濃度の条件において、ＡＴＰ産生反応とＡＴＰ増幅反応との組み合わせがシグナル増強に有利に働くことが示された。
　以上のことから、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素を単独で使用する方法と比較して、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素とＡＴＰを増幅する試薬とを組み合わせて使用する本発明の方法が、ＡＴＰの検出において顕著な効果を有することが示された。さらに、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素であるＰＰＤＫの量が少ない場合にシグナル増強の効率が高まるため、標的分子に結合する標識化結合分子の量が少ない場合、即ち、標的分子が少ない場合であっても、本発明の標的分子の検出方法は、標的分子を検出できると考えられる。
（実施例２）
　ＰＰＤＫで標識した抗ＢＳＡ－ラクダ科動物抗体の重鎖可変領域抗体（以下、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とも称する）を用いて、ＢＳＡの検出を行い、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用した場合と、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて使用した場合のシグナル強度を比較した。ＡＴＰを増幅する酵素としてはＡＫ及びＰＫを用いた。ＢＳＡの検出する試薬としては、甲虫ルシフェラーゼと、その基質を用いた。以下に本実施例で用いた試薬を示す。
・ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体（ＲｅＰＨＡＧＥＮ社製）
・ビオチン標識抗ＢＳＡ抗体（ＩＴＥＡ社製）
・アデニル酸キナーゼ（ＡＫ、ニプロ社製）
・ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、ニプロ社製）
・甲虫ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ、Ｓｉｇｍａ社製）
・ＡＭＰ（富士フィルム和光純薬社製）
・ピロリン酸（ＰＰｉ、富士フィルム和光純薬社製）
・Ｄ－ルシフェリン（富士フィルム和光純薬社製）
・ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ、富士フィルム和光純薬社製）
・ＭｇＣｌ２（富士フィルム和光純薬社製）
　上記の試薬を用いて、以下の手順でＢＳＡを検出した。
（１）プレートの準備
　Ｎｕｎｃ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ　Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　Ｆ９６　Ｂｌａｃｋプレート（Ｔｈｅｒｍｏ社製）をプレートウォッシャーＷｅｌｌｗａｓｈ　Ｖｅｒｓａ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて、３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に、１μｇ／ｍｌに調製したビオチン標識抗ＢＳＡ抗体を各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。各ウェル内のビオチン標識抗ＢＳＡ抗体溶液を除去した後、プレートウォッシャーを用いて、３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。
（２）サンプルの添加
　１μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液を各ウェルに５０μｌずつ添加し（Ｎ＝３）、室温で１時間インキュベートした。また、ＰＢＳ（コントロール）も同様に各ウェルに５０μｌずつ（Ｎ＝３）添加した。各ウェルからＢＳＡ溶液又はＰＢＳを除去した後、各ウェルを３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。次に、ＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈したＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体溶液を各ウェルに５０μｌずつ添加し、室温で１時間インキュベートした。各ウェルからＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体溶液を除去した後、プレートウォッシャーを用いて、各ウェルを３００μｌのＰＢＳで４回洗浄した。
（３）シグナル検出
　各ウェルに終濃度１０μｇ／ｍｌに調製したＡＫを５μｌずつ添加した後、終濃度１０μｇ／ｍｌに調製したＰＫ酵素液を１０μｌずつ添加した。次に、各ウェルにＰＢＳを１０μｌずつ添加した後、試薬Ａ（１ｍＭ　ＰＰｉ、１ｍＭ　ＰＥＰ、１ｍＭ　ＡＭＰ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含むＰＢＳ）を８連ピペッターで２５μｌずつ添加した。
　上記で得られた９６ウェルプレートをルミノメーターＧｌｏＭＡＸ　ｎａｖｉｇａｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にセットし、１５分間静置した。各ウェルに試薬Ｂ（５μｇ／ｍｌ　Ｌｕｃ、２００μＭ　Ｄ－ルシフェリンを含むＰＢＳ）をルミノメーターのポンプで５０μｌずつ添加し、添加後すぐに各サンプルの発光強度を測定した。発光強度の測定は、９６ウェルプレートの各ウェル当たり１秒間の発光量（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃｏｎｄ；ｃｐｓ）を測定する方法で行った。測定結果を図８に示す。
　図８に示したように、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用した場合の発光強度は、平均で１２２６ｃｐｓであり、ＡＴＰの増幅を行わなかった場合のネガティブコントロールの発光強度である１１８７ｃｐｓと比較して、差はわずかであった。一方、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて使用した場合の発光強度は１９２９０ｃｐｓとなり、ＡＴＰの増幅を行った場合のネガティブコントロールの発光強度である３４０９ｃｐｓと比較して、発光強度は大きく増幅された。ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて使用した場合と、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用した場合とについて、ＡＴＰの増幅を行った場合のネガティブコントロールの発光強度と、ＡＴＰの増幅を行わなかった場合のネガティブコントロールの発光強度とをバックグラウンドとしてそれぞれ減算した発光強度のグラフを図９に示す。
　図９に示したように、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体を単独で使用し、ＡＴＰの増幅を行わなかった場合と比較して、ＰＰＤＫ標識抗ＢＳＡ－ＶＨＨ抗体とＡＴＰを増幅する試薬を組み合わせて、ＡＴＰの増幅を行った場合は、発光強度が大きく増加することが分かった。以上のことから、本発明の方法が、サンプル中に含まれる標的分子の検出において顕著な効果を有することが示された。標的分子が少なく、ＡＴＰ産生酵素で標識された抗体を単独で用いた場合ではシグナル検出が困難な場合であっても、本発明の標的分子の検出方法は、シグナルを増幅することで標的分子を検出できると考えられる。
　１０　　標的分子
　２０　　捕捉分子
　３０　　標識化結合分子
　４０　　不溶性担体
　５０　　検体添加部
　５１　　第１試薬収容部
　５２　　第２試薬収容部
　５３　　流路
　５４　　混合／反応部
　５５　　検出部
　５６　　廃液収容部
　５７　　ローラー
　５８　　洗浄液収容部

Claims (23)

  1. 　工程（１）：検体中の標的分子と、前記標的分子と結合する捕捉分子と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子とを反応させ、前記標的分子と前記標識化結合分子と前記捕捉分子とからなる複合体（以下、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と称する）を形成させる、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体形成工程と、
    　工程（２）：前記工程（１）において、標的分子と結合しなかった前記標識化結合分子を除去する工程と、
    　工程（３）：前記標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体と、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質とを反応させＡＴＰを産生させる、ＡＴＰ産生工程と、
    　工程（４）：前記工程（３）で産生されたＡＴＰを増幅する、ＡＴＰ増幅工程と、
    　工程（５）：前記工程（４）で増幅したＡＴＰを検出する、ＡＴＰ検出工程と、
    を含む、検体中の標的分子の検出方法。
  2. 　前記工程（１）において、標的分子・標識化結合分子・捕捉分子複合体を形成させる前に、予め、検体中のＡＴＰを除去する工程を含む、請求項１に記載の検出方法。
  3. 　前記捕捉分子が、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、請求項１又は２に記載の検出方法。
  4. 　前記標識化結合分子が、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の検出方法。
  5. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸及びＡＭＰである、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  6. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、アセチル－ＣｏＡシンテターゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ、ピロリン酸、及びアセチル－ＣｏＡである、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  7. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、アデノシン５’－ホスホスルフェート及びピロリン酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、II型ポリリン酸キナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ及びポリリン酸である、請求項１～４のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼとピルビン酸キナーゼとを用いることにより行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  10. 　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼとポリリン酸キナーゼとを用いることにより行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  11. 　前記工程（４）において、ＡＴＰの増幅を、アデニル酸キナーゼと酢酸キナーゼとを用いることにより行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の検出方法。
  12. 　前記工程（５）において、ＡＴＰの検出を、ルシフェラーゼを用いることにより行う、請求項１～１１のいずれか一項に記載の検出方法。
  13. 　標的分子と結合する捕捉分子が固定化された不溶性担体と、
    　ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、前記標的分子と結合する標識化結合分子と、
    　ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質と、
    　ＡＴＰを増幅する試薬と、
    　ＡＴＰを検出する試薬と、
    を含む、検体中の標的分子検出キット。
  14. 　前記捕捉分子が、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、請求項１３に記載の検出キット。
  15. 　前記標識化結合分子が、ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素で標識された、標的分子と特異的に結合する、抗体若しくは抗体フラグメント、又はアプタマーである、請求項１３又は１４に記載の検出キット。
  16. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ピルビン酸リン酸ジキナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ホスホエノールピルビン酸、ピロリン酸及びＡＭＰである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の検出キット。
  17. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、アセチル－ＣｏＡシンテターゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ、ピロリン酸及びアセチル－ＣｏＡである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の検出キット。
  18. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、アデノシン５’－ホスホスルフェート及びピロリン酸である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の検出キット。
  19. 　前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素が、II型ポリリン酸キナーゼであって、前記ＡＴＰを産生する反応を触媒する酵素の基質が、ＡＭＰ及びポリリン酸である、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の検出キット。
  20. 　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及びピルビン酸キナーゼである、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の検出キット。
  21. 　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、ポリリン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及びポリリン酸キナーゼである、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の検出キット。
  22. 　前記ＡＴＰを増幅する試薬が、ＡＭＰ、アセチルリン酸、マグネシウムイオン、アデニル酸キナーゼ及び酢酸キナーゼである、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の検出キット。
  23. 　前記ＡＴＰを検出する試薬が、Ｄ－ルシフェリン及びルシフェラーゼである、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の検出キット。
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