JPH03167474A - 免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業トの利用分野〕 本発明は、生化学，医化学，微生物王’％　＋分子生物
学の分野におけろ，ペプチド，フホ白（σ，ホルモン，
トキシン靜の生体関連物質の免疫・゛ｌ：的ｉｌ＋ｑ定
法に関する． 〔従来の技術〕 従来の免疫学的な手法を用いた生体物質の検出法につい
ては、アナリティ力ル　バイオケミストリ−　１　７　
１　，　　２　７　１’Ｌ’ｒ（１　９　８　８）　（
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌロｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　　
１　　７　　１　　，　　２　　７　　１　　（　　１
　　９　　８　　８　）　　）　　あるいはジャーナル
　オブ　イムノロジカル　メソツズ　８３．８９頁（　
１　９　８　５　）　　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　８　３．　
８　９　（１　９　８　５）において論じられている。

これらの方法は，まず抗体を固定化したイムノプレート
やガラス片などの担体に試料溶液を添加し，試料溶液中
の測定対象物質を担体上の抗体に特異的に結合させる。

結合しない物質を洗い流した後、酵素標識抗体を添加し
、担体上の抗体を結合した測定対象物質に酵）＋１標識
抗体を結合させる。過剰の酵素標識抗体を洗浄した後に
酵素の基質を用いて担体上の酵素活性を測定することで
目的とする物質を検出する。

この方法は目的とする測定対象物質の検出に酵素を標識
した抗体を用いるため，酵素免疫測定法あるいはエンザ
イムイムノアツセイと呼ばれている．アナリテイカル　
パイオケミストリ−１７１，２７１頁（１　９　８　８
）では、イノーガニック　ピロホスファターゼ（ＥＣ．
３．６．１．１）を標識した抗体を用いて、ａ−フエト
プロテインやヒトＩｇＧを測定した例が記載されている
。イノーガニツク　ピロホストファターゼ活性は、ピロ
燐酸より生成した焦機燐酸をモリブデン酸とマラカイ１
−グリーンで発色させることにより釧定していろ。

また、ジャーナル　オブ　イｌ＼ノロジカル　メソッズ
、８３，８９　（１９８５）では、アルカリホスファタ
ーゼを標識した抗体を用いてヒト甲状腺刺激ホルモンを
測定した例が記載されている。

ここではアルカリホスファターゼの作用により，ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドりん酸（ＮＡＤＰ◆）
より生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤＰ）を用いてアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｔ！
：Ｃ１．１．１．１）とジアホラーゼ（ＥＣ１．６．４
．３）の酵素サイクルを駒動させている。ＮＡＤ＋はア
ルコールデヒドロゲナーゼにより還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ　）に還元
される。Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨがジアホラーゼによりＮＡＤ＋
にもどる時に，テトラゾリウム塩からホルマザン色素を
合成する。

生成したホルマザン色素を測定することにより、目的と
する測定対象物質の量を測定している。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は，抗体等を標識した酵素の検出において
、酵素の触媒作川を用いて基質から色素等を生成し，あ
るいは、基質から生成した物質をさらに他の色素におき
かえて、その吸光度や栄光を測定するが、これらの従来
技術には以下の問題＋−＋＋があ＝）た。

（１）従来技術では、酵素標識物質の非特異的吸着が代
くおさえられていれば，酵素の反応時間を長くすること
で、より低濃度の物質が測定できる。しかし、たとえば
、測定下限を１／１０にシヨうとすると反応時間を最低
でも１０倍にしなければならず、酵素の反応時間が非常
に長くなるという問題があった。これは、従来技術では
、酵素はＪＩＬに基質から色索等を生成させる触媒とし
て使用されるためである．言いかえると、栽質を大過剰
景用いて酵素の回転数が最大となる条件で反応を行わせ
ても、色素等の生或物の飛は反応時間に比例して増加す
るだけであるからである。

（２）＃素の検出は、酵素の作用によりノ１（質から生
成した物質の吸光度や栄光強度を測定することによる。

よって基質自体が大きな吸光係数を持ったり強い惧光を
発する物質はＪ＆質として使用できない。たとえば、フ
ルオレツセインやスルホローダミンｌｏｔやエチジウｌ
１ブロマイドなどの倣光色素は，それ自体が弾い−Ｌ１
′（光を持つので酵素の基質として使用することはでき
ない。

本発明の第１の１１的は、低濃度の物ｒａｔを尖川的な
時間内に検出できる免疫学的検出法を提供することにあ
る。

本発明の第２の１１的は，−ヒ記第ｌの１１的を述成す
るために，フルオレツセインやスルホローダミン１０１
やエチジウムブロマイドなど、従来酵素の活性４１リ定
には使用が難しかったが、弾いＳｔ光を発する色崇を用
いることのできる酵銅の倹出法を導入した免疫学的測定
法を提伏することにある。

〔課題を解決するための手段〕

ヒ記第１の目的は、抗体等の標識物質にＤＮＡあるいは
ｌ）　Ｎ　Ａボリメラーゼを用いて，Ｉ）ＮＡを変性さ
せ一本鎖とする工糊，一本鎖ＤＮＡとオリゴヌクレオチ
ドを相補的に結合させる工糊’．　ＤＮＡポリメラーゼ
によりＤＮＡを合成する工程を導入し、さらにこれらの
工程を繰り返しＤＮＡを増幅させることにより達成され
る． ］−．記第２の目的は、上記第１の目的の達成法におい
てフルオレツセイン算の色素を結合したオリゴヌクレオ
チドを用いることにより、色素を導入したＤＮＡを合成
し，これを測定することで達威される。ここで，未反応
の色素結合オリゴヌクレオチドは電気泳動や限外濾過あ
るいはクロマトグニフイー゛により取り除くことができ
る。また、上記第２の目的は，上記第１の目的の達成法
において増幅したＤＮＡをエチジウムブロマイド等のＤ
ＮＡ用染料を用いて染色することにより達成される。

上記第１の目的を達成する方法においては、必らずしも
合成したＤＮＡを検出しなくてもよく，ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いてＤＮＡを合成する時に生成するピロ燐酸を
定量してもよい．ここで特に留意しなければならない点
は、ＤＮＡポリメラーゼを用いた反応は通常７０℃前後
の不Ｉｉ温で行なわれることである。このためＤＮＡの
増輔中に、ｐＮＡポリメラーゼの基質であるＡＴＰやＧ
　Ｔ　Ｉ）むどは、わずかながら熱分解を受け、非酵素
的にピロ燐酸を生成してしまう点である。従って、Ｉ）
　Ｎ　Ａの増幅を行なった後に、まずピロ燐酸を取り除
き，再度低温でＤＮＡ合成反応を行わせて生成させたピ
ロ燐酸を８１リ定する必要がある。

ピロ燐酸の定量法としては、たとえば、ｄＡＴＰなどを
除いた後にアデノシン　５′−ホスホスルフエート（Ａ
　Ｐ　Ｓ　：　Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ５　’　　−ｐｈｏ
ｓｐｈｏｓｕｌｆａｔｅ）の存花下でＡＰＳスルフリラ
ーゼ（ＡＰＳｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）を反応させてピ
ロ燐酸をアデノシン５′−３燐酸（ＡＴＰ）に変換する
。生成したＡＴＰに０２とルシフエリンの存在下でルシ
フエラーゼを作用させると、アデノシン５’　−１＠酸
とＣ　Ｏ　ｚとピロ燐酸を生或すると同時に発光する。

この発光強度を８１’Ｊ定することによりピロ燐酸の情
を知ることができる。

〔作用〕

担体上に固定化した被測定物質に対してＤＮＡをｒ識し
た抗体等を反応させた後、未反応のＤＮＡ標識抗体を洗
浄して除くと、被測定物費の量に応じた量のＤＮＡ標識
抗体が担体上に残る．過剰量のオリゴヌクレオチドの井
存下で加熱してＤＮＡを解離させて一本鎖とする。次に
温度を下げると，一本鎖になったＤＮＡとオリゴヌクレ
オチドが再結合する。この時ＤＮＡポリメラーゼが存在
するとオリゴヌクレオチドを基点として一本鎖ＤＮＡと
相補的なＤＮＡが合成される。

ＤＮＡを一本鎖に解離させる温度と、オリゴヌクレオチ
ドが再結合する温度と．ＤＮＡポリメラーゼが働く温度
はそれぞれ異なる．よってＤＮＡポリメラーゼが耐熱性
であれば温度を上下させるだけでＤＮＡの解離、オリゴ
ヌクレオチドの結合、ＤＮＡの合成のサイクルをくり返
すことができる。

１　１ｒ＋ｌのサイクルで、２本鎖のＤＮＡそれぞれに
対応する相補鎖が１本ずつ合成される。よって、理想的
には１間のサイクルでＤＮＡの量は２倍になる。サイク
ルをくり返せば、ＤＮＡの量は級数的に増加する。増幅
されたＤＮＡの景は抗体を標識しているＤＮＡに依存し
、抗体をｅ３識していたＤＮＡは担体上に捕捉された被
測定物質の量に依存している。よって、増幅されたＤＮ
Ａの量を知ることができれば、もとの被測定物質の量を
知ることができる。

抗体の捕識にＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について
説明する。｛り休上に固定化した被測定物質に対しＤＮ
Ａポリメラーゼを標識した抗体が結合する。ＤＮＡとオ
リゴヌクレオチドを加え，ＤＮＡの解離、１本鎖ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドの結合、ＤＮＡの合成のサイクル
をくり返すと、Ｉ）　Ｎ　Ａの量が増加する。ここでは
、ＤＮＡポリメラーゼの量に比べ、ＤＮＡやオリゴヌク
レオチトが過剰量存在する条件下で反応が進行する。こ
のため、１同のサイクルで合成されるＩ）　Ｎ　Ａの星
は一定飛となる。増輔されたＬ）ＮＡの飛は抗体を橿識
しているＤＮＡポリメラーゼの量に依存し，ＤＮＡポリ
メラーゼは担体上に捕捉された被？１１１１定物質の量
に依存する。よって、増幅されたＤＮＡの量を知ること
ができれば、もとの被測定物質の歌を知ることができる
。

増幅したＤＮＡを検出する方法としては、たとえば電流
泳動により未反応のオリゴヌクレオチドを除いた後，エ
チジウムブロマイドのようなＤＮＡの栄光染料を用いて
染色し、栄光強度を測定することにより可能である。あ
るいは、栄光色素を結合したオリゴヌクレオチドを用い
てＤＮＡを合威すれば，増幅したＤＮＡに蛍光を持たす
ことができる。未反応のｉｌ’ｔ光色素を結合したオリ
ゴヌクレオチドを除去した後、蛍光強度を洲定すること
により、ＤＮＡの量、すなわち被測定物質の量を知るこ
とができる。蛍光色素を結合したオリゴヌクレオチドは
合成されたＤＮＡに比べ、低分子量であるため、電気泳
動や限外ろ過あるいはプロパノール抽出やクロマトグラ
フイーにより簡単に取り除くことができる． 合威したＤＮＡを検出する代りに、ＤＮＡを合成する時
に生或するピロ燐酸を定量しても被測定物質の量を知る
ことができる．ＤＮＡポリメラーゼの作用により、ＤＮ
Ａを合成する時には、ＤＮＡの塩基が１個結合するとピ
ロ燐ＭＬ個が放出される。よって，合成サイクルをくり
返して増幅したＤＮＡから一度ピロ燐酸を除いた後に，
再度低温でＤＮＡポリメラーゼを作用させると．ＤＮＡ
の鼠に応じたピロ燐酸が生成する。よってピロ燐酸の斌
を知ることができれば合成されたＤＮＡの景がわかるの
で、被測定物質の螢を知ることができる。

〔実施例〕

以下本発明の実施例を説明する。

実施例Ｉ ＤＮＡをｇＲした抗体を用いて，ＤＮＡを増中１１１す
ることで被測定物質が検出できることを確認した。被測
定物質としては１０”Ｍの濃度のヒトα−フエトプロテ
インを用いた。ここでは検出にシンチレーションカウン
ターを使用できるように、アイソトープラベルしたオリ
ゴヌクレオチドを用いた． まず測定に使用する材料について説明する。

（１）担体： 本実施例の抗体としては，抗ヒトα−フエトプロテイン
抗体を固定化したガラスビーズを用いた。以下にその調
製方法を示す。

直径２ｎｙｎで表面が粗面状のガラスビーズを３−（２
−アミノエチルアミノプロピル）一トリメトキシシラン
で処理し、表面にアミノ基を導入した。グルタルアルデ
ヒドを反応させ、アミノｊ＆を介してアモデヒド基を導
入した。抗体を反応させた後、未反応のアルデヒド基を
エタノールアミンで不活性化した。５　０　ｍ　ｇ　７
ｍｏｎ牛血清アルブミンと０．０１％エチル水銀サリチ
ル酸ナトリウムを含む０　．　１　５　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｃ
　Ｑ　　と５０ｍＭ燐酸からなるＰ｝｛７．４　の緩衝
液（以下ＰＢＳと言う）中で保存した。

（２）オリゴヌクレオチド： ヒトミトコンドリアＤＮＡに相補的に結合する２０塩基
よりなる以下の構造の２神類のオリゴヌクレオチドを、
ホスホアミダイド法で合威した。

１　：　５　’　　−ＡＴＧＣＴＡＡＧＴＴＡＧＣＴＴ
ＴＡＣＡＧ−　３　’ｎ　：　５　’　　−ＡＣＡＧＴ
ＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＣ−　３　’（３）ＤＮ
Ａ： ヒトミトコンドリアＤＮＡ出来で、 ５′−＾ＣＡＧＴＴＴＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＧＴＣ−と
−ＣＴＧＴＡＡＡ（ｉｃＴＡＡｃＴＴＡＧｃＡＴ　　３
　’の構造ではさまれる部分とその相補鎖で，１２１塩
基対よりなるフラグメントを用いた。

（４）ＤＮＡポリメラーゼ： ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ （５）アイソトープラベルしたオリゴヌクレオチド：“
モレキュラークローニング：ア　ラボラトリーマニュア
ル”　　（１９８２）ｐｌ２２　　コールドスプリング
ハーバーラボラトリー，コールドスプリングハーバー，
ニューヨーク （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）Ｐ１２２
　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＩｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌｌａｒｂｏｒ
，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．）記載のマニアテイスら（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ）の方法に従い、５′末端
に、８２ｐを導入した前記のオリゴヌクレオチド！、及
び，■を得た。

（６）ＤＮＡを標識した抗ヒトα−フエトプロテイン抗
体： 以下に調製法を示す。

常法に従い，ホスホアミダイド法を用いて前記オリゴヌ
クレオチドを合成した。反応の最終段においてアミノリ
ン７２（アプライド　バイオシステムズ製）を用いて，
オリゴヌクレオチドの５′末端に燐酸エステルの型でア
ミノへキシル基を導入した。アミノへキシル化したオリ
ゴヌクレオチドは、セファデックスＧＩＯカラムを用い
たゲル濾過で精製した。次に二価反応性試薬である．Ｎ
−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブロ
ピオン酸を反応させた。未反応の二価反応性試薬はセフ
ァデツクス６１０カラムを用いて除き，ピリジルジチオ
基を導入したオリゴヌクレオチドを得た．抗ヒ１−α−
フエトプロテイン抗体に２倍モルのＮ　−スクシンイミ
ジル−３−（２−ビリジルジチオ）プロピオン酸を反応
させた後，ジチオスレイトールで還元することでスルフ
イドＪ．（を導入した。

セファデツクス０２５カラムを用いてスルフイド基を導
入した抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を稍製した。

上記方法により調製したピリジルジチオＪｉｔ＋を導入
したオリゴヌクレオチドと，スルフイド基を導入した抗
ヒトα−フエトプロテイン抗体を、２：１のモル比で混
合し、室温で２４時間反応させた。セファデツクスＧ２
５を用いて未反応のオリゴヌクレオチドを除いた。以上
の操作でオリゴヌクレオチドが結合した抗ヒトα−フエ
トプロテイン抗体を得た。

オリゴヌクレオチドは前記した２神類のいずれでもよい
。

次に、オリゴヌクレオチドが結合した抗体に、ヒトミト
コンドリア山来の一本鎖ＤＮＡを相補的に結合させた。

次に、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノーフラグメント（１
０ユニット／　ｍ　Ｑ　）と各２００μＭのｄＴＴＰと
ｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＣＴＰの共存下で３０分間反応
させた．以上の操作でヒトミトコンドリア由来の１２１
塩基対よりなるＤＮＡフラグメントを結合した抗ヒトα
−フエトプロテイン抗体を得た。最後にセフアクリルＳ
−３００カラムを用いたゲル濾過で、ＤＮＡを標識した
抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を精製した。

次に、抗体を標識しているＤＮＡを増幅することでヒト
α−フエトプロテインが測定できることを以下の実験に
もとづいて示す。ここでは、ＤＮＡの増幅反応の同数に
対して、得られる信号強度がどのように変化するかを示
した。

抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を固定化したガラスビ
ーズ１個を容器にとり、１０−”Ｍのヒトα−フエトプ
ロテインを含む溶液１００μ悲を加え．３０分間撹拌し
た．１０ｍｇ／ｍＱ牛血清アルブミンを含むＩ）　Ｂ　
Ｓで洗浄した後、上記手法により調製したＤＮＡｅＡ識
抗ヒトα−フエトプロテイン抗体（抗体濃度として１０
ｎＭ）１００μ氾を加え，３時間撹拌した。１　０　ｍ
　ｇ　／　ｍＱ牛血清アルブミンを含むＰ　１３　Ｓ、
続いて，５０ｍＭＫＣＱと１　．　５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ
　Ｃ　（Ａ　ｚを含むＰＨ８．３の１　０　ｍ　Ｍ　ト
リス塩酸緩衝液で洗浄した。

以上の操作でガラスビーズ上に捕捉したヒトα一フエト
プロテインに対し、ＤＮＡ５識抗ヒトα一フエトプロテ
イン抗体を結合させた。

次に、ＤＮＡの増輔を行なった。２補類のアイソトープ
ラベルしたオリゴヌクレオチド（１μＭ）と各２００μ
Ｍの濃度（７）ｄＡ’ｌ’Ｐ，ｄ’ＦＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄｃＴＰと２．５ユニッ１・のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを含むＤＮＡ合成用緩衝液１００μ悲を加えた。ここ
で、上記ＤＮＡ合成川緩衝液とは５　０　ｍ　ＭのＫＣ
Ｑと１　．　５　ｍ　ＭのＭ　ｇ　Ｃ　Ｑ　ｘと０．０
１％ゼラチンを含むｐｌＩ８．３の１０ｍＭｈリス塩酸
緩衝液のことである。

次に以下の反応サイクルを１〜３４同くり返した。

（１）９４℃にｌ分間保ち、Ｉ）　Ｎ　Ａを一本鎖にす
る。

（２）５５℃に２分間保ち，一本鎖ＤＮＡにオリゴヌク
レオチドを相補的に結合させる。

（３）７２℃で２分間保ち、ＤＮＡを合威させる。

反応液をｌＯ％ポリアクリルアミドゲル電気ｂ動じた。

増幅したＤＮＡバンドの部分を含むゲノ１を切り出し、
液体シンチレーションカウンターズ１１２ｐ山来の放射
活性をａ＋リ定した。

第１図は反応サイクルの同数により放射活性乃どのよう
に変化するかを示すｉｌｌ！Ｉ定曲線である。

その結果、反応ｌ１１１数がｌＯ同から２６同の範９＋
では、反応同数をｌ同増すごとに得られる比放牟活性は
１．６　倍になることがわがった。このことは、反応を
ｎ同くり返すと、ＤＮＡの量が１．６倍に増幅されてい
ることを示している。これは、１［１１の合成反応で得
られたＤＮＡが、次の合成頬応の鋳型として使川される
ことにより、連鎖反応的に反応が進行するためである。

１回のＤＮＡ合成反応は、温度の上下に必要な時間を含
めて約１０分間である。よって１ｏ分間ごとにＤＮＡの
量は１．６倍となる。

ところで従来の免疫的測定法では、酵素やアイソトープ
を直接標識した抗体を検出に用いる．酵索の反応では、
反応成生物の量は時間に比例して増加する。アイソトー
プラベルした抗体を用いる場合も同じで，放射活性の測
定時間に比例してカウント数が多くなる。いずれの場合
も，得られる信号強度は時間に比例して大きくなるだけ
である。

本発明では，反応成生物が連鎖反応的に増えるようなＤ
ＮＡ合成反応を用いるため、従来の方法に比べてより少
ない物質を短時間で検出できる効果がある。たとえば、
ベルオキシダーゼを標識した抗体と、Ｈ　２　０　ｚと
ｐ−ヒドロキシフエニルブロピオン酸を基質として用い
て、蛍光をＫｌ’Ｊ定する従来法では、ＩＱ−１２〜Ｉ
　Ｑ−１”Ｍのヒトα−フェトプロテイン（試料液量１
００μＱ）が検出下限であった。また、この結果は、１
３１　Ｉ　　を標識した抗体を用いてもほとんど同じ結
果であった。

本発明を用いれば．ＤＮＡ合成反応を２０〜３０同くり
返すことにより１０−”Ｍ　のヒトαーフエトプロテイ
ン（試料液量１００μｋ〉を余裕をもって検出できるの
で、従来法より十分高感度な方法である。

本実施例においては，抗体にＤＮＡを標識する方法とし
て、まず、オリゴヌクレオチドを抗体に結合させ，ＤＮ
Ａポリメラーゼ！クレノーフラグメントを用いて抗体上
にＤＮＡを合成する方法を採用した。この他に、一方の
鎖の５′末端にアミノへキシル基を導入したＤＮＡを合
威し、これを上記実施例の方法にしたがって抗体に結合
させた物でも同様の結果が得られた。

また、ＤＮＡを標識した抗体の代りに，オリゴヌクレオ
チドを標識した抗体を用いても以下の手法を用いること
で上記実施例と同様の結果が得られた。

まずガラスビーズ上に捕捉したヒトα−フェトプロテイ
ンにオリゴヌクレチオド標識抗ヒトα−フエトプロテイ
ン抗体を反応させる６次に，オリゴヌクレチオドに相補
的に一本鎖ＤＮＡを加え、４５℃で，５分間放賀する．
未反応のＤＮＡを洗浄により除く。以上の方法で抗体に
標識したオリゴヌクレオチドにＤＮＡが結合する。以後
は、上記実施例と同様に、オリゴヌクレオチドとＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼを加えてＤＮＡ増幅反応をくり返す
． 上記実施例では抗体のＪｌ３織物にＤＮＡを用いている
が．’ｌ”ａｑＤＮＡポリメラーゼをＪｆ３１ｆｉシた
抗ヒトな−フエトプロテイン抗体を用いてＤＮＡ増幅反
応を行わせても，ヒトα−フエトプロテインを検出でき
た。しかし．ＤＮＡ標識抗体を使用した場合と異なり，
ＤＮＡ増幅反応のｆｆ１］数を重ねるにつれてＤＮＡの
増幅串は低下した。

Ｅ記実施例では、ＤＮＡ増幅反応でＤＮＡに取り込まれ
た放射活性をｉ４１１１定することで，抗ヒトα−フエ
トプロテインを検出しているが，ＤＮＡを合成する時に
生じるビロ燐酸をＢ＋ｑ定しても同様な結果が得られた
。

実施例２ 栄光色素標識したオリゴヌクレオチドを用いて，増幅し
たＤＮＡに取り込まれた色素を訓定することでヒトα−
フエトプロテインを検出した。まず測定に使用する材料
について説明する。

（１）　ＪＩ．ｊ体： 抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を固定化したガラスビ
ーズを実施例１と同様にして用意した。

（２）オリゴヌクレオチド： 実施例１と同一の２柿類を作成した。

（３）ＤＮＡ： 実施例１と同一のものを使用した。

（４）ＤＮＡポリメラーゼ： ”ｌ’　ａ　ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（５）色素を
標識したオリゴヌクレオチド二色素としてフルオレツセ
インを川いた．調製方法を以下に示す。

実施例１の方法に従い５′末端にアミノへキシル基を導
入した２種類のオリゴヌクレオチドを得た．ｐＨ８．５
　　において１０倍モルのフルオレツセインイソチオシ
アナートを加え，室温で６時間反応させた。未反応のフ
ルオレツセインイソチオシアナートやその分解物をセフ
ァデツクス０２５カラムを用いて除いた．以上の方法で
フルオレツセイン標識したオリゴヌクレオチドを・得た
。

次に，ヒトα−フエトプロテインの測定法を示す。本実
施例では、各挿濃度のヒトα−フォトプロテインに対し
てどのような栄光強度が得られるかを８１り定した。

まず抗ヒトα−フエトプロテイン抗体を固定化したガラ
スビーズ１個を容器にとり、Ｏ　−１０’ｌ”Ｍのヒ１
・α−フエトプロテインを含む溶液↓ＯＯμ氾を加え、
３０分間撹拌した。１　０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑ牛血冫
青アルブミンを含むＰＢＳで洗浄した後、実施例１の方
法で調製したＤＮＡｅＡ識ヒトα−フエトプロテイン抗
体（抗体濃度として１０ｎＭ）１００ｕｌ２を加え，３
時間撹拌した．１０ｍｇ／ｍＱ牛血清アルブミンを含む
ＰＢＳ、続いて５０ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｃ　Ｉ２と１．５ｍＭ
　ＭｇＣＱｚを含むｐＨ８．３の１　０　ｍ　Ｍ　ｈリ
ス塩酸緩衝液で洗浄した。

以上の操作でガラスビーズ上に捕捉したヒトα一フエト
プロテインに対し、ＤＮＡ標識抗ヒトα−フエトプロテ
イン抗体を結合させた。

次に，ＤＮＡの増幅を行なった。すなわち、２稚類のフ
ルオレツセイン標識したオリゴヌクレオチド（１μＭ）
と各２００μＭの濃度のｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ
，ｄＣＴＰと２．５ユニットのＴ　ａ　ｑ　Ｄ　Ｎ　Ａ
ポリメラーゼを含むＤＮＡ合成用緩衝液を１００μ氾加
えた。

次に以下の反応サイクルを３０回くり返した．（１）９
４℃に１分間保ち、ＤＮＡを一本鎖にする．（２）５５
℃に２分間保ち，１本鎖ＤＮＡにオリゴヌクレオチドを
相補的に結合させる． （３）７２℃に２分間保ち，ＤＮＡを合成する．反応液
を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し
た。増幅したＤＮＡバンドの部分に４８８ｎｍのアルゴ
ンレーザ光を当て、出てくる５２０ｎｍの蛍光を測定し
た。

第２図は、各濃度のヒトα−フエトプロテインに対して
得られた蛍光強度を示す。第２図より、フルオレツセイ
ン標識したオリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ増幅反応
を行うことで、感度よくヒトα−フエトプロテインを８
１リ定できることがわかった。

−Ｌ記実施例ではオリゴヌクレオチドを標識する色素に
フルオレツセインを用いたが、他に，４ーニトロベンゾ
−２−オキサー１，３−ジアゾール、２−オキサ１，３
−ジアゾール−４−２−スルホン酸、スルホローダミン
１０１等を導入しても同様の結果が得られた。

上記実施例ではフルオレッセインの結合したＤＮＡを合
威し，この栄光を測定したが、ＤＮＡを検出する方法と
しては、電気泳動により未反応のオリゴヌクレオチドを
除いた後、エチジウｌ１ブロマイド等の蛍光染料を用い
てＤＮＡを染色しても同様の結果が得られた． 〔発明の効果〕 本発明によれば、ＤＮＡの増幅反応を用いているために
、反応時間に対して得られる信号強度は級数的に増加す
る．また、フルオレッセインなど従来、Ｋｌ素の活性測
定には使用が難しかったが、モル分子吸光系数や栄光収
串の高い色素を用いることができるため、低濃度の物質
を短時間で測定できる効果がある。

【図面の簡単な説明】

第１ｒｇ４は本発明の一実施例におけるＤＮＡ合成反応
のくり返し同数に対し得られる信号値を示す測定同、第
２図は本発明の他の実施例のヒトα−第 図 反尺臼教

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、水に不溶性の担体に固定化したりガンドを介して、
   又は該担体に直接被測定物質を結合させる工程、該被測
   定物質に標識物を結合した抗体等の物質を結合させる工
   程、及び標識物を測定する工程を有する免疫学的測定法
   において、上記標識物がＤＮＡで、該ＤＮＡと該ＤＮＡ
   に相補的なオリゴヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼの
   共存下で、（１）ＤＮＡを変性せしめ一体鎖とする工程
   、（２）一本鎖ＤＮＡとオリゴヌクレオチドを相補的に
   結合せしめる工程、（３）ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
   ＮＡを合成する工程を設け、（１）から（３）の工程を
   繰り返すことにより該ＤＮＡを増幅せしめ、該増幅ＤＮ
   Ａを検出することを特徴とする免疫学的測定法。 ２、抗体等の標識物がオリゴヌクレオチドで、該オリゴ
   ヌクレオチドに相補的な１本鎖ＤＮＡを結合させ、さら
   にオリゴヌクレチオドとＤＮＡポリメラーゼを加えた後
   、請求項１の方法に従いＤＮＡを増幅せしめ、該増幅Ｄ
   ＮＡを検出することを特徴とする免疫学的測定法。 ３、抗体等の標識物がＤＮＡポリメラーゼで、オリゴヌ
   クレチオドとＤＮＡを加えた後、請求項１の方法に従い
   ＤＮＡを増幅せしめ、該増幅ＤＮＡを検出することを特
   徴とする免疫学的測定法。