JPH09275996A - 生体成分の測定法 - Google Patents
生体成分の測定法Info
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- JPH09275996A JPH09275996A JP9105496A JP9105496A JPH09275996A JP H09275996 A JPH09275996 A JP H09275996A JP 9105496 A JP9105496 A JP 9105496A JP 9105496 A JP9105496 A JP 9105496A JP H09275996 A JPH09275996 A JP H09275996A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ビオチン標識体と、アビジン、ストレプ
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体とをポリアニオンの存在下に反応さ
せ、得られた複合体をさらに光学的手段により検出する
生体成分の測定法。 【効果】 ノイズが少なく、解像度が高く、高感度に生
体成分を検出することができる。
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体とをポリアニオンの存在下に反応さ
せ、得られた複合体をさらに光学的手段により検出する
生体成分の測定法。 【効果】 ノイズが少なく、解像度が高く、高感度に生
体成分を検出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ビオチン標識体と
アビジン又はストレプトアビジンを反応させる際に生じ
る非特異的反応を抑制し、この非特異的反応によるノイ
ズが低減され、測定対象を高感度に検出することができ
る生体成分の測定法に関する。
アビジン又はストレプトアビジンを反応させる際に生じ
る非特異的反応を抑制し、この非特異的反応によるノイ
ズが低減され、測定対象を高感度に検出することができ
る生体成分の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学的な手法による特定遺伝子の
検出や塩基配列の決定は、遺伝的な疾患の病因解析や、
タンパク質の構造や機能解析に欠かせない基本技術であ
る。特に、遺伝子解析のための分析法としては、従来よ
り32Ｐや35Ｓといった放射性同位元素（以下、ＲＩと称
す）を使用する方法が主流を成してきた。しかし、ＲＩ
を使用する方法では、ＲＩによる作業者の健康に対する
影響や、取り扱う施設の限定などの問題があるため、近
年、ＲＩを使用しない方法が行われるようになってきて
いる。
検出や塩基配列の決定は、遺伝的な疾患の病因解析や、
タンパク質の構造や機能解析に欠かせない基本技術であ
る。特に、遺伝子解析のための分析法としては、従来よ
り32Ｐや35Ｓといった放射性同位元素（以下、ＲＩと称
す）を使用する方法が主流を成してきた。しかし、ＲＩ
を使用する方法では、ＲＩによる作業者の健康に対する
影響や、取り扱う施設の限定などの問題があるため、近
年、ＲＩを使用しない方法が行われるようになってきて
いる。
【０００３】このようにＲＩを使用せず、非ＲＩを使用
する方法の代表例は、ＤＮＡに標識したビオチンと、こ
れと特異的に結合するストレプトアビジンの反応を利用
したものである。この方法において、ストレプトアビジ
ンを予め特定の酵素、例えばアルカリ性フォスファター
ゼ（以下、ＡＬＰと称す）で標識しておき、目的に合わ
せた基質を用いて検出する方法が知られている。従来、
ＡＬＰ標識ストレプトアビジンと５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウ
ム系を組み合わせたものなどが汎用されていたが、最近
ではジオキセタンなどを基質として高い感度を有する化
学発光法に基づいたものも多用されている。また、発光
法には、化学発光法の他に生物発光法があり、例えばＡ
ＴＰの存在下、ルシフェリン−ホタルルシフェラーゼの
反応により発光させる方法などが行われている。
する方法の代表例は、ＤＮＡに標識したビオチンと、こ
れと特異的に結合するストレプトアビジンの反応を利用
したものである。この方法において、ストレプトアビジ
ンを予め特定の酵素、例えばアルカリ性フォスファター
ゼ（以下、ＡＬＰと称す）で標識しておき、目的に合わ
せた基質を用いて検出する方法が知られている。従来、
ＡＬＰ標識ストレプトアビジンと５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウ
ム系を組み合わせたものなどが汎用されていたが、最近
ではジオキセタンなどを基質として高い感度を有する化
学発光法に基づいたものも多用されている。また、発光
法には、化学発光法の他に生物発光法があり、例えばＡ
ＴＰの存在下、ルシフェリン−ホタルルシフェラーゼの
反応により発光させる方法などが行われている。
【０００４】これらの方法のうち、非ＲＩ標識を用いた
遺伝子測定法においては、ＤＮＡを直接ナイロンメンブ
レン等の固相に吸着あるいは転写するか、あるいは酵素
処理や熱処理などで前処理した後、直接あるいはビオチ
ンなどの標識剤で標識して電気泳動を行い、次にナイロ
ンメンブレン等の固相に吸着あるいは転写し、固定す
る。次に検出したいＤＮＡ断片を、これと特異的に結合
する標識プローブや、予め試料の標識に用いたビオチン
などと特異的に結合するストレプトアビジン−酵素複合
体などと反応させ、その後の発光反応などにより検出す
る。
遺伝子測定法においては、ＤＮＡを直接ナイロンメンブ
レン等の固相に吸着あるいは転写するか、あるいは酵素
処理や熱処理などで前処理した後、直接あるいはビオチ
ンなどの標識剤で標識して電気泳動を行い、次にナイロ
ンメンブレン等の固相に吸着あるいは転写し、固定す
る。次に検出したいＤＮＡ断片を、これと特異的に結合
する標識プローブや、予め試料の標識に用いたビオチン
などと特異的に結合するストレプトアビジン−酵素複合
体などと反応させ、その後の発光反応などにより検出す
る。
【０００５】そして、より正確な検出を行うためには、
非特異的な反応によるノイズを抑制する必要がある。す
なわち、このようなノイズは、固相化されたビオチン標
識体と特異的に結合するはずのストレプトアビジン等
が、非特異的に固相上に吸着するために生ずるものであ
り、このような非特異的な結合を防ぐためにブロッキン
グ操作が必要となる。
非特異的な反応によるノイズを抑制する必要がある。す
なわち、このようなノイズは、固相化されたビオチン標
識体と特異的に結合するはずのストレプトアビジン等
が、非特異的に固相上に吸着するために生ずるものであ
り、このような非特異的な結合を防ぐためにブロッキン
グ操作が必要となる。
【０００６】ＡＬＰ標識ストレプトアビジンに代表され
る化学発光による検出系においては、かかる問題はＡＬ
Ｐ標識ストレプトアビジンとビオチンの反応を行う前
に、ブロッキング剤としてスキムミルク、牛血清アルブ
ミン、カゼイン、ゼラチン、サケ***ＤＮＡ、ドデシル
硫酸ナトリウムなどを含有する緩衝液で、固相を所定時
間浸漬又は所定回洗浄することにより解決することがで
きる（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ，１９８３，４０４５−４０４９）。し
かしながら、生物発光による検出系においては、従来化
学発光による検出系で汎用されているブロッキング剤で
は、固相側のビオチンとストレプトアビジン−酵素複合
体による特異反応以外の非特異反応の抑制が困難であっ
たり、ドデシル硫酸ナトリウムのように発光系の反応を
妨害するものがあるなどの問題もあった。
る化学発光による検出系においては、かかる問題はＡＬ
Ｐ標識ストレプトアビジンとビオチンの反応を行う前
に、ブロッキング剤としてスキムミルク、牛血清アルブ
ミン、カゼイン、ゼラチン、サケ***ＤＮＡ、ドデシル
硫酸ナトリウムなどを含有する緩衝液で、固相を所定時
間浸漬又は所定回洗浄することにより解決することがで
きる（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ，１９８３，４０４５−４０４９）。し
かしながら、生物発光による検出系においては、従来化
学発光による検出系で汎用されているブロッキング剤で
は、固相側のビオチンとストレプトアビジン−酵素複合
体による特異反応以外の非特異反応の抑制が困難であっ
たり、ドデシル硫酸ナトリウムのように発光系の反応を
妨害するものがあるなどの問題もあった。
【０００７】さらに、従来行われている分析法のうち、
化学発光による方法は生物発光による方法より量子収率
が劣るという問題があり、また生物発光による検出で
は、ルシフェラーゼの熱安定性が悪く、かつ大量取得が
困難という問題があった。
化学発光による方法は生物発光による方法より量子収率
が劣るという問題があり、また生物発光による検出で
は、ルシフェラーゼの熱安定性が悪く、かつ大量取得が
困難という問題があった。
【０００８】近年、遺伝子組替え技術により、従来品に
比べ耐熱性の向上したルシフェラーゼが使用できるよう
になり、これと酢酸キナーゼによるＡＴＰ産生系を組み
合わせたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光系が開発さ
れたが、この発光系においても非特異反応によるノイズ
が大きく、塩基配列解析の解像度が低いなどの問題が認
められた。
比べ耐熱性の向上したルシフェラーゼが使用できるよう
になり、これと酢酸キナーゼによるＡＴＰ産生系を組み
合わせたルシフェリン−ルシフェラーゼ発光系が開発さ
れたが、この発光系においても非特異反応によるノイズ
が大きく、塩基配列解析の解像度が低いなどの問題が認
められた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ビオチン標識体とストレプトアビジン等を反応させ
る際に生じる非特異的反応を抑制し、非特異的反応によ
るノイズが少なく、測定対象を高感度に検出することが
できる生体成分の測定法を提供することにある。
は、ビオチン標識体とストレプトアビジン等を反応させ
る際に生じる非特異的反応を抑制し、非特異的反応によ
るノイズが少なく、測定対象を高感度に検出することが
できる生体成分の測定法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った結果、ビオチン標識体とス
トレプトアビジン等とを、ポリアニオンの存在下に反応
させれば、非特異的反応が抑制され、ノイズが低減さ
れ、測定対象を高感度に検出できることを見出し、本発
明を完成した。
発明者らは鋭意研究を行った結果、ビオチン標識体とス
トレプトアビジン等とを、ポリアニオンの存在下に反応
させれば、非特異的反応が抑制され、ノイズが低減さ
れ、測定対象を高感度に検出できることを見出し、本発
明を完成した。
【００１１】すなわち、本発明は、ビオチン標識体と、
アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素複合体
又はストレプトアビジン−酵素複合体とをポリアニオン
の存在下に反応させ、得られた複合体をさらに光学的手
段により検出することを特徴とする生体成分の測定法を
提供するものである。
アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素複合体
又はストレプトアビジン−酵素複合体とをポリアニオン
の存在下に反応させ、得られた複合体をさらに光学的手
段により検出することを特徴とする生体成分の測定法を
提供するものである。
【００１２】また、本発明は、ポリアニオンを含有する
ことを特徴とするビオチン標識体と、アビジン、ストレ
プトアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトア
ビジン−酵素複合体との特異的反応における非特異的反
応を抑制する液を提供するものである。
ことを特徴とするビオチン標識体と、アビジン、ストレ
プトアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトア
ビジン−酵素複合体との特異的反応における非特異的反
応を抑制する液を提供するものである。
【００１３】本発明において、測定対象となる生体成分
とは、核酸（遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ）をいう。
とは、核酸（遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ）をいう。
【００１４】なお、従来、ＲＩ標識を用いる測定におい
て、標識プローブが非特異的吸着をしないようにするた
め、標識プローブを固相上の測定対象物と反応させる前
段階で固相加熱処理液中に、ヘパリン等を添加する方法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９８４，５６２７−５６３８）が知られている。しかし
ながら、この方法において、非特異反応抑制のメカニズ
ムは、標識プローブとして用いる遺伝子断片に親和性を
有し、かつそれと複合体を形成して固相に非特異的に吸
着し易くする性質を有する試薬中の夾雑成分による影響
を、標識プローブを固相に加える前に予めヘパリンを加
えることにより取り除き、標識プローブとして用いる遺
伝子断片の固相への非特異吸着を抑制するというもので
ある。上述の原理は、検出を目的に用いた標識剤に対し
て特異的に結合するはずの酵素標識成分が、固相側に非
特異的に吸着することを抑制する本発明方法とは相違す
るものである。
て、標識プローブが非特異的吸着をしないようにするた
め、標識プローブを固相上の測定対象物と反応させる前
段階で固相加熱処理液中に、ヘパリン等を添加する方法
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１
９８４，５６２７−５６３８）が知られている。しかし
ながら、この方法において、非特異反応抑制のメカニズ
ムは、標識プローブとして用いる遺伝子断片に親和性を
有し、かつそれと複合体を形成して固相に非特異的に吸
着し易くする性質を有する試薬中の夾雑成分による影響
を、標識プローブを固相に加える前に予めヘパリンを加
えることにより取り除き、標識プローブとして用いる遺
伝子断片の固相への非特異吸着を抑制するというもので
ある。上述の原理は、検出を目的に用いた標識剤に対し
て特異的に結合するはずの酵素標識成分が、固相側に非
特異的に吸着することを抑制する本発明方法とは相違す
るものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明において、ビオチン標識体
としては、特に制限されないが、例えば目的とするＤＮ
Ａを通常の方法に従いＰＣＲ法等で増幅し、これにビオ
チンを標識し、固相に含有又は固定させたものを使用す
ることができる。ここで用いられる固相としては、特に
制限されないが、例えばナイロンメンブレン、ニトロセ
ルロースメンブレン、セルロースアセテートメンブレ
ン、ポリビニルピロリドンメンブレン等が挙げられる。
また、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビジン−
酵素複合体の酵素部分としては、例えばリン酸化酵素、
具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、クレア
チンキナーゼ等を用いることができる。
としては、特に制限されないが、例えば目的とするＤＮ
Ａを通常の方法に従いＰＣＲ法等で増幅し、これにビオ
チンを標識し、固相に含有又は固定させたものを使用す
ることができる。ここで用いられる固相としては、特に
制限されないが、例えばナイロンメンブレン、ニトロセ
ルロースメンブレン、セルロースアセテートメンブレ
ン、ポリビニルピロリドンメンブレン等が挙げられる。
また、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビジン−
酵素複合体の酵素部分としては、例えばリン酸化酵素、
具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、クレア
チンキナーゼ等を用いることができる。
【００１６】本発明においては、これらのビオチン標識
体と、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素
複合体又はストレプトアビジン−酵素複合体との反応
を、ポリアニオンの存在下に行う。ここで用いられるポ
リアニオンとしては、多価の陰性荷電を有するものであ
ればいずれでも良く、例えばヘパリン、デキストラン硫
酸、リンタングステン酸などが好ましい。これらのポリ
アニオンは、溶媒に溶解したブロッキング液として用い
られ、溶媒としては、一般にはリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等の緩衝液が用いられる。これ
らの緩衝液には、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カ
リウム等の塩や、界面活性剤等を添加することもでき
る。溶液中のポリアニオンの濃度は特に制限されない
が、一般的には１０-7〜１０重量％が好ましく、特に１
０-7〜５重量％が好ましい。また、ブロッキング液のpH
は５〜１０が好ましく、特にpH６〜９が好ましい。
体と、アビジン、ストレプトアビジン、アビジン−酵素
複合体又はストレプトアビジン−酵素複合体との反応
を、ポリアニオンの存在下に行う。ここで用いられるポ
リアニオンとしては、多価の陰性荷電を有するものであ
ればいずれでも良く、例えばヘパリン、デキストラン硫
酸、リンタングステン酸などが好ましい。これらのポリ
アニオンは、溶媒に溶解したブロッキング液として用い
られ、溶媒としては、一般にはリン酸緩衝液、トリス緩
衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等の緩衝液が用いられる。これ
らの緩衝液には、必要に応じて塩化ナトリウム、塩化カ
リウム等の塩や、界面活性剤等を添加することもでき
る。溶液中のポリアニオンの濃度は特に制限されない
が、一般的には１０-7〜１０重量％が好ましく、特に１
０-7〜５重量％が好ましい。また、ブロッキング液のpH
は５〜１０が好ましく、特にpH６〜９が好ましい。
【００１７】ブロッキング液には、本発明の効果を損わ
ない範囲において、ポリアニオン以外に、従来、固相と
検出系構成試薬との非特異反応を抑制するために非特異
反応抑制剤として使用されている公知の物質等を配合す
ることができる。かかる物質としては、例えば牛血清ア
ルブミン、カゼイン、スキムミルク等が挙げられる。こ
れらの成分の使用濃度も特に限定されるものではない
が、一般的には０．０５〜１０重量％が好ましい。
ない範囲において、ポリアニオン以外に、従来、固相と
検出系構成試薬との非特異反応を抑制するために非特異
反応抑制剤として使用されている公知の物質等を配合す
ることができる。かかる物質としては、例えば牛血清ア
ルブミン、カゼイン、スキムミルク等が挙げられる。こ
れらの成分の使用濃度も特に限定されるものではない
が、一般的には０．０５〜１０重量％が好ましい。
【００１８】ブロッキング操作は、例えばビオチン標識
体が固定された固相をブロッキング液に浸漬するか、又
はこれで洗浄することにより行われる。ブロッキング液
の使用量は固相が浸る量以上あればよく、浸漬処理時間
も特に制限はないが、一般には３０分〜１２０分が好ま
しい。また、洗浄回数も特に制限はないが、一般には２
〜５回が好ましい。
体が固定された固相をブロッキング液に浸漬するか、又
はこれで洗浄することにより行われる。ブロッキング液
の使用量は固相が浸る量以上あればよく、浸漬処理時間
も特に制限はないが、一般には３０分〜１２０分が好ま
しい。また、洗浄回数も特に制限はないが、一般には２
〜５回が好ましい。
【００１９】本発明においては、次に、固相化されたビ
オチン標識体とストレプトアビジン等との反応により得
られた複合体をさらに、光学的手段により検出する。光
学的手段による検出法としては、通常行われるものであ
れば特に制限されないが、量子収率が高い生物発光法が
好ましく、特に検出系のＡＴＰ又はＡＴＰ産生系により
産するＡＴＰを用いる生物発光法が好ましい。ＡＴＰ産
生系としてはどのような系でもよいが、例えばリン酸化
酵素、具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
クレアチンキナーゼ等を用いる系を使用することができ
る。ＡＴＰを用いる生物発光法としては、特に制限され
ないが、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系が好ましく、
通常の方法に従って検出を行えばよい。
オチン標識体とストレプトアビジン等との反応により得
られた複合体をさらに、光学的手段により検出する。光
学的手段による検出法としては、通常行われるものであ
れば特に制限されないが、量子収率が高い生物発光法が
好ましく、特に検出系のＡＴＰ又はＡＴＰ産生系により
産するＡＴＰを用いる生物発光法が好ましい。ＡＴＰ産
生系としてはどのような系でもよいが、例えばリン酸化
酵素、具体的には酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、
クレアチンキナーゼ等を用いる系を使用することができ
る。ＡＴＰを用いる生物発光法としては、特に制限され
ないが、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系が好ましく、
通常の方法に従って検出を行えばよい。
【００２０】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。
【００２１】実施例１ Ａ：試薬の調製 （１）ブロッキング液Ａの調製：カゼイン０．５％、ヘ
パリン０．０２％及び塩化カリウム０．４Ｍの濃度とな
るように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に混和、溶
解し、ブロッキング液Ａとした。 （２）洗浄液Ａの調製：塩化カリウム０．４Ｍ、ヘパリ
ン０．０２％及びＴｗｅｅｎ２０ ０．３％の濃度とな
るように、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（pH８）に溶解
し、洗浄液Ａとした。 （３）洗浄液Ｂの調製：０．１mMジチオスレイトール及
び０．１mM ＥＤＴＡの濃度となるように、０．０５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、洗浄液Ｂとし
た。 （４）固定液の調製：水酸化ナトリウム０．４Ｍの濃度
となるように、精製水に溶解し、固定液とした。 （５）ビオチン化酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン複
合体の調製：ビオチン化酢酸キナーゼ３．７×１０-9Ｍ
を含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）と、スト
レプトアビジン２．１×１０-8Ｍを含む０．０５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（pH７）を等量混合し、室温で３０分放
置して調製した。 （６）発光液の調製：ルシフェラーゼ０．７７mg／ml、
Ｄ−ルシフェリン０．３５mM、ＡＤＰ１２．５μＭ、ア
セチルリン酸２．５mM及び硫酸マグネシウム３０mMを、
５０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、発光液と
した。
パリン０．０２％及び塩化カリウム０．４Ｍの濃度とな
るように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に混和、溶
解し、ブロッキング液Ａとした。 （２）洗浄液Ａの調製：塩化カリウム０．４Ｍ、ヘパリ
ン０．０２％及びＴｗｅｅｎ２０ ０．３％の濃度とな
るように、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（pH８）に溶解
し、洗浄液Ａとした。 （３）洗浄液Ｂの調製：０．１mMジチオスレイトール及
び０．１mM ＥＤＴＡの濃度となるように、０．０５Ｍ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、洗浄液Ｂとし
た。 （４）固定液の調製：水酸化ナトリウム０．４Ｍの濃度
となるように、精製水に溶解し、固定液とした。 （５）ビオチン化酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン複
合体の調製：ビオチン化酢酸キナーゼ３．７×１０-9Ｍ
を含む０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）と、スト
レプトアビジン２．１×１０-8Ｍを含む０．０５Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液（pH７）を等量混合し、室温で３０分放
置して調製した。 （６）発光液の調製：ルシフェラーゼ０．７７mg／ml、
Ｄ−ルシフェリン０．３５mM、ＡＤＰ１２．５μＭ、ア
セチルリン酸２．５mM及び硫酸マグネシウム３０mMを、
５０mM ＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７）に溶解し、発光液と
した。
【００２２】Ｂ：ＤＮＡの検出 （１）ＤＮＡ抽出：大腸腺腫患者より正常大腸粘膜組織
を採取し、プロテアーゼＫ及びフェノールを用いる方法
により、高分子ＤＮＡを抽出した。 （２）目的遺伝子の増幅：大腸腺腫発生に関与するＡＰ
Ｃ遺伝子のうち変異の起こりやすい部位を含む領域をＰ
ＣＲ法により増幅した。 （３）ＤＮＡシークエンシング操作、電気泳動：ＰＣＲ
産物を鋳型ＤＮＡとしてビオチン化プライマーを用いて
サイクル・シークエンシングを行った。次に、サイクル
・シークエンシング産物を６％変性ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、泳動後、ナイロンメンブレンへ転写
した。 （４）固定化：ナイロンメンブレンを室温で２０分間固
定液に浸したのち、室温で１０分間乾燥させ固定化し
た。 （５）ブロッキング：ブロッキング液Ａにナイロンメン
ブレンを室温で３０分間浸し、ブロッキングを行った。 （６）ビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン
複合体の結合反応：ナイロンメンブレンを浸しているブ
ロッキング液１００mlに、ビオチン標識酢酸キナーゼ・
ストレプトアビジン複合体液２５０μｌを加える。室温
で３０分間反応させ、ナイロンメンブレン上のビオチン
とストレプトアビジンを結合させた。 （７）余剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトア
ビジン複合体の洗浄：ナイロンメンブレンを洗浄液に浸
し、過剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビ
ジン複合体を除去した。洗浄は洗浄液Ａで液を交換して
４回行った後、洗浄液Ｂで１回行った。各回とも室温、
１回当り５分間とした。 （８）発光反応：ナイロンメンブレン上の余分な洗浄液
を取り除いたあと、ナイロンメンブレンを発光液に浸し
た。次に余分な発光液を除き、暗所にてＸ線フィルムに
１５分露光後現像した。
を採取し、プロテアーゼＫ及びフェノールを用いる方法
により、高分子ＤＮＡを抽出した。 （２）目的遺伝子の増幅：大腸腺腫発生に関与するＡＰ
Ｃ遺伝子のうち変異の起こりやすい部位を含む領域をＰ
ＣＲ法により増幅した。 （３）ＤＮＡシークエンシング操作、電気泳動：ＰＣＲ
産物を鋳型ＤＮＡとしてビオチン化プライマーを用いて
サイクル・シークエンシングを行った。次に、サイクル
・シークエンシング産物を６％変性ポリアクリルアミド
ゲルで電気泳動し、泳動後、ナイロンメンブレンへ転写
した。 （４）固定化：ナイロンメンブレンを室温で２０分間固
定液に浸したのち、室温で１０分間乾燥させ固定化し
た。 （５）ブロッキング：ブロッキング液Ａにナイロンメン
ブレンを室温で３０分間浸し、ブロッキングを行った。 （６）ビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビジン
複合体の結合反応：ナイロンメンブレンを浸しているブ
ロッキング液１００mlに、ビオチン標識酢酸キナーゼ・
ストレプトアビジン複合体液２５０μｌを加える。室温
で３０分間反応させ、ナイロンメンブレン上のビオチン
とストレプトアビジンを結合させた。 （７）余剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトア
ビジン複合体の洗浄：ナイロンメンブレンを洗浄液に浸
し、過剰なビオチン標識酢酸キナーゼ・ストレプトアビ
ジン複合体を除去した。洗浄は洗浄液Ａで液を交換して
４回行った後、洗浄液Ｂで１回行った。各回とも室温、
１回当り５分間とした。 （８）発光反応：ナイロンメンブレン上の余分な洗浄液
を取り除いたあと、ナイロンメンブレンを発光液に浸し
た。次に余分な発光液を除き、暗所にてＸ線フィルムに
１５分露光後現像した。
【００２３】実施例２ （１）ブロッキング液Ｂの調製：カゼイン０．５％、デ
キストラン硫酸０．０１％及び塩化カリウム０．４Ｍの
濃度となるように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に
混和、溶解し、ブロッキング液Ｂとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液Ｂを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。
キストラン硫酸０．０１％及び塩化カリウム０．４Ｍの
濃度となるように、０．０５Ｍトリス緩衝液（pH８）に
混和、溶解し、ブロッキング液Ｂとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液Ｂを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。
【００２４】比較例１ （１）ブロッキング液ａの調製：カゼイン０．５％及び
塩化カリウム０．４Ｍの濃度となるように、０．０５Ｍ
トリス緩衝液（pH８）に混和、溶解し、ブロッキング液
ａとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液ａを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。
塩化カリウム０．４Ｍの濃度となるように、０．０５Ｍ
トリス緩衝液（pH８）に混和、溶解し、ブロッキング液
ａとした。 （２）ブロッキング液Ａの代わりにブロッキング液ａを
用いる以外は実施例１と同様にして、ＤＮＡの検出を行
った。
【００２５】試験例１ 実施例１、２及び比較例１で得られたＤＮＡ検出の結果
を比較した。すなわち、発光反応の結果より、分析に供
したＤＮＡの配列中、解析できた核酸の個数を求めた。
結果を表１に示す。
を比較した。すなわち、発光反応の結果より、分析に供
したＤＮＡの配列中、解析できた核酸の個数を求めた。
結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】 解析できた 核酸の数 実施例１（ブロッキング液Ａ：ヘパリン含有） ５０塩基 実施例２（ブロッキング液Ｂ：デキストラン硫酸含有） ５０塩基 比較例１（ブロッキング液ａ） ０塩基
【００２７】表１の結果より、比較例では何れも、非特
異反応によるノイズが認められ、結果として解像能の低
下を来しているのに対し、ポリアニオンを用いた本発明
の実施例では高い解像度を示し、本発明で用いるブロッ
キング液が、きわめて良好な非特異反応抑制効果を有す
ることが認められた。
異反応によるノイズが認められ、結果として解像能の低
下を来しているのに対し、ポリアニオンを用いた本発明
の実施例では高い解像度を示し、本発明で用いるブロッ
キング液が、きわめて良好な非特異反応抑制効果を有す
ることが認められた。
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、ビオチン標識体とスト
レプトアビジン−酵素複合体を反応させる際に生じる非
特異的反応が抑制され、この非特異的反応によるノイズ
が低減され、高い解像度が得られる。従って、放射性物
質を使用することなく、安全で高感度にしかも安価に生
体成分を検出することができる。
レプトアビジン−酵素複合体を反応させる際に生じる非
特異的反応が抑制され、この非特異的反応によるノイズ
が低減され、高い解像度が得られる。従って、放射性物
質を使用することなく、安全で高感度にしかも安価に生
体成分を検出することができる。
Claims (8)
- 【請求項１】 ビオチン標識体と、アビジン、ストレプ
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体とをポリアニオンの存在下に反応さ
せ、得られた複合体をさらに光学的手段により検出する
ことを特徴とする生体成分の測定法。 - 【請求項２】 ポリアニオンが、ヘパリン、デキストラ
ン硫酸又はリンタングステン酸である請求項１記載の測
定法。 - 【請求項３】 光学的手段による検出法が、検出系のＡ
ＴＰ又はＡＴＰ産生系により産するＡＴＰを用いる生物
発光法である請求項１又は２記載の測定法。 - 【請求項４】 ＡＴＰ産生系が、リン酸化酵素を用いる
ものである請求項３記載の測定法。 - 【請求項５】 リン酸化酵素が、酢酸キナーゼ、ピルビ
ン酸キナーゼ又はクレアチンキナーゼである請求項４記
載の測定法。 - 【請求項６】 ＡＴＰを用いる生物発光法が、ルシフェ
リン−ルシフェラーゼ系である請求項３記載の測定法。 - 【請求項７】 ポリアニオンを含有することを特徴とす
る固相化されたビオチン標識体と、アビジン、ストレプ
トアビジン、アビジン−酵素複合体又はストレプトアビ
ジン−酵素複合体との特異的反応における非特異的反応
を抑制する液。 - 【請求項８】 ポリアニオンが、ヘパリン、デキストラ
ン硫酸又はリンタングステン酸である請求項７記載の
液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9105496A JPH09275996A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | 生体成分の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9105496A JPH09275996A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | 生体成分の測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09275996A true JPH09275996A (ja) | 1997-10-28 |
Family
ID=14015800
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9105496A Pending JPH09275996A (ja) | 1996-04-12 | 1996-04-12 | 生体成分の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09275996A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013152247A (ja) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| CN116930513A (zh) * | 2023-09-19 | 2023-10-24 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种用于蛋白检测的无蛋白快速封闭液及其应用 |
-
1996
- 1996-04-12 JP JP9105496A patent/JPH09275996A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013152247A (ja) * | 2013-04-12 | 2013-08-08 | Abbott Japan Co Ltd | 非特異的相互作用抑制剤及びその診断測定系への応用 |
| CN116930513A (zh) * | 2023-09-19 | 2023-10-24 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种用于蛋白检测的无蛋白快速封闭液及其应用 |
| CN116930513B (zh) * | 2023-09-19 | 2023-11-17 | 北京索莱宝科技有限公司 | 一种用于蛋白检测的无蛋白快速封闭液及其应用 |
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|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20060711 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060911 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061017 |