JPH04360700A - Ａｔｐ測定用テスター - Google Patents
Ａｔｐ測定用テスターInfo
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- JPH04360700A JPH04360700A JP15506991A JP15506991A JPH04360700A JP H04360700 A JPH04360700 A JP H04360700A JP 15506991 A JP15506991 A JP 15506991A JP 15506991 A JP15506991 A JP 15506991A JP H04360700 A JPH04360700 A JP H04360700A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＡＴＰ濃度を測定する
ためのテスターに関し、より詳しくは簡単に作製でき、
簡便な測定が可能であり、その作製及びそれを用いた測
定におけるコストも低く、更に測定感度も良好なＡＴＰ
測定用テスターに関する。
ためのテスターに関し、より詳しくは簡単に作製でき、
簡便な測定が可能であり、その作製及びそれを用いた測
定におけるコストも低く、更に測定感度も良好なＡＴＰ
測定用テスターに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＡＴＰは高エネルギー化合物であり、多
くの生体エネルギー代謝に関与している。ＡＴＰ値は生
物活性の指標として利用できることから、ＡＴＰ濃度を
測定する方法は、生細胞数の測定や代謝変化の検出をは
じめ、食品の成熟度や腐敗度のチェックなどを含む食品
の品質の管理、水質浄化における水質のチェックなど種
々の分野における各種の測定方法に応用されている。
くの生体エネルギー代謝に関与している。ＡＴＰ値は生
物活性の指標として利用できることから、ＡＴＰ濃度を
測定する方法は、生細胞数の測定や代謝変化の検出をは
じめ、食品の成熟度や腐敗度のチェックなどを含む食品
の品質の管理、水質浄化における水質のチェックなど種
々の分野における各種の測定方法に応用されている。
【０００３】従来から、ＡＴＰ測定法としては、ルシフ
ェリン−ルシフェラーゼ系を利用した生物発光法が広く
用いられている。これは、ホタルの尾から抽出したルシ
フェラーゼとルシフェリンがＡＴＰ存在下で反応して発
する５６０〜５８０ｎｍの光をルミノメーターなどで測
定する方法である。
ェリン−ルシフェラーゼ系を利用した生物発光法が広く
用いられている。これは、ホタルの尾から抽出したルシ
フェラーゼとルシフェリンがＡＴＰ存在下で反応して発
する５６０〜５８０ｎｍの光をルミノメーターなどで測
定する方法である。
【０００４】また、別の方法として、イオン交換カラム
でＡＴＰを分離し、ＡＴＰに依存する２５０〜２６０ｎ
ｍでの紫外吸収を分光光度計などで検出する方法が挙げ
られる。更に、ＡＴＰにその分解酵素を作用させ、ＡＴ
Ｐの分解によって生じた無機リン酸をモリブデン酸と１
−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を用いて測
定するＡＴＰ試験紙も特開平１−１０１８９９号公報に
より知られている。
でＡＴＰを分離し、ＡＴＰに依存する２５０〜２６０ｎ
ｍでの紫外吸収を分光光度計などで検出する方法が挙げ
られる。更に、ＡＴＰにその分解酵素を作用させ、ＡＴ
Ｐの分解によって生じた無機リン酸をモリブデン酸と１
−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を用いて測
定するＡＴＰ試験紙も特開平１−１０１８９９号公報に
より知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系による生物発光を利用
をする方法、あるいはイオン交換カラムを用いた方法な
どの紫外吸収を測定する紫外吸収法では、検出器として
ルミノメーターや紫外分光光度計等の光学分析装置が必
要となるため、目視での判定が不可能である。したがっ
て、このような光学分析装置がないところでは測定がで
きない。しかも測定操作が複雑で、測定コスト自体も高
いという問題がある。特に、生物発光を利用する方法は
、試薬のルシフェラーゼが高価であるために測定コスト
が非常に高くなってしまう。また、ＡＴＰ分解酵素を用
いた試験紙では、無機リン酸の定量法としてモリブデン
酸と１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を用
いる方法を利用しているために、測定感度が低いという
難点を有している。
ルシフェリン−ルシフェラーゼ系による生物発光を利用
をする方法、あるいはイオン交換カラムを用いた方法な
どの紫外吸収を測定する紫外吸収法では、検出器として
ルミノメーターや紫外分光光度計等の光学分析装置が必
要となるため、目視での判定が不可能である。したがっ
て、このような光学分析装置がないところでは測定がで
きない。しかも測定操作が複雑で、測定コスト自体も高
いという問題がある。特に、生物発光を利用する方法は
、試薬のルシフェラーゼが高価であるために測定コスト
が非常に高くなってしまう。また、ＡＴＰ分解酵素を用
いた試験紙では、無機リン酸の定量法としてモリブデン
酸と１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を用
いる方法を利用しているために、測定感度が低いという
難点を有している。
【０００６】本発明の目的は、作製が容易であり、かつ
測定操作が簡易であり、更に作製及び測定コストが低い
ＡＴＰ測定用テスターを提供することにある。本発明の
他の目的は測定感度が良好なＡＴＰ測定用テスターを提
供することにある。
測定操作が簡易であり、更に作製及び測定コストが低い
ＡＴＰ測定用テスターを提供することにある。本発明の
他の目的は測定感度が良好なＡＴＰ測定用テスターを提
供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明のＡＴＰ測定用テ
スターは、測定用基材と、該測定用基材に固定化された
ＡＴＰ分解酵素、モリブデン酸及びアスコルビン酸を有
することを特徴とする。
スターは、測定用基材と、該測定用基材に固定化された
ＡＴＰ分解酵素、モリブデン酸及びアスコルビン酸を有
することを特徴とする。
【０００８】本発明のＡＴＰ測定用テスターで利用する
呈色反応は以下の反応原理に基ずくものである。
呈色反応は以下の反応原理に基ずくものである。
【０００９】ＡＴＰはアデノシントリフォスファターゼ
（ＡＴＰａｓｅ）で代表されるＡＴＰ分解酵素によりＡ
ＤＰとリン酸に分解される。この分解によって生成した
リン酸がモリブデン酸と反応するとリンモリブデン酸が
形成される。このリンモリブデン酸が更にアスコルビン
酸によって還元されるとモリブデンブルーに由来する青
色の呈色が生じる。この青色呈色の度合はＡＴＰの濃度
とほぼ比例関係にあるので、このことを利用して、ＡＴ
Ｐを簡便に測定することが可能となる。
（ＡＴＰａｓｅ）で代表されるＡＴＰ分解酵素によりＡ
ＤＰとリン酸に分解される。この分解によって生成した
リン酸がモリブデン酸と反応するとリンモリブデン酸が
形成される。このリンモリブデン酸が更にアスコルビン
酸によって還元されるとモリブデンブルーに由来する青
色の呈色が生じる。この青色呈色の度合はＡＴＰの濃度
とほぼ比例関係にあるので、このことを利用して、ＡＴ
Ｐを簡便に測定することが可能となる。
【００１０】なお、現在多数のリン酸の定量方法が知ら
れており、その大部分においてもモリブデンブルーの生
成反応が利用されており、それぞれの方法ごとに使用す
る緩衝液や還元剤の種類及び量がことなり、それに応じ
て測定感度も異なる。前述のモリブデン酸と１−アミノ
−２−ナフトール−４−スルホン酸を用いたリン酸定量
法も１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を還
元剤としてリンモリブデン酸を還元する過程を利用する
。この方法では、リン酸の検出限界がおよそサブミクロ
ンｍｏｌであるため、微量のリン酸を測定することは不
可能であり、結果としてこの反応を利用するＡＴＰ試験
紙の感度も低い。また、還元剤として使用する１−アミ
ノ−２−ナフトール−４−スルホン酸は、通常は市販品
を、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムを用いて
精製してから用いるため、試験紙の製作工程が若干煩雑
となる。
れており、その大部分においてもモリブデンブルーの生
成反応が利用されており、それぞれの方法ごとに使用す
る緩衝液や還元剤の種類及び量がことなり、それに応じ
て測定感度も異なる。前述のモリブデン酸と１−アミノ
−２−ナフトール−４−スルホン酸を用いたリン酸定量
法も１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸を還
元剤としてリンモリブデン酸を還元する過程を利用する
。この方法では、リン酸の検出限界がおよそサブミクロ
ンｍｏｌであるため、微量のリン酸を測定することは不
可能であり、結果としてこの反応を利用するＡＴＰ試験
紙の感度も低い。また、還元剤として使用する１−アミ
ノ−２−ナフトール−４−スルホン酸は、通常は市販品
を、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムを用いて
精製してから用いるため、試験紙の製作工程が若干煩雑
となる。
【００１１】本発明で用いるリン酸定量法は、酢酸緩衝
液中でリン酸をリンモリブデン酸にしてアスコルビン酸
で還元する方法、あるいは酢酸緩衝液中に硫酸銅を加え
、同様に操作する方法の応用であり、リン酸の検出限界
は、ナノｍｏｌ程度と非常に低いので、微量のリン酸も
測定可能であり、この反応を利用する本発明のＡＴＰ測
定用テスターは良好な感度を有することができる。
液中でリン酸をリンモリブデン酸にしてアスコルビン酸
で還元する方法、あるいは酢酸緩衝液中に硫酸銅を加え
、同様に操作する方法の応用であり、リン酸の検出限界
は、ナノｍｏｌ程度と非常に低いので、微量のリン酸も
測定可能であり、この反応を利用する本発明のＡＴＰ測
定用テスターは良好な感度を有することができる。
【００１２】本発明のＡＴＰ測定用テスターに用いるＡ
ＴＰ分解酵素としては、ミトコンドリア、クロロプラス
ト、細菌、筋肉組織等から得られるＡＴＰａｓｅなどを
挙げることができる。なかでも、好熱性細菌由来のもの
は、耐熱性に優れており、変性剤や温度等の影響も受け
にくく、取扱性の点から好ましい。
ＴＰ分解酵素としては、ミトコンドリア、クロロプラス
ト、細菌、筋肉組織等から得られるＡＴＰａｓｅなどを
挙げることができる。なかでも、好熱性細菌由来のもの
は、耐熱性に優れており、変性剤や温度等の影響も受け
にくく、取扱性の点から好ましい。
【００１３】ＡＴＰａｓｅの調製は、例えば、好熱性細
菌を大量培養して集菌し、超音波処理などの方法で菌体
破壊を行った後、遠心分離によって膜画分を集めること
で行うことができる。この膜画分を直接測定用基材に固
定しても良い。また、更に精製が必要な場合には、この
膜画分を、低イオン強度の緩衝液や界面活性剤を用いて
洗浄し、ＡＴＰａｓｅを可溶化して液媒体中に溶解させ
、これをイオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィーなどを含む精製処理にかけて所望の精製度と
したものを利用する。
菌を大量培養して集菌し、超音波処理などの方法で菌体
破壊を行った後、遠心分離によって膜画分を集めること
で行うことができる。この膜画分を直接測定用基材に固
定しても良い。また、更に精製が必要な場合には、この
膜画分を、低イオン強度の緩衝液や界面活性剤を用いて
洗浄し、ＡＴＰａｓｅを可溶化して液媒体中に溶解させ
、これをイオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマト
グラフィーなどを含む精製処理にかけて所望の精製度と
したものを利用する。
【００１４】本発明のＡＴＰ測定用テスターに用いる測
定用基材としては、ろ紙、高分子ゲル材料、ガラスから
なるものが利用できる。これらのなかでは、ろ紙が入手
性、取扱性という点で好適である。
定用基材としては、ろ紙、高分子ゲル材料、ガラスから
なるものが利用できる。これらのなかでは、ろ紙が入手
性、取扱性という点で好適である。
【００１５】なお、高分子ゲル材料としては、アガロー
ス、ポリアクリルアミドなどが挙げられるが、使用する
緩衝液の種類や塩濃度により適宜選択する。
ス、ポリアクリルアミドなどが挙げられるが、使用する
緩衝液の種類や塩濃度により適宜選択する。
【００１６】本発明のＡＴＰ測定用テスターは、測定用
基材に、ＡＴＰ分解酵素、モリブデン酸及びアスコルビ
ン酸を固定することによって得ることができる。これら
の成分の固定は、例えば、適当な緩衝液にモリブデン酸
とアスコルビン酸を溶解させ、次ぎにこれにＡＴＰ分解
酵素と塩化マグネシウムを溶解させる。得られた溶液を
、測定用基材に吸着させた後、凍結真空乾燥等の方法を
用いてこれを固定することによって行うことができる。
基材に、ＡＴＰ分解酵素、モリブデン酸及びアスコルビ
ン酸を固定することによって得ることができる。これら
の成分の固定は、例えば、適当な緩衝液にモリブデン酸
とアスコルビン酸を溶解させ、次ぎにこれにＡＴＰ分解
酵素と塩化マグネシウムを溶解させる。得られた溶液を
、測定用基材に吸着させた後、凍結真空乾燥等の方法を
用いてこれを固定することによって行うことができる。
【００１７】固定化する各成分の溶液中での濃度は、検
出感度等に応じて適宜調製されるが、例えばＡＴＰ分解
酵素は０．１〜５ユニット（１ユニットは一定条件下で
１分間に１ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ のＡＴＰを分解する酵
素量）、より好ましくは１〜３ユニット、モリブデン酸
は３０〜１００ｍＭ 、より好ましくは４０〜５０ｍＭ
、アスコルビン酸は４０〜１５０ｍＭ、より好ましくは
５０〜１３０ｍＭ 程度とするのがよい。
出感度等に応じて適宜調製されるが、例えばＡＴＰ分解
酵素は０．１〜５ユニット（１ユニットは一定条件下で
１分間に１ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ のＡＴＰを分解する酵
素量）、より好ましくは１〜３ユニット、モリブデン酸
は３０〜１００ｍＭ 、より好ましくは４０〜５０ｍＭ
、アスコルビン酸は４０〜１５０ｍＭ、より好ましくは
５０〜１３０ｍＭ 程度とするのがよい。
【００１８】該溶液の調製に用いる緩衝液としては、ｐ
Ｈ４．０ で使用できるものであれば特に限定されない
が、例えばｐＨ４．０ の酢酸バッファーあるいは硫酸
銅含有のｐＨ４．０ の酢酸バッファーを用いることが
できる。
Ｈ４．０ で使用できるものであれば特に限定されない
が、例えばｐＨ４．０ の酢酸バッファーあるいは硫酸
銅含有のｐＨ４．０ の酢酸バッファーを用いることが
できる。
【００１９】本発明のＡＴＰ測定用テスターを用いたＡ
ＴＰ濃度の測定は、該テスターをＡＴＰ濃度を測定すべ
きサンプル溶液に浸漬し、青色の呈色度合を目視により
判定することにより、ＡＴＰ濃度を簡易に測定可能であ
る。
ＴＰ濃度の測定は、該テスターをＡＴＰ濃度を測定すべ
きサンプル溶液に浸漬し、青色の呈色度合を目視により
判定することにより、ＡＴＰ濃度を簡易に測定可能であ
る。
【００２０】なお、規定のＡＴＰ標準濃度シリーズを用
意しておき、それぞれの濃度における呈色状態を濃度の
基準として利用しても良い。
意しておき、それぞれの濃度における呈色状態を濃度の
基準として利用しても良い。
【００２１】
実施例１
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５０， １９，
７９１０−７９１６（１９７５）及びＪ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２５０， １９， ７９１７−７９２
３（１９７５） の記載に従って、好熱性細菌ＰＳ３
株の培養及び得られた培養菌体からのＡＴＰａｓｅの抽
出、精製を行い、ＡＴＰａｓｅ精製物を得た。
７９１０−７９１６（１９７５）及びＪ． Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．， ２５０， １９， ７９１７−７９２
３（１９７５） の記載に従って、好熱性細菌ＰＳ３
株の培養及び得られた培養菌体からのＡＴＰａｓｅの抽
出、精製を行い、ＡＴＰａｓｅ精製物を得た。
【００２２】次に、ｐＨ４．０の酢酸バッファー（０．
１Ｍ酢酸、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム混合）１０ｍｌ
中に下記の各成分を溶解してテスター調製用の溶液とし
、これに１×５ｃｍのサイズのクロマトグラフ用ろ紙（
東洋ロ紙製）を浸漬して溶液を染み込ませた後、これを
凍結乾燥して本発明のＡＴＰ測定用テスターを得た。 テスター調製用溶液の組成； ＡＴＰａｓｅ精製物 １ユニッ
ト、塩化マグネシウム ５
ｍＭ、モリブデン酸アンモニウム ４０ｍＭ、ア
スコルビン酸 ６０ｍＭ。
１Ｍ酢酸、０．０２５Ｍ酢酸ナトリウム混合）１０ｍｌ
中に下記の各成分を溶解してテスター調製用の溶液とし
、これに１×５ｃｍのサイズのクロマトグラフ用ろ紙（
東洋ロ紙製）を浸漬して溶液を染み込ませた後、これを
凍結乾燥して本発明のＡＴＰ測定用テスターを得た。 テスター調製用溶液の組成； ＡＴＰａｓｅ精製物 １ユニッ
ト、塩化マグネシウム ５
ｍＭ、モリブデン酸アンモニウム ４０ｍＭ、ア
スコルビン酸 ６０ｍＭ。
【００２３】作製したテスターを、ＡＴＰ標準溶液（Ａ
ＴＰ濃度；０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１
．０ｍＭ、５．０ｍＭ）に浸漬した状態で、モリブデン
ブルーに基づく青色を呈色させ、その呈色定の度合を目
視にて判定したところ、ＡＴＰの濃度に比例して呈色の
度合が大きくなることが確認された。
ＴＰ濃度；０．０５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１
．０ｍＭ、５．０ｍＭ）に浸漬した状態で、モリブデン
ブルーに基づく青色を呈色させ、その呈色定の度合を目
視にて判定したところ、ＡＴＰの濃度に比例して呈色の
度合が大きくなることが確認された。
【００２４】実施例２
酢酸バッファー（９０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１８Ｍ
氷酢酸、６．３Ｍ硫酸銅混合、ｐＨ４．０）を用い、テ
スター調製用溶液の組成を下記組成とする以外は実施例
１と同様にして本発明のＡＴＰ測定用テスターを作製し
た。 テスター調製用溶液の組成； ＡＴＰａｓｅ精製物 １ユニッ
ト、塩化マグネシウム ５
ｍＭ、モリブデン酸アンモニウム ４０ｍＭ、ア
スコルビン酸 １２０ｍＭ。
氷酢酸、６．３Ｍ硫酸銅混合、ｐＨ４．０）を用い、テ
スター調製用溶液の組成を下記組成とする以外は実施例
１と同様にして本発明のＡＴＰ測定用テスターを作製し
た。 テスター調製用溶液の組成； ＡＴＰａｓｅ精製物 １ユニッ
ト、塩化マグネシウム ５
ｍＭ、モリブデン酸アンモニウム ４０ｍＭ、ア
スコルビン酸 １２０ｍＭ。
【００２５】得られたテスターを実施例１で調製したＡ
ＴＰ標準液に浸漬し、同様にして１０分後にテスターを
引き上げてモリブデンブルーに基づく青色呈色の度合を
目視にて判定したところ、ＡＴＰの濃度に比例して呈色
の度合が大きくなることが確認された。
ＴＰ標準液に浸漬し、同様にして１０分後にテスターを
引き上げてモリブデンブルーに基づく青色呈色の度合を
目視にて判定したところ、ＡＴＰの濃度に比例して呈色
の度合が大きくなることが確認された。
【００２６】
【発明の効果】本発明によって、容易に作製可能であり
、またこれを用いた測定操作も簡単であり、作製及び測
定コストが低く、しかも感度の高いＡＴＰ測定用テスタ
ーを提供することが可能となった。
、またこれを用いた測定操作も簡単であり、作製及び測
定コストが低く、しかも感度の高いＡＴＰ測定用テスタ
ーを提供することが可能となった。
Claims (3)
- 【請求項１】 測定用基材と、該測定用基材に固定化
されたＡＴＰ分解酵素、モリブデン酸及びアスコルビン
酸を有することを特徴とするＡＴＰ測定用テスター。 - 【請求項２】 ＡＴＰ分解酵素が、好熱性細菌由来の
ものである請求項１に記載のＡＴＰ測定用テスター。 - 【請求項３】 測定用基材がろ紙、ゲル材料またガラ
スからなるものである請求項１または２に記載のＡＴＰ
測定用テスター。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15506991A JPH04360700A (ja) | 1991-06-01 | 1991-06-01 | Ａｔｐ測定用テスター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15506991A JPH04360700A (ja) | 1991-06-01 | 1991-06-01 | Ａｔｐ測定用テスター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04360700A true JPH04360700A (ja) | 1992-12-14 |
Family
ID=15597985
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15506991A Pending JPH04360700A (ja) | 1991-06-01 | 1991-06-01 | Ａｔｐ測定用テスター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04360700A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852501B2 (en) * | 1999-06-17 | 2005-02-08 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Methods for determining ATPase activity and uses thereof |
| US7122333B2 (en) | 2001-11-21 | 2006-10-17 | Unitika Ltd. | Method and reagent for visually measuring ATP |
| JP2013235014A (ja) * | 2009-04-21 | 2013-11-21 | Univ Of Tokyo | 微生物の数または量を測定する方法および装置 |
| WO2021241446A1 (ja) | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 横河電機株式会社 | 検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット |
-
1991
- 1991-06-01 JP JP15506991A patent/JPH04360700A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6852501B2 (en) * | 1999-06-17 | 2005-02-08 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Methods for determining ATPase activity and uses thereof |
| US7122333B2 (en) | 2001-11-21 | 2006-10-17 | Unitika Ltd. | Method and reagent for visually measuring ATP |
| JP2013235014A (ja) * | 2009-04-21 | 2013-11-21 | Univ Of Tokyo | 微生物の数または量を測定する方法および装置 |
| WO2021241446A1 (ja) | 2020-05-25 | 2021-12-02 | 横河電機株式会社 | 検体中の標的分子の検出方法、及び標的分子検出キット |
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