WO2021166285A1 - 新規ビフィドバクテリウム属細菌及びそれを含む組成物 - Google Patents

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WO2021166285A1
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aub
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sorbitol
culture
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PCT/JP2020/030678
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鈴木　啓太
凛太郎 冨士川
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ＡｕＢ株式会社
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention is a novel bifidobacteria and a composition containing the novel bifidobacteria, more specifically, a novel bifidobacteria having sorbitol assimilation ability isolated from the intestine of an athlete.
  • the present invention relates to foods and drinks containing the genus bacteria and the novel bifidobacteria genus bacteria, probiotic compositions and the like.
  • the health condition can be improved or improved by adjusting the intestinal environment.
  • the intestinal flora composed of a large number of intestinal bacteria by analyzing fecal samples by a molecular biological method. Therefore, research from various viewpoints is being carried out in order to elucidate the relationship between the composition of the intestinal flora and the health condition.
  • Non-Patent Document 1 As a result of analyzing the intestinal flora of 13 female marathon athletes, a certain percentage (6 out of 13 athletes) possessed Prevotella intestinal bacteria was found. Etc. have been reported.
  • sugars such as glucose and sucrose
  • sugars include sugar alcohols such as sorbitol and xylitol, and synthetic sweeteners such as aspartame.
  • sugar alcohols are widely used as sweeteners, food additives, etc. because they are mainly plant-derived natural compounds, so they are highly safe, and because they are difficult to digest and absorb, they have low calories.
  • Non-Patent Document 1 As a result of analyzing the intestinal bacterial flora of athletes, only the knowledge of what kind of microorganisms are present and at what ratio is obtained. , The individual microorganisms that make up the athlete's intestinal flora have not been investigated or isolated.
  • oligosaccharides and polydextrose are difficult to be decomposed and absorbed in the digestive tract, and serve as a selective nutrient source for intestinal bacteria useful for improving health condition and promote their growth. It is used as prebiotics. Therefore, it is expected that sugar alcohols, which are widely used as constituents of foods and drinks, will be utilized as prebiotics.
  • an object of the present invention is to isolate and provide a new lactic acid bacterium having a beneficial function from the intestinal flora of an athlete.
  • Another object of the present invention is to obtain a new lactic acid bacterium having a sugar alcohol assimilation ability capable of growing using a sugar alcohol such as sorbitol and using the sugar alcohol as a prebiotic. To provide.
  • Another object of the present invention is to provide a composition such as a food or drink or a probiotic composition containing the above-mentioned new lactic acid bacterium.
  • the present inventors obtained 1000 or more samples from 500 or more athletes, analyzed the intestinal flora of the athletes, and diligently studied for the purpose of isolating a novel lactic acid bacterium useful as a new probiotic. , The present invention has been completed.
  • the novel lactic acid bacterium of the present invention that solves the above-mentioned problems is Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095) of Bifidobacterium (Bifidobacterium genus bacterium).
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095) according to the present invention is a novel Bifidobacterium genus bacterium having sorbitol assimilation ability. Since this novel bifidobacteria is a longum species, it can be used as a probiotic. In addition, since this novel Bifidobacterium bacterium has the ability to assimilate sorbitol, sorbitol contained in various foods and beverages and sorbitol naturally contained in fruits, etc. are prebiotics. Can be effectively used as. Furthermore, this novel Bifidobacterium genus bacterium has excellent acid resistance as compared with the reference strain (Bifidobacterium longum ATCC15707 strain).
  • composition containing the novel Bifidobacterium genus bacterium of the present invention is a composition containing Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095).
  • composition of the present invention contains Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095) and sorbitol. This results in a composition containing beneficial microorganisms and their nutrient sources, namely probiotics and prebiotics.
  • composition of the present invention is a food or drink.
  • the foods and drinks in the present invention naturally include supplements, health foods, functional foods, dietary supplements, foods for specified health use, and the like.
  • composition of the present invention is a probiotic composition. This selects one aspect of the suitable composition.
  • a composition containing a novel Bifidobacterium genus bacterium and a novel Bifidobacterium genus bacterium having the following excellent effects.
  • the novel lactic acid bacterium of the present invention is Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095) having the ability to assimilate sorbitol.
  • the novel Bifidobacterium bacterium of the present invention is isolated from the intestinal flora of an athlete (male, athletics, former Olympics representative from Japan).
  • This novel Bifidobacterium genus bacterium that is, the Bifidobacterium longum AuB-001 strain, has been internationally deposited with the patented microorganism depository as follows. (1) Contract number: NITE BP-03095 (2) Original deposit date: December 25, 2019 (3) Depositary organization: Patent Microbial Deposit Center, Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Infrastructure Organization (Room 2-5-8 122, Kazusakamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818) )
  • the mycological properties of the Bifidobacterium longum AuB-001 strain isolated from the intestinal flora of athletes are shown in Tables 1 and 2 below.
  • Each test shown in Table 1 below includes morphological observation using an optical microscope (Olympus Corporation product, model number: BX50F4) and the method of Barrow & Feltham et al. (Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd edition, Cambridge: University Press). , 1993).
  • the reaction test for each substrate shown in Table 2 was carried out using an anaerobic bacterium biochemical identification kit (Apikenki (API20A), a product of BioMérieux Japan Co., Ltd.).
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain can be grown by culturing.
  • the culture temperature of the AuB-001 strain is preferably 20 ° C to 40 ° C, more preferably 25 ° C to 40 ° C, and particularly preferably 30 ° C to 40 ° C.
  • the bacterium of the genus Bifidobacterium is an obligate anaerobic bacterium, it is preferable to culture it in an anaerobic environment, for example, it is preferable to culture it while aerating carbon dioxide gas or nitrogen gas.
  • a medium generally used for culturing bifidobacteria can be used, and the medium is not particularly limited, but is limited to GAM bouillon “Nissui” (Nippon Suisan Kaisha Co., Ltd.) or TOS propionic acid agar medium. (Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.) and the like. Further, a saccharide such as sorbitol, which the AuB-001 strain has an assimilation ability, may be blended in this medium.
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain can be used in the state of the culture solution, the state in which the culture solution is concentrated or diluted, and the state of the cells recovered from the culture solution or the like. In addition, various additional treatments such as washing treatment, freeze-drying, L-drying, spray-drying and other drying treatments, and heat treatment may be applied to the culture solution and the recovered bacterial cells as long as the effects of the present invention are not lost. It is possible.
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain is preferably used as a live bacterium, but may be a dead bacterium, and a mixture of the live bacterium and the dead bacterium is used. You may.
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain according to the present invention can be used alone as a beneficial novel bifidobacteria, but can be used as various compositions obtained in combination with other components.
  • can. As the composition containing the Bifidobacterium longum AuB-001 strain of the present invention, foods and drinks to be ingested orally, probiotic compositions, intestinal regulating compositions, quasi-drugs, pharmaceuticals and the like are preferably used. Can be mentioned.
  • foods and drinks include supplements, health foods, functional foods, dietary supplements, foods for specified health use, and the like.
  • the content of the AuB-001 strain in the composition varies depending on the use and mode of use of the composition, but as an example, it is preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 12 cells / g, and 1 ⁇ 10 More preferably, it is 7 to 1 ⁇ 10 11 cells / g.
  • Sorbitol can be contained in the composition containing the Bifidobacterium longum AuB-001 strain of the present invention. Since the AuB-001 strain has the ability to assimilate sorbitol, sorbitol, which is a constituent of the composition, serves as a selective nutrient source for the AuB-001 strain and can activate the growth and activity of the AuB-001 strain. ..
  • the blending ratio of sorbitol in the composition is not particularly limited, but as an example, 0.01 to 20% by weight is preferable, 0.1 to 10% by weight is more preferable, and 0.5 to 5% by weight is particularly preferable. ..
  • Food and drink are suitable for the use of the composition according to the present invention.
  • supplement forms such as tablets and capsules, powders, granules and gels, beverages such as fermented milk and lactic acid bacteria beverages, soft drinks and sports beverages, dairy products such as yogurt and ice cream, candy and gum.
  • beverages such as fermented milk and lactic acid bacteria beverages, soft drinks and sports beverages
  • dairy products such as yogurt and ice cream, candy and gum.
  • chocolate and other confectionery, bread, porridge, cereals, noodles, jelly, soup, seasonings and other food and drink compositions can be combined in this composition. be.
  • These food and drink compositions can be produced by adding, for example, the Bifidobacterium longum AuB-001 strain in powder form or suspension form to the raw material of food and drink and mixing them.
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain it is also possible to add the Bifidobacterium longum AuB-001 strain to a fermented raw material such as milk and cultivate or ferment it to produce a fermented food.
  • the use of the composition according to the present invention it is also preferable to use it as a probiotic composition for adjusting the intestinal environment.
  • the form of the probiotic composition can be the same as that of the above-mentioned food and drink.
  • the prebiotic component include, but are not limited to, oligosaccharides such as galactooligosaccharide and fructooligosaccharide, and dietary fiber such as polydextrose and inulin, in addition to the above-mentioned sorbitol. Can be selected and incorporated into the composition.
  • it is also possible to select one or more probiotics such as Bifidobacterium longum strain, Bifidobacterium strain or Lactobacillus strain other than AuB-001 strain and blend them in the composition. ..
  • Example 1 Isolation of lactic acid bacteria Fecal samples were collected from a large number of athletes and lactic acid bacteria were isolated. Specifically, it was carried out by the following method. The stool sample was suspended in sterilized PBS, and the suspension was further diluted with PBS to prepare a serial diluent, which was applied to TOS propionic acid agar medium (a product of Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.). This plate medium was anaerobically cultured in an anaerobic jar at 37 ° C. for 2 to 3 days using an oxygen scavenger / carbon dioxide generator (Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. product, Aneropack (registered trademark) / Kenki).
  • TOS propionic acid agar medium a product of Yakult Pharmaceutical Co., Ltd.
  • This plate medium was anaerobically cultured in an anaerobic jar at 37 ° C. for 2 to 3 days using an oxygen scavenger / carbon dioxide generator (Mitsubishi Gas Chemical Company
  • Bacterial isolates colonized on a plate medium were caught and inoculated into a liquid medium (GAM bouillon “Nissui", manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) having the medium composition shown in Table 3 below, and the temperature was 37 ° C. under anaerobic conditions. Was cultured in. Then, as described in detail in Example 2 below, the DNA of the isolate is extracted from each culture medium, and the extracted DNA is subjected to ribosomal RNA gene (rDNA) base sequence analysis to estimate the bacterial species of the isolate. bottom.
  • rDNA ribosomal RNA gene
  • the culture medium of the isolate presumed to be of the genus Bifidobacterium was anaerobic in the GAM bouillon "Nissui" liquid medium shown in Table 3 after single colony isolation using TOS propionic acid agar medium for pure culture. Under the conditions, the cells were cultured at 37 ° C., made into a 20% glycerol stock, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • Example 2 Identification of isolates (1)
  • 16S ribosomal RNA gene (rDNA) nucleotide sequence analysis was performed in order to estimate the bacterial species of the colonized bacterial isolate.
  • the DNA of the isolate was extracted from the culture medium, and the 16S rRNA gene was amplified by PCR on the extracted DNA.
  • the sequences of the primer sets used for PCR were "27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO: 1)" and "1492R: 5'-GGTTTACCTTGTCGACTT-3' (SEQ ID NO: 2)".
  • the nucleotide sequence of each PCR product was determined, and the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene region of each isolate was obtained.
  • the sequence of this 16S rRNA gene region was searched for homology by the BLAST program (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on the NCBI international nucleotide sequence database (Genbank).
  • the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene region of a bacterial isolate isolated from a fecal sample of a male athlete was changed to "Bifidobacterium longum subsp. Suillum strain Su 851 16S ribosomal. It was found to show as high a homology as 99.3% with "RNA, partial sequence”. Therefore, the strain of this isolate was presumed to be Bifidobacterium longum and named AuB-001 strain.
  • the nucleotide sequence of the determined 16S rRNA gene region (SEQ ID NO: 3) of this isolate (AuB-001 strain) is shown in Table 4 below.
  • Example 3 3. Identification of isolates (2)
  • the AuB-001 strain presumed to be Bifidobacterium longum was subjected to ANI (Average nucleicide identity) analysis.
  • ANI analysis is performed by dividing the entire genome sequence of the strain to be investigated and the existing strain into fragments of about 1000 bases on a computer, and calculating the similarity of each fragment of both genome sequences by a sequence search algorithm.
  • the 70% concordance in the DNA-DNA hybrid formation test is said to correspond to 95% in the ANI value. Therefore, if the ANI value is 95% or more, it is determined to be the same species, and if the ANI value is less than 95%, it is determined to be a different species.
  • the entire genome sequence of the AuB-001 strain was determined by a sequencer, and a base sequence of 2,548,718 bp was obtained.
  • the ANI analysis was performed programmatically on the ANItools Online (http://ani.mypathogen.cn/) website. The results are shown in Table 5 below.
  • the AuB-001 strain showed an ANI value of 95% or more with respect to a plurality of strains of Bifidobacterium longum species. Therefore, the strain of the AuB-001 strain of the present invention was identified as Bifidobacterium longum. Moreover, since the ANI value with the closely related strain was less than 100%, it was clarified that the AuB-001 strain is a novel strain of Bifidobacterium longum. This Bifidobacterium longum AuB-001 strain was deposited as NITE BP-03095 at the Patent Microorganisms Depositary Center.
  • Example 4 4. Examination of saccharification ability
  • a reaction test was conducted using each saccharide as a substrate. The test was conducted using an anaerobic bacterium biochemical identification kit (Apicenki (API20A), a product of Biomeryu Japan Co., Ltd.), and as a comparative control, the same applies to the Bifidobacterium longum ATCC15707 strain, which is a reference strain of Bifidobacterium longum. Was tested. The results are shown in Table 6 below.
  • the AuB-001 strain according to the present invention is the reference strain B. Unlike the longum ATCC15707 strain, it was revealed that it has the ability to assimilate sorbitol, which is a sugar alcohol.
  • Bifidobacterium longum which has the ability to assimilate sorbitol, from the intestinal flora of athletes supports the diversity and functionality of the intestinal flora of athletes.
  • Example 5 Analysis of organic acid production
  • Organic acids keep the intestinal acidity, promote intestinal peristalsis and water secretion from the intestinal tract, and have the effects of preventing infection, suppressing the production of spoilage products, and improving bowel movements and bowel movements. Has an action. Therefore, it is known that the intestinal environment is adjusted and contributes to health by retaining the bacteria that produce organic acids in the intestine. Therefore, in order to investigate the organic acid-producing ability of the Bifidobacterium longum AuB-001 strain, the amount of organic acid produced in the culture solution was analyzed.
  • culture solution A containing no sorbitol and (2) culture solution B containing sorbitol were used as culture solutions, and the amount of organic acid produced in each culture solution was measured.
  • a Nissui liquid medium containing sorbitol at a concentration of 0.5% was used. The test was conducted as follows.
  • Each culture solution was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.20 ⁇ m, and the concentration of each organic acid was measured with a high performance liquid chromatograph device (manufactured by Shimadzu Corporation, organic acid analysis system) using the filtrate as a sample solution. ..
  • the detailed measurement conditions are as follows.
  • a reference strain Bifidobacterium longum ATCC15707 strain
  • AuB-001 strain a reference strain
  • colonies of the ATCC15707 strain grown on TOS propionic acid agar medium at 37 ° C. for 72 hours by anaerobic culture were sterilized. Suspended in saline, Macfarland turbidity No. Prepared to 0.5.
  • the culture solution B. longum ATCC15707 strain
  • the test was carried out in the same manner as described above, and the concentration of the organic acid was measured. The results are shown in Tables 8 and 9 and FIGS. 1 and 2 below.
  • the total number of bacteria in the culture solution A of the AuB-001 strain after anaerobic culture using the culture solution A was 1.5 ⁇ 10 10 (cells / mL), and the total number of bacteria in the culture solution A of the ATCC15707 strain was 1.5 ⁇ 10 10 (cells / mL). total bacterial count was 8.9 ⁇ 10 9 (cells / mL ).
  • the total number of bacteria in the culture solution B of the AuB-001 strain after anaerobic culture using the culture solution B (Table 7) was 1.2 ⁇ 10 10 (cells / mL), and the culture solution B of the ATCC15707 strain. total bacterial count in the medium was 4.9 ⁇ 10 9 (cells / mL ).
  • the AuB-001 strain in the culture solution A (without sorbitol addition), has the same organic acid producing ability as the reference strain ATCC15707, and all of them contain lactic acid, acetic acid and formic acid. It was found to be produced in large quantities. It was also found that the AuB-001 strain had a high production ability of lactic acid, formic acid and acetic acid even in the culture solution B to which sorbitol was added. From this, it was clarified that the AuB-001 strain can proliferate actively in the presence of sorbitol and produce an organic acid.
  • Example 6 Analysis of saccharifying ability and organic acid production
  • a carbohydrate-free PY medium supplemented with glucose or sorbitol as a carbohydrate source was added instead of the glucose-containing culture medium used in Example 5.
  • the AuB-001 strain and the reference strain (Bifidobacterium longum ATCC15707 strain) were used to analyze the saccharifying ability, that is, the proliferative ability and the amount of organic acid produced in each culture medium.
  • the composition of the PY medium used in this example is shown in Tables 10 and 11 below.
  • the PY medium was obtained by heating and dissolving the solution 1 shown in Table 10, then adding the solution 2 and autoclaving at 121 ° C. for 15 minutes. After quenching this, the culture medium to which D (-)-sorbitol was added so as to have a concentration of 0.5% by weight was defined as "PY medium + 0.5% sorbitol", and D (+)-glucose was 0.5% by mass.
  • the culture medium added to a concentration was defined as "PY medium + 0.5% glucose”.
  • the resazurin solution (* 1) in Table 10 is a solution prepared by dissolving 25 mg in 100 mL of distilled water
  • the salt solution (* 2) is a solution prepared from the components shown in Table 11, and a hemin solution (* 1) is used.
  • 50 mg of hemin was dissolved in 1N NaOH and messed up to 100 mL with distilled water, and 0.15 mL of vitamin K1 was dissolved in 30 mL of 95% ethanol for Vitamin K1 solution (* 4). I used the one.
  • the test was conducted as follows. Colonies of AuB-001 strain grown on TOS propionic acid agar medium (Yakult Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) by anaerobic culture at 37 ° C. for 72 hours were taken and suspended in sterile physiological saline to obtain McFarland turbidity No. Prepared to 0.5. 0.1 mL of this AuB-001 strain bacterial solution was inoculated into 10 mL of each culture solution of "PY medium + 0.5% sorbitol" and "PY medium + 0.5% glucose", and sterilized and pressurized at 37 ° C. for 20 hours. It was anaerobically cultured using a test tube.
  • each culture part from each culture was serially diluted stock solution to 10 4 times, was determined total number of bacteria each culture per 1mL counts the number of bacteria using a hemocytometer. Further, each of the remaining culture solutions was filtered through a membrane filter having a pore size of 0.20 ⁇ m, and the concentration of each organic acid was measured using the filtrate as a sample solution under the same measurement method and conditions as in Example 5 described above.
  • the reference strain Bifidobacterium longum ATCC15707 strain was used, and the colonies of the ATCC15707 strain grown on TOS propionic acid agar medium at 37 ° C. for 72 hours by anaerobic culture were suspended in sterile physiological saline. Turbidity, Macfarland Turbidity No. Prepared to 0.5. About the culture solution (B. longum ATCC15707 strain) in which 0.1 mL of the bacterial solution of this reference strain was inoculated into 10 mL of each culture solution and anaerobically cultured at 37 ° C. for 20 hours, and the culture solution (Blank) not inoculated with the bacteria. was also tested in the same manner, and the total number of bacteria and the concentration of each organic acid per 1 mL of each culture solution were measured. The results are shown in Tables 12 and 13 and FIGS. 3 and 4 below.
  • the AUB-001 strain was vigorously grown to 4.8 ⁇ 10 9 cells / mL, a large amount of lactic acid and acetic acid while produced, the ATCC15707 strain is the reference strain, the total number of bacteria did not proliferate and 5.6 ⁇ 10 6 cells / mL, it was shown that hardly produce lactic acid and acetic acid.
  • the AuB-001 strain can proliferate using sorbitol even though it is a bifidobacteria longum species, and can produce lactic acid and acetic acid as final metabolites.
  • Example 7 Examination of acid resistance
  • Bifidobacterium spp. are vulnerable to a low pH environment, so when ingested orally, they are easily killed by the influence of gastric juice, and there is a problem that it is difficult to reach the intestine alive. Therefore, the acid resistance of the Bifidobacterium longum AuB-001 strain according to the present invention was investigated using a test solution adjusted to pH 2.0 that imitated gastric juice.
  • AuB-001 strain was used at 37 ° C. using TOS propionic acid agar medium (Yakult Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) and an oxygen scavenger / carbon dioxide generator (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd. product, Aneropouch (registered trademark) / Kenki). It was anaerobically cultured for 24 hours. The fresh culture strains were suspended in sterile physiological saline to prepare a bacterial solution so that the number of bacteria per 1mL becomes 10 8 cells / mL.
  • the AuB-001 strain was superior to the reference strain ATCC15707 in acid resistance. Specifically, when contacted with artificial gastric juice of pH 2.0 for 30 minutes, the AuB-001 strain survived 2.3 ⁇ 10 3 CFU / mL, but the number of surviving bacteria of the ATCC15707 strain was 3.3 CFU. It was / mL.
  • the Bifidobacterium longum AuB-001 strain according to the present invention has a sorbitol assimilation ability capable of actively proliferating using sorbitol and producing lactic acid and acetic acid as final metabolites. It was found that it has excellent acid resistance as well as having. Therefore, it was shown that the AuB-001 strain has different properties from the known Bifidobacterium longum species including the reference strain.
  • novel Bifidobacterium longum AuB-001 strain (NITE BP-03095) of the present invention and the composition containing the same are bifidobacteria useful as new probiotics and improve the intestinal environment. It is effectively used for foods (including supplements, health foods, functional foods, foods for specified health uses, etc.) and is widely useful in the medical field.
  • SEQ ID NO: 1 Forward primer for PCR amplification of 16S rRNA gene region
  • SEQ ID NO: 2 Reverse primer for PCR amplification of 16S rRNA gene region
  • SEQ ID NO: 3 New Bifidobacterium longum AuB-001 strain Base sequence of 16S rRNA gene region

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Abstract

健康に有益な新たな乳酸菌を単離し、この新規乳酸菌を含有する飲食品やプロバイオティクス組成物等の組成物を提供する。　アスリートの腸内フローラから単離された、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）及びこれを含有する飲食品やプロバイオティクス組成物等の組成物を提供する。

Description

新規ビフィドバクテリウム属細菌及びそれを含む組成物
　本発明は、新規ビフィドバクテリウム属細菌及びこのビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物、より詳細には、アスリートの腸内から単離された、ソルビトール資化能を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌及びこの新規ビフィドバクテリウム属細菌を含有する飲食品、プロバイオティクス組成物等に関する。
　従来から、腸内環境を整えることにより、健康状態を改善又は向上できることが知られている。また、近年、糞便検体を分子生物学的手法で解析することにより、多数の腸内細菌から構成される腸内フローラについて把握することができるようになった。そこで、腸内フローラの構成と健康状態との関連性を解明するべく、様々な観点からの研究が進められている。
　このうち、アスリートの腸内フローラに関する研究が着目されている。アスリートは身体能力に優れると共に日常的に高度な身体運動を行っていることから、エネルギーの吸収・消費、免疫等に係る機能が、一般の人とは異なっている可能性を有する。そこで、これらの機能改善や健康状態の向上に有用な知見を得るため、アスリートを対象に、エネルギー吸収及び腸管免疫系の場である腸内の腸内細菌叢を解析することが行われている。例えば、非特許文献１では、女子マラソン選手１３名を対象として腸内細菌叢の解析を行った結果、Prevotella属の腸内細菌を保有する選手が一定割合（１３名中６名）存在したこと等が報告されている。
　他方、我々が経口摂取する食品や飲料には様々な糖類が含まれている。糖類には、ブドウ糖やショ糖などのいわゆる糖のほか、ソルビトールやキシリトール等の糖アルコール、アスパルテーム等の合成甘味料が存在する。このうち、糖アルコールは、主に植物由来の天然化合物であるため安全性が高く、消化吸収され難いためカロリーも低いことから、甘味料や食品添加物等として広く使用されている。
松生香里、外７名、「マラソン選手における腸内細菌叢の特徴とＢＭＩの関連」、川崎医療福祉学会誌、Vol.29、No.1、2019年, p.99-105
　このような背景技術下において、腸内環境を整えて健康状態を改善等するために使用され得る、新たな微生物が求められている。特に、アスリートの腸内フローラを構成している微生物から、新たなプロバイオティクスとして使用され得る、特別な機能を有する乳酸菌が単離されることが期待されている。しかしながら、上述した非特許文献１によれば、アスリートの腸内細菌叢を解析した結果、どのような属の微生物がどの程度の割合で存在しているかについての知見が得られているのみであり、アスリートの腸内フローラを構成する個々の微生物についての検討や単離はなされていない。
　他方、上述した糖類のうち、オリゴ糖やポリデキストロースは、消化管で分解・吸収され難く、健康状態の向上に有益な腸内細菌の選択的な栄養源となって増殖を促進することから、プレバイオティクスとして用いられている。そこで、飲食品の構成成分として広く使用されている糖アルコールがプレバイオティクスとして活用されることが期待されている。
　したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、アスリートの腸内フローラから、有益な機能を有する新たな乳酸菌を単離し、提供することにある。
　また、本発明の他の目的としては、ソルビトール等の糖アルコールを利用して生育することができる糖アルコール資化能を有し、糖アルコールをプレバイオティクスとして用いることができる、新たな乳酸菌を提供することにある。
　また、本発明の他の目的としては、上述した新たな乳酸菌を含有する飲食品やプロバイオティクス組成物等の組成物を提供することにある。
　本発明者らは、アスリート５００名以上から１０００検体以上を取得し、アスリートの腸内フローラを解析すると共に、新たなプロバイオティクスとして有用な新規乳酸菌を単離することを目的として鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
　上記課題を解決する、本発明の新規乳酸菌は、ビフィズス菌（ビフィドバクテリウム属細菌）のビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）である。
　本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）は、ソルビトール資化能を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌である。この新規ビフィドバクテリウム属細菌はロンガム種であることから、プロバイオティクスとして使用され得る。また、この新規ビフィドバクテリウム属細菌はソルビトールの資化能を有することから、様々な食品や飲料に配合されているソルビトールや、果実等にも天然に含まれているソルビトールを、プレバイオティクスとして有効活用することができる。さらに、この新規ビフィドバクテリウム属細菌は、基準株（Bifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株）と比べて耐酸性にも優れた性質を有する。
　また、本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）を含有する組成物である。
　また、本発明の組成物は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）及びソルビトールを含有することも好ましい。これにより、有益な微生物とその栄養源、すなわち、プロバイオティクスとプレバイオティクスが配合された組成物が得られる。
　また、本発明の組成物は、飲食品であることも好ましい。これにより、好適な組成物の態様が選択される。なお、本発明における飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、栄養補助食品及び特定保健用食品等も当然に含まれる。
　また、本発明の組成物は、プロバイオティクス組成物であることも好ましい。これにより、好適な組成物の一態様が選択される。
　本発明によれば、以下のような優れた効果を有する新規ビフィドバクテリウム属細菌及び新規ビフィドバクテリウム属細菌を含む組成物を提供することができる。
（１）プロバイオティクスとして使用され得る新たなビフィドバクテリウム属細菌であり、食品や飲料、医薬品等の組成物に配合して使用することができる。
（２）様々な食品や飲料に広く配合され、天然果実等にも多く含まれるソルビトールの資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌であるため、ソルビトールをプレバイオティクスとして有効活用することができる。
（３）基準株（Bifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株）と比べて耐酸性に優れるため、経口摂取した場合でも生きた状態で腸内に到達され易い。
実施例５における本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を培養した培養液Ａ（ソルビトール無）中の有機酸濃度を示すグラフである。 実施例５における本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を培養した培養液Ｂ（ソルビトール含）中の有機酸濃度を示すグラフである。 実施例６における本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を培養した「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」培養液中の有機酸濃度を示すグラフである。 実施例６における本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌を培養した「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」培養液中の有機酸濃度を示すグラフである。
　本発明の新規乳酸菌は、ソルビトールの資化能を有するビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）である。ソルビトール資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びＢ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍの一部の菌以外には、これまでほとんど確認されておらず、ビフィドバクテリウム・ロンガム種においては、今回、発明者らによって初めて確認され、単離されたものである。
　この本発明の新規ビフィドバクテリウム属細菌は、アスリート（男性、競技種目:陸上競技、元五輪日本代表）の腸内フローラから単離されたものである。この新規ビフィドバクテリウム属細菌、すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、以下のとおり特許微生物の寄託機関に国際寄託がなされている。
（１）受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５
（２）原寄託日：２０１９年１２月２５日
（３）寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）
　アスリートの腸内フローラから単離されたビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の菌学的性質を、以下表１及び表２に示す。以下表１に示す各試験は、光学顕微鏡（オリンパス株式会社製品、型番：ＢＸ５０Ｆ４）による形態観察及びBarrow & Felthamらの方法（Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd edition, Cambridge: University Press, 1993）に基づき、行われたものである。また、表２に示す各基質に対する反応試験は、嫌気性菌生化学的同定キット（アピケンキ（ＡＰＩ２０Ａ）、ビオメリュー・ジャパン株式会社製品）を用いて行われたものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、培養により増殖させることができる。ＡｕＢ－００１株の培養温度は２０℃～４０℃が好ましく、２５℃～４０℃がより好ましく、３０℃～４０℃が特に好ましい。また、ビフィドバクテリウム属細菌は偏性嫌気性細菌であるので、嫌気環境下で培養を行うことが好ましく、例えば、炭酸ガスや窒素ガスを通気しながら培養することが好ましい。また、培地としては、ビフィドバクテリウム属細菌の培養に一般的に用いられる培地を用いることができ、特に限定されないが、ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」（日水製薬株式会社）やＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）などが挙げられる。また、この培地中には、ＡｕＢ－００１株が資化能を有するソルビトール等の糖類を配合させてもよい。
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、培養液の状態、培養液を濃縮又は希釈した状態、及び培養液等から回収した菌体の状態で用いることが可能である。また、本発明の効果を失わない範囲において、培養液及び回収菌体に対し、洗浄処理、凍結乾燥やＬ－乾燥、スプレードライ等の乾燥処理又は加熱処理等の種々の追加処理を施すことも可能である。なお、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、生菌として用いることが好ましいが、死菌であってもよく、生菌と死菌とが混合された状態のものを用いてもよい。
　本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、有益な新規ビフィズス菌として菌単独でも用いることができるが、他成分と組み合わせて得られる種々の組成物として用いることができる。本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡｕＢ－００１株を含有する組成物としては、経口摂取される飲食品、プロバイオティクス組成物、整腸用組成物、医薬部外品又は医薬品等が好適に挙げられる。また、飲食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、栄養補助食品及び特定保健用食品等が含まれる。組成物中のＡｕＢ－００１株の含有量としては、組成物の用途や使用態様等によって異なるが、一例として、１×１０６～１×１０１２ｃｅｌｌｓ／ｇであることが好ましく、１×１０７～１×１０１１ｃｅｌｌｓ／ｇであることがより好ましい。
　本発明のビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡｕＢ－００１株を含有する組成物には、ソルビトールを含有させることができる。ＡｕＢ－００１株はソルビトール資化能を有するため、組成物中の構成成分であるソルビトールがＡｕＢ－００１株の選択的な栄養源となり、ＡｕＢ－００１株の増殖及び活動を活性化させることができる。組成物中のソルビトールの配合割合としては、特に限定されないが、一例として、０．０１～２０重量％が好ましく、０．１～１０重量％がより好ましく、０．５～５重量％が特に好ましい。
　本発明に係る組成物の用途としては、飲食品が好適である。この場合、錠剤やカプセル剤、粉末剤、顆粒剤、ゲル状剤などのサプリメント形態、発酵乳や乳酸菌飲料、清涼飲料水、スポーツ飲料などの飲料、ヨーグルトやアイスクリーム等の乳製品、アメやガム、チョコレート等の菓子、パン、粥、シリアル、麺類、ゼリー、スープ、調味料等のあらゆる態様の飲食品組成物として用いることができる。また、この組成物には、飲食品組成物を構成する原料の他に、他の機能性成分、他の微生物、糖類、ビタミン、ミネラル、アミノ酸若しくはタンパク質等の栄養素等を種々組み合わせることも可能である。
　これらの飲食品組成物は、飲食品の原料に、例えば、粉末形態又は懸濁液形態のビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡｕＢ－００１株を添加し、混合等することにより製造することができる。その一方で、牛乳等の発酵原料に、ビフィドバクテリウム・ロンガム　ＡｕＢ－００１株を添加し、培養又は発酵させて、発酵食品として製造することも可能である。
　また、本発明に係る組成物の用途としては、腸内環境を整えるためのプロバイオティクス組成物とすることも好ましい。プロバイオティクス組成物の形態としては、上述した飲食品と同様の形態を取ることができる。また、プロバイオティクス組成物とした場合、ＡｕＢ－００１株の増殖及び活性化を促すプレバイオティクス成分を組み合わせた組成物とすることが好ましい。プレバイオティクス成分としては、上述したソルビトールの他、特に限定されないが、ガラクトオリゴ糖やフラクトオリゴ糖等のオリゴ糖、ポリデキストロースやイヌリン等の食物繊維を挙げることができ、１種又は２種以上の成分を選択して組成物中に配合することができる。さらに、ＡｕＢ－００１株以外のビフィドバクテリウム・ロンガム株、ビフィズス菌株又はラクトバチルス属株等のプロバイオティクスを１種又は２種以上を選択して組成物中に配合することも可能である。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に特に限定されるものではない。
　［実施例１］
　１．乳酸菌の単離
　多数のアスリートから糞便サンプルを採集し、乳酸菌の単離を行った。具体的には、次の方法にて行った。糞便サンプルを滅菌したＰＢＳに懸濁し、この懸濁液をさらにＰＢＳで希釈して系列希釈液を調製し、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社製品）に塗布した。この平板培地を嫌気ジャー内で脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパック（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で２～３日間嫌気培養した。平板培地上でコロニー形成した細菌分離株を釣菌し、以下表３に示す培地組成の液体培地（ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」、日水製薬株式会社製品）に接種し、嫌気性条件下で３７℃にて培養した。そして、以下実施例２で詳述するように、各培養液から分離株のＤＮＡをそれぞれ抽出し、抽出されたＤＮＡについてリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行い、分離株の菌種を推定した。ビフィドバクテリウム属と推定された分離株の培養液は、純粋培養のためにＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用いて単一集落分離した後、表３に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地において嫌気性条件下で３７℃にて培養し、２０％グリセロールストックにして－８０℃で保管した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　［実施例２］
　２．分離株の同定（１）
　実施例１において、コロニー形成した細菌分離株の菌種を推定するために、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）塩基配列解析を行った。まず、培養液から分離株のＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡについて、ＰＣＲにて１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーセットの配列は、「２７Ｆ：５’－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ－３’（配列番号１）」及び「１４９２Ｒ：５’－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ－３’（配列番号２）」とした。各ＰＣＲ産物の塩基配列決定を行い、各分離株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列を得た。この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の配列について、ＮＣＢＩの国際塩基配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ）上で、ＢＬＡＳＴプログラム（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）による相同性検索を行った。
　この結果、ある男性アスリート（競技種目:陸上競技、元五輪日本代表）の糞便サンプルから単離された細菌分離株の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列が、「Bifidobacterium longum subsp. suillum strain Su 851 16S ribosomal RNA, partial sequence」と９９．３％もの高い相同性を示すことが見出された。それゆえ、この分離株の菌種を、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と推定し、ＡｕＢ－００１株と名付けた。この分離株（ＡｕＢ－００１株）の塩基配列決定された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列（配列番号３）を以下表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　［実施例３］
　３．分離株の同定（２）
　実施例２において、ビフィドバクテリウム・ロンガムと推定されたＡｕＢ－００１株について、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ）解析を行った。ＡＮＩ解析とは、調査対象株及び既存株の全ゲノム配列をコンピュータ上で約１０００塩基程度の断片に分け、両者のゲノム配列の各断片の類似度を配列検索アルゴリズムで計算することにより行われるものであり、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド形成試験における７０％の一致度は、ＡＮＩ値では９５％に相当するとされている。それゆえ、ＡＮＩ値が９５％以上であれば同種と判定され、ＡＮＩ値が９５％未満であれば別種と判定される。ＡｕＢ－００１株の全ゲノム配列をシーケンサーにより決定し、２，５４８，７１８ｂｐの塩基配列を得た。ＡＮＩ解析はＡＮＩｔｏｏｌｓ　Ｏｎｌｉｎｅ（http://ani.mypathogen.cn/）ウェブサイトのプログラムにより行った。結果を以下表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示す通り、ＡｕＢ－００１株は、ビフィドバクテリウム・ロンガム種の複数の株に対し、９５％以上のＡＮＩ値を示した。したがって、本発明のＡｕＢ－００１株の菌種を、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と同定した。また、近縁株とのＡＮＩ値が１００％未満であることから、ＡｕＢ－００１株はビフィドバクテリウム・ロンガムの新規菌株であることが明らかとなった。このビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、特許微生物寄託センターにＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５として寄託された。
　［実施例４］
　４．糖資化能の検討
　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）種に同定されたＡｕＢ－００１株の糖資化能を調べるため、各糖類を基質とした反応試験を行った。試験は嫌気性菌生化学的同定キット（アピケンキ（ＡＰＩ２０Ａ）、ビオメリュー・ジャパン株式会社製品）を用いて行い、比較対照として、ビフィドバクテリウム・ロンガムの基準株であるBifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株についても同様の試験を行った。結果を以下表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　この結果によれば、本発明に係るＡｕＢ－００１株は、基準株であるＢ．ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ１５７０７株とは異なり、糖アルコールであるソルビトールの資化能を有することが明らかとなった。ソルビトール資化能を有するビフィドバクテリウム属細菌は、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びＢ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍの一部の菌以外には、これまでほとんど確認されておらず、今回、本発明者らによって、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ種におけるソルビトール資化能が確認された。このように、今回、アスリートの腸内フローラからソルビトール資化能を備えるビフィドバクテリウム・ロンガムが発見されたことは、アスリートの腸内フローラの多様性・機能性を裏付けるものである。
　［実施例５］
　５．有機酸産生量の分析
　有機酸は腸管内を酸性に保ち、腸の蠕動運動や腸管からの水の分泌を促進するほか、感染防御、腐敗産物の生産抑制、便性・便通の改善効果を有する作用を有する。そのため、有機酸を産生する菌を腸内に保有することにより、腸内環境が整い、健康に寄与することが知られている。そこで、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の有機酸産生能を調べるため、培養液中における有機酸産生量を分析した。なお、培養液として、（１）ソルビトールを含まない培養液Ａ、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂ、の２種類の培養液を用い、各培養液中における有機酸産生量を測定した。（１）ソルビトールを含まない培養液Ａとしては、上記表３に示したＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地を用い、（２）ソルビトールを含有する培養液Ｂとしては、下記表７に示すＧＡＭブイヨン「ニッスイ」液体培地にソルビトールを０．５％となるように配合したものを使用した。試験は次のようにして行った。ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡｕＢ－００１株のコロニーを取り、滅菌生理食塩水に懸濁してマックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この菌液０．１ｍＬを各培養液５ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間、脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパウチ（登録商標）・ケンキ）を用いて嫌気培養した。各培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでろ過し、ろ液を試料液として、高速液体クロマトグラフ装置（株式会社島津製作所製品、有機酸分析システム）にて、各有機酸の濃度を測定した。詳細な測定条件は次の通りである。
・カラム：Shim-pack SCR-102(H)、300mm×8mm ID、２本直列で使用
・ガードカラム：Shim-pack SCR-102(H)、50mm×6mm ID
・溶離液：５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐ－トルエンスルホン酸
・反応液：５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｐ－トルエンスルホン酸、１００μｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
・オーブン温度：４５℃
・検出器：電気伝導度検出器　ＣＤＤ－１０Ａ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　さらに、比較対照として、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株を用い、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡＴＣＣ１５７０７株のコロニーを滅菌生理食塩水で懸濁し、マックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この基準株の菌液０．１ｍＬを各培養液５ｍＬに接種し、３７℃で２０時間嫌気培養した培養液（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ１５７０７株）、及び菌を接種していない培養液（Ｂｌａｎｋ）についても、上述と同様に試験を行い、有機酸の濃度を測定した。結果を以下表８、９及び図１、２に示す。
　なお、培養液Ａ（表３）を用いた嫌気培養後のＡｕＢ－００１株の培養液Ａ中における全細菌数は１．５×１０１０（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、ＡＴＣＣ１５７０７株の培養液Ａ中における全細菌数は８．９×１０９（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。また、培養液Ｂ（表７）を用いた嫌気培養後のＡｕＢ－００１株の培養液Ｂ中における全細菌数は１．２×１０１０（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であり、ＡＴＣＣ１５７０７株の培養液Ｂ中における全細菌数は４．９×１０９（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　これらの結果によれば、培養液Ａ（ソルビトール添加なし）においては、ＡｕＢ－００１株は基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株と同様の有機酸産生能を有しており、いずれも乳酸、酢酸及びギ酸を多量に産生することが認められた。そして、ソルビトールが添加された培養液Ｂにおいても、ＡｕＢ－００１株は乳酸、ギ酸及び酢酸の高い産生能を有することが分かった。このことから、ＡｕＢ－００１株は、ソルビトール存在下において活発に増殖し、有機酸を産生できることが明らかとなった。
　［実施例６］
　６．糖資化能及び有機酸産生量の分析
　次に、実施例５で用いたグルコースを含有する培養液に替えて、炭水化物を含有しないＰＹ培地にグルコース又はソルビトールを炭水化物源としてそれぞれ添加した培養液を用い、ＡｕＢ－００１株及び基準株（Bifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株）の各培養液中における糖資化能、すなわち、増殖能と有機酸産生量を分析した。
　本実施例で用いたＰＹ培地の組成を以下表１０及び表１１に示す。ＰＹ培地は表１０に示す溶液１を加温溶解後、溶液２を添加し、１２１℃、１５分間オートクレーブ処理して得た。これを急冷後、Ｄ（－）－ソルビトールを０．５重量％濃度になるように添加した培養液を「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」とし、Ｄ（＋）－グルコースを０．５重量％濃度になるように添加した培養液を「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」とした。なお、表１０中のレサズリン液（※１）は２５ｍｇを１００ｍＬの蒸留水で溶解させたものを用い、塩類溶液（※２）は表１１に示す成分により調製した溶液を用い、ヘミン液（※３）は５０ｍｇのヘミンを１ＮのＮａＯＨで溶解し、蒸留水で１００ｍＬにメスアップしたものを用い、ビタミンＫ１液（※４）は０．１５ｍＬのビタミンＫ１を３０ｍＬの９５％エタノールで溶解させたものを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　試験は次のようにして行った。ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡｕＢ－００１株のコロニーを取り、滅菌生理食塩水に懸濁してマックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。このＡｕＢ－００１株の菌液０．１ｍＬを「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」及び「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」の各培養液１０ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間、滅菌加圧試験管を用いて嫌気培養した。培養後、各培養液から培養液を一部取り、原液～１０４倍に段階希釈し、血球計算盤を用いて細菌数を計数して各培養液１ｍＬ当たりの全細菌数を求めた。また、残りの各培養液を孔径０．２０μｍのメンブレンフィルターでそれぞれろ過し、ろ液を試料液として、上述した実施例５と同様の測定方法及び条件にて各有機酸の濃度を測定した。
　また、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株を用い、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地で３７℃、７２時間、嫌気培養により生育させたＡＴＣＣ１５７０７株のコロニーを滅菌生理食塩水で懸濁し、マックファーランド濁度Ｎｏ．０．５に調製した。この基準株の菌液０．１ｍＬを各培養液１０ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で２０時間嫌気培養した培養液（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＡＴＣＣ１５７０７株）、及び菌を接種していない培養液（Ｂｌａｎｋ）についても、同様に試験を行い、各培養液１ｍＬ当たりの全細菌数と各有機酸の濃度を測定した。結果を以下表１２、１３及び図３、４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　これらの結果によれば、炭水化物源としてグルコースを含有する「ＰＹ培地＋０．５％グルコース」培養液においては、ＡｕＢ－００１株および基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株のいずれも、１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬのオーダーにまで増殖し、乳酸及び酢酸を大量に産生することがわかった。他方、炭水化物源としてソルビトールを含有する「ＰＹ培地＋０．５％ソルビトール」培養液においては、ＡｕＢ－００１株は４．８×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬにまで活発に増殖し、乳酸及び酢酸を大量に産生したのに対し、基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株は、全細菌数が５．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬと増殖せず、乳酸及び酢酸をほとんど産生しないことが示された。
　これらのことから、ＡｕＢ－００１株はビフィドバクテリウム・ロンガム種でありながらソルビトールを利用して増殖し、最終代謝産物として乳酸及び酢酸を産生できることが明らかとなった。
　［実施例７］
　７．耐酸性の検討
　一般的にビフィドバクテリウム属細菌は低いｐＨ環境に弱いため、経口摂取した場合には胃液の影響を受けて死滅しやすく、生きたまま腸に到達し難いという問題がある。そこで、胃液を模したｐＨ２．０に調整した試験液を用い、本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の耐酸性について調べた。
　まず、ＡｕＢ－００１株を、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地（ヤクルト薬品工業株式会社）と脱酸素・炭酸ガス発生剤（三菱ガス化学株式会社製品、アネロパウチ（登録商標）・ケンキ）を用いて３７℃で２４時間、嫌気培養した。この新鮮培養菌株を滅菌生理食塩水で懸濁し、１ｍＬ当たりの菌数が１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように菌液を調製した。この菌液０．１ｍＬを、滅菌中型試験管に収容した１０ｍＬの人工胃液又は１０ｍＬの滅菌生理食塩水（コントロール）に添加し、３７℃で所定時間（人工胃液：１０分・２０分・３０分・４０分・５０分・６０分、滅菌生理食塩水：０分・６０分）反応させた。なお、人工胃液の組成を以下表１４に示す。人工胃液はｐＨ２．０に調整し、０．４５μｍのフィルターでろ過滅菌したものを使用した。また、人工胃液を構成する成分のうち、ペプシンは、「ペプシン　１：１００００、ブタ胃粘膜由来」（富士フイルム和光純薬株式会社製品）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　各反応時間経過後、菌液が添加された人工胃液又は滅菌生理食塩水を１ｍＬ取り、これを原液として希釈平板法により、菌数を測定した。各希釈率につき、３枚の寒天平板培地に原液又は希釈液を０．１ｍＬ塗抹して培養を行った。なお、寒天平板培地はＴＯＳプロピオン酸寒天培地を用い、培養は脱酸素・炭酸ガス発生剤を用いて３７℃で７２時間、嫌気培養することにより行った。結果を下記表１５に示す。
　また、ＡｕＢ－００１株に替えて、基準株であるBifidobacterium longum　ＡＴＣＣ１５７０７株についても、上述と同様の試験を行った。結果を下記表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　これらの結果によれば、ＡｕＢ－００１株は基準株であるＡＴＣＣ１５７０７株よりも耐酸性に優れていることがわかった。具体的には、ｐＨ２．０の人工胃液に３０分接触させた際において、ＡｕＢ－００１株は２．３×１０３ＣＦＵ／ｍＬ生残したが、ＡＴＣＣ１５７０７株の生残菌数は３．３ＣＦＵ／ｍＬであった。
　これらのことから、本発明に係るビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株は、ソルビトールを利用して活発に増殖し、最終代謝産物として乳酸及び酢酸を産生できるソルビトール資化能を有すると共に、耐酸性にも優れていることがわかった。それゆえ、ＡｕＢ－００１株は、基準株をはじめとした公知のビフィドバクテリウム・ロンガム種とは異なる性質を有していることが示された。
　本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含まれるものである。
　本発明の新規ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）及びそれを含む組成物は、新たなプロバイオティクスとして有用なビフィズス菌であり、腸内環境の改善等に有効に利用され、食品（サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含む）や医療の分野において幅広く役立つものである。
　受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）ＡｕＢ－００１株、原寄託日：２０１９年１２月２５日、寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）
　配列番号１：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域のＰＣＲ増幅のためのフォワードプライマー
　配列番号２：１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域のＰＣＲ増幅のためのリバースプライマー
　配列番号３：新規ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子領域の塩基配列

Claims (5)

  1. 　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）。
  2. 　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）を含有することを特徴とする組成物。
  3. 　ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＡｕＢ－００１株（ＮＩＴＥ　ＢＰ－０３０９５）及びソルビトールを含有することを特徴とする組成物。
  4. 　前記組成物は飲食品であることを特徴とする請求項２又は３に記載の組成物。
  5. 　前記組成物がプロバイオティクス組成物であることを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載の組成物。
     
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